JP2015536145A - 抗原特異的形質芽細胞の濃縮 - Google Patents

抗原特異的形質芽細胞の濃縮 Download PDF

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Abstract

本発明は抗原特異的形質芽細胞の濃縮のための方法に関する。該方法は、複数の抗原を認識する希少抗体を含む抗体の同定に有用である。【選択図】図4

Description

関連出願
本出願は、2012年11月13日に出願された米国仮出願第61/725764号の利益を主張し、その全内容は本明細書に参照により援用される。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は本明細書に参照により援用される。前記ASCIIコピーは、2013年10月22日に作成され、P5500R1−WO_SL.txtと命名され、大きさは15,453バイトである。
発明の分野
本発明は抗原特異的形質芽細胞の濃縮のための方法に関する。該方法は、複数の抗原を認識する希少抗体を含む抗体の同定に有用である。
ヒト免疫グロブリン遺伝子のクローニングを可能にする技術の進歩は、治療可能性を有する希少で機能的なヒトモノクローナル抗体の発見に有効であることが証明されている。しかし、そのような希少なヒト抗体を発見するために使用される方法の多くは、わずかな数の潜在的候補抗体を同定するために、インビトロ培養や、数十万ものヒト形質細胞の選別又はヒト形質細胞からの大ファージディスプレイライブラリー作成などを伴い、しばしば困難である。
希少で機能的なヒトモノクローナル抗体の同定効率を高めるための種々の方法が開発されてきた。無感作ヒト脾細胞のインビトロプライミングと抗原を組み合わせ、続いてこのプライミングした脾細胞を免疫不全マウスに腹腔内又は静脈内移植し、次に追加の抗原でドナーマウスにインビボ追加免疫することによる抗原特異的なIgG応答が、Brams等から報告されている。(Brams et al., (1998) J Immunology 160:2051-2058;国際出願公開第1996/40252号参照。)抗原特異的応答性を高めるための、インビトロ脾臓細胞培養、並びにインビトロ及びインビボ両方での抗原攻撃の必要条件が記述された。その他、ヒト末梢血白血球(PBL)を抗原と一緒に直接免疫不全マウスの脾臓に移植した後の抗原選択的ヒトB細胞の増殖が報告されている。(Depraetere et al., (2001) J Immunology 166:2929-2936;国際出願公開第1999/60846号参照。)
これらの抗体同定技術の進歩にもかかわらず、複数の抗原を認識するモノクローナル抗体を含む希少モノクローナル抗体の同定に有用な、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法に対する必要性が存在している。本発明者らは、抗原特異的形質芽細胞の同定に有効な、インビボ形質芽細胞濃縮技術を開発した。ここに記載されるのは、抗原誘導性のインビボ形質芽細胞濃縮技術であり、これらは、抗原特異的細胞の選別と併せて用いられる場合、形質細胞を増殖させたり又はファージディスプレイライブラリーを作成する必要なく、希少で機能的なモノクローナル抗体の同定を効率的且つ高頻度で行うことを可能にする。本発明により提供される方法は、特に、希少抗体の同定に有用である。また、本発明により提供される方法は、特に、複数の抗原に特異性を有する抗体(例えば、モノクローナル抗体)の同定に有用である。
本発明は、一つには、抗原特異的形質芽細胞を濃縮する方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを少なくとも一種の抗原と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、PBMCを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、過剰又は非結合抗原を除去するため、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを少なくとも一種の抗原と接触させることと、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去することと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
いくつかの態様において、PBMCは、予め抗原に曝されたドナーから得られる。したがって、いくつかの態様において、本発明は抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、予め抗原に曝されたドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、PBMCを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
いくつかの態様において、本発明は、抗原を同定又は単離するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを少なくとも一種の抗原と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された抗原特異的形質芽細胞を選別することとを含み、その結果抗体を同定又は単離する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、PBMCを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
本方法のいくつかの態様において、PBMCを抗原と接触させる工程で使用される抗原は、ドナーが予め曝された抗原と同一抗原(又はその断片もしくは一部分)である。他の実施態様において、PBMCを抗原と接触させる工程で使用される抗原は、ドナーが予め曝された抗原とは異なる抗原(該抗原は、例えば、ドナーが予め曝された抗原の変異体、サブタイプ、アイソタイプ、又はホモログ)である。
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得るための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得る、方法を提供する。いくつかの実施態様において、PBMCを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に対して特異性を有する抗原特異的形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に特異的な抗体を産生する、抗原に対して特異性を有する形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
他の態様において、本発明は、抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得るための方法であって、予め抗原に曝されたドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得る、方法を提供する。いくつかの実施態様において、PBMCを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に対して特異性を有する抗原特異的形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に特異的な抗体を産生する、抗原に対して特異性を有する形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
他の態様において、本発明は、複数の抗原に特異性を有する抗体を産生することができる形質芽細胞を同定する方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを、PBMC/抗原プレミックスを得るために複数の異なる抗原と接触させてPBMC/抗原プレミックスを得ることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された形質芽細胞から抗原特異的細胞を選別することとを含み、その結果抗原特異性を有する抗体を産生できる形質芽細胞を同定する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、該方法は、PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植する前にPBMCを洗浄して、PBMC/抗原プレミックスから過剰又は非結合抗原を除去することを更に含む。他の実施態様において、該方法は、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む。
いくつかの態様において、PBMCは、哺乳動物から得られる。いくつかの実施態様において、PBMCは、マウス、ラット、ウサギ又はヤギから得られる。他の実施態様において、PBMCは、ヒトから得られる。他の態様において、PBMCは、非哺乳類動物から得られる。
インビボSCIDマウスにおける形質芽細胞の分化を示すデータを表す。移植前(0日目と表示)のヒト末梢血単核細胞(PBMC)、又は4、7、及び8日目に(ヒトPBMCの脾臓内注射後)SCIDマウスから得られた脾細胞は、B系細胞と識別するために抗CD19及び抗CD38で染色された。上方の円、下方の円、及び矩形はそれぞれ、形質芽細胞、活性化された胚中心様細胞、無感作B細胞を表す。数字は、各サブセットの頻度をパーセントで示している。 破傷風ワクチン接種後7日目のヒトドナーPBMC(破傷風トキソイド反応性)の典型的断面を示す。 破傷風ワクチン接種されたドナー由来のヒトPBMC移植後8日目にSCIDマウスから得られた脾臓細胞(破傷風トキソイド反応性)の典型的断面を示す。数字は、各サブセットの頻度をパーセントで示している。 各刺激条件下での個々のSCIDマウスから得られた、各脾臓あたりの破傷風トキソイド反応性細胞の数を示す。100μgの破傷風トキソイドを含有するインビボ追加免疫がSCIDマウスへ腹腔内注射された。ヒトB細胞活性化因子(BAFF、50g)並びにIL−2、IL−6及びIL−21(各50ng)の混合物を含有するサイトカインカクテルが、SCIDマウスへ腹腔内(ip)注射された。 抗ヘマグルチニン陽性形質芽細胞(H3ヘマグルチニン及びH1ヘマグルチニン)のFACS分析のデータで、上枠は、SCIDマウス濃縮より前、ワクチン接種後7日目のもの(図3A)、及び、下枠は、SCIDマウス濃縮の後、移植後8日目のもの(図3B)で、抗原プレミックスあり、なしをそれぞれ示す。 PBMC/抗原プレミックスなし(円)及びPBMC/抗原プレミックスあり(四角)の各SCID/ベージュマウスからPBMCの脾臓内移植後8日目に得られた脾細胞の分析データを、ヘマグルチニン(H1)/CD38high形質芽細胞のパーセントで示す。四角は、H1形質芽細胞を発現したマウスを示す。 本発明の方法を用いて得られた抗ヘマグルチニン抗体でインフルエンザA型のグループ1及びグループ2の種々のウイルス株をインビトロ中和した際のデータを示す。 モノクローナル抗体39.29でインフルエンザA型のグループ1(図6A)及びグループ2(図6B)の種々のウイルス株をインビトロ中和した際のデータを示す。 モノクローナル抗体81.39でインフルエンザA型のグループ1(図7A)及びグループ2(図7B)の種々のウイルス株をインビトロ中和した際のデータを示す。 インフルエンザA型の種々のウイルス株(A/プエルトリコ/8/1934(PR8)、図8A;A/ポート・チャーマーズ/1/1973(PC73)、図8B;A/香港/1/1968(HK68)、図8C;及びA/愛知/2/1968(愛知68)、図8D)に感染し、様々な量のモノクローナル抗体39.29を投与されたマウスの生存率を示す。
