KR20150084831A - 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 방법에 관한 것이다. 방법은 1종 초과의 항원을 인식하는 희귀 항체를 비롯한 항체의 동정에 유용하다.
Description
관련 출원
본원은 2012년 11월 13일에 출원된 미국 가출원 61/725,764를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자문서로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 2013년 10월 22일에 작성된 상기 ASCII 복사본은 P5500R1-WO_SL.txt로 명명되며 15,453 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 방법에 관한 것이다. 방법은 1종 초과의 항원을 인식하는 희귀 항체를 포함하여 항체의 동정에 유용하다.
인간 이뮤노글로불린 유전자의 클로닝을 가능하게 하는 기술적 진보는 치료 가능성을 지닌 희귀한 기능성 인간 모노클로날 항체의 발견에 효과적인 것으로 증명되었다. 그러나, 수십만 인간 형질세포의 시험관내 배양과 분류 또는 불과 몇 개의 가능성이 있는 항체 후보자의 동정을 위하여 인간 형질세포로부터 거대 파지-제시 라이브러리의 생성을 수반하는, 그러한 희귀 인간 항체의 발견에 사용되는 다수의 방법은 종종 수고로움이 따른다.
희귀한 기능성 인간 모노클로날 항체의 동정 효율을 증가시키기 위한 다양한 방법이 개발되어 왔다. 브람스(Brams) 등은 항원으로 나이브 인간 비장세포의 시험관내 프라이밍, 뒤이어 면역손상 마우스로 프라이밍된 비장세포의 복막내 또는 정맥내 전달, 이어서 부가적인 항원으로 공여자 마우스의 후속 생체내 부스팅의 조합에 의한 항원-특이적 IgG 반응을 보고하였다. (문헌 [Brams et al., (1998) J Immunology 160:2051-2058]; 국제 출원 공개 번호 WO 1996/40252 참조). 항원-특이적 반응의 증강을 달성하기 위하여 시험관내 비장세포 배양과 시험관내 및 생체내 항원 챌린지 둘 다에 대한 필요조건에 주목하였다. 다른 일행들은 직접 면역손상 마우스의 비장으로 항원과 함께 인간 말초 혈액 백혈구 (PBL)의 생착 후에 일어나는 항원-선택적 인간 B 세포 팽창을 보고하였다. (문헌 [Depraetere et al., (2001) J Immunology 166:2929-2936]; 국제 출원 공개 번호 WO 1999/60846 참조).
항체 동정 기술에 있어서 이러한 진보에도 불구하고, 1종 초과의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 포함하여 희귀 모노클로날 항체의 동정에 유용한 항원-특이적 형질모세포의 풍부화 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명자들은 항원-특이적 형질모세포의 동정에 유효한 생체내 형질모세포 풍부화 기술을 개발하였다. 항원-특이적 세포 분류와 조합하여 사용될 때, 형질세포 증식 또는 파지-디스플레이 라이브러리의 생성을 필요로 하지 않고 희귀하고 기능적인 모노클로날 항체의 효율적인 고-빈도 동정을 가능하게 하는 생체내 항원-유도 형질모세포 풍부화 기술이 본원에 기재된다. 본 발명에 의하여 제공된 방법은 희귀 항체의 동정에 특히 유용하다. 본 발명에 의하여 제공된 방법은 또한 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 동정에 특히 유용하다.
본 발명은 부분적으로는 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시키는 단계, PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.
일부 측면에서, PBMC는 항원에 이전에 노출된 공여자로부터 수득된다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 항원에 이전에 노출된 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계, 및 단리된 항원-특이적 형질모세포를 분류하여, 항체를 동정 또는 단리하는 단계를 포함하는, 항체를 동정 또는 단리하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.
본 방법의 일부 측면에서, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계에 사용된 항원은 공여자가 이전에 노출되었던 항원과 동일한 항원 (또는 그의 단편 또는 부분)이다. 다른 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계에 사용된 항원은 공여자가 이전에 노출되었던 항원과 상이한 항원이다 (예를 들어, 그 항원은 공여자가 이전에 노출되었던 항원의 변이체, 하위유형, 이소형 또는 상동체이다).
일부 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 항체-생산 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.
다른 측면에서, 본 발명은 항원에 이전에 노출된 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시키는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 및 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시킨 후 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 형질모세포 집단은 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 1종의 항원-특이적 항체-생산 형질모세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 수행된다.
다른 측면에서, 본 발명은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계, PBMC를 2종 이상의 상이한 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계, 면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계, 및 단리된 형질모세포의 항원-특이적 세포를 분류하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 단계를 포함하는, 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 PBMC/항원 프리믹스로부터 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린의 클로닝을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, PBMC는 포유동물로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 마우스, 래트, 토끼 또는 염소로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 인간으로부터 수득된다. 다른 측면에서, PBMC는 비-포유동물인 동물로부터 수득된다.
도 1은 생체내 SCID 마우스에서의 형질모세포 분화를 보여주는 데이터를 도시한다. 이식전 (0일차로 표시) 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 (인간 PBMC의 비장내 주사 뒤) 4, 7 및 8일차에 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포를 항-CD19 및 항-CD38로 염색하여 B 계통 세포를 구별하였다. 상부 원, 하부 원, 및 직사각형은 각각 형질모세포, 활성화된 배중심-유사 세포, 또는 나이브 B 세포를 나타낸다. 숫자는 각 하위세트의 빈도를 %로 나타낸다.
도 2a는 파상풍 백신접종후 7일차에서 인간 공여자 PBMC (파상풍 변독소-반응성)의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2b는 파상풍-백신접종 공여자로부터 수득한 인간 PBMC의 이식후 8일차에서 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포 (파상풍 변독소 반응성)의 대표적인 프로파일을 도시한다. 숫자는 각 하위세트의 빈도를 %로 나타낸다. 도 2c는 각각의 자극 조건하에서 개별 SCID 마우스로부터 수득한 비장 당 파상풍 변독소-반응성 세포의 수를 도시한다. 생체내 부스트는 SCID 마우스에 IP 주사한 100 ㎍ 파상풍 변독소를 함유하였다. 시토카인 칵테일은 SCID 마우스에 복막내 (i.p.) 주사한 인간 B 세포 활성화 인자 (BAFF, 50 ㎍)와 IL-2, IL-6 및 IL-21 (각각 50 ng)의 혼합물을 함유하였다.
도 3a 및 3b는 SCID 마우스 풍부화전 7일차 후-백신접종 PBMC로부터의 항-헤마글루티닌-양성 형질모세포 (H3 헤마글루티닌 및 H1 헤마글루티닌)의 FACS 분석을 보여주는 데이터 (도 3a) 및 각각 상부 및 하부 패널에 항원 프리믹스의 존재하 및 부재하에 SCID 마우스 풍부화 후 8일차 후-이식으로부터의 항-헤마글루티닌-양성 형질모세포 (H3 헤마글루티닌 및 H1 헤마글루티닌)의 FACS 분석을 보여주는 데이터 (도 3b)를 도시한다.
도 4는 PBMC/항원 프리믹스 부재하에 (원) 및 PBMC/항원 프리믹스 존재하에 (사각형) 개별 SCID/베이지 마우스로부터의 PBMC의 8일차 후-비장내 이식으로부터 수득한 비장세포의 분석을 %헤마글루티닌 (H1)+/CD38high 형질모세포로서 보여주는 데이터를 도시한다. 직사각형은 H1+ 형질모세포를 제시한 마우스를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항-헤마글루티닌 항체에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 6a 및 6b는 모노클로날 항체 39.29에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 (도 6a) 및 군2 (도 6b) 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 7a 및 7b는 모노클로날 항체 81.39에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 (도 7a) 및 군2 (도 7b) 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/PR/8/1934 (PR8), 도 8a; A/포트 챌머스(Port Chalmers)/1/1973 (PC73), 도 8b; A/홍콩/1/1968 (HK68), 도 8c; 및 A/아이치/2/1968 (아이치68), 도 8d)로 감염시키고 다양한 양의 모노클로날 항체 39.29를 투여한 마우스의 %생존을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 2a는 파상풍 백신접종후 7일차에서 인간 공여자 PBMC (파상풍 변독소-반응성)의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2b는 파상풍-백신접종 공여자로부터 수득한 인간 PBMC의 이식후 8일차에서 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포 (파상풍 변독소 반응성)의 대표적인 프로파일을 도시한다. 숫자는 각 하위세트의 빈도를 %로 나타낸다. 도 2c는 각각의 자극 조건하에서 개별 SCID 마우스로부터 수득한 비장 당 파상풍 변독소-반응성 세포의 수를 도시한다. 생체내 부스트는 SCID 마우스에 IP 주사한 100 ㎍ 파상풍 변독소를 함유하였다. 시토카인 칵테일은 SCID 마우스에 복막내 (i.p.) 주사한 인간 B 세포 활성화 인자 (BAFF, 50 ㎍)와 IL-2, IL-6 및 IL-21 (각각 50 ng)의 혼합물을 함유하였다.
