KR100490687B1 - Rsvf-단백질에특이적인고친화성인간모노클로날항체 - Google Patents

Abstract

생체외에서 인간의 비장세포의 초회항원자극과 SCID 마우스에서의 항원 추가접종을 결합시킨 특히 RSV 융합 단백질에 특이적인 인간 항체를 매우 효과적으로 생성시키는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에 의하면 주로 목적하는 항원에 매우 특이적이고 친화성인 항체를 포함하는 IgG 이소타입인 인간 항체가 매우 높은 역가로 제공된다. 이 방법은 조합 인간 항체 유전자 라이브러리의 생성을 위한 인간 세포에 관한 구제 뿐만 아니라, 치료적 및 진단적 응용을 위한 인간의 단일클론성 항체를 생성시키기에 매우 적합하다. 각각 RSV-F 단백질에 대해 ≤2x10^-9몰의 친화력을 갖는 두 인간 단일클론성 항체, RF-1 및 RF-2뿐만 아니라, 그들의 상당하는 아미노산 및 DNA 서열이 개시되어 있다. 이러한 항체들은 RSV 감염의 치료 또는 예방 뿐만 아니라, 분석물에서 RSV의 진단을 위해 치료적 및 예방적으로 사용될 수 있다.

Description

ＲＳＶ Ｆ-단백질에 특이적인 고친화성 인간 모노클로날 항체 {HIGH AFFINITY HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR RSV F-PROTEIN}

호흡기 합포체 바이러스(RSV)는 상하 호흡기관에 일반적으로 감염되는 뉴모바이러스(Pneumovirus)속의 파르믹소바이러스(Parmixovirus)이다. 이러한 바이러스는 전염성이 있어 2세까지는 많은 비율의 어린이들이 상기 바이러스에 감염되고 있다. 또한, 4세부터는 실질적으로 모든 인간이 상기 RSV에 대한 면역성이 있다.

전형적으로는, RSV 감염증은 미약한 증상을 나타내며, 상부 기도에 편재되어 유지되고, 광범위한 치료를 요하지 않는 일반적인 감기와 유사한 증상을 유발시킨다. 그러나, 어떠한 대상, 예를 들어, 유아, 어린이 또는 심폐 질환을 앓고 있는 환자의 경우에 있어서는, 바이러스가 하부 기도로 침투하여, 입원치료를 받아야 되고 호흡상의 보조를 요하게 된다. 이러한 경우 중의 어떠한 경우에는, 상기 감염증이 영구적인 폐 손상을 유발시킬 수 있으며, 치명적일 수도 있다. 미국에서만 해도, RSV로 인해 매년 약 90,000명이 입원치료를 받고 있고, 약 4500명이 사망하고 있다.

RSV는 결합 당단백질, G와 연관된 혈청학적인 상이성을 근거로 하여 두가지의 주요 균주 서브그룹, A 및 B로 나타난다. 주요 표면 당단백질, 즉, 90kD G 단백질은 분리물들 사이의 아미노산 수준에서 50%까지 다를 수 있다[문헌: Johnson et al., Proc. Natl. Acad Sci., (1987), 84, 5625-5629]. 반면, 잠재적인 치료학적 표적인 70kD 융합(F) 단백질은 아미노산 수준에 있어서 다양한 RSV 균주에 걸쳐서, 약 89%로 아주 잘 보존된다[문헌: Johnson et al., J. Gen. Virol.,(1988), 69, 2623-2628, Johnson et al., J. Virol., (1987), 10, 3163-3166, P.L. Collins, Plenum Press, NY (1991), 103-162]. 또한, 주어진 형태의 F-단백질에 대하여 유도된 항체는 그밖의 형태와 교차반응적이라는 것이 공지되어 있다.

F-단백질은 각각 48kD 및 32kD의 이황화물 결합된 단편으로 이루어지는 선형의 전구체로부터 생성된 이종이량체이다[문헌: Walsh et al., J. Gen. Virol, (1985), 66, 401-415]. 폴리클로날 항체에 의한 합포체 형성의 억제는 23kD 단편에 대한 현저한 반응과 연관된다.

주지되는 바와 같이, RSV 감염증은 일반적으로 미약하지만, 어떠한 환자의 경우에 있어서는 RSV 감염증이 치명적일 수 있다. 현재, 심각한 RSV 감염증은 항바이러스제 리바바린(Ribavarin)를 투여함으로써 치료되고 있다. 그러나, 리바바린은 RSV 감염증을 조절하는데 어떠한 효능을 나타내지만, 이의 용도는 몇가지 이유로 인해 만족스럽지 못한 상태이다. 예를 들어, 리바바린은 고가이며 병원에서만 투여될 수 있다. 그밖의 공지된 RSV 치료제는 RSV 감염증의 증상만을 치료하고, 기관지염을 앓고 있는 환자에서는 에어러졸화된 기관지 확장제와 함께 사용하고, 기관지염 및 RSV 폐렴을 앓고 있는 환자에서는 코르티코스테로이드 치료와 병행한다.

현재까지, 항바이러스 방어 항체를 부스팅시키고자 하는 RSV 백신은 크게 성공하지 못하였다. 예를 들어, 약 25년전에 시험된 포르말린 불활성화 RSV를 기본으로 하는 백신은 융합 억제활성이 결핍된 항체를 유도하였으며[문헌: Murphy et al., Clinical Microbiology (1988), 26, 1595-1597], 때로는 질환을 악화시키기도 하였다. 이러한 결과는 포르말린 불활성화된 바이러스의 보호 항체를 유도할 수 없는 능력으로 설명될 수 있을 것이다. 고도의 항체 역가가 백신 수용체에서 측정되지만, 특정의 보호역가는 대조구에서 보다도 낮다. 이러한 결과는 포르말린 불활성화된 RSV가 보호항체를 유도하는데 요구되는 필요한 형태상의 에피토프를 나타내지 않기 때문이다.

오늘날까지 공지된 효과적인 RSV 백신은 없지만, 항체 치료법이 RSV 감염증에 대한 감수성 환자를 보호할 수 있고 기존의 RSV 감염증을 치료할 수 있다는 약간의 임상증거가 있다. 예를 들어, 신생아는 심각한 기관지염에 대하여 낮은 발병율을 보이고 있는 것으로 보고되어 있다. 이러한 결과는 보호성 모체 항체의 존재에 기인되는 것으로 가정되고 있다[문헌: Ogilvie et al., J. Med. Virol(1981), 7, 263-271]. 또한, 재감염으로 면역된 어린이는 통계적으로 재감염된 인간보다 더 항-F-단백질 역가를 나타낸다. 게다가, 고역가 RSV-면역 공여체로부터 제조된 정맥내 면역 글로블린(IVIG)는 비내 RSV 분비를 감소시키고, 산소화를 개선시킨다[문헌: Hemming et al., Anti. Viral Agents and Chemotherapy (1987), 31, 1882-1886]. 또한, 최근의 연구에서는 상기 바이러스가 퇴치될 수 있으며, RSV-풍부화된 면역 글로블린(RSVIG)를 투여함으로써 폐의 손상을 억제할 수 있음을 제시하고 있다[문헌: Groothuis et al., The New England J. Med. (1993), 329, 1524-1530, K. McIntosh, The New England J. Med. (1993), 329, 1572-1573, J. R. Groothuis, Antiviral Research, (1994), 23, 1-10, Siber et al, J. infectious Diseases (1994), 169, 1368-1373, Siber et al, J. Infectious Diseases (1992), 456-463].

유사하게, 몇가지의 동물 연구에서는 바이러스 중화 항체에 의한 항체 치료는 RSV에 대하여 보호될 수 있게 하거나 기존의 RSV 감염증을 퇴치할 수 있음을 제시하고 있다. 예를 들어, 생체외 중화 마우스 모노클로날 항체는 마우스를 감염으로부터 보호할 수 있고, 확립된 RSV 감염증을 제거할 수 있는 것으로 보고되었다[문헌: Taylor et al, J. Immunology, (1984), 52, 137-142, Stott et al., "Immune Responses, Virus Infections and Disease, I.R.L. Press, London (1989), 85-104]. 또한, RSV의 F-단백질에 대한 모노클로날 항체는 생체외 및 생체내 RSV 모델에서 높은 효능을 나타내고 있다[문헌: Tmpest et al., Bio/Technology, (1991), 9, 266-271, Crowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), 91 1386-1390, Walsh et al., Infection and Immunity, (1984), 43, 756-758, Barbas III, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1992), 89, 10164-10168, Walsh, et al., J. Gen. Virol., (1986), 67, 505-513]. 520 내지 2000㎍/체중㎏ 만큼 적은 항체 농도가 동물연구에서 거의 일정한 회복을 유도하는 것으로 보고되었다[문헌: Crowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), 91, 1386-1390]. 또한, 이들 모노클로날 항체는 실험실 균주 및 야생형 균주를 포함한 A 및 B 균주를 중화시키는 것으로 공지되어 있다. 이러한 항체는 주입[문헌: Groothuis et al, The New England J. Med., (1993), 329, 1524-1530, Siber et al, J. Infectious Diseases, (1994), 169, 1368-1373] 또는 에어러졸[문헌: Crowe et al, Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), 91, 1386-1390]로 투여된다.

RSV F-단백질에 대한 두 가지의 상이한 형태의 효능적인 치료학적 모노클로날 항체는 본 발명 이전에 이미 문헌에 기재되어 있는데, 이러한 항체는 인간화된 쥐 항체[문헌: Tempest et al, Biol. Technology, (1991) 9, 266-271, 또는 실제로 인간 항체(Fab 단편)[문헌: Barbas III, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., (1992), 89, 10164-10168]이다. 인간화된 쥐 항체는 교차 균주 중화 쥐 항-F-단백질 항체를 유전성 인간 Fc 뿐만 아니라, 가변부의 구조부위에 CDR 이식을 수행함으로써 생성된다. 인간 Fab 단편은 HIV 양성 공여체(면역손상됨)로부터 수득한 인간 골수 세포를 사용하여 조합 라이브러리 기술로 생성된다. 인간화된 RSV 항체 및 인간 RSV 항체의 생체내 치료학적 역가는 각각 5 및 2 ㎎/체중㎏이다. 그러나, 인간화된 항체는 합포체 억제 검정에서 시험되는 반면에, 인간 항-RSV Fab 단편은 이들의 바이러스 중화 활성을 측정하도록 검정된다. 따라서, 인간화된 항체 및 인간 항-RSV 항체에 관해 보고된 결과는 직접 비교할 수 없다.

조합 라이브러리 기술에 의해 생성된 Fab 단편은 에어러졸에 유용한 것으로 공지되어 있다. 이러한 유용성은 아마도 비교적 작은 크기의 분자 때문일 것이다. 이러한 결과는 RSV 백신을 위한 주요 목적군이 유아이기 때문에 아주 유용하다. 따라서, 에어러졸은 특히 바람직한 투여 방식이다.

그러나, RSV에 특이적인 인간화된 단편 및 Fab 단편에 대해 앞서 공개된 보고에도 불구하고, 개선된 치료학적 효능을 지닌 개선된 항-RSV 항체, 특히, RSV 감염을 효과적으로 중화시키고 방지하는 RSV F-단백질에 대한 높은 친화성 및 특이성을 지니는 개선된 항-RSV 항체가 여전히 요구되고 있다.

항체 치료법은 두가지의 원리적으로 상이한 활성으로 구분되는데, 한가지는 (i) 온전한 비표지된 항체 또는 표지된 항체를 사용한 수동 면역치료법이고, 다른 한 가지는 (b) 자가면역에서의 네트워크 균형을 재정착시키는 항-이디오타입을 이용한 능동 면역치료법으로 구분된다.

수동 면역 치료법에서는, 네이키드(naked) 항체를 투여하여 항원을 중화시키거나 표적된 막 관련 항원에 대한 이펙터의 기능을 유도한다. 중화는 림포킨(lymphokine), 호르몬, 또는 아나필락톡신 즉, C5a로 이루어진다. 이펙터의 기능에는 상보성 고정화, 매크로파아지(macrophage) 활성화 및 보충, 및 항체 의존 세포 중재된 세포독성(ADCC)이 포함된다. 네이키드 항체는 백혈병을 치료하는데 유용하고[문헌: Ritz et al, S.F. Blood, (1981), 58, 141-152 ], GD2에 대한 항체는 신경모세포[문헌: Schulz et al, Cancer Res., (1984), 44:5914] 및 흑색종[문헌: Irie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1986), 83:8694]의 치료에 사용된다. 또한, 높은 항-RSV 역가를 지닌 정맥내 면역 감마 글로블린(IVIG) 항체는 RSV 감염으로 유발된 호흡 장애를 치료하기 위한 실험목적으로 사용된다[문헌: Hemming et al, Anti. Viral Agents and Chemotherapy, (1987), 31, 1882-1886, Groothuis et al., The New England J. Med., (1993), 329, 1524-1530, K. McIntosh, The New England J. Med., (1993), 329, 1572-1573, J. R. Groothuis, Antiviral Resaerch, (1994), 23, 1-10, Siber et al, J. Infectious Diseases, (1994), 169, 1368-1373].

모노클로날 항체의 치료학적 효과는 예를 들어, 항원에 결합된 항체의 양, 반응성, 특이성 및 종류를 포함하는 인자에 좌우된다. 또한, 항체의 생체내 반감기는 아주 중요한 치료학적 인자이다.

항체의 치료효능에 현저한 영향을 줄 수 있는 또 다른 인자는 이들 항체의 기원이되는 종이다. 현재, 면역치료에 사용된 모노클로날 항체는 거의 전부 설치동물로부터의 항체[문헌: Schulz et al., Cancer Res., (1984), 44:5914, Miller et al., Blood, (1981), 58, 78-86, Lanzavecchia et al., J. Epd. Med., (1988), 167, 345-352, Sikora et al., Br. Med. Bull., (1984), 40:240, Tsujisaki et al., Cancer Research, (1991), 51:2599]인데, 그 이유는 대부분의 설치류의 모노클로날 항체의 생성이 잘 특성확인되어 있고 아주 효능적인 기술이기 때문이다[문헌: Kohler et al., Nature, (1995), 256:495, Galfre et al., Nature, (1977), 266:550]. 그러나, 설치류 모노클로날 항체가 치료 효능을 지니기는 하지만, 이들은 인간항체와 관련하의 제한 및 단점이 있을 수 있다. 예를 들어, 이들은 숙주 이펙터 기능(CDCC, 또는 ADCC등)의 서브 최적의 자극을 유도한다. 또한, 쥐 항체는 인간 항-쥐-항체(HAMA) 반응을 유도한다[문헌: Schroff et al., Can. Res., (1985, 45:879-885, Shawler et al., J. Immunol., (1985), 135:1530-1535]. 이러한 유도는 항체 반감기를 단축시키며[문헌: Dillman et al., Mod., (1986, 5, 73-84, Miller et al., Blood, (1983), 몇몇의 경우에 있어서는, 혈청 질환 및 과민증과 같은 부작용이 유발될 수 있다.

어떠한 대상 예를 들어, 과다하게 면역억제된 대상(예, 과중한 화학 또는 방사선 중재된 암치료를 받은 환자)[문헌: Irie etal., Proc. Natl. Acad. Sci., (1986), 83:8694, Dillman et al., Mod., (1986), 5, 73-84, Koprowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1984), 81:216-219]에서, 쥐의 모노클로날 항체를 사용하면 제한된 음성 부작용이 유발된다. 반면, 정상 또는 과민성 면역 시스템을 앓고 있는 환자에서, 적어도 어떠한 질환상태에 대하여 쥐 항체는 제한된 효능을 나타낼 수 있다.

쥐의 모노클로날 항체의 한계를 해소시키기 위한 연구에서는, 재조합된 DNA 기술이 적용되어 키메라 항체[문헌: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1984), 81:216-219, Boulianne et al., Nature, (1984), 312, 644-646], "CDR 이식"에 의한 인간화된 항체[문헌: Riechmann et al., Nature, (1984), 332, 323-327], 및 항원성이 완화되거나 제거되도록 특이적 표면 잔기를 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성시킨 "인공(veneered)" 항체를 생성시키고 있다.

그러나, 상기 항체가 임상에서 성공적으로 사용되고 있지만[문헌: Gillis et al., J. Immunol. Meth., (1989), 25:191], 그러한 항체는 생성시키기가 번거로운 것으로 입증되고 있다. 그러한 이유는 최적의 항원인식 및 친화성이 아직 이해되지 않고 있기 때문이다. 또한, 인간 프레임워크와 마우스 CDR 영역은 항체 활성에 음성의 효과를 나타내면서 공간적으로 상호 작용한다. 또한, 그러한 항체는 여전히 환자에서 강한 HAMA를 유도한다.

인간 항체는 쥐의 항체에 비해 주요 이점을 나타낸다; 인간 항체는 임의의 이펙터 기능을 나타내고, HAMA 반응을 나타내지 않으며, 숙주 항원 특이적 항체가 크세노겐(xenogen) 면역 시스템에 의해 인식되기에 적합할 수 있는 치료적 수치의 에피토프를 동정할 수 있을 것이다[문헌: Lennox et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, "London: Academic Press(1982)].

인간 항체가 아주 바람직하기는 하지만, 이러한 생성은 도덕상의 문제 및 인간 항체를 생성시키는 통상의 방법이 종종 비효율적이라는 사실을 포함한 다양한 인자에 의해 비효율적이다. 예를 들어, 인간은 도덕상 및 안전상의 이유로 대부분의 항원으로 충분히 면역화될 수 없다. 따라서, 특정의 항원에 대한 유용한 친화성, 10⁸몰 이상을 지닌 인간 모노클로날 항체를 분리하고 있는 보고서는 거의 없다[문헌: McCabe et al., Cancer Research, (1988), 48, 4348-4353]. 또한, 공여체 프라이밍 세포로부터의 항-바이러스 인간 모노클로날 항체를 분리하는 것은 바람직하지 못한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 고니(Gorny)는 HIV 양성 공여체로부터의 말초혈액 단핵 세포(PMBC)의 14,329 EBV 형질전환된 배양물중의 단지 7 EBV 형질전환된 배양물만이 안정한 특정의 항-HIV 항체 생성 세포주를 생성시킨다고 보고하였다[문헌: Gorny et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1989), 86:1624-1628].

현재까지, 대부분의 인간 항-종양 항체는 말초혈액 림프구(PBLs)[문헌: Irie et al., Br. J. Cancer, (1981), 44:262], 또는 암환자로부터의 종양 배출 림프절 림프구[문헌: Schlom et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1980), 77:6841-6845, Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1983), 80:2026-2030]에서 생성되고 있다. 그러나, 그러한 항체들은 종종 세포내 반응을 하고 그로 인해, 치료학적으로 바람직하지 못한 항체[문헌: Ho et al., In Hybridoma Technology, Amsterdam, (1988), 37-57]이거나, IgM 클래스[문헌: McCable et al., Cancer Research, (1988), 48, 4348-4353]로 IgG 보다 고형의 종양을 침투하는 능력이 적은 항체 클래스이다. 이들 인간 항체중에 임상시험이 수행된 항체가 거의 없어, 분리된 항체가 서브 최적의 특성을 보유하고 있음을 제시하고 있다. 또한, 이러한 연구는 시험 공여체 프라이밍된 B 세포를 사용하기 때문에, 이들 세포가 유용한 모노클로날항체를 분리하는데 최적의 공급원이 아니라는 것을 나타내고 있다.

