ES2302774T3 - Anticuerpos contra el receptor de il-8 y sus usos terapeuticos. - Google Patents
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Abstract
Un inhibidor de la unión al receptor 2 de IL8, que comprende un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que es capaz de interaccionar con el dominio amino terminal extracelular del receptor 2 de IL8 y que es capaz de competir con IL8 por la unión al receptor, en el que el anticuerpo se puede obtener inmunizando a un mamífero con un inmunógeno que consiste en un polipéptido seleccionado entre F-E-D-F-W-K-G-E-D-L-S-N-Y-S-Y, S-S-T-L-P-P-F-L-L-D-A-A-P-C y F-L-L-D-A-A-P-C-E-P-E-S-L-E-I.
Description
Anticuerpos contra el receptor de
IL-8 y sus usos terapéuticos.
La presente invención se refiere en general a
inhibidores de citoquinas. Más en particular, la invención se
refiere a inhibidores de la unión al receptor 2 de IL8, que incluyen
anticuerpos, que interaccionan con el dominio extracelular amino
terminal del receptor 2 de IL8 y compiten con IL8, y con otros
ligandos naturales relacionados, por la unión al receptor.
Las citoquinas son un grupo de mediadores
semejantes a las hormonas producidos por los leucocitos. Estos
agentes sirven de señales biológicas endógenas que actúan en
conjunción con antígenos para amplificar los mecanismos de defensa
del hospedador, tanto los localizados como los sistémicos, en los
que participan macrófagos, linfocitos y otros tipos de células. Las
citoquinas representativas incluyen las distintas interleuquinas,
interferones, GRO\alpha, GRO\beta y GRO\gamma, el péptido 2
activador de neutrófilos (NAP-2) y
ENA-78. Las citoquinas se han usado para tratar y
prevenir una amplia variedad de trastornos basados en la capacidad
de estas moléculas para estimular una respuesta inmunológica.
La interleuquina-8 (IL8) es una
citoquina originariamente derivada de macrófagos humanos (Suzuki, K.
y col. (1989) J. Exp. Med.
169:1895-1901; Schröder, J.M. y col. (1987)
J. Immunol. 139:3474-3483; Schröder,
J.M. y col. (1988) J. Immunol.
140:3534-3540; Schröder, J.M. (1989) J.
Exp. Med. 170:847-861; Larson, C.G. y
col. (1989) Science 243:1464-1466).
Este factor ha sido también denominado factor quimiotáctico de los
polimorfonucleares (PMN), péptido activador de neutrófilos derivado
de monocitos (MONAP), factor quimiotáctico de neutrófilos derivado
de monocitos (MDNCF) (del inglés,
" Monocyte-Derived Neutrophil
Chemotactic Factor"), factor quimiotáctico de
lincocitos T (TCF) (del inglés, " T lymphocyte
Chemotactic Factor"), péptido activador de
neutrófilos derivado de linfocitos (LYNAP) (del inglés,
" Lymphocyte-derived
Neutrophil-Activating Peptide") y
péptido 1 activador de neutrófilos (NAP-1).
La molécula de IL8 se produce en una amplia
variedad de tejidos y células, que incluyen fagocitos mononucleares,
células endoteliales, fibroblastos, células epiteliales y
macrófagos alveolares, tras estimulación con agentes tales como
lipopolisacárido y miristato de forbol, fitohemaglutinina, Con A, u
otras preparaciones mitógenas, y citoquinas tales como la
interleuquina-1 (IL1) y el factor de necrosis
tumoral (TNF). Se ha clonado el gen que codifica la IL8 humana.
Matsushima, K. y col. J. Exp. Med. (1988)
167:1883-1893; Mukaida, N. y col. J.
Immunol. (1989) 143:1366-1371. El gen
codifica una proteína precursora que tiene 99 aminoácidos y que es
escindida proteolíticamente en polipéptidos de IL8 secretados de
distintas longitudes, tales como los que contienen 69, 72 ó 77
residuos de aminoácidos, con masas moleculares de aproximadamente
8.000 Dalton.
La IL8 humana actúa como una molécula
quimioatrayente de neutrófilos e induce granulocitosis tras su
inyección sistémica, y una reacción dérmica tras su inyección
local, en animales experimentales. Bazzoni, F. y col. (1991)
173:771-774; Van Damme, J. y col. (1988)
J. Exp. Med. 167:1364-1376; Ribeiro,
R.A. y col. (1991) Immunology
73:472-477. Esta molécula también activa la
liberación de aniones superóxido e induce la liberación de los
constituyentes primarios de los gránulos de los neutrófilos, que
incluyen mieloperoxidasa, \beta-glucuronidasa y
elastasa. La IL8 media en estas actividades uniéndose a su receptor
y desencadenando la transducción de señales, una cascada de
reacciones que dan como resultado final una respuesta biológica.
Se han descrito las secuencias de los dos
receptores de la IL8 humana (aquí denominados "IL8R1" e
"IL8R2"). Véanse, p. ej., la Publicación internacional,
documento WO93/06229 (publicado el 1 de abril de 1993) y Holmes y
col. Science (1991) 253:1278-1280.
Estos receptores poseen una afinidad similar por IL8 y son miembros
de la superfamilia de la rodopsina, que consta de siete hélices, y
se extienden a lo largo de la membrana. Estas moléculas receptoras
incluyen siete regiones transmembranarias, unidas por tres lazos
intracelulares y tres lazos extracelulares, y poseen una cola amino
terminal extracelular y una cola carboxi terminal intracelular. Se
sabe que otras citoquinas presentes en la naturaleza comparten un
receptor con IL8. Por ejemplo, GRO\alpha, GRO\beta,
GRO\gamma, NAP-2 y ENA-78, todas
ellas se unen a uno de los receptores de IL8 sobre neutrófilos
humanos, según se describe en Baggiolini y col., FEBS Lett.
(1992) 307:97-101; Walz y col., J. Exp.
Med. (1991) 174:1355; Moser y col., J. Biol. Chem. (1991)
266:10666; Geiser y col., J. Biol. Chem. (1993)
268:15419-15424.
Gayle y col., J. Biol. Chem. (1993)
268:7283-7289 y LaRosa y col., J. Biol.
Chem. (1992) 267:25402-25406 relacionan
con un determinante importante para la unión de agonistas naturales
de IL8R2, GRO\alpha/MGSA y NAP-2, residuos
situados en la región del receptor que incluye el dominio amino
terminal extracelular y una porción de la primera región
transmembranaria.
Se han construido péptido basados en la
secuencia del receptor de IL8 en un intento de determinar el papel
de las distintas regiones del receptor de IL8 en la unión de IL8.
Gayle y col., J. Biol. Chem. (1993)
268:7283-7289 describen péptidos basados en
la secuencia amino terminal del receptor de IL8, y la Publicación
internacional, documento
WO-A-92/04372 (publicada el 19 de
marzo de 1992) describe péptidos y anticuerpos dirigidos contra
ellos, basados en la terminación carboxi del receptor.