도 3a 및 3b는 SCID 마우스 풍부화전 7일차 후-백신접종 PBMC로부터의 항-헤마글루티닌-양성 형질모세포 (H3 헤마글루티닌 및 H1 헤마글루티닌)의 FACS 분석을 보여주는 데이터 (도 3a) 및 각각 상부 및 하부 패널에 항원 프리믹스의 존재하 및 부재하에 SCID 마우스 풍부화 후 8일차 후-이식으로부터의 항-헤마글루티닌-양성 형질모세포 (H3 헤마글루티닌 및 H1 헤마글루티닌)의 FACS 분석을 보여주는 데이터 (도 3b)를 도시한다.
도 4는 PBMC/항원 프리믹스 부재하에 (원) 및 PBMC/항원 프리믹스 존재하에 (사각형) 개별 SCID/베이지 마우스로부터의 PBMC의 8일차 후-비장내 이식으로부터 수득한 비장세포의 분석을 %헤마글루티닌 (H1)+/CD38high 형질모세포로서 보여주는 데이터를 도시한다. 직사각형은 H1+ 형질모세포를 제시한 마우스를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항-헤마글루티닌 항체에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 6a 및 6b는 모노클로날 항체 39.29에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 (도 6a) 및 군2 (도 6b) 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 7a 및 7b는 모노클로날 항체 81.39에 의한 다양한 A형 인플루엔자 군1 (도 7a) 및 군2 (도 7b) 바이러스 균주의 시험관내 중화를 보여주는 데이터를 도시한다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/PR/8/1934 (PR8), 도 8a; A/포트 챌머스(Port Chalmers)/1/1973 (PC73), 도 8b; A/홍콩/1/1968 (HK68), 도 8c; 및 A/아이치/2/1968 (아이치68), 도 8d)로 감염시키고 다양한 양의 모노클로날 항체 39.29를 투여한 마우스의 %생존을 보여주는 데이터를 도시한다.
본 발명은, 그 중에서도, 형질모세포의 항원-특이적 풍부화 방법을 제공한다. 본 방법은 항원-특이적 형질모세포의 신속한 동정 및 희귀 모노클로날 항체의 효율적인 동정을 제공한다.
정의
용어 "형질모세포"는 형질세포에 대한 전구체인 세포를 언급한다.
용어 "비장세포"는 비장에 위치하거나 또는 비장 조직으로부터 수득한 상이한 혈액세포 유형 중 어느 하나를 언급한다.
용어 형질모세포의 "풍부화하는" 또는 "풍부화"는 혼합 세포 집단에 함유된 목적하는 세포, 전형적으로 항원-특이적 세포의 빈도를 증가시키는 것을 언급한다. 따라서, 세포 집단 (예를 들어, 항원-특이적 형질모세포)의 "풍부화하는" 또는 "풍부화"는 풍부화하는 또는 풍부화 단계의 결과로서 보다 높은 빈도의 항원-특이적 세포 (예를 들어, 항원-특이적 형질모세포)를 보유하는 세포 집단을 포함한다.
"말초 혈액 단핵 세포" (PBMC)는 원형의 핵을 보유한 혈액세포를 언급하며, 림프구 (T 세포 및 B 세포), 단핵구, 대식구, 자연 살해 세포, 형질세포 및 형질모세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말초 혈액 단핵 세포"는 림프구 (예를 들어, B 세포, T 세포, 자연 살해 세포)를 포함하는 용어 "말초 혈액 림프구" (PBL)와 교환가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 언급한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하며 이에 제한되지는 않는다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면에 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 언급한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 언급한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 좀더 세분될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 목적하는 치료적 또는 예방적 결과의 달성에 유효한 양을 언급한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "완전 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 보유하거나 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 보유하는 항체를 언급하도록 본원에서 교환가능하게 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되며, 외인성 핵산을 도입시킨 세포 (그러한 세포의 자손 포함)를 언급한다. 숙주 세포는 "형질전환체", 및 일차 형질전환된 세포와 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 양친 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있지만 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유하는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간세포에 의하여 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래한 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간화" 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVR)으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는, HVR (예를 들어, CDR)의 전체 또는 실질적으로 전체가 비-인간 항체의 것들에 상응하고 FR의 전체 또는 실질적으로 전체가 인간 항체의 것들에 상응하는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이다. 인간화 항체는 임의로는 인간 항체로부터 유래한 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 언급한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리시킨 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 결정시에 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 언급하며, 즉 그 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어 자연발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산중에 발생하는 있을지 모르는 변이체 항체는 제외하며, 그러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정기 (에피토프)에 대하여 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대비하여, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정기에 대하여 지향된다. 따라서, 수식 어구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 성격을 나타내며, 임의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 제시법, 및 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하여 (이에 제한되지는 않음) 다양한 기술로 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체 제조를 위한 그러한 방법 및 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합시키지 않는 항체를 언급한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 지닌 자연발생 이뮤노글로불린 분자를 언급한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드 결합되어 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단쪽으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) ("가변 중쇄 도메인" 또는 "중쇄 가변 도메인"으로도 지칭), 그 뒤에 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 보유한다. 마찬가지로, N-말단에서 C-말단쪽으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) ("가변 경쇄 도메인" 또는 "경쇄 가변 도메인"으로도 지칭), 그 뒤에 불변 경 (CL) 도메인을 보유한다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 두 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 그러한 치료제품의 사용에 관련한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합요법, 금기사항 및/또는 주의사항에 관한 정보를 담고 있는, 치료제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 사용설명서를 언급하는 데 사용된다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 해주기 위한 형태로 있고, 제제가 투여될 대상체에 용납하기 어렵게 유독한 부가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 언급한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에 무독한, 활성 성분 이외의 제약 제제중의 성분을 언급한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하며 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" (및 그의 문법적 변이, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")은 치료되는 개체의 자연 경과를 변경시키기 위한 일환으로의 임상적 개입을 언급하며, 임상 병리의 예방을 위해서 또는 그의 진행중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 어떤 직접적인 또는 간접적인 병리학적 귀결의 약화, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 둔화시키는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그것이 연결되는 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 그 용어는 자기-복제성 핵산 구조로서의 벡터 및 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다.
일반 방법
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 통상의 기술자에게 알려져 있고 이용가능한 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 다음과 같은 문헌에 기재되어 있다: Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al ., eds., 1991); 및 Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999). 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현은 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523에 기재되어 있다. (또한, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] (이. 콜라이에서의 항체 단편 발현에 대하여 기재하고 있음) 참조).
달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 발명이 속하는 관련 기술분야에서의 통상의 기술자에 의하여 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에는 희귀 모노클로날 항체의 동정에 유용한 방법이 제공된다. 특히, 본 발명은 항체 및 그러한 항체를 코딩하는 핵산을 단리해 낼 수 있는 항원-특이적 형질모세포의 효율적이고 효과적인 동정을 위한 생체내 형질모세포 풍부화 방법론을 제공한다. 본 발명의 하나의 특정 측면은 형질모세포의 생체내 항원-특이적 풍부화를 이용하는 희귀 항체의 동정 및 단리 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 항체는 희귀한 기능성 모노클로날 항체이다. 본 발명의 또 다른 특정 측면은 1종 초과의 항원을 인식 (예를 들어, 그들에 결합)하는 (예를 들어, 동일한 항원의 변이체, 이소형, 하위유형 또는 상동체를 인식하거나 또는 그들에 결합하는 또는 상이한 종의 동일한 항원을 인식하거나 또는 그에 결합하는) 항체의 동정 및 단리 방법을 제공하는 것이다. 본 방법은 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득 (예를 들어, 단리)하는 단계, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계 (본원에서는 "PBMC/항원 프리믹스"로 언급), 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 (주사, 이식, 또는 기타 수단에 의하여) 전달하는 단계, 주입한 PBMC를 면역손상 동물의 비장에 주재시키거나 또는 잔류시키는 단계, 및 비장으로부터 항원-특이적 형질모세포를 단리하는 단계를 포함한다. 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 방법은 통상의 기술자에게 주지이고 이용가능하다.
일부 실시양태에서, PBMC를 항원과 접촉시키는 단계는 시험관내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, PBMC/항원 프리믹스 후에 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC로부터 미결합 항원을 세척하지 않는다. 다른 실시양태에서, PBMC를 세척하여 미결합 항원을 제거하는 부가적인 단계가 PBMC/항원 프리믹스 후에 및 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 수행된다. 일부 실시양태에서, 항원-특이적 단일-세포 분류의 부가적인 단계가 비장으로부터 항원-특이적 형질모세포의 단리 후에 수행된다. 다른 실시양태에서, 단리된 세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝의 부가적인 단계가 비장으로부터 항원-특이적 형질모세포의 단리 후에 또는 단일-세포 분류 후에 수행된다.
