ES2250964T3 - Receptor de la quimioquina c-c(c-c ckr-1). - Google Patents
Receptor de la quimioquina c-c(c-c ckr-1).Info
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Abstract
SE PROPORCIONAN DNA AISLADOS QUE CODIFICAN EL RECEPTOR DE QUIMIOQUINA C - C HUMANO CKR - 1 C - C Y METODOS PARA OBTENER TAL DNA, JUNTO CON SISTEMAS DE PRESENTACION PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE CKR - 1 C - C UTIL EN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS O DE DIAGNOSTICO. ADICIONALMENTE, SE PROPORCIONA UN METODO PARA IDENTIFICAR NUEVOS RECEPTORES DE QUIMIOQUINA.
Description
Receptor de la quimiocina
C-C(C-C
CKR-1).
Esta invención se refiere al campo de los
receptores de citocinas, sus anticuerpos, y su uso como agentes
diagnósticos y terapéuticos.
Las citocinas son moléculas biológicas que
afectan las células efectoras inflamatorias y relacionadas con el
sistema inmune. Las citocinas inflamatorias, o "quimiocinas",
tienen una variedad de propiedades biológicas, incluyendo la
quimiotaxis y activación selectiva de leucocitos. Estas quimiocinas
forman una superfamilia, denominada en la literatura
alternativamente como la superfamilia PDF4 o las intercrinas, que se
ha dividido en dos clases en base a si los dos primeros residuos
cisteína conservados están separados por un aminoácido intermedio
(C-X-C, o \alpha) o si son
adyacentes (C-C, o \beta). Los miembros de la
clase C-X-C incluyen, por ejemplo,
la interleucina-8 (IL-8), el factor
estimulador del crecimiento de los melanocitos (MGSA), y el factor 4
de las plaquetas (PF4), mientras que la clase C-C
incluye el RANTES (Regulado a partir de la Activación, Expresado y
Secretado en T Normales) y el péptido-1
quimiotáctico de monocitos (MCP-1). La clase
C-X-C ejerce la actividad
proinflamatoria principalmente a través de su acción sobre
neutrófilos, mientras que la clase C-C parece ser
quimioatractores de monocitos.
Mucha atención se ha concentrado en las
interacciones receptor/ligando en esta superfamilia, habiendo más
datos disponibles sobre la unión de quimiocinas
C-X-C que sobre las
C-C. Ha pasado a estar claro que las interacciones
receptor/ligando de quimiocina sobre las células inflamatorias diana
parecen estar estrictamente reguladas. Por ejemplo, no se ha
observado competición cruzada por los sitios de unión, tanto sobre
monocitos como sobre neutrófilos, entre miembros de las ramas
C-X-C o C-C
(Leonard, E.J., et al., Immunol. Today,
11:97-101 (1990); Samanta, A.K., et al., J. Exp.
Med., 169:1185-1189 (1989); Yoshimura, T. et
al., J. Immunol. 145:292-297 (1990); de forma
consistente con los efectos quimioatractores diferenciales sobre
estos dos tipos de células. Los datos sobre la unión directa para
las quimiocinas C-C son sorprendentemente escasos.
Se ha publicado que el HCP-1 humano se une a
monocitos con una afinidad de aproximadamente 2 nM, sin sitios
detectables sobre los neutrófilos (Valente, A.J., et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:309-314
(1991); Yoshimura, T., et al., J. Immunol.,
145:292-297 (1990)). Un único informe muestra que la
Act-2, una variante del MIP-1\beta
humano (HuMIP-1\beta), se une a entre 7.000 y
45.000 sitios sobre PBMC con una afinidad de entre 7,8 y 12 nM
(Napolitano, M., et al., J. Exp. Med.,
172:285-289 (1990)). Kwon y colaboradores han
caracterizado la unión del MIP-1\alpha de ratón
sobre una célula T de ratón y una línea celular de macrófago,
hallando respectivamente una K_{d} de 1,5 y 0,9 nM (Oh, K.O.,
et al., J. Immunol., 147:2978-2983
(1991)).
La mayoría de los detalles moleculares en
relación con la motilidad de leucocitos permanecen sin elucidar. Sin
embargo, recientemente, usando técnicas moleculares, se han clonado
los receptores para la anafilatoxina C5a (Gerard, N.P., et al.,
Nature, 349:614-617 (1991)), el tripéptido
formilado bacteriano fMLP (Boulay, F., et al., Biochemistry,
29:111123-11133 (1990)), y la quimiocina
C-X-C IL-8 (Holmes,
W.E., et al., Science, 253:1278-1280 (1991);
Murphy, P.M., et al., Science, 253:1280-1283
(1991)). Todos estos receptores muestran secuencias de aminoácidos
que se ha predicho se ajustan a una arquitectura que contiene siete
segmentos transmembrana conectados mediante una serie de bucles
intra- y extracelulares. Las secuencias primarias de estos
receptores revelaron dominios que están conservados en los
receptores asociados con la motilidad celular, pero no en otros
receptores con siete segmentos transmem-
brana.
brana.
En consecuencia, es un objeto de la invención
proporcionar un receptor de quimiocina C-C
(C-C CKR-1) aislado para su uso como
un reactivo terapéutico o de diagnóstico.
Es otro objeto de la invención construir
variantes del C-C CKR-1 para su uso
como antagonistas o agonistas. Es otro objeto de la invención
generar anticuerpos contra el C-C
CKR-1 para su uso como agentes de diagnóstico y
terapéuticos.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
procedimiento para identificar nuevos receptores de quimiocinas.
Un aspecto de la invención es el aislamiento del
nuevo receptor de quimiocina C-C
CKR-1.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición que comprende C-C CKR-1
que está libre de polipéptidos contaminantes de la especie animal de
la que se deriva el C-C CKR-1.
En otro aspecto de la invención, el
C-C CKR-1, o fragmentos del mismo
(los cuales podrían sintetizarse mediante procedimientos químicos),
se fusiona (mediante expresión recombinante o procedimiento
covalentes in vitro) con un polipéptido inmunogénico, y este
polipéptido de fusión, a su vez, se usa para inmunizar un animal
para generar anticuerpos contra un epítopo del C-C
CKR-1. Los anticuerpos
anti-C-C CKR-1 se
recuperan del suero de animales inmunizados. Alternativamente, se
preparan anticuerpos monoclonales a partir de células del animal
inmunizado de la forma convencional.
Otro aspecto de la invención es el uso de
anticuerpos anti-C-C
CKR-1 en el diagnóstico de (in vitro o in
vivo) o (cuando se inmovilizan sobre una matriz insoluble) en la
purificación de receptores de quimiocinas que se unen a ellos.
Otro aspecto de la invención es la derivación del
C-C CKR-1 in vitro para
preparar C-C CKR-1 inmovilizado y
C-C CKR-1 marcado, particularmente
con propósitos de diagnóstico del C-C
CKR-1 o sus anticuerpos, o para la purificación por
afinidad de los propios anticuerpos contra el C-C
CKR-1.
Otro aspecto de la invención es la formulación
del C-C CKR-1, sus derivados, o sus
anticuerpos, en vehículos fisiológicamente aceptables, especialmente
para uso terapéutico. Tales vehículos incluyen las formulaciones de
liberación ininterrumpida del C-C
CKR-1.
En aún otros aspectos, la invención proporciona
una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el
C-C CKR-1,
marcada o sin marcar, y una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de, o se hibrida en condiciones definidas con una secuencia de ácido nucleico que codifica el C-C CKR-1.
marcada o sin marcar, y una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de, o se hibrida en condiciones definidas con una secuencia de ácido nucleico que codifica el C-C CKR-1.
Además, la invención proporciona un vector
replicable que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica
el C-C CKR-1, unida operativamente a
secuencias de control reconocidas por un huésped transformado por el
vector; las células huéspedes transformadas con el vector; y un
procedimiento para usar una molécula de ácido nucleico que codifica
el C-C CKR-1, para efectuar la
producción de C-C CKR-1, que
comprende expresar la molécula de ácido nucleico en un cultivo de
las células huéspedes transformadas y recuperar el
C-C CKR-1 del cultivo de células
huéspedes. La secuencia de ácido nucleico es útil también en ensayos
de hibridación del ácido nucleico del C-C
CKR-1.
CKR-1.
Otro aspecto de la invención son las variantes
por sustitución, supresión o inserción de aminoácidos del
C-C CKR-1
y/o de residuos glicosilo, incluyendo las variantes que tienen una glicosilación no nativa. Estas variantes se preparan mediante procedimientos in vitro o recombinantes. Las variantes de la secuencia se examinan opcionalmente en busca de reactividad inmunocruzada con el C-C CKR-1, y en busca de actividad antagonista o agonista del C-C CKR-1.
y/o de residuos glicosilo, incluyendo las variantes que tienen una glicosilación no nativa. Estas variantes se preparan mediante procedimientos in vitro o recombinantes. Las variantes de la secuencia se examinan opcionalmente en busca de reactividad inmunocruzada con el C-C CKR-1, y en busca de actividad antagonista o agonista del C-C CKR-1.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para identificar nuevos receptores de quimiocinas
C-C, tal como se detalla más adelante en las
reivindicaciones.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para determinar la actividad biológica de una variante de quimiocina
C-C sobre el C-C
CKR-1, transformando una célula huésped con ADN que
codifica el C-C CKR-1, cultivando la
célula huésped para expresar el receptor sobre su superficie,
recolectando las células, poniendo en contacto las células con una
variante de quimiocina C-C, y determinando la
actividad biológica de la variante sobre el receptor.
La invención podría usarse para proporcionar
animales transgénicos que comprenden el C-C
CKR-1 de otra especie, animales en los que el
C-C CKR-1 se expresa en un tejido en
el cual no se halla ordinariamente, o animales en los que el
C-C CKR-1 está inactivado mediante,
por ejemplo, la interrupción del gen.
La Figura 1 (SEC. ID. Nº: 1-7)
ilustra la secuencia de aminoácidos predicha del C-C
CKR-1, y el alineamiento de la secuencia de
aminoácidos predicha con las del HUMSTR (nº de acceso en Genbank
#M99293), la del IL8rA (Holmes, W.E., et al., Science,
253:1278-1280 (1991)), la del IL8rB (Murphy, P.M.,
et al., Science, 253:1280-1283 (1991)),
receptor de la C5a (Gerard, N.P., et al., Nature,
349:614-617 (1991)), receptor del fMLP (Boulay, F.,
et al., Biochemistry, 29:111123-11133
(1990)), y la pauta de lectura abierta del citomegalovirus, US28.
Los siete dominios transmembrana están sobrerayados. Los sitios de
glicosilación se indican con puntos negros encima de la secuencia.
Los dos residuos cisteína implicados en el enlace disulfuro se
indican con asteriscos. El sitio consenso para la fosforilación con
proteína quinasa C está indicado como "+". Los aminoácidos
conservados que aparecen más de dos veces en el alineamiento están
encuadrados.
La Figura 2 ilustra el análisis de transferencia
Northern del ARN procedente de células hematopoyéticas sondeadas con
C-C CKR-1. 5 \mug de
poli-A^{+} ó 20 \mug de ARN total procedente de
las líneas celulares indicadas, se fraccionaron según tamaño en 1%
formaldehído-agarosa, se transfirieron sobre
nitrocelulosa, y se hibridaron con ADNc de C-C
CKR-1 marcado radiactivamente. Se lavó el filtro con
0,5\times SSC, 0,1% SDS a 55ºC, y la autorradiografía se reveló
después de 4-6 horas de exposición a -70ºC con
pantallas intensificadoras. También se corrieron en el gel
marcadores de peso molecular de ARN y se indican al lado.
Las Figuras 3A y 3B ilustran el análisis de
transferencia Southern de ADN genómico humano sondeado con
C-C
CKR-1. En la Figura 3A, se digirieron 10 \mug de ADN genómico con el enzima de restricción indicado, se corrió sobre un gel de agarosa al 0,6%, de transfirió sobre Genescreen® y se hibridó con cADN de C-C CKR-1 marcado radiactivamente. Se lavó el filtro con 0,5\times SSC, 1% SDS a 55ºC, y la autorradiografía se reveló después de exposición durante la noche a -70ºC con pantallas intensificadoras. También se corrieron en el gel marcadores de peso molecular de ADN y se indican al lado. En la Figura 3B, la misma transferencia se lavó en condiciones más rigurosas con 0,2\times SSC, 0,1% SDS a 60ºC, y la autorradiografía se realizó tal como se ha indicado más arriba.
CKR-1. En la Figura 3A, se digirieron 10 \mug de ADN genómico con el enzima de restricción indicado, se corrió sobre un gel de agarosa al 0,6%, de transfirió sobre Genescreen® y se hibridó con cADN de C-C CKR-1 marcado radiactivamente. Se lavó el filtro con 0,5\times SSC, 1% SDS a 55ºC, y la autorradiografía se reveló después de exposición durante la noche a -70ºC con pantallas intensificadoras. También se corrieron en el gel marcadores de peso molecular de ADN y se indican al lado. En la Figura 3B, la misma transferencia se lavó en condiciones más rigurosas con 0,2\times SSC, 0,1% SDS a 60ºC, y la autorradiografía se realizó tal como se ha indicado más arriba.
Las Figuras 4A y 4B son gráficas que ilustran las
concentraciones de Ca^{++} intracelulares de células 293
transfectadas con ADNc de C-C CKR-1
y desafiadas con MIP-1\alpha humano
(HuMIP-1\alpha) y RANTES. En la Figura 4A, células
confluentes al 50% se transfectaron con 10-20 \mug
de ADN plasmídico mediante el procedimiento de precipitación con
calcio-fosfato. Después de la expresión transitoria
durante 12-24 horas, se recolectaron las células, se
cargaron con la sonda de calcio INDO-1 AM, y se
ensayaron mediante procedimientos espectrofluorométricos, a 37ºC,
con agitación ininterrumpida. Tal como se indica, transcurridos 12
segundos se añadieron varias concentraciones de
HuMIP-1\alpha. Las concentraciones de Ca^{++}
intracelulares se determinaron tal como se ha descrito (Naccache,
P.H., et al., J. Immunol., 142:2438-2444
(1989)). En la Figura 4B, los detalles fueron como en la Figura 4A,
excepto que, tal como se ha indicado, se usaron varias
concentraciones de RANTES.
Las Figuras 5A y 5B son gráficas que ilustran la
desensibilización en respuesta al desafío del mismo o diferentes
ligandos por parte de células 293 que transitoriamente expresan el
C-C CKR-1. Los detalles son tal como
sed describieron en la Figura 4. Las células transfectadas se
desafiaron primero durante 12 segundos con 100 nM de
HuMIP-1\alpha
o 250 nM de RANTES, y a continuación durante 70 segundos con la misma concentración de ligandos en el orden indicado.
o 250 nM de RANTES, y a continuación durante 70 segundos con la misma concentración de ligandos en el orden indicado.
Las Figuras 6A y 6B son gráficas que ilustran la
unión del ^{125}I-HuMIP-1\alpha
y ^{125}I-RANTES sobre células 293 transfectadas
con el ADNc de C-C CKR-1. En la
Figura 6A, las células renales embrionarias humanas (células 293) se
transfectaron con 10-20 \mug de ADN plasmídico tal
como se describió en la Figura 4. Las células transfectadas se
incubaron durante 2 horas a 4ºC con
^{125}I-HuMIP-1\alpha en
presencia de concentraciones crecientes de
HuMIP-1\alpha sin marcar. El recuadro muestra el
análisis de Scatchard de los datos de unión y revela una K_{d} de
5,1 \pm 0,3 nM del
^{125}I-HuMIP-1\alpha para el C-C CKR-1. La Figura 6B ilustra el desplazamiento del ^{125}I-RANTES con HuMIP-1\alpha sin marcar sobre células 293 transfectadas con el ADNc de C-C CKR-1. El análisis de Scatchard de los datos de unión reveló una K_{d} de 7,6 \pm 1,5 nM para el desplazamiento del ^{125}I-RANTES por parte del HuMIP-1\alpha.