El documento
WO-A-92/18641 describe cDNA que
codifican receptores de IL8, que incluyen el receptor de IL8 humano
de "baja afinidad" (IL8R2). También se proponen antagonistas
que interfieren en la interacción entre IL8 y el receptor de IL8,
que incluyen anticuerpos específicos para el receptor de IL8.
La presente invención proporciona sustancias que
inhiben la unión de IL8 al IL8R2 a través de su interacción con el
dominio amino terminal extracelular de IL8R2. Estos inhibidores son
moduladores útiles de la actividad biológica mediada por un
receptor de IL8.
Por consiguiente, en una de las realizaciones,
la invención se dirige a un inhibidor de la unión al receptor 2 de
IL8, que comprende un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que es
capaz de interaccionar con el dominio amino terminal extracelular
del receptor 2 de IL8 y que es capaz de competir con IL8 por la
unión al receptor, en el que el anticuerpo se puede obtener
inmunizando a un mamífero con un inmunógeno que consiste
esencialmente en un polipéptido seleccionado entre
F-E-D-F-W-K-G-E-D-L-S-N-Y-S-Y,
S-S-T-L-P-P-F-L-L-D-A-A-P-C
y
F-L-L-D-A-A-P-C-E-P-E-S-L-E-I.
La invención proporciona además inhibidores de
la unión al receptor 2 de IL8 según la invención, para usar en un
método de tratamiento de un organismo humano o animal, y
composiciones farmacéuticas para modular una respuesta biológica
mediada por el receptor de IL8, que comprenden un inhibidor de la
unión al receptor 2 de IL8 de la invención, en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además el uso de un
inhibidor de la invención, en la fabricación de un medicamento para
usar en un método de tratamiento, que comprende inhibir la unión de
IL8 a IL8R2.
La invención proporciona también el uso de un
inhibidor de la invención, en la fabricación de un medicamento para
usar en un método de tratamiento, que comprende modular una
respuesta biológica mediada por el receptor 2 de IL8.
La Figura 1 muestra las secuencias de
aminoácidos del dominio amino terminal extracelular del IL8R1 humano
y del IL8R2 humano y representa los péptidos usados para generar
los antisueros.
La Figura 2 muestra los resultados de un
análisis de FACS de neutrófilos usando antisueros contra péptidos
amino terminales de IL8R1 y IL8R2, según se describe en los
ejemplos. Los neutrófilos se incubaron con una IgG previa a la
inmunización, procedente de oveja (Figuras 2A y 2C), con IgG
anti-péptido IL8R1 (Figura 2B) o con IgG
anti-péptido IL8R2 (Figure 2D), cada una de ellas
diluida en proporción 1:150 en PBS + BSA al 1%, después se trataron
con anticuerpos anti-oveja, procedentes de conejo,
marcados con fluoresceína, (1:100 en PBS + BSA al 1%) y se
sometieron a un análisis de FACS, según se describe más
adelante.
La Figura 3 representa los resultados de ensayos
de unión a receptor para el IL8R1, según se describen en los
ejemplos. Células Sf9 se infectaron con un baculovirus recombinante
encargado de la expresión de IL8R1 y se realizó un ensayo de unión
de ^{125}I-IL8 de la manera descrita, después de
una preincubación de 1 hora con IL8 o con anticuerpos: 1672 p,
fracción de IgG procedente de un control de suero previo a la
inmunización, para el suero correspondiente al péptido núm. 1 de
IL8R1; 1672 i, fracción de IgG procedente de un antisuero contra el
péptido núm. 1; 1672 i pur. af., anticuerpos purificados por
afinidad, dirigidos contra el péptido núm. 1 de IL8R1; 1673 p,
fracción de IgG procedente de un control de suero previo a la
inmunización, para el suero correspondiente a los péptidos núms.
10-13 de IL8R2; 1673 i, fracción de IgG procedente
de un antisuero dirigido contra los péptidos núms.
10-13 de IL8R2. Se indican las concentraciones
finales de cada uno de los efectores.
La Figura 4 muestra la inhibición de la unión de
IL8 a IL8R1 por acción del anticuerpo anti-péptido
núm. 1 de IL8R1 en células Sf9. Las células Sf9 se infectaron con
un baculovirus encargado de la expresión de IL8R1, se preincubaron
con anticuerpos y se ensayaron con respecto a la unión de
^{125}I-IL8 según se ha descrito anteriormente.
Cuando se indica (Pur. af. + pépt. 1), los anticuerpos contra el
péptido núm. 1 de IL8R1, purificados por afinidad, se
preabsorbieron con una concentración de 50 mg/ml del péptido núm. 1
antes de su uso. Los datos están corregidos en cuanto a la unión
inespecífica, medida en presencia de una concentración de 1 mg/ml
de IL8 no marcada.
La Figura 5 representa los resultados de los
ensayos de unión a receptor para el IL8R2, según se ha descrito
anteriormente y se describe en los ejemplos.
La Figura 6 muestra la inhibición de la unión de
IL8 a IL8R2 por acción del anticuerpo anti-péptido
núm. 10 de IL8R2 en células Sf9. Las células Sf9 se infectaron con
baculovirus encargado de la expresión de IL8R2, se preincubaron con
anticuerpos y se ensayaron con respecto a la unión de
^{125}I-IL8 según se ha descrito anteriormente.
Las adiciones de los anticuerpos son las siguientes: IgG previa a la
inmunización, fracción de IgG procedente de un control de un suero
previo a la inmunización; IgG anti-pépt R2, fracción
IgG procedente de un antisuero dirigido contra los péptidos núms.
10-13 de IL8R2; Anti-pépt. 10 pur.
af. o Pur. af. - pépt. 10, anticuerpos dirigidos contra el péptido
núm. 10, purificados por afinidad; Pur. Af. + pépt. 10, anticuerpo
dirigido contra el péptido núm. 10 preabsorbido con una
concentración de 50 mg/ml del péptido núm. 10, y purificado por
afinidad. Los datos están corregidos en cuanto a la unión
inespecífica, medida en presencia de una concentración de 1 mg/ml
de IL8 no marcada.
La práctica de la presente invención utilizará,
salvo que se indique lo contrario, métodos convencionales de
virología, microbiología, biología molecular y técnicas de DNA
recombinante incluidas en la experiencia en la técnica. Esos
métodos se explican con todo detalle en la literatura. Véanse, p.
ej., Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2ª Edición, 1989); Maniatis y col. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical
Approach, vol. I y II (D. Glover, redactor); Oligonucleotide
Synthesis (N. Gait, redactor, 1984); Nucleic Acid
Hybridization (B. Homes y S. Higgins, redactores, 1985);
Transcription and Translation (B. Names y S. Higgins,
redactores, 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney,
redactor, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular
Cloning (1984).