최근, 프라이밍된 공여체로부터의 인간 항체를 생성시키는 것은 인간 B 세포의 증식으로 생성되는 CD40으로의 자극[문헌: Banchereau et al., F. Science,(1991), 251:70, Zhang et al., J. Immunol., (1990), 144, 2955-2960, Tohma et al., J. Immunol., (1991), 146:2544-2552], 또는 불멸화를 위한 생체외 추가접종 단계 프라이머[문헌: Chaudhuri et al., Cancer Supplement,(1994), 73, 1098-1104]에 의해 개선되어 왔다. 이러한 원리는 다른 방법(32)으로 얻은 수율 보다 현저하게 높은 수율을 얻으면서, 프라이밍된 공여체(42-44)로부터의 세포로 사이토메갈로바이러스, 에프슈타인-바 바이러스(EBV) 및 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza)에 대한 인간 모노클로날 항체를 생성시키는데 이용되어 왔다.

또한, 공여체 프라이밍의 한계를 처리하기 위해서, 건강한 공여체로부터의 림프구를 생체외 면역화 및 배양하는 것이 보고되어 있다. 프라이밍된 공여체로부터의 PBL 세포의 호민(homine)외 추가접종을 이용하여 인간 모노클로날 항체를 생성시키는데 약간의 성공이 있었다고 보고하고 있다[문헌: Maeda et al., Hybridoma,(1986), 5:33-41, Kozbor et al., J. Immunol., (1984), 14:23, Duchosal et al., Nature,(1992, 355:258-262]. 생체외 면역의 용이성은 쥐의 림프구를 이용하는 문헌[Mishell and Dutton Mishell et al., J. Exp. Med., (1967), 126:423-442]에 의해 1967년에 처음으로 입증되었다. 1973년에, 호프만(Hoffman)은 인간 림프구를 성공적으로 면역화시켰다[문헌: Hoffman et al., Nature, (1973), 243:408-410]. 또한, 말초혈액[문헌: Luzzati et al., J. Exp. Med., (1975), 144:573:585, Misiti et al., J. Exp. Med., (1981), 154:1069-1084, Komatsu et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immunol., (1986), 80:431-434, Ohlin et al., C.A.K. Immunology, (1989), 68:325(1989)], 편도선[문헌: Strike et al., J. Immunol., (1978), 132:1789-1803], 및 비장으로부터의 림프구에 의한 성공적인 일차 면역화가 보고되었다. 상기 비장은 외상(外傷)[문헌: Ho et al., In Hybridoma Technology, Amsterdam(1988), 37-57, Boerner et al., J. Immunol., (1991), 147:86-95, Ho et al., J. Immunol., (1985), 135:3831-3838, Wasserman et al., J. Immunol. Meth., (1986), 93:275-283, Wasserman et al., J. Immunol. Meth., (1986), 93:275-283, Brams et al., Hum. Antibod. Hybridomas, (1993), 4, 47-56, Brams et al., Hum. Antibod. Hybridomas,(1993), 4, 57-65], 및 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP) 환자[문헌: Boerner et al., J. Immunol., (1991), 147:86-95, Brams et al., Hum. Antibod. Hybridomas,(1993), 4, 47-56, Brams et al., Hum. Antibod. Hybridomas,(1993), 4, 57-65, McRoberts et al., " In Vitro Immunization in hybridoma Technology", Elsevier, Amsterdam(1988), 267-275, Lu et al., P. Hybridoma, (1993), 12, 381-389]로부터 얻었다.

생체외 면역은 상당한 이점이 있다. 예를 들어, 용이하게 재현가능한 면역화는 적절한 배양 및 조작 기술에 의해 항체 클래스를 용이하게 처리되게 한다[문헌: Chaudhuri et al., Cancer Supplement,(1994), 73, 1098-1104]. 또한, 생체내 자가 항원에 대한 내성은 IVI 동안 우세하지 않다[문헌: Boerner et al., J. Immunol., (1991), 147:86-95, Brams et al., J. Immunol. Methods,(1987), 98:11]. 따라서, 이러한 기술은 자가 항원에 대한 항체를 생성시키는데 효능적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 종양 마커 및 수용체는 자가면역성과 연관되어 있다.

몇몇의 연구자들은 단지 생체외에서 접종된 다양한 항원 예를 들어, 종양 관련 항원(TAAs)에 대한 반응을 보고하고 있다[문헌: Boerner et al., J. Immunol., (1991), 147:86-95, Borrebaeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1988), 85;3995]. 그러나, 불행하게도 생성된 항체는 전형적으로 IgM이었고, IgG 서브클래스가 아니었으며[문헌: McCabe et al., Cancer Research, (1988), 48, 4348-4353, Koda et al., Hum. Antibod. Hybridomas, (1990), 1:15], 이차 (IgG) 반응은 단지 면역된 공여체로부터의 림프구를 사용한 프로토콜로 보고되어 있다. 따라서, 이러한 프로토콜은 단지 일차 면역반응을 유도하는데 성공적이기는 하지만, 리콜(recall) 반응을 유도하기 위한 공여체 면역된 세포를 필요로 한다.

또한, 연구는 생체외에서 인간 모노클로날 항체를 효과적으로 유도하는 일반적인 프로토콜을 개발하기 위해서 배양 및 면역화 변수를 조직적으로 분석하는 것으로 수행하였다[문헌: Boerner, J. Immunol., (1991) 147:86-95, Brams et al., Hum. Antibod. Hybridomas,(1993), 4, 47-56, Lu et al., Hybridoma,(1993), 12, 381-389]. 이러한 연구는 페리틴(ferritin)에 특이적인 인간 모노클로날 항체를 분리할 수 있었다. 또한, 이러한 연구는 생체외에서 전체적으로 신규한(de novo) 이차반응을 유도할 수 있는 프로토콜을 개발하였다[문헌: Brams et al., Hum. Antibod. Hybridomas, (1993), 4, 57-65].

그러나, IVI의 커다란 잠재적 이점에도 불구하고, 그러한 방법의 효능은 아주 제한적인데, 그 이유는 면역세포가 배양용기의 단일층으로 성장한다는 사실 때문이다. 반면, 3차원 구조를 지닌 생체내 배반중심은 면역반응의 활성동안 비장에서 발견된다. 이러한 3차원 구조는 항원 존재 세포에 의해 둘러싸여 활성화된 T- 및 B-세포를 포함하며, 상기 세포는 B-세포의 항원 특이적 활성화 부위를 비교하는 대부분의 면역학적 설명으로 이해되고 있다.

천연의 비장에 대한 또 다른 연구는 "중증 복합 면역결핍증"(SCID) 마우스와 같은 면역손상된 동물 숙주에서 비장 질환을 "재생(recreate)"시키거나 모방하는 것에 관한 것이다. 인간 림프구는 SCID 마우스(hu-SCID)에 의해 용이하게 받아들여져 고수준의 면역 글로블린을 생성한다[문헌: Mosier et al., Nature,(1988), 335:256, McCune et al., L. Science, (1988), 241, 1632-1639]. 또한, 재구성에 사용된 공여체가 특정의 항원에 노출되는 경우, 동일한 항원에 대한 강한 이차반응이 그러한 마우스에서 유발될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Duchosal et al., Duchosal et al., Nature,(1992), 355:258-262]에는 17년 전에 파상풍 독소로 백신화된 공여체로부터의 인간 말초혈액 B-세포가 SCID 환경에서 재자극되어 높은 혈청수준 즉, 약 10⁴을 생성할 수 있다는 것을 보고하고 있다. 상기 문헌은 또한 추출된 인간 세포로부터의 λ및 M13 파아지 조합 라이브러리 연구[문헌: Huse et al., R.A. Science,(1989), 246:1275]를 이용하여 두개의 인간 항-TT 항체의 유전자의 클로닝 및 발현을 추가로 개시하고 있다. 보고된 항체의 항원 친화성은 10⁸ 내지 10⁹/M 범위이다. 그러나, 이러한 프로토콜은 공여체 프라이밍 세포를 요하고 수율이 아주 낮다. 즉, 370,000 클론의 라이브러리로부터 단지 2 클론만이 수득되었다.

따라서, 대부분의 경우에서 바이러스 또는 박테리아에 대한 노출을 수반한 상기 hu-SPL-SCID 마우스는 문헌[Stahli et al, Methods in Enzymology (1983), 92, 26-36]에 기술된, 공여체 자연적으로 또는 백신 접종에 의해 효과적으로 프라이밍된 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생성하는 것에 이용되어 왔다. 또한, hu-SCID 동물 모델을 이용한 보고된 혈청 역가 수준은 정상 마우스의 면역에 의해 통상적으로 수득된 것 보다 현저하게 낮다.

또한, 두 프로토콜은 미처리된 인간 림프구를 이용한 hu-SCID 마우스에서 이차 항체 반응의 유도는 초기 항체 반응의 유도 후에 발생될 수 있음이 설명되어 왔다. 그러나, 두 프로토콜의 이용은 실질적으로 제한된다. 제 1 프로토콜에서, 초기 반응은 인간 태아 간장, 흉선, 및 림프절이 외과적으로 이식된 hu-SCID 마우스에서 유도된다. 그러나, 이 방법은 문헌[McCune et al, L.Science(1988), 241, 1632-1639]에 기술된 프로토콜의 복잡한 외과적 방법론 뿐만아니라 태아 조직의 제한된 유용성에 의해 심하게 제한된다. 제 2 프로토콜에서, 문헌[Lubin et al. Science(1991), 252:427]에 기술된 치명적으로 방사선을 쬔 정상적인 마우스를 인간 골수 및 SICD 마우스 골수 세포로부터의 T- 및 B-세포로 재구성하였다. 그러나, 4달 동안의 인큐베이션이 필요하기 때문에, 이 방법은 매우 불리하다. 또한, 두 프로토콜은 아주 낮은 항체 역가, 즉 10⁴ 미만을 유도한다.

또한, 항원(파상풍 유독소) 프라이밍된 제공자로부터 PBMC를 이용하는 방법은 문헌[Carlson et al. Carlsson et al, J.Immunol.(1992), 148:1065-1071]에 기술되어 있다. 세포는 SCID 마우스로 이동시키기 전에 생체외 배양에서 짧은 기간 및 프라이밍 기간으로 처리하기 이전에, NK 세포 및 대식세포를 제거하였다. 그 후, hu-SPL-SCID 마우스를 항원으로 추가접종시켰다. 이 방법은 hu-SPL-SCID 혈청에서 약 10⁴의 평균 TT 특이적 인간 IgG 역가를 유도하는 것으로 보고되었고, 5ㅧ10⁵ 이하를 유도하는 것으로 보고되었다.

또한, 인간 모노클로날 항체의 생성은 원하는 인간 모노클로날 항체를 이상적으로 영구적 공급하고, 불변량을 분비하는 세포를 획득하기 위해 통상적으로 불멸의 B-세포의 생성을 필요로한다. B-세포의 불멸화는 일반적으로 하기의 네 가지 방법중 하나에 의해 달성된다: (ⅰ) EBV로 형질전환, (ⅱ) 마우스-인간 이종융합, (ⅲ) 이종융합에 이어서 EBV 형질전환, 및 (ⅳ) 조합 면역글로불린 유전자 라이브러리 기술.

항-HIV 항체의 생성을 위한 EBV 형질전환은 문헌[Gorny, et al. Proc. Natl. Acad. Sci.(1989), 86:1624-1628, Posner, et al. J.Immunol.(1991), 146:4325-32]에서 성공적으로 이용되어 왔다. 주요 잇점은 매 200개의 B-세포당 약 하나가 형질전환된다는 점이다. 그러나 EBV 형질전환된 세포는 통상적으로 불안정하고, 소량의 주요 IgM 항체를 생성하고, 클로닝이 약하며, 여러 달 배양 후에 항체 생성을 멈춘다. 문헌[Carrol, et al, J.Immunol, Meth.(1986), 89:61-72]에 기록된 이종융합은 통상적으로 높은 수준의 IgG 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기에 유리하다. 하이브리도마는 또한 제한 희석에 의해 쉽게 클로닝된다. 그러나, 결점은 낮은 즉, 20,000 림프구당 ≤1 하이브리도마의 수율을 갖는다는 점이다. [참고 문헌: Boerner, et al. J.Immunol.(1991), 147:86-95, Ohlin, et al. C.A.C. Immunology (1989), 68:325, Xiu-mei et al. Hum. Antibody. Hybridomas (1990), 1:42, Borrebaeck C.A.K. Abstract atl the "Second International Conference" on 'Human Antibodies and Hybridomas." April 26-28, 1992, Cambridge, England.] 이종융합에 이어서 결합 EBV 형질전환은 두 가지 잇점을 제공한다: (ⅰ) EBV 형질전환 후에, 인간 B-세포는 융합 파트너와 보다 더 쉽게 융합하고, (ⅱ) 보다 더 안정적이며 하이브리도마를 보다 더 많이 생성한다. [참고 문헌: Ohlin, et al. Immunology (1989), 68:325, Xiu-mei, et al. Hum. Antibod. Hybridomas(1990), 1:42, Borrebaeck C.A.K. Absract at the "Second International Conference" on "Human Antibodies and Hybridomas." April 26-28, 1992, Canbridge, England]. 마지막 기술, 조합 면역글로불린 유전자 라이브러리 기술의 잇점은 매우 많은 정보가 M13 Fab 발현 기술에 의해 스크리닝될 수 있고, 유전자가 생성 세포주로 쉽게 이동할 수 있다는 점이다. [참고 문헌: Huse, et al, Science (1989), 246:1275, William Huse, Antibody Engineering: A Practical Guide, Borrebaeck C.A.K., ed. 5:103-120]. 그러나, 수율은 통상적으로 아주 낮다. 즉, 370,000 클론 당 1이다. [참고 문헌: Duchosal, et al, Nature (1992), 355:258-262].

이와 같이, 상기에 기초하여, RSV에 특이적인 특정 항체에 있어서, 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 보다 더 효과적인 방법은 매우 이롭다는 것은 명백하다. 또한, 보편적으로 이용될 수 있는 것 보다 더 높은 결합 친화성, 특이성, 및 이펙터 기능을 갖는 RSV F-단백질에 대한 인간 항체는 또한 매우 바람직하다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 원하는 항원에 특이적인, 높은 역가의 인간 항체를 생산하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 보다 더 구체적인 목적은, (ⅰ) 생체외에서 미처리된 인간 비장세포의 항원 프라이밍 단계, (ⅱ) 생체외에서 항원 프라이밍된 비장세포를 면역손상된 공여체 예를 들어, SCID 마우스로 전달하는 단계, 및 (ⅲ) 항원으로 추가접종 하는 것을 포함하는 높은 역가의 인간 항체를 생성하기 위한 신규한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적 목적은 호흡기 합포체 바이러스 및 특정 RSV 융합 (F) 단백질에 특이적인 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 IgG를 우세하게 분비하는 EBV 불멸화된 세포를 생산하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하여 IgG를 우세하게 분비하는 EBV 불멸화된 인간 B-세포를 생성하기 위한 방법을 제공하는 것이다:

(ⅰ) 생체외에서, 미처리된 인간 비장세포의 항원 프라이밍 단계;

(ⅱ) 생체외에서, 미처리된 비장세포에 프라이밍된 항원을 면역손상된 공여체 예를 들어, SCID 마우스로 전달하는 단계;

(ⅲ) 항원으로 면역손상된 공여체를 추가접종하는 단계;

(ⅳ) 항원 추가접종된 면역손상된 공여체 예를 들어, SCID 마우스로부터 B-세포를 생성하는 인간 항체를 단리하는 단계; 및

(ⅴ) B-세포를 생성하는 상기 단리된 인간 항체를 EBV 형질전환시키는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 IgG를 우세하게 분비하는 SCID 마우스로부터 수득된 EBV 형질전환된 인간 B-세포를 함유하는 신규한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 보다 더 구체적인 목적은, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 인간 IgG를 우세하게 분비하는 EBV 형질전환된 인간 B-세포를 함유하는 신규한 조성물을 제공하는 것이다:

(ⅰ) 생체외에서, 미처리된 인간 비장세포의 항원 프라이밍 단계;

(ⅱ) 상기 생성된 생체외 항원 프라이밍된 미처리된 비장세포를 면역손상된 동물 공여체 예를 들어, SCID 마우스로 전달하는 단계;

(ⅲ) 면역손상된 동물 공여체 예를 들어, SCID 마우스를 항원으로 추가접종하는 단계;

(ⅳ) 항원으로 추가접종된 면역손상된 공여체 예를 들어, SCID 마우스로부터 B-세포를 생성하는 인간 항체를 단리하는 단계; 및

(ⅴ) B-세포를 생성하는 상기 단리된 인간 항체를 EBV 형질전환시키는 단계.

본 발명의 또 다른 구체적인 목적은 2ㅧ10^-9몰 이하의 RSV F-단백질에 대한 친화성을 갖는 RSV 중화성 인간 모노클로날 항체를 생성하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 2ㅧ10^-9몰 이하의 RSV F 항원에 대한 친화성을 갖는 RSV 중화성 인간 IgG 모노클로날 항체를 분비하는 EBV 불멸화된 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 보다 더 구체적인 목적은 각각 생체내에서 RSV를 중화시키고 각각 ≤2X10^-9의 RSV F-단백질에 대한 친화력을 갖는 RF-2 및 RF-1로서 언급되는 인간 모노클로날 항체를 각각 분비하는, 두 개의 EBVV 불멸화된 세포주 즉, RF-2 및 RF-1을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 RF-1 또는 RF-2의 가변 영역을 함유하는 인간 항체를 분비하는 트랜스펙턴트(transfectant)를 생성하기 위해 RF-1 또는 RF-2 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 엔코딩하는 DNA 서열로 진핵 세포를 트랜스펙션시키는 것이다.

