JP2000510685A

JP2000510685A - 単球化学誘引タンパク質１（ｍｃｐ―１）レセプター（ｃｃｒ２）に結合する抗体

Info

Publication number: JP2000510685A
Application number: JP09530879A
Authority: JP
Inventors: リンド，ペーター; マルティネズ，アロンソ，カルロス; マリオメラード，ガルシア，ホセ; ミゲルロドリゲス，フレイド，ホセ
Original assignee: コンセジョスペリオールデインベスティガシオネスサイエンティフィカス
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2000-08-22
Also published as: WO1997031949A1; DE69727382D1; ATE258560T1; EP0914345B1; EP0914345A1; US6084075A; ES2210496T3; DK0914345T3; SE9600820D0; AU2110497A; PT914345E; DE69727382T2; AU724037B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）レセプターＣＣＲ２に結合することのできる、特にアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することのできる抗体に関する。請求の範囲に記載の抗体は、インビトロ診断および／またはインビボ診断、ＭＣＰ−１レセプターを発現する組織および細胞クラスのスクリーニング、新薬のスクリーニングならびに治療用途に使用することができる。本発明はまた、請求の範囲に記載の抗体を含む製剤、請求の範囲に記載の抗体を産生することのできる微生物または細胞系に関する。

Description

【発明の詳細な説明】単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１）レセプター（ＣＣＲ２）に結合する抗体発明の分野本発明は、概して、単球化学誘引タンパク質１(ＭＣＰ−１)レセプターＣＣＲ２に結合することのできる抗体に関する。さらに詳細には、本発明は、ＭＣＰ−１およびレセプター結合における天然のリガンドと競合し、ＭＣＰ−１レセプターの細胞外領域と相互作用をする、特にモノクローナル抗体を含む抗体を含む、ケモカイン単球化学誘引タンパク質１( ＭＣＰ−１)レセプターＣＣＲ２に作用するアゴニストおよびアンタゴニストに関する。発明の背景ケモカインは、特に炎症状態における免疫反応の活性化において、多くの異なる種類の白血球の走化性遊走および活性化を調節する小さな分泌性の塩基性タンパク質の多様性のある一群である。ケモカインにより走化的に反応し活性化されることが判明している細胞の例は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、さらにＢリンパ球および異なる種類のＴリンパ球である(Oppenheim,J.J.,et al.(1991)Annu．Rev.Immuno l．9,617-48;Miller,M.D.& Krangel,S.K.(1992)Crit.Rev.Immunol.12（1,2）17- 46:Baggiolini,M.,et al.(1994)Adv.Immunol.55,97-179)。ケモカインは、成熟タンパク質内のジスルフィド結合形成に関与するシステイニル残基のパターンに基づいて二種類の主なグループに分類できる。第一のグループ、ＣＸＣケモカインまたはａ−ケモカインは、アミノ末端領域に二つのシステイニル残基があることを特徴とし、その間には別のアミノ酸残基が位置している。第二のグループ、ＣＣケモカインまたはｂ−ケモカインは、アミノ末端領域に二つのシステイニル残基が隣り合わせて存在することを特徴とする。マウスおよびヒトから単離されているリンホタクチン(lymphotactin)(Kelner, G.S.et al.(1994)Science 266,1395-9;Kennedy,J.,et al.(1995)J.Immunol.155, 203-9)に代表される第三のあまり大きくないグループは、おそらく成熟タンパク質中において単一のジスルフィド結合を形成していると考えられる二つのシステイン残基のみが存在することを特徴とする。これまでのところ、これらが、いわゆるＣタイプケモカインの唯一の例である。ＣＸＣケモカイン、特にそのアミノ末端にＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するＣＸＣケモカインは、主に好中球に対して作用する。好中球に対して作用するＣＸＣケモカインの例は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＧＲＯ−α、−βおよび−γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−78、ならびにＧＣＰ−２である。ＣＣケモカインは、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ならびにＴおよびＢリンパ球などのさらに多岐にわたる白血球に作用する。これらの例は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、エオタキシン、RANTES、Ｉ−３０９である。後者は、成熟タンパク質中においておそらく第三のジスルフィド結合を形成すると考えられる二つのさらなるシステイニル残基を有している。ＭＣＰ−１または単球化学誘引タンパク質１は、もともとフィトヘマグルチニンで刺激したヒトリンパ球(Yoshimura,T.et al.(1989)J.Immunol,142,1956-62) 、ヒトグリオーム細胞系(Yoshimura,T.et al.(1989)J.Exp.Med.169,1449-59)、ヒト骨髄単球細胞系ＴＨＰ−１(Matsushima,K.，et al.(1989)J.Exp.Med.169,14 85-90)から精製されたものである。ＭＣＰ−１は、また、ＭＣＡＦ、ＬＤＣＦ、ＧＤＣＦ、ＨＣ１１、ＴＳＧ−８、ＳＣＹＡ２およびＡ２とも呼ばれている。ＭＣＰ−１をコードするｃＤＮＡの分子クローニング(Furutani，Y.，et al．(19 89)Biochem.Biophys.Res.Comm.169.249-55;Rollins B.J.,et al.(1989)Mol.Cel l.Biol.9,4687-95;Chang,H.C.,et al.(1989)Int.Immunol.1,388-97)より、２３個のアミノ酸のシグナルペプチドを含む、９９個のアミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかになった。ＭＣＰ−１は、単球、および内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞、ケラチノサイト、メサンギウム細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞のような種々の組織細胞により、ならびに多数の腫瘍細胞により産生される（Baggio lini,M.,et al.(1994)Adv.Immunol.55,97-179およびこの文献中の参考文献）。その発現は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、リポポリサッカライド、およびＧＭ−ＣＳＦなどのいくつかの種類の前炎症剤（pro-inflammatory agent ）によって刺激される。ＭＣＰ−１は、アテローム性動脈硬化の病因において重要な役割を担っていることが示唆されている。アテローム性硬化病巣における大半の細胞が、リピッドを負荷したマクロフアージ、いわゆる泡沫細胞で構成され、これらの細胞から、および活性化された内皮からのＭＣＰ−１を経由する活発な単球の増加が、脂肪ストリークおよびアテローム性プラークを形成する中心的な役割を果たすことが示唆されている(Yla-Herttuala,S.,et al.