ES2210496T3

ES2210496T3 - Anticuerpos que se unen al receptor (ccr2) de la proteina quimiotactica de monocitos 1 (mcp-1).

Info

Publication number: ES2210496T3
Application number: ES97906403T
Authority: ES
Inventors: Peter Lind; Carlos Martinez Alonso; Jose Mario Mellado Garcia; Jose Miguel Rodriguez Frade
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2017-02-27
Also published as: DE69727382D1; DE69727382T2; PT914345E; EP0914345B1; JP2000510685A; WO1997031949A1; AU2110497A; AU724037B2; DK0914345T3; ATE258560T1; SE9600820D0; US6084075A; EP0914345A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS QUE SON CAPACES DE FIJAR EL RECEPTOR CCR2 DE LA PROTEINA QUIMIOATRACTIVA DE MONOCITOS 1 (MCP - 1), ESPECIALMENTE LOS QUE SON CAPACES DE ACTUAR COMO ANTAGONISTAS O COMO AGONISTAS. LOS ANTICUERPOS REIVINDICADOS PUEDEN UTILIZARSE PARA DIAGNOSTICO IN VITRO Y/O IN VIVO, PARA LA SELECCION Y DETECCION DE TEJIDOS Y CLASES DE CELULAS QUE EXPRESAN EL RECEPTOR MCP - 1, PARA LA SELECCION DE NUEVOS FARMACOS Y PARA USO TERAPEUTICO. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A UNA PREPARACION QUE COMPRENDE EL ANTICUERPO REIVINDICADO Y A UN MICROORGANISMO O LINEA CELULAR CAPAZ DE PRODUCIR EL ANTICUERPO REIVINDICADO.

Description

Anticuerpos que se unen al receptor (CCR2) de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1).

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a anticuerpos que pueden unirse al receptor CCR2 de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1).

De manera más específica, la invención se refiere a agonistas y antagonistas, que actúan sobre los receptores, para el receptor CCR2 de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), que incluyen anticuerpos, especialmente, anticuerpos monoclonales, que interaccionan con las regiones extracelulares de los receptores de MCP-1, que compiten con MCP-1 y otros ligandos naturales para la unión al receptor.

Antecedentes de la invención

Las quimiocinas constituyen un grupo diverso de pequeñas proteínas de secreción básicas que regulan la migración quimiotáctica y la activación de varios leucocitos diferentes, en particular, en el contexto de la activación de la respuesta inmunológica durante situaciones inflamatorias.

Ejemplos de células que han demostrado que responden quimiotácticamente y se activan mediante las quimiocinas son los neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos, así como linfocitos B y diferentes tipos de linfocitos T (Oppenheim, J.J. y col. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9, 617-48; Miller, M.D & Krangel, K. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12 (1,2) 17-46; Baggiolini, M. Y col. (1994) Adv. Immunol. 55, 97-179).

Las quimiocinas pueden clasificarse en dos grupos principales basándose en el patrón de residuos de cisteinil que participan en la formación de puentes disulfuro en las proteínas maduras. El primer grupo, las quimiocinas CXC, o las quimiocinas a, se caracterizan por la presencia de dos residuos cisteinil en la región amino-terminal, entre los que se sitúa un residuo aminoacídico diferente.

El segundo grupo, las quimiocinas CC, o las quimiocinas b, se caracterizan por la presencia de dos residuos cisteinil adyacentes en la región amino terminal.

Un tercer grupo menor de quimiocinas, representado por la linfotactina que se ha aislado de ratón y de humanos (Kelner, G.S. y col. (1994) Science 266, 1395-9; Kennedy, J. y col. (1995) J. Immunol. 155, 203-9), se caracteriza por la presencia de sólo dos residuos de cisteína, presumiblemente formando un único puente disulfuro en la proteína madura. Hasta el momento, estas son las únicas representantes del grupo denominado quimiocinas de tipo c.

Las quimiocinas CXC actúan principalmente sobre los neutrófilos, en particular aquellas quimiocinas CXC que llevan la secuencia de aminoácidos Glu-Leu-Arg en su amino terminal. Ejemplos de quimiocinas CXC que actúan sobre neutrófilos son la interleucina-8 (IL-8), GRO-\alpha, -\beta y \gamma, NAP-2, ENA-78 y GCP-2.

Las quimiocinas CC actúan sobre una gran variedad de leucocitos tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, así como linfocitos B y T. Ejemplos de éstas son MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, eotaxina, RANTES, I-309. La última lleva dos residuos cisteinil adicionales probablemente formando un tercer puente disulfuro en la proteína madura.

MCP-1, o la proteína quimiotáctica de monocitos 1, se purificó originalmente de linfocitos humanos estimulados con fitohemaglutinina (Yoshimura, T. y col. (1989) J. Immunol. 142, 1956-62), de una línea humana de glioma (Yoshimura, T. y col. (1989) J. Exp. Med. 169, 1449-59) y de la línea celular mielomonocítica humana THP-1 (Matsushima, K. y col. (1989) J. Exp. Med. 169, 1485-90). MCP-1 se ha denominado también MCAF, LDCF, GDCF, HC11, TSG-8, SCYA2 y A2. El clonaje molecular del ADNc que codifica para MCP-1 (Furutani, Y. y col. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 169, 249-55; Rollins, B.J. y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4687-95; Chang, H.C. y col. (1989) Int. Immunol. 1, 388-97) reveló un marco abierto de lectura de 99 aminoácidos, que incluyen un péptido señal de 23 aminoácidos.

MCP-1 es producida por los monocitos y una variedad de células de tejidos tales como células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, queratinocitos, células sinoviales, queratinocitos, células mesangiales, osteoblastos, células de músculo liso, así como por una multitud de células tumorales (Baggiolini, M. y col. (1994) Adv. Immunol. 55, 97-179, y en referencias de la presente memoria).

Su expresión se estimula con varios tipos de agentes pro-inflamatorios, tales como IL-1\beta, TNF-\alpha, IFN-\gamma, lipopolisacárido y GM-CSF. Se sugiere que MCP-1 puede desempeñar un importante papel en la patogénesis de la aterosclerosis. Los macrófagos que están cargados con lípidos, denominados células espumosas, comprenden la mayoría de las células en las lesiones ateroscleróticas y se sugiere que el reclutamiento activo de monocitos a través del MCP-1 de estas células y de las células activadas del endotelio tiene un papel central en la formación de las estrías grasas y las placas ateroscleróticas (Ylä-Herttuala, S. y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (12), 5252-6; Schwartz, C.J. y col.(1993) Am. J. Cardiol. 71(6), 9B-14B; Takeya, M. (1993) Hum. Pathol. 24 (5), 534-9).