本発明は、特に、形質芽細胞の抗原特異的な濃縮のための方法を提供する。本方法は、抗原特異的形質芽細胞の迅速な同定及び希少なモノクローナル抗体の効率的な同定のために提供される。
定義
用語「形質芽細胞」は、形質細胞の前駆体である細胞を指す。
用語「脾細胞」は、脾臓内に位置するか、又は膵臓組織から得られる、様々な血液細胞型の何れか一つを指す。
形質芽細胞の「濃縮(「enriching」又は「enrichment」)」なる用語は、所望の細胞、典型的には、混合した細胞集団に含まれる抗原特異的な細胞の頻度を高めることを指す。したがって、細胞集団(例えば、抗原特異的形質芽細胞)の濃縮は、濃縮工程の結果として、より高い頻度の抗原特異的細胞を有する細胞集団(例えば、抗原特異的形質芽細胞)を包含する。
「末梢血単核細胞」(PBMC)は、リンパ球(T細胞及びB細胞)、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、形質細胞並びに形質芽細胞を含む、球状の核を有する血液細胞を指す。本明細書で用いられる場合、用語「末梢血単核細胞」は、用語「末梢血リンパ球」(PBL)と互換的に使用され、それはリンパ球(例えば、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞)を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’);ダイアボディ;線形抗体;単鎖抗体分子(例えばscFv);及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び/又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の5つの主要なクラスがあり:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、また、これらのいくつかは、さらにサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG、IgGに、IgG、IgG、IGA、及びIgAに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるFc領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書において含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域(HVR)由来のアミノ酸残基及びヒトフレームワーク領域(FR)由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、HVR(例えば、CDR)のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げている抗体を指す。
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、並びにげっ歯類(例えば、マウス及びラット)を含む。ある実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えば、イオン交換又は逆相HPLC)により決定されるように、95%以上又は99%の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、通常少量存在し得る、例えば、自然発生的な変異を含む、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生するような、起こり得る変異体抗体を除いて同一であり、且つ/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分(例えば、細胞傷害性部分)又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる、様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖から成る約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)を有し、三つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)が続く。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有し、定常軽鎖(CL)ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)とラムダ(λ)と呼ばれる、二つのタイプの何れかに割り当てることができる。
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、このような治療製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び/又は注意事項についての情報を含む。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられる場合、「治療」(及び「治療する(treat)」又は「治療すること(treating)」などその文法上の変形)は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的帰結の縮小、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが結合されている別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように結合されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
一般的方法
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者にとって既知であり、利用可能である細胞生物学、細胞培養、(組換え技術を含む)分子生物学、微生物学、生化学、及び免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 第3版 (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, 編, 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, 編, 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., 編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., 編, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., 編, 1991); 及びShort Protocols in Molecular Biology (Wiley及びSons, 1999)などの文献に記載されている。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5648237号、第5789199号及び第5840523号に記載されている。(また、大腸菌における抗体断片の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, 248 巻 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 245-254頁も参照)
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
ここに提供されるのは、希少なモノクローナル抗体の同定に有用な方法である。特に、本発明は、抗原特異的形質芽細胞の効率的且つ効果的な同定のための形質芽細胞のインビボ濃縮方法を提供し、その抗原特異的形質芽細胞から、抗体及び該抗体をコードする核酸が単離され得る。形質芽細胞の抗原特異的インビボ濃縮を用いた、希少な抗体(ここで抗体は、希少で機能的なモノクローナル抗体である)の同定及び単離の方法を提供することが、本発明の一態様である。複数の抗原を認識する(例えば、それらに結合する)抗体(例えば、同一抗原の変異体、アイソタイプ、サブタイプかホモログ、もしくは異なる種の同一抗原を認識、又はそれらに結合する)の同定及び単離のための方法を提供することが、本発明の別の態様である。本発明の方法は、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得る(例えば、単離する)ことと、該PBMCを抗原(本明細書中ではPBMC/抗原プレミックスと呼ばれる)と接触させることと、該PBMCを(注射、移植、又は他の方法により)免疫不全動物の脾臓内に移植し、注入されたPBMCが該免疫不全動物の脾臓内に残留するようにすることと、及び該脾臓から抗原特異的形質芽細胞を単離することとを含む。脾臓から形質芽細胞を単離するための方法は当業者にとって周知であり、利用可能な方法である。
いくつかの実施態様において、PBMCと抗原の接触はインビトロで実施される。いくつかの実施態様において、PBMC/抗原プレミックス後、且つ該PBMCの免疫不全動物の脾臓への移植前に、非結合抗原はPBMCから洗い流されていない。他の実施態様において、PBMCを洗浄して非結合抗原を除去する追加の工程が、PBMC/抗原プレミックス後、且つ該PBMCの免疫不全動物の脾臓への移植前に実施される。いくつかの実施態様において、抗原特異的形質芽細胞の脾臓からの単離後、抗原特異的な単一細胞を選別する追加の工程が実施される。他の実施態様において、抗原特異的形質芽細胞の脾臓からの単離後、又は単一細胞の選別後、単離された細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が実施される。