파상풍 변독소 항원을 사용하여 생체내 형질모세포 풍부화를 위한 방법의 최적화를 수행하였다. 이들 연구에서, 본 발명자들은 본원 기재의 방법을 사용하여 증가된 개수의 파상풍 변독소-특이적 형질모세포가 수득되었음을 보여주었다. (실시예 1과 2 참조). 방법을 A형 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌에 대하여 특이적인 희귀 형질모세포의 풍부화 및 동정에 추가 적용하였다. 본 발명의 형질모세포 풍부화 방법의 사용은, 군1 및 군2 헤마글루티닌 둘 다에의 결합에 효과적이고/이거나 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 둘 다의 중화에 효과적인 인간 모노클로날 항체를 포함하여, 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 단리물에의 결합 및 그들의 중화에 효과적인 인간 모노클로날 항체의 동정을 가져왔다. (실시예 3 내지 7 참조).
본 방법은 효율적이고 증진된 항원-특이적 형질모세포 풍부화, 증가된 항원-특이적 반응, 높은 친화도와 기능을 보유한 항체의 동정, 및 1종 초과의 항원을 인식하는 항체의 동정을 포함하여 (이에 제한되지는 않음) 이전의 모노클로날 항체 동정 방법을 능가하는 이점을 제공한다.
본 발명의 방법은 희귀한 기능성 모노클로날 항체를 동정하는 효율을 증가시킴으로써 종래기술 방법을 능가하는 부가적인 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 방법은 면역손상 동물의 비장으로 PBMC의 전달시에 또는 그에 후속하여 관심 항원 또는 항원들로의 면역손상 동물 (예를 들어, 마우스)의 생체내 면역화 없이도 효과적이다. 부가적으로, 본 방법은 면역손상 동물의 비장으로 PBMC의 전달시에 또는 그에 후속하여 면역손상 동물을 관심 항원 또는 항원들로 부스팅시키지 않고도 효과적이다. 또한, 본 발명의 방법은, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하기 위한, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC의 전달하기 전에 항-IL-2-Rb 항체로 동물의 전처리에 의한 것과 같은 면역손상 동물의 자연 살해 (NK) 세포의 제거 또는 사멸과 관련되지 않는다.
(인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한) 항-헤마글루티닌 항체의 동정에 관련해서, 이전의 보고에서는 모든 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 단리물에 결합하여 그들을 중화시킬 수 있는 단일 항체를 발견하기 위한 대략 104,000개의 시험관내 배양한 인간 형질세포로부터의 헤마글루티닌-결합 항체의 직접 클로닝을 기재한 바 있다. (문헌 [Corti et al., (2011) Science 333:850-856] 참조). 그러나 본원 기재의 형질모세포 풍부화 방법은 다양한 헤마글루티닌 하위유형을 인식한 20종의 항-헤마글루티닌 항체의 동정을 도출하였으며, 그들 중 4종의 항-헤마글루티닌 항체는 불과 840개의 클로닝된 인간 모노클로날 항체를 스크리닝함으로써 다양한 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 단리물의 중화에 효과적이었다.
본 발명의 항원-특이적 형질모세포 풍부화 방법은 형질모세포, 및 예를 들어 파상풍 변독소, 풍진, 홍역, 이하선염, 수두대상포진, 톡소플라스마증, 인플루엔자 바이러스, HIV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 유두종바이러스, 효모, 기생충 (예를 들어, 말라리아), 박테리아, CMV, 라우스 육종 바이러스 등을 포함한 어떤 목적 항원에 대한 그들의 상응하는 항체를 동정하는 데에 유용하다.
본 방법에 사용하기 위한 PBMC는 항원-특이적 항체를 원하는 임의 동물 (공여자)로부터 수득될 수 있다. 그러한 동물은 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 닭, 염소, 인간 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 예를 들어 인간과 같은 포유동물로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 적어도 1종의 항원, 감염체 (예를 들어, 박테리아성 또는 바이러스성 인자), 또는 그들의 일부로 이전에 면역화되었거나 또는 그들에 노출된 인간으로부터 수득되며, 여기에서 그 항원은 항원에 대한 면역반응을 도출시키기에 충분하다. 이와 달리, PBMC는 비-인간 동물, 특히 비-인간 포유동물로부터 수득될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, PBMC는 적어도 1종의 항원, 감염체, 또는 그들의 일부로 이전에 면역화되었거나 또는 그들에 노출된 비-인간 동물로부터 수득된다. 항원은 임의의 자기- 또는 비-자기 항원일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 공여자에서 면역반응을 유도할 수 있으며 이는 조혈 및 림프단핵구 조직내 항원-특이적 형질모세포, 형질세포, 또는 B 세포의 주둔으로 이어진다.
본 방법은 마우스 또는 다른 동물 종을 포함하여 임의 면역손상 동물에 적용될 수 있다. 면역손상 동물은 전형적으로 이식한 이종이식편 또는 동종이식편 혈액 백혈구/림프구 (예를 들어, PBMC, PBL) 또는 비장세포에 대한 유효 면역반응 유발 능력이 제한될 것이거나 또는 결여될 것이다. 특정 측면에서, 면역손상 동물은 보유하는 경우에 이식된 세포를 거부할 수도 있는 기능성 T 세포 또는 B 세포를 보유하지 않는다. 본 방법에 사용하기 위한 면역손상 동물의 예는 예를 들어 SCID/베이지 마우스, NOD-SCID 마우스, 누드 마우스 등을 포함한다.
일부 측면에서, PBMC/항원 프리믹스에 사용하기 위한 항원은 정제되거나 또는 실질적으로 정제된 항원이다. 항원은 재조합 수단 (즉, 재조합 항원)에 의하여 생산되거나 또는 자연생산된 항원일 수 있다. 항원은 전장 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 부분 또는 단편, 예컨대 예를 들어 단백질분해 단편을 포함할 수 있다. 항원은 또한 합성 수단에 의하여 생산된 합성 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 부가적으로, PBMC/항원 프리믹스에 사용하기 위한 항원은 1종의 항원 또는 1종 초과의 항원 (예를 들어, 1종 초과의 항원의 혼합물)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 1종 초과의 항원, 예컨대 예를 들어 상이한 A형 인플루엔자 바이러스 단리물로부터의 1종 초과의 헤마글루티닌 하위유형 (예를 들어, 군1 및 군2 헤마글루티닌 하위유형)의 혼합물일 수 있다.
본 방법에 따른 PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 항원의 양은 다양할 수 있다. 본 발명은 PBMC/항원 프리믹스 중 각 1x106개 B 세포에 대한 약 0.1 내지 2 ㎍의 항원이 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화를 가져왔음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 그러나 본 방법은 PBMC/항원 프리믹스에 사용된 항원의 양에 제한되지 않는다. 일반적으로, PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 항원의 양은 1x106개 B 세포당 약 0.001 ㎍, 0.005 ㎍, 0.01 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1.0 ㎍, 2 ㎍, 5 ㎍ 또는 10 ㎍이거나; 또는 1x106개 B 세포당 약 0.001 ㎍ 내지 10 ㎍의 범위일 것이다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위해 PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 항원의 양을 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.
본 방법에 따른 PBMC/항원 프리믹스를 위한 시간의 길이는 다양할 수 있다. 본 발명은 30분 PBMC/항원 프리믹스가 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화를 가져왔음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 일반적으로, PBMC/항원 프리믹스를 위한 시간의 길이는 약 10분 내지 약 180분, 예컨대, 예를 들어 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 75분, 약 90분, 약 120분, 약 150분 또는 약 180분일 것이다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위해 PBMC/항원 프리믹스를 위한 시간의 길이를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.
본 방법에 따라 PBMC/항원 프리믹스가 일어나는 온도는 다양할 수 있다. 본 발명은 예로서 37℃에서 (30분 동안) PBMC/항원 프리믹스의 수행이 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화를 가져왔음을 보여준다. PBMC/항원 프리믹스가 일어나는 온도를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다. 일반적으로, 보다 낮은 온도는 보다 긴 PBMC/항원 프리믹스 시간을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 37℃에서보다는 30℃에서의 PBMC/항원 프리믹스의 수행이 30분보다 긴, 예컨대, 예를 들어 약 45분, 약 60분, 약 90분 등의 항원 프리믹스 시간을 필요로 할 수 있다.