En el líquido sinovial y en el plasma de pacientes con artritis reumatoide, la concentración de MCP-1 ha demostrado estar aumentada al compararse con la de otras enfermedades artríticas y la fuente principal de ésta son los macrófagos que expresan constitutivamente MCP-1. En el sinovio reumatoide, MCP-1 junto con otras citocinas inflamatorias tales como IL-1\beta, IL-6, IL-8 y TNF-\alpha, contribuyen a la inmunopatogénesis de la artritis reumatoide (Koch, A.E. (1992) J. Clin. Invest. 90, 772-79; Hosaka, S. y col. (1994) Clin. Exp. Immunol. 97, 451-7; Akahoshi, T. y col. (1993) Arthritis Rheum. 36, 762-71; Harigai, M. y col. (1993) Clin. Immunol. Immunopathol. 69, 83-91).

El daño pulmonar dependiente de fagocitos mononucleares mediado por complejos inmunes de IgA se caracteriza por la acumulación de células mononucleares y fagocíticas y ha demostrado ser enormemente dependiente de la expresión de MCP-1 (Jones, M.L. y col. (1992) J. Immunol. 149, 2147-54). De manera similar, MCP-1 parece desempeñar un importante papel en la patogénesis de la fibrosis pulmonar idiopática y de la sarcoidosis (Iyonaga, K. y col. (1994) Hum. Pathol. 25, 455-63; Car, B.D. y col. (1994) Am. J. Respir. Crit. Car. Med. 149, 655-9).

En modelos animales, se ha demostrado que MCP-1 se expresa en el cerebro tras la isquemia local (Kim, J.S. (1995) J. Neuroimmunol. 56, 127-34; Wang, X. y col. (1995) Stroke 26,661-5) y durante la encefalomielitis autoinmune experimental (Holkower, K. y col. (1993) J. Immunol. 150, 2525-33; Ransohoff, R.M. y col. (1993) 7, 592-600). MCP-1 puede ser una citocina importante que tiene como diana las células mononucleares en las enfermedades ilustradas por estos modelos animales, tales como el derrame cerebral y la esclerosis múltiple.

En las lesiones psoriásicas, MCP-1 parece regular la interacción entre los queratinocitos proliferantes y los macrófagos dérmicos, y puede localizarse por encima de la unión dérmica/epidérmica. Además de la IL-8, que es importante para la infiltración de neutrófilos en estos tipos de lesiones, MCP-1 puede servir para reclutar células mononucleares (Schroeder, J.M. (1992) Arch. Dermatol. Res. 284 Suppl 1, S22-6; Gillitzer, R. y col. (1993) J. Invest. Dermatol. 101, 127-31).

MCP-1 parece estar implicado en el control de la infiltración celular en muchos tumores sólidos. Se ha demostrado una correlación entre la producción de tumores asociada a MCP-1 y el número y la actividad proliferativa de los macrófagos asociados al tumor (Walter, S. y col. (1991) Pathobiology 59(4), 239-42; Mantovani, A. y col. (1994) Adv. Exp. Med. Biol. 351, 47-54). Usando células de sarcoma trasplantadas en ratones, se ha demostrado que las células que expresan gran cantidad de MCP-1 crecen más lentamente, y que esto está relacionado con el número de macrófagos asociados al tumor (Walter, S. y col. (1991) Int. J. Cancer, 49, 431-5). De manera similar, células de carcinoma de colon murino manipuladas genéticamente para expresar MCP-1 exhibieron un potencial metastático reducido (Huang, S. y col. (1994) Cancer Immunol. Immunother. 39, 231-8).

MCP-1 es un potente agente quimiotáctico y factor de activación para los monocitos, que induce quimiotaxis, flujo de calcio y el estallido respiratorio, mostrando actividad en el intervalo picomolar (Yoshimura, T. & Leonard, E.J. (1990) J. Immunol. 154, 292-97; Zachariae, C.O.C. y col. (1990) J. Exp. Med. 171, 2177-82; Rollins, B. y col. (1991) Blood 78, 1112-6; Vaddi, K. & Newton, R.C. (1994) J. Leukoc. Biol. 55, 756-62). MCP-1, además, regula a la alta CD11b/CD18 y CD11c/CD18 de forma transitoria, que es lo que probablemente facilita la migración transendotelial durante la inflamación (Jiang,Y. y col. (1992) J. Immunol. 148, 2423-8; Vaddi, K. & Newton, R.C. (1994) J. Immunol. 153, 4721-32).

Recientemente, se ha hecho evidente que además de sobre los monocitos, MCP-1 actúa sobre los linfocitos T CD4+ y CD8+ como un agente quimiotáctico in vitro e in vivo (Loetscher, P. y col. (1994) FASEB J. 8, 1055-60; Carr, M.W. y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3652-6; Taub, D.D. y col. (1995) 95, 1370-6). Las células asesinas naturales que se estimulan con interleucina-2 también están sometidas a la quimiotaxis por MCP-1 (Maghazachi, A.A. y col. (1994) J. Immunol. 153, 4969-77; Allaven, P. y col.(1994) Eur. J. Immunol. 24, 3233-6. Esto subraya la importancia de esta quimiocina en el reclutamiento de las células efectoras en las lesiones inflamatorias.

Además de los efectos sobre los monocitos y los linfocitos T, MCP-1 es un agente quimiotáctico moderado y un potente activador de la liberación de mediadores de la alergia, tales como histamina y leucotrienos, de los basófilos (Kuna, P. y col. (1992) J. Exp. Med. 175, 489-93; Bischoff, S.C. y col. (1992) J. Exp. Med. 175, 1271-7; Bischoff, S.C. y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 761-7). En contraste con los basófilos, otros granulocitos implicados en las lesiones alérgicas inflamatorias, los eosinófilos, no responden a MCP-1 (Rot, A. y col. (1992) J. Exp. Med. 176, 1489-95).

Existe un receptor de MCP-1, que parece que se expresa de dos formas ligeramente diferentes debido al ayuste alternativo del ARNm que codifica para la región carboxi-terminal, MCP-1-RA y MCP-1RB (Charo, I.F. y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752-56).

Estos receptores (CCR2) se expresan en monocitos, precursores de células mieloides y linfocitos T activados (Myers, S.J. y col. 1995. J. Biol. Chem., 270, 5786-5792, Qin, S. y col. 1996. Eur. J. Immunol. 26, 640-647). Éstos proporcionan una forma efectiva que define las bases moleculares de las interacciones quimiocina-receptor y la comprensión del papel de MCP-1 en la regulación de la infiltración monocito/macrófago en una variedad de enfermedades.

El receptor MCP-1 pertenece a las proteínas del tipo de siete dominios transmembrana y es homólogo a los receptores de MIP-1\alpha/RANTES(CC-CKR1); Neote, K. y col. (1993) Cell 72, 415-25) e interleucina-8/GRO (Holmes, W.E. y col. (1991) Science 253, 1278-80; Murphy, P.M. & Tiffany, H.L. (1991) Science 253, 1280-3). La constante de disociación de MCP-1 para el receptor transfectado en las células HEK-293 es 0,26 nM que coincide con los valores medidos en monocitos (Myers, S.J. y col. (1995) J. Biol. Chem. 270, 5786-92; Van Riper, G. y col. (1993) J. Exp. Med. 177, 851-6).

