DE69333885T2 - C-c ckr-1, ein c-c chemokin rezeptor - Google Patents

C-c ckr-1, ein c-c chemokin rezeptor Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Cytokinrezeptoren, ihre Antikörper und ihre Verwendung als Diagnostika und Therapeutika.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Cytokine sind biologische Moleküle, die Entzündungs- und mit dem Immunsystem verbundene Effektorzellen beeinflussen. Die Entzündungs-Cytokine oder "Chemokine" weisen zahlreiche verschiedene biologische Eigenschaften auf, einschließlich selektiver Leukozyten-Chemotaxis und -Aktivierung. Diese Chemokine bilden eine Superfamilie, die in der Literatur entweder als die PF4-Superfamilie oder die Interkrine bezeichnet wird und die in zwei Klassen unterteilt wurde, darauf basierend, ob die ersten zwei konservierten Cysteinreste durch eine dazwischen liegende Aminosäure getrennt sind (C-X-C, oder α) oder ob sie benachbart sind (C-C, oder β). Die zugehörigen Chemokine der C-X-C-Klasse umfassen beispielsweise Interleukin-8 (IL-8), Melanozyten-Wachstumsstimulationsfaktor (MGSA) und Plättchenfaktor 4 (PF4), während die C-C-Klasse RANTES (Reguliert bei Aktivierung, Normal T-Exprimiert und Sekretiert) und Monozyten-Chemotaxis-Peptid-1 (MCP-1) umfasst. Die C-X-C-Klasse übt entzündungsfördernde Aktivität hauptsächlich durch ihre Wirkung auf neutrophile Organismen aus, während die C-C-Klasse anscheinend chemische Monozyten-Attraktanten umfasst.
  • Besonderes Augenmerk wurde bisher auf Rezeptor/Liganden-Wechselwirkungen in dieser Superfamilie gelegt, wobei mehr Daten für C-X-C- als für C-C-Chemokinbindung verfügbar sind. Es wurde erkannt, dass Chemokinrezeptor/Liganden-Wechselwirkungen auf Target-Entzündungszellen streng geregelt zu sein scheinen. Beispielsweise wurde keine Kreuz-Konkurrenz um Bindungsstellen an Monozyten oder Neutrophilen zwischen Mitgliedern der C-X-C- oder C-C-Klassen beobachtet (E. J. Leonard et al., Immunol. Today 11, 97–101 (1990); A. K. Samanta et al., J. Exp. Med. 169, 1185–1189 (1989); T. Yoshimura et al., J. Immunol. 145, 292–297 (1990)), was mit den differenziellen Chemoattraktans-Wirkungen auf diese zwei Zelltypen übereinstimmt. Daten zu Direkt-Bindungen für die C-C-Chemokine sind überraschend rar. Für menschliches MCP-1 wurde berichtet, dass es sich an Monozy ten mit einer Affinität von etwa 2 nM bindet, während an Neutrophilen keine Stellen nachweisbar sind (A. J. Valente et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 309–314 (1991); T. Yoshimura et al., J. Immunol. 145, 292–297 (1990)). Ein einziger Bericht zeigt Bindung von menschlichem Act-2, einer menschlichen MIP-1β- (HuMIP-1β-)Variante, an zwischen 7.000 und 45.000 Stellen an PBMC mit einer Affinität von zwischen 7,8 und 12 nM (M. Napolitano et al., J. Exp. Med. 172, 285–289 (1990)). Kwon und Mitarbeiter charakterisierten die Bindung von Maus-MIP-1α an eine Maus-T-Zelle und eine Makrophagen-Zelllinie und konnten eine Kd von 1,5 bzw. 0,9 nM feststellen (K. O. Oh et al., J. Immunol. 147, 2978–2983 (1991)).
  • Die meisten der molekularen Details bezüglich Leukozytenmotilität konnten noch nicht aufgeklärt werden. Erst jüngst jedoch wurden unter Verwendung von molekularer Verfahren die Rezeptoren für das Anaphylatoxin C5a (N. P. Gerard et al., Nature 349, 614–617 (1991)), das bakterielle formylierte Tripeptid fMLP (F. Boulay et al., Biochemistry 29, 11123–11133 (1990)) und das C-X-C-Chemokin IL-8 (W. E. Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991); P. M. Murphy et al., Science 253, 1280–1283 (1991)) kloniert. Alle diese Rezeptoren weisen Aminosäuresequenzen auf, von denen vorhergesagt wird, dass sie konform zu einer Architektur sind, die sieben-Transmembran-umspannende Segmente enthält, die durch eine Reihe von intra- und extrazellulären Schleifen verbunden sind. Die primären Sequenzen dieser Rezeptoren zeigten Domänen auf, die in Rezeptoren konserviert waren, die mit Zellmotilität assoziiert sind, jedoch nicht in anderen sieben-Transmembran-umspannenden Rezeptoren.
  • Demnach ist ein Ziel der Erfindung, isolierten C-C-Chemokinrezeptor (C-C CKR-1) zur Verwendung als ein Therapeutikum oder Diagnostikum bereitzustellen.
  • Ein anderes Ziel der Erfindung ist, Varianten von C-C CKR-1 zur Verwendung als Antagonisten oder Agonisten herzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, Antikörper gegen C-C CKR-1 zur Verwendung als Diagnostika oder Therapeutika herzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zur Identifikation neuer Chemokinrezeptoren bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der Erfindung ist die Isolierung des neuen Chemokinrezeptors C-C CKR-1.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, die C-C CKR-1 umfasst, bereit, die frei von verunreinigenden Polypeptiden der Tierspezies ist, die die Quelle des C-C CKR-1 darstellt.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung wird C-C CKR-1, oder Fragmente davon (die auch mittels chemischer Verfahren synthetisiert werden können), (durch rekombinante Expression oder kovalente In-vitro-Verfahren) an ein immunogenes Polypeptid fusioniert, und dieses Fusionspolypeptid wiederum wird verwendet, um ein Tier zu immunisieren, sodass es Antikörper gegen ein C-C-CKR-1-Epitop entwickelt. Anti-C-C-CKR-1-Antikörper werden aus dem Serum immunisierter Tiere gewonnen. Alternativ dazu werden monoklonale Antikörper aus Zellen des immunisierten Tieres auf herkömmliche Weise hergestellt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Anti-C-C-CKR-1-Antikörpern zur Diagnose (in vitro oder in vivo) oder (sofern an eine unlösliche Matrix immobilisiert) zur Reinigung von Chemokinrezeptoren, die sich daran binden.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Derivatisierung von C-C CKR-1 in vitro, um immobilisierten C-C CKR-1 und markierten C-C CKR-1 herzustellen, insbesondere für Zwecke der Diagnose von C-C CKR-1 oder seiner Antikörper, oder für Affinitätsreinigung von C-C-CKR-1-Antikörpern selbst.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Formulierung von C-C CKR-1, seiner Derivate oder seiner Antikörper zu physiologisch annehmbaren Vehikeln, insbesondere zur therapeutischen Verwendung. Solche Vehikel umfassen Retard-Formulierungen von C-C CKR-1.
  • In wiederum anderen Aspekten stellt die Erfindung ein isoliertes, markiertes oder nicht markiertes Nucleinsäuremolekül bereit, das für C-C CKR-1 kodiert, und eine Nucleinsäuresequenz, die komplementär zu einer für C-C CKR-1 kodierenden Nucleinsäuresequenz ist oder unter definierten Bedingungen an diese hybridisiert.
  • Darüber hinaus stellt die Erfindung einen replizierbaren Vektor, der das für C-C CKR-1 kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, operabel an Kontrollsequenzen gebunden, die von einem durch den Vektor transformierten Wirt erkannt werden; Wirtszellen, die mit dem Vektor transformiert sind; und ein Verfahren zur Verwendung eines für C-C CKR-1 kodierenden Nucleinsäuremoleküls zur Bewirkung der Produktion von C-C CKR-1, umfassend das Exprimieren des Nucleinsäuremoleküls in einer Kultur der transformierten Wirtszellen und die Gewinnung von C-C CKR-1 aus der Wirtszellenkultur, bereit. Die Nucleinsäuresequenz ist auch in Hybridisierungstests für C-C-CKR-1-Nucleinsäure nützlich.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Substitutions-, Deletions- oder Insertions-Varianten von C-C-CKR-1-Aminosäuren und/oder Glykosylresten, einschließlich Varianten mit nicht-nativer Glykosylierung. Diese Varianten werden durch In-vitro- oder Rekombinationsverfahren hergestellt. Sequenzvarianten werden gegebenenfalls auf Immun-Kreuzreaktivität mit C-C CKR-1 und auf C-C-CKR-1-Antagonisten- oder -Agonisten-Aktivität gescreent.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifikation neuer C-C-Chemokinrezeptoren, wie es in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität einer C-C-Chemokinvariante auf C-C CKR-1 durch Transformieren einer Wirtszelle mit für C-C CKR-1 kodierender DNA, Kultivieren der Wirtszelle, sodass sie den Rezeptor an ihrer Oberfläche exprimiert, Ernten der Zellen, Kontaktieren der Zellen mit einer C-C-Chemokinvariante und Bestimmen der biologischen Aktivität der Variante auf den Rezeptor.
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um transgene Tiere, die C-C CKR-1 aus einer anderen Spezies umfassen, Tiere, in denen C-C CKR-1 in einem Gewebe exprimiert wird, in dem er normalerweise nicht gefunden wird, oder Tiere, in denen C-C CKR-1, beispielsweise durch Genunterbrechung, inaktiviert ist, bereitzustellen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 (Seq.-ID Nr. 1–7) beschreibt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von C-C CKR-1 und einen Abgleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz mit HUMSTSR (Genbank Zugriffs-Nr. M99293), IL8rA (W. E. Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)), IL8rB (P. M. Murphy et al., Science 253, 1280–1283 (1991)), C5a-Rezeptor (N. P. Gerard et al., Nature 349, 614–617 (1991)), fMLP-Rezeptor (F. Boulay et al., Biochemistry 29, 11123–11133 (1990)) und dem offenen Leseraster von Zytomegalie-Virus US28. Die mutmaßlichen sieben-Transmembran-umspannenden Domänen sind mit einem Überstrich versehen. Glykosylierungsstellen sind mit schwarzen Punkten über den Sequenzen markiert. Die zwei Cysteinreste, die in Disulfidbindung eingebunden sind, sind mit Sternchen gekennzeichnet. Die Consensus-Stelle für Proteinkinase-C-Phosphorylierung ist mit "+" markiert. Konservierte Aminosäuren, die häufiger als zweimal im Abgleich aufscheinen, sind in den Kästchen zu finden.
  • 2 zeigt Northern-Blot-Analyse von RNA aus blutbildenden Zellen, die mit C-C CKR-1 sondiert wurden. 5 μg von Poly A+ oder 20 μg von Gesamt-RNA aus den angegebenen Zelllinien wurden auf 1% Formaldehyd-Agarose größenfraktioniert, auf Nitrocellulose transferiert und mit radioaktiv markierter C-C-CKR-1-cDNA hybridisiert. Das Filter wurde mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C gewaschen, und die Autoradiographie wurde nach 4–6 Stunden Aussetzung bei –70°C mit Verstärkerfolie entwi ckelt. RNA-Molekulargewichtsmarker wurden ebenfalls am Gel laufen gelassen und sind auf der Seite angegeben.
  • Die 3A und 3B zeigen Southern-Blot-Analyse von menschlicher genomischer DNA, die mit C-C CKR-1 sondiert wurde. In 3A wurden 10 μg genomische DNA mit dem angegebenen Restriktionsenzym verdaut, auf einem 0,6%igen Agarosegel laufen gelassen, auf Genescreen® geblottet und mit radioaktiv markierter C-C-CKR-1-cDNA hybridisiert. Das Filter wurde mit 0,5 × SSC, 1% SDS bei 55°C gewaschen, und die Autoradiographie wurde nach Aussetzung über Nacht bei –70°C mit Verstärkerfolie entwickelt. DNA-Molekulargewichtsmarker wurden ebenfalls am Gel laufen gelassen und sind auf der Seite angegeben. In 3B wurde derselbe Blot unter stringenteren Bedingungen mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C gewaschen, und Autoradiographie wurde wie zuvor angegeben durchgeführt.
  • Die 4A und 4B sind Diagramme, die intrazelluläre Ca++-Konzentrationen von 293-Zellen zeigen, die mit C-C-CKR-1-cDNA transfiziert und menschlichem MIP-1α (HuMIP-1α) und RANTES ausgesetzt wurden. In 4A wurden zu 50% konfluente Zellen mit 10–20 μg Plasmid-DNA durch das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren transfiziert. Nach vorübergehender Expression für 12 bis 24 Stunden wurden die Zellen geerntet, mit der Calciumsonde INDO-1 AM geladen und mittels spektralfluorimetrischer Verfahren bei 37°C unter kontinuierlichem Rühren getestet. Nach 12 Sekunden wurden, wie angegeben, verschiedene Konzentrationen von HuMIP-1α zugesetzt. Die intrazellulären Konzentrationen von Ca++ wurden wie beschrieben (P. H. Naccache et al., J. Immunol. 142, 2438–2444 (1989)) bestimmt. In 4B waren die Bedingungen dieselben wie in 4A, außer dass verschiedene Konzentrationen von RANTES, wie angegeben, verwendet wurden.
  • Die 5A–5D sind Diagramme, die die Desensibilisierung als Reaktion auf den Challenge derselben oder anderer Liganden durch 293-Zellen, die vorübergehend C-C CKR-1 exprimieren, zeigen. Die Details sind dieselben wie für 4. Die transfizierten Zellen wurden zuerst nach 12 Sekunden 100 nM von HuMIP-1α oder 250 nM von RANTES ausgesetzt und wurden dann, nach 70 Sekunden, mit derselben Konzentration von Liganden in der angegebenen Reihenfolge provoziert.