일부 측면에서, PBMC/항원 프리믹스는 아주반트, 예를 들어 완전 프로인트 아주반트, 알룸, 사포닌 등의 부재하에 또는 존재하에 수행될 수 있다. 그 밖의 알려져 있는 아주반트 또한 PBMC/항원 프리믹스에 사용될 수 있다.
임의 개수의 세포를 PBMC/항원 프리믹스 단계에서 항원과 혼합시키거나 또는 접촉시킬 수 있다. 본 방법은 PBMC/항원 프리믹스에서 항원과 접촉된 세포의 수에 제한되지 않는다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위해 PBMC/항원 프리믹스용으로 사용된 세포의 수를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.
본 방법에 따라 면역손상 동물의 비장으로 이식된 세포 (예를 들어, PBMC)의 수 역시도 다양할 수 있다. 본 발명은 면역손상 마우스의 비장으로 이식된 50x106개 PBMC가 희귀 항원-특이적 형질모세포의 성공적인 동정을 가져왔음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 그러나 본 방법은 면역손상 동물의 비장으로 이식된 세포의 수에 제한되지 않는다. 면역손상 동물의 비장으로 이식된 세포의 수를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다. 일반적으로, 세포의 수는 약 1x105, 약 1x106, 약 5x106, 약 1x107, 약 5x107, 약 1x108, 약 5x108, 약 1x109, 약 5x109 또는 약 1x1010개일 것이다.
비장내 이식 뒤에, 이식된 PBMC로 하여금 단리되기 전에 다양한 양의 시간 동안 비장에 잔류하도록 할 수 있다. 본 발명은 이식된 PBMC로 하여금 면역손상 마우스의 비장내에 7 또는 8일 동안 잔류하게 하는 것이 파상풍 변독소 및 헤마글루티닌에 대한 항원-특이적 형질모세포의 효과적이고 강건한 풍부화으로 귀결되었음을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다. 일반적으로, 이식된 PBMC가 단리되기 전에 비장 안에 잔류하는 시간의 길이는 약 4일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일, 또는 약 8일이 될 것이다. 그러나, 이식된 PBMC는 비장내 주사 후에 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 또는 14일 초과 동안 비장 안에 잔류할 수 있다. 14일이 넘어가면, 이식된 PBMC는 마우스 자연 살해 (NK) 세포에 대한 공격을 개시할 수 있는 것으로 예상되거나 또는 예감된다. 보다 적은 수의 세포의 비장내 이식은 이식된 PBMC로 하여금 그들의 단리 전에 비장에 보다 긴 시간 동안 잔류하게 할 수 있다. 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위한 단리 전에 PBMC가 비장에 잔류할 시간의 길이를 (일상 실험에 의하여) 측정하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 속한다.
일부 실시양태에서, PBMC는 하나의 개별 공여자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 하나 초과의 개별 공여자로부터 수득된다. 하나 초과의 공여자로부터 수득한 PBMC는 PBMC/항원 프리믹스 전에 또는 PBMC/항원 프리믹스에 이어 비장내 주사 전에 풀링되거나 또는 함께 혼합될 수 있다.
본 방법은 공여자로부터 수득한 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 위한 PBMC 또는 PBL의 사용에 제한되지 않는다. 형질모세포 및 B 세포에 대한 다른 공여자 세포 공급원, 예컨대 예를 들어 비장세포, 골수 세포, 편도세포, 림프선으로부터 수득한 세포, 줄기세포 등이 본 방법과 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 측면에서, 비장세포 (즉, 비장 세포)는 본 발명에 따른 항원-특이적 형질모세포의 풍부화에 사용하기 위한 공여자로부터 수득될 수 있다. 비장세포는 1종 이상의 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 단리되고, 혼합된 다음, 인큐베이션하거나, 또는 본원 기재의 방법에 따라 항원과 접촉시키고 (항원 프리믹스), 그 후 면역손상 동물의 비장으로 주입시킬 수 있다. 항원 프리믹스 전에, 비장세포는 예를 들어 피콜(Ficoll) 분리 기술을 포함하여 통상의 기술자에 의하여 잘 알려진 방법을 이용하여 단핵세포 (예를 들어, 형질모세포, B 세포 등)에 대하여 풍부화될 수 있다.
본 발명은 1종 초과의 항원에 대하여 또는 동일한 항원의 상이한 변이체, 단리체, 하위유형 또는 상동체에 대하여 특이성을 갖는 (예를 들어, 그들을 인식할 수 있거나 또는 그들에 결합할 수 있는) 희귀 형질모세포 (및 희귀 B 세포) (및 그들의 상응하는 모노클로날 항체)를 동정하는 효율적이고 효과적인 수단을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 1종 초과의 항원을 인식할 수 있거나 그들에 결합할 수 있거나 또는 동일한 항원의 상이한 변이체, 단리체, 하위유형 또는 상동체를 인식할 수 있거나 그들에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 항원-특이적 형질모세포를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 예로서, 개별적으로 A형 인플루엔자 바이러스 군1 및 군2 헤마글루티닌 하위유형을 인식하는 모노클로날 항체를 포함하여 헤마글루티닌에 대하여 지향된 희귀 인간 모노클로날 항체를 동정하기 위한 본 방법의 사용을 보여준다.
따라서, 본 방법은 동일한 항원 (예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 등)의 1종 이상의 상이한 변이체, 상동체, 하위유형 또는 이소형을 인식하거나, 그들에 결합하거나 또는 그들에 대한 특이성을 갖는 항체 (예컨대, 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체), 예컨대, 예를 들어 하나 초과의 종으로부터의 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 보유하거나, 상이한 종으로부터의 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 보유하거나, 하나 초과의 종에 공통인 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 갖는 항체 (예를 들어, 예컨대 인간 및 마우스로부터의 동일한 또는 상동 항원을 인식하거나, 그에 결합하거나 또는 그에 대한 특이성을 갖는 항체)의 동정에 유용하다. 그러한 항체는 상이한 종, 하위유형, 단리물 (예를 들어, 바이러스 단리물), 균주 등으로부터의 동일한 항원 또는 상동 항원을 인식하고/하거나 그 항원에 결합하는 그들의 능력에 의해 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 교차반응성 항체 (예를 들어, 인간 항원뿐만 아니라 비-인간 동물 항원에도 결합하거나 또는 그들을 인식할 수 있는 항체)의 동정에 유용하다.
본 방법에 의하여 수득한 항체는 다양한 연구, 의학적, 치료적 (예를 들어, 수동 면역요법), 및 진단적 적용에 유용하다.
재조합 방법 및 조성물
본 발명의 방법을 사용하여 동정된 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 동정된 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자가 단리될 수 있다. 그러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 그러한 핵산을 포함하는 1종 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열과 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, (1) 또는 (2)로 형질전환된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체, 예를 들어 본원 기재의 방법을 사용하여 동정된 항체를 코딩하는 핵산은 단리된 다음 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 그러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽사리 단리 및 서열분석될 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원 기재의 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 이펙터 기능을 필요로 하지 않을 때 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] (이. 콜라이에서의 항체 단편 발현에 대하여 기재하고 있음) 참조). 발현 후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에도, 자신의 당화 경로가 "인간화"되고, 그에 따라 부분적 또는 완전 인간 당화 패턴을 지닌 항체의 생산을 가져오는 진균 및 효모 균주를 포함하여 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
당화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)TM 기술에 관하여 기재하고 있음)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 성장하도록 순응되는 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의하여 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7); 인간 태아 신장 계통 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장세포 (BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장세포 (MDCK); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A); 인간 폐세포 (W138); 인간 간세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
실시예
하기는 본 발명의 방법과 조성물의 예이다. 상기 제공된 개요가 주어지면 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다고 이해된다.
실시예 1. 형질모세포 풍부화 및 팽창
하기 실험은 SCID/베이지 마우스로 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 비장내 이식 후에 일어나는 PBMC 팽창 및 분화의 효과를 평가하기 위하여 수행되었다.
정상인 공여자로부터의 류코팩(leukopac)을 태평양 혈액센터(Blood Centers of the Pacific, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 방법론을 이용하여 류코팩으로부터 단리하였다. 6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories, 미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였으며 미국 실험동물 관리 협회 지침(American Association of Laboratory Animal Care guidelines)에 따라 제넨테크(Genentech)에 수용하고 유지시켰다. 모든 실험 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침서(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 및 준거 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨테크 실험동물 연구의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Lab Animal Research)의 승인하에 수행되었다. 건강인 공여자로부터의 류코팩 또는 혈액은 동의서가 제공되고 서부 기관윤리심의위원회(Western Institutional Review Board)로부터 윤리심사에 의한 승인이 허여된 후 입수되었다.