Al describir la presente invención, se emplearán
los siguientes términos y expresiones, y se quiere que estén
definidos como se indica a continuación.
Un "inhibidor de la unión al receptor 2 de
IL8" es una sustancia (diferente de la IL8 natural o de otros
ligandos endógenos del receptor de IL8 de neutrófilos, presentes en
la naturaleza, tales como GRO\alpha, \beta, \gamma,
NAP-2 y ENA-78) que interacciona, ya
sea directa o indirectamente, con el receptor 2 de IL8 y que
compite con IL8 o con otros ligandos naturales, tales como
GRO\alpha, \beta, \gamma, NAP-2 y
ENA-78, por la unión al receptor. La interacción
por la unión al receptor 2 de IL8 incluye una asociación tanto
covalente como no covalente entre el inhibidor y IL8R2. El
inhibidor de la invención se une al receptor de IL8 en un sitio de
unión para IL8 en el dominio amino terminal extracelular y bloquea
la unión de IL8.
La capacidad de una molécula para unirse a IL8R2
y para competir con IL8 por la unión a IL8R2 se puede determinar
usando ensayos convencionales de unión a receptores. Por ejemplo, la
capacidad del inhibidor para unirse al receptor se puede determinar
directamente marcando el inhibidor y demostrando su unión a células
que portan el receptor, tales como neutrófilos. La unión del
inhibidor se puede también demostrar mediante métodos tales como
entrecruzamiento químico, mediante reconocimiento, por parte de un
anticuerpo anti-inhibidor, de la presencia del
inhibidor unido a células que portan el receptor, según se describe
en los ejemplos, por medio de NMR o de cristalografía por rayos X
de los complejos inhibidor/receptor, y/o mediante otros métodos
apropiados para usar con un inhibidor determinado, generalmente
conocidos por un facultativo experto. La capacidad de los
inhibidores de la presente invención por competir con IL8 por la
unión a IL8R2 se puede determinar usando ensayos de competición
estándar tales como los radioinmunoensayos descritos por Gayle y
col., J. Biol. Chem. (1993)
268:7283-7289; y LaRosa y col., J. Biol.
Chem. (1992) 267:25402-25406, y en los
ejemplos que aquí se exponen. No es necesario que la molécula
inhiba completamente la unión de IL8, sino que sólo se necesita que
disminuya la cantidad de unión que normalmente ocurriría en ausencia
del inhibidor. Además, un inhibidor de la unión de IL8 puede ser,
o un agonista, es decir, una molécula capaz de promover al menos
una de las respuestas biológicas normalmente asociadas con IL8, o un
antagonista, es decir, una sustancia que se opone al menos a uno de
los efectos de IL8, disminuyendo así la capacidad de IL8 para mediar
en respuestas biológicas normalmente asociadas con ella.
La expresión "receptor de IL8", según aquí
se usa, se refiere a cualquiera de los varios receptores para IL8
de vertebrados, o sus fragmentos que incluyan un dominio de unión
para IL8. Por ejemplo, tanto IL8R1 como IL8R2 humanos están
abarcados por esta expresión. Los inhibidores de la invención
compiten con IL8 por la unión a IL8R2.
La expresión "unión al receptor de IL8" o
"unión de IL8" se refiere a la unión a uno cualquiera de los
receptores de IL8 de cualquiera de IL8, GRO\alpha, GRO\beta,
GRO\gamma, NAP-2 y ENA-78, sus
fragmentos y otros ligandos presentes en la naturaleza. Los
inhibidores de la invención se unen a IL8R2.
Por "modular una respuesta biológica mediada
por un receptor de IL8" se quiere dar a entender un aumento o un
descenso de la incidencia de una o más actividades celulares
normalmente desencadenadas por la unión de IL8 a su receptor. La
naturaleza de estas actividades puede ser bioquímica o biofísica.
Por ejemplo, una sustancia "modularía una respuesta biológica
mediada por un receptor de IL8" si no estimula la misma actividad
de transducción de señales que la IL8 cuando el inhibidor se une a
un receptor de IL8. El aumento o descenso se puede vigilar usando
diferentes ensayos, según se describe más adelante, que también
utilizan moléculas de un receptor de IL8 como controles. Los
inhibidores de la invención compiten con IL8 por su unión a
IL8R2.
Más en particular, se desencadena una cascada de
reacciones bioquímicas cuando IL8 se une a su receptor. Por
consiguiente, un inhibidor de IL8, "modulará una repuesta mediada
por un receptor de IL8" cuando produzca un aumento o una
disminución de una cualquiera de estas reacciones. Por ejemplo, los
receptores para IL8 son proteína acopladas a proteína G, las
cuales, cuando se produce una actividad de transducción de señales
correcta, desencadenan un aumento de los niveles intracelulares de
Ca^{2+}, IP_{3} y DAG. Se pueden usar ensayos estándar para
medir los niveles intracelulares de estas sustancias y con ello
determinar si la respuesta mediada por el receptor de IL8 ha sido
modulada. Se conocen ensayos para medir los niveles Ca^{2+}
citosólico y se describen, p. ej., en la Publicación internacional
documento WO93/06229 (publicado el 1 de abril de 1993); Bazzoni, F.
y col., (1991) J. Exp. Med.
173:771-774 y Peveri, P. y col., (1988) J.
Exp. Med. 167:1547-1559. Las
concentraciones de IP_{3} y los niveles de DAG se pueden medir
también mediante métodos conocidos.
Otras actividades biológicas atribuibles a IL8,
que se pueden medir con el fin de determinar una modulación,
incluyen, por ejemplo, la actividad quimiotáctica sobre neutrófilos,
medida usando ensayos generalmente conocidos en la técnica (véanse,
p. ej., Schnöder, J.M. y col., (1987) J. Immunol.
139:3474-3483; Fincham, N.J. y col. (1988)
J. Immunol. 140:4294-4299; Larson,
C.G. y col. (1989) Science
243:1464-1466; Grob, P.M. y col. (1990)
J. Biol. Chem. 265:8311-8316;
Strieter, R.M. y col. (1989) J. Biol. Chem.
264:10621-10626); ensayos de liberación de
enzimas, tales como ensayos de actividad en PMN de liberación de
peroxidasa, ensayos de liberación de
\beta-glucuronidasa, liberación de O_{2}
determinada mediante ensayos con citocromo C y ensayos de
liberación de elastasa (véanse, p. ej., Schröder, J.M. y col.,
(1987) J. Immunol. 139:3474-3483;
Peveri, P. y col. (1988) J. Exp. Med.
167:1547-1559).
Dos péptidos serán "sustancialmente
iguales" o "sustancialmente idénticos" cuando al menos
aproximadamente el 50%, normalmente al menos aproximadamente el
60%, más típicamente al menos aproximadamente el 75% y
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% - 95% de los
aminoácidos, coinciden a lo largo de una longitud definida de la
molécula. Según aquí se usa, "sustancialmente iguales" se
refiere también a secuencias que muestran una identidad con la
secuencia polipeptídica especificada.