  • Die 6A und 6B sind Diagramme, die die Bindung von 125I-HuMIP-1α und 125I-RANTES an 293-Zellen, die mit C-C-CKR-1-cDNA transfiziert sind, zeigen. In 6A wurden menschliche embryonale Nierenzellen (293-Zellen) mit 10–20 μg Plasmid-DNA wie in 4 beschrieben transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden 2 Stunden lang bei 4°C mit 125I-HuMIP-1α in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von nicht-markiertem HuMIP-1α inkubiert. Das Nebenbild zeigt Scatchard-Analyse der Bindungsdaten, die eine Kd von 5,1 ± 0,3 nM für 125I-MIP-1α zu C-C CKR-1 ergab. 6B zeigt Ersetzung von 125I-RANTES mit nicht-markiertem HuMIP-1α an 293-Zellen, die mit der C-C-CKR-1-cDNA transfiziert sind. Scatchard-Analyse der Bindungsdaten ergab eine Kd von 7,6 ± 1,5 nM für die Ersetzung von 125I-RANTES an den C-C CKR-1.
  • 7 ist ein Diagramm, das Ersetzung von 125I-HuMIP-1α, das sich an 293-Zellen bindet, die mit C-C-CKR-1-cDNA transfiziert sind, zeigt. Die Zellen wurden wie in 4 beschrieben transfiziert und 2 Stunden lang bei 4°C mit 125I-HuMIP-1α in Gegenwart steigender Konzentrationen der kreuzkonkurrierenden Liganden, HuMIP-1α, Maus-MIP-1α, HuMIP-1β, MCP-1 und IL-8, inkubiert. Die Kd und die Anzahl an Stellen, die im linken unteren Eck gezeigt sind, wurden mittels Scatchard-Analyse der Bindungsdaten bestimmt.
  • 8 ist ein Diagramm, das die intrazelluläre Ca++-Konzentration von 293-Zellen zeigt, die vorübergehend C-C CKR-1 exprimieren und HuMIP-1α, RANTES, HuMIP-1β und MCP-1 ausgesetzt wurden. Die Details sind dieselben wie in 4.
  • 9 (Seq.-ID Nr. 8) ist die Nucleotidsequenz von C-C CKR-1 und seiner nichtkodierenden 3'-Region.
  • 10 ist ein Diagramm, das die Bindung von radioaktiv markiertem HuMIP-1α an 293-Zellen, die mit der Kodierregion des offenen Leserasters US28 im Zytomegalie-Virus-(CMV-)Genom transfiziert sind, zeigt. 293-Zellen wurden mit einem Expressionskonstrukt, das die Kodiersequenz von US28 in der Sense- oder Antisense-Ausrichtung enthält, transfiziert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen geerntet und mit 0,9 nM 125I-HuMIP-1α in Kombination mit 1 μM von entweder nicht-markiertem HuMIP-1α, Maus-MIP-1β, MCP-1, RANTES oder IL-8 inkubiert. Die Menge von ersetzbarem 125I-HuMIP-1α wurde durch Subtrahieren der Menge von 125I-HuMIP-1α, das in Abwesenheit von jeglichem kalten Liganden gebunden war, von der Menge, die in Gegenwart von kaltem Liganden gebunden war, bestimmt. Hintergrund bezieht sich auf Zählungen, die von Zellen erhalten wurden, die mit der Antisense-Ausrichtung von US28 transfiziert waren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • A. Definitionen
  • Im Allgemeinen tragen die folgenden Wörter oder Phrasen, wenn sie in der Beschreibung, den Beispielen oder den Ansprüchen verwendet wurden, die nachstehend angegebene Bedeutung.
  • "C-C CKR-1" bezeichnet den Chemokin-Rezeptor, der oben beschrieben wurde, zusammen mit seiner Aminosäuresequenz oder seinen zellulären Analoga, Allelen, vorbestimmten Aminosäuresequenz-Mutationen, Glykosylierungsvarianten und kovalenten Modifikationen.
  • Ausführungsformen von C-C CKR-1 schließen bekannte Chemokinrezeptoren, insbesondere jene, die im oben genannten Abschnitt über den Hintergrund der Erfindung angegeben sind, und Chemokinrezeptoren, die satzungsgemäß offensichtlich von solchen Chemokinrezeptoren stammen, aus.
  • Der "Waisen-Rezeptor" ist als das vorhergesagte Polypeptid definiert, für das Nucleinsäure kodiert, die unter gering stringenten Bedingungen an Sonden hybridisiert, die ausgehend von bekannten Cytokinrezeptor-Nucleinsäuresequenzen oder von anderen bekannten Sequenzen, die wahrscheinlich strukturelle Ähnlichkeit zu Cytokinrezeptoren aufweisen, entworfen werden oder durch so entworfene PCR-Primer nachweisbar sind, wobei das vorhergesagte Polypeptid auf dem Gebiet der Erfindung noch nicht bekannt ist.
  • "Qualitative biologische C-C-CKR-1-Aktivität" ist als immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop von gereinigtem C-C CKR-1 definiert.
  • "Immunologische Kreuzreaktivität" soll bedeuten, dass das Kandidaten-Polypeptid in der Lage ist, die Bindung von nativem C-C CKR-1 an polyklonale Antikörper bzw. Antiseren, die gegen nativen C-C CKR-1 gezüchtet wurden, durch Konkurrenz zu hemmen.
  • "Isolierte(s) C-C-CKR-1-Nucleinsäure oder -Polypeptid" ist eine C-C-CKR-1-Nucleinsäure oder ein C-C-CKR-1-Polypeptid, die/das identifiziert und von zumindest einem Kontaminanten (Nucleinsäure bzw. Polypeptid) getrennt ist, mit dem sie/es normalerweise in der Natur assoziiert ist, wie z.B. von der menschlichen Quelle von C-C-CKR-1-Nucleinsäure oder -Polypeptid. In bevorzugten Ausführungsformen wird C-C CKR-1 bis zu pharmazeutisch annehmbaren Reinheitsgraden in Bezug auf Proteine ihrer Ursprungsspezies isoliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird C-C-CKR-1-Protein (1) bis zu mehr als 95 Gew.-% des Proteins, und am meisten bevorzugt bis zu mehr als 99 Gew.-%, (2) bis zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz durch ein (zum Zeitpunkt der Einreichung der folgenden Beschreibung) im Handel erhältliches Aminosäure-Sequenzierungsgerät zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität durch herkömmliche, nicht-reduzierende SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter C-C CKR-1 umfasst C-C CKR-1 in situ innerhalb von rekombinanten Zellen, die üblicherweise den betreffenden C-C CKR-1 nicht exprimieren, da, in diesem Fall, zumindest eine Komponente aus der natürlichen Umgebung von C-C CKR-1 nicht vorhanden ist. Isolierter C-C CKR-1 umfasst C-C CKR-1 in einer rekombinanten Zellkultur einer anderen Spezies als der Ursprungsspezies des C-C CKR-1, da der C-C CKR-1 unter solchen Umständen frei von Polypeptiden aus der Quelle sind. Üblicherweise jedoch wird isolierter C-C CKR-1 durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
  • Isolierte C-C-CKR-1-Nucleinsäure umfasst eine Nucleinsäure, die identifiziert und von zumindest einer Containment-Nucleinsäure getrennt ist, mit der sie üblicherweise in der natürlichen Quelle der C-C-CKR-1-Nucleinsäure assoziiert ist. Isolierte C-C-CKR-1-Nucleinsäure ist somit in einer anderen Form vorhanden als in der Form oder Anordnung, in der sie in der Natur vorgefunden wird. Dennoch umfasst isolierte, für C-C CKR-1 kodierende Nucleinsäure C-C-CKR-1-Nucleinsäure in normalerweise C-C-CKR-1-exprimierenden Zellen, worin sich die Nucleinsäure in einer chromosomalen Anordnung befindet, die sich von jener der natürlichen Zellen unterscheidet, oder auf andere Weise durch eine andere als in der Natur vorhandene DNA-Sequenz flankiert ist.
  • Die Nucleinsäure oder das Polypeptid kann zum Einsatz als Diagnostikum oder Sonde unter Verwendung einer Markierung, wie sie nachstehend in der Erläuterung der diagnostischen Tests beschrieben und definiert ist, markiert werden.
  • "C-C-CKR-1-Nucleinsäure" ist als RNA oder DNA definiert, die (a) zumindest 25 Basen der genomischen oder cDNA-Sequenz aufweist, die für C-C CKR-1 kodiert, die (b) komplementär zu der genomischen oder cDNA-Sequenz ist, die für C-C CKR-1 kodiert, die (c) an solche Nucleinsäure hybridisiert und unter stringenten Bedingungen stabil an diese gebunden bleibt, oder die (d) für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 60%, vorzugsweise zumindest 70%, Identität zur Aminosäuresequenz von C-C CKR-1 aufweist und das die Fähigkeit besitzt, zumindest ein C-C-Chemokin zu binden. Vorzugsweise enthält die hybridisierende RNA oder DNA zumindest 25 Basen, noch bevorzugter 40, und am meisten bevorzugt 60 Basen, die mit den nachstehend beschriebenen, für C-C CKR-1 kodierenden Sequenzen identisch sind. Im Idealfall besteht C-C-CKR-1-Nucleinsäure im Wesentlichen nur aus für C-C CKR-1 kodierenden Sequenz oder dem Komplement zu solchen Sequenzen.
  • Die "Stringenz" der Bedingungen zur Hybridisierung ist durch Waschbedingungen nach der Hybridisierungsreaktion definiert. Typischerweise sind Hybridisierungsbedingungen definiert als die Verwendung von Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA enthält. Bedingungen "hoher Stringenz" für den Waschschritt sind typischerweise definiert als die Verwendung von 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C, während Bedingungen "geringer Stringenz" für den Waschschritt typischerweise definiert sind als die Verwendung von 0,5 × SSC, 1% SDS bei 42°C. Diese Bedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), Greene Publishing Associates, NY (1989).
  • Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für beispielsweise Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
  • Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription dieser Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden synthetische Oligonucleotid-Adapter oder -Linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
  • Die Ausgangs-Plasmide, die für die Ausführung dieser Erfindung verwendet werden, sind im Handel erhältlich, sind öffentlich auf nicht eingeschränkter Basis verfügbar oder können aus solchen erhältlichen Plasmiden gemäß den veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Darüber hinaus sind auch andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden durchschnittlichen Fachleuten als solche offensichtlich sein. Verfahren für Restriktionsenzymverdau, Gewinnung oder Isolierung von DNA, Hybridisierungsanalyse und Ligation sind übliche Verfahren und mittlerweile durchschnittlichen Fachleuten durchwegs bekannt. Auch die Zelllinien, die zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden, sind im Handel erhältlich oder öffentlich auf nicht eingeschränkter Basis verfügbar.
  • Ein anderes Verfahren zur Gewinnung des Gens von Interesse ist seine chemische Synthese unter Verwendung der in Engels et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716–734 (1989)) beschriebenen Verfahren. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren, wobei üblicherweise Oligonucleotidsynthese auf festen Trägern eingesetzt wird.
  • "Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten Fragments von DNA aus einem Restriktionsverdau bedeutet die Trennung des Verdaus auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber jener von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, die Entfernung des Gelabschnittes, der das erwünschte Fragment enthält, und die Trennung des Gels von der DNA. Dieses Verfahren ist im Allgemeinen bekannt. Siehe hierzu beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • Auf Aminosäuren wird mit den standardgemäßen drei Buchstaben der IUPAC-Abkürzungen Bezug genommen.
  • B. Allgemeine Verfahren zur Durchführung der Erfindung
  • 1. Herstellung von nativer C-C-CKR-1-Nucleinsäure
  • Die Verwendung des Einzahlartikels "der" in Zusammenhang mit C-C CKR-1 soll nicht bedeuten, dass nur eine DNA-Sequenz für C-C CKR-1 kodiert. Tatsächlich wird erwartet, dass Allele, Processing-Zwischenprodukte und vorbestimmte Sequenzvarianten, die nachstehend beschrieben werden, Sequenzen aufweisen, die sich von jener, die für natives C-C CKR-1 kodiert, unterscheiden. Weiters kann C-C CKR-1 einer Unterfamilie von Chemokinrezeptoren angehören, die einen hohen Grad an Sequenzhomologie aufweisen, jedoch ausreichend variieren, um nicht als Allele zu gelten. Alle diese Sequenzen werden von der Definition von C-C-CKR-1-Nucleinsäure abgedeckt.
  • DNA-Sequenzen, die für C-C-CKR-1 kodieren, können entweder genomische oder cDNA-Sequenzen sein. Jede beliebige, repräsentative genomische Bibliothek kann mit den nachstehend beschriebenen Sonden gescreent werden. Verfahren zur Herstellung genomischer DNA und die Erstellung von cDNA-Bibliotheken sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., s.o.
  • 2. Aminosäuresequenzvarianten von C-C CKR-1
  • Aminosäuresequenzvarianten von C-C CKR-1 werden durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in C-C-CKR-1-DNA oder durch In-vitro-Synthese des erwünschten C-C-CKR-1-Polypeptids hergestellt. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz von nativem C-C CKR-1. Jede beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann gewählt werden, um zum Endkonstrukt zu gelangen, vorausgesetzt, dass das Endkonstrukt die erwünschten Eigenschaften besitzt.
  • Die Aminosäureänderungen können auch post-translationale Bearbeitung von C-C CKR-1 verändern, beispielsweise eine Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder durch eine Veränderung seiner Membranverankerungs-Eigenschaften.
  • Beim Entwurf von Aminosäuresequenzvarianten von C-C CKR-1 hängt die Anordnung der Mutationsstelle und die Art der Mutation von der oder den zu modifizierenden Eigenschaft(en) von C-C CKR-1 ab. Die Mutationsstellen können individuell oder in Serie modifiziert werden, z.B. durch (1) Substituieren zuerst mit einer konservativen Aminosäureauswahl und anschließend mit, je nach den erreichten Resultaten, mehr Reste-Selektionen, durch (2) Deletieren des Target-Rests oder (3) durch Insertieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse, die zur lokalisierten Stelle benachbart sind, oder auch durch Kombinationen der Optionen 1–3.
