DE69727382T2

DE69727382T2 - Antikörper die den monozyten chemolockstoff protein 1 (mcp-1) rezeptor (ccr2) binden

Info

Publication number: DE69727382T2
Application number: DE69727382T
Authority: DE
Inventors: Peter Lind; Carlos Martinez Alonso; Jose Mario Mellado Garcia; Jose Miguel Rodriguez Frade
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2017-02-28
Also published as: ATE258560T1; DE69727382D1; WO1997031949A1; JP2000510685A; SE9600820D0; ES2210496T3; AU724037B2; EP0914345B1; DK0914345T3; US6084075A; EP0914345A1; AU2110497A; PT914345E

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Antikörper, die in der Lage sind, den Rezeptor CCR2 für Monozyten-chemotaktisches Protein 1 (Monozyten-chemoattraktives Protein 1; Monocyte Chemoattractant Protein 1, MCP-1) zu binden.
Im einzelnen betrifft die Erfindung Agonisten und Antagonisten, die auf den Chemokinrezeptor CCR2 für Monozyten-chemotaktisches Protein 1 (MCP-1) wirken, einschließlich Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, die mit den extrazellulären Regionen des MCP-1-Rezeptors in Wechselwirkung treten und die mit MCP-1 und anderen natürlichen Liganden um die Rezeptorbindung konkurrieren.
Hintergrund der Erfindung
Die Chemokine stellen eine vielseitige Gruppe kleiner sekretierter basischer Proteine dar, die die chemotaktische Migration und Aktivierung einer Reihe verschiedener Leukozyten regulieren, insbesondere im Zusammenhang mit der Aktivierung der Immunreaktion bei entzündlichen Zuständen.
Beispiele für Zellen, von denen gezeigt wurde, daß sie chemotaktisch reagieren und durch die Chemokine aktiviert werden, sind Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten, Makrophagen sowie B-Lymphozyten und verschiedene Typen von T-Lymphozyten (Oppenheim, J. J. et al. (1991), Annu. Rev. Immunol. 9, 617–48; Miller, M. D. & Krangel, S. K. (1992), Crit. Rev. Immunol. (1, 2), 17–46; Baggiolini, M. et al. (1994), Adv. Immunol. 55, 97–179).
Die Chemokine können auf Grundlage des Musters der Cysteinylreste, die in den reifen Proteinen an der Bildung von Disulfidbindungen teilhaben, in zwei Hauptgruppen unterteilt werden. Die erste Gruppe, die CXC-Chemokine, oder die a-Chemokine, sind durch das Auftreten von zwei Cysteinylresten in der aminoterminalen Region gekennzeichnet, zwischen denen sich ein anderer Aminosäurerest befindet.
Die zweite Gruppe, die CC-Chemokine, oder die b-Chemokine, sind durch das Auftreten von zwei benachbarten Cysteinylresten gekennzeichnet, die sich in der aminoterminalen Region befinden.
Eine dritte, kleinere Gruppe von Chemokinen, die durch Lymphotactin repräsentiert wird, das bei Mäusen und Menschen isoliert wurde (Kelner, G. S. et al. (1994), Science 266, 1395–9; Kennedy, J. et al. (1995), J. Immunol. 155, 203–9), ist durch das Auftreten von nur zwei Cysteinresten gekennzeichnet, die in dem reifen Protein vermutlich eine einzige Disulfidbindung bilden. Bislang sind dies die einzigen Repräsentanten der sogenannten Chemokine vom c-Typ.
Die CXC-Chemokine wirken in erster Linie auf Neutrophile, insbesondere diejenigen CXC-Chemokine, die die Aminosäuresequenz Glu-Leu-Arg an ihrem Aminoterminus tragen. Beispiele für CXC-Chemokine, die bei Neutrophilen aktiv sind, sind Interleukin-8 (IL-8), GRO-α, -β und -γ, NAP-2, ENA-78 und GCP-2.
Die CC-Chemokine wirken auf eine größere Vielzahl von Leukozyten, wie Monozyten, Makrophagen, Eosinophile, Basophile sowie T- und B-Lymphozyten. Beispiele hierfür sind MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β, Eotaxin, RANTES, I-309. Letzteres trägt zwei zusätzliche Cysteinylreste, die in dem reifen Protein vermutlich eine dritte Disulfidbindung bilden.
MCP-1, oder Monozyten-chemotaktisches Protein 1, wurde ursprünglich aus Phytohämagglutinin-stimulierten humanen Lymphozyten (Yoshimura, T. et al. (1989), J. Immunol. 142, 1956–62), einer humanen Gliomzellinie (Yoshimura, T. et al. (1989), J. Exp. Med. 169, 1449–59) und der humanen Myelomonozyten-Zellinie THP-1 (Matsushima, K. et al. (1989), J. Exp. Med. 169, 1485–90) gereinigt. MCP-1 wurde auch als MCAF, LDCF, GDCF, HC11, TSG-8, SCYA2 und A2 bezeichnet. Molekulare Klonierung der für MCP-1 codierenden cDNA (Furutani, Y. et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm. 169, 249–55; Rollins, B. J. et al. (1989), Mol. Cell. Biol. 9, 4687–95; Chang, H. C. et al. (1989), Int. Immunol. 1, 388–97) ergab einen offenen Leserahmen von 99 Aminosäuren, einschließlich eines Signalpeptids von 23 Aminosäuren.
MCP-1 wird durch Monozyten und eine Vielzahl von Gewebezellen, wie Endothelzellen, Epithelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, Synovialzellen, Keratinozyten, Mesangialzellen, Osteoblasten, glatten Muskelzellen, sowie von zahlreichen verschiedenen Tumorzellen produziert (Baggiolini, M. et al. (1994), Adv. Immunol. 55, 97–179, und darin zitierte Literatur). Seine Expression wird durch verschiedene Typen proinflammatorischer Substanzen, wie IL-1β, TNF-α, IFN-γ, Lipopolysaccharid und GM-CSF stimuliert. Man nimmt an, daß MCP-1 eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Atherosklerose spielt. Makrophagen, die mit Lipiden beladen sind, sogenannte Schaumzellen, stellen die überwiegende Mehrzahl von Zellen in atherosklerotischen Läsionen dar, und es wird vermutet, daß aktive Monozytenrekrutierung durch MCP-1 aus diesen Zellen und aus aktiviertem Endothel eine zentrale Rolle bei der Bildung von Fettstreifen und atherosklerotischen Plaques spielt (Ylä-Herttuala, S. et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12), 5252–6; Schwartz, C. J. et al. (1993), Am. J. Cardiol. 71(6), 9B–14B; Takeya, M. (1993), Hum. Pathol. 24(5), 534–9).
Es wurde gezeigt, daß die Konzentration von MCP-1 in der Synovialflüssigkeit und dem Plasma von Patienten mit rheumatoider Arthritis im Vergleich mit anderen arthritischen Erkrankungen erhöht ist, und die Hauptquelle hierfür sind Makrophagen, die MCP-1 konstitutiv exprimieren. Im rheumatoiden Synovium trägt MCP-1 zusammen mit anderen entzündlichen Zytokinen wie IL-1β, IL-6, IL-8 und TNF-α zur Immunpathogenese von rheumatoider Arthritis bei (Koch, A. E. (1992), J. Clin. Invest. 90, 772–79; Hosaka, S. et al. (1994), Clin. Exp. Immunol. 97, 451–7; Akahoshi, T. et al. (1993); Arthritis. Rheum. 36, 762–71; Harigai, M. et al. (1993), Clin. Immunol. Immunopathol. 69, 83–91).