Por "IL8 natural" se quiere dar a entender
un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es
idéntica a una secuencia recuperada de una fuente que produce IL8
en la naturaleza. La IL8 natural puede tener diversas longitudes,
tales como las que contienen 69, 72 y 77 residuos de aminoácidos,
respectivamente.
Los términos "polipéptido" y
"proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos
y no están limitados a una longitud mínima del producto. Así, en la
definición se incluyen péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros
y similares. Tanto las proteínas de longitud completa como sus
fragmentos están abarcados por la definición. Estos términos
también incluyen modificaciones post-expresión del
polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación
y modificaciones similares.
El término "anticuerpo" abarca
preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclonales, así como
preparaciones que incluyen anticuerpos híbridos, anticuerpos
modificados, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos
F(ab), fragmentos F_{v}, anticuerpos de un solo dominio,
anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y sus fragmentos
funcionales, que conservan su especificidad por los sitios de unión
para IL8 del dominio amino terminal extracelular. Por ejemplo, un
anticuerpo puede incluir regiones variables, o fragmentos de
regiones variables, que conservar la especificidad por el dominio
amino terminal extracelular de una molécula de receptor de IL8. La
parte restante del anticuerpo puede derivar de la especie en la que
el anticuerpo será utilizado. Así, si el anticuerpo se va a usar en
un ser humano, el anticuerpo puede ser "humanizado" con el fin
de disminuir su inmunogenicidad aunque conservando su actividad. En
relación con una descripción de anticuerpos quiméricos, véanse, p.
ej., Winter, G. y Milstein, C. (1991) Nature
349:293-299; Jones, P.T. y col. (1986)
Nature 321:522-525; Riechmann, L. y
col. (1988) 332:323-327; y Carter, P. y col.,
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4285-4289. Esos anticuerpos quiméricos
pueden contener no sólo sitios de unión para el receptor de IL8,
sino también sitios de unión para otras proteínas. De esta manera,
se pueden generar reactivos bifuncionales con una especificidad
dirigida a antígenos tanto externos como internos.
Un "antígeno" o un "inmunógeno" se
refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos que
estimularán el sistema inmunitario de un hospedador para generar
una respuesta secretora, humoral y/o celular específica para el
antígeno.
Una "cantidad inhibidora efectiva" de un
inhibidor de IL8 se refiere a una cantidad de inhibidor suficiente
para bloquear la unión, en su totalidad o en parte, de IL8 al
receptor IL8R2. La cantidad inhibidora efectiva precisa dependerá
del número y del tipo de receptores IL8R2 presentes sobre la
superficie de la célula particular en cuestión. Esa cantidad puede
ser fácilmente determinada por un experto en la técnica usando una
experimentación de rutina y ensayos de unión de IL8, tales como los
ensayos estándar de unión a neutrófilos, según se describen en los
ejemplos.
La expresión "cantidad moduladora efectiva"
de un inhibidor de IL8 se refiere a una cantidad de inhibidor
suficiente para provocar un cambio en una actividad biológica
mediada por el receptor 2 de IL8, según se ha descrito
anteriormente. Esta cantidad también dependerá del número y del tipo
de receptores IL8R2 presentes sobre la superficie de la célula
particular en cuestión y variará dependiendo de la actividad
biológica a la que el inhibidor se dirige. Los ensayos para
determinar cambios en una actividad mediada por el receptor 2 de
IL8 se encuentran descritos en lo que antecede.
Es fundamental para la presente invención el
descubrimiento de inhibidores de IL8 que son capaces de suprimir la
unión de diferentes ligandos, que incluyen IL8, GRO\alpha,
GRO\beta, GRO\gamma, NAP-2 y
ENA-78, a los receptores de IL8, modulando de este
modo las respuestas biológicas desencadenadas por esta unión. Por
consiguiente, estos inhibidores son capaces de bloquear o modular la
quimiotaxis y la activación de los neutrófilos. Los inhibidores son
útiles para el tratamiento y prevención de una amplia variedad de
trastornos en los que los neutrófilos contribuyen a la patología de
la enfermedad, que incluyen enfermedades inflamatorias tales como
la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal, así
como para el tratamiento y/o prevención del daño tisular ocasionado
durante enfermedades tales como el choque septicémico y el síndrome
de dificultad respiratoria aguda (ARDS). Los inhibidores de la
presente invención también encontrarán utilidad para estimular una
respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos en el tratamiento de
procesos cancerosos, infecciones víricas, bacterianas, fúngicas y
protozoarias, así como para el tratamiento de procesos en los que el
sistema inmunitario está comprometido, tales como el SIDA y otros
trastornos inmunitarios adquiridos y heredados.
Los inhibidores de la presente invención actúan
en el dominio amino terminal extracelular del receptor de IL8.
Las secuencias del dominio amino terminal
extracelular de los receptores 1 y 2 de la IL8 humana (denominados
IL8R1 y IL8R2 respectivamente) se muestran en las Figuras 1 y 2. Los
inhibidores de uso en la presente invención incluyen anticuerpos
generados contra secuencias peptídicas aisladas, derivadas de
secuencias contiguas que se extienden a lo largo de esta región,
así como anticuerpos generados contra sus análogos (es decir, contra
secuencias con sustituciones, adiciones o deleciones de
aminoácidos), que conservan la capacidad para unirse al receptor
IL8R2 e inhibir la unión de IL8 al mismo, según se ha definido en lo
que antecede. Sorprendentemente, se ha descubierto que los
anticuerpos y las mezclas de anticuerpos, generados contra péptidos
derivados de la región del dominio amino terminal extracelular
tanto de IL8R1 como de IL8R2, son capaces de bloquear la unión de
Il8 al receptor. Así, el sitio de reconocimiento (epítopo) para
estos anticuerpos parece que se solapa con, o que está próximo a,
el sitio de reconocimiento para la IL8. Estos anticuerpos pueden ser
policlonales, monoclonales, quiméricos, o sus fragmentos
funcionales, generados usando técnicas estándar. Además, las
preparaciones de anticuerpos útiles pueden incluir mezclas de
varios anticuerpos diferentes, según se detalla más adelante.
Se han sintetizado varios péptidos sobre la base
de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión amino terminal
extracelular de IL8R1 e IL8R2. Estos péptidos se muestran en las
Tablas 1 y 2, en los ejemplos. Éstos y otros péptidos se pueden
sintetizar mediante técnicas de síntesis de proteínas, conocidas por
los expertos en la técnica. En general, estos métodos utilizan
métodos de síntesis en fase sólida o en fase de disolución, muy
conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., J.M. Stewart y J. D. Young,
Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical
Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R.B. Merrifield, The
Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross y J.
Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), págs.