^{125}I-HuMIP-1\alpha para el C-C CKR-1. La Figura 6B ilustra el desplazamiento del ^{125}I-RANTES con HuMIP-1\alpha sin marcar sobre células 293 transfectadas con el ADNc de C-C CKR-1. El análisis de Scatchard de los datos de unión reveló una K_{d} de 7,6 \pm 1,5 nM para el desplazamiento del ^{125}I-RANTES por parte del HuMIP-1\alpha.
La Figura 7 es una gráfica que ilustra el
desplazamiento de la unión del
^{125}I-HuMIP-1\alpha a las
células 293 transfectadas con el ADNc del C-C
CKR-1. Las células se transfectaron tal como se
esbozó en la Figura 4, y se incubaron durante 2 horas a 4ºC con
^{125}I-HuMIP-1\alpha en
presencia de concentraciones crecientes de los ligandos de
competición cruzada, HuMIP-1\alpha,
MIP-1\alpha de ratón,
HuMIP-1\beta, MCP-1 e
IL-8. La K_{d} y el número de sitios, mostrados en
la esquina inferior izquierda, se determinaron mediante análisis de
Scatchard de los datos de unión.
La Figura 8 es una gráfica que ilustra la
concentración intracelular de Ca^{++} de las células 293 que
expresan transitoriamente el C-C
CKR-1 y son desafiadas con
HuMIP-1\alpha, RANTES,
HuMIP-1\beta y MCP-1. Los detalles
son tal como se describieron en la Figura 4.
La Figura 9 (SEC. Nº ID.: 8) es la secuencia de
nucleótidos del C-C CKR-1 y de su
región 3' no codificante.
La Figura 10 es una gráfica que ilustra la unión
del HuMIP-1\alpha marcado radiactivamente a
células 293 transfectadas con la región codificante de la pauta de
lectura abierta US28 en el genoma del citomegalovirus (CMV). Las
células 293 se transfectaron con una construcción de expresión que
contenía la secuencia codificante de la US28 en la orientación con
sentido y sin sentido. Transcurridas 12 horas, se recolectaron las
células y se incubaron con 0,9 nM de
^{125}I-HuMIP-1\alpha en combinación con 1 \muM de uno de HuMIP-1\alpha sin marcar, MIP-1\alpha de ratón, MCP-1, RANTES o IL-8. La cantidad de ^{125}I-HuMIP-1\alpha desplazable se determinó sustrayendo la cantidad de ^{125}I-HuMIP-1\alpha unido en ausencia de cualquier ligando frío de la cantidad unida en presencia del ligando frío. El valor de fondo se refiere al recuento obtenido a partir de células transfectadas con la orientación anti-sentido de la US28.
^{125}I-HuMIP-1\alpha en combinación con 1 \muM de uno de HuMIP-1\alpha sin marcar, MIP-1\alpha de ratón, MCP-1, RANTES o IL-8. La cantidad de ^{125}I-HuMIP-1\alpha desplazable se determinó sustrayendo la cantidad de ^{125}I-HuMIP-1\alpha unido en ausencia de cualquier ligando frío de la cantidad unida en presencia del ligando frío. El valor de fondo se refiere al recuento obtenido a partir de células transfectadas con la orientación anti-sentido de la US28.
En general, las palabras y frases siguientes
tienen la definición indicada cuando se usan en la descripción,
ejemplos y reivindicaciones.
"C-C CKR-1"
es el receptor de la quimiocina descrito más abajo, junto con si
secuencia de aminoácidos o análogos celulares, alelos, mutaciones
predeterminadas de las secuencia de aminoácidos, variantes de
glicosilación, y modificaciones covalentes. Las realizaciones del
C-C CKR-1 excluyen los receptores de
quimiocinas conocidos, en particular aquéllos expuestos en la
sección Precedentes de más arriba, y los receptores de quimiocinas
evidentemente obvios a partir de tales receptores de
quimiocinas.
"Receptor huérfano" se define como el
polipéptido predicho codificado por el ácido nucleico, el cual se
hibrida en condiciones de baja rigurosidad con sondas diseñadas a
partir de secuencias conocidas de ácido nucleico de receptor de
quimiocinas, u otras secuencias conocidas que es probable que tengan
similitud estructural con los receptores de citocinas, o que son
detectables mediante cebadores de PCR diseñados de esa forma, en
donde el polipéptido predicha no se conoce previamente en el
campo.
"Actividad biológica cualitativa del
C-C CKR-1" es define como la
reactividad inmunológica cruzada con al menos un epítopo del
C-C CKR-1 purificado.
"Que inmunológicamente reacciona de forma
cruzada" se pretende que signifique que el polipéptido candidato
es capaz de inhibir competitivamente la unión del
C-C CKR-1 nativo a anticuerpos
policlonales o antisueros generados contra el C-C
CKR-1 nativo.
"Ácido nucleico o polipéptido del
C-C CKR-1 aislado" es un ácido
nucleico o polipéptido del C-C CKR-1
que está identificado y separado de al menos un contaminante
(respectivamente ácido nucleico o polipéptido) con el cual
ordinariamente está asociado en la naturaleza, tal como los
procedentes de la fuente humana de ácido nucleico o polipéptido del
C-C CKR-1. En las realizaciones
preferidas, el C-C CKR-1 estará
aislado hasta niveles de pureza farmacéuticamente aceptables con
respecto a proteínas de su especie de origen. En las realizaciones
preferidas, la proteína C-C CKR-1
estará purificada hasta (1) más del 95% en peso de proteína, y más
preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente
para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos
N-terminal o interna mediante un secuenciador de
aminoácidos disponible comercialmente en la fecha de registro de
ésta, o (3) hasta la homogeneidad mediante la electroforesis en gel
de poliacrilamida y SDS (SDS-PAGE) no reductora
convencional, usando azul de Coomassie, o preferiblemente tinción de
plata. El C-C CKR-1 aislado incluye
el C-C CKR-1 in situ dentro
de células recombinantes que no expresan ordinariamente el
C-C CKR-1 en cuestión, puesto que,
en este caso, al menos un componente del entorno natural del
C-C CKR-1 no estará presente. El
C-C CKR-1 aislado incluye el
C-C CKR-1 en un cultivo de célula recombinante de otra especie distinta de la especie de origen del C-C CKR-1, puesto que el C-C CKR-1 en tales circunstancias carecerá de polipéptidos fuente. Sin embargo, de forma ordinaria, el C-C CKR-1 se preparará al menos mediante un paso de purificación.
C-C CKR-1 en un cultivo de célula recombinante de otra especie distinta de la especie de origen del C-C CKR-1, puesto que el C-C CKR-1 en tales circunstancias carecerá de polipéptidos fuente. Sin embargo, de forma ordinaria, el C-C CKR-1 se preparará al menos mediante un paso de purificación.
El ácido nucleico aislado del C-C
CKR-1 incluye un ácido nucleico que se identifica y
separar de al menos un ácido nucleico contaminante con el cual está
ordinariamente asociado en la fuente natural del ácido nucleico del
C-C CKR-1.
Por tanto, el ácido nucleico del C-C CKR-1 está presente en otras formas aparte de la forma o disposición en que se halla en la naturaleza. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica el C-C CKR-1 incluye el ácido nucleico del C-C CKR-1 en células que ordinariamente expresan el C-C CKR-1, en donde el ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales, o alternativamente está flanqueado por una secuencia de ADN diferente de la hallada en la naturaleza.
Por tanto, el ácido nucleico del C-C CKR-1 está presente en otras formas aparte de la forma o disposición en que se halla en la naturaleza. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica el C-C CKR-1 incluye el ácido nucleico del C-C CKR-1 en células que ordinariamente expresan el C-C CKR-1, en donde el ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales, o alternativamente está flanqueado por una secuencia de ADN diferente de la hallada en la naturaleza.
El ácido nucleico o polipéptido podría marcarse,
para propósitos de diagnóstico y sondeo, usando una marca tal como
se describe y define adicionalmente más abajo en la discusión de los
ensayos de diagnóstico.
"Ácido nucleico del C-C
CKR-1" se define como un ARN o ADN (a) que
contiene al menos 25 bases de la secuencia genómica o de ADNc que
codifica el C-C CKR-1, (b) o es
complementario de la secuencia genómica o de ADNc que codifica el
C-C CKR-1, (c) que se hibrida con
tal ácido nucleico y permanece unido establemente a éste en
condiciones rigurosas, o (d) codifica un polipéptido que comparte al
menos el 60%, preferiblemente al menos el 70%, con la secuencia de
aminoácidos del C-C CKR-1, y el
polipéptido tiene la habilidad de unir al menos una quimiocina
C-C. Preferiblemente, el ARN o ADN de hibridación
contiene al menos 25 bases, más preferiblemente 40, y más
preferiblemente 60 bases, las cuales son idénticas a las secuencias
que codifican el C-C CKR-1 descritas
más abajo. De forma óptima, el ácido nucleico del
C-C CKR-1 consiste esencialmente
sólo en la secuencia que codifica el
C-C CKR-1 o el complemento de tales secuencias.
C-C CKR-1 o el complemento de tales secuencias.
Las condiciones de "rigurosidad" para la
hibridación se definen como las condiciones de lavado después de la
reacción de hibridación. Típicamente, las condiciones de hibridación
se definen como el empleo de la incubación durante la noche a 24ºC,
en una solución que comprende un 20% de formamida, 5\times SSC
(NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH
7,6), 5\times de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano,
y
20 \mug/ml de ADN cortado y desnaturalizado de esperma de salmón. Las condiciones de "rigurosidad elevada" para el lavado se definen típicamente como el empleo de 0,2\times SSC, 0,1% de SDS a 55ºC, mientras que las condiciones de "baja rigurosidad" para el lavado se definen típicamente como el empleo de 0,5\times SSC, 1% de SDS a 42ºC. Estas condiciones son bien conocidas en la técnica. Consultar, por ejemplo, Current Protocols un Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publishing Associates, N.Y., 1989.
20 \mug/ml de ADN cortado y desnaturalizado de esperma de salmón. Las condiciones de "rigurosidad elevada" para el lavado se definen típicamente como el empleo de 0,2\times SSC, 0,1% de SDS a 55ºC, mientras que las condiciones de "baja rigurosidad" para el lavado se definen típicamente como el empleo de 0,5\times SSC, 1% de SDS a 42ºC. Estas condiciones son bien conocidas en la técnica. Consultar, por ejemplo, Current Protocols un Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publishing Associates, N.Y., 1989.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped
determinado. Las secuencias de control que son apropiadas para los
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación, y potenciado-
res.
res.
Un ácido nucleico está "operativamente
unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia
o líder de secreción está operativamente unido al ADN de un
polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en
la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está
operativamente unido a una secuencia codificantes si está
posicionado de tal forma que facilita la traducción. Generalmente,
"operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que
están enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder de
secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los
potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue
mediante la ligación en los sitios de restricción apropiados. Si
tales sitios no existen, entonces se usan adaptadores o eslabones de
oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica
convencional.
Los plásmidos de partida usados para practicar
esta invención están disponibles comercialmente, o están disponibles
públicamente de forma no restringida, o pueden construirse a partir
de tales plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos
publicados. Además, se conocen otros plásmidos equivalentes en la
técnica y serán aparentes al especialista capacitado. Los
procedimientos para la digestión con enzimas de restricción, la
recuperación y aislamiento del ADN, el análisis de la hibridación, y
la ligación son convencionales, y en este momento son bien conocidos
por el especialista capacitado. De forma similar, las líneas
celulares usadas para practicar esta invención están disponibles
comercialmente o están disponibles públicamente de forma no
restringida.
Otro procedimiento para obtener el gen de interés
es sintetizarlo químicamente usando uno de los procedimientos
descritos en Engels et al., (Angew, Chem. Int. Ed. Engl.,
28:716-734 (1989)). Estos procedimientos incluyen
los procedimientos del triéster, fosfito, fosforamidito, y
H-fosfonato, procediéndose típicamente mediante
síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos.
La "recuperación" o "aislamiento" de un
determinado fragmento de ADN a partir del digerido de restricción
significa la separación del digerido sobre gel de poliacrilamida o
agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de
interés mediante comparación de su movilidad respecto la de
fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocidos, la
retirada de la sección del gel que contiene el fragmento deseado, y
l separación del gel del ADN. Este procedimiento se conoce
generalmente. Por ejemplo, ver Sambrook, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Los aminoácidos se denominan mediante sus
abreviaturas de tres letras estándares de la IUPAC.
El uso del artículo determinado "el" en
relación al C-C CKR-1 no se pretende
que sugiera que sólo una secuencia de ADN codifica el
C-C CKR-1. De hecho, se espera que
los alelos, intermedios del procesamiento, y variantes de la
secuencia predeterminadas descritas más abajo, varíen en su
secuencia respecto del ADN que codifica el C-C
CKR-1
nativo. Además, el C-C CKR-1 podría hallarse dentro de una subfamilia de receptores de quimiocinas que tienen un elevado grado de homología de secuencia pero que varían lo suficiente como para no constituir alelos. Todas estas secuencias se hallan dentro del ámbito del ácido nucleico del C-C CKR-1.
nativo. Además, el C-C CKR-1 podría hallarse dentro de una subfamilia de receptores de quimiocinas que tienen un elevado grado de homología de secuencia pero que varían lo suficiente como para no constituir alelos. Todas estas secuencias se hallan dentro del ámbito del ácido nucleico del C-C CKR-1.
Las secuencia de ADN que codifican el
C-C CKR-1 podrían ser genómicas o de
ADNc. Cualquier biblioteca genómica representativa podría examinarse
con las sondas descritas más abajo. Los procedimientos para la
preparación de ADN genómico y la construcción de bibliotecas de ADNc
son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et
al., ver más arriba.
Las variante de secuencia de aminoácidos del
C-C CKR-1 se preparan introduciendo
los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del
C-C CKR-1, o mediante la síntesis
in vitro del polipéptido C-C
CKR-1 deseado. Tales variantes incluyen, por
ejemplo, las supresiones, o inserciones o sustituciones de residuos
dentro de la secuencia de aminoácidos del C-C
CKR-1 nativo. Puede hacerse cualquier combinación de
supresión, inserción, y sustitución para llegar a una construcción
final, a condición de que la construcción final posea las
características deseadas.
Los cambios de aminoácidos podrían alterar el
procesamiento post-traducción del
C-C CKR-1, tal como cambiando el
número o posición de los sitios de glicosilación, o alterando sus
características de anclaje a la membrana.
Al diseñar variantes de la secuencia de
aminoácidos del C-C CKR-1, la
ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación
dependerán de la(s) característica(s) del
C-C CKR-1 a modificar. Los sitios
para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por
ejemplo, (1) sustituyendo primer con las elecciones de aminoácido
conservadores, y a continuación con selecciones más radicales
dependiendo de los resultados conseguidos, (2) suprimiendo el
residuo diana; o (3) insertando residuos, de la misma o diferente
clase, adyacentes al sitio ubicado, o combinaciones de las opciones
1-3.