形質芽細胞のインビボ濃縮方法の最適化が、破傷風トキソイド抗原を使用して実施された。これらの試験において、本発明者らは、本明細書に記載の方法を使用して、破傷風トキソイド特異的形質芽細胞の数が増加したことを示した。(実施例1及び2を参照)これらの方法は、インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンに対して特異的な希少形質芽細胞の濃縮及び同定に更に適用された。本発明の形質芽細胞の濃縮方法の使用は、グループ1とグループ2双方のヘマグルチニンに結合するのに効果的なヒトモノクローナル抗体、及び/又はグループ1とグループ2双方のインフルエンザA型ウイルス分離株を中和するのに効果的なヒトモノクローナル抗体を含む種々のインフルエンザAウイルス分離株を結合及び中和するのに効果的なヒトモノクローナル抗体の同定につながる。(実施例3−7を参照)
本方法は、効率的且つ改良された抗原特異的形質芽細胞の濃縮、抗原特異的応答の増加、高親和性及び高機能を有する抗体の同定、並びに複数の抗原を認識する抗体の同定を含むがこれらに限定されない、従来のモノクローナル抗体を同定するための方法に勝る利点を提供する。
本発明の方法は、希少で機能的なモノクローナル抗体同定の効率を高めることにより、従来の方法に勝る更なる利点を提供する。例えば、本方法は、免疫不全動物の脾臓へのPBMC移植の時点で、又はその後で、免疫不全動物(例えば、マウス)の目的の抗原(単数又は複数)を用いたインビボ免疫化をせず、効率的である。加えて、本方法は、免疫不全動物の脾臓へのPBMC移植の時点で、又はその後で、免疫不全動物に目的の抗原(単数又は複数)を用いた追加免疫をせず、効率的である。更に、本発明の方法は、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するために免疫不全動物の脾臓にPBMCを移植する前に、前記動物を抗IL−2−Rb抗体を用いて前処理するなど、免疫不全動物のナチュラルキラー(NK) 細胞を除去又は殺傷することを伴わない。
(インフルエンザウイルス感染の治療又は予防に使用するための)抗ヘマグルチニン抗体の同定の文脈で、過去の報告には、グループ1とグループ2すべてのインフルエンザA型ウイルス分離株に結合又はそれらを中和することが可能なただ一つの抗体を発見するために、約104000個のインビトロ培養ヒト形質芽細胞からヘマグルチニン結合抗体を直接クローニングすることが記載されている。(Corti et al., (2011) Science 333:850-856を参照。)しかし、本明細書に記載される形質芽細胞濃縮方法は、たった840個のクローニングされたヒトモノクローナル抗体を選別することで、種々のヘマグルチニンのサブタイプを認識した20個の抗ヘマグルチニン抗体の同定につながり、これら20個のうち、4つの抗ヘマグルチニン抗体がグループ1とグループ2の種々のインフルエンザA型ウイルス分離株を中和するのに効果があった。
本発明の抗原特異的形質芽細胞濃縮方法は、形質芽細胞及びそれらに対応する、任意の所望の抗原(限定されないが、例えば、破傷風トキソイド、風疹、麻疹、おたふくかぜ、水痘帯状疱疹、トキソプラズマ症、インフルエンザウイルス、HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、パピローマウイルス、酵母、寄生虫(例えば、マラリア)、細菌、CMV、ラウス肉腫ウイルス等含む)に対する抗体の同定に有用である。
本方法に使用するためのPBMCは、抗原特異的な抗体が所望される任意の動物(ドナー)から得ることができる。このような動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒト等を含む。いくつかの実施態様において、PBMCは例えばヒトなど、哺乳動物から得られる。他の実施態様では、PBMCは、抗原に対する免疫応答を誘発(illicit)するのに十分である少なくとも一種の抗原、感染因子(例えば、細菌もしくはウイルス剤)、又はその一部で予め免疫化されたか、それらに曝されたヒトから得られる。あるいは、PBMCは非ヒト動物、特に非ヒト哺乳動物から得られる。したがって、いくつかの実施態様において、PBMCは、少なくとも一種の抗原、感染因子、又はその一部で予め免疫化された非ヒト動物から得られる。抗原は、自己又は非自己抗原の何れであってもよい。特定の実施態様において、抗原は、造血組織及びリンパ単球組織(lymphomoncytic tissue)における抗原特異的形質芽細胞、形質細胞又はB細胞の存在につながる、ドナーの免疫応答を誘発することができる。
本方法は、マウス又は他の動物種を含む任意の免疫不全動物に適用され得る。免疫不全動物は、一般的に、異種移植又は同種移植された血中白血球/リンパ球(例えば、PBMC、PBL)もしくは脾細胞に対する有効な免疫応答を引き起こす能力が限られているか、或いは欠いている。ある態様において、免疫不全動物は、移植された細胞を拒絶する機能的なT細胞又はB細胞を持っていない。本方法で使用される免疫不全動物の例は、例えば、SCID/ベージュマウス、NOD−SCIDマウス、ヌードマウスなどを含む。
いくつかの態様において、PBMC/抗原プレミックスに使用される抗原は、精製されているか、又は実質的に精製されている抗原である。前記抗原は、組換え技術により産生された抗原(例えば、組換抗原)又は天然の抗原であってもよい。前記抗原は、完全長タンパク質又はポリペプチドであり得るか、或いは例えばタンパク質分解断片のような、タンパク質又はポリペプチドの一部もしくは断片を含む。前記抗原は、人工的な方法で製造された合成タンパク質又はポリペプチドであってもよい。加えて、PBMC/抗原プレミックスに使用される抗原は、一種以上の抗原(例えば、複数の抗原の混合物)を含むことができる。該抗原は、例えば、様々なインフルエンザA型ウイルス分離株由来の複数のヘマグルチニンサブタイプのような、複数の抗原の混合物(例えば、ヘマグルチニンサブタイプのグループ1とグループ2)であってもよい。
本方法によるPBMC/抗原プレミックス用に使用される抗原の量は様々である。本発明は、PBMC/抗原プレミックス中、B細胞100万個あたり抗原約0.1から2μgが、抗原特異的形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。しかし、本方法は、PBMC/抗原プレミックス中で使用される抗原の量に限られるものではない。一般に、PBMC/抗原プレミックス用に使用される抗原の量は、B細胞100万個あたり約0.001μg、0.005μg、0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1.0μg、2μg、5μg、又は10μg;或いはB細胞100万個あたり約0.001μgから10μgの範囲である。抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのPBMC/抗原プレミックス用に使用される抗原の量を(常套的実験によって)決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
本方法によるPBMC/抗原プレミックスのための時間は様々である。本発明は、30分のPBMC/抗原プレミックスが、抗原特異的形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。一般に、PBMC/抗原プレミックスのための時間の長さは、約10分から約180分、例えば、約10分、約15分、約20分、約30分、約45分、約60分、約75分、約90分、約120分、約150分、又は約180分である。抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのPBMC/抗原プレミックスのための時間の長さを(常套的実験によって)決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
本方法に従ってPBMC/抗原プレミックスが生じる温度は様々である。本発明は、37℃で(30分間)PBMC/抗原プレミックスを行うことが抗原特異的形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを例として示している。PBMC/抗原プレミックスを行う温度を(常套的実験によって)決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。一般に、温度が低いほどPBMC/抗原プレミックスに要する時間が長くなる。例えば、PBMC/抗原プレミックスを37℃ではなく30℃で行うと、PBMC/抗原プレミックスに要する時間が30分以上、例えば、約45分、約60分、約90分などと、長くなる。
いくつかの態様において、PBMC/抗原プレミックスは、完全フロイントアジュバント、ミョウバン、サポニン等のアジュバントの存在又は非存在下で実施され得る。他の知られているアジュバントも、このPBMC/抗原プレミックスで用いられ得る。
PBMC/抗原プレミックス工程では、抗原と混合又は接触する細胞の数はいくつでもよい。本方法は、PBMC/抗原プレミックス中で抗原と接触する細胞の数に限られるものではない。抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのPBMC/抗原プレミックス用に使用される細胞の数を(常套的実験によって)決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
本方法による免疫不全動物の脾臓に移植される細胞(例えば、PBMC)の数は様々である。本発明は、免疫不全マウスの脾臓に移植された50x10個のPBMCが、希少抗原に特異的な形質芽細胞同定の成功をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。しかし、本方法は、免疫不全動物の脾臓に移植される細胞の数に限られるものではない。免疫不全動物の脾臓に移植する細胞の数を(常套的実験によって)決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。細胞の数は、一般に、約1x10個、約1x10個、 約5x10個、約1x10、約5x10個、約1x10個、約5x10個、約1x10個、約5x10個、又は約1x1010個である。
脾臓内に移植後、移植されたPBMCを脾臓内に留めておく単離までの時間を様々に割り当てることができる。本発明は、移植されたPBMCを7日間又は8日間免疫不全動物の脾臓内に留めておくことが、破傷風トキソイド及びヘマグルチニンに対する抗原特異的な形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。移植されたPBMCを脾臓内に留めておく単離までの時間の長さは、一般に、約4日から約14日、約7日から約10日、約7日、又は約8日である。ただし、脾臓内注射後、移植されたPBMCは、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、約10日間、約11日間、約12日間、約13日間、約14日間、又は14日間以上脾臓内に留まることができる。14日を超えると、移植されたPBMCは、マウスのナチュラルキラー(NK)細胞に対して攻撃を開始すると予想される。脾臓内移植する細胞の数が少ないほど、移植されたPBMCは、単離前に脾臓内により長時間留まることが可能になる。PBMCが抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のための単離の前に脾臓に留まる時間の長さを(常套的実験によって)決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