(1991)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 88(12),5252-6;Schwartz,C.J.,et al.(1993)Am.J.Cardiol.71(6 ),9B-14B;Takeya,M.(1993)Hum.pathol.24(5),534-9)。リューマチ様関節炎の患者の滑膜液および血漿中において、ＭＣＰ−１の濃度が、他の関節疾患に比べて増大することが示されており、この主な供給源は構成的にＭＣＰ−１を発現するマクロファージである。リューマチ患者の滑液中においては、ＭＣＰ−１はＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αなどの他の炎症性のサイトカイン(cytokines)と同様にリューマチ様関節炎の免疫学的病因に寄与している(Koch,A.E.(1992)J.Clin.Invest.90,772-79;Hosaka,S.et al .（1994）Clin.Exp.Immunol.97,451-7;Akahoshi,T.,et al.(1993;)Arthritis.Rh eum.36,762-71;Harigai,M.,et al.(1993)Clin.Immunol.Immunopathol.69,83-91) 。ＩｇＡ免疫複合体の介在する単核貪食細胞依存性の肺損傷は、単核および貪食細胞の蓄積を特徴とし、ＭＣＰ−１の発現に大きく依存していることが示されている(Jones,M.L.,et al.(1992)J.Imunol,149,2147-54)。同様に、ＭＣＰ−１は、特発性肺線維症およびサルコイドーシスの病因において重要な役割を果たしているようである(IyonagaK,et al.(1994)Hum.Pathol.24,455-63;Car,B.D.,et al( 1994)Am.J.respir.Crit..Care.Med.149,655-9)。動物モデルにおいて、ＭＣＰ−１は、限局性虚血後の脳において(Kim,J.S.,（ 1995）J.Neuroimmunol.56,127-34;Wang,X.,et al.(1995)Stroke 26,661-5)、および実験的な自己免疫脳脊髄炎において(Hulkower,K.,et al.(1993)J.Immunol.150 ,2525-33;Ransohoff,R M.,et al.(1993)7,592-600)発現されることが示されている。ＭＣＰ−１は、卒中や多発性硬化症などのこれらの動物モデルにより説明される疾患プロセスにおいて、単球を標的とする重要なサイトカインである可能性がある。乾癬病巣において、ＭＣＰ−１は増殖するケラチノサイトと真皮マクロファージとの相互作用を制御すると考えられ、真皮／表皮接合部の上に存在する場合がある。さらにこれらのタイプの病巣内への好中球の浸潤に重要であるIL-8に加えて、ＭＣＰ−１も単核球細胞の増大を支援している可能性がある(Schroder，J.M .（1992）Arch.Dermatol.Res 284 Suppl 1,S22-6;Gillitzer,R.,et al.(1993)J. Invest.Dermatol.101,127-31)。ＭＣＰ−１は、多くの固形ガンにおいて観察される単核球細胞浸潤の制御に関与すると考えられる。腫瘍関連性のＭＣＰ−１産生と腫瘍関連性のマクロファージの数及び増殖活性との間に相関があることが証明されている(Walter，S.，et al.（1991）Pathobiology 59(4),239-42;Mantovani,A.,et al.(1994)Adv.Exp.Me d.Biol.351，47-54)。マウスに移植されたサルコーマ細胞を使用して、高濃度のＭＣＰ−１を発現している細胞はより緩慢に増殖すること、およびこれが腫瘍関連性のマクロファージの数に関係があることが証明されている(Walter,S.,et al .(1991)Int.J.Cancer,49,431-5)。同様に、ＭＣＰ−１を発現するように操作されたネズミ大腸癌細胞では、転移の可能性が低い(Huang，S.，et al．(1994)Can cer Immunol.Immunother.39,231-8)。ＭＣＰ−１は、単球の強力な化学誘引および活性化ファクターであり、走化性、カルシウムフラックス(flux)およびレスピラトリーバーストを誘発し、ピコモルのレベルで活性を示す(Yoshimura,T.& Leonard,E.J.(1990)J.Immunol.154,292 -97;Zachariae,C.O.C.,et al.(1990)J.Exp.Med.171,2177-82;Rollins,B.,et al. (1991)Blood 78,1112-6;Vaddi,K.& Newton,R.C.(1994)J.Leukoc.Biol.55,756-62 )。ＭＣＰ−１はまた、一時的な時間経過において、CD11b/CD18およびCD11c/CD1 8を高い方向へ制御し、これは炎症における内皮を横断する遊走を支援すると考えられる(Jiang,Y,et al.(1992)J.Immunol.148,2423-8;Vaddi,K.& Newton,R.C.( 1994)J. Immunol 153,4721-32)。単球に加えて、インビトロおよびインビボにおいて、ＭＣＰ−１がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球に対して、化学誘引物質として作用することが、最近、明らかになった(Loetscher，P.，et al．(1994)FASEB J．8，1055-60;Carr，M.W .，et al．(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91，3652-6;Taub，D.D.，et al ．(1995)95，1370-6)。インターロイキン−２によって刺激されたナチュラルキラー細胞もまた、ＭＣＰ−１による走化性を受ける（Maghazachi，A.A.，et al ．(1994)J．Immunol．153，4969-77;Allaven，P.，et al．(1994)Eur.J．Immuno l．24，3233-6)。これは、炎症病巣中の細胞の増大作用におけるこのケモカイン (chemokine)の重要性を強めるものである。単球およびＴリンパ球に対する作用に加えて、ＭＣＰ−１は、ヒスタミンおよびロイコトリエンなどのアレルギーメディエーターの好塩基球からの放出の中程度の化学誘引物質および強力なアクチベーターである(Kuna，P.，et al．(1992) J.Exp.Med.175,489-93;Bischoff,S.C.,et al.(1992)J.Exp.Med.175,1271-7;Bisc hoff,S.C.,et al.(1993)Eur.J.Immunol.23,761-7)。好塩基球と反対に、アレルギー性炎症の病巣に関連するもうひとつの顆粒球は、ＭＣＰ−１に反応しない(R ot,A，et al.(1992)J.Exp.Med.176,1489-95)。ＭＣＰ−１に対しては、一つのレセプターが存在し、これはカルボキシ末端領域をコードするmRNAの異なるスプライシングによる二つのわずかに異なる形態、ＭＣＰ−１-ＲＡおよびＭＣＰ−１ＲＢ、で発現されると考えられる(Charo，I.F .,et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,2752-56)。これらのレセプター（ＣＣＲ２）は、単球、骨髄性前駆細胞および活性化Ｔリンパ球内において発現される(Myers，S.J.，et al．1995，J．Biol．Chem.，270 ,5786-5792，Qin，S．et al．1996．Eur．J．Immunol．26，640-647)。