Un procedimiento útil para la identificación de
ciertos residuos o regiones del polipéptido C-C
CKR-1 que son ubicaciones preferidas para la
mutagénesis, se denomina "mutagénesis de barrido con alanina",
tal como fue descrito por Cunningham y Well (Science,
244:1081-1085 (1989)). En éste, se identifica un
residuo o grupo de residuos (por ejemplo, residuos cargados tales
como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen con un aminoácido
neutro o cargado negativamente (más preferiblemente, alanina o
polialanina) para afectar la interacción del aminoácido con el
entorno acuoso que lo envuelve dentro o fuera de la célula. Aquellos
dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones
se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales u
otras en o para los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que
el sitio para introducir una variación de la secuencia de
aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per
se no tiene porque estar predeterminada. Por ejemplo, para
optimizar las prestaciones de una mutación en un sitio determinado,
podría realizarse la mutagénesis por barrido con alanina o aleatoria
en el codón o región diana, y se examinan las variantes del
C-C CKR-1 en busca de la combinación
óptima con la actividad deseada.
Las variantes del C-C
CKR-1 que exhiben al menos una actividad biológica
de la secuencia progenitora, por ejemplo, la unión de quimiocina o
la actividad antigénica. Preferiblemente, el C-C
CKR-1 antigénicamente activo es un polipéptido que
se une a un anticuerpo generado contra el polipéptido en su
conformación nativa, "conformación nativa" indicando
generalmente el polipéptido tal como se halla en la naturaleza, el
cual no ha sido desnaturalizado por agentes caotrópicos, calor u
otro tratamiento que modifique sustancialmente la estructura
tridimensional del polipéptido (esto puede determinarse, por
ejemplo, mediante la migración en geles de calibración por tamaño,
no reductores, no desnaturalizantes). El anticuerpo usado en la
determinación de la actividad antigénica es un anticuerpo policlonal
de conejo generado formulando el polipéptido nativo que no es de
conejo, en el adyuvante completo de Freund, inyectando
subcutáneamente la formulación, e impulsando la respuesta inmune
mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta que el
título del anticuerpo anti-polipéptido se
estabili-
za.
za.
Las supresiones en la secuencia de aminoácidos
generalmente oscilan entre aproximadamente 1 a 30 residuos, más
preferiblemente entre 1 a 10 residuos, y típicamente son contiguas.
Preferiblemente, las supresiones se hacen en regiones de la proteína
que son las menos conservadas cuando la secuencia de aminoácido del
C-C CKR-1 se compara con otros
receptores de quimiocinas. Tales supresiones es más probable que
modifiquen la actividad biológica de los polipéptidos de forma más
significativas que las supresiones hechas en cualquier otra parte.
El número de supresiones consecutivas se seleccionará con objeto de
preservas la estructura terciaria del C-C
CKR-1 en el dominio afectado, por ejemplo, la hoja
plegada beta o la hélice alfa.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos
incluyen las fusiones amino- y/o carboxi terminales que oscilan en
longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o
más residuos, así como las inserciones intrasecuencia de un único o
múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (es
decir, las inserciones dentro de la secuencia del
C-C CKR-1) podrían oscilar
generalmente desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos, más
preferiblemente de 1 a 5, y los más preferiblemente de 1 a 3.
Las variantes por inserción del
C-C CKR-1 o de sus segmentos
extracelulares incluyen la fusión a los extremos N- o
C-terminales del C-C
CKR-1 de polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo,
polipéptidos bacterianos tales como la
\beta-lactamasa o un enzima codificado por el
locus trp de E. coli., o proteína de levadura, y fusiones
C-terminales con proteínas que tienen un vida media
larga, tales como los dominios V_{H} o V_{C} de
inmunoglobulinas, los cuales comprenden las regiones constantes, la
albúmina, o la ferritina (por ejemplo, tal como se ha descrito en WO
89/02.992, publicada el 6 de abril de 1989).
Otro grupo de variantes son las variantes por
sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen suprimido al menos
un residuo aminoácido en la molécula de C-C
CKR-1, y un residuo diferente insertado en su lugar.
Los sitios de mayor interés para las mutaciones por sustitución
incluyen los sitios identificados como el(los)
sitio(s) activo(s) del C-C
CKR-1, y los sitios en donde los aminoácidos que se
hallan en el C-C CKR-1 procedente de
varias especies son sustancialmente diferentes en términos de
volumen de la cadena lateral, carga, y/o hidrofobici-
dad.
dad.
Otros sitios de interés son aquéllos en los que
determinados residuos del C-C CKR-1
están conservados cuando se comparan con otros receptores de
quimiocinas. Estas posiciones podrían ser importantes para la
actividad biológica del C-C CKR-1.
Estos sitios, especialmente aquéllos que se hallan dentro de una
secuencia de al menos otros tres sitios idénticamente conservados,
se sustituyen de forma conservadora. Tales sustituciones
conservadoras se muestran en la Tabla I, bajo la cabecera
"sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en
un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios
más sustanciales, denominados "sustituciones ilustrativas" en
la Tabla I, o tal como se describe adicionalmente más abajo, en
referencia a las clases de aminoácidos, y se examinan los
productos.
productos.
\vskip1.000000\baselineskip
Residuo original | Sustituciones ilustrativas | Sustituciones preferidas |
Ala (A) | ser | ser |
Arg (R) | lys; gln; asn; ala | lys |
Asn (N) | gln; his; lys; arg; ala; asp | asp |
Asp (D) | glu; asn; ala | asn |
Cys (C) | ser; ala; val | ala |
Gln (Q) | asp; glu; ala | asn; glu |
Glu (E) | asp; gln; ala | gln |
Gly (G) | ala; ans | ala |
His (H) | asn; gln; lys; arg; ala | asn |
TABLA 1
(continuación)
Residuo original | Sustituciones ilustrativas | Sustituciones preferidas |
Ile (I) | leu; val; met; ala; phe | val |
Leu (L) | ile; val; met; ala; phe | met |
Lys (K) | arg; gln; asn; met; ala | arg |
Met (M) | leu; phe; ile; ala | leu |
Phe (F) | leu; val; ile; ala; tyr | leu |
Pro (P) | ala | ala |
Ser (S) | thr; ala | ala |
Thr (T) | ser; val; ala | ser |
Trp (W) | tyr; phe; ala | tyr |
Tyr (Y) | trp; phe; thr; ala; gln | phe |
Val (V) | ile; leu; met; phe; ala; thr | ala |
\vskip1.000000\baselineskip
Las modificaciones sustanciales en función de la
identidad inmunológica del C-C CKR-1
se consiguen seleccionando sustituciones que difieren
significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la
estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución,
por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice, (b) la carga o
hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de
la cadena lateral. Los residuos que ocurren de forma natural se
dividen en grupos en base a sus propiedades comunes de la cadena
lateral:
- (1)
- hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
- (3)
- ácidos: asp, glu;
- (4)
- básicos: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras comportarán
intercambiar un miembro de una de estas clases por otro. Tales
residuos sustituidos podrían introducirse en regiones del
C-C CKR-1 que son homólogas con
otros receptores de quimiocinas, o, más preferiblemente, en regiones
no homólogas de la molécula.
Cualquier residuo cisteína que no esté implicado
en el mantenimiento de la conformación apropiada del
C-C CKR-1 podría sustituirse,
generalmente con serina, para mejorar la estabilidad frente a la
oxidación de la molécula y prevenir el entrecruzamiento
aberrante.
El ADN que codifica las variantes de la secuencia
de aminoácidos del C-C CKR-1 se
prepara mediante una variedad de procedimientos conocidos en la
técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el
aislamiento a partir de la fuente natural (en el caso de variantes
de la secuencia de aminoácidos que ocurren de forma natural), o la
preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o
dirigida al sitio), la mutagénesis mediante PCR, y la mutagénesis
con casete de una variante preparada previamente o de una versión no
variante del C-C CKR-1. Estas
técnicas podrían utilizar el ácido nucleico (ADN o ARN) del
C-C CKR-1, o un ácido nucleico
complementario del ácido nucleico del C-C
CKR-1. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos
es un procedimiento preferido para preparar las variantes por
sustitución, supresión e inserción del ADN del C-C
CKR-1. Esta técnica es bien conocida en la técnica
(ver, por ejemplo, tal como describieron Adelman et al., DNA,
2:183 (1983). La mutagénesis mediante la PCR es apropiada también
para construir variantes de aminoácidos del C-C
CKR-1 (ver Erlich, más arriba, pp.
61-70). Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis con casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., (Gene, 34:315-323 (1985)).
61-70). Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis con casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., (Gene, 34:315-323 (1985)).
El ADNc o ADN genómico que codifica el
C-C CKR-1 nativo o variante se
inserta en un vector replicable para su ulterior clonación
(amplificación del ADN) o para su replicación. Hay muchos vectores
disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá de (1) si
deber usarse para la amplificación del ADN o para la expresión del
ADN, (2) del tamaño del ADN a insertarse en el vector, y (3) de la
célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene
varios componentes dependiendo de su función (amplificación del ADN
o expresión del ADN) y la célula huésped con la que es compatible.
Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están
limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un
origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento
potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la
transcripción.
En general, una secuencia de señal podría ser un
componente del vector, o podría ser parte del ADN del
C-C CKR-1
que se inserta en el vector.
que se inserta en el vector.
Ambos, los vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector
se replique en una o más células huéspedes seleccionadas.
Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que
permite que el vector se replique de forma independiente del ADN
cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o
secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien
conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El
origen de replicación procedente del plásmido pBR322 es apropiado
para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el
origen del plásmido 2 \mu es apropiado para levaduras, y varios
orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles
para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el
componente origen de replicación no es necesario para los vectores
de expresión en mamíferos (el origen del SV40 podría usarse
típicamente sólo porque contiene un promotor temprano).
La mayoría de los vectores de expresión son
vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicación en
al menos una clase de organismo, pero pueden transfectarse a otro
organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector se clona en
E. coli y a continuación el mismo vector se transfecta a
levaduras o células de mamífero para su expresión, aun cuando no es
capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula
huésped.
El ADN podría amplificarse también mediante su
inserción en el genoma del huésped. Esto se consigue fácilmente
usando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo,
incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria
de una secuencia que se halla en el ADN genómico de Bacillus.
La transfección de Bacillus con este vector resulta en su
recombinación homóloga con el genoma y en la inserción del ADN del
C-C CKR-1. Sin embargo, la
recuperación del ADN genómico que codifica el C-C
CKR-1 es más compleja que la del vector replicado
exógenamente, porque se requiere la digestión con enzimas de
restricción para cortar el ADN del C-C
CKR-1.
Los vectores de expresión y clonación deberían
contener un gen de selección, también denominado marcador que puede
seleccionarse. Este gen codifica una proteína necesaria para la
supervivencia o crecimiento de células huéspedes transformadas y
cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huéspedes
no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no
sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos
codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a
antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina,
metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias
auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el
medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de
D-alanina para Bacilli.
Un ejemplo de esquema de selección utiliza una
droga para detener el crecimiento en una célula huésped. Esas
células que son sucesivamente transformadas con un gen heterólogo
expresan una proteína que confiere resistencia frente a la droga y
por tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal
selección dominante usan las drogas neomicina (Southern et al.,
J. Molec. Appl. Genet., 1:327-341 (1982)), el
ácido micofenólico (Mulligan et al., Science,
209:1422-1427 (1980)), o la higromicina (Sugden
et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)).
Los tres ejemplos citados más arriba emplean genes bacterianos bajo
control eucariota para conferir respectivamente resistencia frente a
la droga apropiada G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido
micofenólico), o higromicina.
Otro ejemplo de marcadores que pueden
seleccionarse apropiados para las células de mamífero son aquéllos
que permiten la identificación de células competentes para capturar
el ácido nucleico del C-C CKR-1,
tales como la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o la quinasa de
timidina. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo
presión de selección que sólo los transformantes están únicamente
adaptados para sobrevivir gracias a haber captado el marcador. La
presión de selección se impone cultivando los transformantes en
condiciones en las que la concentración de agente de selección en el
medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la
amplificación de ambos, el gen de selección y el ADN que codifica el
C-C CKR-1. La amplificación es el
proceso mediante el cual los genes con mayor demanda de producción
de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem
dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células
recombinantes. A partir del ADN amplificado se sintetizan cantidades
crecientes de C-C CKR-1.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen
de selección de la DHFR se identifican primero cultivando todos los
transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato
(Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula huésped
apropiada cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje es la línea
celular del ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad
DHFR, preparada y propagada tal como describieron Urlaub y Chasin,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77(7):4216-4220 (1980)). Las células
transformadas se exponen a continuación a niveles crecientes de
metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen
de la DHFR, y, de forma concomitante, a múltiples copias de otro ADN
que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que
codifica el C-C CKR-1.
Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier otro huésped apropiado, por ejemplo, el ATCC nº CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de la DHFR endógena, si, por ejemplo, se emplea un gen de la DHFR mutante que es altamente resistente al Mtx (EP-117.060). Alternativamente, las células huéspedes (particularmente los huéspedes del tipo salvaje que contienen la DHFR endógena) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el C-C CKR-1, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador que puede seleccionarse, tal como la aminoglicósido-3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador que puede seleccionarse, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, la kanamicina, neomicina o G418.
Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier otro huésped apropiado, por ejemplo, el ATCC nº CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de la DHFR endógena, si, por ejemplo, se emplea un gen de la DHFR mutante que es altamente resistente al Mtx (EP-117.060). Alternativamente, las células huéspedes (particularmente los huéspedes del tipo salvaje que contienen la DHFR endógena) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el C-C CKR-1, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador que puede seleccionarse, tal como la aminoglicósido-3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador que puede seleccionarse, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, la kanamicina, neomicina o G418.
Un gen de selección apropiado para su uso en
levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7
(Stinchcomb et al., Nature, 282:39-43
(1979)); Kingsman et al., Gene, 7:141-152
(1979)); o Tschemper et al., Gene, 10:157-166
(1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una
cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en
triptófano, por ejemplo, la ATCC nº 44.076. La presencia de la
lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura
proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la
transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De
forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC nº
20.622 ó 38.626) son complementada por plásmidos conocidos
portadores del gen Leu2.
Los vectores de expresión usualmente contienen un
promotor que es reconocido por el organismo huésped y está
operativamente unido al ácido nucleico del C-C
CKR-1. Los promotores son secuencias no traducidas
ubicadas cadena arriba (5') respecto el codón de inicio de un gen
estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 p.b.)
que controla la transcripción y traducción de una secuencia de ácido
nucleico determinada, tal como la del C-C
CKR-1, a la cual están operativamente unidos. Tales
promotores típicamente se agrupan en dos clases, inducibles y
constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician
niveles incrementados de transcripción, a partir del ADN bajo su
control, en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo;
por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en
la temperatura. En este momento, son bien conocidos un número
elevado de promotores reconocidos por una variedad de células
huéspedes potenciales. Estos promotores están operativamente unidos
al ADN que codifica el C-C CKR-1
mediante la supresión del promotor del ADN fuente, usando la
digestión con enzimas de restricción, e insertando la secuencia del
promotor aislado en el vector. Ambas, la secuencia promotora del
C-C CKR-1 nativo y muchos promotores
heterólogos, podrían usarse para dirigir la amplificación y/o
expresión del ADN del C-C CKR-1. Sin
embargo, se prefieren los promotores heterólogos, puesto que
generalmente permiten una mayor expresión y rendimientos más
elevados de C-C CKR-1 expresado en
comparación con el promotor nativo del C-C
CKR-1.