La activación del receptor MCP-1RB en células transfectadas HEK-293 por MCP-1 inhibe la adenilato ciclasa a una concentración de 90 pM y moviliza el calcio intracelular a concentraciones ligeramente más altas, aparentemente independiente de la hidrólisis de fosfatidil inositol. Los efectos sobre la adenilato ciclasa y la liberación de calcio intracelular se inhiben fuertemente con la toxina pertussis, que implica la participación de proteínas G heterotriméricas de tipo Gi en la transducción de la señal (Meyers, S.J. y col. (1995) J. Biol. Chem. 720, 5786-92).

La reciente descripción de los receptores de quimiocinas como correceptores del VIH-1 y de las quimiocinas como agentes neutralizantes de la infección por VIH, asigna a estas moléculas un papel clave en la patogénesis del VIH-1 (Doranz, B.J. y col. 1996, Cell 85, 1149-1158; Feng, Y y col. 1996. Science 272, 872-877; Deng, H. y col. 1996, Nature 381, 661-666; Cocchi F. Y col. 1995, Science 270, 1811-1815; Choe, H. y col. 1996, Cell 85, 1135-1148; Alkhatib, G y col. 1996. Science 272, 1955-1958). Las herramientas específicas son esenciales para desentrañar la forma en la que las quimiocinas y el VIH-1 interaccionan con los receptores de quimiocinas, para determinar qué receptores son importantes en dirigir las diferentes cepas de VIH-1 hacia diferentes poblaciones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y en qué etapa (unión, desensibilización, transducción de señal) tiene lugar esta interacción.

El documento WO94/11504, una solicitud de patente presentada a nombre de Horuk, Neote y Schall, describe el aislamiento de ADN que codifica para el receptor humano de quimiocina CC, C-C CKR-1 y los procedimientos para obtener dicho ADN, junto con los sistemas de expresión para la producción recombinante de C-C CKR-1 son útiles en las composiciones terapéuticas o de diagnóstico. Adicionalmente, se describe un procedimiento para identificar nuevos receptores de quimiocinas.

El documento WO95/19436, una solicitud de patente presentada a nombre de los regentes de la Universidad de California, describe una secuencia de ADN aislado que codifica la expresión del receptor MCP-1. Además, se menciona que podría identificarse un antagonista del receptor de MCP-1 mediante la expresión del dominio N-terminal del receptor de MCP-1 y la detección de una pérdida de unión al dominio del receptor de MCP-1. Se reivindica una composición farmacéutica que comprende los antagonistas del receptor de MCP-1 identificados mediante el procedimiento descrito.

No se realiza dicha identificación ni se aíslan antagonistas.

Hemos generado un AcMo específico para el receptor de quimiocinas CCR2 mediante la inmunización de ratones con péptidos sintéticos que corresponden a varios dominios extracelulares del receptor. Describimos la generación de AcMo capaces de reconocer específicamente al receptor CCR2 nativo. El análisis de la expresión de CCR2 en PBMC y células de amígala, ambas humanas, muestra su expresión en células B, que se añade además a su expresión conocida en monocitos y células T activadas. Esto sugeriría un papel para MCP-1 en las células B. Estos AcMo se caracterizan por su capacidad para bloquear y/o mimetizar la actividad de MCP-1, basándose en la inducción de quimiotaxis y Ca^{2+} en monocitos humanos y líneas celulares monocíticas. Usando estos AcMo, definimos regiones de CCR2 críticas para la unión al ligando y para producir una respuesta a través de este receptor; demostramos una disociación entre estas dos actividades que puede ayudar a desentrañar los complejos mecanismos implicados en la señalización de las quimiocinas así como las relaciones específicas de estos tipos de receptores. Basándose en la capacidad de estos AcMo para activar a los receptores de quimiocinas o para bloquear las respuestas a quimiocinas, hemos esbozado un modelo que tiene en cuenta nuestros conocimientos actuales acerca de las respuestas a quimiocinas.

En contraste con los anticuerpos neutralizantes del receptor de IL-8, que se dirigen a la región NH_{2} terminal (37), nuestros AcMo con actividad antagonista (MCP R-04 y MCP R-05) mapean en el tercer bucle de la región extracelular del receptor CCR2. Otro AcMo con especificidad frente a péptidos similares (MCP R-03), aunque se une al receptor, no bloquea la actividad de MCP-1. La actividad neutralizante de estos anticuerpos se limita, por lo tanto, al reconocimiento de unos pocos residuos clave dentro de esta región, que desempeñan un papel crítico en la unión a la quimiocina o en la modulación de la actividad de la quimiocina.

Estudios iniciales concluyeron la importancia del dominio NH_{2} terminal del receptor de quimiocinas para el IL-8R, un miembro de la familia de receptores de quimiocinas CXC. Varias explicaciones pueden considerar esta diferencia. Primera, las características estructurales que controlan la interacción de la quimiocina CC con su receptor pueden ser distintas de las de las quimiocinas CXC, y la presente implicación del tercer dominio extracelular podría reflejar esta diferencia; los anticuerpos neutralizantes para otros receptores CC deben probarse antes para que se pueda llegar a conclusiones formales. La segunda es el hecho sorprendente de que el AcMo específico del amino terminal, por ejemplo, MCP R-02, pueda mimetizar la respuesta a la quimiocina. Esto nos permite considerar esta región crítica en la activación agonística del receptor CCR2.

Por lo tanto, concluimos que los receptores de quimiocinas se organizan en dos dominios funcionales distintos, que corresponden a las regiones NH_{2} terminal y al tercer bucle extracelular. Todos los receptores de quimiocinas conocidos tienen un alto grado de identidad de la secuencia y muchas quimiocinas pueden interaccionar con más de un receptor de quimiocinas. Por lo que es probable que las interacciones receptor-ligando impliquen regiones similares en los distintos receptores, pero efectuando modificaciones diferentes en el dominio NH_{2} terminal implicado en la transducción de señal. Nuestros hallazgos podrían así extrapolarse a toda la familia de receptores de quimiocinas y contribuir a una explicación de la degeneración en la señalización de quimiocina-receptor de quimiocina.

En la parte experimental describimos la generación de AcMo que son capaces de reconocer al receptor MCP-1 nativo y su caracterización, que incluye su capacidad para bloquear y/o mimetizar a MCP-1 y la inducción de Ca^{2+} en monocitos humanos y líneas celulares monocíticas, y la quimiotaxis.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que es capaz de unirse al receptor CCR2 de la proteína quimiotáctica de monocitos (MCP-1) como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los anticuerpos según las reivindicaciones reconocen la región extracelular amino terminal del receptor o reconocen secuencias presentes en el tercer bucle extracelular del receptor y actúan como agonistas o antagonistas, respectivamente.

El anticuerpo reivindicado puede usarse para diagnóstico in vitro y/o in vivo y para uso terapéutico.

Otro aspecto de la invención es el uso para la discriminación y detección de tejidos y clases de células que expresan el receptor de MCP-1 y para el análisis de nuevos fármacos, por ejemplo, nuevos fármacos anti-inflamatorios.