본 발명의 보다 더 특이적인 목적은, RF-1 또는 RF-2 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 발현하는 트랜스펙션된 CHO 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 RSV F-단백질에 특이적이고, ≤2X10^-9몰의 RSV F-단백질에 대한 Kd를 나타내는 RSV 중화성 인간 모노클로날 항체를 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여함으로서 인간에서 RSV 감염을 치료하거나 예방하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적인 목적은, RF-1 또는 RF-2의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고 발현하는 트랜스펙션된 진핵 세포에서 발현된 인간 모노클로날 항체, 또는 RF-1 또는 RF-2를 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여함으로서, 인간에서 RSV 감염을 치료하거나 예방하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 결합하여, 생체외에서 RSV를 중화시키는, ≤2X10^-9몰의 RSV F-단백질에 대한 Kd를 갖는 RSV F-단백질에 대한 특이적인 인간 모노클로날 항체의 치료적 또는 예방적 유효량을 포함하는, RSV 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 보다 더 구체적인 목적은, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 결합되어, RF-1 또는 RF-2의 가변 중쇄 도메인 및 경쇄 도메인을 엔코딩하는 DNA 서열을 함유하고, 발현하는 트랜스펙션된 진핵 세포로부터 유도된 인간 모노클로날 항체, 또는 RF-1 또는 RF-2의 치료적 또는 예방적 유효량을 포함하는, RSV 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 분석물 예를 들어, 호흡기 유체내에 RSV의 존재를, RSV 융합(F) 단백질 또는 ≤2X10^-9몰을 갖는 인간 모노클로날 항체를 이용하여 검정함에 의한 RSV 감염의 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 항체가 직접 또는 간접적으로 적합한 리포터 분자 예를 들어, 효소 또는 방사선핵종(radiounclide)에 부착하며, ≤2X10^-9몰의 RSV F 단백질에 대한 친화성을 가지며, RSV F-단백질에 대해 특이적인 인간 모노클로날 항체를 포함하는, RSV 감염 검출을 위한 시험 키트 및 신규한 면역프로브를 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 이러한 인간 모노클로날 항체는 RF-1 또는 RF-2, 또는 진핵 세포 예를 들어, CHO 세포에서 생성된 재구성 인간 모노클로날 항체를 포함하고, 이들은 RF-1 또는 RF-2의 가변 중쇄 도메인 및 경쇄 도메인으로 트랜스펙션된다.

발명의 간단한 설명

가장 넓은 구체예에서, 본 발명은 원하는 항원, 바람직하게는 인간 질환의 예방, 치료 또는 발견에 수반되는 항원에 대한 인간 항체를 생성시키는 신규한 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 생체내 천연 인간 비장세포의 항원 프라이밍, 면역 손상 공여체 예를 들어, SCID 마우스로의 상기 생성된 생체외 항원 프라이밍 비장세포의 전달, 및 항원에 의한 상기 면역 손상 공여체의 추가접종을 포함한다.

본 발명은 또한, 생체외 천연 인간 세포의 항원 프라이밍; 면역 손상 공여체 예를 들어, SCID 마우스로의 생성된 생체외 항원 프라이밍 비장세포의 전달; 항원에 의한 면역 손상 공여체의 추가접종; 항원 추가접종 면역 손상 공여체, 예를 들어 SCID 마우스로부터의 인간 항체 분비, 바람직하게는 IgG 분비 B-세포의 단리; 및 상기 단리된 인간 항체 분비 세포의 EBV 형질전환을 포함하는, IgG를 분비하는 세포의 생성을 제공하는 에프슈타인-바 바이러스(EBV) 불멸화된 B-세포를 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 보다 더 구체적으로는, RSV에 대한 인간 항체, 특히 RSV F-단백질에 대한 높은 친화성을 나타내고 또한 RSV 감염을 중화시키는 RSV 융합(F) 단백질을 제조하기 위한 방법, 및 이러한 방법으로부터 생성되는 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 이것은 Il-2 및 임의적으로 RSV F-단백질에 의한 생체외 천연 인간 비장세포의 프라이밍; 면역손상된 공여체 예를 들어, SCID 마우스로의 상기 생성된 생체외 프라이밍 비장세포의 전달; 및 RSV 단백질에 대한 높은 친화성 즉, 2x10^-9 몰 이하을 갖는 중화 항-RSV F-단백질을 분비시키는 인간 B-세포를 생성시키기 위한 RSV F-단백질에 의한 추가접종에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

생성된 B-세포는 인간 항-RSV 모노클로날 항체의 일정한 안정적인 공급을 제공하도록 불멸화되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, B-세포는 항원 추가접종 SCID 마우스로부터 단리시키고, EBV 바이러스에 의해 형질전환되어 인간 IgG를 우세하게 분비시키는 EBV 형질전환된 인간 B-세포를 생성시키기 위한 EBV 바이러스에 의해 형질전환된다.

이들 세포는 RSV F 단백질에 대한 높은 친화성, 즉 10^-7 몰 이하, 바람직하게는 2x10^-9 몰 이하를 갖는 인간 모노클로날 항체를 분비하는 EBV 형질전환된 세포주에 대해 선택적으로 클로닝된다.

본 발명은 또한, 치료 및/또는 예방제, 및 진단제로서 이러한 항-RSV F-단백질 인간 모노클로날 항체의 사용에 관한 것이다. 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 RSV F-단백질에 대한 높은 친화성 즉, 2x10^-9 몰 이하의 RSV F-단백질에 대한 Kd를 나타내며, 또한 생체외에서 RSV를 중화시키는 인간 모노클로날 항체를 생성시킨다. 따라서, 이들 항체는 이상적으로, RSV F-단백질이 상이한 RSV 단리물을 교차하여 고도로 보존되는 표면 단백질이라는 사실을 제공하는 RSV 감염을 예방하거나 치료하기 위한 예방제 및 치료제로서 적합하다. 또한, RSV F-단백질에 대한 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 높은 친화성 및 특이성이 주어지면, 이들은 또한 RSV 감염을 진단하기 위해 사용될 수 있다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 RSV에 대한 2가지 특정 인간 모노클로날 항체, 즉 RF-1 및 RF-2, 뿐만 아니라 RF-1 또는 RF-2의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 엔코딩하는 DNA 서열로 트랜스펙션된 CHO 세포에서 바람직하게 생성되는 RF-1 및 RF-2로부터 유도되는 재조합된 인간 항체를 제공한다. 이들 항체는 RSV 감염의 치료 또는 예방을 위한 예방제 및/또는 치료제로서 특히 유용하다. 또한, 이들 항체는 이들이 고친화도를 갖는 RSV F-단백질을 결합시키며, 즉 각각 2x10^-9 이하의 RSV F-단백질에 대한 친화도를 제공하기 때문에, 진단제로서 유용하다. 이들은 RSV F-단백질에 대한 이들의 높은 친화도 및 특이성, 및 생체외에서 RSV 감염을 효과적으로 중화시키기 위한 이들의 능력 때문에 치료제로서 특히 유용하다.

도 1은 항-F 단백질 hu-SPL-SCID 혈청에 의한 F 단백질의 면역 블롯을 도시한 도면이다 : 정상(A) 및 변성(B) F 단백질이 SDS-PAGE에서 전개되고, 웨스턴 블롯에 의해 니트로셀룰로오스에 전달된다. 니트로셀룰로오스 스트립은 양성 대조구 마우스 항-F 단백질 MAb(레인 1A 및 1B), 음성 대조구 hu-SPL-SCID 혈청 항-TT(레인 2A 및 2B) 및 마우스 #6(레인 3A 및 3B), #3(레인 4A 및 4B) 및 #4(레인 5A 및 5B)로부터의 hu-SPL-SCID 항-F 단백질과 반응된다.

도 2는 hu-SPL-SCID 혈청 항-F 단백질에 의한 HEP의 면역 형광법을 도시한 것이다. 비감염(좌측) 및 RSV 감염된 세포는 추가접종 후에 15일만에 취한 1:50으로 희석된 hu-SPL-SCID 마우스 #6으로부터의 혈청과 반응된다. 결합은 GAH IgG-FITC를 나타낸다.

도 3은 플라스틱 결합 친화성 정제된 RSV F-단백질에 대한 정제된 RF-1 및 RF-2의 반응성을 도시한 것이다. 기준 인간 항-RSV 혈청, 즉 LN의 반응성을 또한 기록하였다. ELISA 판을 50ng의 RSV F-단백질로 피복시켰다.

도 4는 종양 세포 상등액으로부터 정제된 RF-1(레인 2) 및 RF-2(레인 3) 인간 MAb의 IEF를 도시한 것이다. IEF는 3-10의 구배에서 수행하였다. 레인 1은 pi 표준을 나타낸다.

도 5는 HEp-2 세포 및 RSV, 1ㅧ10⁶으로 감염시키고, 다양한 양의 RF-1과 인큐베이팅시키며, 후속하여 FITC-표지된 GAH IgG와 인큐베이션시킨 HEp-2 세포의 간접적인 면역 형광 유속 세포분석법 검정을 도시한다. 전체군의 상대적 평균 세기를 기록하였다.

도 6은 인간 항체의 발현을 위해 사용된 NEOSPLA 벡터를 도시한다. CMV는 시토메갈로바이러스 프로모터이다. BETA는 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터이다. BGH는 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날이다. SVO는 SV40의 리플리케이션 오리진이다. N1은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1이다. N2는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 2이다. LIGHT는 인간 면역글로불린 카파 불변 영역이다. H.eavy는 인간 면역글로불린 감마 1 또는 감마 4 PE 불변 영역이다. L은 리더이다. SV는 SV40 폴리아데닐화 영역이다.

도 7a는 RF-1의 가변 경쇄 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.

도 7b는 RF-1의 가변 중쇄 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.

도 8a는 RF-2의 가변 경쇄 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.

도 8b는 RF-2의 가변 중쇄 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.

도 9a는 RF-1 경쇄의 아미노산 및 핵산 서열, 리더 서열 및 인간 카파 불변 영역 서열을 도시한 것이다.

도 9b는 RF-1 중쇄의 아미노산 및 핵산 서열, 리더 서열 및 인간 감마 불변 영역 서열을 도시한 것이다.

도 9c는 인간 불변 영역 서열을 도시한 것이다.

도 10은 도 9a-9c에 도시한 RF-1 핵산 서열 및 인간 감마 불변 영역을 함유하는 NSKE1로 언급되는 NEOSPLA 인자의 개략도이다.

도 11a는 RF-2 경쇄의 아미노산 및 핵산 서열, 리더 서열 및 인간 카파 불변 영역을 도시한 것이다.

도 11b는 RF-2 중쇄의 아미노산 및 핵산 서열, 리더 서열 및 인간 감마 불변 영역을 도시한 것이다.

도 11c는 인간 감마 불변 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.

도 12는 도 11a-11c에 도시한 RF-2 핵산 서열 및 인간 감마 불변 영역 서열을 함유하는 NSKE1로 언급되는 NEOSPLA 벡터의 개략도이다.

기술된 바와 같이, 본 발명은 바람직한 항원, 바람직하게는 인간 질환에 수반되는 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 신규한 매우 효과적인 방법을 제공한다. 인간 질환에 수반되는 항원은 항체에 대한 적합한 치료 표적을 포함하는 표면 항원이 전형적일 것이다. 예를 들어, 이것은 인간 암세포의 표면상에서 발현되는 바이러스 및 항원의 표면 단백질을 포함한다. 바람직한 양태에서, 표면 항원은 RSV의 융합 단백질(F-단백질)을 포함할 것이다.

인간 질환은 예를 들어, 바이러스 감염 예를 들어, RSV, 파필로바이러스, 간염, AIDS 등, 암, 박테리아 감염, 효모 감염, 기생충 감염 예를 들어, 말라리아 등을 포함한다. 본질적으로, 인간 질환은 특정 항원에 대해 특이적인 인간 모노클로날 항체의 투여에 의해 예방하거나 치료할 수 있는 임의의 인간 질환을 포함한다.

인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 본 방법은 필수적으로 미처리 인간 비장세포의 생체외 프라이밍, 이러한 비장세포의 면역손상된 공여체 즉, SCID 마우스로의 전달 후에 상기 비장세포가 투여된 SCID 마우스의 항원 추가접종의 조합을 포함한다. 놀랍게도 인간 항체를 생성하기 위한 이러한 두 개의 공지된 방법이 조합이 상승적인 결과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 면역화 항원에 대해 매우 증진된 항원 특이적 반응물을 초래할 뿐만 아니라 매우 높은 역가 온도의 IgG 이소타입(isotype)의 인간 모노클로날 항체를 초래한다. 보다 구체적으로, 상기와 같은 조합은 새로운 높은 제 2의 반응물을 초래한다: hu-SPL-SCID 혈청내에서의 인간 IgG 반응물은 SCID에서의 미처리된 세포의 전달로 인한 것들보다 10배 높으며, 특이적 항체 반응물은 1000배 증가된다. 또한, 형성된 항체는 실험적으로 지나치게 활동적인 면역 동물에게서 생성된 항체에 대등하게 높은 친화성 및 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 미처리 비장세포를 사용하는 경우, 이러한 예상치 못했던 결과를 얻기 위해서는 생체외에서, 그리고 형성된 hu-SPL-SCID 마우스에 도입시키기 전에 항원을 유발하는 것이 필요하다. 또한, 추가의 새로운 프라이밍되지 않은 비장세포를 항원의 추가접종 이전에 hu-SPL-SCID 공여체에 도입하는 것이 필수적인 것은 아니나 바람직하다. 이는 항체 반응물의 추가적 증진을 초래하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 이미 문헌(Brams et al, Hum. Antibod. Hybridomas(1993), 4, 57-65)에 기재된 미처리된 인간 비장세포로부터 제 2의 반응물을 생성시키는 데 적합한 생체내 일차 및 추가접종 프로토콜 이후에 개발되었다. 상기 프로토콜(Brams et al, Hum. Antibod. Hybridomas(1993), 4, 57-65)은 하나의 항원 유발 처리된 배양물로부터 얻어진 것보다 약 2 내지 10배 높은 항원 특이적 IgG 반응물을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 생체외 면역화(IVI) 프로토콜은 매우 상이한 항원, 즉 말 페리틴(HoF), 칼로듈린(calmodulin), 전립선 특이적 항원(PSA), 마우스 IgG, 트랜스페린(transferrin), T-세포 의존 단백질 담체에 결합된 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanine: KLH) 디-니트로 페닐(DNP) 및 RSV 융합(F) 단백질을 사용하여 개발되었으며, 최적화되었다.

필수적으로, 이러한 프로토콜은 1:1 비로 항원과 함께 자가이식 비장세포로 배양이 개시된 후 1일 째에 비장세포 배양물의 재자극을 포함한다. 이러한 프로토콜을 사용하여 측정된 IgG 반응물은 반복된 항원 노출의 결과이며, 제 2의 반응물과 등가임이 입증되었다.

이들 실험은 미처리된 비장이 외상- 및 ITP 비장을 포함하여 림프구의 최선의 공급원인 것을 입증하였다. 대조적으로, 말초혈 림프구(PBL) 및 편도선 또는 림프절로부터의 세포가 항원 특이적 반응물의 유입에 대해 열등한 것으로 밝혀졌다. 또한, 세포 성분의 고갈 또는 중화는 열등한 반응물을 초래하였다[참조: Boerner et al., J. Immunol.(1991), 147:86-95]. 또한, 이들 시험은 소정의 비장세포 제조 및 항원에 대해 특이적인 적합한 항원 농도가 있는 것으로 나타났다.

따라서, 이미 기재된 미처리된 인간 비장세포로부터 제 2의 반응물을 생성시키는 데 적합한 생체내 일차 및 추가접종 프로토콜은 인간 모노클로날 항체 즉, SCID 마우스를 생성시키는 선행하는 생체내 방법과 조합하여 이 프로토콜을 시험하기 위해 계획되었다. 항원 프라이밍된 비장세포의 투여로 SCID 마우스 또는 유지시키려는 인간 림프구의 능력에 의해 소정의 항원에 대해 인간 모노클로날 항체의 생성에 미치는 효과를 실험하기 전에는 알 수 없다. 그러나, 이것은 개선된 항원 추가접종 및 생체외 항원 프라이밍된 미처리된 비장세포의 개선된 발현을 제공할 것으로 여겨졌다.

이와 관련하여, 인간 림프구는 자리잡을 수 있으며, 수개월간 생존할 수 있다[참조: McCune et al., Science(1988), 241, 1632-1639, Lubin et al, Science(1991), 252:427]. 그러나, 기재된 바와 같이, 항원에 대해 SCID 또는 인간 모노클로날 항체를 사용하는 상기 선행 방법은 자연적으로 또는 백신에 의해 항원에 이미 노출된 공여체로부터의 세포를 사용하며, 일반적으로 높은 인간 항체 역가를 초래하지 않았다.

놀랍게도, hu-SCID 모델에서 미처리된 인간 비장세포로부터 제 2의 반응물을 생성시키는 데 적합한 생체내 일차 및 추가접종 프로토콜의 조합(Brams et al, Hum. Antibod. Hybridomas(1993), 4, 57-65)은 면역화 항원에 대한 매우 상당히 항원 특이적인 IgG에 의해 입증된 바와 같은 상승 효과를 일으켰다.

또한, 이러한 방법(모델 항원으로 말 페리틴(HoF)를 사용)의 조합은 하기와 같은 것으로 밝혀졌다:

(i) SCID로 전달시키기 전에 생체외 면역화 단계를 도입하는 것이 현저한 항원 특이적 반응물을 확실하게 유도하게 위해 필수적이다;

(ii) 인간 세포가 복막내로 전달되어 SCID 마우스에서 인간 비장세포를 적합하게 유지시킨다;

(iii) 적합한 생체외 배양은 약 3일이다;

(iv) IL-2 및 임의로 IL-4 또는 IL-6의 생체외 사용은 hu-SPL-SCID 마우스에서 항원 특이적 반응의 최고 항원 역가를 초래한다;

(v) 마우스에서 hu-SPL-SCID는 애주번트 예를 들어, 프로인트 완전 애주번트(Freunds Complete Adjuvant)(FCA) 및/또는 백반중에서 항원 애멀션화되면서 추가접종되는 것이 바람직하다;

(vi) NK 세포의 치사 또는 중성화는 쥐 기원이든지 인간 기원이든지 항체 생성에 전혀 이롭지 않다. 그러나, 생체외 프라이밍된 세포에 대해 숙주로서 NK가 낮은 라인인 SCID-베이지 마우스의 사용은 추가접종이 애주번트, 즉 FCA 및 백반의 조합물을 사용에 영향을 받는 경우에 우수한 반응을 제공하는 것으로 밝혀졌다;

(vii) 림프절이 hu-SPL-SCID 마우스의 약 1/3이 아닌 비장을 정상 SCID와 비교하여 25배 이하로 확대하였다. 또한, 이들중 이러한 비장에서의 2/3 이하의 세포가 정상적인 인간 림프구 막 마아커에 양성인 것으로 시험되었다.

보다 구체적으로, 본 방법은 약 1 내지 10일, 바람직하게는 약 3일 동안 항원과 함께 생체외에서 미처리된 인간 비장세포를 프라이밍시키고, 프라이밍된 세포를 SCID 마우스에 전달하고, 이후 약 3 내지 14일 후, 바람직하게는 약 7일 후에 항원으로 마우스를 추가접종시키는 것을 포함한다. 이는 약 24일 후에 형성된 hu-SPL-SCID 마우스가 혈청에 높은 항원 특이적 IgG 반응물을 유발시킴을 입증하였다. 일반적으로, 혈청의 말기-희석 역가는 미처리 항원인 말 페리틴을 사용하여 약 10⁶(약 50㎎ IgG/㎖에서 최대 반응물의 절반)이고, 회수 반응물이 바이러스 항원 즉, RSV의 융합 단백질로 유도되는 경우에 약 10⁷(약 5㎎ IgG/㎖에서 최대 반응물의 절반)이다. 이러한 결과에 근거하여 유사한 반응물이 다른 항원을 사용하여 얻어질 수 있는 것으로 예상된다.