Los promotores apropiados para su uso con
huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la
\beta-lactamasas y de la lactosa (Chang et al., Nature, 275:617-624 (1978)); y Goeddel et al., Nature, 281:544-548 (1979)), el de la fosfatasa alcalina, y sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8(18):4057-4074 (1980), y EP-36,776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25, (1983)). Sin embargo, son apropiados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo de ese modo que un trabajador capacitado las una operativamente al ADN que codifica el C-C CKR-1 (Siebenlist, et al., Cell, 20:269-281 (1980)) usando eslabones o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos generalmente contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el C-C CKR-1.
\beta-lactamasas y de la lactosa (Chang et al., Nature, 275:617-624 (1978)); y Goeddel et al., Nature, 281:544-548 (1979)), el de la fosfatasa alcalina, y sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8(18):4057-4074 (1980), y EP-36,776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25, (1983)). Sin embargo, son apropiados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo de ese modo que un trabajador capacitado las una operativamente al ADN que codifica el C-C CKR-1 (Siebenlist, et al., Cell, 20:269-281 (1980)) usando eslabones o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos generalmente contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el C-C CKR-1.
Las secuencias promotoras apropiadas para su uso
con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J.
Biol. Chem., 255(24):12073-12080 (1980))
u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme
Reg., 7:149-167 (1968)); y Holland,
Biochemistry, 17:4900-4907 (1978)), tales
como la enolasa, la deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato, la
hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la
isomerasa de la glucosa-6-fosfato,
la mutasa del 3-fosfoglicerato, la quinasa del
piruvato, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y
la glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, los cuales son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la
transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las
regiones promotoras de las deshidrogenasa 2 del alcohol, del
isocitocromo C, de la fosfatasa ácida, de los enzimas asociados con
el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína, de la
deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato, y de los
enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa.
Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en
levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman et al.,
EP-73.657A. Los potenciadores de levadura también se
usan ventajosamente con los promotores de levadura.
Las secuencias de promotores son conocidas para
los eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una
región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena
arriba respecto del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra
secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba respecto del inicio
de la transcripción de muchos genes es la región CXCAAT, en donde X
podría ser cualquier nucleótido. En el extremo 30 de la mayoría de
los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la
señal para la adición de la cola poli-A al extremo
3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan
convenientemente en los vectores de expresión en
mamíferos.
mamíferos.
La transcripción del C-C
CKR-1 a partir de vectores en células de mamífero
está controlada por promotores obtenidos de los genomas de virus
tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el
virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus
de la hepatitis B, y más preferiblemente el Virus 40 de los Simios
(SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo,
el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir
de promotores de choque térmico, y a partir del promotor asociado
normalmente con la secuencia del C-C
CKR-1, a condición que tales promotores sean
compatibles con los sistemas de la célula huésped.
Los promotores temprano y tardío del virus SV40
se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción
del SV40 que contiene también el origen de replicación viral del
SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113-120
(1978); Mulligan y Berg, Science,
209:1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). El
promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene
convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E
(Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)).
En US-4.419.446 se descubre un sistema para expresar
ADN en huéspedes de mamífero usando el virus del papiloma bovino
como vector. Una modificación de este sistema se describe en
US-4.601.978. Ver también, Gray et al.,
Nature, 295:503-508 (1982), sobre la expresión
de ADNc, que codifica el interferón inmune, en células de mono;
Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982),
sobre la expresión del cADN del interferón \beta humano en células
de ratón bajo el control del promotor de la quinasa de timidina del
virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 79:5166-5170 (1982), sobre la expresión del
gen del interferón \beta1 humano en células cultivadas de ratón y
conejo; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
79:6777-6781 (1982), sobre la expresión de
secuencias CAT bacterianas en células renales de mono
CV-1, en fibroblastos embrionarios de pollo, en
células ováricas de hámster chino, en células HeLa, en células
NIH-3T3 de ratón, usando como promotor la repetición
terminal larga del virus del sarcoma de Rous.
La transcripción de un ADN que codifica el
C-C CKR-1 de esta invención por
parte de eucariotas superiores se incrementa a menudo mediante la
inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis,
usualmente de aproximadamente 10-300 p.b., que
actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los
potenciadores son relativamente independiente de su posición y
orientación, habiéndose hallado 5' (Laimins et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 78:464-468 (1981)) y 3' (Lusky
et al., Mol. Cell. Biol.,
3(6):1108-1122 (1983)) respecto la unidad de
transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al.,
Cell,
33:729-740 (1983)) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell. Biol., 4(7):
1293-1305 (1984)). Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador podría ayustarse dentro del vector, en una posición 5' ó 3' respecto el ADN del C-C CKR-1, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto del
promotor.
33:729-740 (1983)) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell. Biol., 4(7):
1293-1305 (1984)). Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador podría ayustarse dentro del vector, en una posición 5' ó 3' respecto el ADN del C-C CKR-1, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto del
promotor.
Los vectores de expresión usados en células
huéspedes eucariotas (de levadura, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas procedentes de otros
organismos multicelulares) también contendrán las secuencias
necesarias para la terminación de la transcripción, y para
estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente
en el extremo 5' y, ocasionalmente, en las regiones 3' no traducidas
de ADN virales o ADNc. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción
no traducida del ARNm que codifica el C-C
CKR-1. Las regiones 3' no traducidas incluyen
también sitios de terminación de la transcripción.
Los vectores apropiados que contienen uno o más
de los componentes listados más arriba, y las secuencias codificante
y de control deseadas, se construyen mediante técnicas de ligación
estándares. Los plásmidos aislados o fragmentos del ADN se cortan,
adaptan y religan en la forma deseada para generar los plásmidos
requeridos.
En el análisis para confirmar las secuencias
correctas en los plásmidos construidos, se usan las mezclas de
ligación para transformar E. coli K12 de la cepa 294 (ATCC
31.446) y los transformantes exitosos se seleccionan mediante
resistencia a la ampicilina o tetraciclina según convenga. Los
plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, se analizan
mediante digestión con endonucleasa de restricción, y/o se
secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic
Acids Res., 9(2):309-321 (1981)), o
mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in
Enzymology, 65:499-560 (1980)).
Los vectores de expresión que proporcionan las
expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifica el
C-C CKR-1 son particularmente útiles
en la práctica de esta invención. En general, la expresión
transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de
replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la
célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión, y, a
su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado
codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión
transitoria, que comprenden un vector de expresión apropiado y una
célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de
polipéptidos codificados por ADN clonados, así como el examen rápido
de tales polipéptidos con propiedades biológicas o fisiológicas
deseadas. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son
particularmente útiles en la invención para los propósitos de
identificar análogos y variantes del C-C
CKR-1 que tienen actividad similar a la del
C-C CKR-1, y para el análisis del
efecto de la unión de variantes de quimiocinas al
C-C CKR-1.
Otros procedimientos, vectores y células
huéspedes apropiadas para su adaptación a la síntesis del
C-C CKR-1 en cultivo de células de
vertebrado recombinantes se describen en Gething et al.,
Nature, 293:620-625 (1981)); Mantel et al.,
Nature, 281:40-46 (1979));
EP-117.060; y EP-117.058. Un
plásmido particularmente útil para la expresión del
C-C CKR-1 en cultivo de células de
mamífero es el pRK5 (EP, nº de publicación 307.247) o el pSVI6B
(EE.UU., solicitud con nº de serie 07/441.574, registrada el 22 de
noviembre de 1989).
Las células huéspedes apropiadas para la
clonación o expresión de los vectores de expresión del
C-C CKR-1 son las células
procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas más
arriba. Las procariotas apropiadas incluyen las eubacterias, tales
como los organismos Gram-negativos y
Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, Bacilli
tales como B. subtilis, especies de Pseudomonas tales
como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, o
Serratias marcescens. Un huésped de clonación E. coli
preferido es E. coli 294 (ATCC 31.5446), aunque otras cepas
como E. coli B, E. coli \chi1776 (ATCC 31.537), y
E. coli W3110 (ATCC 27.325) son apropiadas. Estos ejemplos
son ilustrativos en vez de limitantes. Preferiblemente, la célula
huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas
proteolíticos. Alternativamente, son apropiados los procedimientos
de clonación in vitro, por ejemplo la PCR u otras reacciones
de polimerasa de ácido nucleico.
Además de las procariotas, los microbios
eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son
huéspedes apropiados para vectores que contienen el ADN del
C-C CKR-1. Saccharomyces
cerevisiae, o levadura común de panadería, es el más comúnmente
usado de entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores.
Sin embargo, un cierto número de otros géneros, especies, y cepas
están comúnmente disponibles y son útiles para la práctica de la
invención, tales como S. pombe (Beach y Nurse, Nature,
290:140-143 (1981)), Kluyveromyces lactis
(Louvencourt et al., J. Bacteriol.,
154(2):737-742 (1983)), Pichia
pastoris (EP-183.070), Trichoderma reesia
(EP-244.234), Neurospora crassa (Case et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
(1979)), y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans
(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene
26:205-221 (1983)); Yelton et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)), y A.
niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:
475-479 (1985)).
475-479 (1985)).
Las células huéspedes apropiadas para la
expresión del polipéptido del C-C
CKR-1 glicosilado se derivan de organismos
multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de un
procesamiento complejo y de actividades de glicosilación. En
principio, es útil cualquier cultivo de células eucariotas
superiores, sea un cultivo procedente de vertebrados o de
invertebrados. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las
células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y
variantes de baculovirus y las correspondientes células huéspedes de
insecto permisivas a partir de huéspedes tales como Spodoptera
frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes
albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de
la fruta), y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al.,
Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et
al., en Genetic Engineering, J.K. Setlow et al.,
8:277-279 (Plenum Publishing, 1986), y Maeda et
al., Nature, 315:592-594 (1985)). Una diversidad
de tales cepas virales están disponibles públicamente, por ejemplo,
la variante L-1 del NPV de Autographa
californica, y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx
mori, y tales virus podrían usarse como el virus acorde con la
presente invención, particularmente para la transfección de células
de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales de algodón,
maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como
huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan
mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens, al cual se ha manipulado
previamente para contener el ADN del C-C
CKR-1. Durante la incubación del cultivo de células
vegetales con A. tumefaciens, el ADN que codifica el
C-C CKR-1 es transferido a la célula
huésped vegetal de fal forma que ésta es transfectada y, en
condiciones apropiadas, expresa el ADN del C-C
CKR-1. Además, hay disponibles secuencias de señal y
reguladoras compatibles con las células vegetales, tales como las
secuencias del promotor de la sintasa de nopalina y de la señal de
poliadenilación. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen.,
1:561-573 (1982). Además, los segmentos de ADN
aislados de la región cadena arriba del gen 780 del
T-ADN son capaces de activar o incrementar los
niveles de transcripción de genes que pueden expresarse en plantas
en tejido vegetal que contenga ADN recombinante. Ver la
EP-321.196, publicada el 21 de junio de 1989.
Sin embargo, el interés en las células de
vertebrados ha sido máximo, y la propagación de las células de
vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) ha devenido un
procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture,
Academic Press, Eds. Kruse y Patterson, 1973). Los ejemplos de
líneas celulares huéspedes de mamífero útiles son la línea CV1 de
riñón de mono transformada por el SV40 (COS-7, ATCC
CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (293 o células 293
subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham
et al., J. Gen. Virol., 36:59-72 (1977)); las
células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células
de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220
(1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.
Reprod., 23:243-251 (1980)); las células renales
de mono (CV1, ATCC CCL 70); las células renales de mono verde
africano (VERO-76, ATCC CRL-1587);
las células de carcinoma cervical humanas (HeLa, ATCC CCL 2); las
células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células hepáticas
de la rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células pulmonares
humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas humanas (Hep G2,
HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las
células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.,
383:44-68 (1982)); las células MRC 5; las células
FS4; y una línea celular humana de hepatoma (Hep G2). Las células
huéspedes preferidas son las células 293 renal embrionaria humana y
las ováricas de hámster chino.
El huésped escogido para la expresión podría ser
también un organismo multicelular, tal como en un animal
transgénico. Tales animales se han producido mediante la
transfección de células madre, células somáticas, o embriones con
ADN heterólogo, implantando apropiadamente las células transfectadas
y dejando que las células maduren dentro, o se integren establemente
dentro de animales adultos que contienen el ADN heterólogo. Un
porcentaje reproducible de tales animales transcriben y expresan el
ADN heterólogo como una proteína que puede identificarse en los
tejidos, incluyendo la sangre y suero. Los procedimientos apropiados
para crear animales transgénicos se describen en la patente
estadounidense 4.396.601 y en Palmiter et al., Nature,
300:611-615 (1982).
Las células huéspedes se transfectan y son
preferiblemente transformadas con los vectores de expresión o
clonación de esta patente descritos más arriba, y se cultivan en
medio nutritivo convencional, modificado según sea apropiado para
inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar
los genes que codifican las secuencias deseadas.
La transfección se refiere a la captación de un
vector de expresión por parte de una célula huésped, se expresen o
no de hecho alguna secuencia codificante. Numerosos procedimientos
de transfección son conocidos por el técnico ordinariamente
capacitado, por ejemplo, el CaPO_{4} y la electroporación. La
transfección exitosa generalmente se reconoce cuando ocurre
cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la
célula huésped.
La transformación significa introducir ADN dentro
de un organismo de forma que el ADN es replicable, bien como un
elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica.
Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza
usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El
tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, tal como se
describe en la Sección 1.82 de Sambrook et al., se usa
generalmente con procariotas u otras células que contienen barreras
sustanciales en forma de pared celular. La infección con
Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de
ciertas células vegetales, tal como describieron Shaw et al.,
Gene, 23:315-330 (1983) y
WO-89/05.859, publicada el 29 de junio de 1989. Para
las células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el
procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico descrito en
las Secciones 16.30-16.37 de Sambrook et al.,
ver más arriba. Los aspectos generales de las transformaciones de
sistemas de células huéspedes de mamífero han sido descritos por
Axel en US-4.399.216, concedida el 16 de agosto de
1983. Las transformaciones en levaduras se realizan típicamente de
acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J.
Bacteriol., 130(2):946-947 (1977) y Hsiao
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76(8):3829-3833 (1979). Sin embargo, también
podrían usarse otros procedimientos para introducir ADN dentro de
células, tales como la inyección nuclear, la electroporación, o la
fusión de protoplastos.
Las células procariotas usadas para producir el
polipéptido del C-C CKR-1 de esta
invención se cultivaron en medio apropiado tal como se describe de
forma general en Sambrook et al., ver más arriba.
Las células de mamífero usadas para producir el
C-C CKR-1 de esta invención podrían
cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles
comercialmente, tales como el F10 de Ham (Sigma), el Medio Esencial
Mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el
Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son apropiados
para cultivar las células huéspedes. Además, cualquiera de los
medios descritos en Ham y McKeehan, Meth. Enz.,
58:44-93 (1979); Barnes y Sato, Anal.
Biochem., 102:255-270 (1980); patentes
US-4.767.704, US-4.657.866,
US-4.927.762; o US-4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195; solicitud de patente estadounidense nº 30.985; o patente US-5.122.469, podría usarse como medio de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según fuera necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferrina, o factor del crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, cálcico, magnésico y fosfatos), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y la timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquier otros suplementos necesarios podrían incluirse también en las concentraciones apropiadas que serán conocidas por los especialistas en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son aquéllas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes al especialista ordinariamente capacitado.
US-4.927.762; o US-4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195; solicitud de patente estadounidense nº 30.985; o patente US-5.122.469, podría usarse como medio de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según fuera necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferrina, o factor del crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, cálcico, magnésico y fosfatos), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y la timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquier otros suplementos necesarios podrían incluirse también en las concentraciones apropiadas que serán conocidas por los especialistas en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son aquéllas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes al especialista ordinariamente capacitado.