3-254, en relación con técnicas de síntesis de
péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide
Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) y E.
Gross y J. Meienhofer, redactores, The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, en relación con la
síntesis clásica en disolución.
Los péptidos también se pueden producir mediante
métodos recombinantes, conocidas en la técnica. Por ejemplo, una
secuencia de DNA que codifica el péptido en cuestión se puede
sintetizar usando métodos estándar. Véanse, p. ej., Edge (1981)
Nature 292:756; Nambair y col. (1984) Science
223:1299; Jay y col. (1984) J. Biol. Chem.
259:6311. En general, se seleccionarán los codones preferidos
para el hospedador en el que se quiere que la secuencia sea
expresada. Como alternativa, la secuencia puede derivar de DNA
genómico o de cDNA. El DNA se clona en un vector de expresión
adecuado, ya sea procariota o eucariota, usando métodos
convencionales, las células hospedadoras se transforman con el
vector y se cultivan en condiciones que permiten la expresión de la
proteína de interés.
Los péptidos se pueden producir también mediante
escisión enzimática o química del receptor IL8R2 purificado o de un
polipéptido que contiene la secuencia deseada. Esos procedimientos
son convencionales y muy conocidos en la técnica.
En una de las realizaciones, los inhibidores de
la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o
monoclonales que se pueden generar in vitro o in vivo.
Los métodos para generar esos anticuerpos son conocidos en la
técnica.
Los anticuerpos policlonales dirigidos contra
estos péptidos se generan inmunizando un animal adecuado, tal como
un ratón, rata, conejo, oveja o cabra, con el péptido de interés.
Con el fin de aumentar la inmunogenicidad, el péptido se puede unir
a un transportador antes de la inmunización. Los transportadores
adecuados son típicamente macromoléculas grandes, de metabolización
lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos,
ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de
aminoácidos, agregados lipídicos, (tales como gotitas de aceite o
liposomas) y partículas víricas inactivas. Esos transportadores son
muy conocidos por los que poseen una experiencia normal en la
técnica. Además, el péptido se puede conjugar con un toxoide
bacteriano, tal como un toxoide procedente de la difteria, el
tétanos o el cólera, etc., con el fin de aumentar su inmuno-
genicidad.
genicidad.
Los conejos, ovejas y cabras son los preferidos
cuando se desea obtener volúmenes grandes de sueros. Estos animales
constituyen unas buenas opciones de diseño también debido a la
disponibilidad de anticuerpos anti-conejo,
anti-oveja y anti-cabra marcados. La
inmunización generalmente se lleva a cabo mezclando o emulsionando
la proteína en disolución salina, preferiblemente en un adyuvante
tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando la muestra o
la emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o
intramuscular). El animal generalmente recibe una dosis de refuerzo
2 - 6 semanas más tarde, con una o más inyecciones de la proteína
en disolución salina, preferiblemente usando adyuvante incompleto de
Freund. Los anticuerpos también se pueden generar mediante una
inmunización in vitro usando métodos conocidos en la técnica.
Los antisueros policlonales se obtienen luego procedentes del
animal inmunizado.
Los anticuerpos monoclonales generalmente se
preparan usando el método de Kohler y Milstein, Nature (1975)
256:495-96, o una de sus modificaciones.
Típicamente, se inmuniza a un ratón o una rata según se ha descrito
anteriormente. Sin embargo, en vez de sacar la sangre al animal para
extraer el suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente varios
ganglios linfáticos grandes) y se disocia en células aisladas. Si se
desea, las células del bazo se pueden someter a escrutinio (después
de retirar las células inespecíficamente adherentes) aplicando una
suspensión de las células a una placa o a un pocillo revestidos con
el antígeno proteico. Las células B, que expresan la
inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno, se
unirán a la placa y no serán arrastradas por los lavados junto con
el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las
células del bazo disociadas, se inducen luego a que se fusionen con
células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un
medio selectivo (p. ej., medio de hipoxantina, aminopterina y
timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran en
placa por dilución límite, y se ensayan con respecto a la producción
de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante
(y que no se unen a antígenos no relacionados). Los hibridomas
seleccionados que secretan el anticuerpo monoclonal se cultivan
luego ya sea in vitro
(p. ej., en botellas para cultivo de tejidos o en reactores de fibra hueca), o in vivo (en forma de ascitis en ratones).
(p. ej., en botellas para cultivo de tejidos o en reactores de fibra hueca), o in vivo (en forma de ascitis en ratones).
Los fragmentos funcionales de los anticuerpos
inhibidores también encontrarán utilidad en la presente invención y
se pueden producir escindiendo una región constante, no responsable
de la unión a antígeno, de la molécula del anticuerpo, usando p.
ej., pepsina, para producir fragmentos F(ab')_{2}. Estos
fragmentos contendrán dos sitios de unión a antígeno, pero
carecerán de una porción de la región constante de cada una de las
cadenas pesadas. De manera similar, si se desea, se pueden producir
fragmentos Fab, que comprenden un único sitio de unión a antígeno,
p. ej., mediante digestión de anticuerpos policlonales o
monoclonales con papaína. También se pueden producir fragmentos
funcionales, que incluyen sólo las regiones variables de las cadenas
ligera y pesada, usando técnicas estándar. Estos fragmentos se
conocen como F_{v}.
También se pueden producir anticuerpos
quiméricos o anticuerpos humanizados para usar en la presente
invención. Estos anticuerpos se pueden diseñar de manera que
minimicen reacciones inmunológicas no deseadas atribuibles a
regiones constantes heterólogas y a regiones estructurales
variables, específicas de especie, típicamente presentes en los
anticuerpos monoclonales y policlonales. Por ejemplo, si los
anticuerpos se van a usar como inhibidores de IL8 en sujetos
humanos, se pueden crear anticuerpos quiméricos reemplazando
regiones constantes no humanas, en una de las dos cadenas, ligera o
pesada, o en ambas, con regiones constantes humanas, usando métodos
generalmente conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Winter, G. y
Milstein, C. (1991) Nature
349:293-299; Jones, P.T. y col. (1986)
Nature 321:522-
525; Riechmann, L. y col. (1988) 332:323-327; y Carter, P. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289.
525; Riechmann, L. y col. (1988) 332:323-327; y Carter, P. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289.
Las preparaciones anteriormente mencionadas se
pueden ensayar con respecto a su capacidad para unirse al receptor
IL8R2 y para modular una actividad mediada por un receptor de IL8,
usando ensayos conocidos. Las sustancias se pueden ensayar con
respecto a su capacidad por competir con IL8 por su unión al
receptor, usando ensayos de competición tales como los
radioinmunoensayos descritos en Gayle y col., J. Biol. Chem.