Die von mononukleären Phagozyten abhängige, durch IgA-Immunkomplexe vermittelte Lungenverletzung ist durch Akkumulation mononukleärer und phagozytischer Zellen gekennzeichnet, und es wurde gezeigt, daß sie größtenteils von der Expression von MCP-1 abhängt (Jones, M. L. et al. (1992), J. Immunol. 149, 2147–54). Ähnlich scheint MCP-1 eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von idiopathischer pulmonaler Fibrose und von Sarkoidose zu spielen (Iyonaga, K. et al. (1994), Hum. Pathol. 25, 455–63; Car, B. D. et al. (1994), Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 149, 655–9).
In Tiermodellen wurde gezeigt, daß MCP-1 nach fokaler Ischämie im Hirn (Kim, J. S. (1995), J. Neuroimmunol. 56, 127–34; Wang, X. et al. (1995), Stroke 26, 661–5) und bei experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (Hulkower, K. et al. (1993), J. Immunol. 150, 2525–33; Ransohoff, R. M. et al. (1993), 7, 592–600) exprimiert wird. MCP-1 könnte ein wichtiges Zytokin sein, das bei dem durch diese Tiermodelle veranschaulichten Krankheitsprozeß, wie Schlaganfall und multipler Sklerose, auf mononukleäre Zellen zielt.
Bei psoriatischen Läsionen scheint MCP-1 die Wechselwirkung zwischen proliferierenden Keratinozyten und dermalen Makrophagen zu regulieren und kann über der dermalen/epidermalen Verbindung oder "Junction" lokalisiert werden. Zusätzlich zu IL-8, das für die Neutrophileninfiltration in diese Läsionstypen wichtig ist, könnte MCP-1 dazu dienen, mononukleäre Zellen zu rekrutieren (Schroder, J. M. (1992), Arch. Dermatol. Res. 284, Suppl. 1, S22–6; Gillitzer, R. et al. (1993), J. Invest. Dermatol. 101, 127–31).
MCP-1 scheint an der Regulierung der Infiltration mononukleärer Zellen beteiligt zu sein, die bei vielen soliden Tumoren beobachtet wird. Es wurde eine Korrelation zwischen tumorassoziierter MCP-1-Produktion und der Anzahl und der Proliferationsaktivität tumorassoziierter Makrophagen gezeigt (Walter, S. et al. (1991), Pathobiology 59(4), 239–42; Mantovani, A. et al. (1994), Adv. Exp. Med. Biol. 351, 47–54). Mittels transplantierter Sarkomzellen wurde in Mäusen gezeigt, daß Zellen, die große Mengen MCP-1 exprimieren, langsamer wachsen, und daß dies mit der Anzahl tumorassoziierter Makrophagen zusammenhängt (Walter, S. et al. (1991), Int. J. Cancer 49, 431–5). Ähnlich zeigen murine Kolonkarzinomzellen, die so manipuliert wurden, daß sie MCP-1 exprimierten, ein geringeres Metastasepotential (Huang, S. et al. (1994), Cancer Immunol. Immunother. 39, 231–8).
MCP-1 ist ein starker chemoattraktiver und aktivierender Faktor für Monozyten, der Chemotaxis, Calciumstrom und den respiratorischen Burst induziert und Aktivität im Pikomolbereich zeigt (Yoshimura, T. & Leonard, E. J. (1990), J. Immunol. 154, 292–97; Zachariae, C. O. C. et al. (1990), J. Exp. Med. 171, 2177–82; Rollins B. et al. (1991), Blood 78, 1112–6; Vaddi, K. & Newton, R. C. (1994), J. Leukoc. Biol. 55, 756–62). MCP-1 reguliert auch CD11b/CD18 und CD11c/CD18 in einem transienten Zeitverlauf hoch, was wahrscheinlich transendotheliale Migration bei Entzündungen erleichtert (Jiang, Y. et al. (1992), J. Immunol. 148, 2423–8; Vaddi, K. & Newton, R. C. (1994), J. Immunol. 153, 4721–32).
Kürzlich wurde deutlich, daß MCP-1 zusätzlich zu Monozyten sowohl in vitro als auch in vivo als Chemoattraktant auf CD4⁺- und CD8⁺-T-Lymphozyten wirkt (Loetscher, P. et al. (1994), FASEB J. 8, 1055–60; Carr, M. W. et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3652–6; Taub, D. D. et al. (1995), 95, 1370–6). Natürliche Killerzellen, die durch Interleukin-2 stimuliert worden waren, unterliegen ebenfalls Chemotaxis durch MCP-1 (Maghazachi, A. A. et al. (1994), J. Immunol. 153, 4969–77; Allaven, P. et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24, 3233–6). Dies unterstreicht die Bedeutung dieses Chemokins bei der Rekrutierung von Effektorzellen zu entzündlichen Läsionen.
Zusätzlich zu der Wirkung auf Monozyten und T-Lymphozyten ist MCP-1 ein moderater Chemoattraktant und ein starker Aktivator der Freisetzung von Allergiemediatoren wie Histamin und Leukotrienen aus Basophilen (Kuna, P. et al. (1992), J. Exp. Med. 175, 489–93; Bischoff, S. C. et al. (1992), J. Exp. Med. 175, 1271–7; Bischoff, S. C. et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23, 761–7). Im Gegensatz zu den Basophilen reagiert ein anderer Granulozyt, der an allergischen inflammatorischen Läsionen beteiligt ist, der eosinophile Granulozyt, nicht auf MCP-1 (Rot, A. et al. (1992), J. Exp. Med. 176, 1489–95).
Es gibt einen Rezeptor für MCP-1, der als Folge von alternativem Spleißen der für die carboxyterminale Region codierenden mRNA in zwei leicht unterschiedlichen Formen exprimiert zu werden scheint, MCP-1-RA und MCP-1RB (Charo, I. F. et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752–56). Diese Rezeptoren (CCR2) werden in Monozyten, myeloiden Vorläuferzellen und aktivierten T-Lymphozyten exprimiert (Myers, S. J. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 5786–5792; Qin, S. et al. (1996), Eur. J. Immunol. 26, 640–647). Sie stellen ein effektives Mittel dar, um die molekulare Basis der Chemokin-Rezeptor-Wechselwirkungen näher bestimmen zu können und um die Rolle von MCP-1 bei der Regulierung der Monozyten/Makrophagen-Infiltration bei einer Vielzahl von Krankheitsprozessen zu verstehen.
Der MCP-1-Rezeptor gehört zu den sieben Typen von Transmembranproteinen und ist homolog zu den Rezeptoren für MIP-1α/RANTES (CC-CKR1; Neote, K. et al. (1993), Cell 72, 415–25) und Interleukin-8/GRO (Holmes, W. E. et al. (1991), Science 253, 1278–80; Murphy, P. M. & Tiffany, H. L. (1991), Science 253, 1280–3). Die Dissoziationskonstante von MCP-1 gegenüber dem in HEK-293-Zellen transfizierten Rezeptor ist 0,26 nM, was mit an Monozyten gemessenen Werten übereinstimmt (Myers, S. J. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 5786–92; Van Riper, G. et al. (1993), J. Exp. Med. 177, 851–6). Die Aktivierung des MCP-1RB-Rezeptors auf transfizierten HEK-293-Zellen durch MCP-1 inhibiert Adenylylcyclase bei einer Konzentration von 90 pM und mobilisiert intrazelluläres Calcium bei leicht höheren Konzentrationen anscheinend unabhängig von der Hydrolyse von Phosphatidylinositol. Die Wirkung auf Adenylylcyclase und intrazellulärer Calciumfreisetzung wird durch Pertussistoxin stark inhibiert, was die Beteiligung von heterotrimeren G-Proteinen vom Gi-Typ bei der Signaltransduktion impliziert (Meyers, S. J. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 5786–92).