6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터)에 세슘-137 공급원을 사용하여 350 rad로 준치사적으로 조사하였다. 폴리믹신 B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)을 조사 후에 오는 7일 동안 식수에 첨가하였다. 조사한지 4시간 후, 각 마우스의 좌측 옆구리를 제모한 다음 베타딘(Betadine)®(퍼듀 파마(Purdue Pharma), 미국 코네티컷주 스탬포드)과 70% 알콜로 준비시켰다. 무균 외과적 절차를 이용하여 마취하에 외과적 절차를 수행하였다. 각 마우스의 늑골 경계 바로 밑에 1 cm 피부 절개를 행하고, 뒤이어 복벽 및 복막의 절개를 행하였다. 각 마우스의 비장을 신중을 기하여 노출시키고 30 ㎕ PBS에 재현탁시킨 50x106개 인간 PBMC를 주입하였다. 각각 5-O 비크릴(Vicryl)® 봉합사 (에티콘(Ethicon), 미국 뉴저지주 서머빌) 및 외과용 스테이플을 사용하여 근육층에서 및 피부에서 절개부를 봉합하였다. 마우스를 이식후 8일차에서 희생시키고, 그들의 비장을 수확하였다.
B 계통 세포를 구별하기 위하여 비장세포의 단일 세포 현탁액을 항-인간 mAb (CD38 PECy7, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산호세; 및 CD19)의 칵테일로 염색하였다.
도 1은 생체내 SCID 마우스에서의 형질모세포 분화의 결과를 도시한다. 이식전 (0일차로 표시) PBMC 또는 (인간 PBMC의 비장내 주사 후에 오는) 4, 7 및 8일차에 SCID 마우스로부터 수득한 비장세포를 항-CD19 및 항-CD38로 염색하고 분류하여 B 계통 세포를 구별하였다. 상부 원, 하부 원, 및 직사각형은 각각 형질모세포, 활성화된 배중심-유사 세포, 또는 나이브 B 세포를 나타낸다. 숫자는 %로 환산한 각 하위세트의 빈도를 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, 인간 형질모세포는 5x107개 인간 PBMC의 이식후 8일차에 총 비장세포 집단의 거의 40%로 팽창하였다.
실시예 2. 파상풍 독소-특이적 인간 형질모세포의 풍부화
헌혈 7일전 DT (디프테리아 및 파상풍 변독소) 백신을 투여받은 정상인 공여자로부터의 류코팩을 태평양 혈액센터(미국 캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 방법론을 이용하여 류코팩으로부터 단리하였다. 6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈 (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였으며 미국 실험동물 관리 협회 지침에 따라 제넨테크에 수용하고 유지시켰다. 모든 실험 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침서 및 준거 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨테크 실험동물 연구의 동물실험윤리위원회의 승인하에 수행되었다. 건강인 공여자로부터의 류코팩 또는 혈액은 동의서가 제공되고 서부 기관윤리심의위원회로부터 윤리심사에 의한 승인이 허여된 후 입수되었다.
생체내 항원-유도 형질모세포 풍부화 및 팽창은 다음과 같이 PBMC의 비장내 이식을 이용하여 수행되었다. 상기 기재된 바와 같이 수득한 단리된 PBMC를 각 1x106개 B 세포에 대하여 0.1 내지 2 ㎍으로 파상풍 변독소 (TT) (리스트 바이올로지컬 래보러토리즈, 인크.(List Biological Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 캠벨)와 재현탁시키고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다 (PBMC/항원 프리믹스). PBMC/항원 프리믹스에 이어서, PBMC를 비장내 주사 전에 부드럽게 세척하여 잉여 또는 미결합 항원을 제거하였다. 실험의 이러한 시리즈에서, 일부 PBMC는 파상풍 독소-특이적 형질모세포의 풍부화의 범위 또는 정도에 미치는 항원 프리믹스의 효과를 비교하기 위하여 비장내 주사 전에 어떠한 항원 프리믹스에도 투입하지 않았다.
6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터)에 세슘-137 공급원을 사용하여 350 rad로 준치사적으로 조사하였다. 폴리믹신 B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)을 조사 후에 오는 7일 동안 식수에 첨가하였다. 조사한지 4시간 후, 각 마우스의 좌측 옆구리를 제모한 다음 베타딘®(퍼듀 파마, 미국 코네티컷주 스탬포드)과 70% 알콜로 준비훈련시켰다. 무균 외과적 절차를 이용하여 마취하에 외과적 절차를 수행하였다. 각 마우스의 늑골 경계 바로 밑에 1 cm 피부 절개를 행하고, 뒤이어 복벽 및 복막의 절개를 행하였다. 각 마우스의 비장을 신중을 기하여 노출시키고 30 ㎕ PBS에 재현탁시킨 50x106개 인간 PBMC를 주입하였다. 각각 5-O 비크릴® 봉합사 (에티콘, 미국 뉴저지주 서머빌) 및 외과용 스테이플을 사용하여 근육층에서 및 피부에서 절개부를 봉합하였다. 항원-특이적 세포 분류 실험을 위해, 마우스를 이식후 8일차에서 참수하고, 그들의 비장을 수확하였다.
비장세포의 단일 세포 현탁액을 인간 IgG+ 형질모세포를 CD38highIgG+ 발현으로서 정의하는 항-인간 mAb (CD38 PECy7, 비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세; 및 IgG 다일라이트(Dylight), 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)의 칵테일로 염색하였다. 파상풍 변독소-반응성 형질모세포는 rTTc.PE (파상풍 독소 C-단편, 리스트 바이올로지컬 래보러토리즈, 인크., 미국 캘리포니아주 캠벨) 및 형질세포에서 발견되는 막관통 단백질인 인간 p63을 인식하는 모노클로날 마우스 항체인 VS38c-FITC (다코(Dako), 미국 캘리포니아주 카핀테리아)로 염색함으로써 동정하였다.
이어서 샘플을 아리아(Aria) 고속 세포 선별기 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)상에서 프로피디움 아이오다이드 사멸 세포 배제의 존재하에서 분석하였으며, 항-파상풍 독소-특이적 형질모세포를 5% 낮은 IgG 태아 소 혈청 (깁코(Gibco), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 보충한 50 ㎕ RPMI 세포 배양배지를 함유한 96-웰 조직 배양 플레이트에 단일 세포 방식으로 분류하였다. 5x106개 생존 세포를 모든 분석 프로파일에 대하여 기록하였다. 프로파일은 플로우조(Flowjo) 버전 9.4.11 소프트웨어로 분석하였다.
SCID/베이지 수용자의 비장내 이식시, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 고속 팽창 및 인간 형질모세포로의 분화를 위한 B-세포 활성화를 겪었다. 구체적으로, TT 항원 프리믹스에 투입되지 않은 인간 형질모세포는 5x107개 인간 PBMC의 이식후 8일차에 총 비장세포 집단의 거의 40%로 팽창하였다.
항원-특이적 형질모세포를 풍부화하기 위하여 당해 과정을 개선시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, B-세포 수용체 복합체에의 항원 결합을 통해 생존 신호를 제공하도록 파상풍-백신접종한 인간 공여자로부터의 PBMC를 비장내 주사 전에 파상풍 변독소와 인큐베이션하였다 (PBMC/항원 프리믹스). 당해 기술은 이식 전에 항원과 인큐베이션하지 않았던 세포와 비교하여 파상풍 변독소-결합 모노클로날 항체를 생산하는 형질모세포의 20배 풍부화를 가져왔다.
도 2a는 백신접종후 7일차에서 인간 공여자 항-TT+ PBMC의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2b는 비장내 이식후 8일차에서 SCID 마우스의 비장으로부터 취한 항-TT+ 세포의 대표적인 프로파일을 도시한다. 도 2c는 표지한 바와 같이 각 자극 조건하에서 개별 마우스에서의 비장당 항-TT+ 세포의 정량화를 도시한다. 시토카인 칵테일은 hSCID 마우스에 ip 주사한 인간 BAFF (50 ㎍)와 IL-2, IL-6 및 IL-21 (각각 50 ng)의 혼합물을 함유하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 검사된 모든 조건 중에서, 가장 높은 수의 항-TT+ 형질모세포는 본원 기재의 방법을 사용하는 PBMC/항원 프리믹스에서 관찰되었다. 이들 발견은 파상풍 변독소-백신접종한 공여자로부터 수득한 PBMC를 사용하는 시험관내 PBMC/항원 프리믹스가 SCID/베이지 수용자내에 파상풍 독소 항원-특이적 형질모세포의 풍부화를 가져왔음을 나타내었다.