(1993) 268:7283-7289; y en LaRosa y col.,
J. Biol. Chem. (1992) 267:25402-25406
y en los ejemplos aquí incluidos. Que los compuestos que compiten
con IL8 interaccionan con el receptor se puede demostrar por medio
de los métodos anteriormente descritos. La capacidad de estas
moléculas para interaccionar con el dominio amino terminal
extracelular del receptor, se puede demostrar, también mediante los
métodos anteriormente descritos, usando por ejemplo receptores
quiméricos que se ha demostrado que se unen a IL8, que consisten en
un dominio amino terminal extracelular del receptor IL8R2 y en otro
receptor no relacionado.
Además, la capacidad de los inhibidores para
modular una actividad mediada por el receptor 2 de IL8 se puede
ensayar, según se ha explicado anteriormente, mediante la medida de,
p. ej., los niveles de Ca^{2+} citosólico libre, de las
concentraciones de IP_{3} intracelular y de los niveles de DAG
(véanse, p. ej., la Publicación internacional documento WO93/06229
(publicada el 1 de abril de 1993); Bazzoni, F. y col. (1991) J.
Exp. Med. 173:771-774; Peveri, P. y col.
(1988) J. Exp. Med. 167:1547-1559).
Otras medidas de una actividad mediada por IL8 incluyen ensayos
quimiotácticos en neutrófilos (véanse, p. ej., Schröder, J.M. y col.
(1987) J. Immunol. 139:3474-3483;
Fincham, N.J. y col. (1988) J. Immunol.
140:4294-4299; Larson, C.G. y col. (1989)
Science 243:1464-1466; Grob, P.M. y
col. (1990) J. Biol. Chem.
265:8311-8316; Stricter, R.M. y col. (1989)
J. Biol. Chem. 264:10621-10626);
ensayos de liberación de enzimas, tales como los ensayos de
actividad en PMN de liberación de peroxidasa, ensayos de liberación
de la \beta-glucuronidasa, liberación de O_{2},
según se determina mediante ensayos con citocromo C, y ensayos de
liberación de elastasa (véanse, p. ej., Schröder, J.M. y col.
(1987) J. Immunol. 139:3474-3483;
Peveri, P. y col. (1988) J. Exp. Med.
167:1547-1559).
Los anticuerpos inhibidores de la presente
invención, no son solamente útiles como moduladores de una actividad
de IL8, sino que se pueden usar para identificar genes homólogos de
receptores de IL8 en otras especies de vertebrados y para
inmunopurificar el receptor de IL8 procedente de fuentes que lo
producen. Por último, los anticuerpos se pueden usar también como
agentes de direccionamiento para suministrar otros agonistas y
antagonistas de IL8 a sitios de unión a IL8. Para hacer esto, los
anticuerpos se pueden conjugar a estos agentes o a proteínas de
fusión, incluyendo al menos la región de unión activa del
anticuerpo, unida al menos a una porción funcionalmente activa de
un inhibidor de IL8, y se pueden construir usando métodos de DNA
recombinante muy conocidos en la técnica.
Los inhibidores de la presente invención se
pueden proporcionar en composiciones farmacéuticas para inhibir la
unión de la IL8 a su receptor y para modular una respuesta biológica
mediada por un receptor de IL8. Las composiciones generalmente
incluirán uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente
aceptables" tales como agua, disolución salina, glicerol,
etanol, etc. Adicionalmente, en esos vehículos pueden estar
presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o
emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y sustancias
similares.
Las composiciones farmacéuticas comprenden una
cantidad inhibidora o moduladora efectiva de un inhibidor de IL8,
según se ha definido anteriormente. Las composiciones se
administran de manera convencional por vía parenteral, p. ej., por
medio de una inyección, ya sea por vía intravenosa, subcutánea,
intramuscular o intraperitoneal. Formulaciones adicionales
adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones
para administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones
transdérmicas. El tratamiento posológico puede seguir una pauta de
una dosis única o una pauta de dosis múltiples.
A continuación se presentan ejemplos de
realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención.
Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no
pretenden limitar el alcance de la invención en modo alguno.
Se ha hecho todo lo posible para garantizar la
exactitud en relación con las cifras utilizadas (p. ej., cantidades,
temperaturas, etc.), pero por supuesto que se debe permitir cierto
error y desviación experimental en ellas.
La síntesis de péptidos, la conjugación a
toxoides, la inmunización de ratones y ovejas, y la determinación
de la reactividad mediante un ensayo ELISA frente a un péptido
acoplado en alfileres y frente a un péptido revestido sobre placa
se llevaron a cabo en Chiron Mimotopes Pty. Ltd. (Clayton,
Victoria 3168, Australia) utilizando procedimientos estándar. En
particular, los péptidos que presentaban una homología sustancial
con porciones de la región amino terminal extracelular de los
receptores de IL8 humanos, IL8R1 e IL8R2, según se muestran en las
Tablas 1 y 2, se sintetizaron usando técnicas estándar. Algunos de
los péptidos (según se indica en las Tablas), se acoplaron a través
de un residuo interno de cisteína a una toxina para aumentar su
inmunogenicidad. Los grupos acetilo N-terminales o
los grupos
\beta-alanina-dicetopiperazine
C-terminales son grupos bloqueadores que imitan el
entorno de la secuencia peptídica dentro de la proteína.
Se generaron antisueros en ratones frente a los
péptidos núm. 1 y núm. 3, y se generaron en oveja frente al péptido
núm. 1 (Figura 1, Tabla 1). Se generaron antisueros contra el
dominio amino terminal extracelular de IL8R2 en ratones frente a
los péptidos núm. 6 y núm. 7 y en oveja frente a una mezcla de los
péptidos núm. 10, núm. 11, núm. 12, núm. 13 (Figura 1, Tabla 2).
Los inmunosueros, pero no los sueros previos a la inmunización ni
los antisueros generados frente a los péptidos núm. 6 y núm. 7,
mostraron un título alto frente al péptido(s) inmunizante
según se determinó mediante ELISA frente al péptido acoplado a
alfileres y/o revestido sobre placas. El fabricante citó
dificultades técnicas como explicación de la falta de
inmunorreactividad de los antisueros frente a los péptidos
inmunizantes núm. 6 y núm. 7. Estos antisueros particulares no se
siguieron usando y en su lugar se utilizaron los antisueros
generados contra los péptidos núm. 10 y núm. 13.
Los antisueros se usaron, o bien sin tratar, o
bien se purificaron mediante cromatografía en Proteína
G-Agarosa (Pharmacia) o mediante
cromatografía de afinidad sobre Sepharose con péptido núm. 1 (en el
caso de los inmunosueros anti-IL8R1) o sobre
Sepharose con péptido núm. 10 (en el caso de los inmunosueros
anti-IL8R2). Los péptidos conjugados con
Sepharose se prepararon en Chiron Mimotopes.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos se ensayaron con respecto a su
capacidad para reconocer neutrófilos como se expone a continuación.