  • Ein nützliches Verfahren zur Identifikation bestimmter Reste oder Regionen von C-C-CKR-1-Polypeptid, die bevorzugte Stellen für Mutagenese sind, ist unter dem Namen "Alanin-Scanning-Mutagenese" bekannt und wird in Cunningham & Wells (Science 244, 1081–1085 (1989)) beschrieben. Hierbei wird ein Rest oder eine Gruppe von Target-Resten identifiziert (z.B. geladene Reste wie arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (am meisten bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung zwischen den Aminosäuren mit der wässrigen Umgebung in oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit auf diese Substitutionen zeigen, werden dann durch Einführen weiterer oder anderer Varianten an den oder für die Substitutionsstellen verfeinert. Während also die Stelle für die Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt wird, muss die Art der Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann Alanin-Scanning oder Zufallsmutagenese am Target-Codon oder der Target-Region durchgeführt werden, und die exprimierten C-C-CKR-1-Varianten werden auf die optimale Kombination der erwünschten Aktivität gescreent.
  • C-C-CKR-1-Varianten weisen zumindest eine biologische Aktivität der verwandten Sequenz, beispielsweise Chemokinbindung oder antigenetische Aktivität, auf. Vorzugsweise ist das antigenisch aktive C-C CKR-1 ein Polypeptid, das sich an einen Antikörper bindet, der gegen das Polypeptid in seiner nativen Konformation gezüchtet wurde, wobei "native Konformation" im Allgemeinen das Polypeptid beschreibt, wie es in der Natur zu finden ist und das nicht durch chaotrope Mittel, Hitze oder andere Behandlung denaturiert wurde, die die dreidimensionale Struktur des Polypeptids wesentlich modifiziert (dies kann beispielsweise durch Migration auf nichtreduzierenden, nicht-denaturierenden Größenordnungs-Gelen bestimmt werden). Antikörper, der zur Bestimmung von antigenischer Aktivität verwendet wird, ist polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der durch Formulieren des nativen Nicht-Kaninchen-Polypeptids in Freundschem komplettem Adjuvans, subkutanes Injizieren der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion der Formulierung, bis der Titer des Anti-Polypeptid-Antikörpers ein Maximum erreicht, gezüchtet wird.
  • Aminosäuresequenz-Deletionen liegen im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, noch bevorzugter von etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend. Vorzugsweise werden Deletionen in Regionen des Proteins vorgenommen, die die am wenigsten konservierten sind, wenn C-C-CKR-1-Aminosäuresequenz mit anderen Chemokinrezeptoren verglichen wird. Bei solchen Deletionen besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass sie die biologische Aktivität der Polypeptide signifikanter modifizieren als Deletionen, die an anderen Stellen vorgenommen werden. Die Anzahl an aufeinander folgenden Deletionen wird so ausgewählt, dass die Tertiärstruktur von C-C CKR-1 in der betroffenen Domäne, z.B. β-Faltblatt oder α-Helix, aufrechterhalten bleibt.
  • Aminosäuresequenz-Insertionen umfassen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen mit einer Länge im Bereich von einem Rest bis zu Polypeptiden, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Insertionen innerhalb der Sequenz mittels einzelner oder vielfacher Aminosäurereste. "Intrasequenz-Insertionen" (d.h. Insertionen in nerhalb der C-C-CKR-1-Sequenz) können im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10, noch bevorzugter von 1 bis 5, am meisten bevorzugt von 1 bis 3, Resten liegen.
  • Insertionsvarianten von C-C CKR-1 oder seiner extrazellulären Segmente umfassen die Fusion an den N- oder C-Terminus von C-C CKR-1 von immunogenen Polypeptiden, z.B. bakteriellen Polypeptiden wie β-Lactamase oder einem Enzym, für das der E.-coli-trp-Locus kodiert, oder Hefeprotein, und C-terminale Fusionen mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, beispielsweise anstelle von VH- oder VC-Domänen von Immunglobulinen, die konstante Regionen umfassen, Albumin oder Ferritin (wie z.B. in der WO 89/02922, veröffentlicht am 6. April 1989, beschrieben wird).
  • Eine andere Gruppe von Varianten sind Aminosäure-Substitutionsvarianten. Diese Varianten weisen zumindest einen Aminosäurerest im C-C-CKR-1-Molekül auf, der entfernt und anstelle dessen ein anderer Rest insertiert wurde. Die Stellen größten Interesses für Substitutions-Mutagenese umfassen Stellen, die als die aktive(n) Stelle(n) von C-C CKR-1 identifiziert sind, und Stellen, an denen die Aminosäuren, die in C-C CKR-1 von verschiedenen Spezies gefunden wurden, in Bezug auf sperrige Seitenketten, Ladung und/oder Hydrophobizität wesentlich verschieden sind.
  • Andere Stellen von Interesse sind jene, in denen bestimmte Reste von C-C CKR-1 im Vergleich zu anderen Chemokinrezeptoren konserviert sind. Diese Positionen können für die biologische Aktivität von C-C CKR-1 wichtig sein. Diese Stellen, insbesondere jene, die innerhalb einer Sequenz von zumindest drei anderen identisch konservierten Stellen liegen, werden auf eine relativ konservative Weise substituiert. Solche konservativen Substitutionen sind in Tabelle I unter dem Titel "bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden mehr wesentliche Änderungen, die als beispielhafte Substitutionen in Tabelle I bezeichnet werden, oder wie nachstehend in Bezug auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt, und die Produkte werden gescreent.
  • Tabelle I
    Figure 00170001
  • Wesentliche Modifikationen der Funktion oder immunologischen Identität von C-C CKR-1 wurden durch die Auswahl von Substitutionen durchgeführt, die eine signifikant unterschiedliche Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise als eine Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) der sperrigen Seitenkette aufweisen. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt:
    • (1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
    • (2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
    • (3) sauer: asp, glu;
    • (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
    • (5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
    • (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
  • Nicht-konservative Substitutionen umfassen die Änderung eines Elements einer dieser Klassen gegen ein anderes. Solche substituierten Reste können in Regionen von C-C CKR-1 eingeführt werden, die mit anderen Chemokinrezeptoren homolog sind, oder, noch bevorzugter, in die nicht-homologen Regionen des Moleküls.
  • Jeder beliebige Cysteinrest, der nicht in die Aufrechterhaltung der passenden Konformation von C-C CKR-1 eingebunden ist, kann, im Allgemeinen mit Serin, substituiert werden, um die oxidative Stabilität des Moleküls zu verbessern und anormale Vernetzung zu unterbinden.
  • DNA, die für Aminosäuresequenzvarianten von C-C CKR-1 kodiert, wird durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, hergestellt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Fall von natürlich vorkommenden Amionsäuresequenz-Varianten) oder Herstellung durch Oligonucleotid-vermittelte (oder ortsgerichtete) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassetten-Mutagenese einer früher hergestellten Variante oder einer nicht-Varianten-Version von C-C CKR-1. Diese Verfahren können C-C-CKR-1-Nucleinsäure (DNA oder RNA) oder Nucleinsäure, die komplementär zu C-C-CKR-1-Nucleinsäure ist, verwenden. Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertions-Varianten von C-C-CKR-1-DNA. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe beispielsweise die Beschreibungen in Adelman et al., DNA 2, 183 (1983)). PCR-Mutagenese ist auch für die Herstellung von Aminosäurevarianten von C-C CKR-1 geeignet (siehe Erlich, s.o., 61–70). Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Varianten, Kassetten-Mutagenese, basiert auf der in Wells et al. (Gene 34, 315–323 (1985)) beschriebenen Vorgehensweise.
  • 3. Insertion von DNA in ein Klonierungsvehikel
  • Die cDNA oder genomische DNA, die für nativen C-C CKR-1 oder eine C-C-CKR-1-Variante kodiert, wird in einen replizierbaren Vektor zum weiteren Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression insertiert. Zahlreiche Vektoren sind verfügbar, und Selektion des geeigneten Vektors hängt davon ab, ob (1) er für DNA-Amplifikation oder für DNA-Expression verwendet wird, hängt (2) von der Größe der zu insertierenden DNA und (3) von der Wirtszelle, die mit dem Vektor zu transformieren ist, ab. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten, die von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und von der Wirtszelle, mit der er kompatibel sein muss, abhängen. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere der folgenden Komponenten: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • a. Komponente der Signalsequenz
  • Im Allgemeinen kann eine Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil von C-C-CKR-1-DNA sein, die in den Vektor insertiert ist.
  • b. Komponente des Replikationsursprungs
  • Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist in Kloniervektoren diese Sequenz eine, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakte rien geeignet, der 2 μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyomavirus, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zum Klonieren von Vektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist die Replikationsursprungskomponente für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden, weil er den frühen Promotor enthält).
  • Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind zu Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig, können jedoch zur Expression auch in andere Organismen transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, und derselbe Vektor wird zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht in der Lage ist, unabhängig vom Wirtszellenchromosom zu replizieren.
  • DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies kann leicht unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte erreicht werden, beispielsweise durch Einbinden einer DNA-Sequenz, die zu einer in genomischer Bacillus-DNA gefundenen Sequenz komplementär ist, in den Vektor. Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in homologer Rekombination mit dem Genom und Insertion von C-C-CKR-1-DNA. Die Gewinnung von genomischer DNA, die für C-C CKR-1 kodiert, ist jedoch komplizierter als jene eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um C-C-CKR-1-DNA auszuschneiden.
  • c. Komponente des Selektionsgens
  • Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum von transformierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden, erforderlich ist. Wirtszellen, die nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformiert sind, überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) wichtige Nährstoffe zuführen, die aus dem komplexen Medium nicht erhältlich sind, z.B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert.
  • Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet einen Wirkstoff, um Wachstum einer Wirtszelle anzuhaften. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, exprimieren ein Protein, das Wirkstoffresistenz verleiht, und überleben somit die Selektionsbedingungen. Beispiele für diese dominante Selektion verwenden die Wirkstoffe Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327–341 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422–1427 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)). Die drei oben genannten Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Steuerung, um Resistenz gegenüber dem geeigneten Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
  • Ein anderes Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die fähig sind, C-C-CKR-1-Nucleinsäure aufzunehmen, wie beispielsweise Dihydrofolatreductase (DHFR) oder Thymidinkinase. Die Säugetierzellen-Transformanten werden unter Selektionsdruck gebracht, an den nur die Transformanten einheitlich angepasst sind, um zu überleben, indem sie den Marker aufgenommen haben. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen, unter denen die Konzentration von Selektionsmittel im Medium sukzessiv verändert wird, angelegt, was zur Amplifikation von sowohl dem Selektionsgen als auch der DNA, die für C-C CKR-1 kodiert, führt. Amplifikation ist das Verfahren, durch das Gene, nach denen zur Produktion eines Proteins, das maßgeblich für Wachstum ist, größere Nachfrage besteht, im Tandem innerhalb der Chromosome von aufeinander folgenden Generationen rekombinanter Zellen reiteriert werden. Gesteigerte Mengen an C-C CKR-1 werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
  • Zellen beispielsweise, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert sind, werden zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotre xat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält, identifiziert. Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und vermehrt wie in Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(7), 4216–4220 (1980), beschrieben. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Konzentrationen von Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von multiplen Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig von multiplen Kopien anderer DNA, die die Expressionsvektoren enthält, wie beispielsweise der DNA, die für C-C CKR-1 kodiert. Dieses Amplifikationsverfahren kann mit jedem anderen geeigneten Wirt, z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, verwendet werden, trotz der Gegenwart von endogener DHFR, sofern beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen, das äußerst resistent gegenüber Mtx ist, verwendet wird ( EP 117.060 ). Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogene DHFR enthalten), die mit für C-C CKR-1 kodierenden DNA-Sequenzen, Wildtyp-DHFR-Protein und anderen selektierbaren Markern wie z.B. Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase (APH) transformiert oder co-transformiert sind, durch Zellwachstum in Medium, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker wie ein aminoglykosidisches Antibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält, selektiert werden.
  • Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39–43 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141–152 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157–166 (1980)). Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC-Nr. 44076. Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom stellt dann ein wirksames Umfeld zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. In ähnlicher Weise werden Leu-2-defiziente Hefestämme (ATCC-Nr. 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen tragen, ergänzt.
  • e. Komponente des Promotors
  • Expressionsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an C-C-CKR-1-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromauf (5') zum Startcodon eines strukturellen Gens (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1.000 bp) angeordnet sind, die die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, wie z.B. C-C CKR-1, steuern, an die sie operabel gebunden sind. Solche Promotoren können typischerweise zwei Klassen zugeordnet werden: induzierbare und konstitutive Promotoren. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die gesteigerte Niveaus von Transkription aus DNA unter ihrer Steuerung in Reaktion auf eine bestimmte Änderung der Kulturbedingungen, z.B. auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder einer Veränderung der Temperatur, initiieren. Zur Zeit sind zahlreiche Promotoren, die durch eine Vielzahl von potenziellen Wirtszellen erkannt werden, bekannt. Diese Promotoren sind durch Entfernen des Promotors aus der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau und Insertieren der isolierten Promotorsequenz in den Vektor operabel an DNA, die für C-C CKR-1 kodiert, gebunden. Sowohl die native C-C-CKR-1-Promotorsequenz als auch zahlreiche heterologe Promotoren können verwendet werden, um Amplifikation und/oder Expression von C-C-CKR-1-DNA zu steuern. Heterologe Promotoren werden jedoch bevorzugt, da sie im Allgemeinen mehr Transkription und höhere Ausbeuten an exprimiertem C-C CKR-1 ermöglichen als der native C-C-CKR-1-Promotor.
  • Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 617–624 (1979); und Goeddel et al., Nature 281, 544–548 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8(18), 4057–4074 (1980), und die EP 36.776 ) und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Doch auch andere bekannte bakterielle Promotoren sind geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, um hierdurch Fachleuten die Möglichkeit zu geben, sie operabel an DNA, die für C-C CKR-1 kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269–281 (1980)), unter Verwen dung von Linkern oder Adaptoren zu ligieren, um jegliche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten im Allgemeinen auch eine Shine-Dalgrano-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die für C-C CKR-1 kodierende DNA gebunden ist.
  • Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255(24), 12073–12080 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149–167 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900–4907 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil sind, über eine durch Wachstumsbedingungen gesteuerte Transkription zu verfügen, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Verwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in Hitzeman et al., EP 73.657A , beschrieben. Hefe-Enhancer werden auch vorteilhafterweise mit Hefepromotoren verwendet.
  • Promotorsequenzen sind für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene haben eine AT-reiche Region, angeordnet etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle, an der Transkription initiiert wird. Eine andere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf vom Trasnkriptionsstart in vielen Genen zu finden ist, ist eine CXCAAT-Region, worin X jedes beliebige Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene ist eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes zum 3'-Ende der Kodiersequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in Säugetier-Expressionsvektoren insertiert.
  • C-C-CKR-1-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird durch Promotoren, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogelsarkomavirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt von Affenvirus 40 (SV40) gewonnen werden, von heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, von Hitzeschockpromotoren und vom Promotor, der normalerweise mit C-C-CKR-1-Sequenz assoziiert ist, gesteuert, vorausgesetzt solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
  • Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden günstigerweise als ein SV40-Restriktionsfragment gewonnen, das auch den SV40-Virus-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273, 113–120 (1978); Mulligan & Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981)). Der sehr frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus wird günstigerweise als ein HindIII-E-Restriktionsfragment gewonnen (Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982)). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinderpapillomavirus als Vektor ist in der US 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems wird in der US. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), bezüglich der Expression von cDNA, die für Immuninterferon kodiert, in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), bezüglich Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Steuerung eines Thymidinkinase-Promotors aus Herpes-Simplex-Virus; Canaani & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), bezüglich der Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Mäuse- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), bezüglich der Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryonen-Fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Rous-Sarkomavirus-Wiederholung als Promotor.
  • f. Komponente des Enhancerelements
  • Transkription einer DNA, die für C-C CKR-1 dieser Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa von 10–300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Enhancer sind relativ Ausrichtungs- und Positions-unabhängig und wurden 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 464–468 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3(6), 1108–1122 (1983)) zur Transkriptionseinheit innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729–740 (1983)) sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Biol. 4(7), 1293–1305 (1984)) gefunden. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), bezüglich der Elemente zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zu C-C-CKR-1-DNA gespleißt werden, ist jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
  • g. Komponente der Transkriptionstermination
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Menschen oder kernhaltige Zellen aus anderen zellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zur Termination von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'- und gegebenenfalls 3'-Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für C-C CKR-1 kodierenden mRNA transkribiert werden. Die untranslatierten 3'-Regionen umfassen auch Transkriptionsterminationsstellen.
  • Geeignete Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgelisteten Komponenten und die erwünschten Kodier- und Kontrollsequenzen enthalten, werden durch herkömmliche Ligationsverfahren konstruiert. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespaltet, zugeschnitten und zur erwünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
  • Zur Analyse zur Bestätigung von korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC-Nr. 31.466) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden aufgrund ihrer Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, sofern geeignet, ausgewählt. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonuclease-Verdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9(2), 309–321 (1981), oder das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499–560 (1980), sequenziert.
  • Besonders nützlich zur praktischen Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression von für C-C CKR-1 kodierender DNA in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, effizient in einer Wirtszelle zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors ansammelt und dann wieder hohe Konzentrationen eines erwünschten Polypeptids, für das der Expressionsvektor kodiert, synthetisiert. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die einfache positive Identifikation von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren, sowie das rasche Screenen solcher Polypeptide auf erwünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Somit sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung besonders nützlich zur Identifikation von Analoga und Varianten von C-C CKR-1, die C-C-CKR-1-ähnliche Aktivität aufweisen, und zur Analyse der Wirkung der Bindung von Chemokinvarianten an C-C CKR-1.
  • Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für Adaptation an die Synthese von C-C CKR-1 in rekombinanten Wirbeltier-Zellkulturen geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); der EP 117.060 ; und der EP 117.058 beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid für Säugetier-Zellkulturexpression von C-C CKR-1 ist pRK5 (EP-Veröffentlichung Nr. 307.247) oder pSVI6B (US-Serien-Nr. 07/441.574, eingereicht am 22. November 1989).
  • 4. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren von C-C-CKR-1-Expressionsvektoren sind die zuvor beschrieben prokaryotischen, Hefe- oder höheren eukaryotischen Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, z.B. E. coli, Bacilli wie z.B. B. subtilis, Pseudomonas-Spezies wie z.B. P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC-Nr. 31.446), wenn auch andere Stämme wie z.B. E. coli B, E. coli χ1776 (ATCC-Nr. 31.537) und E. coli W3110 (ATCC-Nr. 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und stellen keine Einschränkung dar. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen sekretieren. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierungsverfahren wie z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerase-Reaktion geeignet.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie z.B. Fadenpilze oder Hefe geeignete Wirte für Vektoren, die C-C-CKR-1-DNA enthalten. Saccharomyces cerevisiae, oder herkömmliche Bäckerhefe, wird unter niedereren eukaryotischen Wirts-Mikroorganismen am häufigsten verwendet. Zahlreiche andere Genera, Spezies und Stämme sind jedoch üblicherweise erhältlich und für die praktische Durchführung der Erfindung nützlich, wie z.B. S. pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140–143 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2), 737–742 (1983)), Pichia pastoris ( EP 183.070 ), Trichoderma reesia ( EP 244.234 ), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosylierten C-C-CKR-1-Polypeptiden werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Prinzipiell ist jegliche höhere eukaryotische Zellkultur bearbeitungsfähig, unabhängig, ob sie aus einer Wirbeltier- oder Wirbellosen-Kultur stammt. Beispiele für Wirbellosen-Zellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirusstämme und -varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen aus Wirten wie z.B. Spodoptera-frugiperda-(Raupe), Aedes-aegypti-(Stechmücke), Aedes-albopictus-(Stechmücke), Drosophila-melanogaster-(Fruchtfliege) und Bombyx-mori-Wirtszellen wurden bereits identifiziert. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al. in: Genetic Engineering, J. K. Setlow et al., 8, 277–279, Plenum Publishing (1986), und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Zahlreiche solche viralen Stämme sind öffentlich zugänglich, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als das Virus gemäß der vorliegenden Verwendung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
  • Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdäpfel (Kartoffel), Sojabohne, Petunie, Paradeiser (Tomate) und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens, das davor manipuliert wurde, um C-C-CKR-1-DNA zu enthalten, transfiziert. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für C-C CKR-1 kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt übertragen, sodass dieser transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen C-C-CKR-1-DNA exprimiert. Darüber hinaus sind Regulations- und Signalsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, erhältlich, wie z.B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungs-Signalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561–573 (1982). Weiters sind DNA-Segmente, die aus der Stromauf-Region des T-DNA-780-Gens isoliert wurden, in der Lage, Transkriptionsniveaus von in Pflanzen expri mierbaren Genen in rekombinantem DNA-hältigem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu steigern. Siehe die EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
  • Das Interesse war jedoch für Wirbeltierzellen stets am größten, und Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den vergangenen Jahren bereits zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse & Patterson (Hrsg.) (1973)). Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV 40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonennierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59–72 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC-CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(7), 4216–4220 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HeLa, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomzelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind menschliche Embryonennieren-293-Zellen und Chinahamster-Eierstockzellen.
  • Der für Expression ausgewählte Wirt kann auch ein multizellulärer Organismus, wie z.B. in einem transgenen Tier, sein. Solche Tiere wurden durch Transfektion von Keimzellen, Somazellen oder Embryonen mit heterologer DNA, geeignetes Implantieren der transfizierten Zellen und Reifenlassen der Zellen zu erwachsenen Tieren oder stabiles Integrieren der Zellen in erwachsene Tiere, die heterologe DNA enthalten, gebildet. Ein reproduzierbarer Prozentsatz von solchen Tieren transkribiert und exprimiert die heterologe DNA als Protein, das in Geweben, die Blut oder Serum einbinden, identifiziert werden kann. Geeignete Verfahren zur Herstellung transgener Tiere werden im US-Patent Nr. 4.396.601 und in Palmiter et al., Nature 300, 611–615 (1982), beschrieben.
  • Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Kloniervektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das entsprechend zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, modifiziert wird.
  • Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob eine Kodiersequenz tatsächlich exprimiert wird oder nicht. Durchschnittlichen Fachleuten sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, z.B. CaPO4 und Elektroporation. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Hinweis auf das Funktionieren dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
  • Transformation bezeichnet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder als integrativer chromosomaler Bestandteil. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al. beschrieben wird, wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315–330 (1983), und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren, das in den Abschnitten 16.30–16.37 von Sambrook et al., s.o., beschrieben wird, bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtsystemtransformationen wurden von Axel in US 4.399.316 , ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen zu Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bacteriol. 130(2), 946–947 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(8), 3829–3833 (1979), durchgeführt. Doch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen wie beispielsweise Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion können verwendet werden.
  • 5. Kultivieren der Wirtszellen
  • Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um C-C-CKR-1-Polypeptid dieser Erfindung herzustellen, werden in geeignetem Medium kultiviert, wie im Allgemeinen von Sambrook et al., s.o., beschrieben wird.
  • Die Säugetierwirtszellen, die verwendet werden, um C-C CKR-1 dieser Erfindung herzustellen, können in zahlreichen verschiedenen Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) sind zum Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Darüber hinaus kann jedes der Medien, die in Ham & McKeehan, Meth. Enz. 58, 44–93 (1979), Barnes & Sato, Anal. Biochem. 102, 255–270 (1980), und in den US 4.767.704 ; 4.657.866; 4.927.762 oder 4.560.655; in der WO 90/03430; WO 87/00195; dem US-Pat. Re. 30.985; oder US 5.122.469 beschrieben sind, als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Alle diese Medien können, sofern erforderlich, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. GentamycinTM-Wirkstoff), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in geringen Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer entsprechenden Energiequelle ergänzt sein. Alle anderen erforderlichen Zusätze können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen, die Fachleuten bekannt sind, eingebunden werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die davor für die zur Expression selektierten Wirtszellen verwendet wurden, und sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt.
  • Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung verwiesen wird, umfassen Zellen in In-vitro-Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstiers befinden.
  • 6. Detektion von Genamplifikation/-expression
  • Genamplifikation und/oder -expression können in einer Probe, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer entsprechend markierten Sonde, direkt gemessen werden. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am üblichsten sind jedoch Radioisotope, insbesondere 32P. Dennoch können auch andere Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Stelle zur Bindung an Avidin oder an Antikörper, die mit zahlreichen verschiedenen Markierungen, wie z.B. Radionucliden, fluoreszierenden Substanzen, Enzymen oder dergleichen, markiert sein können.
  • Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Protein-Duplices, erkennen können. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann dort durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung eines Duplex an der Oberfläche die Gegenwart des an den Duplex gebundenen Antikörper nachgewiesen werden kann.
  • Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie z.B. durch immunhistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Mit immunhistochemischen Färbungsverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratisierung und Fixierung, gefolgt von Umsetzung mit markierten Antikörpern, die für das gebundene Genprodukt spezifisch sind, worin die Markierungen üblicherweise visuell nachweisbar sind, z.B. enzymatische Markierungen, fluoreszierende Markierungen, lumineszierende Markierungen und dergleichen. Ein besonders empfindliches Färbungsverfahren, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
  • Antikörper, die zur immunhistochemischen Färbung und/oder für den Test von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Geeigneterweise können die Antikörper gegen ein natürliches oder synthetisches C-C-CKR-1-Polypeptid oder eine Variante davon hergestellt werden.
  • 7. Reinigung von C-C-CKR-1-Polypeptid
  • C-C CKR-1 wird aus Zellkulturen durch Solubilisieren von Zellmembranen in einem Detergens gewonnen.
  • Wenn ein menschlicher C-C CKR-1 in einer rekombinanten Zelle, die nicht von menschlichem Ursprung ist, exprimiert wird, so ist C-C CKR-1 vollständig frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Dennoch ist es notwendig, C-C CKR-1 von rekombinanten Zellproteinen oder -polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die in Bezug auf Protein im Wesentlichen homogen zu C-C CKR-1 sind. In einem ersten Schritt werden die Zellen zentrifugiert, um sie vom Kulturmedium zu trennen, und in weiterer Folge geeigneten Reinigungsverfahren wie z.B.: Fraktionierung an Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder einem anderen Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75; unterzogen.
  • C-C-CKR-1-Varianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert wurden, werden auf dieselbe Weise gewonnen wie der natürliche C-C CKR-1, wobei jegliche wesentliche Veränderung der Eigenschaften, die durch die Variation verursacht wird, berücksichtigt wird. Beispielsweise erleichtert die Herstellung einer C-C-CKR-1-Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z.B. mit einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Immunaffinitätssäule, die Antikörper gegen das Antigen enthält, kann verwendet werden, um die Fusion zu adsorbieren. Immunaffinitätssäulen wie z.B. eine polyklonale Kaninchen-Anti-C-C-CKR-1-Säule kann verwendet werden, um C-C-CKR-1-Variante durch Bindung an zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren. Ein Proteaseinhibitor wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann auch nützlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und Antibiotika können eingebunden werden, um das Wachstum von hinzugekommenen Kontaminanten zu unterbinden. Fachleuten werden verstehen, dass Reinigungsverfahren, die für natürlichen C-C CKR-1 geeignet sind, bestimmter Modifikationen bedürfen, um Veränderungen der Eigenschaften von C-C CKR-1 oder seiner Varianten bei Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.
  • 8. Kovalente Modifikationen von C-C-CKR-1-Polypeptiden
  • Kovalente Modifikationen von C-C-CKR-1-Polypeptid oder seiner Glykosyl-Substituenten sind in den Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden. Sowohl nativer C-C CKR-1 als auch Aminosäuresequenzvarianten von C-C CKR-1 können kovalent modifiziert werden. Kovalente Modifikationen von C-C CKR-1, Fragmente davon oder Antikörper hiergegen werden in das Molekül durch Umsetzen von Target-Aminosäureresten von C-C CKR-1, Fragmenten davon oder C-C-CKR-1-Antikörper mit einem organischen derivatisierenden Mittel eingeführt, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten zu reagieren. Am häufigsten sind C-C CKR-1 und seine Antikörper kovalent an nachweisbare Gruppen, die zur Diagnose verwendet werden, z.B. Enzyme, Radioisotope, Spinmarkierungen, Antigene, fluoreszierende oder chemilumineszierende Gruppen und dergleichen, gebunden.
  • Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogencetaten (und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazol)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
  • Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
  • Lysinyl- und Amino-terminale Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt die Umkehrung der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-hältigen Resten umfassen Imidoester wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin zählen, modifiziert. Derivatisierung von Argininresten erfordert aufgrund des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen erfolgt. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Arginin-epsilon-Aminogruppe reagieren.
  • Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann unter besonderem Interesse an der Einführung von spektralen Markierungen in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan erfolgen. Am üblichsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von 125I oder 131I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests herzustellen, wobei das zuvor beschriebene Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
  • Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') modifiziert, worin R und R' verschiedene Alkylgruppen, wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid, sind. Weiters werden Aspartyl- und Glu tamylreste zu Asparaginyl und Glutaminylresten durch Reaktion mit Ammoniumionen umgesetzt.
  • Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich für das Vernetzen von C-C CKR-1, seiner Fragmente oder Antikörper zu einer wasserunlöslichen Trägermatrize oder -oberfläche zur Verwendung in Verfahren zur Reinigung von Anti-C-C-CKR-1-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis-(succinimidylpropionat), und bifunktionale Maleinimide, wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergaben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrizen wie z.B. Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die in den US 3.969.287 , 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substrate zur Proteinimmobilisierung verwendet.
  • Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Schutzumfang dieser Erfindung.
  • Andere Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminaler Carboxylgruppe.
  • Eine andere Art kovalenter Modifikation von C-C-CKR-1-Polypeptid, die ebenfalls in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst eine Änderung des nativen Glyko sylierungsmusters des Polypeptids. Unter Änderung wird die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydrat-Gruppierungen, die im nativen Polypeptid vorhanden sind, und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im nativen Polypeptid nicht vorhanden sind, verstanden.
  • Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrestes. Die Tripeptid-Sequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X jede beliebige Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für enzymatische Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Somit schafft die Gegenwart einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Bindung einer der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am üblichsten an Serin oder Threonin, wobei 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin ebenfalls verwendet werden können.
  • Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zu C-C-CKR-1-Polypeptid erfolgt günstigerweise durch Ändern der Aminosäuresequenz, sodass sie eine oder mehrere der zuvor beschriebenen Tripeptid-Sequenzen enthält (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Änderung kann auch durch die Addition von oder die Substitution durch einem/n oder mehrere(n) Serin- oder Threoninresten an der nativen C-C-CKR-1-Sequenz vorgenommen werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Aus praktischen Gründen wird die C-C-CKR-1-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Änderungen auf DNA-Niveau, insbesondere durch Mutation der für C-C-CKR-1-Polypeptid kodierenden DNA an präselektierten Basen, geändert, sodass Codons gebildet werden, die in die erwünschten Aminosäuren translatieren. Die DNA-Mutation(en) kann bzw. können unter Verwendung der zuvor unter der Überschrift "Aminosäuresequenzvarianten von C-C CKR-1" beschriebenen Verfahren vorgenommen werden.
  • Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am C-C-CKR-1-Polypeptid ist der Einsatz von chemischem oder enzymatischem Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind dadurch von Vorteil, dass sie die Herstellung des Polypeptids in einer Wirtszelle, die Glykosylierungsfähigkeiten für N- und O-gebundene Glykosylierung aufweist, nicht erfordern. Je nach verwendetem Bindungsverfahren kann bzw. können der bzw. die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen wie z.B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen wie z.B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste wie z.B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren werden in der am 11. September 1987 veröffentlichten WO 87/05330 sowie in Aplin & Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981)) beschrieben.
  • Die Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die am nativen C-C-CKR-1-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erfolgen. Chemische Deglykosylierung erfordert das Aussetzen des Polypeptids gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker außer des Bindungszuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt bleibt. Chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin et al. (Arch. Biochem. Biophys. 259, 52–57 (1987)) und von Edge et al. (Anal. Biochem. 118, 131–137 (1981)) beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung zahlreicher verschiedener Endo- und Exo-Glycosidasen erreicht werden, wie auch von Thotakura et al. (Meth. Enzymol. 138, 350–359 (1987)) beschrieben wird.
  • Glykosylierung an potenziellen Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin unterbunden werden, wie Duskin et al. (J. Biol. Chem. 257, 3105–3109 (1982)) beschreiben. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glycosidbindungen.
  • Der C-C CKR-1 kann auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation (beispielsweise Hydroxymethylcellulose oder Gelatin-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]mikrokapseln) hergestellt werden, in kolloide Arzneimittel freisetzende Systeme (beispielsweise Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen werden. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
  • C-C-CKR-1-Präparate sind auch zur Herstellung von Antikörpern nützlich, zur Verwendung als Standards in Tests für C-C CKR-1 (z.B. durch Markieren von C-C CKR-1 zur Verwendung als ein Standard in einem Radioimmuntest, enzymgekoppelten Immuntest oder einem Radiorezeptortest), in Affinitäts-Reinigungsverfahren und in kompetitiven Rezeptorbindungstests, wenn sie mit Radioiod, Enzymen, Fluorophoren, Spinmarkierungen und dergleichen markiert sind.
  • Da es häufig schwierig ist, im Vorhinein die Eigenschaften einer Variante von C-C CKR-1 zu bestimmen, wird verstanden werden, dass gewisses Screenen der gewonnenen Variante erforderlich sein wird, um die optimale Variante zu selektieren. Beispielsweise wird eine Veränderung der immunologischen Eigenschaft von C-C-CKR-1-Molekül, wie z.B. Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch einen kompetitiven Immuntest gemessen. Die Variante wird auf Veränderungen der Suppression oder auf Steigerung ihrer Aktivität durch Vergleichen mit der im selben Test am nativen C-C CKR-1 beobachteten Aktivität getestet. Andere mögliche Modifikationen von Protein- oder Polypeptideigenschaften wie z.B. Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobizität, Empfänglichkeit für proteolytischen Abbau oder Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren getestet.
  • 9. Therapeutische Zusammensetzungen und Verabreichung von C-C CKR-1
  • Therapeutische Formulierungen von C-C CKR-1 (einschließlich seiner C-C-CKR-1-Bindungsfragmente) oder Antikörpern hiergegen werden zur Lagerung durch Vermischen von C-C CKR-1, das den erwünschten Reinigungsgrad aufweist, mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelträgern oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o.) in Form eines Lyophilisats oder von wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisatoren sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen gegenüber den Rezipienten nichttoxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Der C-C CKR-1 oder -Antikörper, der zur In-vivo-Verabreichung zu verwenden ist, muss steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution vorgenommen werden. Der C-C CKR-1 wird üblicherweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
  • Therapeutische C-C-CKR-1- oder -Antikörper-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise in einem Lösungsbeutel zur intravenösen Verabreichung oder in einer Phiole mit einem Septum, das mit einer Nadel zur subkutanen Injektion durchstochen werden kann, gegeben.
  • Die Art der Verabreichung von C-C CKR-1 oder -Antikörper erfolgt gemäß bekannter Verfahren, z.B. durch Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, oder mittels Retardsysteme, die nachstehend erläutert werden.
  • Geeignete Beispiele von Retard-Präparaten umfassen semipermeable Polymermatrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln. Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( US 3.773.919 , EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982)), Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.) oder Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ). Retard-C-C-CKR-1- oder -Antikörperzusammensetzungen umfassen auch durch Liposomen eingefangenen C-C CKR-1 oder -Antikörper. Liposomen, die C-C CKR-1 oder -Antikörper enthalten, werden mittels an sich bekannter Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008; US 4.485.045 und US 4.544.545 ; und EP 102.324 . Üblicherweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200–800 Å) unilamellaren Typ, in dem der Lipidgehalt über etwa 30 mol.-% Cholesterin liegt und der selektierte Abschnitt auf die optimale C-C-CKR-1- oder -Antikörpertherapie eingestellt ist.
  • Eine wirksame Menge von C-C CKR-1 oder -Antikörper, die therapeutisch einzusetzen ist, hängt beispielsweise von den therapeutischen Zielen, der Art der Verabreichung und dem Zustand des Patienten ab. Beispielsweise wird erwartet, dass C-C CKR-1 in der Behandlung von Cytokin-vermittelter Entzündung therapeutische Wirkung zeigt. Demgemäß muss der therapierende Arzt die Dosierung so titrieren und die Art der Verabreichung wie erforderlich modifizieren, dass die optimale therapeutische Wirkung erzielt werden kann. Typischerweise verabreicht der Arzt C-C CKR-1 oder -Antikörper, bis eine Dosierung erreicht ist, die die erwünschte Wirkung erzielt.
  • Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mittels herkömmlicher Tests beobachtet werden.
  • 10. C-C-CKR-1-Antikörper-Präparat
  • Polyklonale Antikörper gegen C-C CKR-1 werden im Allgemeinen in Tieren mit multiplen subkutanen (sk) oder intraperitonealen (ip) Injektionen von C-C CKR-1 und einem Adjuvans gezüchtet. Immunisierung mit rekombinanten Zellen, die mit C-C CKR-1 transformiert sind (z.B. Maus- oder CHO-Zellen, die mit menschlichem C-C CKR-1 transformiert sind), kann zufrieden stellend sein, oder es kann nützlich sein, C-C CKR-1 zu trennen und es oder ein Fragment davon, das die Target-Aminosäuresequenz enthält, an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsin-Inhibitor, unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder R1N=C=NR, worin R und R1 verschiedene Alkylgruppen sind.
  • Tiere werden üblicherweise gegen die Zellen oder immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg oder 1 μg von C-C CKR-1 in Freundschem komplettem Adjuvans und intradermale Injektion der Lösung an mehreren Stellen immunisiert. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge des Konjugats in Freundschem komplettem Adjuvans durch subkutane Injektionen an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Anti-C-C-CKR-1-Titer getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer den Sättigungswert erreicht hat. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat desselben C-C CKR-1 geboostet, jedoch an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch Aggregationsmittel wie Alaun können verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken.
  • Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von kombinatorischen Bibliotheken variabler Domänen und von Screeningverfahren, um die erwünschten Anti-C-C-CKR-1-Antikörper zu identifizieren.
  • Monoklonale Antikörper werden durch Gewinnen von Milzzellen aus immunisierten Tieren und durch Immortalisierung der Zellen auf herkömmliche Weise, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen oder durch Epstein-Barr-(EB-)Virustransformation, und durch Screenen auf Klone, die den erwünschten Antikörper exprimieren, hergestellt.
  • Der monoklonale Antikörper ist vorzugsweise spezifisch für jedes Target-C-C-CKR-1-Polypeptid. Der Antikörper wird so ausgewählt, dass er entweder agonistisch oder antagonistisch ist oder keine Wirkung auf die Aktivität oder Bindung des C-C CKR-1 hat.
  • 11. Verwendungen von C-C-CKR-1-Nucleinsäure und -Antikörpern
  • Die für C-C CKR-1 kodierende Nucleinsäure kann als ein Diagnostikum für Gewebetypisierung verwendet werden. Beispielsweise können Verfahren wie In-situ-Hybridisierung und Northern- und Southern-Blotting sowie PCR-Analyse verwendet werden, um zu bestimmen, ob DNA und/oder RNA, die für C-C CKR-1 kodieren, im oder in den zu bewertenden Zelltyp(en) vorhanden sind.
  • Isoliertes C-C-CKR-1-Polypeptid kann in quantitativen Diagnosetests als Standard oder Kontrolle verwendet werden, der bzw. die mit Proben z.B. aus Erythrozyten, die unbekannte Mengen an C-C CKR-1 enthalten, verglichen werden kann. Rekombinante Zellen, die C-C CKR-1 exprimieren, können in Tests für C-C-CKR-1-Liganden auf dieselbe Weise verwendet werden, wie beispielsweise Neutrophile in IL-8-Tests verwendet werden. Die C-C-CKR-1-Polypeptide, -Fragmente oder -Zellen (als solche oder derivatisiert) können auch als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern gegen C-C CKR-1 oder zur Reinigung solcher Antikörper von Aszites oder rekombinantem Zellkulturmedium verwendet werden.
  • C-C-CKR-1-Antikörper sind für Diagnosetests auf C-C-CKR-1-Expression in spezifischen Zellen oder Geweben nützlich, worin die Antikörper auf dieselbe Weise wie C-C CKR-1, wie oben beschrieben, markiert und/oder an einer unlöslichen Matrize immobilisiert werden. C-C-CKR-1-Antikörper sind auch zur Affinitätsreinigung von C-C CKR-1 aus rekombinanter Zellkultur oder aus natürlichen Quellen nützlich. Die C-C-CKR-1-Antikörper, die nicht auf nachweisbare Weise mit anderen Chemokinrezeptoren kreuzreagieren, können verwendet werden, um jeden C-C CKR-1 zu reinigen, der frei von anderen homologen Chemokinrezeptoren ist. C-C-CKR-1-Antikörper, die Antagonisten der PF4-Superfamilie sind, sind als Anti-Entzündungsmittel oder bei der Behandlung anderer PF4-Superfamilien-vermittelten Störungen nützlich.
  • Geeignete Diagnosetests für C-C CKR-1 und seine Antikörper sind an sich bekannt. Solche Tests umfassen kompetitive und Sandwich-Tests sowie sterische Inhibitionstests. Kompetitive und Sandwich-Verfahren verwenden einen Phasentrennungsschritt als einen integralen Bestandteil des Verfahrens, während sterische Inhibitionstests in einem einzigen Reaktionsgemisch durchgeführt werden. Im Wesentlichen werden dieselben Verfahren für den Test von C-C CKR-1 und für Substanzen, die C-C CKR-1 binden, verwendet, wobei jedoch bestimmte Verfahren je nach Molekulargewicht der zu testenden Substanz bevorzugt werden. Daher werden die zu testenden Substanzen Analyt genannt, ungeachtet der Tatsache, dass sie ein Antigen oder Antikörper sind, und Proteine, die sich an den Analyt binden, werden als Bindungspartner bezeichnet, unabhängig davon, ob sie Antikörper, Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene sind.