실시예 3. A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 -특이적 인간 형질모세포의 풍부화
헌혈 7일전 계절성 인플루엔자 플루비린(Fluvirin)® 백신 (노파르티스(Novartis) Lot #111796P1)을 투여받은 정상인 공여자로부터의 류코팩을 태평양 혈액센터(미국 캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 방법론을 이용하여 류코팩으로부터 단리하였다. 6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈 (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였으며 미국 실험동물 관리 협회 지침에 따라 제넨테크에 수용하고 유지시켰다. 모든 실험 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침서 및 준거 법률 및 규정에 따라 AAALACi-인가 시설에서 제넨테크 실험동물 연구의 동물실험윤리위원회의 승인하에 수행되었다. 건강인 공여자로부터의 류코팩 또는 혈액은 동의서가 제공되고 서부 기관윤리심의위원회로부터 윤리심사에 의한 승인이 허여된 후 입수되었다.
생체내 항원-유도 형질모세포 풍부화 및 팽창은 다음과 같이 PBMC의 비장내 이식을 이용하여 수행하였다. 단리된 PBMC를 헤마글루티닌 항원 (각 1x106개 B 세포에 대하여 0.1 내지 2 ㎍)과 재현탁시키고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다 (PBMC/항원 프리믹스). 당해 인큐베이션에 이어서, PBMC를 세척하여 미결합 항원을 제거하였다. 교차반응성 헤마글루티닌 항체를 생산한 형질모세포를 풍부화하기 위하여, PBMC/항원 프리믹스 및 단일 세포 분류를 위해 사용된 헤마글루티닌 항원 변이체는 인플루엔자 플루비린® 백신 안에 함유된 헤마글루티닌 항원 변이체와 다르도록 특이적으로 선택되었다. 당해 연구에 사용된 헤마글루티닌 항원은 따라서 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/NWS/1933으로부터의 H1 헤마글루티닌 (군1 A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌), A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/홍콩/8/1968로부터의 H3 헤마글루티닌 (군2 A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌), 및 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/네덜란드/219/2003으로부터의 H7 헤마글루티닌 (군2 A형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌)을 포함하였다. 헤마글루티닌 항원은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제넨테크에서 생산하였다.
6 내지 8주령 암컷 SCID/베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 홀리스터)에 세슘-137 공급원을 사용하여 350 rad로 준치사적으로 조사하였다. 폴리믹신 B (110 mg/L) 및 네오마이신 (1.1 g/L)을 조사 후에 오는 7일 동안 식수에 첨가하였다. 조사한지 4시간 후, 각 마우스의 좌측 옆구리를 제모한 다음 베타딘®(퍼듀 파마, 미국 코네티컷주 스탬포드)과 70% 알콜로 준비훈련시켰다. 무균 외과적 절차를 이용하여 마취하에 외과적 절차를 수행하였다. 각 마우스의 늑골 경계 바로 밑에 1 cm 피부 절개를 행하고, 뒤이어 복벽 및 복막의 절개를 행하였다. 각 마우스의 비장을 신중을 기하여 노출시키고 30 ㎕ PBS에 재현탁시킨 50x106개 인간 PBMC를 주입하였다. 각각 5-O 비크릴® 봉합사 (에티콘, 미국 뉴저지주 서머빌) 및 외과용 스테이플을 사용하여 근육층에서 및 피부에서 절개부를 봉합하였다. 항원-특이적 세포 분류 실험을 위해, 마우스를 이식후 8일차에서 참수하고, 그들의 비장을 수확하였다.
마우스로부터 수득한 비장세포의 단일 세포 현탁액을 인간 IgG+ 형질모세포를 CD38high/IgG+ 발현으로서 정의하는 항-인간 모노클로날 항체 CD38 PECy7 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)과 IgG 다일라이트 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크., 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)의 칵테일로 염색하였다. 단리된 비장세포의 현탁액내 헤마글루티닌-교차반응성 형질모세포를 동정하기 위하여, 라이트닝-링크(Lightning-Link)® 표지 키트 (이노바 바이오사이언시스(Innova Biosciences), 영국 캠브리지)를 사용하여 각각 FITC 또는 PE와 사전에 접합시켜 놓은 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/NWS/1933으로부터의 헤마글루티닌 H1 및 A형 인플루엔자 바이러스 단리물 A/홍콩/8/1968로부터의 헤마글루티닌 H3으로 세포를 염색하였다.
도 3a는 SCID/베이지 마우스 풍부화 전 (즉, PBMC/항원 프리믹스 전) 7일차 후-백신접종 PBMC로부터의 항-헤마글루티닌-양성 (H3 및 H1) 형질모세포의 대표적인 FACS 분석을 도시한다. 도 3b는 각각 상부 및 하부 패널에서 프리믹스-무함유와 항원 프리믹스를 비교하는, SCID/베이지 마우스 풍부화 후 8일차 후-이식으로부터의 헤마글루티닌-양성 (H3 및 H1) 형질모세포의 대표적인 FACS 데이터 분석을 도시한다. 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이, 비장내 이식전 PBMC/항원 프리믹스는 H3+/H1+ 항-헤마글루티닌-반응성 형질모세포의 보다 높은 빈도를 가져왔다.
하기 표 1은 본원 기재의 SCID 풍부화 전후의 항-H1+/항-H3+ 형질모세포 빈도의 비교를 도시한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 항-H1+/항-H3+ 형질모세포의 빈도는 SCID/베이지 마우스 풍부화 없이 관찰된 것과 비교하여 본 발명의 SCID/베이지 마우스 풍부화 방법을 사용하여 대폭 증가되었다.
이어서 샘플을 아리아 고속 세포 선별기 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)상에서 프로피디움 아이오다이드 사멸 세포 배제의 존재하에서 분석하였으며, 항-헤마글루티닌-특이적 형질모세포를 5% 낮은 IgG 태아 소 혈청 (깁코, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 보충한 50 ㎕ RPMI 세포 배양배지를 함유한 96-웰 조직 배양 플레이트에 단일 세포 방식으로 분류하였다. 5x106개 생존 세포를 모든 분석 프로파일에 대하여 기록하였다. 프로파일은 플로우조 버전 9.4.11 소프트웨어로 분석하였다.
도 4는 프리믹스-무함유 (원)와 항원-프리믹스 (사각형)를 비교하는, 확률(stochastic) 반응을 나타내는 개별 SCID/베이지 마우스로부터의 8일차 후-이식으로부터 수득한 비장세포의 분석을 도시한다. 데이터는 %항-H1+/CD38high 형질모세포로서 제시된다. 직사각형은 항-H1+ 형질모세포를 제시한 마우스를 나타낸다.
이들 결과는 A형 인플루엔자 바이러스 군1 (예를 들어, H1) 및 군2 (예를 들어, H3, H7) 헤마글루티닌 항원을 비장내 이식 전에 PBMC와 인큐베이션하였을 경우 광범위 헤마글루티닌-교차반응성 형질모세포가 검출되었음을 보여주었다. 이들 결과는 인플루엔자-백신접종한 공여자로부터의 헤마글루티닌 항원-프라이밍 PBMC의 시험관내 자극이 SCID/베이지 마우스 수용자 안에서 형질모세포의 헤마글루티닌 항원-특이적 풍부화를 촉진하였음을 추가로 나타내었다.
실시예
4. 단일
형질모세포로부터의
IgG
클로닝
헤마글루티닌 H1 및 H3 교차반응성 인간 형질모세포 (상기 기재)를 단일-세포 분류하였으며, 그에 따라 대략 950개의 형질모세포가 도출되었다. 단일 형질모세포는 5% 낮은 IgG 태아 소 혈청을 함유하는 50 ㎕ RPMI가 들어있는 U자형 바닥 96-웰 마이크로웰 플레이트에 직접 분류하였다. 플레이트를 5분 동안 600 x g로 원심분리시켰고 (베크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 브레아), 배지를 조심스럽게 흡인 제거하였다. 동일한 절차 후에 세포를 재현탁시키고 90 ㎕의 PBS에서 2회 세척하였다.
가변 중쇄와 경쇄를 코딩하는 cDNA를 생성하기 위하여, 2 유닛 RNaseout (인비트로젠(Invitrogen), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 0.5 mM 4dNTP (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 월탐), 1.5 mM MgCl2, 37.5 mM KCl, 10 mM DTT (디티오트레이톨), 0.25% 노니뎃(Nonidet) P40 (유에스 바이올로지컬(US Biological), 미국 매사추세츠주 마블헤드), 0.1 mg/ml 소 혈청 알부민 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 25 mM 트리스(Tris) pH 8.3, 0.25 pmol의 IgG1 -4 불변, 카파 쇄 불변, 및 람다 쇄 불변 영역 특이적 올리고뉴클레오티드 (아래에 나타냄) 및 40 U 슈퍼스크립트(Superscript) III (인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 함유하는 6 ㎕의 역전사효소 (RT) 반응 혼합물에 각각의 세포를 재현탁시켰다.