いくつかの実施態様において、PBMCは一個体のドナーから得られる。他の実施態様において、PBMCは複数個体のドナーから得られる。複数個体のドナーから得られるPBMCは、PBMC/抗原プレミックスの前に、又はPBMC/抗原プレミックス後の脾臓内注射の前にプールされるか、或いは混ぜ合わされる。
本方法は、ドナーから得られる抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのPBMC又はPBLの使用に限られるものではない。例えば、脾臓細胞、骨髄細胞、扁桃細胞、リンパ腺から得られる細胞、幹細胞等、形質芽細胞及びB細胞の他のドナー細胞源が、本方法に関して使用され得る。例えば、ある態様において脾細胞(すなわち、脾臓細胞)は、本発明による抗原特異的な形質芽細胞の濃縮に使用するためにドナーから得ることができる。脾細胞は、本明細書に記載の方法に従って混合され、インキュベートされ、又は抗原(抗原プレミックス)と接触した一種以上の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離され、次に免疫不全動物の脾臓に注射される。抗原プレミックスの前に、脾細胞は、例えばフィコロール分離法等の当業者に周知の方法を用いて、単核細胞(例えば、形質芽細胞、B細胞等)に濃縮され得る。
本発明は、複数の抗原、又は同一抗原の様々な変異体、分離株、サブタイプもしくはホモログに特異性を有する(例えば、それらを認識又は結合できる)希少形質芽細胞(及び希少B細胞)(並びにそれらに対するモノクローナル抗体)を同定する効率的か且つ効果的な方法を提供する。一態様において、本発明は、複数の抗原、又は同一抗原の様々な変異体、分離株、サブタイプもしくはホモログを認識できる、或いはそれらに結合できる抗体を産生する、抗原特異的な形質芽細胞を同定するための方法を提供する。本発明は、例えば、インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンサブタイプのグループ1及びグループ2をそれぞれ認識するモノクローナル抗体を含む、ヘマグルチニンに向けられた希少なヒトモノクローナル抗体を同定するための本方法の使用を例として示す。
したがって、本方法は、例えば、同一抗原又は複数の種に由来する相同抗原、同一抗原又は異なる種に由来する相同抗原、同一抗原又は複数の種に共通する相同抗原を認識又は結合するか、或いはそれらに対して特異性を有する抗体(例えば、同一抗原又はヒト及びマウス由来の相同抗原を認識又は結合するか、或いはそれらに対して特異性を有する抗体)のように、同一抗原(例えば、タンパク質、ポリペプチド等)の、一又は複数の様々な変異体、ホモログ、サブタイプもしくはアイソタイプを認識又は結合するか、或いはそれらに対する特異性を有する(例えばモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体のような)抗体を同定するのに有用である。このような抗体は、同一の抗原又は異なる種、サブタイプ、分離株(例えば、ウイルス分離株)、菌株等に由来する相同抗原を認識及び/又はそれらに結合する自身の能力のために、特に有用であるいくつかの実施態様において、本方法は、交差反応性抗体(例えば、非ヒト動物抗原及びヒト抗原を結合又は認識することができる抗体)を同定するために有用である。
本方法によって得られる抗体は、様々な研究、医療、治療(例えば、受動免疫療法)及び診断用途において有用である。
組換え方法及び組成物
本発明の方法を用いて同定される抗体は、例えば米国特許第4816567号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて製造することができる。例えば、本発明に従って同定された抗体をコードする、単離された核酸分子が単離され得る。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施態様において、宿主細胞は以下を含む(例えば、以下で形質転換されている):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。
抗体の組換え生産のために、抗体(例えば本明細書に記載の方法を使用して同定される抗体)をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され得、一般的な手順を用いて例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びFcエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で製造され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5648237号、第5789199号及び第5840523号を参照。(また、大腸菌における抗体断片発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, 248 巻 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 245-254頁も参照)発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
原核生物に加えて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、「ヒト化」されたグリコシル化経路を有する真菌及び酵母の株を含む、糸状菌又は酵母のような真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 及び Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)参照。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。今まで多数のバキュロウイルス株が同定されているが、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る。
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第5959177号、第6040498号、第6420548号、第7125978号及び第6417429号(遺伝子組み換え植物における抗体産生に関するPLANTIBODIESTM技術を記載)を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。他の有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7);ヒト胎児腎臓株(例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)に記載の293又は293細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)に記載のTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス乳房腫瘍(MMT 060562);TRI細胞(例えば、Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)に記載);MRC 5細胞;及びFS4細胞である。他の有用な補注動物宿主細胞株は、DHFRCHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));並びにY0、NS0及びSp2/0等のミエローマ細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki 及びWu, Methods in Molecular Biology, 248巻 (B.K.C. Lo, 編., Humana Press, Totowa, NJ), 255-268頁 (2003)を参照。
以下は本発明の方法および組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得る。
実施例1.形質芽細胞の濃縮及び増殖
以下の実験は、SCID/ベージュマウスへのヒト末梢血単核細胞(PBMC)の脾臓内移植後のPBMCの増殖及び分化の影響を評価するために実施された。
正常なヒトドナーのロイコパック(leukopac)をBlood Centers of the Pacific(San Francisco,CA)から得た。標準的方法を用い、末梢血単核細胞(PBMC)をロイコパックから単離した。6−8週齢の雌SCID/ベージュマウスをCharles River Laboratories(Hollister,CA)より購入し、全米実験動物協会(American Association of Laboratory)の動物ケアガイドライン(Animal Care guidelines)に従い、ジェネンテック社にて収容、飼養した。実験研究はすべて、ジェネンテック実験動物研究施設内の動物管理使用委員会(the Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Lab Animal Research)の承認の下、AAALACi(国際実験動物ケア評価認証協会)認定施設内で、実験動物のケアと使用に関する指針及び関連法令、規則に従って実施された。健康なヒトドナー由来のロイコパック又は血液は、書面によるインフォームド・コンセントが提出され、欧米の治験審査委員会(the Western Institutional Review Board)の倫理的承認を得た後、採取された。
6−8週齢の雌SCID/ベージュマウス(Charles River Laboratories(Hollister,CA)に、セシウム137線源を使用し、吸収線量350ラドで半致死的に照射した。照射後7日間、飲料水にポリミキシンB(110mg/L)及びネオマイシン(1.1g/L)を添加した。照射の4時間後、各マウスの左わき腹を剪毛し、Betadine(登録商標)(Purdue Pharma,Stamford,CT)及び70%アルコールで前処理した。無菌の外科的手順を用い、麻酔下の外科手技が実施された。各マウスの肋骨境界腺の真下の皮膚が1センチ切開され、続いて腹壁と腹膜の切開が行われた。各マウスの膵臓が注意深く露出され、PBS30μLに再懸濁された50×10ヒトPBMCが注射された。切り込みは、5−OVicryl(登録商標)縫合糸(Ethicon, Somerville,NJ)を使用して筋層で、外科用ステープラーを使用して皮膚で閉じられた。マウスは移植後8日目に屠殺され、脾臓が収集された。
脾臓細胞の単一細胞懸濁液が、B系統細胞を区別するための抗ヒトmAb(CD38 PECy7,BD Biosciences, San Jose,CA;及びCD19)のカクテルで染色された。