  • Analytische Verfahren für C-C CKR-1 oder seiner Antikörper verwenden alle eines oder mehrere der folgenden Reagenzien: markiertes Analyt-Analogon, immobilisiertes Analyt-Analogon, markierten Bindungspartner, immobilisierten Bindungspartner und sterische Konjugate. Die markierten Reagenzien sind auch als "Tracer" bekannt.
  • Die verwendete Markierung (und dies ist auch nützlich, um C-C-CKR-1-Nucleinsäure zur Verwendung als Sonde zu markieren) ist jegliche nachweisbare Funktionalität, die die Bindung zwischen Analyt und seinem Bindungspartner nicht stört. Zahlreiche Markierungen sind zur Verwendung in Immuntests bekannt, Beispiele umfassen Gruppierungen, die direkt nachgewiesen werden können, wie z.B. Fluorochrom, chemilumineszierende Substanzen und radioaktive Markierungen, sowie Gruppierungen, wie z.B. Enzyme, die reagiert oder derivatisiert werden müssen, um nachgewiesen zu werden. Beispiele für solche Markierungen umfassen die Radioisotope 32P, 14C, 125I, 3H und 131I, Fluorophore wie z.B. Seltenerdchelate oder Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon, Luciferasen, z.B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase (US-Pat. Nr. 4.737.456), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen, z.B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase, heterozyklische Oxidasen wie z.B. Uricase und Xanthinoxidase, gebunden mit einem Enzym, das Wasserstoffperoxid verwendet, um einen Farbstoffvorläufer wie z.B. HRP zu oxidieren, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase, Biotin/Avidin, Spinmarkierungen, Bakteriophagenmarkierungen, stabile freie Radikale und dergleichen.
  • Herkömmliche Verfahren sind erhältlich, um diese Markierungen kovalent an Proteine oder Polypeptide zu binden. Beispielsweise können Bindungsmittel wie Dialdehyde, Carbodiimide, Dimaleinimide, Bis-imidate, Bis-diazotiertes Benzidin und dergleichen verwendet werden, um die Antikörper mit den zuvor beschriebenen fluoreszierenden, chemilumineszierenden und Enzymmarkierungen zu markieren. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 3.940.475 (Fluorimetrie) und 3.645.090 (Enzyme); Hunter et al., Nature 194, 495–496 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014–1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods 40, 219–230 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407–412 (1982). Bevorzugte Markierungen sind Enzyme wie z.B. Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase.
  • Die Konjugation solcher Markierungen, einschließlich der Enzyme, an den Antikörper ist für durchschnittliche Fachleute auf dem Gebiet der Immuntestverfahren eine herkömmliche manipulative Vorgehensweise. Siehe beispielsweise O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in: Methods in Enzymology, J. J. Langone & H. Van Vunakis (Hrsg.), Bd. 73, Academic Press, New York, New York, 147–166 (1981)). Solche Bindungsverfahren sind zur Verwendung mit C-C CKR-1 oder seinen Antikörpern geeignet, die alle proteinhältig sind.
  • Immobilisierung von Reagenzien ist für bestimmte Testverfahren erforderlich. Immobilisierung erfordert das Trennen des Bindungspartners von jeglichem Analyt, der frei in Lösung verbleibt. Dies erfolgt üblicherweise durch entweder Unlöslichmachen des Bindungspartners oder Analyt-Analogons vor dem Testverfahren, beispielsweise durch Adsorption an eine wasserunlösliche Matrize oder Oberfläche (Bennich et al., US 3.720.760 ), durch kovalente Bindung (z.B. unter Verwendung von Glutaraldehyd-Vernetzung) oder durch anschließendes Insolubilisieren des Partners oder Analogons, z.B. durch Immunfällung.
  • Andere Testverfahren, die als kompetitive Tests oder Sandwich-Tests bekannt sind, sind durchwegs üblich und in der kommerziellen Diagnoseindustrie weit verbreitet.
  • Kompetitive Tests bauen auf der Fähigkeit eines Tracer-Analogons auf, mit dem Testprobenanalyt um eine limitierte Anzahl an Bindungsstellen an einem gemeinsamen Bindungspartner zu konkurrieren. Der Bindungspartner wird im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion unlöslich gemacht, und anschließend werden Tracer und Analyt, die an den Bindungspartner gebunden sind, von dem ungebundenen Tracer und Analyt getrennt. Diese Trennung erfolgt durch Dekantieren (wenn der Bindungspartner im Vorhinein insolubilisiert wurde) oder durch Zentrifugieren (wenn der Bindungspartner nach der Konkurrenzreaktion ausgefällt wurde). Die Menge an Testprobenanalyt ist umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Tracer, wie durch die Menge an Markersubstanz gemessen werden kann. Dosis-Wirkungs-Kurven mit bekannten Mengen an Analyt wurden hergestellt und mit den Testergebnissen verglichen, um die Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyt quantitativ zu bestimmen. Diese Tests werden als ELISA-Systeme bezeichnet, wenn Enzyme als nachweisbare Marker verwendet wurden.
  • Eine andere Art von kompetitiven Test, der als "homogener" Test bezeichnet wird, erfordert keine Phasentrennung. Hier wird ein Konjugat eines Enzyms mit dem Analyt hergestellt und so verwendet, dass, wenn sich der Anti-Analyt an den Analyt bindet, die Gegenwart des Anti-Analyts die Enzymaktivität modifiziert. In diesem Fall werden C-C CKR-1 oder seine immunologisch aktiven Fragmente mit einer bifunktionellen organischen Brücke an ein Enzym wie z.B. Peroxidase konjugiert. Konjugate werden zur Verwendung mit Anti-C-C-CKR-1 ausgewählt, sodass Bindung des Anti-C-C-CKR-1 die Enzymaktivität der Markierung hemmt oder potenziert. Dieses Verfahren an sich wird unter dem Namen EMIT weitverbreitet praktiziert.
  • Sterische Konjugate werden in sterischen Hinderungsverfahren für homogene Tests verwendet. Diese Konjugate werden durch kovalente Bindung eines niedermolekularen Haptens an einen kleinen Analyt synthetisiert, sodass der Antikörper gegen Hapten im Wesentlichen nicht in der Lage ist, das Konjugat zugleich mit dem Anti-Analyt zu binden. In diesem Testverfahren bindet der in der Testprobe vorhandene Analyt den Antianalyt, wodurch er ermöglicht, dass Anti-Hapten das Konjugat bindet, was wiederum in einer Änderung der Eigenschaft des Konjugat-Haptens verändert, z.B. eine Veränderung der Fluoreszenz bewirkt, wenn das Hapten ein Fluorophor ist.
  • Sandwich-Tests sind besonders zur Bestimmung von C-C CKR-1 oder C-C-CKR-1-Antikörpern nützlich. In sequenziell angeordneten Sandwich-Tests wird ein immobilisierter Bindungspartner verwendet, um Testprobenanalyt zu adsorbieren, die Testprobe wird beispielsweise durch Waschen entfernt, der gebundene Analyt verwendet, um markierten Bindungspartner zu adsorbieren, und gebundenes Material wird dann vom restlichen Tracer getrennt. Die Menge an gebundenem Tracer ist direkt proportional zum Testprobenanalyt. Im "gleichzeitigen" Sandwich-Test wird die Testprobe nicht vor dem Zusatz des markierten Bindungspartners abgetrennt. Ein sequenzieller Sandwich-Test unter Verwendung eines monoklonalen Anti-C-C-CKR-1-Antikörpers als einen Antikörper und eines polyklonalen Anti-C-C-CKR-1-Antikörpers als den anderen Antikörper ist zum Testen von Proben auf C-C-CKR-1-Aktivität nützlich.
  • Die obigen Verfahren sind nur Beispiele für Diagnosetests für C-C-CKR-1 und -Antikörper. Andere Verfahren, die nun oder nachstehend zur Bestimmung dieser Analyte erläutert werden, fallen, einschließlich der zuvor beschriebenen Biotests, ebenfalls in den Schutzumfang der Erfindung.
  • Die folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung dargeboten.
  • C. VERSUCHSBEISPIELE
  • Beispiel I
  • Isolierung von Waisen-Rezeptoren
  • Ein Klonierungsvorgang für "Waisen-Rezeptoren" wurde eingesetzt, um zu versuchen, cDNAs, die für C-C-Chemokinrezeptoren kodieren, zu isolieren. Die Zelloberflächenrezeptoren für die chemischen Lockstoffe C5a (N. P. Gerard et al., Nature 349, 614–617 (1991)), das bakterielle Tripeptid fMLP (F. Boulay et al., Biochemistry 29, 11123–11133 (1990)) sowie zwei Rezeptoren für die C-X-C-Chemokin-IL-8-Rezeptoren A und B (IL8rA und IL8rB) wurden vor kurzer Zeit kloniert (W. E. Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991); P. M. Murphy et al., Science 253, 1280–1283 (1991)), und es wurde erkannt, dass sie zur Superfamilie von Rezeptorproteinen gehören, von deren Strukturen vorhergesagt wird, dass sie die Zellmembran sieben Mal queren (H. G. Dohlman et al., Annu. Rev. Biochem. 60, 653–688 (1991)). Da sieben-Transmembran-umspannende Moleküle typischerweise an G-Proteine gebunden sind, deren Funktion durch Pertussis-Toxin inhibiert werden kann, nahmen die Erfinder an, dass die Rezeptoren für die C-C-Chemokinklasse von Proteinen ebenfalls die Sieben-Transmembran-Architektur aufweisen würden. Demzufolge wurden zwei degenerierte Oligonucleotide, die konservierten Aminosäuresequenzen in zwei Transmembran-Regionen (TM) der IL8rA-, der C5a- und der fMLP-Rezeptoren entsprechen, synthetisiert. Das erste Oligonucleotid entsprach einer Region in TM2: LNLA (L/V) AD (L/F) (L/G) (Seq.-ID Nr. 9), und das zweite entsprach einer Region in TM7: NP (I/M) (I/L) Y (A/V) (F/V) (I/M/A) GQ (Seq.-ID Nr. 10).
  • Diese Oligomere wurden dann als Primer unter Verwendung von cDNA-Substraten aus verschiedenen blutbildenden Zelltypen, die dafür bekannt sind, auf C-C-Chemokine einschließlich peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) zu reagieren, und aus den Zelllinien 0937, HL60 und THP-1 in RT-PCR-Versuchen verwendet. PCR wurde wie folgt durchgeführt. 1–2 μg von Gesamt-RNA aus verschiedenen blutbildenden Zelllinien wurden als Substrate in RT-PCR verwendet (J. W. Larrick, Trends Biotech. 10, 146–152 (1992)), wie vom Lieferanten empfohlen wurde (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Degenerierte Oligonucleotide, die konservierten Regionen von Chemoattraktans-Rezeptoren entsprachen, wurden in der PCR verwendet. PCR-Bedingungen waren wie folgt: 94°C, 0,5'; 50–55°C, 0,5'; 72°C 0,5–1'; 30 Zyklen. PCR-Produkte wurden stumpfendig in die SmaI-Stelle von pBS (Stratagene, LaJolla, CA) wie zuvor beschrieben (T. Nguyen et al., Gene 109, 211–208 (1991)) kloniert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Quiagen-Sets (Quiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten isoliert. Sequenzieren erfolgte mit Sequenase-Set (USBC, Cleveland, OH) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
  • Subklonieren und Sequenzieren der PCR-Produkte zeigten die Gegenwart von IL8rA, IL8rB, C5a-Rezeptor und von zwei neuen Klonen auf, die Eigenschaften von Sieben-Transmembran-Segment-Rezeptoren und ausgeprägte Ähnlichkeit zu den IL-8-Rezeptoren aufwiesen. Teilweise funktionelle Charakterisierung dieser Waisen-Rezeptoren zeigte, dass sie sich nicht an HuMIP-1α binden. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese zwei Klone, die mit den IL-8-Rezeptoren stärker verwandt waren als mit anderen sieben-Transmembran-umspannenden Rezeptoren, ein neues konserviertes Aminosäuremotiv am Ende von TM3 aufwiesen, DRYLAIVHA (Seq.-ID Nr. 11), das eine Subfamilie von IL-8-Rezeptor-verwandten, sieben-Transmembran-umspannenden Molekülen zu definieren schien, die die C5a- und die fMLP-Rezeptoren ausschloss. Daher wurde ein zweiter Durchgang von RT-PCR/Waisen-Klonieren unter Verwendung des TM2-degenerierten Oligonucleotids und eines DRYLAIVHA-(Seq.-ID Nr. 11)degenerierten Oligonucleotids durchgeführt. Um darüber hinaus die Möglichkeiten zur Erhaltung von C-C-Chemokinrezeptoren zu steigern, wurde cDNA aus kultivierten menschlichen Monozyten, die radioaktiv markier tes HuMIP-1α binden, und aus B-Zellen, die chemotaktisch auf HuMIP-1α reagieren, gewonnen und in der PCR-Reaktion verwendet. Klonieren und Sequenzieren dieser PCR-Produkte brachte mehrere zusätzliche, einmalige, sieben-Transmembran-umspannende Rezeptoren hervor.
  • Monozyten wurden durch herkömmliche Verfahren kultiviert, die üblicherweise auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Kurz zusammengefasst wurden Buffy-Coat-Zellen an einem Ficoll-Gradienten getrennt. Mononukleäre Zellen, die aus der Grenzschicht gewonnen wurden, wurden wiederholt zentrifugiert, um Plättchen zu entfernen. Die Monozyten wurden durch Adhäsion an Gewebekulturschälchen von anderen mononukleären Zellen getrennt. Die nicht-adhärenten Zellen wurden abgewaschen, und die adhärenten Monozyten wurden dann 48–72 Stunden vor Verwendung kultiviert.
  • Alternativ dazu könnte genomische oder cDNA auf die Gegenwart von Waisen-Rezeptorgenen durch herkömmliche Southern-Blot-Hybridisierung an die Oligomere, wie zuvor beschrieben, oder an Sonden aus klonierter DNA eines sieben-Transmembran-umspannenden Proteins gescreent werden.