Las células huéspedes preferidas en este
descubrimiento abarcan las células en cultivo in vitro, así
como las células que se hallan dentro de un animal huésped.
La amplificación y/o expresión del gen podrían
mediarse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern para
cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:5201-5205 (1980), transferencia en
punto (análisis del ADN), o hibridación in situ, usando una
sonda marcada apropiadamente. Podrían emplearse varias sondas, más
comúnmente radioisótopos, particularmente el ^{32}P. Sin embargo,
también podrían emplearse otras técnicas, tales como los nucleótidos
modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. A
continuación, la biotina sirve como sitio para la unión de avidina o
anticuerpos, los cuales podrían marcarse con una amplia variedad de
marcas, tales como radionúcleos, compuestos fluorescentes, enzimas,
o similares.
Alternativamente, podrían emplearse anticuerpos
que pueden reconocer dúplexes específicos, incluyendo los dúplexes
de ADN, dúplexes de ARN, y dúplexes híbridos de
ADN-ARN o dúplexes de ADN-proteína.
A su vez, los anticuerpos podrían marcarse, y podría llevarse a cabo
el ensayo en el que el dúplex está unido a una superficie, de forma
que, a partir de la formación del dúplex sobre la superficie, puede
detectarse la presencia
\hbox{de anticuerpo unido al dúplex.}
Alternativamente, la expresión del gen podría
medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción
inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo del cultivo
celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la
expresión del producto del gen. En las técnicas de tinción
inmunohistoquímicas, se prepara una muestra de células, típicamente
mediante deshidratación y fijación, seguida por reacción con
anticuerpos marcados específicos para el producto del gen acoplado,
en donde las marcas son usualmente detectables visualmente, tales
como marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminiscentes,
y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible y
apropiada para su uso en la presente invención es la descrita
\hbox{por Hu et al., Am. J. Clin. Path ., 75:734-738 (1980).}
Los anticuerpos útiles para la tinción
inmunohistoquímica y/o para el ensayo de muestras de fluidos podría
ser monoclonal o policlonal, y podría prepararse en cualquier
mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos podrían prepararse
contra un polipéptido de C-C CKR-1
nativo o sintético, o contra variantes del mismo.
El C-C CKR-1 se
recupera a partir de los cultivos de células mediante solubilización
de la membrana celular con detergente.
Cuando un C-C
CKR-1 humano se expresa en una célula recombinante
distinta de una de origen humano, el C-C
CKR-1 está completamente libre de proteínas o
polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar
el C-C CKR-1 a partir de proteínas o
polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que
son sustancialmente homogéneas en proteína como C-C
CKR-1. Como un primer paso, las células se
centrifugan para separarla del medio de cultivo, seguida por
procedimientos de purificación apropiados, tales como:
fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o intercambio
iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa;
cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio
catiónico tales como la DEAE; cromatoenfoque;
SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico;
filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75.
Las variantes del C-C
CKR-1 en las que se han suprimido, insertado o
sustituido residuos, se recuperan de la misma forma que el
C-C CKR-1 nativo, tomando en
consideración cualesquier cambios sustanciales en las propiedades
causados por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión
del C-C CKR-1 con otra proteína o
polipéptido; por ejemplo, una antígeno bacteriano o viral, facilita
la purificación; puede usarse una columna de inmunoafinidad que
contenga anticuerpo contra el antígeno para adsorber la fusión. Las
columnas de inmunoafinidad, tales como la columna de
anti-C-C CRK-1
policlonal de conejo, pueden emplearse para adsorber la variante del
C-C CKR-1 uniéndola al menos a un
epítopo inmune restante. También podría emplearse un inhibidor de
proteasa, tal como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para
inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y
podrían incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de
contaminantes adventicios. Alguien especialista en la técnica se
percatará de que los procedimientos de purificación apropiados para
el C-C CKR-1 nativo podrían requerir
modificaciones para tomar en consideración los cambios en el
carácter del C-C CKR-1 o de sus
variantes a partir de su expresión en cultivos de células
recombinantes.
Las modificaciones covalentes del polipéptido del
C-C CKR-1 o sus sustituyentes
glucosilo se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Tanto el
C-C CKR-1 nativo como las variantes
de la secuencia de aminoácidos del C-C
CKR-1 podrían modificarse covalentemente. Las
modificaciones covalentes del C-C
CKR-1, de los fragmentos del mismo, o de los
anticuerpos contra el mismo, se introducen en la molécula haciendo
reaccionar los residuos aminoácidos apuntados del
C-C CKR-1, de los fragmentos del
mismo, o del anticuerpo contra el C-C
CKR-1, con un agente derivatizador orgánico que es
capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los
residuos N- o C-terminales. Más comúnmente, el
C-C CKR-1 y sus anticuerpos se unen
covalentemente a grupos detectables usados en el diagnóstico, por
ejemplo, enzimas, radioisótopos, marcadores de espín, antígenos,
grupos fluorescentes o quimioluminiscentes, y similares.
Los residuos cisteinilo, más habitualmente se
hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y las
aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la
cloroacetamida, para rendir derivados carboximetilos o
carboxamidometilos. Los residuos cisteinilo se derivatizan también
mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido
\alpha-bromo-\beta-(5-imidazol)propiónico,
fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas,
3-nitro-2-piridil-disulfuro,
metil-2-piridil-disulfuro,
p-cloromercuribenzoato,
2-cloromercuri-4-nitrofenol,
o
cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.
Los residuos histidilo se derivatizan mediante
reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque
este agente es relativamente específico para la cadena lateral del
histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo es
también útil; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato
sódico 0,1 M a pH 6,0.
Los residuos lisinilo y amino terminal se hacen
reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos
carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de
invertir la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos
apropiados para derivatizar residuos que contienen
\alpha-amino incluyen los imidoésteres tales como
el metil picolinimidato; el piridoxal fosfato; el piridoxal; el
cloroborohidruro; el ácido trinitrobencensulfónico; la
O-metilisourea; la 2,
4-pentanodiona; y la reacción con glioxilato
catalizada por la transaminasa.
Los residuos arginilo se modifican mediante
reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos, el
fenilglioxal, la 2,3-butanodiona, la
1,2-ciclohexanodiona, y la ninhidrina. La
derivatización de residuos arginilo requiere que la reacción se
realice en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del
grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos podrían
reaccionar con los grupos de la lisina así como con el grupo
épsilon-amino de la arginina.
La modificación específica de los residuos
tirosilo podría hacerse, con especial interés en la introducción de
marcas espectrales dentro de los residuos tirosilo, mediante
reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano.
Más comúnmente, se usan la N-acetilimidazola y el
tetranitrometano para formar respectivamente especies
O-acetil-tirosilo y derivados
3-nitro. Los residuos tirosilo se yodan usando
^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su uso
en radioinmunoensayos, siendo apropiado el procedimiento de la
cloramina T descrito más
arriba.
arriba.
Los grupos carboxilos laterales (aspartilo y
glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con
carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), en
donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como la
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida
o la
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfenil)carbodiimida.
Además, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos
asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil para el entrecruzamiento del C-C
CKR-1, de sus fragmentos, o de sus anticuerpos, a
una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en
procedimientos para purificar los anticuerpos
anti-C-C CKR-1, y
viceversa. Los agentes entrecruzadores comúnmente usados incluyen,
por ejemplo, el
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
el glutaraldehído, los ésteres de
N-hidroxisuccinimida, por ejemplos, los ésteres con
ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres
homobifuncionales, incluyendo los disuccinimidilésteres tales como
el
3-3'-ditiobis-(succinimidilpropionato), y las maleimidas bifuncionales tales como la bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizante tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermedios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, para la inmovilización de proteínas, se emplean matrices insolubles en agua, tales como los carbohidratos activados con cianuro bromuro, y los sustratos reactivos descritos en US-3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440.
3-3'-ditiobis-(succinimidilpropionato), y las maleimidas bifuncionales tales como la bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizante tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermedios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, para la inmovilización de proteínas, se emplean matrices insolubles en agua, tales como los carbohidratos activados con cianuro bromuro, y los sustratos reactivos descritos en US-3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440.
Los residuos glutaminilo y asparaginilo
frecuentemente se desamidan respectivamente a los correspondientes
residuos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se
desamidan en condiciones suavemente ácidas. Cualquier forma de estos
residuos se halla dentro del ámbito de esta invención.
Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de
prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos
serilo y treonilo, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Mollecular Properties, Eds. W.H. Freeman & Co., San
Francisco, pp. 79-86, 1983), la acetilación de la
amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo
carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido del C-C CKR-1 incluida
dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el patrón de
glicosilación nativo del polipéptido. Por alteración se quiere
significar suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en el
polipéptido nativo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que
no están presentes en el polipéptido nativo.
La glicosilación de polipéptidos está típicamente
unida a N o a O. Unida a N se refiere a la unión del grupo
carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las
secuencias de tripéptido
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, en donde X es
cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la
cadena lateral de la asparagina. Así pues, la presencia de
cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea
un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación unida a O se
refiere a la unión de uno de los azúcares
N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un
hidroxiaminoácido, más comúnmente, serina o treonina, aunque también
podrían usarse la 5-hidroxiprolina o la
5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido del C-C CKR-1 se
consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de
tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptido
descritas más arriba (para los sitios de glicosilación unidos a N).
La alteración podría hacerse también mediante la adición de, o la
sustitución por, uno o más residuos serina o treonina en la
secuencia del C-C CKR-1 nativo (para
sitios de glicosilación unidos a O). Por facilidad, la secuencia de
aminoácidos del C-C CKR-1 se altera
preferiblemente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente
mutando el ADN que codifica el polipéptido del C-C
CKR-1 en bases preseleccionadas de tal forma que se
generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. Las
mutaciones del ADN podrían realizarse usando procedimientos
descritos más arriba bajo la cabecera de "Variantes de la
secuencia de aminoácidos del polipéptido del C-C
CKR-1".
Otros medios para incrementar el número de grupos
carbohidrato sobre el polipéptido del C-C
CKR-1 es mediante el acoplamiento químico o
enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son
ventajosos ya que no requieren la producción del polipéptido en una
célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para la
glicosilación unidad a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento
usado, el(los) azúcar(es) podría(n) unirse a
(a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos
sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos
hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o
hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la
fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la
glutamina. Estos procedimientos se describen en
WO-87/05.330, publicada el 11 de septiembre de 1987,
y en Aplin y Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., pp.
259-306 (1981)).
La supresión de grupos carbohidratos presentes en
el polipéptido del C-C CKR-1 podría
conseguirse química o enzimáticamente. La desglicosilación química
requiere la exposición del polipéptido al compuesto ácido
trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este
tratamiento resulta en la eliminación de la mayoría de los azúcares,
excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o
N-acetilgalactosamina), mientras que deja el
polipéptido intacto. La desglicosilación química está descrita por
Hakimuddin, et al. (Arch. Biochem. Biophys.,
259:52-57 (1987)) y por Edge et al. (Anal.
Biochem., 118:131-118 (1981)). La eliminación
enzimática de grupos carbohidratos sobre polipéptidos puede
conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y
exoglicosidasas, tal como describieron Thotakura et al. (Meth.
Enzymol., 138:350-359 (1987)).
La glicosilación en sitios de glicosilación
potenciales podría impedirse mediante el uso del compuesto
tunicamicina tal como describieron Duskin et al., (J. Biol.
Chem., 257:3105-3109 (1982)). La tunicamicina
bloquea la formación de los enlaces
proteína-N-glicósido.
El C-C CKR-1
también podría atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo,
mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización
interfacial (por ejemplo, respectivamente microcápsulas de
hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de
poli-(metilmetacilato)), en sistemas coloidales de suministro de
fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina,
microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en
microemulsiones. Tales técnicas se descubren en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Ed. A. Osol, (1980).
Las preparaciones de C-C
CKR-1 son útiles también para generar anticuerpos,
para su uso como estándares en ensayos del C-C
CKR-1 (por ejemplo, marcando el C-C
CKR-1 para su uso como un estándar en un
radioinmunoensayo, en un inmunoensayo unido a enzima, o un ensayo
con radiorreceptor), en técnicas de purificación por afinidad, y en
ensayos de unión al receptor del tipo competitivos cuando está
marcado con yodo radiactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de
espín, y similares.
Puesto que a menudo es difícil predecir con
antelación las características de una variante del
C-C CKR-1, se apreciará que será
necesario cierto examen de la variante recuperada para seleccionar
la variante óptima. Por ejemplo, un cambio en el carácter
inmunológico de la molécula del C-C
CKR-1, tal como la afinidad por un determinado
anticuerpo, se mide mediante un inmunoensayo del tipo competitivo.
La variante se ensaya en busca de cambios en la supresión o
potenciación de su actividad en comparación con la actividad
observada para el C-C CKR-1 nativo
en el mismo ensayo. Otras modificaciones potenciales de la proteína
o del polipéptido, tales como el redox o la estabilidad térmica, la
hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, o
la tendencia a agregarse con portadores o en multímeros, se ensayan
mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.
Las formulaciones terapéuticas del
C-C CKR-1 (incluyendo sus fragmentos
unidores del C-C CKR-1) o de los
anticuerpos contra el mismo se preparan para el almacenamiento
mezclando el C-C CKR-1, que tiene el
grado de pureza deseado, con portadores, excipientes o
estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington's
Pharmaceutical Sciences, ver más arriba), en forma de
formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores,
excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los
receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen
tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos;
antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo
peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas,
tales como la albúmina del suero, la gelatina, o inmunoglobulinas;
polímeros hidrofílicos, tales como la polivinilpirrolidona;
aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o
lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos,
incluyendo la glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales
como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol y sorbitol;
contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como el Tween, Pluronics o
polietilenglicol (PEG).
El C-C CKR-1 o
anticuerpo a usarse para la administración in vivo debe ser
estéril. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través
de membranas de filtración estéril, antes o después de la
liofilización y reconstitución. El C-C
CKR-1 ordinariamente se almacenará en forma
liofilizada o en solución.
Las composiciones terapéuticas del
C-C CKR-1 o anticuerpo se colocan
generalmente en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril,
por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene
un tapón que se puede perforar por medio de una aguja de inyección
hipodérmica.
La ruta de administración del C-C
CKR-1 o anticuerpo está de acuerdo con los
procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante
rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular,
intraocular, intraarterial, o intralesional, o mediante sistemas de
liberación continua tal como se ha destacado más arriba.
Los ejemplos apropiados de composiciones de
liberación continua incluyen las matrices de polímero semipermeable
en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Las matrices de liberación continua incluyen los
poliláctidos (US-3. 773.919,
EP-58.481), los copolímeros de ácido
L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato
(Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556
(1983)), el poli(2-hidroxietilmetacrilato)
(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.,
15:167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech.,
12:98-105 (1982)), el etilenvinil acetato (Langer
et al., ver más arriba) o el
poli-D-(-)-3-hidroxibutirato
(EP-133.988). Las composiciones de liberación
continua de C-C CKR-1 o anticuerpo
incluyen también el C-C CKR-1 o
anticuerpo atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen
C-C CKR-1 o anticuerpo se preparan
mediante procedimientos conocidos per se:
DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034
(1980); EP-52.322; EP-36.676;
EP-88.046; EP-143.949;
EP-142.641; la solicitud de patente japonesa
83-118.008; US-4.485.045 y
4.544.545; y
EP-102.324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms), en los cuales el contenido de lípido es superior a aproximadamente el 30% molar en colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con el C-C CKR-1 o anticuerpo.