Die kürzliche Beschreibung von Chemokinrezeptoren als HIV-1-Corezeptoren und von Chemokinen als Neutralisierungsmittel für HIV-1-Infektionen weist diesen Molekülen eine Schlüsselrolle bei der HIV-1-Pathogenese zu (Doranz, B. J. et al. (1996), Cell 85, 1149–1158; Feng, Y. et al. (1996), Science 272, 872–877; Deng, H. et al. (1996), Nature 381, 661–666; Cocchi, F. et al. (1995), Science 270, 1811–1815; Choe, H. et al. (1996), Cell 85, 1135–1148; Alkhatib, G. et al. (1996), Science 272, 1955–1958). Spezifische Tools sind wichtig, um bei der Aufklärung der Art und Weise zu helfen, mit der Chemokine und HIV-1 mit den Chemokinrezeptoren in Wechselwirkung treten, um festzustellen, welche Rezeptoren wichtig sind, um verschiedene HIV-1-Stämme zu verschiedenen Populationen peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) zu dirigieren, und in welchem Stadium (Bindung, Desensibilisierung, Signaltransduktion) diese Wechselwirkung erfolgt.
Die WO 94/11504, eine im Namen von Horuk, Neote und Schall eingereichte Patentanmeldung, beschreibt DNA-Isolate, die für den humanen C-C-Chemokinrezeptor C-C CKR-1 codieren, und Verfahren zum Erhalt solcher DNA, zusammen mit Expressionssystemen für die rekombinante Produktion von C-C CKR-1, der sich für therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen eignet. Zusätzlich wird ein Verfahren zur Identifizierung neuer Chemokinrezeptoren beschrieben.
Die WO 95/19436, eine im Namen von "The Regents of the University of California" eingereichte Anmeldung, beschreibt eine isolierte DNA-Sequenz, die für die Expression des MCP-1-Rezeptors codiert. Es wird auch erwähnt, daß ein Antagonist des MCP-1-Rezeptors durch Expression der N-terminalen Domäne des MCP-1-Rezeptors und Nachweis eines Verlusts der Bindung der MCP-1-Rezeptordomäne identifiziert werden könnte. Es wird eine pharmazeutische Zusammensetzung beansprucht, die den MCP-1-Rezeptor-Antagonisten umfaßt, wie er durch das offenbarte Verfahren identifiziert wird. Es wird keine derartige Identifizierung durchgeführt und es werden keine Antagonisten isoliert.
Wir haben mAb's erzeugt, die für den CCR2-Chemokinrezeptor spezifisch sind, indem wir Mäuse mit synthetischen Peptiden immunisiert haben, die verschiedenen extrazellulären Rezeptordomänen entsprachen. Wir beschreiben die Erzeugung von mAb's, die in der Lage sind, nativen CCR2-Rezeptor spezifisch zu erkennen. Analyse der CCR2-Expression auf humanen PBMC- und Tonsillenzellen zeigt dessen Expression in B-Zellen, was also zu der bekannten Expression in Monozyten und aktivierten T-Zellen hinzukommt. Dies würde eine Rolle für MCP-1 in B-Zellen vermuten lassen. Diese mAb's wurden basierend auf Chemotaxis und Ca²⁺-Induktion in humanen Monozyten und monozytischen Zellinien anhand ihre Fähigkeit charakterisiert, MCP-1-Aktivität zu blockieren und/oder zu imitieren. Mit diesen mAb's definieren wir CCR2-Regionen, die für die Ligandenbindung und das Auslösen einer Reaktion über diesen Rezeptor entscheidend sind; wir zeigen eine Aufspaltung zwischen diesen beiden Aktivitäten, die helfen könnte, die komplexen Mechanismen bei der Chemokin-Signalgebung sowie die Spezifitätszusammenhänge bei diesen Rezeptortypen aufzuklären. Auf Basis der Fähigkeit dieser mAb's, entweder Chemokinrezeptoren zu triggern oder Chemokinreaktionen zu blockieren, haben wir ein Modell entworfen, das unser augenblickliches Wissen über Chemokinreaktionen berücksichtigt.
Im Gegensatz zu IL-8-Rezeptor-neutralisierenden Antikörpern, die gegen die NH₂-terminale Region gerichtet sind (37), kartieren unsere mAb's mit Antagonistenaktivität (MCPR-04 und MCPR-05) auf der dritten extrazellulären Loopregion des CCR2-Rezeptors. Ein anderer mAb mit ähnlicher Peptidspezifität (MCPR-03) blockiert die MCP-1-Aktivität nicht, obwohl er an den Rezeptor bindet. Die neutralisierende Wirkung dieser Antikörper ist also auf die Erkennung einiger weniger Schlüsselreste innerhalb dieser Region beschränkt, die bei der Chemokinbindung oder bei der Modulation der Chemokinaktivität eine entscheidende Rolle spielen. Frühere Untersuchungen schließen auf die Bedeutung der NH₂-terminalen Chemokinrezeptordomäne für den IL-8R, ein Mitglied der CXC-Chemokinrezeptorfamilie. Für diesen Unterschied könnte es mehrere Erklärungen geben. Erstens könnten sich die strukturellen Merkmale, die die Wechselwirkung des CC-Chemokins mit seinem Rezeptor steuern, von denen der CXC-Chemokine unterscheiden, und die vorliegende Beteiligung der dritten extrazellulären Domäne könnte diesen Unterschied widerspiegeln; neutralisierende Antikörper für andere CC-Rezeptoren müssen getestet werden, bevor formale Schlußfolgerungen gezogen werden können. An zweiter Stelle steht die überraschende Tatsache, daß mAb's, die für den Aminoterminus spezifisch sind, beispielsweise MCPR-02, die Chemokinreaktion imitieren können. Dies läßt den Schluß zu, daß diese Region für die Aktivierung des CCR2-Rezeptors durch Agonisten entscheidend ist.
Wir kommen daher zu dem Schluß, daß Chemokinrezeptoren in zwei unterschiedlichen funktionellen Domänen organisiert sind, die der NH₂-terminalen Region und der dritten extrazellulären Loopregion entsprechen. Alle bekannten Chemokinrezeptoren weisen ein hohes Maß an Sequenzidentität auf, und viele Chemokine können mit mehr als einem Chemokinrezeptor in Wechselwirkung treten. Es ist daher wahrscheinlich, daß in den unterschiedlichen Rezeptoren ähnliche Regionen an der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung beteiligt sind, diese aber in der NH₂-terminalen Domäne, die an der Signaltransduktion beteiligt ist, unterschiedliche Modifikationen zur Folge hat. Unsere Beobachtungen könnten daher auf die gesamte Chemokinrezeptorfamilie extrapoliert werden und tragen zu einer Erklärung für die Degeneriertheit bei der Chemokin-Chemokinrezeptor-Signalgebung bei.
Im experimentellen Teil beschreiben wir die Erzeugung von mAb's, die in der Lage sind, den nativen MCP-1-Rezeptor zu erkennen, und ihre Charakterisierung, einschließlich ihrer Fähigkeit, MCP-1 zu blockieren und/oder zu imitieren, sowie Induktion von Ca²⁺ in humanen Monozyten und monozytischen Zellinien und Chemotaxis.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, den Rezeptor CCR2 für Monozyten-chemotaktisches Protein (MCP-1) wie in den anliegenden Ansprüchen definiert zu binden.
Antikörper entsprechend den Ansprüchen erkennen die extrazelluläre aminoterminale Region des Rezeptors oder erkennen Sequenzen, die sich im dritten extrazellulären Loop des Rezeptors befinden, und wirken als Agonisten bzw. Antagonisten.
Der beanspruchte Antikörper kann zur in vitro- und/oder in vivo-Diagnose und für therapeutische Zwecke verwendet werden.
Weitere Aspekte der Erfindung sind die in vitro-Verwendung zum Screenen und zum Nachweis von Geweben und Zellklassen, die den MCP-1-Rezeptor exprimieren, und zum Screenen auf neue Wirkstoffe, z. B. neue entzündungshemmende Wirkstoffe.