これらは、ケモカイン−レセプター相互作用の分子的基礎を定めること、および様々な疾患プロセスにおける単球核／マクロファージ浸潤の制御におけるＭＣＰ−１の役割を解明することにおいて、有効な手段を提供するものである。ＭＣＰ−１レセプターは、７のトランスメンブランタイプのタンパク質に属し、MIP-1α/RANTES(CC-CKR1;Neote,K.et al.(1993)Cell 72,415-25)およびインターロイキン−８／ＧＲＯ(Holmes，W.E.，et al．(1991)Science 253，1278-80;Mur phy,P.M.& Tiffany,H.L.(1991)Science 253,1280-3)のレセプターと同族である。ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトさせたレセプターに対するＭＣＰ−１の解離定数は、０．２６ｎＭで、これは単球において測定された値と矛盾しない (Mycrs,S.J.et al.(1995)J.Biol.Chem.270,5786-92;Van Riper,G.et al.(1993)J .Exp．Med．177，851-6)。トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞上のＭＣＰ −１ＲＢレセプターのＭＣＰ−１による活性化により、アデニリルシクラーゼが９０ｐＭの濃度で阻害され、これより少し高い濃度で細胞内カルシウムを移動させ、ホスファチジルイノシトールの加水分解とは独立しているようである。アデニリルシクラーゼおよび細胞内カルシウム放出に対する作用は、百日咳毒素により、強く阻害を受け、シグナル伝達へのGiタイプのヘテロトリメリックG-タンパク質の関与を示唆するものである（Meyers，S.J．et al.，(1995)J．Biol．Chem ．270,5786-92)。ＨＩＶ−１コレセブターとしてのケモカインレセプターおよびＨＩＶ−１感染の中和剤としてのケモカインの最近の記載は、これらの分子にＨＩＶ−１病因における鍵となる役割を与えている(Doranz,B.J et al.1996,Cell 85,1149-1158;F eng,Y et al.1996.Science 272,872-877;Deng,H et al.1996,Nature 381,661-66 6;Cocchi,F et al．1995，Science 270，1811-1815;Choe，H et al．1996，Cell 85，1135-1148;Alkthatib,G et al.1996,Science 272,1955-1958)。ケモカインおよびＨＩＶ−１がケモカインレセプターと相互作用する様子を解明するため、異なるＨＩＶ−１株を異なる末梢血単球（ＰＢＭＣ）集団に作用させるにあたり、どのレセプターが重要であるか、およびどの段階で（結合、脱感作、シグナル伝達）この相互作用が起こるのかを測定するにあたり、特定の道具が必須である。 WO95/19436、ザ・リージェント・オブ・ユニバーシティ・オブ・カリフオルニアの特許出願は、ＭＣＰ−１レセプターの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列を記載している。この出願はまた、ＭＣＰ−１レセプターのアンタゴニストがＭＣＰ−１レセプターのN末端ドメインの発現およびＭＣＰ−１レセプタードメインの結合の喪失の検出により同定できることを記載している。開示される方法により同定されるＭＣＰ−１レセプターアンタゴニストを含む医薬組成物が特許請求されている。そのような同定は行われておらず、アンタゴニストも単離されていない。本発明者らは、マウスをいくつかの細胞外レセプタードメインに相当する合成ペプチドで免疫することにより、ＣＣＲ２ケモカインレセプターに特異的なｍＡｂを作成した。本発明者らは、ネイティブなＣＣＲ２レセプターを特異的に認識できるｍＡｂの作成について述べる。ヒトのPBMCおよび扁桃腺細胞上におけるＣＣＲ２の発現分析の結果、Ｂ細胞における発現が示され、これはしたがって単球および活性化Ｔ細胞における既知の発現に加えられるものである。このことは、Ｂ細胞におけるＭＣＰ−１の役割を示唆するものであろう。これらのｍＡｂは、ヒトの単球および単球細胞系における走化性およびＣａ²⁺誘導に基づいて、そのＭＣＰ−１活性をブロックおよび／または模擬する能力により特徴づけられる。これらのｍＡｂを使用して、本発明者らは、リガンド結合、およびこのレセプターを通じての反応の誘導に重要なＣＣＲ２領域を決定し、ケモカインシグナリングおよびこれらのタイプのレセプターの特異性の関係に関与する複雑なメカニズムを解明する一助となるかもしれない、これらの二つの活性の間の解離を示す。これらのｍＡｂのトリガーケモカインレセプターのいずれかに対する、またばケモカイン反応をブロックする能力に基づいて、本発明者らは、ケモカイン反応の本発明者らの現在の知識を考慮にいれたモデルを概説している。ＮＨ₂末端領域に対するものであるＩＬ−８レセプター中和抗体（３７）とは対照的に、本発明者らのアンタゴニスト活性を有するｍＡｂ（ＭＣＰＲ−０４、ＭＣＰＲ−０５）は、ＣＣＲ２レセプターの第三細胞外ループ領域に位置する。同様のペプチド特異性を有する別のｍＡｂ（ＭＣＰＲ−０３）は、レセプターに結合するが、ＭＣＰ−１活性をブロックしない。これらの抗体の中和活性は、このように、ケモカイン結合においてまたはケモカイン活性の調節において重要な役割を果たす、この領域内の２、３の鍵となる残基に限定される。先の研究では、ＣＸＣケモカインレセプターファミリーであるＩＬ−８ＲについてのケモカインレセプターＮＨ₂末端ドメインの重要性について結諭を出している。この違いについて、いくつかの説明が考えられる。まず、そのレセプターとＣＣケモカインの相互作用をコントロールする構造上の特徴は、ＣＸＣケモカインのそれとは異なる可能性があり、およびこの第三の細胞外ドメインの意味するところは、この差を反映しているのかもしれない。正式な結論諭を得るには、他のＣＣレセプターに対する中和抗体について調べる必要がある。第二は、アミノ末端特異的ｍＡｂ、例えばMCPR-02、がケモカイン応答を模擬できるという驚くべき事実である。これらから、本発明者らはこの領域がＣＣＲ２レセプターのアゴニスト活性化において重要であると考える。従って本発明者らは、ケモカインレセプターは、ＮＨ₂末端および第三の細胞外ループ領域に相当する二つの別個の機能性ドメインに構成されていると結論する。すべての既知のケモカインレセプターは、高いレベルの配列相同性を有し、多くのケモカインが１種以上のケモカインレセプターと相互反応する。このように、リガンド−レセプター相互作用は、別個のレセプターの同様の領域に関与すると考えられるが、シグナル伝達に示されるＮＨ₂末端ドメインにおいては異なる修飾を行っている。本発明者らの所見は、このように、ケモカインレセプターファミリー全体について推論され、ケモカイン−ケモカインレセプターシグナリングにおけるデジェネラシーの説明の一端となるものである。実験の部分において、本発明者らは、ネイティブなＭＣＰ−１レセプターを認識できるｍＡｂの作成ならびにそのＭＣＰ−１をブロックおよび／または模倣する能力、およびヒト単球および単球細胞系におけるＣａ²⁺誘導および走化性を含むそれらの特性評価について記載する。発明の概要本発明は、添付の請求の範囲に記載される通り、単球化学誘引タンパク質１( ＭＣＰ−１)レセプターＣＣＲ２に結合することのできる抗体、好ましくはモノクローナル抗体に関する。請求の範囲に記載される抗体は、レセプターの細胞外アミノ末端領域を認識し、レセプターの第三の細胞外ループに存在する配列を認識する。請求の範囲に記載される抗体は、インビトロ診断および／またはインビボ診断用途ならびに治療用途に使用することができる。本発明の他の態様は、ＭＣＰ−１レセプターを発現する組織および細胞クラスのスクリーニングおよび検出、ならびに新しい薬、例えば新しい抗炎症剤のスクリーニングにおける使用である。