Por ejemplo, los anticuerpos marcados radiactivamente capaces de unirse al receptor de MCP-1 pueden usarse para visualizar áreas de procesos inflamatorios activos en todo el cuerpo in vivo, donde hay una acumulación de especies celulares que llevan receptores de MCP-1 en sus superficies. Además, puede analizarse in vitro la presencia de especies celulares que expresan el receptor de MCP-1 en las poblaciones celulares heterogéneas usando un microscopía de inmunofluorescencia o citometría de flujo.

Otro uso para los anticuerpos que se unen a regiones específicas del receptor, como se ejemplifica en la parte experimental, es el análisis in vitro de sustancias de bajo peso molecular capaces de interaccionar con el receptor de tal forma que desplacen a estos anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen al dominio extracelular amino terminal del receptor pueden marcarse radiactivamente, con fluorescencia, enzimáticamente o con un marcador de afinidad, de tal forma que estos anticuerpos pueden interaccionar con preparaciones del receptor de MCP-1 purificado bioquímicamente inmovilizado en pocillos de placas de plástico. El desplazamiento de estos anticuerpos por los compuestos de bajo peso molecular podría medirse mediante la detección del anticuerpo residual unido o mediante la liberación del anticuerpo. De manera similar, los anticuerpos que interaccionan con otras regiones extracelulares del receptor de MCP-1 podrían usarse para analizar otros compuestos que afectan a la unión de estos anticuerpos. Puede esperarse que los compuestos de bajo peso molecular que desplazan estos anticuerpos lo hagan uniéndose a las regiones extracelulares del receptor de MCP-1, y así poseen propiedades agonistas o antagonistas. Puede esperarse que los compuestos antagonistas de bajo peso molecular posean propiedades anti-inflamatorias potenciales cuando se administran in vivo, y sean útiles como nuevos fármacos en el tratamiento de situaciones inflamatorias.

La invención se refiere además a una preparación de anticuerpo que comprende el anticuerpo reivindicado y una preparación de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un vehículo.

La preparación comprende el anticuerpo en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo se selecciona dependiendo de la ruta de administración y se conoce por los expertos en la técnica.

Esta preparación, posible junto con un vehículo, puede tener un uso terapéutico potencial, especialmente cuando se tratan enfermedades tales como la inflamación, la artritis reumatoide, el daño pulmonar dependiente de fagocitos mononucleares, la fibrosis pulmonar idiopática, la sarcoidosis, la isquemia focal, la encefalomielitis autoinmune, el derrame cerebral, la esclerosis múltiple, las lesiones psoriásicas, tumores y rechazo crónico de trasplante mediante la administración del anticuerpo reivindicado al paciente que lo necesita.

Como el receptor de MCP-1 está presente en las células T CD4+ y CD8+ el anticuerpo reivindicado puede ser activo en una destrucción específica de células mediada por linfocitos, tales como células tumorales o células infectadas por virus que causan, por ejemplo, SIDA.

El anticuerpo que es un agonista para el receptor de MCP-1 podría usarse además en un anticuerpo biespecífico en el que una parte se dirige contra una célula o una célula infectada por VIH y la otra parte es el agonista. La bibliografía correspondiente a anticuerpos biespecíficos se da, por ejemplo, en AL Howell y col. J. Leuckoc. Biol. 1994, Mar 55(3); 385-91 y Haagen I.A. y col. Cancer Immunol. Immunother. 1994, Dec 39(6); 391-6.

Son también parte de la invención un microorganismo o una línea celular capaces de producir el anticuerpo reivindicado.

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Son parte de la invención anticuerpos quiméricos u otros anticuerpos recombinantes capaces de unirse al receptor de MCP-1, así como derivados de proteínas de fusión, derivados de conjugación o derivados fragmentados de estos anticuerpos.

Los anticuerpos especiales MCPR-01, MCPR-03 y MCPR-06 como se describen más adelante son útiles para la caracterización del receptor y MCPR-02 es un agonista del receptor y, MCPR-04 y MCPR-05 son antagonistas del receptor.

El AcMo MCPR-02 podría usarse para neutralizar la infección y el AcMo MCPR-04 y MCPR-05 podrían usarse para bloquear la neutralización del VIH-1 inducida por MCP-1.

Además, hemos usado estos AcMo para identificar el receptor CCR2 en varias poblaciones leucocitarias y para identificar la polarización de este receptor en los linfocitos. Estos AcMo podrían usarse además para identificar cambios conformacionales en los receptores de CCR2 después de la activación.

Mediante el uso de estas secuencias que hemos identificado en los dos dominios funcionales distintos los anticuerpos pueden prepararse por una persona experta en la técnica.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras de 1a a 1f muestran la unión de anticuerpos monoclonales seleccionados a células Mono-Mac-1 usando citometría de flujo. Cada figura muestra la unión de uno de los anticuerpos monoclonales de MCPR-01 a MCPR-06, respectivamente.

La Figura 2 ilustra la liberación de calcio inducida por MCP-1 en células Mono-Mac-1 y los efectos de la preincubación con un anticuerpo monoclonal irrelevante (AcMo-), con el anticuerpo monoclonal MCPR-04, con el anticuerpo monoclonal MCPR-05 y con el anticuerpo monoclonal MCPR-06.

Las Figuras 3a a 3f muestran la movilización de Ca^{2+}. Las células Mono-Mac-1, cargadas con Fluo-3 se estimularon secuencialmente con 100 nM de un anticuerpo monoclonal irrelevante (3a) o con MCPR-04 (3b) seguido por MCP-1 5 nM. En otros casos las células se incubaron durante 30 min a 4ºC con la misma concentración de un anticuerpo monoclonal irrelevante (3c) o con MCPR-05 (3d) previamente a la estimulación con MCP-1.

Las células cargadas se incubaron con un AcMo irrelevante (3e) o con MCPR-01 (3f), seguidas de MCP-1 nM.

Las Figuras 4a y 4b. Quimiotaxis. Las células Mono-Mac-1 se preincubaron con varias concentraciones de MCPR-05 y se situaron en la parte superior de la cámara de los cultivos polarizados cubiertos de células endoteliales y se añadió MCP-1 (1nM) al pocillo inferior (4a). Las células migraron al pocillo inferior donde se contaron y el resultado se expresó como Índice de Migración (I.M.), que se calculó como el incremento x-veces en la migración observada en el control negativo (Medio).4b muestra el efecto de la dilución del AcMo MCPR-02 en la migración de células Mono-Mac-1 bajo las mismas condiciones.

Figuras 5a y 5b. Expresión del receptor CCR2 en leucocitos humanos. La expresión del receptor de quimiocinas CCR2 en PBL en reposo (-) o activadas (+) o en células derivadas de amígdala (5a), usando doble tinción con MCPR-05 y anticuerpos anti-T (CD4) o anti-B (CD-19, CD-20), como se indica. El porcentaje de células que expresan el receptor CCR2, como se define por la unión de MCPR-05 en la citometría de flujo en varias poblaciones linfocitarias definidas con los marcadores CD indicados.