Beispielsweise können radiomarkierte Antikörper, die in der Lage sind, an den MCP-1-Rezeptor zu binden, verwendet werden, um Bereiche aktiver entzündlicher Prozesse im ganzen Körper in vivo sichtbar zu machen, wo es eine Akkumulation von Zellspezies gibt, die MCP-1-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen. Ferner können mittels Immunfluoreszenzmikroskopie oder fluoreszenzaktivierter Zellsortierung heterogene Zellpopulationen in vitro auf das Auftreten von Zellspezies analysiert werden, die den MCP-1-Rezeptor exprimieren.
Eine weitere Verwendung von Antikörpern, die an spezifische Regionen des Rezeptors binden, wie sie im experimentellen Teil erläutert werden, ist das in vitro-Screening von niedermolekularen Substanzen, die in der Lage sind, mit dem Rezeptor in einer solchen Weise in Wechselwirkung zu treten, daß diese Antikörper verdrängt werden. Beispielsweise können Antikörper, die an die aminoterminale extrazelluläre Domäne des Rezeptors binden, radioaktiv markiert, fluoreszenzmarkiert, enzymatisch markiert oder mit einem Affinitäts-"Tag" markiert werden, so daß diese Antikörper mit biochemisch gereinigten MCP-1-Rezeptorpräparaten, die in Vertiefungen in Plastikschalen immobilisiert sind, in Wechselwirkung treten können. Verdrängung dieser Antikörper durch niedermolekulare Verbindungen könnte durch Nachweis von verbliebenem gebundenem Antikörper oder von freigesetztem Antikörper gemessen werden. Ähnlich könnten Antikörper, die mit anderen extrazellulären Regionen des MCP-1-Rezeptors in Wechselwirkung treten, verwendet werden, um auf andere Verbindungen zu screenen, die sich auf die Bindung dieser Antikörper auswirken. Es ist zu erwarten, daß niedermolekulare Verbindungen, die diese Antikörper verdrängen, dies tun, indem sie an die extrazellulären Regionen des MCP-1-Rezeptors binden, wobei sie entweder agonistische und/oder antagonistische Eigenschaften entfalten. Es ist zu erwarten, daß niedermolekulare antagonistische Verbindungen potentiell entzündungshemmende Eigenschaften besitzen, wenn sie in vivo verabreicht werden, und als neue Wirkstoffe bei der Behandlung entzündlicher Zustände geeignet sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Antikörperpräparat, das den beanspruchten Antikörper umfaßt, und pharmazeutische Zusammensetzungen oder Präparate, die den beanspruchten Antikörper und einen Trägerstoff umfassen.
Das Präparat umfaßt den Antikörper in einer therapeutisch wirksamen Menge zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Die Trägerstoffe werden abhängig vom Verabreichungsweg gewählt und sind dem Fachmann bekannt.
Dieses Präparat, gegebenenfalls zusammen mit einem Trägerstoff, könnte potentiell von therapeutischem Nutzen sein, insbesondere wenn Erkrankungen wie Entzündungen, rheumatoide Arthritis, von mononukleären Phagozyten abhängige Lungenverletzung, idiopathische pulmonale Fibrose, Sarkoidose, fokale Ischämie, Autoimmunenzephalomyelitis, Schlaganfall, multiple Sklerose, psoriatische Läsionen, Tumoren und chronische Transplantatabstoßung durch Verabreichung des beanspruchten Antikörpers an den bedürftigen Patienten behandelt werden.
Da sich der Rezeptor für MCP-1 auf den CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen befindet, kann der beanspruchte Antikörper bei einer lymphozytenvermittelten Zerstörung spezifischer Zellen aktiv sein, beispielsweise Tumorzellen oder virusinfizierten Zellen, die z. B. AIDS verursachen.
Der Antikörper wird zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung der oben offenbarten Erkrankungen verwendet.
Der Antikörper, der ein Agonist des MCP-1-Rezeptors ist, könnte auch in einem bispezifischen Antikörper verwendet werden, bei dem ein Teil gegen eine Zelle oder eine HIV-infizierte Zelle gerichtet ist und der andere Teil der Agonist ist. Hinsichtlich bispezifischer Antikörper wird z. B. auf AL Howell et al., J. Leukoc. Biol. (1994), Mar 55(3), 385–91 und Haagen, I. A. et al., Cancer. Immunol. Immunother. (1994), Dec. 39(6), 391–6, verwiesen.
Ein Mikroorganismus oder eine Zellinie, die in der Lage sind, den beanspruchten Antikörper zu produzieren, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Chimere oder andere rekombinante Antikörper, die in der Lage sind, den MCP-1-Rezeptor zu binden, sowie Fusionsproteinderivate, Konjugationsderivate oder fragmentierte Derivate dieser Antikörper sind Teil der Erfindung.
Die speziellen Antikörper MCPR-01, MCPR-03 und MCPR-06, wie sie nachfolgend beschrieben sind, eignen sich zur Charakterisierung des Rezeptors, und MCPR-02 ist ein Rezeptoragonist und MCPR-04 und MCPR-05 sind Rezeptorantagonisten.
Der mAb MCPR-02 könnte verwendet werden, um HIV-1-Infektionen zu neutralisieren, und die mAb's MCPR-04 und MCPR-05 könnten verwendet werden, um eine MCP-1-induzierte HIV-1-Neutralisierung zu blockieren.
Wir haben diese mAb's auch verwendet, um den CCR2-Rezeptor in mehreren Leukozytenpopulationen zu identifizieren und um die Polarisierung dieses Rezeptors in Lymphozyten zu identifizieren. Diese mAb's könnten auch zur Idenfizierung von Konformationsänderungen in CCR2-Rezeptoren nach Aktivierung nützlich sein.
Mittels der von uns in den zwei verschiedenen funktionellen Domänen identifizierten Sequenzen können die Antikörper von einem Fachmann hergestellt werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1a bis 1f zeigen die Bindung ausgewählter monoklonaler Antikörper an Mono-Mac-1-Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Jede Figur zeigt die Bindung von jeweils einem der monoklonalen Antikörper MCPR-01 bis MCPR-06.
2 stellt die MCP-1-induzierte Calciumfreisetzung in Mono-Mac-1-Zellen und die Wirkung der Vorinkubation mit einem irrelevanten monoklonalen Antikörper (mAb-), dem monoklonalen Antikörper MCPR-04, dem monoklonalen Antikörper MCPR-05 und dem monoklonalen Antikörper MCPR-06 dar.
3a bis 3f zeigen die Mobilisierung von Ca²⁺. Mono-Mac-1-Zellen, die mit Fluo-3 beladen waren, wurden nacheinander mit 100 nM eines irrelevanten monoklonalen Antikörpers (3a) oder MCPR-04 (3b) gefolgt von 5 nM MCP-1 stimuliert. In anderen Fällen wurden Zellen vor der Stimulation mit MCP-1 30 min bei 4°C mit der gleichen Konzentration eines irrelevanten monoklonalen Antikörpers (3c) oder MCPR-05 (3d) vorinkubiert. Challenge beladener Zellen erfolgte mit einem irrelevanten mAb (3e) oder MCPR-01 (3f), gefolgt von 5 nM MCP-1.
4a und 4b. Chemotaxis. Mono-Mac-1-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von MCPR-05 vorinkubiert und auf die obere Kammer von mit Endothelzellen beschichteten Transwells gegeben, und MCP-1 (1 nM) wurde zu der unteren Kammer gegeben (4a). Zellen, die zur unteren Kammer migriert waren, wurden gezählt und als ein Migrationsindex (M.I.) ausgedrückt, der als die x-fache Zunahme der Migration berechnet wird, die im Verhältnis zur negativen Kontrolle (Medium) beobachtet wird. 4b zeigt die Wirkung einer Verdünnung von MCPR-02-mAb's auf die Migration von Mono-Mac-1-Zellen unter den gleichen Bedingungen.