기재된 바와 같이, 바람직한 항체 반응물을 적합하게 유도하는 데는 hu-SPL-SCID 마우스에서 생체외 및 생체내에서 모두 인간 세포의 항원 접종이 요구된다. 또한, IL-2가 생체외 프라이밍 동안에 필요하며, IL-2와 동시에 투여된 IL-4 및 IL-6은 hu-SPL-SCID 마우스에서 반응물을 더욱 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, SCID 재구성은 용이하지만 조사된 동종 림프구의 동시 복강내 투여에 의존적이지는 않았다.

또한, 어느 한 비장에서 다른 비장으로의 항체 반응물에 상당한 변화가 있는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 일부 비장에는 항원 특이적 항체 반응물의 생성을 위해 10일 째에 항원과 새로운 자가이식 비장세포를 동시에 투여하는 것을 필요로 하였다. 또한, 항체 반응물의 수준이 상이한 hu-SPL-SCID 마우스에서 다소 변형된 것으로 밝혀졌다. 그러나, 본 출원의 내용을 기초로 하여, 당업자는 주어진 항원에 대해 적합한 항원 특이적 항체 반응물을 생성시키기에 적합한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

예를 들어 10일 생체외 면역화 후에, 배양물에서 특이적 항체를 생성하는 능력에 대해 수개의 상이한 비장 제조물을 시험하므로써, 최적 반응체를 확인할 수 있다. 또한, 다수의 세포를 각각의 비장으로부터 제조하여 냉동시키기 때문에, 선택된 비장으로부터 3일 동안 새로운 생체외 면역화를 설정한 후, SCID 마우스에 전달시킬 수 있다. 대조적으로, 다른 세포 물질 예를 들어, 말초 혈구는 1회 전달시에 하나의 공여체로부터 상당히 제한된 양의 회수될 수 있는 PBL이 얻어진다는 점에서 이러한 최적화가 용이하지 않다.

앞서 기재된 바와 같이, 상기 보고와는 대조적으로, 말초 혈구가 사용되는 경우, 본 발명에 대해서는 인간 NK 활성의 중화가 비장에 아무런 영향을 미치지 않았다. 또한, 항-아시알로(asialo) GMI 항체를 고정하는 보충물로 SCID NK 세포를 중화하는 것은 항원-특이적 IgG 반응물을 감소시켰다. 대조적으로, SCID/베이지 마우스의 사용 즉, NK 세포 수준이 감소된 균주는 정상 SCID와 비교하여 상당히 증가된 항원 특이적 IgG 반응물을 제공하였다.

추가로, 두 개의 면역 경로로, 정맥내(IV) 및 복강내(IP) 경로가 SCID 마우스, 즉 그 안의 비장세포의 유지 및 인간 항체의 생성을 제공하는 능력에 대해 비교하였다. 복막이 세포 전달 및 면역화에 적합한 부위인 것으로 밝혀졌다. 또한, 현재까지, 세포의 정맥내 전이는 0.01㎍/㎖ 인간 IgG 이상이 마우스 혈청에서 검출되는 경우에 재집합을 유발하지 않는 것으로 밝혀졌다.

또한, 형성된 IgG 농축물은 전달된 인간 세포 수와 직접적으로 상호관련되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, SCID의 재집합은 5x10⁶ 생체외 프라이밍된 비장세포가 복강내로 주사되는 경우에 92%이고, 5x10⁷ 생체외 프라이밍된 비장세포가 복강내로 주사되는 경우에 실질적으로 100%이다. 당업자는 본 출원에 기초로 하여, 주사된 생체외 프라이밍된 비장세포의 적합한 수를 선택한다. 일반적으로, 세포수는 약 10⁴ 내지 약 10⁸, 보다 바람직하게는 약 10⁶ 내지 약 10⁸, 매우 바람직하게는 적어도 약 10⁷ 내지 약 10⁸의 범위에 이른다.

또한, 항체 반응은 특정 애주번트의 존재에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. 보다 구체적으로, 최대 인간 항체 반응은 hu-SPL-SCID 마우스가 프로인트 완전 애주번트(CFA)중에서 또는 CFA와 백반을 함께 사용하여 애멀션화시킨 항체로 추가접종되는 경우에 달성되는 것으로 관찰되었다. 페리틴으로 추가접종된 hu-SPC-SCID에서의 시험으로 CFA가 백반보다 우수한 애주번트인 것으로 나타났다(각각 33㎎/㎖ 인간 IgG 및 13㎎/㎖ 인간 IgG 유발). CFA와 백반의 조합은 SCID에서 반응을 개선시키지 않았다. 그러나, SCID/베이지-hu(이러한 마우스는 NK 세포 활성이 감소되게 하는 돌연변이 물질을 함유한다)에서 이러한 애주번트의 사용은 CFA 단독의 경우와 비교하여 IgG의 생성을 8-10배 증가시킨다. 그러나, 기타 애주번트, 또는 이들의 조합은 또한 유사하거나 개선된 결과를 나타낼 수 있다. 프로인드 완전 애주번트와 백반을 함께 사용하는 총 인간 IgG의 최고 농도는 약 10㎎/㎖이고, 최고 특이적 IgG 농도는 약 500㎍/㎖ 모노클로날 항체 당량이었다.

페리틴과 함께 상기 방법의 사용은 특이성, 반응성 및 Ig 사슬 이소토프의 사용과 관련하여 과면역 염소, 토끼 및 돼지에서 수득되는 것과 유사한 폴리클로날 항체 반응물을 생성하였다. hu-SPL-SCID 혈청 항체는 페리틴이 높은 조직으로부터의 세포에만 결합되고 페리틴은 낮은 또는 페리틴이 네거티브인 조직으로부터의 세포에는 결합되지 않는 IgG가 대부분이었으며, 웨스턴 블롯으로 중성 페리틴 뿐만 아니라 변성된 페리틴이 인지되었다. 이 결과는 얻어진 항체 농도 및 인간 항체의 항원 특이성에서 예상되지 않았다. 또한, 유사한 결과가 상이한 항원을 사용하여 얻어진다.

주사 후, 인간 세포는 두 개의 부위, 즉, 복막 및 마우스 비장에 축적하는 경향이 있는 것으로 나타났다. 인간 세포의 약 7% 이하가 혈액에서 발견되는 반면, 인간 항원의 림프절 및 간의 세포의 25% 내지 33%는 확대된 비장 및 일부 동물에서 예비 종양으로 인간 기원이었다. 이들 인간 세포에는 거의 B 및 T 세포가 제외되어 있으며, 확대된 비장에서 소량의 CD14+ 세포, 대부분 단핵세포를 가진다.

이들 결과는 비장, 림프절, 간 및 복막을 조사한 플로우 시토메트리(flow cytometry)로 측정하였다. 인간 비장세포가 비장에서 재집합되는 경우에, 비장이 종종 미처리 SCID 비장 크기의 25배까지 확대되었다. 인간 세포는 추출후 즉시 측정되는 경우에 알려지지 않은 기원의 잔류물과 함께 비장에서 세포 총수의 약 30% 까지 구성한다. 그러나, 배양한 지 3일 후, 생존하는 세포의 대다수는 항체가 결합된 세포로서 인간 기원인 것으로 나타났으며, 마우스 림프구와의 교차 반응성은 없는 것으로 나타났다.

또한, 재구성된 마우스는 두 개의 그룹, 즉 정상 크기의 비장을 갖는 그룹과 확대된 비장을 갖는 그룹으로 나눌 수 있는 것으로 관찰되었다. 확대된 비장, 즉 정상 크기의 25배인 Hu-SPL-SCID 마우스는 정상 비장을 갖는 마우스보다 약 150배 높은 인간 IgG 수준을 가지며, 항원 특이적 인간 IgG의 수준은 유사하게 처리된 정상 크기의 비장을 갖는 마우스보다 약 10,000배 높았다. 또한, 항원 특이적 반응의 상대적 친화성은 반응을 통해 증가된 것으로 밝혀졌으며, 이는 보다 더 높은 비율의 전체 면역글로불린 푸울이 결합 특성이 보다 우수한 항체로 이루어짐을 나타낸다. 이들 결과는 상기 시스템이 항원 유도된 것임을 나타낸다.

이들 결과는 매우 중요하며, 일반적으로 hu-SPL-SCID로부터 인간 세포를 구하고, 조합 인간 항체 유전자 라이브러리를 생성시키기 위해 동일하게 사용하여, 임상적으로 및/또는 진단적으로 사용될 수 있는 높은 친화성 및 특이성의 인간 모노클로날 항체를 유도할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 RSV F-단백질에 대해 높은 친화성 즉, ≤2x10^-9 몰 단백질을 나타내고, 인간 모노클로날 항체가 생체외에서 RSV를 중화시킬 수 있는 RSV F-단백질에 대한 신규한 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 RSV F-단백질에 대한 이러한 인간 모노클로날 항체의 제조방법을 제공한다.

일반적으로, 이러한 인간 항체는, RSV F-단백질로 미처리 인간 비장세포를 생체외에서 면역화, 이러한 생체외에서 면역된 인간 비장세포를 면역손상된 동물 공여체 즉, SCID 마우스에 전달, 상기 동물을 RSV F-단백질로 추가접종, 이로부터 RSV F-단백질에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 인간 B 세포 단리, 이 인간 B 세포의 면역화, 및 RSV F-단백질에 대해 친화성이 높은, 바람직하게는 10^-7 몰 이상, 보다 바람직하게는 ≤2x10^-9 몰인 인간 모노클로날 항체를 분비하는 세포를 선택하기 위해 상기 면역된 B 세포를 클로닝시킴으로써 생성된다.

논의된 바와 같이, 특히 이미 RSV F-항원에 노출되거나 노출되지 않았으며, 이후 면역손상된 동물 공여체, 즉 RSV F-단백질 항원으로 추가접종된 SCID 마우스에 전달된 특히, 인간 비장세포의 조합은 인간 항체를 생성시키기 위한 종래의 방법과 비교하여 상당한 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 매우 높은 항체 역가(즉, 최고 항-F 단백질 역가는 약 10^-7이다), 높은 IgG 농도(즉, 최고 반응체에 대해 3㎎/㎖이다)를 제공한다. 또한, 본 방법은 매우 유리한 특성의 조합, 즉 RSV F-단백질에 대해 친화성이 높고, 또한 실질적으로, 생체외 중화 활성을 나타내는 것으로, 인간 항체를 생성하게 한다.

실시예에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 인간 모노클로날 항체를 두 가지 즉, 플라스몬 공명법(plasmon resonance)에 의해 측정되는 경우에 F-단백질에 대한 친화성 상수 Ka가 10¹⁰M을 나타내는 RF-1, 및 적정 미량비색측정법에 의해 측정되는 경우에 친화성 상수 Ka가 5 x 10⁸M을 나타내는 RF-2로 분리하였다. 또한, 계산된 RF-2의 Kd는 5 x 10^-9M였다. 또한, 이들 항체는 둘다 8 내지 120ng/㎖의 농도에서 생체외 바이러스 중화 특성을 나타낼 뿐만 아니라 이미 RSV 감염된 세포의 융합을 억제시키는 능력을 나타낸다. 현저하게, 상기 생체외 중화 활성은 광범위하게 다양한 상이한 야생형 및 실험실형 RSV 균주, 즉, A 및 B형 바이러스 형에 대해 적용할 수 있다.

이들 결과, 즉 RSV 감염된 세포 표면상에 발현된 표면 단백질을 포함하는 RSV F-단백질에 대한 본 항체의 높은 친화성, 뿐만 아니라 바이러스를 효과적으로 중화시키고, 바이러스로 감염된 세포의 융합을 억제시키는 능력에 따라, 본 인간 모노클로날 항체는 치료제 및 예방제, 즉 RSV 감염에 민감성이거나 RSV 감염된 대상을 치료하거나 예방하기 위해 적합해야 한다. 기재된 바와 같이, RSV 감염은 유아와 면역손상된 인간에게 특히 유행된다. 따라서, 본 단일클론성 항체는 특히 이러한 대상에게서 RSV 감염을 예방하거나 치료하는 데 적합할 것이다.

또한, 상기 본 모노클로날 항체의 인간 기원은 수동 면역치료에 적합할 수 있다. 이는 상기 항체가 쥐 모노클로날 항체의 잠재적 압박, 즉 HAMA 반응물 및 정상 인간 이펙터 기능의 부재로 처리되지 않을 것이기 때문이다. 사실상, 본 인간 모노클로날 항체의 특성(하기 실시예에 기재되는)을 기초로 하여, RF-1 및 RF-2는 이미 기재된 쥐 또는 키메라 항-F 단백질 항체 및 재조합 라이브러리로부터 유도된 인간 Fab 단편보다 생체외 중화 활성 및 감염된 RSV 세포의 융합을 억제시키는 능력이 실질적으로 더 크게 나타나는 것으로 여겨질 것이다. 또한, 이들의 인간 기원에 따라, 이러한 중화 활성이 생체내 투여시에 유지될 것으로 예상된다.

본 인간 모노클로날 항체의 기타 이점은 정상조직과의 반응성이 실질적으로 없다는 것이다. 하기에 나타나는 바와 같이, 본 인간 모노클로날 항체는 RSV 감염된 세포에만 결합하고, 임파성 조직, 간, 포복성 또는 후두 표피를 나타내는 세포주에는 결합하지 않는다. 따라서, 생체내 투여시 이들 항체는 RSV 감염된 세포에는 효과적으로 결합하나, 정상 조직에는 결합하지 않아서, RSV 감염을 중화시킨다. 또한, 기재된 특성을 기초로 하여, RSV F-단백질에 대한 본 인간 모노클로날 항체는 RSV 감염에 대해 감염되기 쉬운 숙주를 보호하는 데 사용될 수 있다.

보다 더 구체적으로, RSV F 단백질에 대한 본 인간 모노클로날 항체는 예를 들어, 외상 또는 ITP 공급원으로부터 인간 비장세포를 얻음으로써 생성되고, 이후 생체외에서 프라이밍된다. 이는 필수적으로 충분량의 Il-2 및 임의로 면역을 유도(항원 프라이밍으로서 언급됨)하는 RSV F-단백질의 존재하에서 생체외 상기 미처리 인간 비장세포를 배양하는 것을 포함한다. 일반적으로, 사용될 수 있는 RSV F-단백질의 양은 RSV 단백질의 약 1 내지 200ng/㎖, 보다 바람직하게는 10 내지 100ng/㎖, 가장 바람직하게는 RSV F-단백질의 약 40ng/㎖이다.

생체외 배지는 또한 림포킨을 특히 IL-2, 및 임의로 IL-4 및 IL-6을 함유하는 것이 바람직할 것이다. 이의 양은 면역 및 항체 생성 세포의 바람직한 생성을 제공할 수 있는 양일 것이다. 예를 들어, IL-2의 경우, 약 5 내지 200IU/㎖, 보다 바람직하게는 약 10 내지 50IU/㎖, 가장 바람직하게는 25IU/㎖가 적합하다.

이러한 배양 배지는 또한 배양시 인간 비장세포의 생존을 유지시키는 데 필요한 기타 구성물 예를 들어, 아미노산 및 혈청을 함유할 것이다. 예로서, 2mM 글루타민, 2mM 나트륨 피루베이트, 비필수아미노산, 25 IU/㎖ IL-2 및 20% 송아지 혈청으로 보충된 IMDM을 함유하는 배지가 사용되었다. 그러나, 당업자는 본 출원을 기초로 통상의 최적화를 사용하여 배지를 변경할 수 있다.

생체외 면역 단계는 면역을 유도하기에 충분한 시간 동안 영향받을 수 있다. 일반적으로, 세포는 약 1 내지 10일 동안, 바람직하게는 약 3일 동안 RSV F-단백질의 존재하에서 배양될 수 있다. 그러나, 이것은 예컨대 특정 비장 샘플에 따라 변할 것이다. 유사하게, 본 출원의 기술을 기초로 하는 기술 및 종래 방법을 사용하는 당업자는 생체외 면역 단계에 적합한 기간을 결정할 수 있다.

비장세포가 F-단백질에 대해 면역되고 다른 불필요한(비표면) 항원에 대해서는 면역되지 않는 것을 보장하기 위해 생체외 면역에 사용되는 항원은 정제된 RSV F-단백질인 것이 바람직하다. 정제된 RSV 단백질을 수득하는 방법은 종래에 공지되어 있다. 특히 본 발명자들은 하기 문헌의 방법을 이용하였다: Walsh et al., J. Gen Vitrol., 70, 2953-2961, 1989. 그러나, RSV F-단백질에 특이성을 갖는 인간 모노클로날 항체를 수득하기 위한 충분한 순도의 RSV F-단백질이 수득되는 것을 제공하는 특정 방법은 중요하지 않다. 대안적으로, RSV F-단백질은 U.S. 특허 제 5288630 호(1994년 2월 22일 출원)에 설명된 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.

생체외 면역 후, RSV F-단백질 면역 또는 프라이밍된 미처리된 인간 비장세포는 면역손상된 공여체, 즉 SCID 마우스내로 도입된다. 바람직하게 이것은 SCID 마우스내로 RSV F-단백질 프라이밍된 인간 비장세포를 복막내 투여함으로써 이루어진다. 투여되는 각각의 비장세포의 수는 전형적으로 약 10⁴ 내지 10⁸ 비장세포, 바람직하게는 10⁷ 내지 10⁸ 비장세포로부터 변한다. 상기 세포의 수는 원하는 재생물, 즉 RSV F-단백질에 특이적인 인간 항체의 회수될 수 있는 농축물을 생성하는 SCID 마우스를 얻을 수 있다. 바람직하게는, 상기 비장세포는 투여전에 약 8ㅧ10⁸ 세포/ml의 농도에서 HBSS중에 현탁된다.

비장세포의 복강내 전달 후, SCID 마우스는 RSV F-단백질로 추가접종된다. 이는 인간 항-RSV F-단백질 항체의 원하는 생성이 이루어지도록 비세포의 전이에 충분히 근접한 시간에서 영향받는다. 일반적으로, 이것은 전달 후 3 내지 14일, 최상으로는 약 7일 동안 영향받을 것이다. 바람직하게는, 상기 항원 투여는 복강내로 이루어질 것이다. 투여된 RSV F-단백질의 양은 약 1 내지 50㎍ 및 바람직하게는 약 1 내지 10㎍일 것이다. 실시예에서, 5㎍ 단백질이 투여되었다. 그러나, 면역된 양 및 면역 시간은 특정 마우스, 비장세포, 및 RSV F-단백질의 순도에 따라 변할 수 있다.