Figuras 6a a 6c. Efecto de la preincubación con el AcMo antagonista MCPR-05 en el flujo de Ca^{2+} inducido por MCP-3 (A, B) y transmigración (C) de las células.

Las Tablas I a III ilustran la invención.

Descripción detallada de la invención Definiciones

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 BSA \+ Albúmina de suero bovino\cr  CD11b y c \+ Antígenos de
superficie\cr  DMF \+ Dimetil formamida\cr  DMSO \+ Dimetil
sulfóxido\cr  ECL \+ Quimioluminiscencia enzimática\cr  ED1 \+ Un
anticuerpo monoclonal que reconoce los  monocitos de rata de
Serotec.\cr  ED2 \+ Un anticuerpo monoclonal que reconoce los 
macrófagos de rata de Serotec.\cr  EIA \+ Ensayo inmunoenzimático\cr
 FACS \+ Citometría de flujo\cr  FCS \+ Suero de ternera fetal\cr 
FITC \+ Isotiocianato de fluoresceína\cr  GM-CSF \+
Factor estimulante de colonias de  granulocitos y monocitos\cr  VIH
\+ Virus de la inmunodeficiencia humana\cr 
IFN- \gamma  \+
Interferón- \gamma \cr  IL-1 \beta 
\+ Interleucina\cr  KLH \+ Hemocianina de la lapa californiana,
Pierce\cr  MCP-1RB \+ Receptor tipo B de la proteína
quimiotáctica  de monocitos-1.\cr  MIP \+ Proteína
inflamatoria de macrófagos\cr 
Mono-Mac-1 \+ Células que expresan
el receptor de MCP-1, obtenidas de la Colección
Alemana de\cr  \+ Microorganismos y Cultivos Celulares (DSM
ACC252)\cr  PBL \+ Leucocitos de sangre periférica, aislados de 
células de sangre completa obtenidos de pacientes\cr  \+  sanos y
purificados mediante  centrifugación en Ficoll-Paque
(5,7 mg/ml)\cr  PBS \+ Tampón fosfato salino\cr  RPMI \+ Medio
estándar\cr  THP-1 \+ Células que expresan el
receptor de MCP-1, ATCC TIB202\cr 
TNF- \alpha  \+ Factor de necrosis tumoral
- \alpha \cr}

Ejemplo 1 Síntesis peptídica

Se sintetizaron dos péptidos FDYDYGAPCHKFDVK y GLSNCESTSQLDQATQVTET que cubren las secuencias 24-38 y 273-292, respectivamente, del receptor tipo B (MCP-1RB) de la proteína quimiotáctica de monocitos-1 en un sintetizador de péptidos múltiple automatizado (AMS 422, Abimed) usando el procedimiento de fase sólida y química F-moc estándar en una base de 25 \mumol. La síntesis se llevó a cabo sobre un aminoácido protegido N-\alpha-Fmoc, unido a una resina de alcohol p-benziloxibenzil (resina 4-(Hidroximetil)fenoximetil-copoli(estireno-1% divinilbenceno)(resina Wang, Novabiochem), con aminoácidos protegidos Fmoc activados in situ con PyBOP (benzotriazola-1-il-oxi-tris-pirridolino-fosfonio hexafluorfosfato) en presencia de N-metil morfolina (NMM) y 20% de piperidina/DMF para eliminar la protección. Los grupos de la cadena lateral protegida fueron los que siguen: Asn, Cys, Gln e His Trt); Glu y Asp (OtBu); Lys (Boc); Ser, Thr y Tyr (tBu). Los péptidos se separaron de la resina con ácido trifluoroacético 82,5% (TFA) y fenol 5%, H_{2}O 5%, tioanisol 5%, EDT 3,5% como eliminadores de radicales, se precipitaron y se lavaron con metil ter-butil éter, se extrajeron con agua, se liofilizaron y se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución en una columna semipreparativa Nucleosil C-18 (Tracer). La pureza y la composición de los péptidos se confirmaron por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa en una columna analítica Nucleosil 120 C-18 (Tracer) con un gradiente de acetonitrilo 5-70% que contenía TFA 1% y mediante el análisis de aminoácidos usando un analizador de aminoácidos Beckman 6300, tras la hidrólisis ácida en una atmósfera de N_{2} durante 18h a 110ºC.

Ejemplo 2 Preparación del antígeno e inmunizaciones 2.1 Acoplamiento de los péptidos a KLH

Los péptidos MCP-1RB (24-38) y (273-292) se acoplaron a la hemocianina de lapa californiana (KLH, Pierce) a través de la Cys 32 y la Cys 277 respectivamente usando sulfo-succinimidil 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) como agente enlazante.

KLH se activó en tampón fosfato salino pH 7,2 usando un cociente molar de Sulfo-SMCC de 6000:1 durante 60 minutos a 30ºC. La KLH activada se filtró en gel a través de Sephadex G-25 y se mezcló con los péptidos en fosfato de sódico 0,1 M pH 8,0 usando un cociente molar del péptido y KLH de 3000:1 durante 18 h a temperatura ambiente. El cociente molar final del péptido y la proteína vehículo se estimó por la composición de aminoácidos del complejo en relación con la composición de aminoácidos de la proteína vehículo sola.

2.2 Inmunización

Se inmunizaron ratones Balb/c, de dos a tres meses de edad, con los péptidos acoplados a KLH descritos anteriormente. Cada ratón recibió inicialmente una inyección subcutánea de 40 \mug de péptido en 0,15 ml de tampón fosfato salino (PBS) emulsionados en 0,15 ml del adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, USA), (Día 0). Se estimuló a los ratones subcutáneamente los días 30 y 60 con la misma cantidad de péptido, emulsionado en el adyuvante incompleto de Freund. Antes de la fusión, se estimuló a los ratones vía intravenosa los días -3 y -2 con 30 \mug de péptido en 0,15 ml de solución salina estéril.

El suero de los ratones inmunizados con KLH-MCP1RB(24-38) o con KLH-MCP1RB(2273-292) se recogió a los 7-10 días posteriores a cada estimulación y se determinó la presencia de anticuerpos específicos mediante ensayo inmunoenzimático (EIA), transferencia Western o citometría de flujo (FACS). Todos los ratones respondieron al inmunógeno correspondiente (péptido sintético sin acoplar) en el EIA, con títulos (dilución de antisuero que daba la mitad de la unión máxima) de 1/2500-1/20000.