5a und 5b. Expression von CCR2-Rezeptor auf humanen Leukozyten. Expression von CCR2-Chemokinrezeptor in ruhenden (–) oder aktivierten (+) PBL-Zellen oder von Tonsillen stammenden Zellen (5a) mittels Doppelfärbung mit MCPR-05 und anti-T (CD4)- oder anti-B (CD19, CD20)-Antikörpern, wie angegeben. Der Prozentsatz an Zellen, die den CCR2-Rezeptor exprimierten, wie definiert durch MCPR-05-Bindung bei Durchflußzytometrie in verschiedenen Lymphozytenpopulationen, definierte die angegebenen CD-Marker.
6a bis 6c. Wirkung der Vorinkubation mit dem Antagonisten-mAb MCPR-05 auf MCP-3-induzierten Ca²⁺-Influx (A, B) und Transmigration (C) von Zellen.

Die Tabellen I bis III erläutern die Erfindung. Ausführliche Beschreibung der Erfindung DEFINITIONEN

BSA	Rinderserumalbumin
CD11b und c	Oberflächenantigene
DMF	Dimethylformamid
DMSO	Dimethylsulfoxid
ECL	Enzymatische Chemilumineszenz
ED1	Monoklonaler Maus-Antikörper von Serotec, der Rattenmonozyten erkennt
ED2	Monoklonaler Maus-Antikörper von Serotec, der Rattenmakrophagen erkennt
EIA	Enzyme-linked Immunoassay
FACS	Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
FCS	Fötales Kälberserum
FITC	Fluoresceinisothiocyanat
GM-CSF	Granulocyte and Macrophage Colony Stimulating Faktor
HIV	Human Immunodeficiency Virus
IFN-γ	Interferon-γ
IL-1β	Interleukin

KLH	Keyhole Limpet-Hämocyanin, Pierce
MCP-1RB	Typ B-Rezeptor für Monozyten-chemotaktisches Protein 1
MIP	Macrophage Inflammatory Protein
Mono-Mac 1	Zellen, die den MCP-1-Rezeptor exprimieren, erhalten von Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM ACC252)
PBL	Periphere Blutleukozyten, isoliert aus Vollblutzellen, erhalten von gesunden Spendern und gereinigt durch Zentrifugation an Ficoll-Paque (5,7 g/l)
PBS	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
RPMI	Standardmedium
THP-1	Zellen, die den MCP-1-Rezeptor exprimieren, ATCC TIB202
TNF-α	Tumornekrosefaktor α

Beispiel 1. Peptidsynthese
Zwei Peptide FDYDYGAPCHKFDVK und GLSNCESTSQLDQATQVTET, die die Sequenzen 24–38 bzw. 273–292 des Typ B-Rezeptormoleküls für das Monozyten-chemotaktische Protein-1 (MCP-1RB) abdecken, wurden mittels Festphasenverfahren und Standard-Fmoc-Chemie an einem automatischen Multipeptid-Synthesegerät (AMS 422, Abimed) auf einer Basis von 25 μmol synthetisiert. Die Synthese wurde an N-α-Fmoc-geschützten Aminosäuren durchgeführt, die an p-Benzyloxy-benzylalkohol-Harz (4-(Hydroxymethyl)phenoxymethyl-Copoly(styrol-1% Divinylbenzol)-Harz) (Wang-Harz, Novabiochem) gebunden waren, wobei die Fmoc-geschützten Aminosäuren in situ mit PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat) in Gegenwart von N-Methylmorpholin (NMM) und 20% Piperidin/DMF zur Entschützung aktiviert wurden. Die Seitenkettenschutz-gruppen waren wie folgt: Asn, Cys, Gln und His (Trt); Glu und Asp (OtBu); Lys (Boc); Ser, Thr und Tyr (tBu). Die Peptide wurden von dem Harz mit 82,5%iger Trifluoressigsäure (TFA) und 5% Phenol, 5% H₂O, 5% Thioanisol, 3,5% EDT als Radikalfänger abgespalten, präzipitiert und mit kaltem Methyl-tert-butylether gewaschen, mit Wasser extrahiert, lyophilisiert und durch Reversed-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer halbpräparativen Nucleosil C-18-Säule (Tracer) gereinigt. Reinheit und Zusammensetzung der Peptide wurden durch Reversed-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer analytischen C-18 Nucleosil 120-Säule (Tracer) mit einem 5–70%igen Acetonitrilgradienten, der 1% TFA enthielt, und durch Aminosäureanalyse mit einem Beckman 6300-Aminosäureanalysator nach 18 h saurer Hydrolyse in einer N₂-Atmosphäre bei 110°C bestätigt.
Beispiel 2. Antigenpräparation und Immunisierungen
2.1 Kopplung von Peptiden an KLH
Die Peptide MCP-1RB (24–38) und (273–292) wurden über Cys 32 bzw. Cys 277 mittels Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) als Kopplungsmittel an Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH, Pierce) gekoppelt.
KLH wurde in einer Phosphatpufferlösung, pH 7,2, bei einem Molverhältnis von Sulfo-SMCC von 6000 : 1 60 min bei 30°C aktiviert. Das aktivierte KLH wurde durch Sephadex G-25 gelfiltriert und mit den Peptiden in 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,0, 18 h lang bei Raumtemperatur gemischt, wobei ein Molverhältnis von Peptid zu KLH von 3000 : 1 verwendet wurde. Das endgültige Molverhältnis von Peptid zu Trägerprotein wurde durch die Aminosäurezusammensetzung des Komplexes im Vergleich mit der Aminosäurezusammensetzung des Trägerproteins allein berechnet.
2.2 Immunisierung
Balb/c-Mäuse im Alter von zwei bis drei Monaten wurden mit den oben beschriebenen KLH-gekoppelten Peptiden immunisiert. Jede Maus erhielt zuerst eine subkutane Injektion von 40 μg Peptid in 0,15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) emulgiert in 0,15 ml komplettem Freundschem Adjuvans (Difco Laboratories, USA) (Tag 0). Die Mäuse wurden an den Tagen 30 und 60 mit der gleichen Menge Peptid, das in inkomplettem Freundschem Adjuvans emulgiert war, subkutan geboostert. Vor Fusion wurden die Mäuse an den Tagen –3 und –2 intravenös mit 30 μg Peptid in 0,15 ml steriler Kochsalzlösung geboostert.
Serum von immunisierten Mäusen, die mit KLH-MCP1RB (24–38) oder KLH-MCP1RB (273–292) immunisiert worden waren, wurde 7–10 Tage nach jeder Boosterung gesammelt, und die Anwesenheit spezifischer Antikörper wurde im Enzyme-linked Immunoassay (EIA), durch Western Blot oder durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) bestimmt. Alle Mäuse reagierten auf das entsprechende Immunogen (nicht-gekoppeltes synthetisches Peptid) im EIA mit Titern (Antiserumverdünnung, die halbmaximale Bindung lieferte) von 1/2500–1/20.000.
Beispiel 3. Präparation monoklonaler Antikörper
Bei allen Fusionsexperimenten wurde die nicht-sekretierende Myelomzellinie P3X63Ag8.653 (CRL 1580, ATCC) verwendet. Immunisierte Mäuse, die auf Basis der Antikörperproduktion ausgewählt worden waren, wurden getötet, und die Milz wurde aseptisch entnommen und zerlegt, bis der größte Teil der Zellen freigesetzt worden waren. Die Zellen wurden in RPMI 1640 (Biowhittaker) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1 mM Pyruvat und 2 mM Glutamin (komplettes Medium) überführt. Vor der Fusion wurden rote Zellen aus der Milz mit NH₄Cl (0,85 in H₂O) lysiert und durch Zentrifugation entfernt. Die Myelomzellen wurden mit den Splenozyten in einem Verhältnis von 1 : 5 gemischt und die Zellen wurden zweimal durch Zentrifugation in vorgewärmtem Medium ohne Serum gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde während 1 min unter leichtem Rühren 1 ml vorgewärmtes Polyethylenglykol 4000 (PEG, Merck, 50% w/v in RPMI 1640) zu dem Zellpellet gegeben. Das PEG wurde durch langsame Zugabe von 20 ml Medium ohne Serum verdünnt (1 ml/min). Dann wurden die Zellen zentrifugiert (1000 rpm, 10 min bei Raumtemperatur), in komplettem Medium resuspendiert, gezählt und in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in Kolben überführt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C in einer 50%igen CO₂-Atmosphäre belassen.