例えば、ＭＣＰ−１レセプターに結合することのできる放射標識抗体を、インビボにおいて体全体のなかにおける炎症プロセスが活性である部分、ここにはＭＣＰ−１レセプターをその表面に有する細胞種が蓄積しているが、を可視化するのに使用することができる。また、不均一な細胞集団を、ＭＣＰ−１レセプターを発現している細胞の存在を、免疫蛍光顕微鏡検査法または蛍光活性化セルソティングを使用することにより、インビトロで分析することができる。レセプターの特定の領域に結合している抗体の別の使用方法は、実験の部分において例証されるように、これらの抗体と置換するような形態でレセプターと相互作用することのできる低分子量物質のインビトロにおけるスクリーニングにおけるものである。例えば、レセプターのアミノ末端細胞外ドメインに結合する抗体は、これらの抗体が、生化学的に精製され、プラスチック皿中のウェルに固定されたＭＣＰ −１レセプター調製物と相互作用可能なように、放射活性標識、蛍光標識、酵素標識、またはアフィニティータッグによる標識をおこなうことができる。これらの抗体の低分子量物質との置換は、残存する結合した抗体または遊離の抗体を検出することにより、測定することができる。同様に、ＭＣＰ−１レセプターの他の細胞外領域と相互作用する抗体は、これらの抗体の結合に影響を与える化合物のスクリーニングに使用することができる。上記の抗体と置換する低分子量化合物は、ＭＣＰ−１レセプターの細胞外領域と結合することによりこれを行うと予想され、したがって作動および／または拮抗特性を有する。低分子量拮抗化合物は、インビボで投与した場合に抗炎症特性を与える可能性が期待され、炎症状態を治療する新しい薬として有用である可能性がある。本発明は、また、請求の範囲に記載される抗体を含む抗体製剤、および請求の範囲に記載される抗体および担体を含む医薬組成物に関する。その製剤は、治療において有効な量の抗体と薬学的に許容される担体とを含む。担体は、投与経路によって選択され、当業者によく知られている。担体も含み得るこの製剤は、特に炎症、リューマチ様関節炎、単球−貪食細胞依存性肺損傷、特発性肺線維症、サルコイドーシス、局所的虚血、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、多発性硬化症、乾癬病巣、腫瘍、および慢性移植拒絶などの疾患の治療において、請求の範囲に記載される抗体をこれらを必要とする患者に投与することにより、潜在的な治療における用途を有する可能性がある。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上にＭＣＰ−１のレセプターが存在するために、請求の範囲に記載される抗体は、リンパ球の介在する、腫瘍細胞または例えばＡＩＤＳを引き起こすウイルス感染細胞などの特定の細胞の破壊においても、活性を有し得る。抗体は、上記に開示される疾患を治療する医薬製剤の製造に使用される。ＭＣＰ−１レセプターのアゴニストである抗体は、また、一部が細胞またはＨＩＶ感染細胞に作用し、他方がアゴニストである二重特異性抗体としても使用することができる。二重特異性抗体に関する参考文献としては、例えば、AL Howel l et al.J.Leukoc.Biol.1994,Mar 55(3);385-91およびHaagen I.A.et al,Cancer .Immunonol.Immunother.1994,dec,39(6):391-6がある。請求の範囲に記載される抗体を産生することのできる微生物または細胞系もまた、本発明の一部である。ＭＣＰ−１レセプターに結合することのできるキメラまたは他の組み換え抗体、およびこれらの抗体の融合タンパク質誘導体、包合体誘導体または、フラグメント化誘導体は、本発明の一部である。特別な抗体ＭＣＰＲ−０１、ＭＣＰＲ−０３およびＭＣＰＲ−０６は以下に記載されるとおり、レセプターの特性評価に有用であり、ＭＣＰＲ−０２はレセプターアゴニスト、ＭＣＰＲ−０４およびＭＣＰＲ−０５はレセプターアンタゴニストである。ｍＡｂＭＣＰＲ−０２は、ＨＩＶ−１感染を中和するのに使用することができ、ｍＡｂＭＣＰＲ−０４およびＭＣＰＲ−０５は、ＭＣＰ−１の誘発するＨＩＶ−１中和をブロックするために使用することができる。本発明者らは、また数種類の白血球集団におけるＣＣＲ２レセプターを同定するため、およびリンパ球のこのレセプターの極性を同定するためにこれらのｍＡｂを使用している。これらのｍＡｂは、また、活性化後のＣＣＲ２レセプターにおけるコンフォメーションの変化を同定するのに使用することができる。二つの異なる機能ドメインの中に本発明者らの同定した配列を使用することにより、当業者は抗体を作成することができる。図面の簡単な説明図１ａから図１ｆは、蛍光活性化セルソーティングを使用した、選択されたモノクローナル抗体のＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞への結合を示す。各図は、それぞれＭＣＰＲ−０１からＭＣＰＲ−０６のモノクローナル抗体の一つの結合を示す。図２は、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞におけるＭＣＰ−１誘導カルシウム放出、ならびに、無関係のモノクローナル（ｍＡｂ−）、モノクローナル抗体ＭＣＰＲ −０４、モノクローナル抗体ＭＣＰＲ−０５およびモノクローナル抗体ＭＣＰＲ −０６とのプレインキュベーションの効果を示す。図３ａから図３ｆは、Ｃａ²⁺の動員(mobilization)を示す。Ｆｌｕｏ−３を添加したＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を、１００ｎＭの無関係なモノクローナル抗体（３ａ）またはＭＣＰＲ−０４（３ｂ）、ついで５ｎＭのＭＣＰ−１で順次刺激した。また、ＭＣＰ−１による刺激に先だって、細胞は、同濃度の無関係のモノクローナル抗体（３ｃ）またはＭＣＰＲ−０５（３ｄ）と共に３０分間、４℃にてプレインキュベーションした。添加された細胞は、無関係のｍＡｂ（３ｅ）またはＭＣＰＲ−０１（３ｆ）、ついで５ｎＭのＭＣＰ−１によりチャレンジされた。図４ａおよび図４ｂ。走化性。Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を数種類の濃度のＭＣＰＲ−０５と共にプレインキュベートし、内皮細胞で被覆したトランスウェルの上部チャンバーに入れ、下部ウェルにＭＣＰ−１（１ｎＭ）を添加した（４ａ）。下部ウェルに移動した細胞を計数し、負のコントロール（培地）に対して観察された移動の増大のｘ倍として算出される、移動インデックス(M.I.)であらわした。４ｂは、同条件におけるＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞移動に対する、ＭＣＰＲ−０２ｍＡｂ希釈物の作用を示す。図５ａおよび図５ｂ。ヒト白血球上でのＣＣＲ２レセプター発現。示される通り、ＭＣＰＲ−０５および抗Ｔ（ＣＤ４）または抗Ｂ（ＣＤ１９、ＣＤ２０）抗体によるダブルカラー染色を使用した休止（−）もしくは活性化（＋）ＰＢＬまたは扁桃腺由来細胞（５ａ）におけるＣＣＲ２ケモカインレセプター発現。ＣＤマーカーで定義される様々なリンパ球集団のフローサイトメトリーにおいてＭＣＰＲ−０５結合により定められたＣＣＲ２レセプターを発現している細胞のパーセンテージ。図６ａから図６ｃ。ＭＣＰ−３導Ｃａ²⁺流入（Ａ、Ｂ）および細胞の移動（Ｃ）に対する、ｍＡｂＭＣＰＲ−０５アンタゴニストとのプレインキュベーションの効果。表Ｉから表IIIは、本発明を説明するものである。