Ejemplo 3 Preparación de los anticuerpos monoclonales

En todos los experimentos de fusión se usó la línea celular de mieloma no secretora P3X63Ag8.653 (CRL 1580, ATCC). Los ratones inmunizados se seleccionaron basándose en la producción de anticuerpo, se sacrificaron y el bazo se extirpó asépticamente y se aplastó hasta que se liberó a la mayoría de las células. Las células se transfirieron a RPMI 1640 (Biowhittaker) que contenía 10% de suero de ternera fetal (FCS), piruvato 1mM y glutamina 2nM (medio completo). Previo a la fusión, los eritrocitos del bazo se lisaron usando NH_{4}Cl (0,85% en H_{2}O) y se eliminaron mediante centrifugación. Las células de mieloma se mezclaron con los esplenocitos en un cociente 1:5 y las células se lavaron dos veces mediante centrifugación en medio sin suero precalentado. Después del último lavado, se añadió 1 ml de Polietilenglicol 4000 (PEG, Merck, 50% p/v en RPMI 1640) precalentado al sedimento de células durante 1 min con agitación suave. El PEG se diluyó mediante la adición lenta de 20 ml de medio sin suero (1 ml/min). Entonces las células se centrifugaron (1000 rpm, 10 min a temperatura ambiente), se resuspendieron en medio completo, se contaron y se transfirieron a botellas de cultivo a una concentración de 10^{6} cel/ml. Las células se dejaron toda la noche a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO_{2}.

Las células fusionadas se centrifugaron y se resuspendieron en medio completo que contenía azaserina e hipoxantina (10^{-5} y 10^{-4} M, respectivamente, Sigma Chemical Co.) y se cultivaron a una densidad de 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos sobre timocitos como capa nutricia. En la mayoría de los casos sólo se cultivó parte de la fusión y el resto de la fusión se congeló. Después de 12-14 días se analizó la presencia de anticuerpos específicos en los sobrenadantes de los pocillos con los híbridos en crecimiento (véase a continuación en el Ejemplo 4).

Los pocillos que contenían los híbridos positivos se transfirieron a placas de 24 pocillos en medio completo que contenía hipoxantina. Aquellos híbridos que produjeron anticuerpos que se consideraron de interés, se estabilizaron mediante clonaje por dilución límite, hasta que se consiguió una producción de anticuerpo estable.

Los sobrenadantes de los híbridos que crecían en medio libre de suero y del fluido ascítico de ratones inyectados con pristano, se usaron como fuente de anticuerpos.

Ejemplo 4 Análisis y caracterización de los anticuerpos monoclonales 4.1 Ensayo inmunoenzimático (EIA) de captura del anticuerpo

Los péptidos sintéticos MCP1RB (24-38) y (273-292) (3 \mug/ml en PBS, 100 ml/pocillo) se adsorbieron en placas de microvaloración (Maxi-sorb, Nunc) durante toda la noche a 4ºC. Los sitios de unión de la proteína se bloquearon con BSA 0,5% en PBS (200 \mul/pocillo, 60 min a 37ºC). Tras lavar las placas con agua destilada, los anticuerpos monoclonales se incubaron durante 60 min a 37ºC, seguido de un anticuerpo de cabra contra inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (GAM-PO, Tago Inc.) y OPD (Sigma Chemical Co.). La reacción se paró con ácido sulfúrico 3N y la densidad óptica se determinó a 492 nm.

4.2 Determinación del isotipo

El isotipo de cada anticuerpo se determinó mediante EIA, usando anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulinas de ratón purificados adsorbidos en fase sólida (2,5 \mug/ml en PBS, 100 \mul/pocillo) durante toda la noche a 4ºC. Tras el bloqueo con BSA, los anticuerpos monoclonales se incubaron durante 60 min a 37ºC, seguido por anticuerpos específicos de subclase anti-Ig de ratón marcados con peroxidasa (Southern Biotechnologies Associates, Inc. EEUU) y OPD. La reacción se paró con ácido sulfúrico 3N y las densidades ópticas se determinaron a 492 nm.

4.3 Análisis por citometría de flujo (análisis FACS)

Las células THP-1 o Mono-Mac-1, que expresan el receptor MCP-1, se centrifugaron (1000 rpm, 10 min, a temperatura ambiente), se cultivaron en placas con fondo en V de 96 pocillos (250.000 cél/pocillo) y se incubaron con
50 \mul/pocillo de los diferentes sobrenadantes sin diluir (del Ejemplo 3) durante 60 min a 4ºC. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA 2% y FCS 2% mediante centrifugación (750 rpm, 5 min a 4ºC). El anticuerpo de cabra contra ratón conjugado con FITC se añadió entonces y se incubó durante 30 min a 4ºC y se lavó dos veces. La fluorescencia unida a la célula se determinó en un citómetro de flujo Profile XL.

4.4 Determinaciones de calcio

Los cambios en las concentración de calcio intracelular se controlaron usando la sonda fluorescente Fluo-3 (Calbiochem). Las células Mono-Mac-1 (2,5 x 10^{6} cél/ml) se resuspendieron en medio completo que contenía HEPES 10 nM y se incubaron con 2 ml/10^{6} células de Fluo-3 (250 nM en DMSO) durante 15 min a 37ºC. Después de la incubación las células se lavaron y se resuspendieron en medio completo que contenía CaCl_{2} 2 mM y se guardaron a 37ºC antes de que se añadiera un intervalo de diferentes concentraciones de ligando (quimiocina o anticuerpo monoclonal en PBS). La liberación de Calcio en respuesta a las citocinas o al anticuerpo monoclonal se determinó mediante FACS a 525 nm, mostrando la unión del receptor al ligando.

Para la determinación de la actividad antagonista del AcMo correspondiente, las células Mono-Mac-1 se preincubaron con varias concentraciones de anticuerpos purificados con sulfato amónico en RPMI (medio estándar) durante 30 min a 4ºC. Tras lavarse, las células se cargaron con Fluo-3 y la liberación de Calcio se determinó como se describió anteriormente.

4.5 Inmunoprecipitación y transferencia Western.

Las células Mono-Mac-1, las células THP-1, los PBL humanos y las células de bazo de rata se centrifugaron y se resuspendieron en tampón Tris 50 mM, NaCl 50 mM, DTT 5 mM que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas. Las células se sometieron a 3-5 ciclos de congelación (en nitrógeno líquido) y descongelación. Después, las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 2 min a 4ºC y se desechó el sedimento. El sobrenadante que quedó se centrifugó a 12500 rpm a 4ºC durante 15 min, y el sedimento se resuspendió en PBS. Los lisados se corrieron en geles de poliacrilamida SDS de 12,5% (p/v) bajo condiciones reductoras según el método de Laemmli UK y col. (Nature, 227, 680-85, 1970). Los geles se transfirieron a nitrocelulosa en un aparato de transferencia semi-seca (Bio-Rad) durante 60 min a 250 mA en un tampón base Tris 48 mM, glicina 39 mM, metanol 20% que contenía SDS 0,037%. Tras bloquear la membrana con leche desnatada 10% en PBS, los anticuerpos monoclonales se incubaron con agitación durante 120 min a temperatura ambiente, seguido de un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulinas de ratón marcado con peroxidasa diluido (ICN). La transferencia se reveló usando ECL (Amersham), siguiendo las instrucciones del fabricante.