바람직하게는, 항원 추가접종은 애주번트 예를 들어, 프로인트 완전 애쥬번트, 백반, 사포닌 등의 존재하에서, 바람직한 프로인트 완전 애주번트(CFA) 및 백반으로 영향받을 것이다. 그러나, 다른 공지된 애주번트가 실질적으로 동일하거나 오히려 증가된 결과를 수득하기 위해 치환될 수 있다.

항원 추가접종 후, SCID 마우스는 방혈, 예를 들어 미(tail)방혈되고, 이들의 혈청은 인간 IgG 농도 및 항-F 단백질 항체 역가에 대해 시험된다. 그 후 가장 높은 항체 역가 및 농도를 나타내는 동물은 인간 IgG 분비 세포의 회수를 위해 사용된다.

가장 높은 항-F 인간 항체 역가를 갖는 SCID 마우스는 인간 항체 분비 세포의 양호한 공급원을 제공하는 커다란 복부 종양을 전개시키는 것이 발견되었다. 바람직하게는, 이러한 종양은 무균 조건하에서 절제에 의해 회수되고, 단일 세포 현탁액이 제조된 후, 세포는 세척되고 배양된다. 실시예에서, 세포는 2% 소 태아 혈청을 함유하는 IMDM으로 세척되고, 세포는 10% FCS를 갖는 IMDM을 함유하는 T-25 플라스크에서 10⁶ 세포/ml의 현탁액중에서 배양된다. 그러나, 배양 조건은 당업자들에 의해 변화될 수 있다.

그 후, 상기 세포는 EBV를 사용하여 바람직하게는 불멸화된다. 항-F 단백질 항체를 분비하는 불멸화된 세포는 공지된 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 확인된다. 언급된 바와 같이, 이 방법은 구체적으로 RSV F-단백질, 즉 RF-1 및 RF-2를 결합시키는 2개의 분명한 인간 모노클로날 항체를 확인하는데 사용된다. 그러나, 본 발명자들의 출원중의 기술을 기초로 하여, 특정 실시예에서, 유사한 성질을 갖는 RSV F-단백질에 대한 다른 인간 모노클로날 항체가 과도한 실험 없이 당업자들에 의해 수득될 수 있다. 이러한 항체는 대부분 상이한 SCID 마우스를 사용하여, 2회의 상이한 실험에서 발생되는 분명한 사실을 제공한다. RF-1 및 RF-2를 발현하는 세포주는 연장된 시간 즉, 각각 약 18 및 16개월 동안, 약 36 내지 48 시간의 거의 2배 시간으로 나누어져 배양물에서 유지되었다. 특정 항체 농도는 3일 동안 성장된, 0.5ㅧ10⁶ 세포/ml로 시딩된 배양물중에 평균 약 0.8 내지 1㎍/ml이다.

하기에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, RF-1 및 RF-2 둘 다 각각 0.6 및 1ng/ml에서 ELISA 중에 F-단백질에 결합되고, 각각 약 8.8 및 8.9의 등전점을 나타내는 반최대(half-maximal) 결합을 갖는 IgG(1,k)이다.

또한, 상기 항체들은 RSV F-단백질에 대해 고친화성을 나타낸다. 구체적으로, RF-1에 있어서 IASYS 기기상의 플라스몬 공명에 의해 측정되는 RF-1에 대한 해리 상수는 약 10^-10M 이다. 유사하게 RF-2에 대한 Ka 상수는 높으며; 하기 문헌에 따라 적정 마이크로콜로리미트리에 의해 결정되는 경우, Ka 상수는 약 2ㅧ10^-9M이다: Wiseman et al. (1989) 및 Robert et al. (1989).

또한, 이러한 항체는 처리된 정상 인간 세포 예를들어, 호흡기도 내막(HEp-2, 후두성 표피양 암, CCL 23), 간(HepG2, 인간 간암 세포주, HB 8068), 림프구 조직, SB, 인간 B 림프아구성 세포주, cat 번호 제 CCL 120.1 및 HSB, T 림프 아구성 세포주, cat. 제 CRL 120.1, 및 프로스트레이트(LNCaP.FGC, 인간 프로스트레이트 선암종 세포주, cat. 제 CRL 1740)에는 결합되지 않지만, RSV 감염 세포에 효과적으로 결합하는 것으로 증명되었다.

RF-1 및 RF-2 둘 다 현저한 생체외 RSV 바이러스 중화를 나타내는 것으로 제시되고 있다. 이는 2가지 상이한 검정(하기에 설명됨), 즉 세포에 바이러스의 첨가 전에 정제된 모노클로날 항체와 바이러스의 사전 반응에 의해 영향받는 감염 중화 검정 및 세포내로 바이러스의 유입 후 바이러스 성장 및 증대를 억제시키는 모노클로날 항체의 능력을 측정하는 융합 억제 검정으로 증명된다.

또한, 하기에 설명되는 바와 같이, RF-1 및 RF-2 둘 다 각각 약 30nm/ml 내지 1000ng/ml의 농도에서 12개의 다른 단리물의 바이러스 감염을 억제한다. 이와 같이, RF-2는 명백히 RF-1 보다 양호하게 수행하여, RF-1 보다 약 1.25 내지 10배가 더 낮은 농도에서 50% 바이러스 억제도(ED50)를 얻는다.

대조적으로, 모노클로날 항체의 높은 농도가 RF-2 보다 약 1.25 내지 10배 더 효능 있는 RF-1으로 이전에 감염된 세포에서 융합 및 바이러스 항원 발현을 억제시키는데 요구된다. 또한, RF-1 및 RF-2 둘 다 타입 B RSV, 타입 B 원형 RS 6556, 및 타입 A RSV, 타입 A 원형 RS 롱(Long)에 대해 효과적이다. 이와 같이, 생체외의 결과는 본 인간 모노클로날 항체가 다른 RSV 균주, 타입 A 및 타입 B 원형 둘 다에 의해 유발되는 RSV 감염을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있음을 제시한다. 상기한 바와 같이, RSV F-단백질은 다른 RSV 단리물에서 매우 잘 보존된다. 그러므로, RSV F-단백질에 대한 본 모노클로날 항체는 RSV F-단백질의 보존된 에피토프와 결합된다.

설명된 바와 같이, 가변 중쇄 서열 및 경쇄 서열(제조 방법은 하기에서 설명됨)을 함유하는 본 인간 모노클로날 항체 또는 재조합된 인간 항체는 피동성 항체 치료법에 의해 RSV 감염을 치료하거나 예방하기 위한 치료제 및 예방제로서 사용된다. 특히, 이러한 DNA 가변 영역을 엔코딩하는 DNA 서열은 도 2에 도시된 IDEC 특허 발현에 관계될 수 있다. 이러한 버전은 실질적으로 본원에 참고적으로 인용된 공동 양도된 U.S. 우선권 제 08/379/072 호(1995년 1월 25일 출원)에 설명되어 있다. 이러한 벡터 불변 인간 불변 영역 예를 들어, 인간 감마 1, 인간 감마 4 또는 이들의 변이 형태는 감마 4 PE로서 언급된다. (본원에 인용된 U.S. 우선권 제 08/379,072 호를 참조한다). 일반적으로, 이것은 감염되기 쉽거나 RSV 감염을 나타내는 대상에 본 인간 모노클로날 항체의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함할 것이다. 유효한 용량으로는 약 50 내지 20,000 ㎍/Kg, 보다 더 바람직하게는 약 100 내지 5000 ㎍/Kg이다. 그러나, 적합한 용량은 처리된 숙주의 증상, 체중 등과 같은 인자에 따라 변할 것이다. 적합한 유효한 용량은 당업자들에 의해 결정될 수 있다.

본 인간 모노클로날 항체는, 항체를 투여하기에 적합한 투여 모드 중 어느 것에 의해서나 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 항체는 주사 예를 들어, 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 더욱 바람직하게는 에어러졸에 의해 투여될 것이다. 이전에 언급된 바와 같이, 에어러졸 투여는 처리되는 피검자가 신생아인 경우에 특히 바람직하다.

약제학적으로 허용되는 형태의 항체 조성물은 공지된 약제학적 담체 및 부형제를 사용하여, 공지된 방법에 의해 영향받을 수 있다. 적합한 담체 및 부형제는 예를 들어 완충 염수, 소 혈청 알부민등을 포함한다.

또한, RSV 감염 세포에 높은 특이성 및 높은 친화성을 제공하는 본 항체는 RSV 감염의 진단을 위해 면역프로브로서의 이용성을 갖는다. 이는 일반적으로 RSV 감염된 것으로 의심되는 인간의 샘플 예를 들어, 호흡 유체를 취하고 본 인간 모노클로날 항체를 갖는 샘플을 인큐베이션시켜 RSV 감염 세포의 존재를 검출하는 것을 포함한다.

이는 인간 모노클로날 항체 RSV 면역 복합체의 검출을 위해 제공하는 리포터 분자로 본 인간 항체를 직접 또는 간접적으로 표지화시키는 것을 포함한다. 공지된 표지의 예는 예를 들어, β-락타마아제, 루시퍼라아제 등과 같은 효소, 및 방사성 표지를 포함한다.

모노클로날 항체를 사용하는 항원의 효과적인 면역 검출 방법은 종래 기술에 널리 공지되어 있다. 또한, 적합한 리포터 분자를 진단학적 유효량의 본 항-RSV F-단백질 항체의 조합은 RSV 감염의 검출을 위한 시험용 키트로서 제형화될 수 있다.

재료 및 방법

하기의 재료 및 방법을 실시예 1 내지 6에서 사용하였다.

F 단백질 제조 및 정제:

F 단백질을 실질적으로 하기 문헌의 방법에 따라 제조하였다: Walsh et al., J. Gen Vitrol., 70, 2953-2961, (1989). 간단하게, 70% 융합성의 HEp-2 세포를 RSV의 롱 균주, A 타입의 랩 적응 균주로 감염시켰다. 5% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민 및 2mM 소듐 피루베이트로 보강된 IMDM 중의 T-150 배양 플라스크에서 48시간 동안 배양시킨 후, 세포를 1% 트리톤(Triton) X-100 및 1% 데옥시콜레이트를 함유하는 PBS의 용해 완충액중에 용해시켰다. F 단백질을 쥐 모노클로날 항-F 항체, B4(Hiroki Tsutsumi로부터의 기프트 종)에 커플링된 세파덱스(Sephadex)의 친화성 칼럼상에서 미정제 세포 용해물로부터 정제했다(Tsutsumi et al. 1987). 칼럼을 용해 완충액으로 광범위하게 세척하고 정제된 F 단백질을 0.1% 데옥시콜레이트를 함유하는 0.1M 글리신(pH 2.5)에서 용리했다. 용리물을 1M 트리스(pH 8.5)로 바로 중화시키고 PBS에 대해 투석시켰다. 세제를 Extracti-D 겔 칼럼(피어스, 록포드, IL, Cat. No. 20346)상에서 제거하고, F 단백질 농도를 EIA에 의해 결정하고 용액을 감마 방사선에 의해 살균했다.

림프 세포 제조:

비장을 특발성 트롬보펜 자발병(ITP) 환자의 임상학적으로 지시된 비장절제술에 따라 수득했다. 단일 세포 현탁액을 금속 메쉬를 통한 시빙(sieving)으로 제조하고, 2% 소 태아 혈청으로 보강된 IMDM 매질에서 세척했다. 적혈구를 37℃에서 90초 동안 암모늄 클로라이드 용해 완충액으로 처리함으로써 제거한다. 그 후 백혈구 부화 현탁액을 혈청 함유 배지로 2회 세척하고, 10⁸ 세포/ml의 얼음 냉각된 매질(5% DMSO를 갖는 95% FCS)중에 재현탁시키고 사용할 때까지 액체 질소중에 냉동시켰다.

생체외 면역(IVI):

배양물을 2mM 글루타민, 2mM 소듐 피루베이트, 비필수 아미노산, 25㎍/ml IL-2 및 10% 소 태아 혈청으로 보강된 IMDM 중에 고정시켰다. 2.5㎍/ml 암포테리신(amphotericin), 100㎍/ml 암피실린, 100㎍/ml 카나미신, 5㎍/ml 클로르테트라시클린, 50㎍/ml 네오미신 및 50㎍/ml 겐타미신을 포함하는 항생 물질 혼합물을 첨가했다. 세포를 6 웰 클러스터에서 40 ng/ml F 단백질로 3ㅧ10⁶ 세포/ml로 배양시켰다. 3일 후에, 세포를 모으고, 세척하고 SCID 재생을 위해 8ㅧ10⁸ 세포/ml로 HBSS 중에 재현탁시켰다.

SCID 마우스의 재생:

5 내지 8주령된 암컷 CB17/SCID 마우스를 IVI되는 4ㅧ10⁷ 인간 비장세포를 함유하는 HBSS 200㎕를 복강내 주사함으로써 재생시키고; 마우스를 CFA중의 5㎍ F 단백질로 1주 후에 추가접종시키고 다시 15일 후에 미방혈시켰다. 이들의 혈청을 인간 IgG 농도 및 항-F 항체 역가에 대해 시험했다.

hu/SCID 마우스로부터 인간 세포의 회수:

높은 항-F 항체 역가를 갖는 2개의 hu-SPL-SCID 마우스에 커다란 복부 종양을 전개시켰다. 종양을 무균 조건하에서 희생 마우스로부터 절제에 의해 회수하고, 단일 세포 현탁액을 제조하고, 세포를 세척하고 2% 소 태아 혈청을 함유하는 IMDM으로 세척하고, 10% FCS를 갖는 IMDM을 함유하는 T-25 플라스크에서 10⁶ 세포/ml의 현탁액중에서 배양했다.

인간 IgG 및 항-F 단백질 항체에 대한 시험:

인간 IgG 및 항-F 단백질에 대한 시험을 ELISA에서 수행했다. 이 목적을 위해, 플레이트를 0.1M 중탄산염 완충액(pH 9.5)에서 각각 GAH-Ig(0.05㎍/웰) 또는 F 단백질(0.05㎍/웰)로 밤새 코팅시키고, 1% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS로 차단했다. 마우스 혈청, 배양 상층액 또는 정제된 항체의 연속 희석액을 플레이트에 반응시켰다. 결합된 인간 IgG를 GAH IgG-HRP 및 OPD 기질(시그마,..,..)의 연속 첨가에 의해 나타냈다. 선택된 높은 역가의 인간 혈청을 2가지 검정에서 양성 대조구로서 사용하고 정제된 폴리클로날 인간 IgG, 또는 (γ,κ) 골수종 단백질을 각각 인간 IgG 및 모노클로날 항체의 농도를 평가하는 표준으로서 사용했다.

인간 항체의 이소타입화:

이소타입화를 상기에 설명된 바와 같이 F 단백질 코팅 플레이트상의 ELISA에서 수행했다. 결합된 인간 IgG는 인간 γ1, γ2, γ3, γ4, μ, κ 및 λ에 특이성을 갖는 HRP 콘쥬게이트 마우스 모노클로날 항체의 연속 첨가에 의해 나타났다. 양성 대조구를 (γ1,κ), (γ2,κ), (γ3,λ), (γ4,λ) 또는 (λ,λ) 이소타입 및 유리 κ및 λ사슬의 골수종 단백질로 수행했다.

단백질 A 정제:

항체를 단백질 A 세파로오스 4B 칼럼상에 배양 상층액으로부터 정제시킨다. 간단하게, 상층액을 모으고, 0.2mm 필터를 통해 여과시키고 0.02% 소듐 아지드로 보강시킨다. 칼럼(겔 부피: 약 0.5ml)를 0.02% 소듐 아지드를 갖는 PBS에서 평형시킨 후, 낮은 속도에서 상층액으로 로딩했다. 광범위한 세척 후, 결합된 인간 모노클로날 IgG를 0.1M 소듐 시트레이트 완충액(pH 3.5)중에 용리시키고, 센트리콘 10 필터(아미콘, ,)을 사용하여 PBS-아지드에 대해 투석시키고 추가 사용할 때까지 감마 방사선으로 살균시켰다. 칼럼을 시트르산(pH 2.5)으로 재생시키고 연속 사용을 위해 0.02% 소듐 아지드를 갖는 PBS로 재평형시켰다.

등전기 집속:

인간 항체의 등전기 집속(IEF)를 pH가 3 내지 10인 폴리아크릴아미드 사전 주조 겔(Pharmacia, Uppsala, Sweden, Cat. No. 80-1124-80)에서 수행했다. 간단하게, 20㎕의 샘플을 적하시키고 90분 동안 1500V에서 작업했다. pi 5.8 내지 10.25의 표준을 pi 기준(...)용으로 사용했다. 겔을 쿠마시 블루 스테인에 착색시키고 25% 메탄올, 68% 물 및 8% 아세트산을 함유하는 탈착색 완충액중에서 탈착색시켰다.

웨스턴 블롯:

미처리된 끓여서 변성된, 정제된 F 단백질을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 이동시켰다. 겔을 2시간 동안 30V 및 하룻밤 동안 60V에서 니트로셀룰로오스 시이트상에서 블롯팅시켰다. 전달 후, 니트로셀룰로오스를 PBS중의 1% BSA 및 0.1% 트윈-20로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 상이한 스트립을 PBS중에서 세척하고 일차 항체, hu-SPL-SCID 항-F 단백질 혈청, 또는 hu-SPL-SCID 항-테타누스 톡소이드 음성 대조구, 또는 마우스 항-F 단백질 양성 대조구를 1시간 동안 첨가했다. 모든 혈청을 1:500 으로 희석했다. PBS로의 광범위한 세척 후에, 2차 항체, 샘플에 대한 GAH IgG-HRP 및 음성 대조구, 또는 양성 대조구에 대한 GAM IgG를 1시간 동안 첨가했다. 블롯을 4-클로로-1-나프톨로 나타냈다.

면역 형광 검사:

RSV 감염 HEp-2 세포(4ㅧ10⁴)를 빙결된 차가운 아세톤을 사용하여 유리 슬라이드상에 고정시키고 37℃에서 1시간 동안 1:10 으로 희석된 혈청 20㎕ 또는 정제된 MAb, 2㎕/ml과 반응시켰다. 슬라이드를 세척하고 결합된 항체를 37℃에서 30분 동안 GAH IgG-FITC로 나타내고 형광 현미경으로 관찰했다.

FACScan 분석:

RSV 감염 HEp-2 세포(10⁶ 세포/샘플)을 세척용 완충액(소듐 아지드 0.1%를 갖는 PBS)로 세척한다. 세포 펠릿을 2㎍/ml RF-1 또는 RF-2를 함유하는 인큐베이션 완충액(BSA 0.1%로 보강된 소듐 아지드 0.1%를 갖는 PBS) 50㎕중에 재현탁시킨다. 얼음상에서 15분 인큐베이션시킨 후, 세포를 세척하고 얼음상에서 추가 15분 동안 GAH IgG-FITC를 함유하는 인큐베이션 완충액중에서 재현탁시켰다. 3회 세척 후, 세포를 1% 포름알데히드를 갖는 PBS 1ml중에 고정시키고 벡톤-딕킨손 FACScan 기기에서 분석했다.