発明の詳細な説明定義ＢＳＡウシ血清アルブミンＣＤ１１ｂおよびｃ表面抗原ＤＭＦジメチルホルムアミドＤＭＳＯジメチルスルホキシドＥＣＬ酵素的化学発光ＥＤ１ Serotec製のラット単球を認識するマウスモノクローナル抗体ＥＤ２ Serotec製のラットマクロファージを認識するマウスモノクローナル抗体ＥＩＡ酵素結合免疫測定法（enzyme-linked immunoassay）ＦＡＣＳ蛍光活性化セルソーティングＦＣＳウシ胎児血清ＦＩＴＣフルオレセインイソチオシアネートＧＭ−ＣＳＦ顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子ＨＩＶヒト免疫不全ウイルスＩＦＮ−γ インターフェロンγ ＩＬ−１β インターロイキンＫＬＨキーホールリンペットヘモシアニン、Pierce ＭＣＰ−１ＲＢ単球化学誘引タンパク質−１レセプタータイプＢＭＩＰマクロファージ炎症タンパク質Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１ＭＣＰ−１レセプターを発現する細胞、ドイツのCollec tion of Micro-organisms and Cell Culturesより入手（DSM ACC252）ＰＢＬ末梢血白血球、全血球細胞から単離、健常な提供者から入手し、Fico ll-Paque(5,7 g/L)を使用した遠心分離により精製ＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水ＲＰＭＩ標準培地ＴＨＰ−１ＭＣＰ−１レセプターを発現する細胞、ATCC TIB202 ＴＮＦ−α 腫瘍壊死因子−α 実施例１．ペプチド合成単球化学誘引タンパク質−１レセプタータイプＢ分子（ＭＣＰ−１ＲＢ）の配列２４〜３８および２７３〜２９２をそれそれカバーする二種類のペプチドFDYD YGAPCHKFDVKおよびGLSNCESTSQLDQATQVTETを、自動マルチプルペプチドシンセサイザー(AMS 422、Abimed)で、固相手法および標準Fmoc-ケミストリーを使用して２５μモルベースで合成した。合成は、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（4-(ヒドロキシメチル)フェノキシメチル-コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）樹脂）(Wang樹脂、Novabiochem)に結合させたN-α-Fmoc保護アミノ酸上で、脱保護のためにN-メチルモルホリン(NMM)および２０％ピペリジン／DMF 存在下におけるインシチュ(in situ)でPyBOP(ベンゾトリアゾール−１−イル− オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト)により活性化されたFmoc-保護アミノ酸を使用して行われた。保護されている側鎖グループは、次の通りである。Asn、Cys、GlnおよびHis(Trt);GluおよびAsp(OtBu) ;Lys(Boc);Ser，ThrおよびTyr(tBu)。ペプチドは、８２．５％トリフルオロ酢酸 (TFA)および５％フェノール、５％Ｈ₂Ｏ、５％チオアニソール、３．５％ＥＤＴをスカベンジャーとして樹脂より解離され、冷メチルt-ブチルエーテルで沈殿および洗浄され、水抽出され、凍結乾燥され、そしてNucleosil C-18セミプリパラティブカラム(Tracer)を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーで精製された。ペプチドの純度および組成は、１％TFAを含有する５-70%アセトニトリルグラジエントを使用したC-18 Nucleosil 120分析用カラムを使用した逆相高速液体クロマトグラフィー、およびＮ₂雰囲気中、１１０℃、１８時間の条件による酸加水分解後の、ベックマン６３００アミノ酸分析装置を使用したアミノ酸分析によって確認された。実施例２．抗原の調製と免疫感作２．１ＫＬＨへのペプチドのカップリングペプチドＭＣＰ−１ＲＢ（２４−３８）および（２７３−２９２）を、それぞれＣｙｓ３２およびＣｙｓ２７７を介し、スルホ−サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）を結合剤として使用して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、ピアース）にカップリングした。ＫＬＨは、リン酸緩衝剤溶液ｐＨ７．２中にて、６０００：１というスルホＳＭＣＣのモル比で６０分間、３０℃で活性化した。活性化されたＫＬＨは、セファデックスＧ−２５を通してゲル濾過し、ペプチド対ＫＬＨのモル比が３０００：１で、１８時間室温にて、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０中のペプチドと混合された。キャリアタンパク質に対するペプチドの最終的なモル比は、キャリアタンパク質単独の場合のアミノ酸組成に比較した複合体のアミノ酸組成から推定した。２．２免疫感作２〜３週齢のBalb/cマウスを上記のＫＬＨ結合ペプチドで免疫感作した。各マウスは、最初に、フロイントの完全アジュバンド(Difco Laboratories，USA)０．１５ｍｌ中に乳化されたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)０．１５ｍｌ中４０μｇのペプチドの皮下注射を受けた（０日目）。マウスには、３０日目および６０日目にフロイントの不完全アジュバンド中に乳化された同量のペプチドの追加免疫を行った。融合に先立ち、マウスは−３日目および−２日目に０．１５ｍｌの滅菌食塩水中の３０μｇのペプチドを追加免疫として経静脈投与した。ＫＬＨ−ＭＣＰ１ＲＢ（２４−３８）またはＫＬＨＭＣＰ１ＲＢ（２７３− ２９２）で免疫感作したマウスから、各追加免疫後７から１０日後に、血清を採取し、特定の抗体の存在について、酵素結合免疫測定法（ＥＩＡ）、ウエスターンブロット、または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で判定した。ＥＩＡにおいて、すべてのマウスは、相当する免疫源（非カップリングの合成ペプチド）に、１／２，５００−１／２０，０００の力価（最大結合の半分の値を与える抗血清希釈）で、反応した。実施例３．モノクローナル抗体の調製すべての融合実験において、非分泌P3X63Ag8.653ミエローマ細胞系(CRL1580、 ATCC)が使用された。抗体の産生を基準に選択された免疫マウスを屠殺し、脾臓を無菌的に取り出し、大半の細胞がばらばらになるまでほぐした。細胞を１０％ウシ胎児血清(FCS)、１ｍＭピルベートおよび２ｍＭグルタミンを含有するRPMI1 640(Biowhittaker)（完全培地）に移した。融合に先立ち、脾臓から得た赤血球をＮＨ₄Ｃｌ（Ｈ₂Ｏ中０．８５％）を使用して溶解し、遠心分離で除去した。ミエローマ細胞を、牌臓細胞と1:5の比率で混合し、血清を含まない、前もって暖めておいた培地中で細胞を遠心分離により二回洗浄した。最終洗浄後、前もって暖めておいたポリエチレングリコール４０００(PEG，Merk，RPMI1640中50%w/v) を緩やかに撹拌しながら１分間かけて細胞ペレットに添加した。血清を含まない培地２０ｍｌをゆっくり加えて（１ｍｌ／分）ＰＥＧを希釈した。ついで細胞を遠心分離し（１，０００ｒｐｍ、室温にて１０分間）、完全培地中に再度懸濁し、計数し、１０⁶細胞／ｍｌの濃度でフラスコに移した。細胞は、５０％ＣＯ₂雰囲気中、３７℃で一晩放置した。融合した細胞は、遠心分離し、アザセリンおよびヒポキサンチン（それぞれ１Ｏ^-5と１０^-4Ｍ、Sigma Chemical Co.）を含有する完全培地中に再度懸濁し、９６ウェル組織培養プレートに10⁴細胞/ウェルの密度でフィーダー層である胸腺細胞の上に添加した。大半の場合、融合物の一部のみをプレートに添加し、残りの融合物は凍結された。１２〜１４日後、ハイブリットの生長が観察されたウェルの上清を、特異的抗体の存在について検査した（下記の実施例４を参照のこと）。陽性のハイブリッドを含むウェルをヒポキサンチンを含有する完全培地中、２４ウェルプレートに移した。目的のものであると考えられる抗体を産生するこれらのハイブリッドを、安定な抗体産生が得られるまで、限界希釈によるクローニングによって安定化させた。プリスタン(pristane)を注射したマウスから得た腹水中および血清を含有しない培地中において生長したハイブリッドから得られた両方の上清を、抗体源として使用した。