EP-102.324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms), en los cuales el contenido de lípido es superior a aproximadamente el 30% molar en colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con el C-C CKR-1 o anticuerpo.
Una cantidad terapéutica de C-C
CKR-1 o su anticuerpo a emplearse terapéuticamente
dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de
administración, y de la condición del paciente. Por ejemplo, se
espera que el C-C CKR-1 sea
terapéuticamente efectivo en el tratamiento de la inflamación
mediada por citoquina. En consecuencia, será necesario para el
terapeuta valorar la dosis y modificar la ruta de administración
según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo.
Típicamente, el clínico administrará el C-C
CKR-1 o su anticuerpo hasta que se alcance una dosis
que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se
monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.
Los anticuerpos policlonales contra el
C-C CKR-1 generalmente se generan en
animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o
intraperitoneales (ip) de C-C CKR-1
y un adyuvante. La inmunización con células recombinantes
transformadas con el C-C CKR-1 (por
ejemplo, células de ratón o CHO transformadas con el
C-C CKR-1 humano) podría ser
satisfactoria, o podría ser útil separar el C-C
CKR-1 y conjugarlo, o un fragmento conteniendo la
secuencia aminoácido diana, con una proteína que es inmunogénica en
la especie a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con
forma de ojo de cerradura, la albúmina del suero, la tiroglobulina
bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja, usando un agente
bifuncional o derivatizante, por ejemplo, el éster maleimidobenzoil
sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), la
N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina),
el glutaraldehído, el anhídrido succínico, el SOCl_{2}, o el
R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos alquilo dife-
rentes.
rentes.
Los animales ordinariamente se inmunizan contra
las célula, o conjugados inmunogénicos, o derivados, combinando 1 mg
o 1 \mug de C-C CKR-1 en adyuvante
completo de Freund, e inyectando la solución intradérmicamente en
múltiples sitios. Un mes más tardes, se estimulan los animales con
de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del conjugado en el adyuvante
completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples
sitios. De 7 a 14 días más tarde, se sangran los animales y se
ensaya el suero para determinar el título de
anti-C-C CKR-1. Los
animales se estimulan hasta que el título se estabiliza.
Preferiblemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo
C-C CKR-1, pero conjugado con una
proteína diferente y/o a través un agente entrecruzador diferente.
Los conjugando pueden prepararse también en cultivo de células
recombinantes como proteínas de fusión. También se usan agentes
agregantes, tales como el alum, para potenciar la respuesta
inmune.
Otra opción es emplear biblioteca combinatorias
de dominio variable y métodos de examen para identificar los
anticuerpos anti-C-C
CKR-1 deseados.
Los anticuerpos monoclonales se preparan
recuperando células de bazo a partir de animales inmunizados, e
inmortalizando las células de la forma convencional, por ejemplo,
mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con
el virus de Epstein-Barr (EB), y examinando en busca
de clones que expresan el anticuerpo deseado.
El anticuerpo monoclonal preferiblemente es
específico para cada polipéptido diana del C-C
CKR-1. El anticuerpo se selecciona para que sea
agonista, antagonista, o para que no tenga efecto alguno sobre la
actividad o sobre la unión del C-C
CKR-1.
El ácido nucleico que codifica el
C-C CKR-1 podría usarse como un
diagnóstico para la tipificación específica del tejido. Por ejemplo,
podrían usarse procedimientos tales como la hibridación in
situ, y la transferencia Northern y Southern, y el análisis
mediante la PCR, para determinar si el ADN y/o ARN que codifican el
C-C CKR-1 están presentes en los
tipos de células que se están evaluando.
El polipéptido del C-C
CKR-1 aislado podría usarse en ensayos diagnósticos
cuantitativos como un estándar o control respecto al que podrían
compararse las muestras, por ejemplo, procedentes de eritrocitos,
que contienen cantidades desconocidas de C-C
CKR-1. Las células recombinantes que expresan el
C-C CKR-1 pueden usarse en ensayos
para ligandos del C-C CKR-1 de la
misma forma que, por ejemplo, se usan los neutrófilos en los ensayos
de la IL-8. Los polipéptidos del C-C
CKR-1, los fragmentos o células (como tales, o
derivatizadas) también pueden usarse como inmunogenes en la
producción de anticuerpos contra el C-C
CKR-1, o para la purificación de tales anticuerpos a
partir de ascites o medio de cultivo de células recombinantes.
Los anticuerpos contra el C-C
CKR-1 son útiles en los ensayos diagnósticos de la
expresión del C-C CKR-1 en células o
tejidos específicos, en donde los anticuerpos se marcan de la misma
forma descrita más arriba para el C-C
CKR-1, y/o se inmovilizan sobre una matriz
insoluble. Los anticuerpos contra el C-C
CKR-1 son útiles también para la purificación
mediante afinidad del C-C CKR-1 a
partir de cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales.
Los anticuerpos contra el C-C CKR-1
que no reaccionan detectablemente de forma cruzada con otros
receptores de quimiocinas pueden usarse para purificar cada
C-C CKR-1 libre de otros receptores
de quimiocinas homólogos. Los anticuerpos contra el
C-C CKR-1 son antagonistas de la
superfamilia PF4 son útiles como agentes antiinflamatorios o en el
tratamiento de otros trastornos mediados por la superfamilia
PF4.
Los ensayos diagnósticos apropiados para el
C-C CKR-1 y su anticuerpos son bien
conocidos per se. Tales ensayos incluyen los ensayos
competitivos y en sándwich, y los ensayos de inhibición estérica.
Los procedimientos competitivos y en sándwich emplean un paso de
separación de fase como una parte integral del procedimiento,
mientras que los ensayos de inhibición estérica se realizan en una
única mezcla de reacción. Fundamentalmente, se usa el mismo
procedimiento para el ensayo del C-C
CKR-1 y de sustancias que unen el
C-C CKR-1, aunque se favorecerán
ciertos procedimientos dependiendo del peso molecular de la
sustancia que se esté ensayando. Por tanto, la sustancia a ensayarse
se denomina como analito, con independencia de su estado, sea un
antígeno o un anticuerpo, y las proteínas que unen el analito se
denominan parejas de unión, sean anticuerpos, receptores de
superficie celular, o antígenos.
Los procedimientos analíticos para el
C-C CKR-1 o sus anticuerpos usan
todos uno o más de los siguientes reactivos: análogo del analito
marcado, análogo del analito inmovilizado, pareja de unión marcada,
pareja de unión inmovilizada, y conjugados estéricos. Los reactivos
marcados también se denominan "trazadores".
La marca usada (y esto es útil también para
marcar el ácido nucleico del C-C
CKR-1 para su uso como sonda) es cualquier
funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del analito
a su pareja de unión. Se conocen numerosas marcas para uso en
inmunoensayos, incluyendo los ejemplos grupos que podrían detectarse
directamente, tales como fluorocromos, agentes quimioluminiscentes,
y marcas radiactivas, así como porciones, tales como enzimas, que
deben reaccionar o derivatizarse para ser detectados. Los ejemplos
de tales marcas incluyen los radioisótopos ^{32}P, ^{14}C,
^{125}I, ^{3}H, y ^{131}I, fluoróforos tales como quelatos de
tierras raras, o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus
derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, la
luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente
estadounidense nº 4.737.456), la luciferina, las
2,3-dihidroftalazinedionas; la peroxidasa de rábano
silvestre, la fosfatasa alcalina, la
beta-galactosidasa, la glucoamilasa, el lisozima,
las oxidasas de sacáridos, por ejemplo, la glucosa oxidasa, la
galactosa oxidasa, y la deshidrogenasa de la
glucosa-6-fosfato, las oxidasas
heterocíclicas, tales como la uricasa y la xantina oxidasa,
acopladas con un enzima que emplea el peróxido de hidrógeno para
oxidar un precursor de colorante tal como la HRP, la
lactoperoxidasa, o la microperoxidasa, la biotina/avidina, las
marcas de espín, las marcas de bacteriófago, los radicales libres
estables, y similares.
Hay procedimientos convencionales disponibles
para unir estar marcas covalentemente a proteínas o polipéptidos.
Por ejemplo, podrían usarse agentes de acoplamiento tales como los
dialdehídos, la carbodiimidas, la dimaleimidas, los
bis-imidatos, la bencidina
bis-diazotizada, y similares, para marcar los
anticuerpos con los marcas fluorescentes, quimioluminiscentes, y
enzimáticas descritas más arriba. Ver, por ejemplo, las patentes
estadounidenses nº 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas);
Hunter et al., Nature, 144:495-496 (1962);
David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021
(1974); Pain et al., J. Immunol. Methods,
40:219-230 (1981); y Nygren, J., Histochem.
Cytochem., 30: 407-412 (1982). Las marcas
preferidas en ésta son los enzimas como la peroxidasa de rábano
silvestre y la fosfatasa alcalina.
La conjugación de tal marca, incluyendo los
enzimas, al anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar
para alguien con la formación ordinaria en las técnicas de
inmunoensayo. Ver, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods
for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates
for Use In Enzyme Immunoassay," en Methods in Enzymology,
Eds. J.J. Langone y H. Van Vunakis, volumen 73 (Academic Press,
Nueva York, Nueva York, 1981), pp. 147-166. Tales
procedimientos de enlace son apropiados para su uso con los
anticuerpos y polipéptidos de esta invención.
En ciertos procedimientos de ensayo se requiere
la inmovilización de los reactivos. La inmovilización comporta
separar la pareja de unión de cualquier analito que permanezca libre
en solución. Esto se consigue convencionalmente bien solubilizando
la pareja de unión o análogo del analito antes del procedimiento de
ensayo, como mediante la adsorción a una matriz o superficie
insoluble en agua (Bennich et al.,
US-3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por
ejemplo, usando el entrecruzamiento con glutaraldehído), o mediante
la posterior insolubilización de la pareja o análogo, por ejemplo,
mediante inmunoprecipitación.
Otros procedimientos de ensayo, conocidos como
ensayos competitivos o en sándwich, están bien establecidos y son
ampliamente usados en la industria de diagnósticos comerciales.
Los ensayos competitivos se fundamentan en la
capacidad de un análogo trazador para competir con el analito de la
muestra de ensayo por un número limitado de sitios de unión sobre
una pareja de unión común. La pareja de unión generalmente se
insolubiliza antes o después de la competición, y a continuación el
trazador y analito unidos a la pareja de unión se separan del
trazador y analito no unidos. Esta separación se consigue decantando
(cuando la pareja de unión estaba preinsolubilizada) o mediante
centrifugación (cuando la pareja de unión se precipitó después de la
reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de
ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido,
según se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan
curvas de dosis-respuesta con cantidades conocidas
de analito, y se comparan con los resultados del ensayo para
determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la
muestra de ensayo. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando
los enzimas se usan como los marcadores detectables.
Otra especie de ensayo competitivo, denominada
ensayo "homogéneo", no requiere una fase de separación. En
ésta, no requiere una separación de fase. En éste, se prepara y usa
un conjugado de un enzima con el analito de tal forma que, cuando el
anti-analito une el analito, la presencia del
anti-analito modifica la actividad del enzima. En
este caso, el C-C CKR-1 o sus
fragmentos inmunológicamente activos, se conjugan con un puente
orgánico bifuncional a una enzima tal como la peroxidasa. Los
conjugados se seleccionan para su uso con un
anti-C-C CKR-1, de
tal forma que la unión del anti-C-C
CKR-1 inhibe o potencia la actividad del enzima de
la marca. Este procedimiento per se se practica ampliamente
bajo el nombre de EMIT.
Los conjugados estéricos se usan en
procedimientos de impedimento estérico para ensayos homogéneos.
Estos conjugados se sintetizan uniendo covalentemente un hapteno de
bajo peso molecular a un analito pequeño, de forma que el anticuerpo
contra el hapteno es sustancialmente incapaz de unir el conjugado al
mismo tiempo que el anti-analito. En este
procedimiento de ensayo, el analito presente en la muestra de ensayo
unirá el anti-analito, permitiendo de ese modo que
el anti-hapteno se una al conjugado, resultando en
un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un
cambio en la fluorescencia cuando el hapteno es un fluoróforo.
Los ensayos en sándwich son particularmente
útiles para la determinación del C-C
CKR-1 o anticuerpos contra el C-C
CKR-1. En los ensayos en sándwich secuenciales, una
pareja de unión inmovilizada se usa para adsorber el analito de la
muestra de ensayo, la muestra de ensayo se retira mediante lavado,
el analito unido se usa para adsorber la pareja de unión marcada, y
el material unido se separa a continuación del trazador residual. La
cantidad de trazador unido es directamente proporcional al analito
en la muestra de ensayo. En los ensayos en sándwich
"simultáneos", la muestra de ensayo no se separa antes de
añadir la pareja de unión marcada. Un ensayo en sándwich secuencial,
usando un anticuerpo monoclonal
anti-C-C CKR-1 como
un anticuerpo, y un anticuerpo policlonal
anti-C-C CKR-1 como
el otro, es útil para ensayar muestras en busca de actividad del
C-C CKR-1.
Los anteriores son meramente ensayos diagnósticos
ilustrativos par el C-C CKR-1 y sus
anticuerpos. Otros procedimientos, desarrollados ahora y a partir de
ahora, para la determinación de estos analitos se incluyen dentro
del ámbito de esta invención, incluyendo los bioensayos descritos
más arriba.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplo
I
Se empleó una estrategia de clonación de
"receptor huérfano" en un intento de aislar los ADNc que
codifican los receptores de las quimiocinas C-C. Los
receptores de superficie celular para los quimioatractores C5a
(Gerard, N.P., et al., Nature, 349:614-617
(1991)), el tripéptido bacteriano fMLP (Boulay, F., et al.,
Biochemistry, 29:111123-11133 (1990)), así como
los dos receptores de la quimiocina
C-X-C IL-8,
receptores A y B (IL8rA e IL8rB) (Holmes, W.E., et al.,
Science, 253:1278-1280 (1991); Murphy, P.M.,
et al., Science, 253:1280-1283 (1991)) se
halló que pertenecían a la superfamilia de receptores de proteínas
cuyas estructuras se predice que atraviesan siete veces la membrana
celular (Dohlman, H.G., et al., Annu. Rev. Biochem.,
60:653-658 (1991)). Puesto que las moléculas que
abarcan siete veces la membrana están típicamente asociadas con
proteínas G, cuya función puede inhibirse mediante la toxina
pertusis, asumimos que los receptores de la clase de proteína
quimiocinas C-C compartirían también la arquitectura
de siete elementos transmembrana. De acuerdo con esto, se
sintetizaron dos oligonucleótidos degenerados correspondientes a las
secuencias de aminoácidos conservadas en dos regiones transmembrana
(TM) del IL8rA, y de los receptores del C5a y del fMLP. El primer
oligonucleótido correspondía a una región en TM2:
LNLA(L/V)AD(L/F)(L/G) (SEC. Nº ID.: 9) y el
segundo en TM7:
NP(I/M)(I/L)Y(A/V)(F/V)(I/M/A)GS (SEC.
Nº ID.: 10).
