TW201925233A - 抗體、用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物以及在樣品中偵測或捕捉多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的在於提供一種抗體、一種用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物、以及一種在樣品中偵測或捕捉多肽的方法。本揭露提供一種抗體、一種用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物、以及一種在樣品中偵測或捕捉多肽的方法。

Description

抗體、用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物以及在樣品中偵測或捕捉多肽的方法
本揭露是關於抗體、用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物、以及在樣品中偵測或捕捉多肽的方法。
雜交瘤(hybridoma)技術使單株抗體的生產得以實現，此種單株抗體技術於許多科學領域中具有廣泛的應用(非專利文獻1)，於此項技術實現之後，進一步地投注心力於治療性抗體及診斷性抗體的領域。從美國首次許可單株抗體治療以來已歷經30年(非專利文獻2)。美國食品藥物管理局(FDA)已許可了30多種抗體，且大量的候選藥物(candidates)正在進行臨床及臨床前評估。到目前為止，單株抗體仍然為標準治療分子，且使用於各種疾病領域，例如，癌症、自體免疫疾病、呼吸系統疾病、傳染疾病及神經疾病(非專利文獻3)。
為了增加治療性抗體的價值，已確立許多不同類型的工程化Fc修飾(engineered Fc modifications)以改善功能，例如，用於抗體依賴性細胞調節的細胞毒性加強、補體依賴性細胞毒性加強、抗體半衰期延長、抗原清除調節及重鏈異二聚體化(heterodimerization)促進的修飾(非專利文獻4)。
於治療性單株抗體生產的過程期間，抗體分子的異質性(heterogeneity)可能造成實現一致性的製造及品質控制上的潛在困難(非專利文獻5)。重組單株抗體的重鏈C末端異質性，包括野生型重鏈、C末端離胺酸缺失的重鏈(稱為“delta-K”)、以及以醯胺化的(amidated)脯胺酸結束的重鏈(稱為“delta-GK-醯胺(delta-GK-amide))，為先前報導的一種例子(非專利文獻6)。有趣的是，此種切割現象與內源性(endogenous)抗體Fc的修飾相似。一般而言，內源性抗體的重鏈C末端的離氨酸於體內(in vivo)會被內源性羧肽酶(carboxypeptidase)切割。亦已有報導指出C末端甘胺酸裂解以及脯胺酸醯胺化的進一步修飾，這是因為肽基甘胺酸α-醯胺化單加氧酶(peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase，PAM)將C末端甘胺酸裂解並將脯胺酸醯胺化。
為了克服此C末端異質性問題，科學家已成功鑑定出關鍵殘基並工程設計抗體Fc，其中將C末端離胺酸(K)(EU編號系統中的第447位)及甘胺酸(G)(EU編號系統中的第446位)從Fc區中基因地(genetically)刪除(稱為“delta-GK”)(專利文獻1)。
已有報導指出特異性地結合工程化Fc區但不結合野生型Fc的抗體(非專利文獻7；專利文獻2)，其已證實針對工程化Fc區的抗體於各種用途相當有用。
[文獻表][專利文獻]
[專利文獻1] WO2009041613A1；
[專利文獻2] WO2017072210A1。
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Kohler, G. et al., Nature 256:495-497 (1975)；
[非專利文獻2] Reichert, J. M. et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9:423-430 (2008)；
[非專利文獻3] Lagasse HAD et al. F1000Research 2017, 6 (F1000 Faculty Rev):113；
[非專利文獻4] Mimoto et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 17:1298-1314 (2016)；
[非專利文獻5] Liu, H. et al., J. Pharm. Sci. 97: 2426-2447 (2008)
[非專利文獻6] K. A. Johnson et al., Anal. Biochem. 360:75-83 (2007)；
[非專利文獻7] Yu et al., Antimicrob Agents Chemother. 61 (2016)。
本揭露已提供一些包括經修飾的IgG重鏈恆定區的抗體，其源自人類IgG重鏈恆定區，且缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，且其中保留(remain)根據EU編號系統第445位的胺基酸，此種經修飾的IgG重鏈恆定區中的一組修飾於本文中稱為“IgG delta-GK”，且包括具有IgG delta-GK的經修飾的IgG重鏈恆定區的抗體包含，例如，satralizumab、nemolizumab、emicizumab、SKY59、AMY109及GYM329。本揭露提供特異性地結合、偵測及捕捉於經修飾的IgG重鏈恆定區中的此種delta-GK(δ-GK)的抗體、包含此種抗體的組成物、以及使用此種抗體的方法。
具體而言，本揭露是關於：
[1] 一種抗體，其與第一經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合，第一經修飾的IgG重鏈恆定區源自人類IgG重鏈恆定區，其中第一經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第一經修飾的IgG重鏈恆定區中。
[2] 如[1]所述之抗體，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸於第一經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的(amidated)。
[3] 如[2]所述之抗體，其與第二經修飾的IgG重鏈恆定區實質上不結合，第二經修飾的IgG重鏈恆定區源自人類IgG重鏈恆定區，其中第二經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第二經修飾的IgG重鏈恆定區中，且為經醯胺化的。
[4] 如[1]至[3]任一項所述之抗體，其與下列(i)或(ii)實質上不結合：
(i) 源自人類IgG重鏈恆定區的第三經修飾的IgG重鏈恆定區，或未經修飾的人類IgG重鏈恆定區，其中根據EU編號系統第445位、第446位及第447位的胺基酸保留於第三經修飾的IgG重鏈恆定區或未經修飾的人類IgG重鏈恆定區中；以及
(ii) 源自人類IgG重鏈恆定區的第四經修飾的IgG重鏈恆定區，其中第四經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位及第446位的胺基酸保留於第四經修飾的IgG重鏈恆定區中。
[5] 如[3]所述之抗體，其中抗體對第二經修飾的IgG重鏈恆定區的結合活性低於酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunoassay，ELISA)的偵測極限。
[6] 如[4]所述之抗體，其中抗體對擇自於第三經修飾的IgG重鏈恆定區、第四經修飾的IgG重鏈恆定區、及未經修飾的人類IgG重鏈恆定區所組成的群組的至少一IgG重鏈恆定區的結合活性低於酵素免疫吸附法的偵測極限。
[7] 如[1]至[6]任一項所述之抗體，其中抗體對第一經修飾的IgG重鏈恆定區的結合活性於酵素免疫吸附法中為可偵測的(detectable)。
[8] 如[1]至[7]任一項所述之抗體，其中抗體與包括下列所述者的抗體競爭結合第一經修飾的IgG重鏈恆定區，
(a) 包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；