実施例４．モノクローナル抗体のスクリーニングと特性評価４．１．抗体補足酵素結合免疫測定法(EIA) 合成ペプチドＭＣＰ１ＲＢ（２４−２８）および（２７３−２９２）（ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌ，１００ｍｌ／ウェル）を、４℃で一晩、マイクロタイタープレート(Maxi-sorb、Nunc)上に吸着させた。残存するタンパク質結合部位をＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ（２００μｌ／ウェル、３７℃で６０分間）でブロックした。プレートを蒸留水で洗浄した後、モノクローナル抗体を３７℃で６０分間インキュベートし、ついでペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体(G AM-PO、Tago Inc.)およびＯＰＤ(Sigma Chemical Co.)とインキュベートした。反応を３Ｎ硫酸で停止させ、４９２ｎｍにおける光学濃度を測定した。４．２．アイソタイプ測定各抗体のアイソタイプを、固相吸着アフィニティー精製ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌ、１００μ１／ウェル）、４℃一晩を使用したＥＩＡで測定した。ＢＳＡでブロックした後、モノクローナル抗体を３７℃で６０分間インキュベートし、ついでサブクラス特異的抗マウスＩｇ、ペルオキシターゼ標識抗体(Southern Biotechnologies Associates，Inc.USA)およびＯＰＤとインキュベートした。反応を３Ｎ硫酸で停止させ、４９２ｎｍにおける光学濃度を測定した。４．３．蛍光活性化セルソーティング分析（ＦＡＣＳ分析）ＭＣＰ−１レセプターを発現するＴＨＰ−１またはＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を遠心分離し（１，０００ｒｐｍ、室温で１０分間）、Ｖ底９６ウェルプレートに（２５０，０００細胞／ウェル）入れ、５０μｌ／ウェルのさまざま未希釈上清（実施例３より）を入れて、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を２％ＢＳＡおよび２％ＦＣＳを含有するＰＢＳで、遠心分離（７５０ｒｐｍ、４℃で５分間）で二回洗浄した。次にヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合体を添加し二回洗浄した。細胞に結合した蛍光をProfile XL蛍光活性化セルソーターで測定した。４．４．カルシウム測定蛍光プローブＦｌｕｏ−３(Calbiochem)を使用して、細胞内カルシウム濃度の変化をモニターした。Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞（２．５ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）を、１０ｎＭＨＥＰＥＳを含有する完全培地中に再懸濁し、２ｍｌ／１０⁶細胞のＦｌｕｏ−３（ＤＭＳＯ中２５０ｍＭ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、２ｍＭＣａＣｌ₂を含有する完全培地中に再懸濁し、様々な濃度のリガンド(PBS中、ケモカインまたはモノクローナル抗体)を添加するまで、３７℃に置いた。モノクローナル抗体のサイトカインに応答するカルシウムの放出は、ＦＡＣＳにおいて５２５ｎｍで測定され、リガンドへのレセプターの結合を示した。相当するｍＡｂの拮抗作用を測定するため、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を、ＲＰＭＩ（標準培地）中様々な濃度の、硫酸アンモニウム精製抗体と４℃で３０分間プレインキュベートした。洗浄後、細胞にＦｌｕｏ−３を添加し、上記のようにカルシウム放出を測定した。４．５．免疫沈降およびウエスタンブロットＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞、ヒトＰＢＬおよびラット脾臓細胞を遠心分離し、混合プロテアーゼインヒビターを含有する５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＤＴＴバッファ中に再懸濁した。細胞に、３〜５サイクルの凍結（液体窒素中において）、融解処理をした。その後、細胞を、４℃において１，５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、沈殿を廃棄した。残った上清を４℃において１２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、沈殿をＰＢＳ中に再懸濁した。ライゼートは、Laemmli UK et al(Nature 227，680-85，1970)の方法により、還元条件下において１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。ゲルを、セミドライブロッター(Bio-Rad)上のニトロセルロースに、０．０３７％のＳＤＳを含有する４８ｍＭトリス塩基、３９ｍＭグリシン、２０％メタノールバッファ中にて２５０ｍＡで６０分間転写した。ＰＢＳ中１０％脱脂粉乳でメンブランをブロックした後、モノクローナル抗体は室温で１２０分間、撹拌しながらインキュベートし、ついで１／５，０００希釈ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩＣＮ）とインキュベートした。ブロットは、ＥＣＬ(Amersham)を使用し、メーカーの指示に従って発色させた。免疫沈降は、(30)に記載される通りおこなった。簡単に説明すると、タンパク質抽出物を２０μｇ／１０⁷細胞の抗マウスＩｇＧ-アガロース(Sigma)との４℃ での60分間インキュベーションおよび遠心分離(15,000xg、１分間)により予備的に精製した。次いで上清をｍＡｂＭＣＰ−１R03(PBS中5mg/ml)と４℃において90 分間インキュベートし、20μg/10⁷細胞の抗マウスIgG-アガロース(Sigma)と６０分間インキュベートした。サンプルは、４℃において１５，０００ｘｇにて１５分間遠心分離し、アガロース沈殿物を溶解バッファで二回洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．６で三回洗浄し（４℃にて、１５，０００ｘｇ、１分間）、Laemmliバッファ中に再懸濁して電気泳動をおこなった。４．６．抗体の精製腹水または血清を含まない培地で生長した相当するハイブリッドの上清(Ultra doma培地中0〜１％FCS，Gibco)の、５０％硫酸アンモニウム沈殿および／または固定化タンパク質Ａセファロース(Pharmacia、スウェーデン)によるアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製した。４．７．走化性Ｎｙｃｏｐｒｅｐ^TM精製ヒト単球のＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を、事前にマウス脳内皮細胞で被覆した(５０，０００細胞／ウェル、３７℃で４８時間、５％ＣＯ₂またはhasta confluencia)２４ウェルトランスマイグレーションチャンバー(Transwell，Costar，Cambridge MA)の上部ウェルに入れた。ケモカィンまたはアンタゴニスト抗体を、下部ウェルにいれ、ＲＰＭＩ，０．２５％ＢＳＡ中で希釈した。プレートを３７℃において１２０分間、５％ＣＯ₂でインキュベートし、不活性なものはウェルから排除し、下部チャンバーに移動したものを計数した。ＭＣＰ−１誘発性の走化性をブロックするために、ＰＢＳ中様々な濃度の精製したｍＡｂを、上部ウェルに添加し、同時に下部ウェルにケモカインを入れた。走化性を、上記の通り観察した。実施例５．