Los neutrófilos se aislaron procedentes de sangre completa usando el
medio de aislamiento de neutrófilos (NIM) (del inglés,
" Neutrophil Isolation Media")
(Cardinal), esencialmente de la manera descrita por el fabricante
con las siguientes modificaciones. Se centrifugaron 20 ml de NIM y
30 ml de sangre en tubos de 50 ml durante 50 minutos. Los glóbulos
rojos contaminantes se eliminaron mediante lisis en agua enfriada
con hielo. Los neutrófilos resultantes se resuspendieron en
disolución salina tamponada de Hank (HBS) (del inglés,
" Hank's Buffered Saline") y se
almacenaron sobre hielo.
Los neutrófilos se incubaron y se sometieron a
un análisis de FACS como se expone a continuación. Los neutrófilos
se tiñeron para el análisis de FACS resuspendiendo 1 x 10^{6}
células en 50 \mul de IgG previa a la inmunización (Figuras 2A y
2C), de IgG anti-péptido IL8R1 (Figura 2B) o de IgG
anti-péptido IL8R2 (Figure 2D), procedentes de
oveja, cada una de ellas diluida en proporción 1:150 en PBS + BSA al
1%. Las células se incubaron 2 horas sobre hielo, se centrifugaron
a 1.000 RPM durante 5 minutos y después se lavaron dos veces con PBS
+ BSA al 1%. Las células lavadas se resuspendieron en 50 \mul de
anticuerpo IgG (cadena pesada + cadena ligera)
anti-oveja, procedente de conejo, fragmento
F(ab')_{2}, conjugado con FITC (en proporción 1:100 en PBS
+ BSA al 1%, Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las
células se incubaron 1 hora sobre hielo, se centrifugaron a 1.000
RPM durante 5 minutos, se lavaron en PBS + BSA al 1% y después se
lavaron en PBS. Las células que iban a ser analizadas se
resuspendieron inmediatamente en 500 ml de PBS. Se añadió yoduro de
propidio en una concentración de 2,5 ng/ml como tinción de
viabilidad. Los neutrófilos se pudieron fijar en paraformaldehído al
1% y analizar en un plazo máximo de hasta 72 horas más tarde. Las
células marcadas se analizaron en un FACSCAN (Becton
Dickinson).
\newpage
Como se puede observar en la Figura 2, los
antisueros dirigidos contra el péptido núm. 1 de IL8R1 (Figura 2B)
o contra los péptidos núms. 10 - 13 de IL8R2 (Figura 2D), que
contienen el dominio amino terminal extracelular, pero no los
antisueros previos a la inmunización (Figuras 2A y 2C), reconocieron
a los neutrófilos. Esto indica que los antisueros generados contra
péptido(s) procedentes del dominio amino terminal
extracelular de los receptores de IL8 son capaces de reconocer al
receptor natural. El antisuero generado contra el péptido núm. 3 de
IL8R1, a pesar de su alto título contra el péptido inmunizante, no
reconoció a los neutrófilos (datos no mostrados). Este resultado no
da indicación alguna sobre el papel de la secuencia del péptido núm.
3 de IL8R1 en el reconocimiento de ligandos, sino que significa
únicamente que el péptido núm. 3 no se encontraba presente en
cantidades suficientes en una conformación mimética a la del
receptor como para inducir la generación de anticuerpos
anti-receptor, en contraposición a los anticuerpos
anti-péptido exactos. Los antisueros generados
contra el péptido núm. 6 o contra el péptido núm. 7 de IL8R2
mostraron un título bajo frente a los péptidos inmunizantes y no se
siguieron usando.
Los anticuerpos se ensayaron con respecto a su
capacidad para bloquear la unión de IL8 a su receptor como se
explica a continuación. Los IL8R1 e IL8R2, de uso en los ensayos de
unión a receptor, se produjeron mediante técnicas recombinantes. El
DNA que codifica IL8R1 e IL8R2 se aisló a partir de DNA genómico
humano mediante PCR usando cebadores oligonucleotídicos basados en
secuencias publicadas de IL8R1 (Holmes y col. Science (1991)
253:1278) y de IL8R2 (Murphy y Tiffany, Science (1991)
253:1280). La secuencia de nucleótidos de los genes aislados
se confirmó mediante secuenciación dideoxi.
La secuencia que codifica IL8R1 (en el vector
pVL1392 de transferencia a baculovirus, Invitrogen) o la secuencia
que codifica IL8R2 (en el vector pAcC13 de transferencia, descrito
en Munemitsu y col. Mol. Cell. Biol. (1990) 10:5977)
se recombinó en el baculovirus Autographa california (AcNPV)
mediante la cotransfección de células Sf9 con 2 \mug de vector
recombinante de transferencia del receptor y con 0,5 \mug de DNA
vírico de tipo salvaje, linearizado, según se ha descrito (Kitts y
col., Nuc. Acids. Res. (1991) 18:5667). Los
baculovirus recombinantes se aislaron mediante purificación de las
placas de lisis (Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983)
3:2156). Los cultivos en suspensión de \sim1,5 x 10^{6}
células Sf9 por ml se recogieron para su análisis después de 40
horas - 48 horas de la infección con la preparación madre del
baculovirus relevante a un valor de MOI de 2 - 10, en medio libre
de suero (Maiorella y col. Biotech. (1988)
6:1406).
Células Sf9 de insectos se infectaron con un
baculovirus recombinante que portaba IL8R1 o IL8R2 y se sembraron
en placas de cultivo Remova, de 96 pocillos, en medios ExCell 400. A
las 40 horas - 48 horas después de la infección, el medio de
cultivo se retiró y las monocapas de células se pretrataron durante
1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo, en tampón de unión de
Hepes-BSA (Hepes 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM,
CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, albúmina de suero bovino en
concentración de 1 mg/ml). Se añadió ^{125}I-IL8
hasta obtener una concentración final 0,2 nM y la incubación se
continuó a temperatura ambiente durante 3 horas. Las células se
lavaron una vez con el tampón de unión de Hepes-BSA
y se determinó la ^{125}I-IL8 unida mediante
medida de las cuentas de radiación gamma. La unión inespecífica se
midió en presencia de una concentración de 1 \mug/ml de IL8 no
marcada. Los datos son la media de determinaciones por
duplicado.
El antisuero contra el péptido núm. 1 de IL8R1,
pero no el antisuero previo a la inmunización, bloqueó la unión de
^{125}I-IL8 a los receptores IL8R1 expresados en
las células SF9 infectadas con el baculovirus recombinante (Figura
3). El antisuero contra el péptido núm. 1 de IL8R1 no inhibió la
unión de IL8 a IL8R2 (Figura 5). Por lo tanto este antisuero
neutralizaba específicamente la unión de IL8 a IL8R1. El epítopo
presente en el IL8R1 reconocido por los anticuerpos
anti-péptido núm. 1 de IL8R1 está cerca de, o se
solapa con, el sitio de reconocimiento para IL8 presente en
IL8R1.