친화성 측정:

가용성 F 단백질에 대한 인간 MAb 친화성을 측정하는데 2가지 방법을 사용한다:

플라스몬 공명에서, IASYS 기기를 사용하여, 항체를 질향의 변화가 장치의 건조부 상에서 라이트 숀(light shone)의 굴절의 변화를 기초로 하여 결정될 수 있는 장치의 습윤부에 공유 결합시켰다. F-단백질의 다른 농축물을 가하고, 후속하여 항정 흐름의 PBS를 사용하여 용리시켰다. 항체로부터 F-단백질 방출의 결과로서 매스에서의 변화를 측정하고, 반응 속도론으로부터 K_off를 결정했다. Ka를 초기 포화의 상이한 수준으로부터 오프 속도를 시험함으로써 계산했다.

대안적으로, 친화도 상수를 하기와 같이 Wiseman et al. 및 Robert et al.에 따라 마이크로-칼로리미트리에 의해 결정했다: RF-2 및 F 단백질을 42℃에서 열실에서 공지된 농도로 동시 인큐베이트시키고 용액중에서 면역 복합체 형성으로 인한 엔탈피 변화를 측정했다. 반응을 50℃에서 반복했다. 결합 해리 상수 K를 하기의 방정식으로 Robert et al.에 따른 온도 및 엔탈피 변화의 함수로서 계산했다:

상기 방정식에서, Kob는 결합 평형 상수이고 △H^obs는 제공된 절대 온도, Tob에서의, 실험적으로 관찰된 엔탈피 변화이고; R은 보편 기체 상수(1.987)이고 △C는 실험적으로 결정된 결합 열 용량 변화이다.

보체-강화된 바이러스 중화 분석:

치료 받는 유아로부터 분리된 두 개의 실험 계통(롱(Long), 타입 A 및 18537, 타입 B)과 열 개의 야생형 타입 RS 바이러스 단리물은 항-F 단백질 인간 MAb의 중화 능력을 평가하는데 이용했다. 일련의 희석된 인간 MAb은 100㎕ IMDM/웰 마이크로적정 플레이트에서 보체의 존재하에 바이러스(50 내지 100 pfu)와 30분 동안 실온에서 미리 인큐베이션하였다. HEp-2 세포(5ㅧ104/웰)를 100㎕ MEM에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 아세톤으로 고정시키고, 공기 건조시키고, 마우스 MAb를 이용한 ELISA로 RSV 항원을 검출하였다. 항체를 갖지 않는 대조 웰과 비교하여 중화 종료점을 항체 생성물을 50% 감소시키는 희석제로 전단적으로 측정하였다.

바이러스 융합 억제 분석:

융합 억제 역가를 마이크로적정 플레이트에서 VERO 세포(5ㅧ103/웰)를 갖는 100 TCID₅₀ RSV 롱(A 바이러스 원형) 또는 RS 6556(임상적으로 분리된 형태 B)를 37℃, 5% CO₂에서 4 시간 동안 미리 인큐베이션함으로서 측정하였다. 인간 모노클로날 항체의 다양한 농도 또는 대조구를 각각의 웰에 첨가하고, 4배 배양으로 37℃, 5% CO₂에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 대조구 배양은 항체의 부재하에서 바이러스에 감염되지 않은 세포(음성) 또는 감염된 세포(양성)를 함유하였다. 토끼 폴리클로날 항-F 단백질 항혈청 및 HRP-표지된 항-토끼 IgG를 이용한 ELISA로 바이러스 성장을 측정하였다. 반응을 TM블루 기질(KPI, Gathersburg, MD)에서 발현시켰다. 역가(ED50)는 MAb 용량당 반응의 성장 역행 분석에 기초하여 바이러스 성장을 50% 억제시키는 항체의 농도로 정의하였다.

실시예 1

HU-SPL-SCID 역가:

15마리의 SCID 마우스에 ITP 조건으로 단일 공여체로부터 인간 비장세포를 제공했다. 세포를 IL-2 및 다른 농도의 가용성 F 단백질의 존재하에서 3일 동안 미리 배양하였다. 모든 동물은 성공적으로 재구성되었고, F 단백질이 추가접종된후, 혈청중의 인간 IgG 농도가 총 12㎍/㎖ 내지 10㎎/㎖로 변화되고, 항-F 단백질 역가는 3ㅧ10² 내지 10⁶(표 Ⅰ)로 변화되었다. 생체외에서의 F 단백질 노출과 생체내에서의 항-F 단백질 역가의 상호 관계는 관찰되지 않았다. 말 페리틴 항원 시스템에서 본 발명을 사용하여, 항원 노출이 후속하는 생체내에서의 특정 항체의 역가를 확실히 하기 위해 비장세포의 생체외 배양중에 필수적임이 이미 관찰되었다. 이들 두 시스템 사이의 불일치는 포함된 항원의 상이함에서 기인된 것이다: 인간은 말 페리틴에 자연상태에서 노출되지 않기 때문에, ⅣⅠ 단계는 비장세포의 항원 프라이밍을 포함하고, 생체내에서의 일차 반응을 유도한다; 반면에, 실질적으로 모든 인간은 어렸을 때 자연적인 감염을 통해 RSV에 면역이 되고, 이것은 F 단백질에 대한 영구적 기억을 유도하여, 생체외에서의 IL-2 단독 자극에 후속하는 생체내에서의 F 단백질의 추가접종이 제 2 반응을 유도하는데 충분하다.

항혈청은 등전기 집속 패턴(기재되지 않은 데이터)으로부터 판별된 것으로서의 폴리클로날이었다. 그들을 웨스턴 블롯에서 F 단백질에 대한 반응성으로 시험하였다. 본 결과는 폴리클로날 인간 Ab가 이들의 이합체 형태(140KD) 및 이들의 단량체 형태(70KD) 모두에서 가용성의 미처리된 F 단백질을 인식함을 제시지하였다; 이들은 또한 48KD과 23KD의 두 개의 서브유니트에 특이적으로 결합하는 변성된 F 단백질과도 강력하게 반응한다(도 1에서의 대표적인 데이터). 이것은 F 단백질에 대한 체액 반응의 하나 이상의 분획이 선상, 즉 분자의 비 입체형태적 에피토프에 대하여 직접 반응함을 암시한다. 면역형광법 연구는 또한 RSV-감염된 HEp-2 세포와 강하게 반응하는 hu-SPL-SCID 혈청, 면역 혈청, 그러나, 미처리된 SCID 마우스 혈청을 제외한 혈청의 특이성을 증명하였다(도 2). 음성 대조구로 이용된 비감염된 HEp-2 세포에 대한 반응성은 관찰되지 않았다. 따라서, 가용성 F 단백질은 자연적으로 감염된 세포상에 발현되는 막 바이러스성 항원에 특이적인 항체 생성을 위한 항원으로 적합하였다.

실시예 2

종양 세포 배양에서 항체의 동정:

높은 항-F 단백질 역가를 갖는 모든 마우스는 희생시키고, 인간 세포를 복막 관류 및 비장으로부터 채취하였다. 두 마리 마우스(hu-SPL-SCID ＃6 및 hu-SPL-SCID ＃15)는 복부에 고형 종양을 자발적으로 생성했으며, 상기 종양을 회수하여 단일 세포 현탁액으로 분쇄했다. 종양 세포는 ELISA에서 측정된 것으로서의 특이적 항-F 단백질 항체를 분비하였다. 이러한 종양 및 항체를 RF-1(RSV F-단백질) 및 RF-2로 명명했다. RF-1 및 RF-2를 약 2개월의 분리된 두 개의 상이한 실험에서 생성하고, 개별적인 hu-SPL-SCID 마우스로부터 단리했기 때문에, 이들은 별개의 항체이다; 이들은 약 36 내지 48 시간의 배가시간(doubling time)으로 분리하여, 각각 18개월 및 16개월 이상 동안 배양시켜 자리를 잡게했다. 특이적 항체 농도는 0.5ㅧ10⁶ 세포/㎖로 접종하여 3일 동안 증식시킨 배양에서 일반적으로 0.5 내지 1㎍/㎖였다.

추가적인 특성확인을 위해, 두개의 인간 MAb를 단백질 A 세파로스(Sepharose) 칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피로 배양 상청액으로부터 정제하였다. RF-1 및 RF-2 양자 모두는 ELISA중의 F-단백질과 각각 0.6 및 1 ng/㎖에서 반최대 결합을 갖는 IgG(_1.k)이다(도 3). IEF중의 이동 패턴으로부터, RF-1 및 RF-2 등전점은 각각 8.8 및 8.9로 측정했다(도 4). RF-1 및 RF-2는 특히 유속 세포분석법에서 RSV로 감염된 HEp-2 세포를 특이적으로 인식하였다(도 5). RF-1에 대한 해리상수, Kd를 10^-10M 범위의 IASYS 기기상에서 플라스몬 공명으로 측정하였다. RF-2의 Kd 상수를 위스먼 등(1989) 및 로버트 등(1989)에 따른 2ㅧ10^-9M에서의 적정 마이크로 열량 측정법으로 측정하였다.

실시예 3

항-F-단백질의 조직 특이성

정제 항체를 유속 세포분석법에 의해 측정된 간접적인 면역형광법 분석에 의해 ATCC에서 입수가능한 일련의 인간 세포주에 대한 반응성으로 스크리닝하였다(표 Ⅱ): 결과는 항체가 호흡 관 내층(HEp-2, 후두부 표피양 암종, cat. 번호. CCL 23), 간장(HepG2, 인간 간종양 세포주, cat. 번호. HB 8065), 임파성 조직(SB, 인간 B 임파구종성피진 세포 계통, cat. 번호. CCL 120 및 HSB, T 임파구종성피진 계통, cat. 번호. CCL 120.1) 및 전립선(LNCaP. FGC, 인간 전립선 선암 계통, cat. 번호. CRL 1740)을 나타내는 세포주와 결합하지 않음을 보였다.

실시예 4

생체외에서 기능적 활성:

항체가 생체외에서 바이러스 중화 효과를 갖는지의 여부를 측정하기 위해, 이들을 기능적인 분석법의 두가지 형태로 실험하였다: 감염 중화 분석은, 세포에 이들을 첨가하기 전에 정제된 MAb를 지닌 바이러스를 미리-반응시킴으로써 수행하였으며, 그 결과 상기 분석은 바이러스 감염성을 억제하기 위한 MAb의 능력을 반영했다; 세포에 바이러스가 침입한 후에, 융합 억제는 바이러스 성장 및 증대를 억제하기 위한 Ab의 능력을 반영한다. 둘 모두의 분석 결과를 EIA에서의 바이러스 항원 역가의 측정으로서, 주어진 인큐베이션 시간 후에 배양중에 방출된 바이러스의 양으로 측정하였다.

둘 모두의 Ab는 RF-1 및 RF-2 각각에 대한 농도 30ng/㎖ 내지 1000ng/㎖ 및 8ng/㎖ 내지 165ng/㎖에서 단리되어 실험된 모든 12마리의 바이러스 감염을 억제할 수 있었다. RF-2는 RF-1보다 더 잘 수행하였고, RF-1 보다 1.25 내지 10배 낮은 농도에서 50% 바이러스 억제(ED50) 수율을 나타냈다. 데이터를 표 Ⅲ에 제시했다.

예상했던 바와 같이, 보다 더 높은 농도의 MAb를 미리 감염된 세포에서 융합 및 바이러스 항원의 발현을 억제하기 위해 필요하였다. 이 분석에서, RF-1은 RF-2보다 5 내지 10배 더 효능이 있었다. 둘 모두의 MAb는 타입 A 원형 RS 롱보다 타입 B 원형 RS 6556에서 보다 더 효과적이었다(표 Ⅲ).

표 Ⅰ: 단일 혈액 공여체로부터의 비장세포를 IL-2의 존재하에 3일 동안, F 단백질의 존재 또는 부재하에 배양하였다. SCID 마우스를 4ㅧ10 세포로 재구성하였고, CFA에서의 F 단백질 ip 10㎍으로 추가접종시켰다. 마우스 ＃ 1, 2, 3, 4, 및 5에서, 신선한 자가 세포(20ㅧ10⁶)을 추가접종과 함께 주입하였다. 인간 IgG 농도를 폴리클로날 IgG 표준 곡선과 비교하여 측정하고, 항-F 단백질 역가를 EIA에서 종말 점 희석에 의해 측정하였다.

표 Ⅱ

세포주	조직 형태	조직 표지
HEp-2RSV 감염된-HEp-2SBHSBLNCaPHepG2	후두 표피후두 표피(RSV)림프양림프양전립선간장	-++++----

표 Ⅱ: 다양한 세포주에서의 RF-2 반응성. 다양한 세포주를 RF-2,200 ng/10⁶ 세포를 갖는 간접적 면역형광 표지로 시험하였다. Fab 염소 항-인간 IgG-FITC를 제 2 단계로서 이용하였다. RF-2의 존재를 나타내는 (-)는 평균 형광 채널의 변화를 유도하지 않았다; (+)는 0.5log에 의해 평균 표지의 증가를 나타냈다.

표 Ⅲ

항체	융합 억제 활성ED50 역가		항체	감염 중화 활성ED50 역가
	RS 롱(타입 A)	RS 6556(타입 B)		MR 144(타입 A)	18537(타입 B)
RF-1	660ng/㎖	40ng/㎖	RF-1	30ng/㎖	30ng/㎖
RF-2	3300ng/㎖	400ng/㎖	RF-2	8ng/㎖	12ng/㎖

표 Ⅲ: ED은 모노클로날 항체 용량-반응의 성장 역행 분석에 기초하여 바이러스 성장을 50% 억제하는 항체의 농도로 정의된다.

실시예 5(비교)

생체외에서 F-단백질에 대한 IgG 리콜 반응의 유도:

2세 초과의 집단의 95% 초과가 RSV[참고 문헌: Henderson et al, J.Med. (1979), 300, 530-534]에 노출되어 왔고, RSV에 성공적으로 반응하였다. RSV F-단백질을 갖는 생체외에서의 비장세포의 접종은 리콜 반응을 유도하고, 실제로 대부분의 IgG 반응은 비장세포를 갖는 생체외 실험에서 유도했다(도 5 참조). 적정 항체 농도 즉, 40ng/㎖는 일차 반응을 유도하는 항체에 대해 관찰한 것, 즉 페리틴 보다 크기의 정도에 있어서 하나 이상 더 작았다. [참고 문헌: Ilig/㎖, Boerner et al, J.Immunol., 1991, 147, 86-95; Brams et al, Hm. Antibod. Hybridomas, 1993, 4, 47-56]. 따라서, 생체외에서 F-단백질을 갖는 프라이밍이 이차 반응을 유도하는 것으로 여겨질 수 있다. 생체외에서, RSV F-단백질에 대한 현저한 반응을 유도하기 위한 여러 시도는 PBMCs 및 편도선 유도 세포에서 실패했다.

생체외 프라이밍된 비장세포로부터 모노클로날 항체를 유도하기 위한 제한된 노력은 RSV F-단백질에 대한 여러 모노클로날 IgG 항체를 유도했다. 그러나, 이들중 대부분은 ELISA에서 여러 대조 항원과도 교차반응을 하였다(결과는 기재되지 않았음).

실시예 6

RF-2에 대한 유전자 코딩의 클로닝:

RF-1 또는 RF-2 클론 어느 것도 현저한 양의 항체를 생성하지 않는다. 또한, 이들 세포주 둘 모두는 20% FCS를 갖는 배지에서 가장 잘 자라며, 소 IgG를 갖는 정제된 항체의 오염을 유도하기 때문에 불리하다. 따라서, 유의할 만한 동물 모델 시험에 필요한 양의 항체(통상적으로 선택된 항체의 1 그램 이하가 필요하다)를 생성하고, 정제하기 위해, RF-1 및 RF-2를 코딩하는 유전자를 생산 벡터 및 세포주에 전달하는 것이 유리하다. 본 양수인, IDEC 파라마세우티칼, Inc.는 CHO 세포에서 인간 모노클로날 항체의 생성을 유도하는 아주 효과적인 진핵생물 생성 시스템을 계발해 왔다. 이 벡터 시스템은 문헌[ U.S Serial NO. 08/379,072, filed January 25, 1995, 및 U.S Serial NO. 08/149,099, filed November 3, 1993(이 둘 모두는 본 원의 참조에 의해 같이 이용됐다)]에 설명되어 있다. 이러한 시스템을 통상적으로 사용하여, 항체 유전자 트랜스펙션된 CHO 세포가 스핀너 배양에서 혈청 부재 배지 1리터당 항체 약 200㎎을 생성하였고, 메토트랙사트에서 증폭시킨 후, 발효조에서 500㎎/리터 보다 더 많이 생성했다.

세포 배양(하기 참조) 클로닝된 RF-2 세포 약 5ㅧ10⁶를 mRNA 분리 키트 즉, 패스트 트랙트(In VitroGen, San Diego, California)를 이용하여 RNA 추출하였고, 단일 가닥 cDNA를 올리고-dT 플라이머 및 역전사효소를 이용하여 제조하였다. cDNA의 부분을 가변 영역 유전자의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 위한 출발 물질로 이용하였다. PCR은 두 세트의 프라이머를 이용하여 수행했다(표 Ⅳ 참조).

표 Ⅳ ^*

Mlu 1 부위를 갖는 중쇄 프라이머

Nhe 1 부위를 갖는 중쇄 불변 영역 프라이머 안티-센스 가닥

Dra Ⅲ 부위를 갖는 카파 사슬 프라이머

Bis WI 부위를 갖는 카파의 불변 영역 프라이머 안티-센스 가닥

^*표 Ⅳ에 대한 범례: 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변영역의 PCR 증폭에 이용하였다. 클로닝에 대한 제한 부위는 굵은 선으로 표시했다.

프라이머의 제 1 세트를 중쇄 가변 영역을 증폭하기 위해 디자인했다. 이것은 J 영역에 결합하는 하나의 3'프라이머 및 후기의 리더 및 골격 1 영역에 결합하는 다섯개의 집단-특이적 5'프라이머로 구성되었다. 프라이머의 제 2 세트를 카파 가변 영역을 증폭하기 위해 디자인했다. 이것은 후기의 리더 및 골격 1 영역에 결합하는 하나의 3'프라이머 및 네 개의 5'프라이머로 구성되어 있다. PCR 반응을 아가로스 겔상에서 전기영동 시켜서, 정확하게 크기가 350 염기 쌍 밴드를 절단하였다. DNA를 전기현탁시키고, 적당한 제한효소로 절단하고, IDEC's NEOSPLA 발현 벡터로 클로닝하였다(도 6 참조).