La inmunoprecipitación se realizó como se describe (30). Brevemente, los extractos de proteínas se pre-clarificaron mediante incubación con 20 \mug/10^{7} células de anti-IgG de ratón-agarosa (Sigma) durante 60 min a 4ºC y se centrifugaron (1 min, 15.000 \chig). Los sobrenadantes se incubaron entonces con el AcMo MCP-1R03 (5 mg/ml en PBS) durante 90 min a 4ºC, seguido de una incubación con 20 \mug/10^{7} células de anti-IgG de ratón-agarosa durante 60 min. Las muestras se centrifugaron a 15.000 \chig durante 15 min a 4ºC y los sedimentos de agarosa se lavaron dos veces con tampón de lisis y tres veces con Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 (15.000 \chig, 1 min a 4ºC), se resuspendieron en tampón de Laemmli y se sometieron a electroforesis.

4.6 Purificación de los anticuerpos

Los anticuerpos se purificaron mediante precipitación con sulfato amónico 50% y/o cromatografía de afinidad sobre Sefarosa con proteína A inmovilizada (Pharmacia, Suecia) de fluido ascítico o de sobrenadantes de los híbridos correspondientes cultivados en medio libre de suero (0-1% FCS en medio Ultradoma, Gibco).

4.7 Quimiotaxis

Los monocitos humanos de células Mono-Mac-1 purificados con Nycoprep^{TM} se situaron en el pocillo superior de las cámaras de transmigración de 24 pocillos (Transwell, Costar, Cambridge MA), que se habían cubierto previamente con células endoteliales de cerebro de ratón (50.000 cél/pocillo durante 48 horas a 37ºC, CO_{2} 5% o hasta la confluencia). Las quimiocinas o el anticuerpo agonista se añadieron al pocillo inferior, diluidos en RPMI, BSA 0,25%. Las placas se incubaron durante 120 min a 37ºC, CO_{2} 5%. Después, las inertes se eliminaron de los pocillos y se contaron las células que migraron a la cámara inferior.

Para bloquear la quimiotaxis inducida por MCP-1, se añadieron diferentes concentraciones de AcMo purificado en PBS al pocillo superior, simultáneamente a la adición de quimiocinas al pocillo inferior. La quimiotaxis se siguió como se describió anteriormente.

Ejemplo 5 Resultados

Dos de los sueros que reconocían a las células Mono-Mac-1 en FACS (Tabla I) y los ratones correspondientes se usaron posteriormente para las fusiones celulares. Tras la fusión, se seleccionaron y estabilizaron los híbridos que producían anticuerpos que se unían al péptido sintético sin acoplar en EIA y dieron resultados positivos en FACS.

Se caracterizaron seis anticuerpos monoclonales con el fin de determinar su capacidad para reconocer el receptor de MCP-1 en lisados de células Mono-Mac-1 mediante inmunoprecipitación del receptor de MCP-1 asó como en transferencia Western.

Además, se caracterizó también su capacidad para actuar como agonistas o antagonistas de MCP-1.

Las características principales de estos anticuerpos monoclonales se resumen en la tabla III.

Los seis AcMo reconocen células Mono-Mac-1 y células THP-1 en FACS (Figura1).

El eje X indica el logaritmo de la intensidad de fluorescencia relativa y el eje Y indica el número de células relativo.

La proteína reconocida mediante transferencia Western corresponde a una proteína de 32 kDa en los tipos de células t empleados (líneas celulares humanas monocíticas y monocitos humanos).

Los análisis de transferencia Western muestran que MCPR-02 y MCPR-05 son capaces de unirse al receptor de MCP-1 humano y de rata inmovilizado sobre una membrana de celulosa.

Los seis anticuerpos reconocen células THP-1 y Mono-Mac-1 en análisis de citometría de flujo. Uno, MCPR-05 reconoce además una banda específica de 32 kDa en ambas líneas celulares, así como en PBLs y linfocitos derivados de amígdala, en análisis de transferencia Western, que se desplaza con el péptido (273-292); el AcMo MCPR-03 inmunoprecipita la misma proteína de 32 kDa de las células Mono-Mac-1. La especificidad del anticuerpo monoclonal para CCR2 se demostró previamente mediante transferencia Western y análisis por citometría de flujo usando células 239, que se sabe que no expresan los receptores de quimiocinas CCR2, transfectadas con CCR2, así como en células Jurkat, que expresan varios receptores de quimiocinas (CCR3, CCR5 y fusina) pero no CCR2. Mientras que ninguno de estos anticuerpos reconoció ninguna de las líneas celulares mediante citometría de flujo o transferencia Western, ambas son claramente positivas después de transfectarse con el gen de CCR2.

Los análisis de citometría de flujo de PBLs humanos indican que estos AcMo reconocen PBLs CD-11b. Uno de los AcMo, MCPR-05, reconoce también leucocitos de sangre periférica de rata y esplenocitos, que se tiñen positivamente con los anticuerpos monoclonales ED1 y ED2 (Serotec). El anticuerpo monoclonal de ratón ED1 reconoce monocitos y macrófagos de rata, mientras que el anticuerpo monoclonal de ratón ED2 reconoce macrófagos de rata.

Tres AcMo (MCPR-04, -05 y -06) actúan como antagonistas del receptor, ya que bloquean el flujo de Calcio inducido por MCP-1 en células Mono-Mac-1 (figura 2). Los anticuerpos con actividad antagonista reconocen el tercer bucle extracelular del receptor (aa 273-292), mientras que el anticuerpo agonista reconoce la región amino terminal (aa 24-38).

Un AcMo (MCPR-02) actúa como agonista del receptor de MCP-1, basándose en determinaciones de Calcio. Se vio un incremento rápido y transitorio en la concentración de Ca^{2+} en las células Mono-Mac-1 después de la estimulación con el AcMo MCPR-02. El pretratamiento de las células con este AcMo lleva a un marcado incremento en la respuesta a MCP-1, mostrando que la respuesta al calcio es desensibilizante (Figura 3f).

Quimiotaxis. Las células Mono-Mac-1 se preincubaron con varias concentraciones de MCPR-05 y se situaron en la cámara superior de los cultivos polarizados cubiertos de células endoteliales y se añadió MCP-1 (1 nM) al pocillo inferior (Figura 4a). Las células que migraron al pocillo inferior se contaron y se expresó como Índice de Migración (I.M.), que se calculó como el incremento observado en la migración x-veces respecto al control negativo (Medio).

Para la concentración de 100 a 1000 nM se pudo observar una reducción significativa de la quimiotaxis de las células Mono-Mac-1 para el anticuerpo antagonista MCPR-05.

La Figura 4b muestra el efecto de la dilución del AcMo MCPR-02 sobre la migración de células Mono-Mac-1 bajo las mismas condiciones.

CCR2 se expresa en monocitos, células B en reposo y células T activadas.