반응을 3 x 30분 간격 동안 각각 45℃, 50℃ 및 55℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서, 반응 혼합물을 TE 완충제 (10 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA)로 15 ㎕가 되도록 희석하였다. 상기로부터의 희석된 RT 칵테일 2 ㎕와 어드밴티지(Advantage)-GC 2 폴리머라제 믹스 (클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 초기 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 IgG 중쇄, 카파 쇄 및 람다 쇄를 증폭시켰다. 아래에 나타낸 가변 중쇄 및 경쇄 배선 및 불변 영역 서열에 기초하여 축중성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다.
중쇄 및 경쇄 PCR 증폭 반응은 다음과 같이 두 반응으로 각각 나누었다: 중쇄 패밀리 VH.1,2,3 (프라이머 IGVH1a, IGVH1b, IGVH2, IGVH3) 및 VH.4,5,6,7 (프라이머 IGVH4, IGVH5, IGVH6 및 IGVH7); 카파 쇄 패밀리 VK.1,2,3 (프라이머 IGKV1, IGKV2 및 IGKV3) 및 VK.4,5,6 (프라이머 IGVK4, IGVK5 및 IGVK6); 및 람다 쇄 패밀리 VL.1,2,3,4,5 (IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4 및 IGLV5) 및 VL.6,7,8,9 (프라이머 IGLV6, IGLV7, IGLV8 및 IGLV9). 온도 사이클링을 위해 터치다운 PCR 증폭 프로토콜이 사용되었다.
반응에 이어서, PCR 증폭 생성물을 엑소뉴클레아제1 (Exo)과 새우 알칼리성 포스파타제 (SAP)로 처리하여 PCR 증폭 반응의 각각으로부터 잉여 뉴클레오티드와 프라이머를 제거하였다 (유.에스. 바이올로지컬스(U.S. Biologicals), 미국 매사추세츠주 마블헤드). 생어(Sanger) 서열분석을 이용하여 초기 PCR 증폭 생성물을 직접 서열분석하여 중쇄와 경쇄 둘 다의 가변 서열을 결정하였다. 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 포유동물 신호 및 불변 영역 클로닝 서열을 삽입하기 위하여 배선-매칭 중쇄 및 경쇄 가변 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제2 네스팅 PCR 증폭을 수행하였다.
제조업체의 권장에 따라 프라임스타(PrimeStar) HS DNA 폴리머라제와 GC (다카라 바이오(Takara Bio), 일본 시가)를 사용하여 PCR 증폭 반응을 셋업하였다. PCR 증폭 반응에 이어서, 증폭 생성물을 상기 기재된 바와 같은 Exo/SAP로 처리하였다. 무제한 엔도뉴클레아제 절차를 이용하여 PCR 증폭 생성물을 코딩하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포유동물 발현 벡터에 삽입하였다. 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발 프로토콜을 이용하여 20 ㎕의 PCR 증폭 생성물을 IgG1, 카파 및 람다 쇄에 대한 단일 가닥 DNA 인간 주형에 어닐링하였다. (문헌 [Kunkel (1985) PNAS 82:488-492] 참조). DNA 서열분석에 의하여 정확히 삽입된 구축물을 확인하였다. 중쇄와 경쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드를 일시적인 발현을 위해 퓨진(Fugene) 형질감염 시약 (로슈 디아그노스틱(Roche Diagnostic), 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 사용하여 293T 인간 배아 신장세포로 공-형질감염시키고, 실시예 5에 이하에서 기재한 바와 같이 발현 및 결합에 대하여 분석하였다.
실시예 5. 헤마글루티닌 ELISA 스크리닝 검정
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 각 모노클로날 항-헤마글루티닌 항체의 다양한 헤마글루티닌 하위유형에의 결합능을 다음과 같이 ELISA에 의하여 검사하였다. 다양한 헤마글루티닌-발현 플라스미드를 상기 기재된 바와 같이 293T 세포에 형질감염시켰다. 이들은 H1N1/사우스 캐롤라이나/1918로부터의 헤마글루티닌 H1, H3N2/퍼스/2009로부터의 헤마글루티닌 H3, H5N1/Viet/2004로부터의 헤마글루티닌 H5, 및 H7N7/네덜란드/2003 A형 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌 H7을 포함하였다. 2일 후, 세포를 50 mM 트리스, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% 트리톤(Triton) X-100 + 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)에 용해시켰다. 핵을 원심분리에 의하여 정화된 다음 생성되는 용해물을 -80℃에서 저장하였다.
ELISA 스크리닝을 위하여, 384-웰 플레이트 (눈크 맥시소르프(Nunc MaxiSorp))를 PBS중 5 ㎍/ml 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis) 렉틴 (시그마)으로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 이어서 다양한 발현된 헤마글루티닌을 함유하는 세포 용해물의 희석액으로 코팅하였다. 플레이트를 세척한 다음 항-헤마글루티닌 항체의 다양한 희석액과 그리고 후속하여 염소-항-인간-HRP 2차 항체 (잭슨)와 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 검출을 위해 프로세싱하였다.
실시예 2에 상기 기재된 단일-세포 분류로부터 대략 950개의 형질모세포를 수득하였다. 이중에서 840개의 모노클로날 항체를 293T 세포에서 일시적으로 발현시키고 H1, H3, H5 및 H7 헤마글루티닌 하위유형에의 결합에 대하여 ELISA에 의하여 스크리닝하였으며, 그에 따라 A형 인플루엔자 바이러스 군1 또는 군2 헤마글루티닌에 결합한 82개의 모노클로날 항체, 및 A형 인플루엔자 바이러스 군1 및 군2 헤마글루티닌 둘 다에 결합한 20개의 모노클로날 항체가 도출되었다.
실시예 6. 시험관내 A형 인플루엔자 바이러스 중화
본 발명의 방법을 사용하여 동정된 항-헤마글루티닌 항체의 시험관내에서 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 단리물의 패널의 광범위한 헤마글루티닌 하위유형 결합 및 중화 도출능을 다음과 같이 검사하였다.
MDCK 세포를 10% FBS로 보충한 DMEM 배지중에 단일 25% 융합성(confluent) 단층으로서 투명한 바닥 영상화 플레이트를 갖춘 96-웰 블랙 (코스타(Costar) 3904)에서 성장시켰다. 각각의 A형 인플루엔자 바이러스 하위유형/균주를 인플루엔자 배지 (DMEM + 0.2% BSA, 2 ㎍/ml TPCK-처리 트립신)에 1의 MOI가 되게 희석한 다음 1시간 동안 37℃에서 다양한 농도 (0.02 nM 내지 1,600 nM 범위)의 각 항체와 인큐베이션하였다. 차가운 100% 에탄올로의 세포 고정 전에 5% CO2 인큐베이터중 37℃에서 16시간 동안 각각의 항체/인플루엔자 바이러스 혼합물이 MDCK 세포를 감염시키도록 하였다. 이어서 고정된 세포를 훽스트(Hoechst) 33342 (인비트로젠, Cat# H3570)로 염색하여 세포핵을 가시화하고 총 세포수를 측정하였다. 세포를 또한 A형 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 특이적인 광범위하게 반응성인 모노클로날 항체 (밀리포어(Millipore) Cat# MAB8258)로 염색하여 감염된 세포의 수를 측정하였다.
세포를 이미지 익스프레스 마이크로(Image Express Micro, 몰리큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 영상화하고, 데이터 영상을 메타엑스프레스(MetaXpress) 3.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 감염된 세포의 %를 측정하여 Y-축 상에 플롯팅하고 그와 대비하여 Log 10 항체 농도를 X-축 상에 플롯팅하였다. 모든 중화 검정은 삼중으로 완료하였다. 비-선형 회귀 용량-반응 곡선을 이용하여 데이터를 맞추고, 도 5에 IC50 값 (nM)으로서 95% 신뢰 구간 (95% CI)으로 제시하였다.
각 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌 (HA) 하위유형을 도 5에 제공하였다.
A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 광역 패널에 대하여 본원 기재 모노클로날 항체의 다양한 농도를 사용하여 시험관내 중화 용량-반응 곡선을 생성하였다. 도 6a 및 6b는 각각 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 패널에 대한 mAb 39.29의 중화 곡선을 도시한다. 도 6a 및 6b에 도시된 바와 같이, mAb 39.29는 시험된 모든 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 시험관내 중화에 효과적이었다. 부가적으로, 도 7a 및 7b는 각각 A형 인플루엔자 군1 및 군2 바이러스 균주의 패널에 대한 mAb 81.39의 중화 곡선을 도시한다. 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이, mAb 81.39는 시험된 모든 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 시험관내 중화에 효과적이었다.