Estos oligómeros se usaron a continuación como
cebadores en experimentos de RT-PCR usando sustratos
de ADNc procedentes de diferentes tipos de células hematopoyéticas
que se sabe responden a las quimiocinas C-C,
incluyendo las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y
las líneas celulares U937, HL60 y THP-1. La PCR se
realizó tal como sigue: se usaron 1-2 \mug de ARN
total procedente de diferentes líneas celulares hematopoyéticas como
sustratos de la RT-PCR (Larrick, J.W., Trends
Biotech., 10:146-152 (1992)), tal como
recomendaba el proveedor (Perkin Elmer, Norwalk, CT). En la PCR se
usaron los oligonucleótidos degenerados correspondientes a las
regiones conservadas de los receptores de quimioatractores. Las
condiciones de la PCR fueron como sigue: 94ºC durante 0,5 min,
50-55ºC durante 0,5 min, 72ºC durante
0,5-1 min, 30 ciclos. Los productos de la PCR se
clonaron con extremos romos en el sitio SmaI del pBS (Stratagene, La
Jolla, CA) tal como se había descrito previamente (Nguyen, T. et
al., Gene, 109:211-218 (1991)). El ADN
plasmídico se aisló usando el equipo Quiagen (Quiagen Inc.,
Chatsworth, CA) según recombinada el proveedor. La secuenciación se
realizó con el equipo Sequenase (USBC, Cleveland, OH) según
recomendaba el proveedor.
La subclonación y secuenciación de los productos
de la PCR reveló la presencia de IL8rA, IL8rB, receptor del C5a, y
dos nuevos clones que tenían características de receptores con siete
segmentos transmembrana y una marcada similitud con los dos
receptores de la IL-8. La caracterización funcional
parcial de estos receptores huérfanos reveló que no unían el
HuMIP-1\alpha. Sin embargo, se apreció que estos
dos clones, los cuales estaban más relacionados con los receptores
de la IL-8 que con otros receptores que abarcan
siete veces la membrana, poseían un nuevo motivo de aminoácidos
conservado en el extremo de TM3, DRYLAIVHA (SEC Nº ID.: 11), el cual
parecía definir una subfamilia de las moléculas que abarcan la
membrana siete veces relacionadas con el receptor de la
IL-8, que excluía los receptores del C5a y fMLP. Por
tanto, se llevó a cabo una segunda ronda de
RT-PCR/clonación del huérfano usando el
oligonucleótido degenerado de la TM2 y un oligonucleótido degenerado
de DRYLAIVHA (SEC. Nº ID.: 11). Además, para incrementar las
probabilidades de obtener receptores de quimiocinas
C-C, el ADNc se obtuvo de monocitos humanos
cultivados, los cuales unían el HuMIP-1\alpha
marcado radiactivamente, y de células B, las cuales respondían
quimiotácticamente al HuMIP-1\alpha, y se usó en
la reacción de la PCR. La clonación y la secuenciación de estos
productos de la PCR reveló varios receptores adicionales únicos que
abarcaban siete veces la
membrana.
membrana.
Los monocitos se cultivaron mediante técnicas
estándares comúnmente conocidas en la técnica. De forma breve, se
separaron células de la capa de leucocitos en un gradiente de
Ficoll. Las células mononucleares recuperadas de la interficie se
centrifugaron repetidamente para suprimir las plaquetas. Los
monocitos se separaron de otras células mononucleares adhiriéndolos
a placas de cultivo de células. Las células no adherentes se
eliminaron mediante lavado y los monocitos adherentes se cultivaron
a continuación durante 48-72 horas antes de su
uso.
Alternativamente, el ADN genómico o ADNc se pudo
examinar en busca de la presencia de genes de receptores huérfanos
mediante hibridación tradicional de la transferencia Southern con
los oligómeros descritos más arriba, o con sondas diseñadas a partir
de ADN clonado de una proteína que abarca la membrana siete
veces.
Ejemplo
II
Se aisló un ADNc correspondiente a un clon, el
JOSH1, examinando una biblioteca de cADN de \lambdagt10 preparada
a partir de células HL60 tratadas con PMA (forbol
12-miristato 13-acetato) con
fragmentos de restricción marcados con ^{32}P. Se aisló el ADN de
fagos y los insertos de los clones \lambdagt10 se obtuvieron
mediante la PCR, empleando 20 ciclos con cebadores flanqueadores del
inserto y en enzima polimerasa del ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla,
CA), según recomendaba el proveedor. Los productos de la PCR se
subclonaron en el sitio SmaI del pRK5 tal como se describió más
arriba.
La secuencia de nucleótidos de JOSH1 reveló una
pauta de lectura abierta de 1065 bases, que codificaba una proteína
de 355 aminoácidos (Figuras 1 y 9). La secuencia de aminoácidos
deducida, designada provisionalmente como el receptor I de
quimiocina C-C (C-C
CKR-1), tiene características claves relacionadas
con los receptores vinculados a la proteína G de la superfamilia de
receptores que abarcan siete veces la membrana. Por ejemplo, tiene
siete regiones hidrofóbicas que se predice abarcan la membrana
celular, y residuos cisteína en el primer y segundo bucle
extracelular que están implicados en la formación de un enlace
disulfuro (Figura 1). Sin embargo, ciertas características de la
proteína C-C CKR-1 predicha la hacen
distinta de los receptores clásicos que abarcan siete veces la
membrana. El extremo carboxilo es relativamente corto y carece de
residuos cisteína implicados en el anclaje a membrana a través de un
grupo palmitoilado (O'Dowd, B.F. et al., J. Biol. Chem.,
264:7564-7569 (1989)), y los segmentos entre los
dominios transmembrana son relativamente cortos, una característica
consistente con otros receptores quimioatractores (Boulay, F., et
al., Biochemistry, 30:2993-2999 (1991); Boulay,
F., et al., Biochemistry, 29:111123-11133
(1990); Gerard, N.P., et al., Nature,
349:614-617 (1991); Holmes, W.E., et al.,
Science, 253:1278-1280 (1991); Murphy, P.M.,
et al., Science, 253:1280-1283 (1991)). Hay
tres sitios potenciales de glicosilación en el C-C
CKR-1 (Figura 1), uno en el extremo
N-terminal, uno en el primer bucle citoplasmático, y
el tercero en el TM6. Este último sitio es improbable que esté
glicosilado, puesto que se predice que esté enterrado en la membrana
celular. Finalmente, hay una secuencia consenso para un sitio de
fosforilación para la proteína quinasa C, en la posición 192, pero
esta posición se predice que sea extracelular.
Se comparó la secuencia de aminoácidos deducida
del C-C CKR-1 con otros receptores
quimioatractores vinculados a la proteína G (Figura 1). Los IL8rA e
IL8rB mostraron aproximadamente un 32% de identidad de secuencia con
el C-C CKR-1, mientras que los
receptores del C5a y fMLP mostraron aproximadamente un 23% de
identidad (Figura 1). Recientemente se ha depositado en Genebank
(código de acceso #M99293), por parte de Federsspiel et al.,
una molécula putativa que abarca siete veces la membrana,
HUMST-SR, que se halló tenía un 31% de identidad con
el C-C CKR-1. La secuencia de esta
molécula es idéntica a uno de los receptores putativos aislados en
nuestro primer intento de clonación mediante RT-PCR
descrito más arriba. El ligando para el HUMSTSR todavía no ha sido
identificado. El segundo grupo de receptores que está estrechamente
relacionado con el C-C CKR-1 son los
receptores del neuropéptido Y y de la angiotensina II (no se
muestran los datos). En último lugar, una pauta de lectura abierta
en el genoma del citomegalovirus, denominada US28, tiene
aproximadamente un 33% de identidad con el C-C
CKR-1, y aproximadamente un 60% de identidad en la
región N-terminal antes de la TM1 con el
C-C CKR-1.
\newpage
Ejemplo
III
La expresión del C-C
CKR-1 se verificó en un panel limitado de líneas de
células hematopoyéticas usando el análisis de transferencia
Northern. La hibridación de la transferencia Northern se realizó
como sigue. Se aisló el ARN total usando el procedimiento del
guanidinio-isotiocianato-CsCl
(Sambrook et al., 1989), o mediante el procedimiento del
RNAzol según recomendaba el proveedor. Se aisló el
poli-A^{+} ARN usando Dynabeads oligoT (DYNAL,
Great Neck, NY) según recomendaba el proveedor. El ARNm de HL60,
denominado "HL60-C" en este informe, se obtuvo
de Clontech (Palo Alto, CA). 20 \mug de ARN total ó 5 \mug de
poli-A^{+} ARN se fraccionaron en geles de
formaldehído-agarosa, se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa, y se hibridaron con ADNc de
C-C CKR-1 (Korneluk, R.G. et al.,
J. Biol. Chem., 261:8407-8413 (1986)).
Se detectó una única banda de aproximadamente 3
kb en las líneas celulares pre-monocíticas, por
ejemplo, células U937 y HL60 no diferenciadas o diferenciadas
(Figura 2), pero no en una preparación comercial de ARN de HL60
(HL60-C, Figura 2). También se detectaron niveles
inferiores de mARN en las líneas de células B 1788 y Daudi, pero se
detectó poco o ningún mARN en las células K562 (Figura 2). Los
niveles más elevados se detectaron en células THP-1
tratadas con PMA, en donde se obtuvo una señal intensa cuando se
analizaron 20 \mug de ARN total (Figura 2).
La hibridación de la transferencia Southern se
realizó como sigue. El ADN genómico humano, obtenido de Clontech
(Palo Alto, CA), se digirió mediante restricción, se transfirió
sobre Genescreen® (Dupont), y se hibridó (Neote, K., et al., J.
Clin. Invest., 86:1524-1531 (1990)) con el ADNc
del C-C CKR-1. El patrón de
hibridación indicó que el gen del C-C
CKR-1 podía carecer de intrones. Más aún, esto
sugería la existencia de un segundo gen relacionado o posiblemente
de un pseudo-gen. Las Figuras 3A y 3B representan
los lavados con bajo y elevada rigurosidad de la misma transferencia
de ADN genómico humano, el cual se había digerido con varios enzimas
de restricción. En condiciones de elevada rigurosidad (Figura 3B),
se detectaron fragmentos de restricción simples que se hibridaban
con el ADNc del C-C CKR-1 cuando el
ADN genómico se digería con BamHI, HindIII o SacI, y, tal como se
predecía a partir de la secuencia del ADNc, se detectan dos
fragmentos en las digestiones de ADN con EcoRI y PstI. Sin embargo,
la hibridación con baja rigurosidad reveló la presencia de bandas
adicionales que se hibridaban con el ADNc del C-C
CKR-1, por ejemplo, un fragmento de PstI de
aproximadamente 7 kb y un fragmento de HindIII de aproximadamente
1,6 kb (Figura 3A). Estas bandas desaparecían cuando las
transferencias se lavaban en condiciones de elevada rigurosidad,
mientras que las otras bandas permanecían inalteradas entre los dos
lavados.
Ejemplo
IV
MCP-1, RANTES,
HuMIP-1\alpha y huMIP-1\beta
inducen un incremento rápido y transitorio del Ca^{++}
intracelular en monocitos humanos (Rollins, B.J., et al.,
Blood, 78:1112-1116 (1991); Sozzani, S., et
al., J. Immunol., 147:2215-2221 (1991)). Para
determinar si el C-C CKR-1 era un
receptor funcional de quimiocinas C-C, se expresó
transitoriamente en células 293 renales humanas y se midieron los
niveles intracelulares de Ca^{++} en respuesta a diferentes
quimiocinas C-C.
Se expresó el RANTES recombinante en E.
coli y se purificó tal como describieron Kuna et al. (J.
Immunol. 149:636-642 (1992b)). El
huMIP-1\alpha y el huMIP-1\beta
se expresaron en E. coli, y se purificaron tal como
describieron Rot et al. (J. Exp. Med., en prensa). El
huMIP-1\alpha se yodó mediante el procedimiento
del cloroglicourilo (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 80:849-857 (1978)) hasta una actividad
específica inicial de 472 Ci/mmol. El
huMIP-1\alpha marcado se purificó mediante una
combinación de filtración en gel y HPLC en fase inversa. El
RANTES marcado con ^{125}I, actividad específica de 2200 Ci/mmol, se obtuvo de Dupont/NEN (Boston, MA). El MCP-1 recombinante y el MIP-1\alpha de ratón se obtuvieron de Peprotech (Rocky Hill, NJ).
RANTES marcado con ^{125}I, actividad específica de 2200 Ci/mmol, se obtuvo de Dupont/NEN (Boston, MA). El MCP-1 recombinante y el MIP-1\alpha de ratón se obtuvieron de Peprotech (Rocky Hill, NJ).
Se transfectaron células 293 renales embrionarias
humanas con 10-20 \mug de ADN plasmídico mediante
el procedimiento del fosfato cálcico según está descrito (Schall,
T.J., et al., Eur. J. Immunol., 22:1477-1481
(1992)) o mediante el procedimiento modificado del fosfato cálcico
(Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol.,
7:2745-2752 (1987)). Las células transfectadas se
ensayaron después de la expresión transitoria durante
12-24 horas.
Las mediciones del Ca^{++} intracelular se
realizaron en el SLM 8000C esencialmente tal como se ha descrito
(Naccache, P.H. et al., J. Immunol.,
142:2438-2444 (1989)), con modificaciones menores:
se usó INDO-1-AM a una concentración
final de 20 mg/ml y se usaron 2-4 \times 10^{6}
células por ensayo.
Inicialmente se usó una dosis 100 nM de RANTES,
huMIP-1\alpha, huMIP-1\beta, y
MCP-1 como una primera aproximación de la
concentración máxima fisiológicamente relevante. Cuando las células
transfectadas, cargadas con la sonda de calcio
INDO-1-AM, se desafiaron con 100 nM
de uno de huMIP-1\alpha o RANTES, se observó un
incremento rápido del Ca^{++} intracelular (Figura 4). El desafío
con la misma dosis de MCP-1 o
huMIP-1\beta produjo un pequeño flujo detectable
de Ca^{++} (no se muestran los datos). Las células control,
transfectadas con el vector solo o con el vector conteniendo el
C-C CKR-1 en la orientación opuesta
(no codificante), no respondieron a ninguno de los ligandos (no se
muestran los datos). Las respuestas de señalización eran
dependientes de la dosis, 10 n; de huMIP-1\alpha y
100 nM de RANTES eran suficientes para obtener una respuesta máxima
o prácticamente máxima (Figura 4A y 4B).
Se sabe que la exposición rápida y sucesiva al
mismo ligando desensibiliza la capacidad de señalización de los
receptores vinculados a la proteína G (Schild, H.O., "Receptor
classification with special reference to
\beta-adrenergic receptors," en Drug
Receptors, Ed. H.P. Rang (University Press, 1973), pp.
29-36). Además, la desensibilización puede ocurrir
también cuando dos agonistas diferentes señalizan a través del mismo
receptor. El huMIP-1\alpha claramente bloquea la
capacidad del receptor C-C CKR-1
para transmitir una segunda señal de Ca^{++} cuando se añade el
huMIP-1\alpha sucesivamente dos veces a las
células transfectadas (Figura 5A). De forma similar, el RANTES
bloquea la respuesta frente a un segundo desafío a la misma
concentración (Figura 5B). Cuando el huMIP-1\alpha
se añade primero, bloquea la respuesta al RANTES, indicando que ha
ocurrido la desensibilización completa (Figura 5C). Sin embargo, el
desafío de las células transfectadas con el C-C
CKR-1 con 250 nM de RANTES no impidió un flujo
subsiguiente de Ca++ a causa de la adición de
huMIP-1\alpha 100 mM (Figura 5D), indicando que no
había ocurrido la desensibilización del receptor. Sin embargo, el
subsiguiente flujo de Ca^{++} por parte del
huMIP-1\alpha está reducido, desde un cambio de
Ca^{++} intracelular de aproximadamente 70 nM (Figuras 5A y 5C)
hasta aproximadamente 40 nM (Figura 5D), sugiriendo que había
ocurrido una desensibilización parcial.