結果ＦＡＣＳで二種類の血清がＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を認識し（表Ｉ）および相当するマウスを引き続いて細胞融合に使用した。融合後、カップリングされていない合成ペプチドとＥＩＡにおいて結合し、ＦＡＣＳで陽性の結果を与えた抗体を産生するハイブリッドを選択して安定化させた（表II）。６つの安定化させたモノクローナル抗体を、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞のライゼート中のＭＣＰ−１レセプターを認識するその能力を測定する目的でＭＣＰ− １レセプターの免疫沈降およびウエスタンブロットにより特性評価した。さらに、ＭＣＰ−１のアゴニストまたはアンタゴニストとしての、これら抗体の能力も特性評価した。これらのｍＡｂの主な特徴を、表IIIにまとめる。すべての６つのｍＡｂは、ＦＡＣＳにおいてＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１およびＴＨＰ−１細胞を認識した（図１）。Ｘ軸は、相対的蛍光強度の対数を表し、Ｙ軸は相対的細胞数を表す。ウエスタンブロットにより認識されたタンパク質は、使用されたＴ細胞タイプ中の３２ｋＤａタンパク質に相当する（ヒト単球細胞株およびヒト単球）。ウエスタンブロット分析の結果は、ＭＣＰＲ−０２およびＭＣＰＲ−０５は、セルロースメンブラン上に固定化されたヒトおよびラットＭＣＰ−１レセプターと結合する能力を有することを示す。すべての６つのｍＡｂは、フローサイトメトリー分析において、ＴＨＰ−１およびＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を認識する。一種類のＭＣＰＲ−０５はまた、ウエスタンブロット分析において、特定の３２ｋＤａバンドをいずれの細胞系、ならびに（２７３〜２９２）ペプチドで置換されているＰＢＬおよび扁桃腺由来のリンパ細胞において認識し、ｍＡｂＭＣＰＲ−０３は、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞の同じ３２ｋＤａのタンパク質を免疫沈降する。ＣＣＲ２に対するモノクローナル抗体の特異性については、以前にウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析において、ＣＣＲ２ケモカインレセプターを発現しないことが知られている、ＣＣＲ２でトランスフェクトされた２９３細胞、およびいくつかのケモカインレセプター(ＣＣＲ３、ＣＣＲ５およびフシン(fusin))を発現するがＣＣＲ２を発現しないJurkat細胞を使用して証明されている。フローサイトメトリーまたはウエスタンブロットにおいて、これらのどの抗体にどちらの細胞系も認識されないが、どちらの細胞系もＣＣＲ２遺伝子をトランスフェクトさせた後は明らかに陽性になる。ヒトPBLのフローサイトメトリー分析は、これらのｍＡｂはCD-11b，PBLを認識することを示す。ひとつのｍＡｂ、ＭＣＰＲ−０５はまた、ラットの末梢血白血球および脾臓細胞を認識し、モノクローナル抗体ＥＤ１およびＥＤ２(Serotec) で陽性染色を示す。マウスモノクローナル抗体ＥＤ１は、ラット単球およびマクロファージを認識するのに対して、マクロファージモノクローナル抗体ＥＤ２はラットのマクロファージを認識する。三種類のｍＡｂ（ＭＣＰＲ−０４、−０５および−０６）は、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞におけるＭＣＰ−１誘発カルシウムフラックスをブロックすることから（図２）、レセプターのアンタゴニストとして作用する。これらのアンタゴニスト活性を有する抗体は、レセプターの第三の細胞外ループを認識する(ａａ２７３〜２９２)のに対して、作動的な抗体はアミノ末端領域を認識する(ａａ２４〜３８)。あるｍＡｂ（ＭＣＰＲ−０２）は、カルシウム測定の結果から、ＭＣＰ−１レセプターのアゴニストとして作用する。Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞をｍＡｂＭＣＰＲ−０２で刺激後、Ｃａ²⁺濃度の迅速かつ一時的な上昇が観察された。このｍＡｂによる細胞の前処理により、ＭＣＰ−１に対する反応性が顕著に低下し、カルシウム反応が脱感作されていることが示される（図３ｆ）。走化性。Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞を、数種類の濃度のＭＣＰＲ−０５と共にプレインキュベートし、内皮細胞で被覆したトランスウェルの上部チャンバーに入れ、ＭＣＰ−１（１ｎＭ）を下部ウェルに添加した（図４ａ）。下部ウェルに遊走した細胞を計数し、陰性対照（培地）に対して観察された遊走の増加のｘ倍として算出される遊走定数(Migration Index，M.I.)として表した。１００および１，０００ｎＭの濃度については、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞の走化性の有意な低下が、拮抗作用抗体ＭＣＰＲ−０５に関して観察される。図４ｂは、同じ条件下における、Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞の移動に対するＭＣＰＲ−０２ｍＡｂ希釈の効果を示す。ＣＣＲ２は単球、休止状態のＢ細胞および活性状態のＴ細胞で発現している。これらのｍＡｂの特異性に基づいて、本発明者らはＣＣＲ２を発現するヒト末梢血単球集団を確立している。休止状態およびPHAによってまたはイオノホアによって活性化されたPBMCを、単球／マクロファージ、Ｂ細胞およびＴ細胞に特異的なマーカー類を組み合わせたダブルカラー染色を使用したフローサイトメトリーで調べた。未処理の細胞においては、前方および側方散乱分析の結果、ｍＡｂは、単球／マクロファージ集団のＣＤ１１ｂ⁺、ＣＤ１３⁺およびＣＤ１４⁺細胞の１００％を認識した。抗ＣＣＲ２抗体は、全ＣＤ１９⁺細胞の５０％と結合する一方、ＣＤ３⁺細胞においては、わずかな結合が観察されるかまたは結合はまったく観察されなかった。このことは、単球およびＢ細胞においてはＣＣＲ２ケモカインレセプターが発現されたが、T細胞においては発現されなかったことを示すものである。休止状態および活性状態の扁桃腺由来リンパ球を使用してこれらのデータを確認したところ、実際に脾臓および扁桃腺におけるすべての単球マクロファージおよび大半のＢ細胞は抗ＣＣＲ２抗体により染色される（図５ａおよび５ｂ）ことが示された。活性化した後はＣＤ４⁺細胞の３５〜４５％、ＣＤ８⁺細胞の２０〜４０％がＣＣＲ２レセプターを発現するのに対して、扁桃腺および末梢血Ｂ細胞においては変化なく、Ｔ細胞においてＣＣＲ２発現が活性化に依存性であることが示される。Ｂ細胞においては、その由来がＰＢＬまたは扁桃腺にかかわらず、活性化によるレセプター発現の変化はみられない。図５ａおよび５ｂは、扁桃腺およびＰＢＬにおけるＣＣＲ２ケモカインレセプターを発現する細胞集団をまとめたものである。図６ａから６ｃは、ＭＣＰＲ−０５がＭＣＰ−３誘発Ｃａ²⁺流入(influx)およびＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞の移動(transmigration)をブロックすることを示す。３ｎＭのＭＣＰ−３を使用することによりカルシウム流入が引き起こされた。アイソタイプの一致する対照ｍＡｂ(hGH5)の作用と比較して、これらの細胞における、ＭＣＰ−３誘発Ｃａ²⁺流入に与える、アンタゴニストｍＡｂＭＣＰＲ−０５とのプレインキュベーションの効果を、図６ａと６ｂに示し、移動を図６ｃに示す。結果は、代表的な実験の３回の平均に相当する。Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１拮抗的抗体ＭＣＰＲ−０２は、１／２および１／６の希釈でＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞の有意な走化性反応を誘導した。