図1はインビボSCIDマウスにおける形質芽細胞分化の結果を示す。移植前(0日目と表示されている)のPBMC、又はSCIDマウスから(ヒトPBMCの脾臓内注射後)4、7及び8日目に得られた脾細胞が染色され、B系統細胞を区別するための抗CD19及び抗CD38を用いて選別された。上方の円、下方の円、及び矩形はそれぞれ、形質芽細胞、活性化された胚中心様細胞、無感作B細胞を示す。数字は、各サブセットの頻度をパーセントで示している。図1に示すように、ヒト形質芽細胞は、五千万個のヒトPBMC移植後8日目に脾臓細胞集団の総数の約40%にまで増殖した。
実施例2.破傷風毒素特異的なヒト形質芽細胞の濃縮
採血7日前にDT(ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイド)ワクチンを受けた正常なヒトドナー由来のロイコパックを、Blood Centers of the Pacific(San Francisco,CA)から得た。標準的方法を用い、末梢血単核細胞(PBMC)をロイコパックから単離した。6−8週齢の雌SCID/ベージュマウスをCharles River Laboratories(Hollister,CA)より購入し、全米実験動物協会(American Association of Laboratory)の動物愛護ガイドライン(Animal Care guidelines)に従い、Genentech社にて飼養、保管した。実験研究はすべて、ジェネンテック実験動物研究の施設内動物管理使用委員会(the Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Lab Animal Research)の承認の下、AAALACi(国際実験動物ケア評価認証協会)認定施設内で、実験動物のケアと使用に関する指針及び関連法令、規則に従って実施された。健康なドナー由来のロイコパック又は血液は、書面によるインフォームド・コンセントが提出され、欧米の治験審査委員会(the Western Institutional Review Board)の倫理的承認を得た後、採取された。
抗原誘導性のインビボ形質芽細胞濃縮及び増殖は、PBMCの脾臓内移植を用いて以下の通り実施された。上記の通り得られた、単離されたPBMCは、破傷風トキソイド(TT)(List Biological Laboratories,Inc,Campbell,CA)で各百万個のB細胞に対して0.1-2μgで再懸濁され、37℃で30分間インキュベートされた(PBMC/抗原プレミックス)。PBMC/抗原プレミックスに続き、PBMCを優しく洗浄し、脾臓内注射に先立って過剰又は非結合抗原を除去した。この一連の実験において、PBMCの一部は、破傷風毒素特異的な形質芽細胞の濃縮の程度に対する抗原プレミックスの効果を比較するため、脾臓内注射前に抗原プレミックスに全く曝されることがなかった。
6−8週齢の雌SCID/ベージュマウス(Charles River Laboratories(Hollister,CA)に、セシウム137線源を使用し、吸収線量350ラドで半致死的に照射した。照射後7日間、飲料水にポリミキシンB(110mg/L)及びネオマイシン(1.1g/L)が添加された。照射の4時間後、各マウスの左わき腹を剪毛し、Betadine(登録商標)(Purdue Pharma,Stamford,CT)及び70%アルコールで前処理した。無菌の外科的手順を用い、麻酔下の外科手技が実施された。各マウスの肋骨境界腺の真下の皮膚が1センチ切開され、続いて腹壁と腹膜の切開が行われた。各マウスの膵臓が注意深く露出され、PBS30μLに再懸濁された50×10ヒトPBMCが注射された。切り込みは、5−OVicryl(登録商標)縫合糸(Ethicon,Somerville,NJ)を使用して筋層で、外科用ステープラーを使用して皮膚で閉じられた。抗原特異的な細胞の選別実験のために、移植後8日目にマウスを屠殺し、その膵臓を収集した。
脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、ヒトIgG+形質芽細胞をCD38highIgG+発現として明らかにする抗ヒトmAb(CD38 PECy7,BD Biosciences,San Jose,CA;及びIgG Dylight,Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA))のカクテルで染色された。破傷風トキソイド反応性形質芽細胞は、rTTc.PE(破傷風毒素断片C、List Biological Laboratories,Inc.,Campbell,CA)、及び形質細胞内にある膜貫通タンパク質である、ヒトp63を認識するマウスモノクローナル抗体VS38c−FITC(Dako,Carpinteria,CA)で染色することによって同定された。
次いで試料を、ヨウ化プロピジウムの存在下で死細胞を排除してAria高速セルソーター(BD Biosciences,San Jose,CA)で解析し、抗破傷風毒素特異的形質芽細胞を、単一細胞方式で選別して5%低IgGウシ胎児血清で補充した50μlのRPMI細胞培地を含む96ウェル組織培養ブレートに入れた。(Gibco, Grand Island,NY)。五百万個の生細胞のすべての解析プロファイルが記録された。プロファイルは、Flowjo version 9.4.11ソフトウェアで解析された。
SCID/ベージュレシピエントの脾臓内移植の際、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)が急速に増殖し、B細胞活性化を行い、ヒト形質芽細胞に分化した。具体的には、TT抗原プレミックスに曝されなかったヒト形質芽細胞は、五千万個のヒトPBMC移植後8日目に脾臓細胞集団の総数の約40%にまで増殖した。
この工程が抗原特異的形質芽細胞を濃縮するために改善され得るかを決定するためには、脾臓内注射(PBMC/抗原プレミックス)に先立って抗原結合を介してB細胞レセプター複合体に生存シグナルを送るために、破傷風ワクチンを接種したヒトドナー由来のPBMCを破傷風トキソイドと共にインキュベートした。この技術は、移植前に抗原と共にインキュベートされなかった細胞に比べて、破傷風トキソイドに結合するモノクローナル抗体を産生する形質芽細胞の濃縮が20倍になった。
図2Aは、ワクチン接種後7日目のヒトドナー抗TT+PBMCの典型的なプロファイルを示す。図2Bは、脾臓内移植後8日目のSCIDマウスの脾臓から採取された抗TT+細胞の典型的プロファイルを示す。図2Cは、表示されている各刺激条件下での個々のマウスの脾臓あたりの抗TT+細胞の定量を示す。ヒトBAFF(50μg)と、IL−2、IL−6及びIL−21(各50ng)の混合物を含有するサイトカインカクテルをhSCIDマウスに腹腔内注射した。
図2に示すように、試験された全条件のうち、本明細書に記載の方法を用いたPBMC/抗原プレミックスにおいて、最多の抗TT+形質芽細胞数が観察された。これらの結果は、破傷風トキソイドワクチン接種ドナー由来のPBMCを使用したインビトロPBMC/抗原プレミックスが、SCID/ベージュレシピエントにおいて破傷風毒素抗原特異的形質芽細胞の濃縮をもたらしたことを示す。
実施例3.インフルエンザAウイルスヘマグルチニン特異的ヒト形質芽細胞の濃縮
採血の7日前に季節性インフルエンザワクチンFluvirin(登録商標)(ノバルティス ロット#111796P1)を接収した正常ヒトドナー由来のロイコパックをBlood Centers of the Pacific(San Francisco,CA)より得た。標準的方法を用い、末梢単核細胞(PBMC)をロイコパックから単離した。6−8週齢の雌SCID/ベージュマウスをCharles River Laboratories(Hollister,CA)より購入し、全米実験動物協会(American Association of Laboratory)の動物愛護ガイドライン(Animal Care guidelines)に従い、Genentech社にて飼養、保管した。実験研究はすべて、ジェネンテック実験動物研究の施設内動物管理使用委員会の承認の下、AAALACi(国際実験動物ケア評価認証協会)認定施設内で、実験動物のケアと使用に関する指針及び関連法令、規則に従って実施された。健康なヒトドナー由来のロイコパック又は血液は、書面によるインフォームド・コンセントが提出され、欧米の治験審査委員会(the Western Institutional Review Board)の倫理的承認を得た後、採取された。
抗原誘導性のインビボ形質芽細胞濃縮及び増殖は、PBMCの脾臓内移植を用いて以下の通り実施された。単離されたPBMCをヘマグルチニン抗原(B細胞100万個毎に0.1−2μg)で再懸濁させ、37℃で30分間インキュベートした (PBMC/抗原プレミックス)。このインキュベーションに続き、PBMCを洗浄して非結合抗原を除去した。交差反応性ヘマグルチニン抗体を産生した形質芽細胞を濃縮するために、PBMC/抗原プレミックス及び単一細胞選別用に使用されるヘマグルチニン抗原変異体が、インフルエンザワクチンFluvirin(登録商標)中に含有されるヘマグルチニン抗原変異体とは異なるように、特に選択された。したがって、本試験で使用されるヘマグルチニン抗原は、インフルエンザAウイルス分離株 A/NWS/1933のヘマグルチニンH1(インフルエンザAウイルスグループ1のヘマグルチニン)、インフルエンザAウイルス分離株 A/香港/8/1968のヘマグルチニンH3(インフルエンザAウイルスグループ2のヘマグルチニン)、及びインフルエンザAウイルス分離株 A/オランダ/219/2003のヘマグルチニンH7(インフルエンザAウイルスグループ2のヘマグルチニン)を含む。これらのヘマグルチニン抗原は、標準的な分子生物学の手法を用いてジェネンテックにて作製された。
6−8週齢の雌SCID/ベージュマウス(Charles River Laboratories(Hollister,CA)に、セシウム137線源を使用し、吸収線量350ラドで半致死的に照射した。照射後7日間、飲料水にポリミキシンB(110mg/L)及びネオマイシン(1.1g/L)が添加された。照射の4時間後、各マウスの左わき腹を剪毛し、Betadine(登録商標)(Purdue Pharma,Stamford,CT)及び70%アルコールで前処理した。無菌の外科的手順を用い、麻酔下の外科手技が実施された。各マウスの肋骨境界腺の真下の皮膚が1センチ切開され、続いて腹壁と腹膜の切開が行われた。各マウスの膵臓が注意深く露出され、PBS30μLに再懸濁された50×10ヒトPBMCが注射された。切り込みは、5−OVicryl(登録商標)縫合糸(Ethicon,Somerville,NJ)を使用して筋層で、外科用ステープラーを使用して皮膚で閉じられた。抗原特異的な細胞の選別実験のために、移植後8日目にマウスを屠殺し、その膵臓を収集した。