  • Beispiel II
  • Charakterisierung von C-C-CKR-1-DNA
  • Eine cDNA, die einem Klon entspricht, JOSH1, wurde durch Screenen einer λgt10-cDNA-Bibliothek, die aus PMA-(Phorbol-12-myristat-13-acetat) behandelten HL60-Zellen erstellt wurde, mit 32P-markierten Restriktionsfragmenten isoliert. Phagen-DNA wurde isoliert, und die Inserts der λgt10-Klone wurden durch PCR unter Verwendung von 20 Zyklen mit Primern, die das Insert flankieren, und dem Enzym-Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, LaJolla, CA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gewonnen. Die PCR-Produkte wurden in die SmaI-Stelle von pRK5 wie zuvor beschrieben subkloniert.
  • Die Nucleotidsequenz von JOSH1 wies einen offenen Leseraster von 1065 Basen auf, der für ein Protein von 355 Aminosäuren kodierte (1 und 9). Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die provisorisch als der C-C-Chemokin-Rezeptor 1 (C-C CKR-1) bezeichnet wurde, hat zentrale Eigenschaften, die mit G-Protein-gebundenen Rezeptoren der sieben-Transmembran-umspannenden Superfamilie verwandt sind. Beispielsweise weist er sieben hydrophobe Regionen auf, von denen vorhergesagt wird, dass sie sich über die Zellmembran erstrecken, und Cysteinreste in der ersten und der zweiten extrazellulären Schleife, die in die Bildung einer Disulfidbindung eingebunden ist (1). Bestimmte Eigenschaften des vorhergesagten C-C-CKR-1-Proteins unterscheiden es jedoch von klassischen sieben-Transmembran-umspannenden Rezeptoren. Der Carboxyl-Terminus ist relativ kurz und weist keine Cysteinreste auf, die in Membranverankerung über eine palmitoylierte Gruppierung eingebunden sind (B. F. O'Dowd et al., J. Biol. Chem. 264, 7564–7569 (1989)), und die Segmente zwischen den Transmembrandomänen sind relativ kurz, eine Eigenschaft, die in anderen Chemoattraktans-Rezeptoren übereinstimmend ist (F. Boulay et al., Biochemistry 30, 2993–2999 (1991); F. Boulay et al., Biochemistry 29, 11123–11133 (1990); N. P. Gerard et al., Nature 349, 614–617 (1991); W. E. Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991); P. M. Murphy et al., Science 253, 1280–1283 (1991)). Es gibt drei potenzielle Glykosylierungsstellen im C-C CKR-1 (1), eine am N-Terminus, eine an der ersten zytoplasmatischen Schleife und die dritte an TM6. Diese letzte Stelle wird unwahrscheinlich glykosyliert, da von ihr vorhergesagt wird, dass sie in der Zellmembran eingebettet ist. Schließlich gibt es eine Consensus-Sequenz für eine Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstelle an Position 192, doch diese Position ist laut Vorhersagen extrazellulär.
  • Die abgeleitete Aminosäuresequenz von C-C CKR-1 wurde mit anderen G-Protein-gebundenen Chemoattraktans-Rezeptoren verglichen (1). Der IL8rA und der IL8rB zeigten etwa 32% Sequenzidentität zu C-C CKR-1, während die C5a- und fMLP-Rezeptoren etwa 23% Identität zeigten (1). Ein mutmaßliches sieben-Transmembran-umspannendes Molekül, Für HUMSTSR, das vor kurzer Zeit bei GenBank von Federsspiel et al. hinterlegt wurde (Zugriffs-Nr. M99293), wurde erkannt, dass es etwa 31% Identität mit C-C CKR-1 aufwies. Die Sequenz dieses Mo leküls ist identisch mit einer der mutmaßlichen Rezeptoren, die in einem ersten Versuch von RT-PCR-Klonieren der Erfinder (oben beschrieben) isoliert wurden. Der Ligand für HUMSTSR wurde bisher noch nicht identifiziert. Die zweite Gruppe von Rezeptoren, die mit dem C-C CKR-1 eng verwandt sind, umfasst das Neuropeptid Y und die Angiotensin-II-Rezeptoren (Daten nicht dargestellt). Schließlich weist ein offener Leseraster im Zytomegalie-Virusgenom, bezeichnet als US28, etwa 33% Identität mit dem C-C CKR-1 und etwa 60% Identität in der N-terminalen Region vor TM1 mit C-C CKR-1 auf.
  • Beispiel III
  • Northern- und Southern-Analyse von C-C CKR-1
  • Die Expression von C-C CKR-1 wurde in einer limitierten Auswahl von blutbildenden Zelllinien unter Verwendung von Northern-Blot-Analyse bewertet. Northern-Blot-Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Guanidinium-Isothiocyanat-CsCl-Verfahrens (Sambrook et al., 1989) oder durch das RNAzol-Verfahren gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Poly-A+-RNA wurde unter Verwendung von Dynabeads oligodT (DYNAL, Great Neck, NY) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten isoliert. HL60-mRNA, in dieser Beschreibung als "HL60-C" bezeichnet, wurde von Clontech (Palo Alto, CA) erhalten. 20 μg von Gesamt-RNA oder 5 μg von Poly-A+-RNA wurde auf Formaldehyd-Agarosegelen fraktioniert, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und mit der C-C-CKR-1-cDNA hybridisiert (R. G. Korneluk et al., J. Biol. Chem. 261, 8407–8413 (1986)).
  • Eine einzelne Bande von etwa 3 kb wurde in prämonozytischen Zelllinien, z.B. in undifferenzierten oder differenzierten U937- und HL60-Zellen (2) nachgewiesen, jedoch nicht in einem im Handel erhältlichen Präparat von HL60-RNA (HL60-C, 2). Geringere Konzentrationen von mRNA wurden auch in B-Zelllinien 1788 und Daudi nachgewiesen, jedoch wenig oder keine RNA wurde in K562-Zellen nachgewiesen (2). Die höchsten Konzentrationen wurden in PMA-behandelten THP-1-Zellen nachgewiesen, in denen ein starkes Signal erhalten wurde, wenn 20 mg von Gesamt-RNA analysiert wurden (2).
  • Southern-Blot-Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt. Menschliche genomische DNA, erhalten von Clontech (Palo Alto, CA), wurde restriktionsverdaut, auf Genescreen® (Dupont) geblottet und mit der C-C-CKR-1-cDNA hybridisiert (K. Neote et al., J. Clin. Invest. 86, 1524–1531 (1990)). Das Hybridisierungsmuster wies darauf hin, dass das C-C-CKR-1-Gen ohne Intronen sein könnte. Weiters ließ es auf die Existenz eines zweiten verwandten Gens oder möglicherweise eines Pseudogens schließen. Die 3A und 3B zeigen nieder- und hochstringente Waschschritte desselben Blots menschlicher genomischer DNA, die mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut wurde. Unter hochstringenten Bedingungen (3B) wurden einzelne Restriktionsfragmente, die an die C-C-CKR-1-cDNA hybridisierten, nachgewiesen, wenn genomische DNA mit BamHI, HindIII oder SacI verdaut worden war, und, wie aus der cDNA-Sequenz vorhergesagt wurde, zwei Fragmente wurden in DNA nachgewiesen, die mit EcoRI und PstI verdaut worden war. Hybridisierung unter niederstringenten Bedingungen zeigte jedoch die Gegenwart von zusätzlichen Banden auf, die an die C-C-CKR-1-cDNA hybridisierten, z.B. ein etwa 7 kb langes PstI-Fragment und ein etwa 1,6 kb langes HindIII-Fragment wurden nachgewiesen (3A). Diese Banden verschwanden, wenn die Blots unter hochstringenten Bedingungen gewaschen wurden, während die anderen Banden zwischen den zwei Waschschritten unverändert blieben.
  • Beispiel IV
  • Signalgebung durch den C-C CKR-1 in Reaktion auf HuMIP-1α und RANTES
  • MCP-1, RANTES, HuMIP-1α und HuMIP-1β induzieren einen raschen und vorübergehenden Anstieg an intrazellulärem Ca++ in menschlichen Monozyten (B. J. Rollins et al., Blood 78, 1112–1116 (1991); S. Sozzani et al., J. Immunol. 147, 2215–2221 (1991)). Um zu bestimmen, ob C-C CKR-1 ein funktioneller C-C-Chemokinrezeptor ist, wurde er in menschlichen Nieren-293-Zellen vorübergehend exprimiert, und intrazelluläre Ca++-Konzentrationen als Reaktion auf verschiedene C-C-Chemokine wurden gemessen.
  • Rekombinantes RANTES wurde in E. coli exprimiert und wie in Kuna et al. (J. Immunol. 149, 636–642 (1992b)) beschrieben gereinigt. HuMIP-1α und HuMIP-1β wurden in E. coli exprimiert und wie von Rot et al. (J. Exp. Med., in Druck) beschrieben gereinigt. HuMIP-1α wurde durch Chlorglykoluril-Verfahren (Fraker et al., Biochem. Biphys. Res. Comm. 80, 849–857 (1978)) zu einer anfänglichen spezifischen Aktivität von 472 Ci/mmol iodiert. Das markierte HuMIP-1α wurde durch eine Kombination von Gelfiltration und Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Das 125I-markierte RANTES, spezifische Aktivität 2200 Ci/mmol, wurde von Dupont/NEN (Boston, MASS) gewonnen. Rekombinantes MCP-1 und Maus-MIP-1α wurden von Peprotech (Rocky Hill, NJ) erhalten.
  • Menschliche embryonale Nieren-293-Zellen wurden mit 10–20 μg Plasmid-DNA durch das Calcium-Phosphat-Verfahren wie beschrieben (T. J. Schall et al., Eur. J. Immunol. 22, 1477–1481 (1992)) oder durch das modifizierte Calcium-Phosphat-Verfahren (C. Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7, 2745–2752 (1987)) transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden nach vorübergehender Expression 12–24 Stunden lang getestet.
  • Intrazelluläre Ca++-Messungen wurden am SLM 8000C im Wesentlichen wie beschrieben (P. H. Naccache et al., J. Immunol. 142, 2438–2444 (1989)) unter geringfügigen Änderungen durchgeführt: IND0-1-AM wurde bei einer Endkonzentration von 20 mg/ml verwendet, und 2–4 × 106 Zellen wurden pro Test eingesetzt.
  • Eine 100-nM-Dosis von RANTES, HuMIP-1α, HuMIP-1β und MCP-1 wurde anfänglich als eine erste Annäherung der maximalen, physiologisch relevanten Konzentration verwendet. Als transfizierte Zellen, beladen mit der Calciumsonde INDO-1-AM, 100 nM entweder von HuMIP-1α oder von RANTES ausgesetzt wurden, wurde ein rascher Anstieg der Konzentration von intrazellulärem Ca++ beobachtet (4). Aussetzung gegenüber derselben Dosis von MCP-1 oder HuMIP-1β rief geringen nachweisbaren Ca++-Fluss hervor (Daten nicht dargestellt). Kontrollzellen, die mit Vektor alleine oder Vektor, der C-C CKR-1 in der entgegengesetzten Ausrichtung (nicht- kodierend) enthielt, reagierte auf keinen der Liganden (Daten nicht dargestellt). Die Signalreaktionen waren Dosis-abhängig, 10 nM von HuMIP-1α und 100 nM von RANTES waren ausreichend, um eine maximale oder beinahe maximale Reaktion zu erhalten (4A und 4B).
  • Rasche aufeinander folgende Aussetzung gegenüber demselben Liganden ist dafür bekannt, die Signalgebungskapazität von G-Protein-gebundenen Rezeptoren zu desensibilisieren (H. O. Schild, "Receptor classification with special reference to β-adrenergic receptors", in: Drug Receptors, H. P. Rang (Hrsg.), University Press, 29–36 (1973)). Darüber hinaus kann Desensibilisierung auch auftreten, wenn die zwei verschiedenen Agonisten durch denselben Rezeptor signalisieren. HuMIP-1α blockiert eindeutig die Fähigkeit des C-C-CKR-1-Rezeptors, ein zweites Ca++-Signal zu übertragen, wenn HuMIP-1α zu transfizierten Zellen zweimal hintereinander zugesetzt wird (5A). In ähnlicher Weise blockiert RANTES die Reaktion auf einen zweiten Challenge bei derselben Konzentration (5B). Wird HuMIP-1α zuerst zugesetzt, so blockiert es die Reaktion auf RANTES, was darauf hinweist, dass vollständige Desensibilisierung aufgetreten ist (5C). Challenge von C-C-CKR-1-cDNA-transfizierten Zellen mit 250 nM RANTES verhinderte jedoch nicht einen darauf folgenden Ca++-Fluss durch den Zusatz von 100 nM HuMIP-1α (5D), was darauf hinweist, dass keine Rezeptor-Desensibilisierung eingetreten ist. Der darauf folgende Ca++-Fluss durch HuMIP-1α ist jedoch reduziert, von einer intrazellulären Ca++-Veränderung von etwa 70 nM (5A und 5C) auf etwa 40 nM (5D), was darauf schließen lässt, dass eine teilweise Desensibilisierung eingetreten ist.
  • Beispiel V
  • Bindung von HuMIP-1α und RANTES an C-C CKR-1
  • Um die Wechselwirkung von HuMIP-1α und RANTES mit kloniertem C-C CKR-1 weiter zu untersuchen, wurden direkte Bindungsversuche mit 125I-markierten Liganden durchgeführt.