Die fusionierten Zellen wurden zentrifugiert und in komplettem Medium, das Azaserin und Hypoxanthin (10^–5 bzw. 10^–4 M, Sigma Chemical Co.) enthielt, resuspendiert und mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/Vertiefung in 96-Loch-Gewebekulturplatten auf Thymozyten als "Feeder Layer" ausplattiert. In den meisten Fällen wurde nur ein Teil der Fusion ausplattiert und der Rest der Fusion wurde eingefroren. Nach 12–14 Tagen wurden die Überstände von Vertiefungen mit wachsenden Hybriden auf die Anwesenheit spezifischer Antikörper getestet (siehe nachfolgendes Beispiel 4).
Vertiefungen mit positiven Hybriden wurden in komplettem Medium, das Hypoxanthin enthielt, in 24-Loch-Platten überführt. Diejenigen Hybride, die Antikörper produzierten, die als interessant angesehen wurden, wurden mittels Klonierung durch limitierende Verdünnung stabilisiert, bis eine stabile Antikörperproduktion erreicht war.
Sowohl Überstände von Hybriden, die in serumfreiem Medium wuchsen, als auch Aszitesflüssigkeit, die aus mit Pristane gespritzten Mäusen erhalten wurde, wurden als Antikörperquelle verwendet.
Beispiel 4. Screening und Charakterisierung der monoklonalen Antikörper
4.1 Antikörper-Capture-Enzyme-Linked-Immunoassay (EIA)
Die synthetischen Peptide MCP1RB (24–28) und (273–292) (3 μg/ml in PBS, 100 ml/Vertiefung) wurden an Mikrotiterplatten (Maxi-sorb, Nunc) über Nacht bei 4°C adsorbiert. Verbleibende Proteinbindungsstellen wurden mit 0,5% BSA in PBS blockiert (200 μl/Vertiefung, 60 min bei 37°C). Nach Waschen der Platten mit destilliertem Wasser wurden monoklonale Antikörper 60 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von einem Peroxidase-markierten Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (GAM-PO, Tago Inc.) und OPD (Sigma Chemical Co.). Die Reaktion wurde mit 3 N Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte wurde bei 492 nm bestimmt.
4.2 Isotypenbestimmung
Der Isotyp von jedem Antikörper wurde im EIA über Nacht bei 4°C bestimmt, wobei affinitätsgereinigte Ziege-anti-Maus-Immungobulin-Antikörper verwendet wurden, die an einer festen Phase adsorbiert waren (2,5 μg/ml in PBS, 100 μl/Vertiefung). Nach Blockieren mit BSA wurden die monoklonalen Antikörper 60 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von Subklassen-spezifischem anti-Maus-Ig, Peroxidase-markierten Antikörpern (Southern Biotechnologies Associates, Inc. USA) und OPD. Die Reaktion wurde mit 3 N Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte wurde bei 492 nm bestimmt.
4.3 Analyse mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS-Analyse)
THP-1- oder Mono-Mac-1-Zellen, die den MCP-1-Rezeptor exprimierten, wurden zentrifugiert (1000 rpm, 10 min bei Raumtemperatur), in 96-Loch-Platten mit V-Boden plattiert (250.000 Zellen/Vertiefung) und mit 50 μl/Vertiefung der verschiedenen unverdünnten Überstände (aus Beispiel 3) 60 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal durch Zentrifugation mit PBS, das 2% BSA und 2% FCS enthielt, gewaschen (750 rpm, 5 min bei 4°C). Dann wurde Ziege-anti-Maus-FITC-Konjugat zugegeben und 30 min bei 4°C inkubiert und zweimal gewaschen. Zellgebundene Fluoreszenz wurde in einem Profile XL fluoreszenzaktivierten Zellsortierer bestimmt.
4.4 Calciumbestimmungen
Änderungen in der intrazellulären Calciumkonzentration wurden mit der fluoreszierenden Sonde Fluo-3 (Calbiochem) verfolgt. Mono-Mac-1-Zellen (2,5 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in komplettem Medium, das 10 nM HEPES enthielt, resuspendiert und mit 2 ml/10⁶ Zellen Fluo-3 (250 mM in DMSO) 15 min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und in komplettem Medium, das 2 mM CaCl₂ enthielt, resuspendiert und bei 37°C gehalten, bevor eine Reihe verschiedener Ligandenkonzentrationen zugegeben wurde (Chemokin oder monoklonaler Antikörper in PBS). Die Calciumfreisetzung in Reaktion auf Cytokine oder monoklonalen Antikörper wurde mittels FACS bei 525 nm bestimmt, was die Bindung des Rezeptors an den Liganden zeigte.
Zur Bestimmung der Antagonistenaktivität des entsprechenden mAb wurden Mono-Mac-1-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen Ammoniumsulfat-gereinigter Antikörper in RPMI (Standardmedium) 30 min bei 4°C vorinkubiert. Nach Waschen wurden die Zellen mit Fluo-3 beladen und die Calciumfreisetzung wurde wie oben bestimmt.
4.5 Immunpräzipitation und Western Blot
Mono-Mac-1-Zellen, THP-1-Zellen, humane PBL- und Rattenmilzzellen wurden abzentrifugiert und in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM DTT-Puffer, der einen Cocktail aus Proteaseinhibitoren enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden 3–5 Zyklen von Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen unterworfen. Dann wurden die Zellen bei 1500 rpm 2 min bei 4°C zentrifugiert und das Pellet wurde verworfen. Der verbliebene Überstand wurde bei 12.500 rpm bei 4°C 15 min zentrifugiert und das Pellet in PBS resuspendiert. Lysate wurden unter reduzierenden Bedingungen auf 12,5%igen (w/v) SDS-Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli, UK et al. (Nature 227, 680–85, 1970) laufen gelassen. Die Gele wurden 60 min bei 250 mA in einem Puffer mit 48 mM Tris-Base, 39 mM Glycin, 20% Methanol, der 0,037 SDS enthielt, auf Nitrocellulose auf einem Semi-Dry-Blotter (Bio-Rad) transferiert. Nach Blockieren der Membran mit 10%iger fettfreier Trockenmilch in PBS wurden die monoklonalen Antikörper unter Schütteln 120 min bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einem 1/5000 verdünnten Peroxidase-markierten Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (ICN). Der Blot wurde mit ECL (Amersham) entwickelt, wobei der Anleitung des Herstellers gefolgt wurde.
Die Immunpräzipitation wurde wie beschrieben durchgeführt (30). Kurz gesagt wurden Proteinextrakte durch 60 min Inkubation mit 20 μg/10⁷ Zellen anti-Maus-IgG-Agarose (Sigma) bei 4°C und Zentrifugation (1 min, 15.000 × g) vorgeklärt. Der Überstand wurde dann mit mAb MCP-1R03 (5 mg/ml in PBS) 90 min bei 4°C inkubiert, gefolgt von 60 min Inkubation mit 20 μg/10⁷ Zellen anti-Maus-IgG-Agarose. Die Proben wurden bei 15.000 × g 15 min bei 4°C zentrifugiert, und das Agarosepellet wurde zweimal mit Lysispuffer und dreimal mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, gewaschen (15.000 × g, 1 min bei 4°C), in Laemmli-Puffer resuspendiert und einer Elektrophorese unterworfen.