マウスから得た脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、ヒトIgG+形質芽細胞をCD38highIgG+発現として明らかにする抗ヒトモノクローナル抗体CD38 PECy7(BD Biosciences, San Jose,CA)及びIgG Dylight(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)のカクテルで染色された。単離された脾臓細胞の懸濁液中のヘマグルチニン交差反応性形質芽細胞を同定するために、該脾臓細胞は、インフルエンザウイルスA分離株 A/NWS/1933のヘマグルチニンH1、及びインフルエンザウイルスA分離株 A/香港/8/1968のヘマグルチニンH3で染色された。尚、これらの分離株はLightning−Link(登録商標)標識キット(Innova Biosciences, Cambridge,UK)を使用して、予めFITC又はPEとそれぞれコンジュゲートされていた。
図3Aは、ワクチン接種後7日目、SCID/ベージュマウス濃縮前(すなわち、PBMC/抗原プレミックス前)のPBMCの抗ヘマグルチニン陽性(H3及びH1)形質芽細胞の典型的なFACS解析を示す。図3Bは、プレミックスなし(上枠)、及び抗原プレミックス(下枠)と比較した、移植後8日目、SCID/ベージュマウス濃縮後のヘマグルチニン陽性(H3及びH1)形質芽細胞の典型的なFACSデータ解析を示す。図3A及び3Bが示すように、脾臓内移植前PBMC/抗原プレミックスは、H3/H1抗ヘマグルチニン反応性形質芽細胞を高頻度にもたらした。
以下の表1は、本明細書に記載のSCID濃縮前後での、抗H1/抗H3形質芽細胞の頻度を比較したものである。表1に示されるように、抗H1/抗H3形質芽細胞の頻度は、SCID/ベージュマウス濃縮なしで観察されるものと比較して、本発明のSCID/ベージュマウス濃縮方法使用時に大きく上昇した。
Figure 2015536145
次いで試料を、ヨウ化プロピジウムの存在下で死細胞を排除してAria高速セルソーター(BD Biosciences,San Jose,CA)で解析し、抗ヘマグルチニン特異的形質芽細胞を、単一細胞方式で選別して5%低IgGウシ胎児血清で補充した50μlのRPMI細胞培地を含む96ウェル組織培養プレートに入れた(Gibco,Grand Island,NY)。五百万個の生細胞のすべての解析プロフィールが記録された。プロファイルは、Flowjo version 9.4.11ソフトウェアで解析された。
図4は、プレミックスなし(円)と抗原プレミックスあり(四角)とを比較した、確率応答を示す各SCID/ベージュマウスからの、移植後8日目の脾細胞の解析を示す。データは、抗H1/CD38high形質芽細胞をパーセントで示している。矩形は、抗H1形質芽細胞を示したマウスを表す。
これらの結果は、インフルエンザAウイルスのグループ1(例えば、H1)及びグループ2(例えば、H3、H7)ヘマグルチニン抗原を脾臓内移植前にPBMCと共にインキュベートした場合、ヘマグルチニン交差反応性がある広範な形質芽細胞が検出されたことを示す。これらの結果は、インフルエンザワクチン接種ドナーのヘマグルチニン抗原刺激PBMCのインビトロ刺激が、SCID/ベージュマウスレシピエントにおける形質芽細胞のヘマグルチニン抗原特異的濃縮を促進したことを更に示す。
実施例4.単一形質芽細胞からのIgGクローニング
ヘマグルチニンH1及びH3交差反応性ヒト形質芽細胞(上に記載)は単一細胞選別され、約950個の形質芽細胞となった。単一形質芽細胞を、5%低IgGウシ胎児血清含有RPMIを50μl含むU字底型96ウェルマイクロウェルプレートに直接入れた。該プレートを600xgで5分間遠心分離し(Beckman Coulter,Brea,CA)、培地を吸引により注意深く除去した。細胞を再懸濁させ、同じ手順に従い、PBS 90μl中で二回洗浄した。
可変重鎖及び可変軽鎖をコードするcDNA生成のため、各細胞を、RNaseout(Invitrogen,Grand Island,NY)2ユニット、4dNTP(Perkin Elmer,Waltham,MA)0.5mM、MgCl 1.5mM、KCl 37.5mM、DTT(ジチオスレイトール) 10mM、ノニデットP40(US Biological,Marblehead,MA) 0.25%、ウシ血清アルブミン(Sigma−Aldrich) 0.1mg/ml、pH8.3トリス 25mM、0.25pmolのIgG1−4の定常領域、カッパ鎖定常領域及びラムダ鎖定常領域に特異的なオリゴヌクレオチド(下記)、並びにSuperscriptIII(Invitrogen,Grand Island,NY)40ユニットを含有する6μlの逆転写酵素(RT)反応混合液に再懸濁させた。
IgG1−4定常:GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG(配列番号1)
カッパ定常:CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG(配列番号2)
ラムダ定常:GGGTKTGGTSGTCTCCAC(配列番号3)
反応物を30分おきに3回、それぞれ45℃、50℃、55℃でインキュベートした。インキュベーションに続いて、反応混合物をTE緩衝液(10mm トリス HCl、1mM EDTA)で15μlに希釈した。2μlの上記希釈RTカクテルとAdvantage−GC 2 Polymerase Mix(Clontech,Mountain View,CA)を製造業者の示す手順に従って使用して最初のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施し、IgG重鎖、カッパ鎖及びラムダ鎖を増幅させた。PCR増幅は、以下に示す可変重鎖及び可変軽鎖の生殖細胞系配列並びに定常領域配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドを使用して実施された。
IGVH1aCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC(配列番号4)
IGVH1bCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC(配列番号5)
IGVH2CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC(配列番号6)
IGVH3GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGG(配列番号7)
IGVH4CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC(配列番号8)
IGVH5GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(配列番号9)
IGVH6CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCC(配列番号10)
IGVH7CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGG(配列番号11)
IGKV1GHCATCCRGWTGACCCAGTCTC(配列番号12)
IGKV2GATRTTGTGATGACYCAGWCTC(配列番号13)
IGKV3GAAATWGTRWTGACRCAGTCTC(配列番号14)
IGKV4GACATCGTGATGACCCAGTCTCC(配列番号15)
IGKV5GAAACGACACTCACGCAGTCTC(配列番号16)
IGKV6GAWRTTGTGMTGACWCAGTCTC(配列番号17)
IGLV1CAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(配列番号18)
IGLV2CAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(配列番号19)
IGLV3TCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(配列番号20)
IGLV4CAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(配列番号21)
IGLV5CAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC(配列番号22)
IGLV6AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(配列番号23)
IGLV7CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(配列番号24)
IGLV8CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(配列番号25)
IGLV9CAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(配列番号26)
HC301.5定常GCAGCCCAGGGCSGCTGTGC(配列番号27)
カッパ102定常GCACACAACAGAGGCAGTTCCAG(配列番号28)
ラムダ202定常CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(配列番号29)
重鎖及び軽鎖PCR増幅反応はそれぞれ次の二つの反応に分かれる:重鎖ファミリー VH.1、2、3(プライマー IGVH1a、IGVH1b、IGVH2、IGVH3)とVH.4、5、6、7(プライマー IGVH4、IGVH5、IGVH6及びIGVH7);カッパ鎖ファミリー VK.1、2、3(プライマー IGKV1、IGKV2及びIGKV3)とVK.4、5、6(プライマー IGVK4、IGVK5及びIGVK6);並びにラムダ鎖ファミリー VL.1、2、3、4、5(IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4及びIGLV5)とVL.6、7、8、9(プライマー IGLV6、IGLV7、IGLV8及びIGLV9)。温度循環のためにタッチダウンPCR増幅手順が用いられた。
この反応に続いて、PCR増幅産物を、エキソヌクレアーゼ1(Exo)及びエビアルカリホスファターゼ(SAP)で処理し、過剰なヌクレオチドやプライマーを各PCR増幅反応から除去した(U.S. Biologicals, Marblehead,MA)。最初のPCR増幅産物を、重鎖及び軽鎖両方の可変配列を決定するために、サンガー配列決定を用いて直接配列決定した。入れ子形式の第2次PCR増幅は、哺乳動物のシグナルと定常領域クローニング配列を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて挿入するために、生殖細胞系列が一致した重鎖可変及び軽鎖可変オリゴヌクレオチドを用いて実施された。
sVH1a:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGG(配列番号30)