이들 결과는 본 발명의 방법을 사용하여 동정된 항-헤마글루티닌 항체가 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 중화 활성을 나타내었음을 보여주었다. 구체적으로, 2종의 항-헤마글루티닌 항체 (mAb 39.29 및 mAb 81.39)가 군1 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/CA/7/2009, A/브리스반/59/2007, A/솔로몬/3/2006, A/뉴 칼도니아 (칼레도니아?)/20/1999, A/PR/8/1934, 및 A/일본/305/1957)와 군2 A형 인플루엔자 바이러스 균주 (A/빅토리아/361/2011, A/퍼스/16/2009, A/브리스반/10/2007, A/위스콘신/67/2005, A/빅토리아/3/1975, A/포트 챌머스/1/1973, A/HK/8/1968, 및 A/아이치(Aichi)/2/1968) 둘 다의 중화를 포함하여 검사된 모든 A형 인플루엔자 바이러스 균주의 중화에 효과적이었다.
종합하면, 이들 결과는 본 발명의 항원-특이적 형질모세포 풍부화 방법론을 사용함으로써 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 (즉, 다양한 헤마글루티닌 하위유형에 대한 특이성을 갖는) 모노클로날 항체의 동정을 가져왔음을 보여주었다. 부가적으로, 이들 결과는 본원 기재의 형질모세포 풍부화 방법론이 불과 950개의 단리된 형질모세포로부터 군1 및 군2 A형 인플루엔자 바이러스 균주 둘 다를 중화할 수 있는 모노클로날 항체의 동정을 가져왔음을 보여주었다.
실시예
7. 마우스에서
mAb
39.
29의 생체내
효능
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항-헤마글루티닌 항체를 추가 특성해석하였다. 마우스에서 A형 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 mAb 39.29 (mAb 39.29 NC v1)의 생체내 효능은 다음과 같이 수행되었다. DBA/2J 마우스 (잭슨 랩(Jackson Lab), 미국 메인주 바 하버)를 인플루엔자 배지 (DMEM, 0.2% BSA, 2 ㎍/mL TPCK-처리 트립신)에 희석한 50 ㎕의 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 균주로 최소 LD100 용량으로 비내 감염시켰다. 다음의 것들을 포함하여 광범위한 시험관내 IC50 값을 보이는 4종의 상이한 A형 인플루엔자 바이러스 균주를 당해 시리즈의 실험에 사용하였다: H1N1 A/PR/8/1934 (제넨테크; IC50 2.0 nM), 마우스당 40 PFU로 사용; H3N2 A/홍콩/1/1968 (비라퍼(ViraPur), 미국 캘리포니아주 샌디에고; IC50 45.1 nM), 마우스당 3 PFU로 사용; H3N2 A/포트 챌머스/1/1973 (비라퍼, 미국 캘리포니아주 샌디에고; IC50 2.2 nM), 마우스당 1.5x104개 PFU로 사용; 및 H3N2 A/아이치/2/1968 (비라퍼, 미국 캘리포니아주 샌디에고; IC50 35 nM), 마우스당 2x102개 PFU로 사용. mAb 39.29의 정맥내 투여 전에 72시간 동안 인플루엔자 바이러스 감염이 진행하도록 하였다.
A형 인플루엔자 바이러스 감염후 72 시간 후, 다양한 양의 mAb 39.29를 200 ㎕ PBS 중 900 ㎍/마우스 (대략 45 mg/kg), 300 ㎍/마우스 (대략 15 mg/kg), 및 100 ㎍/마우스 (대략 5 mg/kg)의 용량으로 마우스에 정맥내 투여하였다. 대조군-처리 동물에는 mAb gD5237 (단순 포진 바이러스 (HSV)의 당단백질 D에 특이적인 모노클로날 항체)을 mAb 39.29의 가장 높은 시험된 등가 용량 (즉, 대략 45 mg/kg)으로 투여하였다. 마우스를 신체 상태조절 및 생존에 대하여 매일 모니터링하였으며, 또한 감염 후 21일까지 매일 체중을 측정하였다. 모든 4가지 A형 인플루엔자 바이러스 균주 감염에서의 모든 mAb39.29 용량 대 대조군은 P<0.01의 Log-랭크 시험을 부여하였다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 각각 A형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/1934, A/포트 챌머스/1/1973, A/홍콩/1/1968 및 A/아이치/2/1968로의 감염 72시간 후 다양한 양의 mAb 39.29를 투여한 마우스의 %생존 (시간경과에 따른, 일수로 표시)을 도시한다. 도 8a, 8b, 8c 및 8d에 도시된 바와 같이, 대조군 항체를 투여한 감염된 마우스에서는 14일차에 가서 100% 폐사율이 관찰되었다. 그러나, 본 발명의 모노클로날 항체를 투여한 감염된 마우스는 증가된 생존을 나타내었다. 특히, 인플루엔자 바이러스 A/포트 챌머스/1/1973 또는 인플루엔자 바이러스 A/아이치/2/1968로 감염시킨 마우스에서는 시험된 39.29의 모든 용량에서 100% 생존이 관찰되었다. (도 8b 및 8d 참조).
이들 결과는 본 발명의 방법에 따라 수득한 모노클로날 항체가 다양한 A형 인플루엔자 바이러스 하위유형 감염의 치료에 효과적임을 보여주었다.
비록 상기 기재된 발명이 명확을 기하고 이해를 위한 목적상 실례로서 다소 상세하게 기재되었지만, 상세한 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 그 전문이 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> GENENTECH, INC. ET AL.
<120> ENRICHMENT OF ANTIGEN-SPECIFIC PLASMABLASTS
<130> P5500R1-WO
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tcctatgagc tgacwcagsh vccckc 26
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aattttatgc tgactcagcc ccac 24
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cttgragctc ctcagaggag 20
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacag 65
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cagagg 66
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacaggtgca gctgcagg 78
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
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cagacatcca gatgacccag tctccatcct ccctg 95
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cagatattgt gatgactcag tctcactctc cctgc 95
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
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<213> Artificial Sequence
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacagtctgc cctgactcag cct 83
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<213> Artificial Sequence
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
catcctatga gctgacwcag shvccckc 88
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ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
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<400> 48
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacagcctgt gctgactcag ccaacttc 88
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<400> 49
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
caaattttat gctgactcag ccccac 86
<210> 50
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<213> Artificial Sequence
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<400> 50
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacaggctgt ggtgactcag gagccc 86
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<213> Artificial Sequence
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primer"
<400> 51
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacagactgt ggtgacccag gagcc 85
<210> 52
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<212> DNA
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<400> 52
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cacagcctgt gctgactcag ccacc 85
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
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<400> 53
gccaggggga agaccgatg 19
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<400> 54
ctgggataga agttattcag caggcacaca acagaagcag ttccagattt caactgctc 59
Claims (19)
- 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계;
PBMC를 항원 또는 그의 단편 또는 부분과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계; 및
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 형질모세포에 대해 풍부화된 형질모세포 집단을 수득하는 방법. - 제1항에 있어서, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 PBMC/항원 프리믹스로부터 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 공여자가 항원 또는 그의 단편 또는 부분에 이전에 노출된 공여자인 방법.
- 제1항에 있어서, 형질모세포의 단일-세포 분류를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝을 추가로 포함하는 방법.
- 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계;
PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계; 및
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하여, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 단계
를 포함하는, 항원-특이적 형질모세포를 풍부화하는 방법. - 제7항에 있어서, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 PBMC/항원 프리믹스로부터 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 공여자가 항원 또는 그의 단편 또는 부분에 이전에 노출된 공여자인 방법.
- 제7항에 있어서, 형질모세포의 단일-세포 분류를 추가로 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 형질모세포의 항원-특이적 단일-세포 분류를 추가로 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝을 추가로 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, PBMC를 2종 이상의 상이한 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계;
PBMC를 적어도 1종의 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계; 및
단리된 형질모세포의 항원-특이적 세포를 분류하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 단계
를 포함하는, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 방법. - 제14항에 있어서, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 PBMC/항원 프리믹스로부터 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝을 추가로 포함하는 방법.
- 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계;
PBMC를 2종 이상의 상이한 항원과 접촉시켜 PBMC/항원 프리믹스를 수득하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하는 단계;
면역손상 동물의 비장으로부터 형질모세포를 단리하는 단계; 및
단리된 형질모세포의 항원-특이적 세포를 분류하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 단계
를 포함하는, 1종 초과의 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 형질모세포를 동정하는 방법. - 제17항에 있어서, 면역손상 동물의 비장으로 PBMC를 전달하기 전에 PBMC를 세척하여 PBMC/항원 프리믹스로부터 잉여 또는 미결합 항원을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 단리된 형질모세포로부터의 이뮤노글로불린 클로닝을 추가로 포함하는 방법.
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