4.6 Reinigung von Antikörpern
Antikörper wurden durch Fällung mit 50% Ammoniumsulfat und/oder durch Affinitätschromatographie von Aszitesflüssigkeiten oder Überständen entsprechender Hybride, die in serumfreiem Medium gezüchtet worden waren (0–1% FCS in Ultradoma-Medium, Gibco), an an Sepharose immobilisiertem Protein A (Pharmacia, Schweden) gereinigt.
4.7 Chemotaxis
Mit Nycoprep^TM gereinigte humane Monozyten von Mono-Mac-1-Zellen wurden in die obere Kammer von 24-Loch-Transmigrationskammern (Transwell, Costar, Cambridge MA) gegeben, die zuvor mit Maus-Hirnendothelzellen beschichtet worden waren (50.000 Zellen/Vertiefung, 48 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ oder bis zur Konfluenz). Chemokine oder Agonistenantikörper wurden, verdünnt in RPMI, 0,25% BSA, in die untere Kammer gegeben. Die Platten wurden 120 min bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert, dann wurden die Einsätze aus den Kammern entfernt und Zellen, die zur unteren Kammer gewandert waren, wurden gezählt.
Zur Blockierung von MCP-1-induzierter Chemotaxis wurden gleichzeitig mit der Zugabe von Chemokinen zur unteren Kammer verschiedene Konzentrationen an gereinigtem mAb in PBS in die obere Kammer gegeben. Die Chemotaxis wurde wie oben verfolgt.
Beispiel 5. Ergebnisse
Zwei der Seren erkannten Mono-Mac-1-Zellen bei der FACS (Tabelle 1), und die entsprechenden Mäuse wurden anschließend für Zellfusionen verwendet. Nach Fusion wurden Hybride, die Antikörper produzierten, die ungekoppeltes synthetisches Peptid im EIA banden und bei der FACS positive Ergebnisse lieferten, selektiert und stabilisiert (Tabelle II).
Es wurden sechs stabilisierte monoklonale Antikörper charakterisiert, um ihre Fähigkeit, den MCP-1-Rezeptor in Lysaten von Mono-Mac-1-Zellen zu erkennen, durch Immunpräzipitation des MCP-1-Rezeptors sowie im Western Blot zu bestimmen. Außerdem wurde auch ihre Fähigkeit, als Agonist oder Antagonist des MCP-1 zu fungieren, charakterisiert.
Die Hauptmerkmale dieser mAb's sind in Tabelle III zusammengefaßt. Alle sechs mAb's erkennen bei der FACS Mono-Mac-1- und THP-1-Zellen (1). Die x-Achse gibt den Logarithmus der relativen Fluoreszenzintensität wieder und die y-Achse gibt die relative Zellzahl an.
Das durch Western Blot erkannte Protein entspricht einem 32 kDa-Protein in den eingesetzten T-Zelltypen (humane monozytische Zellinien und humane Monozyten). Eine Western Blot-Analyse zeigt, daß MCPR-02 und MCPR-05 in der Lage sind, den auf Cellulosemembran immobilisierten Rezeptor für humanes MCP-1 und für MCP-1 von Ratten zu binden.
Alle sechs mAb's erkennen THP-1- und Mono-Mac-1-Zellen bei der Analyse mittels Durchflußzytometrie. Einer, MCPR-05, erkennt bei Western Blot-Analyse auch eine spezifische 32 kDa-Bande in beiden Zellinien sowie in PBL und von Tonsillen stammenden Lymphozyten, die durch das (273–292)- Peptid verdrängt wird; mAb MCPR-03 immunpräzipitiert das gleiche 32 kDa-Protein von Mono-Mac-1-Zellen. Die Spezifität der monoklonalen Antikörper für CCR2 wurde bereits im Western Blot und durch Analyse mittels Durchflußzytometrie mit CCR2-transfizierten 293-Zellen, von denen bekannt ist, daß sie die CCR2-Chemokinrezeptoren nicht exprimieren, sowie in Jurkat-Zellen, die verschiedene Chemokinrezeptoren (CCR3, CCR5 und Fusin), aber nicht CCR2 exprimieren, gezeigt. Obwohl keine der beiden Zellinie bei der Durchflußzytometrie oder im Western Blot von irgendeinem dieser Antikörper erkannt wurde, sind beide nach Transfektion mit dem CCR2-Gen klar positiv.
Analyse von humanen PBLs mittels Durchflußzytometrie zeigt, daß diese mAb's CD-11b, PBLs, erkennen. Ein mAb, MCPR-05, erkennt auch periphere Blutleukozyten und Splenozyten von Ratten, die mit den monoklonalen Antikörpern ED1 und ED2 positiv färben (Serotec). Der monoklonale Maus-Antikörper ED1 erkennt Rattenmonozyten und -makrophagen, wogegen der monoklonale Maus-Antikörper ED2 Rattenmakrophagen erkennt.
Drei mAb's (MCPR-04, -05 und -06) wirken als Antagonisten des Rezeptors, da sie den MCP-1-induzierten Calciumstrom in Mono-Mac-1-Zellen blockieren (2). Die Antikörper mit Antagonistenaktivität erkennen den dritten extrazellulären Loop des Rezeptors (As 273–292), während der Agonistenantikörper die aminoterminale Region (As 24–38) erkennt.
Ein mAb (MCPR-02) wirkt, basierend auf Calciumbestimmungen, als Agonist des MCP-1-Rezeptors. Nach Stimulation mit dem mAb MCPR-02 wurde ein rascher und transienter Anstieg der Ca²⁺-Konzentration in Mono-Mac-1-Zellen beobachtet. Die Vorbehandlung der Zellen mit diesem mAb führte zu einer deutlichen Abnahme der Responsivität gegenüber MCP-1, was zeigt, daß die Empfindlichkeit der Calciumreaktion herabgesetzt ist (3f).
Chemotaxis. Mono-Mac-1-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an MCPR-05 vorinkubiert und auf die obere Kammer von mit mit Endothelzellen beschichteten Transwells gegeben, und MCP-1 (1 nM) wurde in die untere Vertiefung gegeben (4a). Zellen, die zur unteren Vertiefung gewandert waren, wurden gezählt und als Migrationsindex (M.I.) ausgedrückt, der als die x-fache Zunahme der Migration, die gegenüber der negativen Kontrolle (Medium) beobachtet wurde, berechnet wurde. Für die Konzentrationen 100 und 1000 nM wurde bei dem Antagonistenantikörper MCPR-05 eine signifikante Reduktion der Chemotaxis von Mono-Mac-1-Zellen beobachtet. 4b zeigt die Wirkung einer Verdünnung des mAb MCPR-02 auf die Migration von Mono-Mac-1-Zellen unter den gleichen Bedingungen.
CCR2 wird in Monozyten, ruhenden B-Zellen und aktivierten T-Zellen exprimiert.