sVH2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGATCACCT(配列番号31)

sVH3vv:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAG(配列番号32)

sVH3gl:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGG(配列番号33)

sVH4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGCAGG(配列番号34)

sVH5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGGTGCA(配列番号35)

sVH6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTACAGC(配列番号36)

sVH7:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCA(配列番号37)

sVK1:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG(配列番号38)

sVK2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGATATTGTGATGACTCAGTCTCACTCTCCCTGC (配列番号39)

sVK3:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTG(配列番号40)

sVK4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTG(配列番号41)

sVK5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC(配列番号42)

sVK6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCG(配列番号3)

sVL1:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(配列番号44)
sVL2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(配列番号45)

sVL3:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCATCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(配列番号46)

sVL4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(配列番号47)

sVL5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC(配列番号48)

sVL6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(配列番号49)

sVL7:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(配列番号50)

sVL8:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(配列番号51)

wVL9:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(配列番号52)

重鎖定常:GCCAGGGGGAAGACCGATG(配列番号53)

カッハ゜定常:CTGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACAGAAGCAGTTCCAGATTTCAACTGCTC(配列番号54)

ラムタ゛定常:CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(配列番号29)
PCR増幅反応は、製造者の推奨に従い、PrimeStar HS DNA Polymerase with GC(Takara Bio,Shiga,Japan)を使用して設定した。PCR増幅反応に続き、増幅産物を上記のExo/SAPで処理した。PCR増幅産物をコードする重鎖可変及び軽鎖可変を、制限エンドヌクレアーゼ除去手順を使用して哺乳動物発現ベクターに挿入した。キュンケル突然変異誘発法を用いて、PCR増幅産物20μlをIgG、カッパ鎖及びラムダ鎖の一本鎖DNAヒト鋳型にアニールした。(Kunkel (1985) PNAS 82:488-492参照。)正しく挿入された構築物がDNA配列決定により確認された。重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含有するプラスミドを、一過性発現のためのFugeneトランスフェクション試薬(Roche Diagnostic,Indianapolis,IN)を用いて293Tヒト胎児性腎臓細胞にコトランスフェクトし、発現及び結合について以下の実施例5に記載の通り解析した。
実施例5.ヘマグルチニンELISAスクリーニングアッセイ
本発明の方法を用いて得られた各モノクローナル抗ヘマグルチニン抗体が種々のヘマグルチニンサブタイプに結合する能力を、ELISAによって次の通り調べた。種々のヘマグルチニン発現プラスミドが、上記293T細胞にトランスフェクトされた。これらには、H1N1/サウスカロライナ/1918インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンH1、H3N2/パース/2009インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンH3、H5N1/ベトナム/2004インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンH5、及びH7N7/オランダ/2003インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンH7が含まれた。2日後、細胞を50mMのトリス(pH8)、5mMのEDTA、150mMのNaCl、1%トリトンX−100プラスプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)に溶解した。核を遠心分離により取り除き、得られた溶解物を−80℃で保存した。
ELISAスクリーニング用に、PBS中のガランサス・ニバリスのレクチン(Sigma)5μg/mlで384ウェルプレート(Nunc MaxiSorp)をコーティングした。このプレートを洗浄し、次いで種々の発現ヘマグルチニンを含有する細胞溶解物の希釈液でコーティングした。このプレートを洗浄し、抗ヘマグルチニン抗体の種々の希釈液で、次にヤギ抗ヒトHRP二次抗体(Jackson)でインキュベートした。プレートを洗浄し、TMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)基質検出のための処理をした。
約950個の形質芽細胞が上記実施例2に記載の単一細胞選別から得られた。このうち、840個のモノクローナル抗体が293T細胞において一時的に発現され、H1、H3、H5及びH7ヘマグルチニンサブタイプへの結合についてELISAによりスクリーニングされ、結果としてインフルエンザAウイルスグループ1又は2のヘマグルチニンに結合した82個のモノクローナル抗体、並びにインフルエンザAウイルスグループ1及び2のヘマグルチニンに結合した20個のモノクローナル抗体が得られた。
実施例6.インビトロインフルエンザAウイルスの中和
本発明の方法を用いて同定された抗ヘマグルチニン抗体の、広範なヘマグルチニンサブタイプへの結合、並びにインフルエンザAグループ1及びグループ2ウイルス分離株パネルのインビトロ中和を引き起こす能力を下記の通り調べた。
MDCK細胞は、96-ウェル黒透明底イメージングプレート(Costar 3904)中、均一の25%コンフルエントな単層として、10%FBSを補充したDMEM培地中で増殖した。各インフルエンザAウイルスのサブタイプ/菌株をインフルエンザ培地(DMEM+0.2%BSA、2μg/ml TPCKで処理したトリプシン)中で感染多重度(MOI)1に希釈し、各抗体の濃度を変えて(0.02nMから1600nMの範囲)37℃で1時間インキュベートした。各抗体/インフルエンザウイルス混合物を、5%COインキュベーター内37℃で16時間、冷100%エタノールでの細胞固定の前にMDCK細胞に感染させた。次いで固定した細胞をHoechst 33342(Invitrogen,カタログ#H3570)で染色し、細胞核を視覚化し、総細胞数を決定した。細胞を、インフルエンザAウイルス核タンパク質に特異的な、広範囲反応性のモノクローナル抗体(Millipore カタログ#MAB8258)でも染色し、感染細胞数を決定した。
細胞はImage Express Micro(Molecular Devices)を使用して撮像され、データ画像はMetaXpress 3.1ソフトウェアを使用して解析された。感染細胞の割合を決定し、X軸上のlog10の抗体濃度に対してY軸上にプロットした。すべての中和アッセイを3重測定で完了した。データは、非線形回帰用量応答曲線を用いて適合させ、95%信頼区間(95%CI)でのIC50値がnM単位で図5に示されている。
各インフルエンザAウイルス菌株のヘマグルチニン(HA)サブタイプが図5に示されている。
インフルエンザAグループ1及びグループ2ウイルス株の広範なパネルに対して、様々な濃度の本明細書に記載のモノクローナル抗体を用いて、インビトロ中和用量応答曲線を作成した。図6A及び6Bは、インフルエンザAグループ1及びグループ2ウイルス株のパネルに対するmAb 39.29の中和曲線をそれぞれ示す。図6A及び6Bが示すように、mAb 39.29は、試験されたすべてのインフルエンザAウイルス株のインビトロ中和に有効であった。加えて、図7A及び7Bは、インフルエンザAグループ1及びグループ2ウイルス株のパネルに対するmAb81.39の中和曲線をそれぞれ示す。図7A及び7Bが示すように、mAb81.39は、試験されたすべてのインフルエンザAウイルス株のインビトロ中和に有効であった。