인간의 항체 발현용으로 사용한 NEOSPLA 벡터는 다음과 같다: CMV = 시토메갈로바이러스 프로모터, BETA = 마우스 베타 글로블린 주요 단백질, BGH = 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날, SVO = SV40 리플리케이션 오리진. N1 = 네오마이신 포스포암스페라아제 엑손 1, N2 = 네오마이신 포스포트렌스퍼라아제 엑손 2, LIGHT = 인간의 면역글로불린 카파 불변 영역. Heavy = 인간의 면역글로불린 감마 1 또는 감마 4 PE 불변 영역. L = 리더. SV = SV40 폴리아데닐화 영역.

면역글로불린 유전자를 대량으로 생성시키기 위해, IDEC's NEOSPLA 발현 벡터를 설계하였다[참고문헌: Reff et al, Blood, (1994), 83, 435-445](본원에 인용됨). 이들 벡터를 사용하여, 마우스/인간 키메라(chimerics), 영장류/인간 키메라 및 인간 항체를 높은 수준으로 성공적으로 발현시켰다. NEOSPLA는 적합하게 통합된 플라스미드 벡터 DNA를 갖는 CHO 세포 선택용 네오마이신 포스포트렌스퍼라아제 유전자를 함유했다. 또한, NEOSPLA는 메토트렉세이트, 인간 불변 경쇄(κ또는 λ) 및 인간 불변 중쇄 영역(γ1 또는 γ4(PE))에서 증폭용 히드로폴레이트 리덕타아제 유전자를 함유한다. 감마 4(PE)는 인간 γ4 불변 영역으로서 두 개의 돌연변이 즉, 잔류 FcR 결합을 제거하기 위해 도입된 CH2 영역에서 글루탐산, 및 중쇄 이황화 결합의 안정도를 증가시킬 의도의 힌지(hinge) 영역에서 프롤린 치환을 갖는다. 상기 내용은 문헌[Algre et al, J. Immunol., 148, 3461-3468, (1992); Angal et al, Mol. Immunol., 30, 105-108(1993)]에 기술되어 있으며, 본원에서 참조로 인용된다. 유일한 제한 부위는, 원하는 경쇄 가변 영역의 삽입을 용이하게 하기 위해 벡터내로 통합되었다. [참고문헌: Reff et al., Blood, (1994), 83, 435-445].

RF-2의 경쇄가 NEOSPLA중으로 복사되어 클로닝되고, 문헌[Sanger et al., Pro. Natl. Acad. Sci. (1977), 74, 5463-5467]에 기술된 방법에 따라 시퀀싱되었다. 카파 쇄는 다수의 카파 2 서브그룹이다. 유사하게, RF-2의 인간 중쇄 가변 영역을 단리하고, 인간 γ1 불변 영역의 앞에 클로닝시켰다.

RF-1 및 RF-2의 경쇄 코딩 유전자를 용이하게 클로닝시켰으나, 중쇄를 엔코딩하는 유전자의 cDNA는 통상의 Tac 역전사효소를 생성시킬 수 없었다. 그러나, 이러한 문제는 고온 즉 70℃, 역전사효소를 대체시킴으로써 제거하였다. 이로 인해, V_H2 족 유전자로부터 주로 유도된 프라이머와 함께 손상되지 않은 PCR 생성물을 수득하였다.

RF-1 가변 경쇄 도메인 및 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열 및 핵산 서열은, 각각 도 7a 및 도 7b에 나타냈다. RF-2에 대한 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열 및 핵산 서열은, 각각 도 8a 및 8b에 나타냈다. 도 9a-9c는 NEOSPLA 벡터에서 발현된 RF-1에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다. 도 9a 및 도 9b는 리더, 가변 경쇄 및 중쇄, 및 인간 불변 영역 서열 즉, 인간의 카파 영역 및 인간의 감마/불변 영역을 도시한다. 도 9c는 인간 감마/불변 영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 도시한다. 도 10은 도 9a-9c에 도시된 서열의 발현용으로 제공하는 발현 벡터 및 그 결과의 CHO 세포중 재조합 RF-1을 개략적으로 도시한다.

도 11a-11c는 유사하게, 리더 서열, RF-1 가변 경쇄, 인간 카파 불변 영역, RF-2 가변 중쇄, 및 인간의 감마/불변 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 유사하게 도시한다. 도 12는 CHO중에서 재조합 RF-2의 발현용으로 제공되는 발현 벡터를 개략적으로 도시한다.

실시예 7

EBV 형질전환된 세포의 클로닝용 프로토콜의 수행

EBV 형질전환된 세포로부터 항체 생성은 연속적으로 감소되어 결국에는 중지된다. [참고문헌: Kozbor et al., J. Immunol. (1981), 127, 1275-1280]. 항체 생성을 계속적으로 수행하기 위해서는, 수행하기 전에 세포로부터 면역글로불린 코딩 유전자를 추출하여 적합한 발현 시스템으로 이들을 옮기는 것이 필수적이다. EBV 형질전환된 세포에 의해서 생성된 항체의 항원 결합 가변 도메인에 대해 코딩하는 유전자를 분리해내기 위해, 세포 물질이 모노클로날이라는 것을 확인하는 것이 필수적이다. 그러나, EBV 형질전환된 세포는 제한적인 희석으로 인해 또는 반고체의 한천(agar)에서 클로닝시키기가 매우 어렵다. 본 발명자의 두 항-F 단백질 항체 즉, RF-1 및 RF-2의 단백질 A 정제된 제조물의 등전기 집속 겔 전기 영동법은 RF-2 제조물중에서의 둘 이상의 항체 집단, 및 RF-1 제조물중에서의 올리고클론성의 가능성을 보여주었다.

공급층으로서 문헌[Zhang et al., J. Immunol., (1990)]에 기술된 마우스 티오마 세포주 EL-4 B5를 사용하여, 제한 희석액을 통해서 단일 세포로부터 세포를 확장시켰다. 인간의 티오마 세포주 EL-4 B5는 B 세포를 성장시키는 막 수용체 경로에서 gp39를 발현시킨다. 5ㅧ10⁴ EL-4 B5 세포/웰을 미소 역가판에 플레이팅시키고, 배양액으로부터 세포를 EL-4 B5 층상에 다양한 농도, 0.38세포/웰 농도부터 그 이상의 농도로 플레이팅시켰다. 적절한 시간이 경과한 후, 플레이팅한 각 농축물에 대해, 증식이 있는 웰을 계수했다.

상청액을 인간의 IgG의 존재 및 항원-특이적 IgG에 대하여 시험하였다. 이러한 프로토콜에서, 본 발명자들은 본래의 올리고클로날 제조물로부터 각각 RF-1(표 5 참조) 및 RF-2(표 6참조)를 생성시키는 세포를 분리하고 클로닝시켰다. 클로닝시에 발견된 비특이적 항체를 단지 이소타입과 관련하여 분석하였고, 이를 통해 특이적 항체, IgGlk와 동일하다는 것을 발견하였다. 생성된 IgG의 수량 뿐만 아니라 RF-1의 배양중에 다양한 시점에서 제조된 결빙물로부터 F-단백질 특이적 클론의 수율을 기초로 하여, 특이적 항체가 배양 개시 이후 곧바로 전체 항체 수량의 약 1/20까지 생성되고 배양액중에서 약 8개월 후에 소멸된 것을 알 수 있었다. RF-2는 전체 IgG의 훨신 더 높은 부분을 구성하며, 어떠한 시점에서도 10% 이상이었다. 올리클로날 제조물로부터의 항체를 사용하여 생체외 중화 데이터를 생성시켰으며, 이는 과대 평가된 ED50 역가를 초래했다. 그러나, 본 발명자들의 플라스몬 공명을 사용한 친화성 연구는 순수한 항체의 사용에 의존하는 것은 아니다. 적정 마이크로 칼로리미터를 사용하는 친화성 연구를 클로닝된 물질과 함께 수행했다.

표 V*

세포/웰의 수	웰의 수	항-F 웰의 수 (%)	증식이 있는 웰의 수
30	48	48(100)	48(100)
10	48	48(100)	48(100)
3.3	96	27(28)	68(71)
1.1	192	17(9)	112(58)
0.38	384	18(5)	116(30)

* 표 5에 대한 범례: 제한적인 희석에 의한 RF-1의 클로닝. 평평한 바닥의 96웰 플레이트중에 EL4-B5를 5ㅧ10⁴세포/웰로 플레이팅시켰다. 약 24시간 후, 지수 증식기 단계의 RF-1 세포를 공급물 층상에 기술된 농도로 플레이팅시켰다. 2-3주 후에, 증식 및 항-F 활성의 존재에 대해 웰을 계수했다.

표 6*

세포/웰의 수	웰의 수	항-F 웰의 수 (%)	증식이 있는 웰의 수 (%)
30	40	40(100)	15(37.5)
10	120	120(100)	22(18)
3.3	120	102(85)	9(7.5)
1.1	120	50(41.6)	1(0.83)
0.33	180	30(16.7)	5(2.8)

* 표 14에 대한 범례: 제한적 희석액에 의한 RF-2의 클로닝. 표 8에서와 같이 수행했다.

생체외 바이러스 중화 활성을 지닌 두개의 인간 모노클로날 항체의 임상 적용성을 확인하기 위해, 이들 항체는 두개의 다른 동물 모델에서 RSV 감염을 치유하는 이들의 효능에 대해 추가로 특성확인하였다. 이러한 전임상 성능 평가는 발현 벡터중으로 삽입된 항체에 대해 코딩하는 클로닝된 유전자로 트란스펙션된 CHO 세포에 의해 생성된 물질로 수행했다(도 6 참조). 두개의 항체 모델은, 하나는 손상되지 않은 보충물 및 Fc 수용체 결합 영역 즉, γ1이며, 하나는 이들 도메인이 없는 즉, γ4(PE 돌연변이체)였다. [참고문헌: Alegre et al., J. Immunol.,(1992), 148, 3461-3468; Angal et al., Molecular Immunology, (1993), 30, 105-108]. γ4 버전을 시험하기 위한 이론적 근거는 두가지 생각에 기초한다: (i) 항-F-단백질 Fabs는 생체외에서 현저한 바이러스 중화 효과를 나타내며[참고문헌: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1992), 89, 10164-10168, 및 Crowe et al, Proc. Natl. Acad. Sci.(1994), 91, 1386-1390], (ii) 폐로 직접 투여되는 경우에도, 바이러스 감염에 의해 이미 긴장된 감염되기 쉬운 조직에서 이펙터 기능 활성화에 의해 야기된 폐 손상을 잠재적으로 회피하는 것은 유리할 수 있다. 한 세트의 비특이적 대조구 항체로서, 하나는 γ1이고, 하나는 γ4(PE)인 대조구 항체는 사내의 비특이적 히브리도마 IgG₁ 항체로부터 제조할 수 있다.

제 1 동물 모델은 마우스 모델[참고문헌: Taylor et al., J. Immunology (1994), 52, 137-142; Walsh, E.E., J. Infectious Diseases(1994), 170, 345-350]이다. 이러한 모델을 사용하여, 1 주일 인큐베이션 후 폐 조직에서 바이러스 로딩이 2 로그만큼 감소하는 결과를 초래하는 최소 용량으로서 정의된 유효 투여량을 결정했다. 이러한 모델을 사용하여 어느 항체 모델을 사용할 지를 결정했다. 제 2 동물 모델은 아프리카산 사바나원숭이를 사용하는 영장류 모델이다[참고문헌: Kakuk et al, J. Infectious Diseases(1993), 167, 553-561]. RSV는 아프리카산 사바나원숭이의 폐 손상을 야기시키며, 이러한 모델의 주된 목적은 항체의 특성을 억제하는 손상을 평가하기 위함이다. 이 모델에서 시험 횟수는 하나의 항체를 5가지 상이한 투여량으로 시험하는 것으로 제한했다. 감염 데이터와 관련된 항체, 투여량 및 주입물 데이터는 마우스 모델에서 발견된 사실을 기초로 하여 측정했다. 폐 절편은 플라크 검정으로 바이러스 로딩에 대해 조사하고, 광현미경으로 RSV에 대한 병변을 검출했다.

두 항체를 생성시키는 세포를 자극하여 증대시키는 공정중에 아미노산 서열의 변화가 있는 경우 이것이 발생하는 경우 관찰하였다. 이것은 RF-1 및 RF-2의 유전자 코딩 서열이 두 개의 세포주가 발생되는 본래의 동결된 세포 물질에 존재하는 지의 여부를 RF-1 및 RF-2의 중쇄의 CDR3 영역에 기초한 한 세트의 PCR 프라이머로 시험함으로써 수행했다. 양성 대조구는 RF-1 및 RF-2 스파이킹된(spiked) 공급원 세포였다. 분석은 문헌[Levy et al., 1989, Levy et al., J. Exp. Med. (1989), 169: 2007 and Alegre et al., J. Immunol. (1992), 148, 3461-3468; Angal et al., Molecular Immunology(1993), 30, 105-108; Foote et al.,Nature(1991), 352, 530-532; Rada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1991), 88, 5508-5512; Kocks et al., Rev. Immunol. (1989), 7, 537-559; Wysocki et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1986), 83, 1847-1851; Kipps et al., J. Exp. Med. (1990), 171, 189-196; Ueki et al., Exp. Med. (1990), 171, 19-34]에 기술된 방법과 같이 수행했다.

실시예 8

다량(>100㎎/리터)의 RF-1 및 RF-2를 생성시키는 CHO 세포주의 생성:

a. 발현 플라스미드의 트랜스펙션, 최고 수준의 RF-1 및 RF-2를 발현시키는 G418 내성 CHO 클론의 단리 및 증대.

RF-1 및 RF-2 가변 영역 유전자를 NEOSPLA중으로 클로닝시켜, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포(DG44)[참고문헌: Urlaub et al, J. Somat. Cell Mol. Genet.,(1986), 16, 555]는 플라스미드 DNA로 형질전환시켰다. SSFM H 마이너스 히포크산틴 및 티미딘(C1BCO)중에서 CHO 세포를 배양시켰다. BTX 600 일렉트로포레이션 장치(캘리포니아 산디에고에 소재하는 BTX에서 구입가능)를 사용하여, 0.4㎖ 일회용 큐벳에서 4ㅧ10⁶ 세포를 25㎍ 플라스미드 DNA와 함께 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션을 수행하기 전에, 박테리아에서 배양에 사용된 플라스미드의 일부로부터 포유류 세포에서 발현된 유전자를 분리하는 Pac I로 플라스미드 DNA를 절단했다. 일렉트로포레이션의 조건은 230V, 400㎌, 13Ω이었다. 각 일렉트로포레이션을 96웰 디시(약 40,000세포/웰)중으로 플레이팅시켰다. 일렉트로포레이션을 수행한지 3일 후에 400㎍/㎖에서 G418(Geneticin, GIBCO)를 함유하는 배지를 디시에 공급하고, 그 후에, 콜로니가 생성될 때까지는 주기적으로 공급했다. 인간 IgG의 존재 및 항-F-단백질 활성에 대해 ELISA에서 클로니로부터의 상청액을 검정했다.

b. 메토트렉세이트중에서 항체 발현 증폭.

가장 많은 양의 면역글로불린을 생성시키는 G418 내성 콜로니를 거대 용기에 옮겨서 증대시켰다. 유전자 증폭 즉, 96웰 디시에서 5nM 메토트렉세이트(MIX)중에서 선택하여, 가장 많이 분비하는 G418 클론의 발현을 증가시켰다. 가장 많은 양의 항체를 생성하는 5nM 콜로니를 증대시키고, 이어서 96웰 디시중 50nM MTX에서 선택하여 발현물을 다시 증폭했다. 이러한 프로토콜을 수행한 다음, 본 발명자들은 스피너 배양액중에서 7일 이내에 200mgs/리터(6일 이내에 발효기중에서 0.5그램/리터 이상)를 분비하는 CHO 세포를 미리 유도할 수 있었다. 다음, 단백질 A 친화성 크래마토그래피를 사용하여 상청액으로부터 인간의 항체를 정제했다.

c. 항체의 생성 및 정제

100㎎의 각 항체를 생성시켰다. 선택된 항체는 마우스 모델 연구로부터 결정된 양으로 생성시켰다. 50nM 메토트렉세이트를 함유한 CHO-S SFM II 혈청 부재 배지(GIBCO Cat. No. 91-0456DK) 중에서 선택된 CHO 트렌스펙토마스를 갖는 스피너 플라스크를 사용하여 요구량의 항체를 생성시켰다. 상청액을 수거하고, 한 세트의 필터를 통해 여과하여 특정 물질을 제거하며, 0.2nm 필터로 마무리 하였다. 전체 항체의 양을 기초로 하여 미리 결정된 크기를 갖춘 단백질 A 칼럼을 통해 상청액을 유출시켰다. 세척 후, 항체를 칼럼(0.1M 글리신/HCl, pH 2.8)으로부터 중성 완충액(1M 트리스/HCl, pH7.4)중으로 용리시켰다. 아미콘 센트리프렙 또는 센트리콘 30(Cat. no. 4306 및 4209)를 통한 한외 여과법을 사용하여 살균 PBS로 용리액/중성 완충액을 1000회 이상 광범위하게 교환시켰다. 항체의 농도를 2㎎/㎖로 조정하고, 0.2nm 필터를 통한 여과법을 사용하여 살균했다. 항체를 정제하여, 동물에 사용할 때까지 2㎖ 냉동관중의 얼음상에 저장했다.