Basierend auf der Spezifität dieser mAb's haben wir die Population humaner mononukleärer peripherer Blutzellen, die den CCR2 exprimieren, festgestellt. Ruhende sowie PHA- oder Ionophoren-aktivierte PBMC wurden mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung von Zweifarbenfärbung in Verbindung mit Markern, die für Monozyten/Makrophagen, B-Zellen und T-Zellen spezifisch sind, getestet. In unbehandelten Zellen erkannte der mAb 100% der CD11b⁺-, CD13⁺- und CD14⁺-Zellen in der Monozyten/Makrophagen-Population, basierend auf Analyse mittels Vorwärts- und Seitwärtsstreuung. Anti-CCR2-Antikörper banden an 50% aller CD19⁺-Zellen, während bei CD3⁺-Zellen nur Bindung in Spuren oder überhaupt keine Bindung beobachtet wurde. Dies zeigt eine Expression des CCR2-Chemokinrezeptors in Monozyten und B-Zellen, aber nicht in T-Zellen. Ruhende und aktivierte, von Tonsillen stammende Lymphozyten wurden verwendet, um diese Daten zu bestätigen, was zeigte, daß tatsächlich alle Monozyten/Makrophagen und die Mehrzahl der B-Zellen in Milz und Tonsillen durch anti-CCR2-Antikörper gefärbt werden (5a und 5b). Nach Aktivierung exprimieren 30–45% der CD4⁺- und 20–40% der CD8⁺-Zellen den CCR2-Rezeptor, während seine Expression in B-Zellen von Tonsillen und peripherem Blut unverändert ist, was eine aktivierungs-abhängige CCR2-Expression in T-Zellen anzeigt. Keine Modifikationen in der Rezeptorexpression sind nach Aktivierung in B-Zellen zu beobachten, ungeachtet ihrer Herkunft aus PBL oder Tonsillen. Die 5a und 5b fassen die Zellpopulationen zusammen, die den CCR2-Chemokinrezeptor in Tonsillen und PBL exprimieren.
Die 6a bis 6c zeigen, daß MCPR-05 den MCP-3-induzierten Ca²⁺-Influx und die Transmigration von Mono-Mac-1-Zellen blockiert. Calcium-Influx wurde mit 3 nM MCP-3 induziert. Die Wirkung der Vorinkubation mit dem Antagonisten-mAb MCPR-05 auf den MCP-3-induzierten Ca²+-Influx dieser Zellen ist in den 6a und 6b gezeigt und die Transmigration ist in 6c gezeigt, jeweils im Vergleich mit einem Isotypen-gematchten Kontroll-mAb (hGH5). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert eines dreifach durchgeführten repräsentativen Experiments dar.
Der Mono-Mac-1-Antagonistenantikörper MCPR-02 rief eine signifikante chemotaktische Reaktion auf Mono-Mac-1-Zellen bei Verdünnungen von 1/2 und 1/6 hervor.
Diskussion
Wir haben demnach mAb's erhalten, die in der Lage sind, die MCP-1-Aktivität zu neutralisieren, und mAb's, die die MCP-1-Aktivität imitieren. Diese beiden Eigenschaften stehen deutlich mit zwei Regionen des MCP-1-Rezeptors in Zusammenhang. Die blockierenden mAb's erkennen Sequenzen, die sich im dritten extrazellulären Loop des Rezeptors befinden, was mit Regionen korrelieren könnte, die an der Bindung von MCP-1 beteiligt sind, während die Agonistenaktivität in der N-terminalen Region des Rezeptors kartiert und mit Regionen korrelieren sollte, die für die Funktion des Rezeptors benötigt werden.
Wir haben also Antikörper gefunden, die in der Lage sind, an den MCP-1-Rezeptor zu binden und von denen einige Agonisten (MCPR-02) und einige Antagonisten (MCPR-04, MCPR-05 und MCPR-06) sind. Diese Entdeckungen müssen als sehr überraschend angesehen werden und sind für die Verwendung als Medikament sehr interessant und vielversprechend.
Alle beschriebenen Antikörper, die den MCP-1-Rezeptor erkennen, können für Diagnosezwecke in vivo nützlich sein.
Zwei der gefundenen Antikörper (MCPR-02 und MCPR-05) sind in der Lage, den MCP-1-Rezeptor bei einer Immunpräzipitation im Zusammenhang mit einem biologischen Gewebes zu binden und können bei Immunoblot-Experimenten auch den an eine künstliche Membran gebundenen Rezeptor erkennen. Die Antikörper können für Diagnosezwecke in vitro nützlich sein, die immobilisierte Antigene beinhalten.
Wir beschreiben also ein Reihe monoklonaler Antikörper, die für den humanen CCR2 spezifisch sind, die mit synthetischen Peptiden der dritten extrazellulären Domäne (Aminosäurereste 273–292) und der aminoterminalen Region (Reste 24–38) dieses Rezeptors erhalten wurden. Bei Analysen mittels Durchflußzytometrie und Western Blot erkennen diese mAb's CCR2-transfizierte Jurkatt- und 293-Zellen, während es bei scheintransfizierten Zellen keine Erkennung gibt. Kürzlich wurde gezeigt, daß mehrere CC (CCR2, 3, 4 und 5)- und CXC (Fusin)-Chemokinrezeptoren als die Corezeptoren wirken, die für Zellfusion und HIV-Infektion von Zellen erforderlich sind. Dies hat das Interesse an dieser Rezeptorfamilie als mögliches Ziel zum Verhindern der Folgen einer HIV-Infektion (22–27) gesteigert. Wir haben ferner beschrieben, daß CCR2 als ein HIV-1-Corezeptor fungiert, was zeigt, daß MCP-1 eine HIV-1-neutralisierende Aktivität aufweist (eingereicht). Zusätzlich fördert der MCPR-02-mAb eine HIV-1-Neutralisierung, während der MCP-1-Antagonisten-mAb MCPR-05 das Virus nicht neutralisiert, sondern eine MCP-1-induzierte Neutralisierung wirksam blockiert. Da der MCPR-04- und der -R-05-mAb eine HIV-Infektion nicht blockieren, weisen diese Daten darauf hin, daß HIV-1 mit der NH₂-terminalen Domäne des CCR2-Rezeptors in Wechselwirkung tritt. Da der mAb MCPR-02 sowie das MCP-1-Chemokin eine HIV-1-Infektion blockieren, vertreten wir schließlich die Auffassung, daß HIV-1 mit der inaktiven Form des Rezeptors, aber nicht mit der aktiven Form in Wechselwirkung tritt.
Tabelle I
Tabelle II
Tabelle III

Claims

Antikörper, welcher in der Lage ist, den Rezeptor CCR2 für Monozyten-chemotaktisches Protein 1 (MCP-1) zu binden, welcher (a) die extrazelluläre aminoterminale Region des Rezeptors erkennt und als funktioneller Agonist wirkt oder (b) Aminosäuresequenzen erkennt, die sich im dritten extrazellulären Loop des Rezeptors befinden, und als funktioneller Rezeptorantagonist wirkt.
Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 1, welcher Sequenzen erkennt, die sich im dritten extrazellulären Loop des Rezeptors befinden, und welcher die Aminosäurereste 273–292 des Rezeptors erkennt.
Antikörper nach Anspruch 1, welcher die extrazelluläre aminoterminale Region des Rezeptors erkennt und welcher die Aminosäurereste 24–38 des Rezeptors erkennt.
Antikörper nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welcher in der Lage ist, den MCP-1-Rezeptor zu binden, und welcher zur Immunpräzipitation des MCP-1-Rezeptors im Zusammenhang mit Zellen oder biologischen Geweben in der Lage ist und welcher zum Nachweis des an eine künstliche Membran adsorbierten MCP-1-Rezeptors in der Lage ist.
Antikörper nach Anspruch 5, welcher ferner Mono-Mac-1- und THP1-Zellen, die den MCP-1-Rezeptor exprimieren, gemäß Immunfluoreszenz erkennt.
Verwendung eines Antikörpers nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur in vitro-Diagose.
Verwendung eines Antikörpers nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zum in vitro-Screening und -Nachweis von Geweben und Zellklassen, die den MCP-1-Rezeptor exprimieren.
Verwendung eines Antikörpers nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zum in vitro-Screening auf neue Wirkstoffe.
Antikörperpräparat, umfassend Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6.
Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur therapeutischen Verwendung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 und einen Trägerstoff.
Mikroorganismus oder Zelllinie, welche in der Lage sind, den Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zu produzieren.
Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als in vivo-Diagostikum.
Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Mittel zum in vivo-Screenen auf neue Wirkstoffe.