La capacidad de los anticuerpos
anti-péptido núm. 1 de IL8R1 para neutralizar la
unión de IL8 a su receptor fue anulada por un exceso de péptido
núm. 1 de IL8R1, lo que confirma la especificidad del antisuero
(Figura 4). Por lo tanto, los epítopo(s) responsables de la
neutralización de la unión de IL8 están contenidos dentro de la
correspondiente región del IL8R1, residuos de aminoácidos 1 - 15 del
dominio amino terminal extracelular. Estos resultados sugieren que
el dominio amino terminal extracelular de IL8R1 está implicado en el
reconocimiento de la IL8.
El antisuero contra el material reunido de los
péptidos núms. 10 - 13 de IL8R2, pero no el antisuero previo a la
inmunización, bloqueó la unión de ^{125}I-IL8 a
los receptores IL8R2 expresados en células Sf9 infectadas con el
baculovirus recombinante. El antisuero contra los péptidos núms. 10
- 13 de IL8R2 no inhibió la unión de IL8 a IL8R1 (Figura 3). Por
lo tanto, este antisuero neutralizaba específicamente la unión de
IL8 a IL8R2 y reconocía el epítopo(s) cercano a, o que
solapa con, la secuencia de reconocimiento para IL8 de IL8R2.
El antisuero contra los péptidos núms. 10 - 13
se fraccionó mediante una cromatografía de afinidad en presencia de
péptido núm. 10. Los anticuerpos contra el péptido núm. 10 de IL8R2
inhibieron la unión de la IL8 a sus receptores IL8R2 expresados en
células Sf9 (Figura 6). El péptido núm. 10 libre bloqueó la
neutralización producida por este anticuerpo y confirmó que el
péptido núm. 10 incluye un epítopo(s) situado en, o cercano
a, el sitio de reconocimiento para IL8 presente en IL8R2 (Figura 6).
Este epítopo corresponde a un epítopo(s) neutralizante
contenido en la región de los residuos de aminoácidos 1 - 15 de
IL8R2. El agotamiento de los anticuerpos
anti-péptido núm.10 no anuló la capacidad del
antisuero anti-péptido de IL8R2 para inhibir la
unión de IL8 a IL8R2 (datos no mostrados). Esto indica que existe un
epítopo(s) adicional contenido en la parte restante de la
región amino terminal extracelular de IL8R2, residuos de aminoácidos
16 - 41, que también contribuye a la actividad neutralizante del
antisuero anti-péptido IL8R2. Estos resultados
sugieren que los aminoácidos 1 - 41 del dominio amino terminal
extracelular de IL8R2 incluyen secuencias implicadas en el
reconocimiento de IL8.
Así pues, se describen nuevos inhibidores de
IL8, así como métodos para el uso de los mismos. Aunque las
realizaciones preferidas de la presente invención se han descrito
con cierto detalle, se entiende que se pueden realizar
modificaciones obvias dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
<110> Chiron Corporation
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS INHIBIDORES DE IL8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> N71056A JCI/TJD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 02017044.5
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
29-07-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido de la terminación amino de
IL8R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Péptido de la terminación amino de
IL8R2
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<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido de la terminación amino de
IL8R2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido de la terminación amino de
IL8R2
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido de la terminación amino de
IL8R2
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Péptido modificado de la terminación
amino de IL8R1
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<220>
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<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
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<223> La posición terminal incluye un
grupo amino
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
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<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa =
beta-alanina
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El aminoácido terminal incluye un
grupo dicetopiperizo
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<223> Péptido modificado de la terminación
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residuo)
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<223> La posición terminal incluye un
grupo amino
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<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
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residuo)
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<212> PRT
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amino de IL8R1
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residuo)
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<223> La posición terminal incluye un
grupo amino
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residuo)
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beta-alanina
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<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
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<223> El aminoácido terminal incluye un
grupo dicetopiperizo y tiopropil-Sepharose
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amino de IL8R1
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residuo)
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<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
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grupo dicetopiperizo
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amino de IL8R1
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residuo)
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grupo acetilo
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residuo)
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beta-alanina
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residuo)
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residuo)
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grupo amino
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residuo)
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residuo)
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residuo)
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grupo acetilo
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residuo)
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incluye dicetopiperazina
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amino de IL8R2
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residuo)
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grupo amino
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residuo)
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residuo)
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<223> La posición terminal incluye un
grupo acetilo
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residuo)
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<223> El aminoácido terminal incluye un
grupo un grupo amida
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residuo)
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<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
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<223> El aminoácido terminal incluye un
grupo amida
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amino de IL8R2
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residuo)
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residuo)
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<223> El aminoácido terminal incluye
dicetopiperazina y tiopropil-Sepharose
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<223> Péptido modificado de la terminación
amino de IL8R2
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residuo)
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grupo acetilo
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residuo)
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<223> Xaa = beta-alanina e
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido modificado de la terminación
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residuo)
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<223> La posición terminal incluye un
grupo acetilo
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grupo un grupo amida
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<212> PRT
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<221> MOD RES (Modificación de un
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
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<223> El aminoácido terminal incluye un
grupo amida
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido modificado de la terminación
amino de IL8R2
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residuo)
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<222> (1)...(1)
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<223> La posición terminal incluye un
grupo acetilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = beta-alanina e
incluye dicetopiperazina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido modificado de la terminación
amino de IL8R2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La posición terminal incluye un
grupo acetilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES (Modificación de un
residuo)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El aminoácido terminal incluye un
grupo un grupo amida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminación amino de IL8R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminación amino de IL8R2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
Claims (5)
1. Un inhibidor de la unión al receptor 2 de
IL8, que comprende un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que es
capaz de interaccionar con el dominio amino terminal extracelular
del receptor 2 de IL8 y que es capaz de competir con IL8 por la
unión al receptor, en el que el anticuerpo se puede obtener
inmunizando a un mamífero con un inmunógeno que consiste en un
polipéptido seleccionado entre
F-E-D-F-W-K-G-E-D-L-S-N-Y-S-Y,
S-S-T-L-P-P-F-L-L-D-A-A-P-C
y
F-L-L-D-A-A-P-C-E-P-E-S-L-E-I.
2. Una composición farmacéutica para modular una
respuesta biológica mediada por el receptor 2 de IL8, que comprende
un inhibidor de la unión al receptor 2 de IL8 según la
reivindicación 1, en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
3. Un inhibidor de la unión al receptor 2 de IL8
según la reivindicación 1, para usar en un método de tratamiento de
un organismo humano o animal.
4. Uso de un inhibidor según la reivindicación
1, en la fabricación de un medicamento para usar en un método de
tratamiento que comprende inhibir la unión de IL8 al receptor 2 de
IL8.
5. Uso de un inhibidor según la reivindicación
1, en la fabricación de un medicamento para usar en un método de
tratamiento que comprende modular una respuesta biológica mediada
por el receptor 2 de IL8.
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