考察本発明者らは、このようにして、ＭＣＰ−１活性を中和するｍＡｂおよびＭＣＰ−１活性を模倣するｍＡｂを得た。これらのふたつの特性は、明らかに、ＭＣＰ−１レセプターの二つの領域を識別している。ブロック作用のあるｍＡｂは、ＭＣＰ−１の結合部位に関与する領域に関係するレセプターの第三細胞外ループに存在する配列を認識し、一方、作動作用のほうは、レセプターのＮ末端領域に位置し、レセプターの機能に必要な領域に関するはずである。本発明者らは、このようにしてＭＣＰ−１レセプターと結合可能な抗体を見つけだし、そのなかのあるものはアゴニスト（ＭＣＰＲ−０２）および他のものはアンタゴニスト（ＭＣＰＲ−０４、ＭＣＰＲ−０５およびＭＣＰＲ−０６）である。これらの所見は、非常に驚くべき事実であり、医薬品としての使用において非常に興味深く魅力あるものであると考えられるはずである。記載されるすべてのＭＣＰ−１を認識する抗体は、インビボ診断用としても使用可能なものである。見いだされた抗体の二つ（ＭＣＰＲ−０２およびＭＣＰＲ−０５）は、生物学的組織に関する免疫沈降においてＭＣＰ−１レセプターと結合でき、また免疫ブロッティング実験において人工メンブランに吸着させたレセプターを認識できる。抗体は、固定化抗原を含むインビトロにおける診断目的において使用できる。本発明者らは、このように、このレセプターの第三細胞外ドメイン（アミノ酸残基273〜292）およびアミノ末端領域（残基２４〜３８）の合成ペプチドを使用して得られる、ヒトＣＣＲ２に特異的なモノクローナル抗体のパネルについて記載する。フローサイトメトリーおよびウエスタンブロット分析において、これらのｍＡｂは、ＣＣＲ２でトランスフェクトされたJurkattおよび２９３細胞を認識するのに対して、モック(mock)でトランスフェクトされた細胞は認識しない。いくつかのＣＣ（ＣＣＲ２、３、４および５）およびＣＸＣ(fusin)ケモカインレセプターが、細胞融合および細胞のＨＩＶ感染に必要なコレセプターとして作用することが、最近証明されている。このことは、ＨＩＶ感染の結果を防止するための可能なターゲットとしてのこのレセプターファミリーに対する関心を増大させている（２２〜２７）。本発明者らは、また、ＣＣＲ２がＨＩＶ−１コレセプターとして作用することをすでに報告しており、ＭＣＰ−１がＨＩＶ−１中和活性を有することを示している（投稿済み）。さらに、ＭＣＰＲ−０２ｍＡｂはＨＩＶ−１中和を促進する一方、ＭＣＰ−１アンタゴニストであるｍＡｂＭＣＰＲ−０５はこのウイルスを中和せず、ＭＣＰ−１の誘導する中和を有効にブロックする。ＭＣＰＲ−０４および−Ｒ１０５ｍＡｂは、ＨＩＶ感染をブロックしないため、これらのデータは、ＨＩＶ−１がＣＣＲ２レセプターのＮＨ₂末端ドメインと相互作用することを示す。最後に、ｍＡｂＭＣＰＲ−０２およびＭＣＰ −１ケモカインは、ＨＩＶ−１感染をブロックすることから、本発明者らは、ＨＩＶ−１が不活性型のレセプターと相互反応し、活性型のものとは反応しないことを提唱する。表Ｉ１固相吸着非カップリング合成ペプチドを使用したＥＩＡ２Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１またはＴＨＰ−１細胞の膜を使用３Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１およびＴＨＰ−１細胞のフローサイトメトリー分析表II１固相吸着非カップリング合成ペプチドを使用したＥＩＡ２Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−1およびＴＨＰ−１細胞のフローサイトメトリー分析表III １対応するｍＡｂにより認識されるＭＣＰ−１レセプタータイプＢの配列２還元条件におけるＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞ライゼートの認識３Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞のフローサイトメトリー分析４Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−１細胞におけるＭＣＰ−１誘導カルシウムフラックスに対する対応するｍＡｂの効果５内皮細胞で被覆したトランスウェル上におけるＭＣＰ−１誘発走化性に対する異なるｍＡｂの効果

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９Ｆ // Ａ６１Ｐ 9/10 ６１１ 11/00 ６１７Ｅ 17/06 ６１９Ａ 19/02 ６２６Ｎ 25/28 ６２９ 29/00 ６３５ 35/00 ６３７Ａ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メラード，ガルシア，ホセマリオスペイン，イー―28008 マドリッド，23, マルティンデロスヘロス (72)発明者ロドリゲス，フレイド，ホセミゲルスペイン，イー―28016 マドリッド，32, チレ

Claims

【特許請求の範囲】１．単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１）レセプターＣＣＲ２と結合可能な抗体。２．モノクローナル抗体である、請求の範囲第１項に記載の抗体。３．アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかとして作用することができる請求の範囲第１項または２のいずれかに記載の抗体。４．機能性レセプターアンタゴニストとしてＭＣＰ−１レセプターに作用する請求の範囲第３項に記載の抗体。５．機能性レセプターアゴニストとしてＭＣＰ−１レセプターに作用する請求の範囲第３項に記載の抗体。６．レセプターの第三の細胞外ループに存在する配列を認識する、請求の範囲第４項に記載の抗体。７．レセプターの第三の細胞外ループに存在する配列を認識し、レセプターのアミノ酸残基２７３〜２９２を認識する、請求の範囲第６項に記載の抗体。８．レセプターの細胞外アミノ末端領域を認識する請求の範囲第５項に記載の抗体。９．レセプターの細胞外アミノ末端領域を認識し、レセプターのアミノ酸残基２４〜３８を認識する請求の範囲第８項に記載の、およびレセプターの細胞外アミノ末端領域を認識する抗体。１０．ＭＣＰ−１レセプターと結合することができ、細胞または生物学的組織においてＭＣＰ−１レセプターの免疫沈降ができ、人工膜上に吸着されたＭＣＰ −１レセプターの検出が可能である、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか一項に記載の抗体。１１．免疫蛍光法において、ＭＣＰ−１レセプターを発現するＭｏｎｏ−Ｍａｃ−１およびＴＨＰ１細胞を認識する請求の範囲第１０項に記載の抗体。１２．インビトロ診断および／またはインビボ診断のための請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか一項に記載の抗体の使用。１３．ＭＣＰ−１レセプターを発現する組織および細胞クラスをスクリーニングおよび検出するための請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項に記載の抗体の使用。１４．新薬のスクリーニングのための請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項に記載の抗体の使用。１５．請求の範囲第１項から１２項のいずれかに記載の抗体を含む抗体製剤。１６．治療に使用するための請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項に記載の抗体。１７．請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項に記載の抗体と担体とを含む医薬組成物。１８．請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項に記載の抗体を産生することができる微生物または細胞系。