Ejemplo
V
Con objeto de investigar adicionalmente la
interacción del huMIP-1\alpha y RANTES con el
C-C CKR-1 clonado, se llevaron a
cabo experimentos de unión con ligandos marcados con ^{125}I.
Los ensayos de unión se realizaron tal como se ha
descrito previamente (Horuk, R. et al., J. Biol. Chem.,
262:
16275-16278 (1987)). Las células transfectadas (2 \times 10^{6} células por ml) se incubaron con ligandos marcados radiactivamente y diversas concentraciones de ligandos sin marcar, a 4ºC, durante 2 horas. La incubación se terminó retirando alícuotas de la suspensión de células, y separando las células del tampón mediante centrifugación a través de una mezcla de silicona/aceite de parafina tal como se ha descrito previamente (Robb, R.J. et al., J. Exp. Med., 160:
1126-1146 (1984)). La unión no específica se determinó en presencia de 1 \muM de ligando no marcado. Se representaron las determinaciones de ensayos individuales, representativas de al menos tres experimentos independientes. Los datos de unión se ajustaron con una curva con el programa de ordenador LIGAND (Munson, P.J. et al., Anal. Biochem., 107:220-239 (1980)) modificado para el PC de IBM (McPherson, G.A., Comp. Prog. Biomed., 17:107-114 (1983)) para determinar la afinidad (K_{d}), el número de sitios, y la unión no específica. Las curvas mostradas son las isotermas de la unión determinadas por LIGAND.
16275-16278 (1987)). Las células transfectadas (2 \times 10^{6} células por ml) se incubaron con ligandos marcados radiactivamente y diversas concentraciones de ligandos sin marcar, a 4ºC, durante 2 horas. La incubación se terminó retirando alícuotas de la suspensión de células, y separando las células del tampón mediante centrifugación a través de una mezcla de silicona/aceite de parafina tal como se ha descrito previamente (Robb, R.J. et al., J. Exp. Med., 160:
1126-1146 (1984)). La unión no específica se determinó en presencia de 1 \muM de ligando no marcado. Se representaron las determinaciones de ensayos individuales, representativas de al menos tres experimentos independientes. Los datos de unión se ajustaron con una curva con el programa de ordenador LIGAND (Munson, P.J. et al., Anal. Biochem., 107:220-239 (1980)) modificado para el PC de IBM (McPherson, G.A., Comp. Prog. Biomed., 17:107-114 (1983)) para determinar la afinidad (K_{d}), el número de sitios, y la unión no específica. Las curvas mostradas son las isotermas de la unión determinadas por LIGAND.
Por tanto, cuando las células 293, que
transitoriamente expresaban el C-C
CKR-1, se incubaron con
^{125}I-huMIP-1\alpha y
concentraciones crecientes de huMIP-1\alpha sin
marcar, se observó la unión desplazable del
^{125}I-huMIP-1\alpha al
C-C CKR-1 (Figura 6A). El análisis
de Scatchard mostró una constante de disociación (K_{d}) de 5,1
\pm 0,3 nM y aproximadamente 130.000 sitios/célula. Esta K_{d}
está dentro del rango de la determinada para la unión del
huMIP-1\alpha a monocitos humanos, y sugiere que
el C-C CKR-1 es al menos uno de los
receptores del huMIP-1\alpha presente sobre
monocitos. Sin embargo, no pudo conseguirse la unión directa del
RANTES al C-C CKR-1, es decir, el
^{125}I-RANTES no pudo ser desplazado por el
RANTES sin marcar. De forma interesante, a medida que se
incrementaba la cantidad de RANTES sin marcar en el ensayo de unión,
se observó un incremento concomitante del
^{125}I-RANTES unido a las células (no se muestran
los datos). Puesto que el C-C CKR-1
transduce una señal (moviliza el Ca^{++}) en respuesta al RANTES
(Figura 4) y, por tanto, el ligando estar uniéndose al receptor
clonado, no está clara la razón para el inusual perfil de unión
observado para el ^{125}I-RANTES. Se obtuvieron
fenómenos de unión similares si se usaban otras células diana que
respondían al RANTES. De forma interesante, el
^{125}I-RANTES pudo ser desplazado por
huMIP-1\alpha sin marcar sobre células 293 que
expresaban el C-C CKR-1
transitoriamente (Figura 6B). El análisis de Scatchard de este
desplazamiento heterólogo sugirió una K_{d} de 7,6 \pm 1,5 nM
(aproximadamente 350.000 sitios/célula) y es consistente con la
K_{d} de los datos de unión del huMIP-1\alpha
descritos más arriba. Estas observaciones nos sugirieron
inicialmente que el C-C CKR-1 une el
huMIP-1\alpha y el RANTES y subsiguientemente
transduce una señal incrementando los niveles intracelulares de
Ca^{++}.
Ejemplo
VI
Para caracterizar adicionalmente las propiedades
de unión del C-C CKR-1, y en
particular para intentar definir una K_{d} para la unión del
RANTES al C-C CKR-1 clonado, se
realizó el desplazamiento heterólogo del
^{125}I-huMIP-1\alpha con RANTES
y también con huMIP-1\beta, MCP-1,
IL-8, y MIP-1\alpha de ratón. De
forma interesante, todas las quimiocinas C-C
(RANTES, MIP-1\beta y MCP-1)
desplazaron el
^{125}I-huMIP-1\alpha, pero la
quimiocina C-X-C
IL-8 no lo hizo (Figura 7). A partir del análisis de
Scatchard se determinó que la K_{d} para el RANTES,
huMIP-1\beta y MCP-1, y el
MIP-1\alpha era respectivamente de 486 \pm 280,
232 \pm 70,1, 122 \pm 39,9 y 4,2 \pm 2,7 nM, y en cada caso
había presentes aproximadamente 250.000-350.000
sitios/célula (Figura 7). Estos resultados revelaron una amplia
especificidad de ligando del C-C
CKR-1, incluyendo cierta ausencia de especificidad
de especie en la unión. De forma más importante, sugirió que la
afinidad de unión entre el ligando y el receptor no predice la
eficacia de la señalización que resulta de la interacción, es decir,
aunque el huMIP-1\beta y el MCP-1
se unen con una afinidad superior que el RANTES, 100 mM de
MIP-1\beta o MCP-1 no transmiten
una señal a través del receptor clonado, mientras que el RANTES sí
que lo hace (Figura
4).
4).
\newpage
Ejemplo
VII
Para determinar la relevancia de la unión del
huMIP-1\beta y MCP-1 al
C-C CKR-1, se desafiaron células
293, transfectadas con el ADNc del C-C
CKR-1, con dosis elevadas de
huMIP-1\beta y MCP-1, y se
determinaron los niveles intracelulares de Ca^{++}. Se tuvo que
usar una concentración de 1 mM del MPC-1
recombinante para producir un flujo de Ca^{++}. Sin embargo, este
flujo de Ca^{++} fue sólo del 20% de la respuesta máxima obtenida
con el huMIP-1\alpha o RANTES (Figura 8).
Concentraciones inferiores rindieron un flujo casi indetectable (no
se muestran los datos). Los experimentos de control utilizando
células THP-1 y 50-100 nM de
MCP-1 rindieron los intensos flujos de Ca^{++}
esperados (un incremento transitorio de 200-300 nM
de Ca^{++}, no se muestran los datos). De forma similar, se
necesitaron 250 nM de huMIP-1\beta para producir
un flujo de Ca^{++} en células 293 que transitoriamente expresaban
el C-C CKR-1, el cual fue
aproximadamente el 20% de la señal máxima obtenida con el
huMIP-1\alpha o RANTES (Figura 8). Estos
resultados apoyan la sugerencia de que las afinidades de unión del
huMIP-1\beta y MCP-1 no reflejan
sus capacidades de señalización.
Ejemplo
VIII
Puesto que la secuencia de aminoácidos del
C-C CKR-1 es aproximadamente un 35%
idéntica a una pauta de lectura abierta en el genoma del CMV humano
denominada US28, buscamos determinar si la proteína codificada por
esta pauta de lectura abierta uniría el
huMIP-1\alpha. Se amplificó la pauta de lectura
abierta US28 a partir de un lote de citomegalovirus, virus Towne
(amable donación del Dr. Philip Dormitzer), con cebadores que
flanqueaban la región codificante, usando la PCR y la polimerasa del
ADN termoestable Pfu. El producto de la PCR se subclonó en el vector
de expresión pRK5 y su identidad se confirmó mediante secuenciación.
El ADN del plásmido que contenía la US28 en la dirección con
sentido, y el opuesto, anti-sentido, se transfectó
en células 293. Las células transfectadas se usaron a continuación
para determinar la unión del huMIP-1\alpha marcado
radiactivamente. Las células 293 transfectadas con la secuencia
codificante de la US28 en la orientación con sentido unieron el
^{125}-huMIP-1\alpha, mientras
que se obtuvo una unión despreciable en las células transfectadas
con la orientación anti-sentido (Figura 10). El
huMIP-1\alpha marcado radiactivamente también se
pudo desplazar con 1 \muM de MIP-1\alpha de
ratón, huMIP-1\beta, RANTES y
MCP-1, pero no con la quimiocina
C-X-C IL-8 (Figura
10). Estos resultados indican que la proteína codificada por la US28
une específicamente quimiocinas C-C y no quimiocinas
C-X-C.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GENENTECH, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE QUIMIOCINA C-C
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 460 Point San Bruno Blvd
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: South San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- (ZIP): 94080
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 360 Kb, 5,25 pulgadas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: patin (Genentech)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Fitts, Renne A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.136
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA: 806
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415/225-1489
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415/952-9881
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 910/371-7168
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 352 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 350 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 350 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 350 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 323 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 7:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1495 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Pro Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Gly
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (35)
1. Polipéptido C-C
CKR-1 aislado que tiene
- (i)
- la capacidad de unir al menos una quimiocina C-C, y
- (ii)
- la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 1, o una secuencia que comparte al menos el 60% de identidad de secuencia a lo largo de su longitud total con la secuencia de la Figura 1.
2. Polipéptido según se reivindica en la
reivindicación 1, el cual tiene una secuencia de aminoácidos que
comparte al menos el 70% de identidad de secuencia a lo largo de su
longitud total con la secuencia de la Figura 1.
3. Polipéptido según se reivindica en la
reivindicación 2, el cual tiene la secuencia de aminoácidos
ilustrada en la Figura 1.
4. Polipéptido según se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, el cual tiene la capacidad de
unir una quimiocina C-C seleccionada de entre:
RANTES, HuMIP-1\alpha,
HuMIP-1\beta, o MCP-1.
5. Composición que comprende el polipéptido
C-C CKR-1 de la reivindicación 1, en
donde el polipéptido C-C CKR-1 se
deriva de una fuente natural, y cuya composición está libre de un
polipéptido contaminante de la especie animal que es la fuente del
polipéptido C-C CKR-1.
6. Anticuerpo que es capaz de unir el polipéptido
C-C CKR-1 de la reivindicación 1,
que no reacciona de manera cruzada con otro receptor de
quimiocina.
7. Anticuerpo según se reivindica en la
reivindicación 6, el cual es un anticuerpo monoclonal.
8. Molécula de ácido nucleico aislado que
codifica el polipéptido C-C CKR-1 de
la reivindicación 1.
9. Molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8 que es ADN y contiene más de aproximadamente 25
bases.
10. Molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8 que es ADNc.
11. Molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8 que es una secuencia genómica.
12. Molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8 que además comprende un promotor unido
operativamente a la secuencia de ácido nucleico.
13. Molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 12, en donde el promotor es heterólogo para el
polipéptido C-C CKR-1.
14. Vector de expresión que comprende la
secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 unida
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
hospedadora transformada con el vector.
15. Célula hospedadora transformada con el vector
de la reivindicación 14.
16. Procedimiento para determinar la presencia de
un ácido nucleico del C-C CKR-1, que
comprende hibridar el ácido nucleico según la reivindicación 8, o su
complementario, con un ácido nucleico de muestra de ensayo, y
determinar la presencia del ácido nucleico del C-C
CKR-1 con el cual se hibrida.
17. Procedimiento para amplificar una muestra de
ensayo de ácido nucleico, que comprende cebar una reacción de
polimerasa de ácido nucleico con un ácido nucleico según la
reivindicación 8 o su complementario.
18. Composición que comprende el polipéptido
C-C CKR-1 de la reivindicación 1 y
un portador farmacéuticamente aceptable.
19. Composición que comprende el anticuerpo de la
reivindicación 6 ó 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
20. Polipéptido aislado que comprende el
polipéptido C-C CKR-1 de la
reivindicación 1, fusionado con un polipéptido heterólogo al
polipéptido C-C CKR-1.
21. Procedimiento para identificar un receptor de
quimiocina C-C según se reivindica en la
reivindicación 1, que comprende,
- (a)
- diseñar un cebador de la PCR correspondiente a una región transmembrana de una proteína con siete segmentos transmembrana;
- (b)
- cebar una reacción de PCR con un sustrato de ADNc procedente de un tipo de célula hematopoyético que se sabe responde a la quimiocina C-C;
- (c)
- recuperar los productos de la PCR del paso (b).
22. Procedimiento de la reivindicación 21, en
donde el cebador comprende un conjunto de oligonucleótidos
degenerados que codifican la secuencia
LNLA(L/V)AD(L/F)(L/G).
23. Procedimiento de la reivindicación 21, en
donde el cebador comprende un conjunto de oligonucleótidos
degenerados que codifican la secuencia
NP(I/M)(I/L)Y(A/V)(F/V)(I/M/A)GQ.
24. Procedimiento de la reivindicación 21, en
donde el cebador comprende un conjunto de oligonucleótidos
degenerados que codifican la secuencia DRYLAIVHA.
25. Procedimiento de la reivindicación 21, en
donde el tipo de célula son monocitos humanos cultivados.
26. Procedimiento que comprende transformar una
célula hospedadora con ADN que codifica el polipéptido del
C-C CKR-1 de la reivindicación 1, cultivar la célula hospedadora para expresar el receptor sobre su superficie, recolectar las células, poner en contacto las células con una variante de quimiocina C-C, y determinar la actividad biológica de la variante sobre el receptor.
C-C CKR-1 de la reivindicación 1, cultivar la célula hospedadora para expresar el receptor sobre su superficie, recolectar las células, poner en contacto las células con una variante de quimiocina C-C, y determinar la actividad biológica de la variante sobre el receptor.
27. Ensayo para un analito del polipéptido
C-C CKR-1 de la reivindicación 1,
ensayo que comprende ensayar para determinar la unión del analito a
una pareja de unión, en donde dicha pareja de unión es dicho
polipéptido C-C
CKR-1.
CKR-1.
28. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 27, que es un ensayo competitivo, un ensayo en
sándwich, o un ensayo de inhibición estérica.
29. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 27 o reivindicación 28, que usa uno o más de los
siguientes reactivos: análogo del analito marcado, análogo del
analito inmovilizado, pareja de unión marcada, pareja de unión
inmovilizada.
30. Ensayo, tal como se ha reivindicado en la
reivindicación 29, en donde la pareja de unión se separa de
cualquier analito que permanezca libre en solución.
31. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 30, que usa un análogo del analito, en donde bien la
pareja de unión o el análogo del analito se insolubiliza antes del
procedimiento de ensayo.
32. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 31, que usa un análogo del analito, en donde bien la
pareja de unión o el análogo del analito se insolubiliza después del
procedimiento de ensayo.
33. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 28, que es un ensayo competitivo homogéneo.
34. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 28, que es un ensayo en sándwich simultáneo.
35. Ensayo, según se reivindica en la
reivindicación 28, que es un ensayo en sándwich secuencial.
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---|---|---|---|
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