  • Bindungstests wurden wie zuvor beschrieben (R. Horuk et al., J. Biol. Chem. 262, 16275–16278 (1987)) durchgeführt. Transfizierte Zellen (2 × 106 Zellen pro ml) wurden mit radioaktiv markierten Liganden und verschiedenen Konzentrationen unmarkierter Liganden bei 4°C 2 Stunden lang inkubiert. Die Inkubation wurde durch Entfernen von Aliquoten aus der Zellsuspension und Trennen der Zellen vom Puffer durch Zentrifugation durch ein Silicon/Paraffin-Ölgemisch wie zuvor beschrieben beendet (R. J. Robb et al., J. Exp. Med. 160, 1126–1146 (1984)). Nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM unmarkiertem Liganden bestimmt. Individuelle Testbestimmungen, die für zumindest drei separate Versuche repräsentativ waren, wurden in Diagrammform dargestellt. Die Bindungsdaten wurden mittels des Computerprogramms LIGAND (P. J. Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220–239 (1980)), das für IBM-PCs modifiziert wurde (G. A. McPherson, Comp. Prog. Biomed. 17, 107–114 (1983)), an eine Kurve gefittet, um die Affinität (Kd), Anzahl von Stellen und nichtspezifische Bindung zu bestimmen. Die gezeigten Kurven sind die Bindungsisothermen, bestimmt durch LIGAND.
  • Wurden 293-Zellen, die C-C CKR-1 vorübergehend exprimierten, mit 125I-HuMIP-1α und steigenden Konzentrationen von unmarkiertem HuMIP-1α inkubiert, so wurde ersetzbare Bindung von 125I-HuMIP-1α an den C-C CKR-1 beobachtet (6A). Scatchard-Analyse zeigte eine Dissoziationskonstante (Kd) von 5,1 ± 0,3 nM und etwa 130.000 Stellen/Zelle. Diese Kd liegt innerhalb des Bereichs von jener, die für HuMIP-1α-Bindung an menschliche Monozyten bestimmt wurde, und lässt darauf schließen, dass C-C CKR-1 zumindest einer der an Monozyten vorhandenen HuMIP-1α-Rezeptoren ist. Direkte Bindung von RANTES an C-C CKR-1 konnte jedoch nicht durchgeführt werden, d.h. 125I-RANTES konnte nicht durch unmarkiertes RANTES verdrängt werden. Interessanterweise wurde ein gleichzeitiger Anstieg von 125I-RANTES, gebunden an Zellen, beobachtet, wenn die Menge von unmarkiertem RANTES im Bindungstest gesteigert wurde (Daten nicht dargestellt). Da C-C CKR-1 ein Signal als Reaktion auf RANTES transduziert (Ca++ mobilisiert) (4) und der Ligand sich daher an den klonierten Rezeptor binden muss, ist der Grund für das unübliche Bindungsprofil, das für 125I-RANTES beobachtet wurde, nicht klar. Ähnliche Bindungsphänomene werden erhalten, wenn andere Targetzellen, die auf RANTES reagieren, verwendet werden. Interessanterweise konnte 125I-RANTES durch unmarkiertes HuMIP-1α an 293-Zellen, die vorübergehend C-C CKR-1 exprimierten, verdrängt werden (6B). Scatchard-Analyse dieser heterologen Ersetzung ließ auf eine Kd von 7,6 ± 1,5 nM (etwa 350.000 Stellen/Zelle) schließen, was mit der Kd von zuvor beschriebenen HuMIP-1α-Bindungsdaten übereinstimmt. Diese Beobachtungen ließen die Erfinder darauf schließen, dass sich C-C CKR-1 an HuMIP-1α und RANTES bindet und daraufhin ein Signal durch Steigerung der intrazellulären Ca++-Konzentrationen transduziert.
  • Beispiel VI
  • Ersetzung von HuMIP-1α durch heterologe Chemokine
  • Um die Bindungseigenschaften von C-C CKR-1 näher zu charakterisieren, und insbesondere um zu versuchen, eine Kd für RANTES-Bindung an den klonierten C-C CKR-1 zu definieren, wurde heterologe Ersetzung von 125I-HuMIP-1α mit RANTES und auch mit HuMIP-1β, MCP-1, IL-8 und Maus-MIP-1α durchgeführt. Interessanterweise ersetzten alle C-C-Chemokine (RANTES, MIP-1β und MCP-1) 125I-HuMIP-1α, aber das C-X-C-Chemokin IL-8 tat es nicht (7). Die Kd von RANTES, HuMIP-1β und MCP-1 sowie Maus-MIP-1α, bestimmt durch Scatchard-Analyse, beträgt 468 ± 280, 232 ± 70,1, 122 ± 39,3 bzw. 4,2 ± 2,7 nM, und in jedem Fall waren etwa 250.000–350.000 Stellen/Zelle vorhanden (7). Diese Resultate zeigten eine umfassende Ligandenspezifität des C-C CKR-1, einschließlich eines gewissen Mangels an Speziesspezifität bei Bindung. Noch wichtiger war, dass sie darauf schließen ließen, dass die Bindungsaffinität zwischen dem Liganden und dem Rezeptor die aus dieser Wechselwirkung resultierende Signalgebungseffizienz nicht vorhersagt, d.h. obwohl sich HuMIP-1β und MCP-1 mit einer höheren Affinität binden als RANTES, übertragen 100 nM von MIP-1β oder MCP-1 kein Signal über den klonierten Rezeptor, während RANTES dies sehr wohl tut (4).
  • Beispiel VII
  • Calcium-Mobilisierung in Reaktion auf HuMIP-1β und MCP-1
  • Um die Bedeutung von HuMIP-1β- und MCP-1-Bindung an C-C CKR-1 zu bestimmen, wurden mit C-C-CKR-1-cDNA transfizierte 293-Zellen hohen Dosen an HuMIP-1β und MCP-1 ausgesetzt, und intrazelluläre Ca++-Konzentrationen wurden bestimmt. Eine Konzentration von 1 mM des rekombinanten MCP-1 musste verwendet werden, um einen Ca++-Fluss auszulösen. Dieser Ca++-Fluss belief sich jedoch auf nur etwa 20% der maximalen Reaktion, die durch HuMIP-1α oder RANTES erreicht wurde (8). Geringere Konzentrationen ergaben einen fast nicht nachweisbaren Fluss (Daten nicht dargestellt). Kontrollversuche unter Verwendung von THP-1-Zellen und 50–100 nM von MCP-1 ergaben die erwarteten starken Ca++-Flüsse (einen vorübergehenden Anstieg auf 200–300 nM Ca++, Daten nicht dargestellt). In ähnlicher Weise waren 250 nM von HuMIP-1β erforderlich, um einen Ca++-Fluss in 293-Zellen, die vorübergehend C-C CKR-1 exprimieren, zu produzieren, der etwa 20%. des maximalen Signals betrug, das durch HuMIP-1α oder RANTES erhalten wurde (8). Diese Resultate unterstützen die Vermutung, dass die Bindungsaffinitäten von HuMIP-1β und MCP-1 nicht deren Signalgebungsfähigkeiten widerspiegeln.
  • Beispiel VIII
  • Bindung von HuMIP-1α an 293-Zellen die das durch US28 kodierte Protein exprimieren
  • Da die Aminosäuresequenz von C-C CKR-1 etwa zu 35% identisch mit einem offenen Leseraster des menschlichen CMV-Genoms ist, das als US28 bezeichnet wird, versuchten die Erfinder zu bestimmen, ob das durch diesen offenen Leseraster kodierte Protein HuMIP-1α binden würde. Der offene Leseraster US28 wurde aus einem Ausgangsmaterial von Zytomegalie-Virus des Towne-Stamms (freundlicherweise von Dr. Philip Dormitzer zur Verfügung gestellt) mit Primern, die die Kodierregion flankierten, unter Verwendung von PCR und der wärmestabilen DNA-Polymerase Pfu amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den Expressionsvektor pRK5 subkloniert und seine Identität durch Sequenzieren bestätigt. Plasmid-DNA, die US28 in der Sense-Ausrichtung und der entgegengesetzten Antisense-Ausrichtung enthielt, wurde in 293-Zellen transfiziert. Transfizierte Zellen wurden dann verwendet, um Bindung an radioaktiv markiertes HuMIP-1α zu bestimmen. 293-Zellen, die mit der US28-Kodiersequenz in der Sense-Ausrichtung transfiziert waren, banden 125I-HuMIP-1α, während vernachlässigbare Bindung in Zellen erhalten wurde, die mit der Antisense-Ausrichtung transfiziert wurden (10). Das radioaktiv markierte HuMIP-1α konnte auch durch 1 μM von Maus-MIP-1α, HuMIP-1β, RANTES und MCP-1 ersetzt werden, jedoch nicht durch das C-X-C-Chemokin IL-8 (10). Diese Resultate weisen darauf hin, dass das Protein, für das US28 kodiert, zwar C-C-Chemokine spezifisch bindet, jedoch C-X-C-Chemokine nicht.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (35)

  1. Isoliertes C-C-CKR-1-Polypeptid, das (i) die Fähigkeit besitzt, sich an zumindest ein C-C-Chemokin zu binden, und (ii) die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine Sequenz, die über ihre gesamte Länge zumindest 60% Sequenzidentität mit der in 1 gezeigten Sequenz aufweist, umfasst.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die über ihre gesamte Länge zumindest 70% Sequenzidentität mit der in 1 gezeigten Sequenz hat.
  3. Polypeptid nach Anspruch 2, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
  4. Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, das die Fähigkeit besitzt, sich an ein aus RANTES, HuMIP-1α, HuMIP-1β oder MCP-1 ausgewähltes C-C-Chemokin zu binden.
  5. Zusammensetzung, umfassend das C-C-CKR-1-Polypeptid nach Anspruch 1, worin das C-C-CKR-1-Polypeptid aus einer natürlichen Quelle stammt und worin die Zusammensetzung frei von jeglichem verunreinigendem Polypeptid der Tierspezies ist, die die Quelle des C-C-CKR-1-Polypeptids darstellt.
  6. Antikörper, der in der Lage ist, das C-C-CKR-1-Polypeptid nach Anspruch 1 zu binden, das mit keinem anderen Chemokinrezeptor kreuzreagiert.
  7. Antikörper nach Anspruch 6, der ein monoklonaler Antikörper ist.
  8. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für das C-C-CKR-1-Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
  9. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das DNA ist und mehr als etwa 25 Basen enthält.
  10. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das cDNA ist.
  11. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das eine genomische Sequenz ist.
  12. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das weiters einen operabel an die Nucleinsäuresequenz gebundenen Promotor umfasst.
  13. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, worin der Promotor zum C-C-CKR-1-Polypeptid heterolog ist.
  14. Expressionsvektor, umfassend die Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
  15. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 14 transformiert ist.
  16. Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart einer C-C-CKR-1-Nucleinsäure, umfassend das Hybridisieren von Nucleinsäure nach Anspruch 8 oder ihres Komplements an eine Testprobennucleinsäure und das Bestimmen der Gegenwart von C-C-CKR-1-Nucleinsäure, die hieran hybridisiert.
  17. Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäurentestprobe, umfassend das Primen einer Nucleinsäure-Polymerasereaktion mit Nucleinsäure nach Anspruch 8 oder ihrem Komplement.
  18. Zusammensetzung, umfassend das C-C-CKR-1-Polypeptid nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  19. Zusammensetzung, umfassend den Antikörper nach Anspruch 6 oder 7 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  20. Isoliertes Polypeptid, umfassend das C-C-CKR-1-Polypeptid nach Anspruch 1, fusioniert an ein Polypeptid, das heterolog zum C-C-CKR-1-Polypeptid ist.
  21. Verfahren zur Identifikation eines C-C-Chemokinrezeptors nach Anspruch 1, umfassend: (a) den Entwurf eines PCR-Primers, der einer Transmembranregion eines sieben Transmembrane umspannenden Proteins entspricht; (b) das Primen einer PCR-Reaktion mit einem cDNA-Substrat aus einem blutbildenden Zelltyp, der für seine Reaktionsfähigkeit gegenüber einem C-C-Chemokin bekannt ist; (c) das Gewinnen von PCR-Produkten aus Schritt (b).
  22. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Primer eine Reihe von degenerierten Oligonucleotiden umfasst, die für die Sequenz LNLA (L/V) AD (L/F) (L/G) kodieren.
  23. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Primer eine Reihe von degenerierten Oligonucleotiden umfasst, die für die Sequenz NP (I/M) (I/L) Y (A/V) (F/V) (I/M/A) GQ kodieren.
  24. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Primer eine Reihe von degenerierten Oligonucleotiden umfasst, die für die Sequenz DRYLAIVHA kodieren.
  25. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Zelltyp kultivierte menschliche Monozyten ist.
  26. Verfahren, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit für das C-C-CKR-1-Polypeptid nach Anspruch 1 kodierender DNA, das Kultivieren der Wirtszelle zur Expression des Rezeptors an ihrer Oberfläche, das Ernten der Zellen, das Kontaktieren der Zellen mit einer C-C-Chemokinvariante und das Bestimmen der biologischen Aktivität der Variante am Rezeptor.
  27. Test für einen Analyten des C-C-CKR-1-Polypeptids nach Anspruch 1, worin der Test das Testen auf Bindung des Analyten an einen Bindungspartner umfasst, worin der Bindungspartner das C-C-CKR-1-Polypeptid ist.
  28. Test nach Anspruch 27, der ein kompetitiver Test, ein Sandwich-Test oder ein sterischer Hinderungstest ist.
  29. Test nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, der eines oder mehrere der folgenden Reagenzien verwendet: markiertes Analytanalogon, immobilisiertes Analytanalogon, markierter Bindungspartner, immobilisierter Bindungspartner.
  30. Test nach Anspruch 29, worin der Bindungspartner von sämtlichen Analyten getrennt wird, die frei in Lösung bleiben.
  31. Test nach Anspruch 30, der ein Analytanalogon verwendet, worin entweder der Bindungspartner oder das Analytanalogon vor dem Testverfahren unlöslich gemacht wird.
  32. Test nach Anspruch 31, der ein Analytanalogon verwendet, worin entweder der Bindungspartner oder das Analytanalogon nach dem Testverfahren unlöslich gemacht wird.
  33. Test nach Anspruch 28, der ein homogener kompetitiver Test ist.
  34. Test nach Anspruch 28, der ein gleichzeitiger Sandwich-Test ist.
  35. Test nach Anspruch 28, der ein sequenzieller Sandwich-Test ist.
DE69333885T 1992-11-10 1993-11-04 C-c ckr-1, ein c-c chemokin rezeptor Expired - Lifetime DE69333885T2 (de)

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