실시예 9

RSV 동물 모델에서의 수행능에 관한 RF-1 및 RF-2 특성확인

적합한 동물 모델을 사용하여 RF-1 및 RF-2의 수행능을 측정한다. 평가는 두 단계 즉, 먼저 (a) 항체의 효능을 측정하기 위한 Balb/c 모델[참고문헌: Taylor et al., J. Immunology(1984), 52, 137-142; Crowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1994), 91, 1396-1390; Connors et al., J. Virology(1992), 66, 7444-7451], 및 어떠한 타입의 지지 형태(이펙터) 기능이 동물에서 바이러스 로딩을 제거하는데 필수적인 가를 측정하는 것으로 나뉜다. 마우스 모델로부터 얻은 결과로부터, 영장류 모델에서의 추가적 연구를 위해 하나의 후보를 선택했다. 영장류 모델은 아프리카산 사바나원숭이 모델[참고문헌: Kakuk et al., J. Infectious Diseases(1993), 167, 553-561]이었다. 영장류 모델은 본 모노클로날 항체가 바이러스 관련 폐 손상을 억제하는데 사용될 수 있는 지를 확인하는데 특히 적합했다.

a. 마우스 모델에서의 시험 수행능

본 발명자들이 선택한 설치류 모델은 Balb/c 마우스였다. 이러한 모델은 수동 치료 연구용으로 특성확인되었다[참고문헌: Crowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci(1994), 91,1386-1390; Connors et al., J. Virology(1992), 66, 7444-7451]. Balb/c 마우스는 모든 연령에서 상위 및 하위 기도 양자 모두에서 RSV의 성장을 주로 허용한다[참고문헌: Taylor et al., J. Immunology(1984), 52, 137-142]. 동물은 5 그룹으로 나누어 사육하고, 규정량의 마우스 음식, 및 임의로 물을 먹이며, 로체스터 제너럴 호스피탈 비바리움 가이드라인에 따라 보호했다. 이들 지침은 뉴욕 스테이트 헬스 디파트먼트(New York State Health Department), 연방 동물 보호 조치 및 DHHS 법규에 따른다. 주입, 바이러스 감염, 눈 부위 출혈 및 경부 탈구에 의한 희생을 포함하여, 모든 방법을 구멍난 두건내에서 펜트란 마취제하에 수행했다.

i. 유효량의 항체 결정, 및 RF-1 및 RF-2의 γ1과 γ4(PE 버전)의 성능 비교

0일째에 100㎕ 용적의 RSV의 106 롱(서브그룹 A) 또는 10⁵ 18537(서브그룹 B) 플라크 형성 유닛(PFU)의 비내적하에 의해 5마리의 마우스 그룹을 감염시켰다. 4일 째, 피크 바이러스 역가에서, 각각 네 개의 F-단백질 특이적 모노클로날 항체 제조물 또는 대조구 항체를 사용하여 동물에 복강내로 주입시켰다. 시험 용량은 생체와 연구로부터 약 1:300 이상의 혈청 중화 역가를 제공하기 위해 계산된 참조 용량에 초기화하여 집중시켰다. 이러한 역가는 소수의 동물내 RSV를 사용한 접종에 대한 보호 수준과 관련되었다. 투여량 반응은 기준 용량의 25, 5, 1, 1/5 및 1/25로 처리하여 평가했다. 고 용량 또는 저 용량 실험은 필요한 경우에만 수행했다. 상기한 바와 같이, 대조구 마우스에 동량의 이소타입 매칭된 모노클로날 항체를 주입했다. 24 시간 후, 즉 5일 째에 바이러스 발산은 최고였고, 마우스가 사망했다. 심장내 구멍을 통해 혈청을 수득하고, 코 갑개골 및 폐를 제거하며, 중량을 재고, 1 및 2㎖의 NMM중에서 각각 균질화시켰다. 균질화물을 HEp-2 세포상 바이러스에 대하여 역가 측정하고, 바이러스 역가를 TCID₅₀/gm 조직으로 나타냈다. 그룹 사이의 평균 역가를 스투던트 t-테스트에 의한 대조구와 비교했다. 혈청을 감염시 및 희생시에, 효소 면역 검정법 및 중화 검정법을 사용하여 인간의 모노클로날 항체 정량화를 위해 수득했다. IgG 이소타입이 상기도에서 (IgA와 대조적으로) 활성적으로 분비되지 않기 때문에, 바이러스 역가의 가장 큰 감소가 폐 바이러스 증식중에 있을 것을 예측했다. 감염 4일 째에, 치료가 폐 바이러스를 감소시키는데 효과적이지 않음을 입증해야 한다면, 2 및/또는 3일 째에 치료를 평가해야 할 것이다.

보존액 및 주사된 동물로부터의 혈청에 존재하는 각 모노클로날 항체의 역가를 상기한 바와 같이, ELISA를 사용하여 측정했다. 확립된 방법(82)에 따라 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 RSV 융합 단백질을 고상으로 사용했다. RSV G 단백질에 관한 별도의 분석법이 또한 실험적 RSV 감염에 대한 마우스 IgG 반응을 측정하기 위해 고안되었다. 인간 IgG 및 마우스 IgG(Virion Systems, Inc., Bethesda, MD로부터 입수가능)에 특이적인 토끼 항체를 ELISA에서 인간 모노클로날 항체 또는 마우스 항체를 검출하기 위하여 사용했다.

모노클로날 항체의 투여량 반응 효과를, 바이러스 역가를 2 log₁₀ 초과 또는 >99%로 감소시키는 최저 항체 역가로서 항체에 대해 측정했다. 방어의 정도는 희생시 도달되는 혈청 항체 수준과 상호관련이 있었다. 또한, 인간 모노클로날 항체의 다양한 조합에 의한 잠재적인 상승 효과를 측정했다. 상기한 초기 생체외 연구의 결과가 생체내 실험의 가이드로서 사용되었다. 예를 들어, RF-1 및 RF-2가 RSV F 단백질에 뚜렷한 항원성 결합위치를 갖는 경우, 동일한 이소타입(γ1 또는 γ4)의 조합이 상승 방어를 제공할 수 있었다.

ii. 폐조직의 조직학적 측정

폐렴에 대한 수동 치료법의 효과를 표준의 조직병리학 및 면역조직화학 기술에 의해 측정했다. 기관지 주위의 침윤물 및 폐포 침윤물 양자 모두를 1차 또는 2차 감염 후에 마우스에서 기술했다(Conners et al., J. Virology, (1992), 66, 7444-7451). 실험용 동물을 상기한 바와 같이, 모노클로날 항체로 처리했다. 비감염의 비처리 대조구 마우스는 조직학적 효과를 측정하기 위한 비교 대상으로서의 역할을 한다. 감염 5일 및 8일 째에, 폐를 제거하고 포르말린으로 일정한 충전 압력(30cm H₂O)에서 30분 동안 증대. 절단하고 헤마톡실린-에오신으로 착색한 후에, 기관지 주위 및 폐포 영역의 염증성 침윤물(각각, PMN 및 임파구)의 정도를 표준화된 기록 시스템을 사용하여 측정했다. γ1 및 γ4 모노클로날 항체는 보체를 별도로 고정하고 활성화할 수 있다고 예상되기 때문에, 폐 절편을 마우스 C3 침착(deposition)을 위해 염증 영역에서 상업적으로 입수가능한 토끼 항-마우스 C3 항체(Virion Systems, Inc. Bethesda, MD) 및 퍼옥시다아제가 결합된 염소 및 토끼 IgG를 사용하여 착색시켰다.

고정된 폐 조직에서 나타나는 조직학적 변화의 측정에 더하여, 폐렴을 폐포 세포학의 측정으로 평가했다. 상기와 같이 처리한 마우스 그룹을 희생시키고, 기관지폐포세척(BAL)을 PBS 3ml를 하부 기도로 반복하여 주입함으로써 수행했다. BAL의 세포 계수를 수행하고, 세포 타입을 세포원심분리 제조물의 착색에 의해 확인했다.

iii. 감염에 대한 자연 면역 반응에 미치는 항체 요법의 효과

목화쥐 및 올빼미 원숭이에서, RSV 감염의 폴리클로날 IgG 제조물에 의한 수동 치료법은 바이러스에 대한 자연 항체 반응을 감소시켰으나, 동물은 재 접종시 완전히 방어되었다(Hemming et al., J. Infectiouds Diseases (1985), 152, 1083-1086; Prince et al., Virus Research (1985), 3, 193-206). 대조적으로, 그라함은 처리된 마우스가 둔감해진 항체 반응을 가지며, 재 접종에 관하여는 바이러스에 감염되기 쉽다는 것을 발견하였다(Graham et al., Ped. Research (1983), 34, 167-172). 인간 모노클로날 항체를 사용하여 이러한 가능성을 평가하기 위하여, 마우스를 RSV의 롱 균주(Long strain)로 감염시키고, 4일 째에 상기한 바와 같이, 방어량의 항체로 처리하였다. 대조구는 비감염의 비처리 동물 및 비감염의 처리 동물을 포함했다. 마우스를 항체 측정을 위해 8주 동안 격주로 출혈시킨 다음, 다시 8주 동안 4주 간격으로 방혈시켰다. RSV F 및 G 단백질에 대한 인간 모노클로날 항체 및 마우스 항체 양자 모두를 ELISA에 의해 측정했다. 또한, 매시점에서 혈청의 중화 역가를 측정했다. 나머지 인간 모노클로날 항체 및 능동적으로 제조된 마우스 항체에 의한 중화에 대한 기여는 ELISA 결과로부터 비감염의 항체 처리된 대조구의 중화 활성의 결과에 의해 유추될 수 있었다. 인간 모노클로날 항체가 ELISA에 의해 검출불가능한 경우, 동물을 RSV의 동일한 균주로 다시 접종했다. 4일 경과 후, 동물을 희생시키고 폐 및 비조직을 바이러스에 관해 역가측정하고 대조구와 비교했다.

세포독성 T-세포(CTL) 유도에 미치는 모노클로날 항체 치료법의 영향을 평가하기 위하여, 유사한 실험을 수행하였으나, 감염 6주 후에 마우스를 희생시키고 비장세포 배양물을 5일동안 생존 RSV로 자극하였다(Walsh, E.E., J. Infectious Diseases (1994), 170, 345-350). CTL 활성을 표준 크로뮴 51 방출 분석에 의해, 지속적으로 감염된 Balb/c 섬유아세포 세포주(BCH4 세포)를 사용하여 평가하고 감염되지 않은 Balb/c 섬유아세포주와 비교하였다.

주로 확립된 RSV 감염에 대한 수동 치료법의 유효 투여량 연구를 기초로, 항체 RF-1 또는 RF-2가 RSV 감염을 예방 또는 치료하는데 가장 효과적인 것으로 측정된다. γ1 또는 γ2 (PE) 버전 중 어느 것을 선택할 것인가는 폐 조직학적 연구, 특히 보체의 보충이 Clq 결합 항체에 의해 현저히 증가될 것같은지를 고려하여 결정한다. 보체의 대규모 활성화는 잠재적으로 부작용을 유발할 수 있지만, 수반되는 증가된 혈관신생은 바이러스-항체 대립을 증가시킬 수 있다.

c. 원숭이 모델에서 테스트 수행

선택된 항체에 관한 결정적인 테스트는 영장류 모델에서이다. 아프리카 사바나 원숭이(Cercopithecus aethiops)를 그것이 RSV에 대해 매우 수용적인 이유로 선택하였으며, 감염은 폐 질병상태를 악화시키고 검출가능한 병변을 증가시켰다(Kakuk et al., J. Infectious Diseases (1993), 167, 553-561). 아프리카 사바나원숭이는 또한 용이하게 입수할 수 있고 위험하지 않았다. 이 원숭이의 중량은 5 내지 10kg이었다. 예상되는 항체의 최대 투여량은 20mg/kg이다. 각각 10kg인 세 동물에 20mg/kg의 항체는 600mg과 같았다. 어떤 야생 아프리카 사바나 원숭이는 자연적으로 RSV에 감염되었고, 원숭이를 연구에 사용하기 위해서는 그것이 RSV에 음성인 혈청을 가져야 한다.

마우스 모델에서 확립된 베이스라인, 유효 투여량/kg 및 치료전의 감염시간을 기준으로, 제한된 일련의 테스트를 이것이 폐 질병, 특히 실질 염증 병발(parenchymal inflammatory involvement)의 예방과 관련이 있는지를 확인할 뿐만 아니라, 바이러스 감소를 위한 유효 투여량를 확립하기 위하여 수행했다. 오직 하나의 바이러스 균주, 롱(서브타입 A)을 테스트했다. 초기에 참조 복용량의 24, 5, 1 및 1/25배를 테스트했다. 두 대조구-하나는 바이러스는 수용하지만 항체는 수용하지 않는 것이고, 다른 하나는 바이러스 및 최대 투여량의 이소타입에 매칭된 대조구 항체를 수용하는 것-을 분석했다. 본질적으로, 실험은 상기와 같이 달성된다. 3의 그룹에 있는 원숭이를 또한 비내 점적주입법에 의해 바이러스의 10⁶ PFU로 감염시켰다. 바이러스로 감염시킨 6 내지 7일 경과 후, 원숭이를 희생시키고 폐 및 인두 샘플을 상기한 바와 같은 바이러스 분석 및 조직학을 위해 채취했다.

조직학은 본질적으로 상기한 바와 같이 수행했다. 간단히, 폐에 10% 중성 완충 포르말린을 일정한 충전 압력하에 살포했다. 폐를 포르말린에 적어도 1주일 동안 그대로 두었다. 절편을 절단하고 헤마톡실린-에오신으로 착색한 후, 슬라이드를 카쿠크의 방법에 따라 조직병리학적으로 평가했다(Kakuk et al., J. Infectious Diseases (1993), 167, 553-561). 또한, ELISA 및 감염중화 분석에서 RSV에 대한 인간 항체의 역가를 측정하기 위하여, 혈청 시료를 채취했다.

실시예 10

1. 인간 조직 절편에서의 생체외 실험에 의한 조직 특이성의 확인

두개의 다른 개체로부터의 다른 동결된 정상 조직 절편에 관한 면역조직학적 연구에 의해, 항체의 정상 조직에 대한 잠재적인 교차 반응성을 테스트했다. 간단히, 동결 조직의 저온조 마이크로톰 컷팅을 3가지 테스트로 처리했다: 즉, 고정화 분석, 질소화 분석 및 특이성/분포성 분석. 1% BSA가 존재하는 PBS 내의 정제된 비오틴 표지된 항-RSV F-단백질 항체를 가하고, 슬라이드를 30분 동안, 200℃의 가습 챔버에서 배양했다. 다음, 슬라이드를 1% BSA가 존재하는 PBS에서 세척했다. 이어서, 슬라이드를 아비딘-HRP와 함께 1% BSA가 존재하는 PBS에서 30분 동안 배양했다. HRP를 3,3-디아미노벤지딘-테트라히드로클로라이드와 반응시켜, HRP와의 산화에 의해 매개된 불용성 침강 균주를 제조했다. 이것은 본 인간 모노클로날 항체의 어떤 잠재적인 교차 반응을 증명했다. 상기 테스트는 임패트 라보라토리(Impath Laboratories, N.Y., N.Y.)에 의해 수행했고, FDA에 의해 인간 치료용으로 예정된 제품에 관한 I.N.D. 기탁에 대해서 승인을 받았다. 이러한 조직학적 접근은 이미 존재하는 조직을 사용하고, 대안적인 방사선표지된 항체가 존재하는 RSV 감염 원숭이의 표적 연구보다 더 저렴했다.

Claims (37)

1. 호흡기 합포체 바이러스 (RSV) F-단백질에 특이적으로 결합하며, 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열; 및 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체.
2. 제 1항에 있어서, 시험관내에서 RSV를 중화시킴을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
3. 제 1항에 있어서, 항체가 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
4. 제 1항에 있어서, 항체가 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
5. 제 1항에 있어서, 항체가 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 및 인간 감마 1, 인간 감마 4 및 인간 감마 4 PE 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 재조합 항체임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
6. 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역; 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역; 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄; 및 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 엔코딩하는 DNA 서열로 트랜스펙션된 진핵세포.
7. 제 6항에 있어서, 진핵세포가 CHO 세포임을 특징으로 하는 진핵세포.
8. 도 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b-9c, 11a 및 11b-11c 중의 어느 하나에 제시된 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열로 트랜스펙션된 진핵세포.
9. RSV F-단백질에 특이적으로 결합하며, 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열; 및 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화된 엡슈타인-바(Epstein-Barr) B 세포주.
10. 제 9항에 있어서, 항체가 시험관내에서 RSV를 중화시킴을 특징으로 하는 세포주.
11. 제 9항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 및 인간 감마 1, 인간 감마 4 및 인간 감마 4 PE 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 재조합 항체임을 특징으로 하는 세포주.
12. 도 9a에 도시된 항체 RF-1의 경쇄의 가변 도메인; 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 중쇄의 가변 도메인; 도 11a에 도시된 항체 RF-2의 경쇄의 가변 도메인; 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 중쇄의 가변 도메인; 도 9a에 도시된 항체 RF-1의 경쇄; 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 중쇄; 도 11a에 도시된 항체 RF-2의 경쇄; 및 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 중쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 엔코딩하는 DNA 서열.
13. 제 12항에 따른 DNA 서열을 포함하며, 이러한 서열을 발현시키는 발현 벡터.
14. 도 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b-9c, 11a 및 11b-11c에 제시된 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 RF-1 또는 RF-2의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열.
15. 시험관내에서 RSV를 중화시키며 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열; 및 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 모노클로날 항체를 예방적 또는 치료적 유효량으로 포함하는, 감염되기 쉽거나 RSV에 감염된 인간에서 RSV 감염을 예방하거나 치료하는데 적합한 약학적 조성물.
16. 제 15항에 있어서, 항체가 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
17. (i) RSV F-단백질에 특이적으로 결합하며, 각각 도 9a 및 도 9b-9c에 도시된 항체 RF-1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열; 및 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및

    (ii) 상기 모노클로날 항체에 직접적 또는 간접적으로 부착되는 리포터 분자를 포함하는, 분석물 내 RSV의 존재 여부를 검정하기 위한 테스트 키트.
18. 제 17항에 있어서, 항체가 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 및 인간 감마 1, 인간 감마 4 및 인간 감마 4 PE 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 테스트 키트.
19. 제 17항에 있어서, 리포터 분자가 검출가능한 효소 또는 방사선핵종(radionuclide)임을 특징으로 하는 테스트 키트.
20. 제 17항에 있어서, 분석물이 호흡기 조직으로부터 수득한 유체를 포함함을 특징으로 하는 테스트 키트.
21. 제 1항에 있어서, 도 9a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄 및 도 9b-9c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
22. 제 1항에 있어서, 도 11a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄 및 도 11b-11c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
23. 제 1항에 있어서, RSV F-단백질에 대해 2x10^-9몰 내지 2x10^-10몰의 친화력 (Kd)을 지님을 특징으로 하는 항체.
24. 제 1항에 있어서, 인간 RSV F-단백질과 결합함을 특징으로 하는 항체.
25. 제 24항에 있어서, 시험관내에서 인간 RSV를 중화시킴을 특징으로 하는 항체.
26. 제 9항에 있어서, 항체가 도 9a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄 및 도 9b-9c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 세포주.
27. 제 9항에 있어서, 항체가 도 11a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄 및 도 11b-11c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 세포주.
28. 제 15항에 있어서, 항체가 RSV F-단백질에 대해 2x10^-9몰 내지 2x10^-10몰의 친화력 (Kd)을 지님을 특징으로 하는 약학적 조성물.
29. 제 15항에 있어서, 조성물이 주사 또는 에어로졸에 의해 투여되기에 적합함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
30. 제 15항에 있어서, 조성물이 투여시에 50 내지 20,000㎍/㎏의 유효 용량을 제공하는 항체량을 함유함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
31. 제 15항에 있어서, 항체가 IgG 이소타입임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
32. 제 15항에 있어서, 항체가 각각 도 11a 및 도 11b-11c에 도시된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
33. 제 15항에 있어서, 항체가 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 및 인간 감마 1, 인간 감마 4 및 인간 감마 4 PE 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
34. 제 15항에 있어서, 항체가 도 9a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄, 및 도 9b-9c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
35. 제 15항에 있어서, 항체가 도 11a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄, 및 도 11b-11c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
36. 제 17항에 있어서, 항체가 도 9a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-1의 경쇄, 및 도 9b-9c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 RF-1의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 테스트 키트.
37. 제 17항에 있어서, 항체가 도 11a에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 항체 RF-2의 경쇄, 및 도 11b-11c에 도시된 폴리펩티드 서열을 지닌 RF-2의 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 테스트 키트.