これらの結果から、本発明の方法を用いて同定された抗ヘマグルチニン抗体が種々のインフルエンザAウイルス株に対して中和活性を示したことがわかる。とりわけ、二つの抗ヘマグルチニン抗体(mAb 39.29及びmAb 81.39)が、インフルエンザAウイルス株のグループ1(A/CA/7/2009、A/ブリズベン/59/2007、A/ソロモン/3/2006、A/ニューカレドニア(New Caldonia)(Caledonia?)/20/1999、A/プエルトリコ/8/1934、A/日本/305/1957)及びグループ2(A/ビクトリア/361/2011、A/パース/16/2009、A/ブリズベン/10/2007、A/ウィスコンシン/67/2005、A/ビクトリア 3/1975、A/ポート・チャーマーズ/1/1973、A/香港/8/1968、A/愛知/2/1968)両方の中和を含む全インフルエンザAウイルス株の中和に有効であった。
まとめると、これらの結果は、本発明の抗原特異的な形質芽細胞濃縮技術の使用が、複数の抗原に特異性を有する(つまり、種々のヘマグルチニンのサブタイプに特異性を有する)モノクローナル抗体の同定をもたらしたことを示した。加えて、これらの結果は、本明細書に記載の形質芽細胞濃縮技術により、インフルエンザAウイルス株のグループ1とグループ2両方の中和が可能なモノクローナル抗体を、わずか950個の分離された形質芽細胞から同定することが可能になったことを示した。
実施例7.マウスにおけるmAb 39.29のインビボ有効性
本発明の方法を使用して得られた抗ヘマグルチニン抗体の特性を更に明らかにした。mAb 39.29(mAb 39.29 NC v1)の、マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染に対するインビボ有効性試験が以下の通り実施された。DBA/2Jマウス(Jackson Lab,Bar Harbor,ME)を、インフルエンザ培地(DMEM、0.2% BSA、2μg/mL TPCKで処理したトリプシン)中、最小LD100量に希釈した種々のインフルエンザAウイルス株50μに経鼻感染させた。マウス当たり40PFUで使用したH1N1 A/プエルトリコ/8/1934(Genentech;IC50 2.0nM);マウス当たり3PFUで使用したH3N2 A/香港/1/1968(ViraPur,San Diego,CA;IC50 45.1nM);マウス当たり1.5x10PFUで使用したH3N2 A/ポート・チャーマーズ/1/1973 (ViraPur,San Diego,CA;IC50 2.2nM);及びマウス当たり2x10PFUで使用したH3N2 A/愛知/2/1968(ViraPur,San Diego,CA;IC50 35nM)を含む、様々なインビトロIC50値を示す4つの異なるインフルエンザAウイルス株が、この一連の実験で使用された。mAb 39.29の静脈内投与に先立って、インフルエンザウイルス感染を72時間進行させた。
インフルエンザウイルス感染後72時間後、200μl PBS中900μg/マウス(約45mg/kg)、300μg/マウス(約15mg/kg)、及び100μg/マウス(約5mg/kg)の種々の用量でmAb 39.29をマウスへ静脈投与した。コントロール処置した動物には、mAb gD5237(単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質Dに特異的なモノクローナル抗体)を、mAb 39.29の試験した最高用量と同等の用量(すなわち、約45mg/kg)で投与した。感染後21日目まで、マウスの体調と生存を毎日モニターし、体重も毎日測定した。4つすべてのインフルエンザAウイルス株感染における、mAb 39.29全用量対コントロールは、ログランク検定でP<0.01であった。
図8A、8B、8C及び8Dは、インフルエンザAウイルスA/プエルトリコ/8/1934、A/ポート・チャーマーズ/1/1973、A/香港/1/1968及びA/愛知/2/1968にそれぞれ感染してから72時間後に種々の量のmAb 39.29を投与されたマウスの生存率(経時、日単位)を示す。図8A、8B、8C及び8Dが示すように、コントロール抗体を投与された感染マウスにおいて、14日目までに100%の死亡率が観察された。しかし、本発明のモノクローナル抗体を投与された感染マウスでは、生存率が増加した。特に、インフルエンザウイルスA/ポート・チャーマーズ/1/1973又はインフルエンザウイルスA/愛知/2/1968に感染したマウスにおける試験された39.29の全用量で、100%の生存率が観察された。(図8B及び8D参照。)
これらの結果は、本発明の方法に従って得られたモノクローナル抗体は、種々のインフルエンザAウイルスのサブタイプの感染を治療するのに有効であることを示した。
前述の発明は、明確性と理解の目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、これらの説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その内容全体が出典明示により援用される。

Claims (19)

  1. 抗原に特異性を有する形質芽細胞を濃縮した形質芽細胞の集団を得る方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを、PBMC/抗原プレミックスを得るために抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原に特異性を有する形質芽細胞を濃縮した形質芽細胞の集団を得る、方法。
  2. PBMCの免疫不全動物の脾臓への移植前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原をPBMC/抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項1に記載の方法。
  3. ドナーが、抗原又はその一部の断片に予め曝されているドナーである、請求項1に記載の方法。
  4. 形質芽細胞の単一細胞選別を更に含む、請求項1に記載の方法。
  5. 形質芽細胞の抗原特異的単一細胞選別を更に含む、請求項1に記載の方法。
  6. 形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項1に記載の方法。
  7. 抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを、PBMC/抗原プレミックスを得るために少なくとも一種の抗原と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法。
  8. PBMCの免疫不全動物の脾臓への移植前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原をPBMC/抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項7に記載の方法。
  9. ドナーが、抗原又はその一部の断片に予め曝されているドナーである、請求項7に記載の方法。
  10. 形質芽細胞の単一細胞選別を更に含む、請求項7に記載の方法。
  11. 形質芽細胞の抗原特異的単一細胞選別を更に含む、請求項7に記載の方法。
  12. 形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項7に記載の方法。
  13. PBMCを、複数の異なる抗原と接触させることを更に含む、請求項7に記載の方法。
  14. 抗原に特異性を有する抗体を産生することができる形質芽細胞を同定する方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを、PBMC/抗原プレミックスを得るために少なくとも一種の抗原と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された形質芽細胞から抗原特異的細胞を選別することとを含み、その結果抗原特異性を有する抗体を産生できる形質芽細胞を同定する、方法。
  15. PBMCの免疫不全者の脾臓への移植前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原をPBMC/抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項14に記載の方法。
  16. 単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項14に記載の方法。
  17. 複数の抗原に特異性を有する抗体を産生することができる形質芽細胞を同定する方法であって、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得ることと、該PBMCを、PBMC/抗原プレミックスを得るために複数の異なる抗原と接触させることと、該PBMCを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された形質芽細胞から抗原特異的細胞を選別することとを含み、その結果抗原特異性を有する抗体を産生できる形質芽細胞を同定する、方法。
  18. PBMCの免疫不全者の脾臓への移植前に、PBMCを洗浄して過剰又は非結合抗原をPBMC/抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項17に記載の方法。
  19. 単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項17に記載の方法。

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