Basándonos en la especificidad de estos AcMo, hemos establecido la población de células mononucleares de sangre periférica humana que expresan el CCR2. Las PBMC en reposo, así como las activadas con PHA o ionóforo, se examinaron por citometría de flujo con tinción de doble color en conjunción con marcadores específicos para monocito/macrófagos, células B y células T. En las células sin tratar, el AcMo reconoció el 100% de las células CD11b^{+}, CD13^{+} y CD14^{+} en la población de monocito/macrófagos,en función del análisis de los detectores de tamaño y complejidad. Los anticuerpos anti-CCR2 se unieron al 50% de todas las células CD19^{+}, mientras que se observó mínima o ninguna unión en las células CD3^{+}. Esto indica la expresión del receptor de quimiocinas CCR2 en monocitos y células B, pero no en células T. Los linfocitos derivados de amígdala en reposo y activados se usaron para confirmar estos datos, mostrando que efectivamente todos los monocitos/macrófagos y la mayoría de las células B del bazo y las amígdalas se marcaban con los anticuerpos anto-CCR2 (Figuras 5a y 5b). Tras la activación, el 30-45% de las células CD4^{+} y el 20-40% de las CD8^{+} expresan el receptor CCR2, mientras que su expresión no se altera en amígdala, ni en células B de sangre periférica, indicando una expresión de CCR2 en células T dependiente de activación. No se ven modificaciones en la expresión del receptor en células B en la activación, a pesar de que su origen sea PBL o amígdala.

Las Figuras 5a y 5b resumen las poblaciones celulares que expresan el receptor de quimiocinas CCR2 en amígdala y en PBL.

Las Figuras 6a a 6c muestran que MCPR-05 bloquea el flujo de Ca^{2+} y la transmigración de las células Mono-Mac-1. El flujo de Calcio se indujo usando MCP-3 3 nM. El efecto de la preincubación con el AcMo antagonista MCPR-05 sobre el flujo de Ca^{2+} inducido por MCP-3 se muestra en las Figuras 6a y 6b y la transmigración de estas células se muestra en la Figura 6c, comparadas con un AcMo control de isotipos (hGH5). Los resultados corresponden a la media de triplicados de un experimento representativo.

El anticuerpo antagonista MCPR-02 de Mono-Mac-1 provocó una respuesta quimiotáctica significativa de las células Mono-Mac-1 a las diluciones 1/2 y 1/6.

Exposición

Por lo tanto, hemos obtenido AcMo que son capaces de neutralizar la actividad de MCP-1 y AcMo que mimetizan la actividad de MCP-1. Estas dos propiedades están diferenciadas claramente en dos regiones del receptor de MCP-1. El AcMo bloqueante reconoce secuencias presentes en el tercer bucle extracelular del receptor, que podría correlacionarse con regiones implicadas en la unión de MCP-1, mientras que la actividad agonista mapea en la región N-terminal del receptor y podría correlacionarse con regiones necesarias para el funcionamiento del receptor.

Así, hemos hallado anticuerpos capaces de unirse al receptor de MCP-1 y entre los cuales algunos son agonistas (MCPR-02) y algunos son antagonistas (MCPR-04, MCPR-05 y MCPR-06). Estos hallazgos deben considerarse muy sorprendentes y muy interesantes y prometedores en su uso como medicamentos.

Todos los anticuerpos descritos que reconocen el receptor de MCP-1 pueden ser útiles con fines diagnósticos in vivo.

Dos de los anticuerpos hallados (MCPR-02 y MCPR-05) son capaces de unirse al receptor de MCP-1 en inmunoprecipitación en el contexto de un tejido biológico y además reconocen el receptor adsorbido a una membrana artificial en experimentos de inmunotransferencia. Los anticuerpos pueden ser útiles con fines diagnósticos in vitro que impliquen antígenos inmovilizados.

Describimos un panel de anticuerpos monoclonales específicos para CCR2 humano, derivados usando péptidos sintéticos del tercer dominio extracelular (residuos aminoacídicos 273-292) y de la región amino terminal (residuos 24-38) de este receptor. En el análisis por citometría de flujo y transferencia Western, estos AcMo reconocen células Jurkat y 293 transfectadas con CCR2, mientras que no reconocen células transfectadas control. Se ha demostrado recientemente que varios receptores de quimiocinas CC (CCR2, 3, 4 y 5) y CXC (fusina) actúan como correceptores requeridos para la fusión celular y para la infección de células por VIH. Esto ha aumentado el interés en esta familia de receptores como posibles dianas para la prevención de las consecuencias de la infección por VIH (22-27). También hemos descrito que CCR2 actúa como un correceptor del VIH-1, mostrando que MCP-1 exhibe una actividad neutralizante sobre el VIH (enviado para publicar). Además, el AcMO MCPR-02 promueve la neutralización del VIH, mientras que el AcMo antagonista de MCP-1 MCPR-05 no neutraliza al virus, pero bloquea efectivamente la neutralización inducida por MCP-1. Debido a que los AcMo MCPR-04 y R-05 no bloquean la infección por VIH, estos datos indican que VIH-1 interacciona con el dominio NH_{2} terminal del receptor CCR2. Finalmente, ya que el AcMo MCPR-02, así como la quimiocina MCP-1 bloquea la infección por VIH-1, podríamos defender que el VIH-1 interacciona con la forma inactiva del receptor, pero no con la forma activa.

TABLA I

1

^{1}: EIA usando péptido sintético sin acoplar adsorbido a fase sólida.

^{2}: Usando membranas de células mono mac-1 o THP-1

^{3}: Análisis por citometría de flujo de células mono mac-1 y THP-1.

TABLA II

2

^{1}: EIA usando péptido sintético sin acoplar adsorbido a fase sólida.

^{2}: Análisis por citometría de flujo de células mono mac-1 y THP-1.

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(Tabla pasa a la página siguiente)

3

Claims

1. Anticuerpo que es capaz de unirse al receptor CCR2 de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) que (a) reconoce la región extracelular amino terminal del receptor y actúa como un agonista funcional o (b) reconoce las secuencias de aminoácidos presentes en el tercer bucle extracelular del receptor y actúa como un antagonista funcional del receptor.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 que reconoce secuencias presentes en el tercer bucle extracelular del receptor y que reconoce los residuos aminoacídicos 273-292 del receptor.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1 que reconoce la región extracelular amino terminal del receptor y que reconoce los residuos aminoacídicos 24-38 del receptor.

5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes capaz de unirse al receptor de MCP-1 y capaz de inmunoprecipitar el receptor MCP-1 en el contexto de células o tejido biológico y capaz de detectar el receptor de MCP-1 adsorbido sobre una membrana artificial.

6. Anticuerpo según la reivindicación 5 y que reconoce las células Mono-Mac-1 y THP-1, que expresan el receptor de MCP-1, en inmunofluorescencia.

7. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para diagnóstico in vitro.

8. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la discriminación y detección in vitro de tejidos y clases de células que expresan el receptor de MCP-1.

9. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la discriminación de nuevos fármacos, in vitro.

10. Preparación de anticuerpo que comprenda el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso terapéutico.

12. Composición farmacéutica que comprenda el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo.

13. Un microorganismo o línea celular capaz de producir el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como un diagnóstico in vivo.

15. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como un discriminante in vivo para nuevos fármacos.