(b) 包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；
(c) 包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3；
(d) 包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；
(e) 包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及
(f) 包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
[9] 如[1]至[8]任一項所述之抗體，其中抗體與包括下列所述者的抗體結合至相同的抗原決定基(epitope)，
(a) 包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；
(b) 包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；
(c) 包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3；
(d) 包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；
(e) 包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及
(f) 包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
[10] 一種用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物，其中組成物包括如[1]至[9]任一項所述之抗體，且多肽包括第五經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，其中第五經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第五經修飾的IgG重鏈恆定區中。
[11] 如[10]所述之組成物，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸於第五經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
[12] 一種用於在樣品中偵測或捕捉多肽的方法，其中方法包括將[1]至[8]任一項所述之抗體與樣品接觸，且多肽包括第六經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，其中第六經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第六經修飾的IgG重鏈恆定區中。
[13] 如[12]所述之方法，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸於第六經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
I.定義
“親和性(affinity)”指的是分子(例如，抗體)的單一結合部位與其結合配偶體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總計強度。除非另有說明，於本文中所使用的“結合親和性”或“結合活性”指的是內在的結合親和性，其反映結合對(例如，抗體及抗原)的成員之間的1:1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和性一般可藉由解離常數(dissociation constant，Kd)來表示。親和性可藉由本技術領域公知的方法進行測量，包含本文中描述的那些。用於測量結合親和性之具體說明及示例性實施例將於下文中描述。
用語“與源自人類IgG重鏈恆定區之經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合的抗體”指的是能夠以足夠的親和性與特定類型的經修飾的IgG重鏈恆定區結合的抗體，使得所述抗體可於標靶經修飾的IgG重鏈恆定區中作為檢測、捕捉或診斷劑。在一實施例中，對於與源自人類IgG重鏈恆定區之第一經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合的抗體而言，抗體對除了第一經修飾的IgG重鏈恆定區以外之IgG重鏈恆定區(例如，第二、第三、及第四經修飾的IgG重鏈恆定區以及未經修飾的人類IgG重鏈恆定區)的結合程度，即其與第一經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合的結合程度，經測量小於第一經修飾的IgG重鏈恆定區的結合的約10%，例如，藉由放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)測量。在某些實施例中，與源自人類IgG重鏈恆定區之經修飾的IgG重鏈恆定區結合的抗體具有1micro M或更小、100 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.1 nM或更小、0.01 nM或更小、或0.001 nM或更小的解離常數(dissociation constant，Kd)(例如，10-8 M或更小，例如，10-8 M至10-13 M，例如，10-9 M至10-13 M)。在某些實施例中，與源自人類IgG重鏈恆定區之經修飾的IgG重鏈恆定區結合的抗體與經修飾的IgG重鏈恆定區的抗原決定基結合。
用語“抗體”於本文中以最廣泛的含義使用並涵蓋多種抗體結構，包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要它們展現期望的抗原結合活性。
抗體的“種類(class)”指的是它的重鏈所具有的恆定域(constant domain)或恆定區(constant region)的類型。存在五種主要種類的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，這些種類中的數種可進一步分類為次類(subclass)(同型(isotype))，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類的免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)及μ(mu)。
於本文中使用的用語“單株抗體”指的是從實質上同源的(homogeneous)抗體的族群獲得的抗體，亦即，包括相同的族群及/或結合至相同抗原決定基的單獨抗體，除了例如包含自然存在的突變或在產生單株抗體製備期間出現之可能的變異體抗體(這類變異體通常以較小量存在)以外。不同於通常包含針對不同決定位(determinant)(抗原決定基)的不同抗體之多株抗體的製備，單株抗體製備的每一單株抗體是針對抗原上的單一決定位。因此，修飾詞“單株”指的是從實質上同源的抗體族群獲得的抗體特徵，而不解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本揭露使用的單株抗體可藉由各種技術進行製備，其包含但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示(phage-display)方法、以及利用包含全部或部分的人類免疫球蛋白基因座(loci)的基因轉殖動物的方法，這類方法以及於文中描述之其它用以製造單株抗體的示例性方法。
用語“Fc區”於本文中是用以定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域，其包含至少一部分的恆定區。此用語包含自然序列Fc區及變異體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區域從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端。除非本文另有說明，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
用語“可變區”或“可變域”指的是涉及結合抗體至抗原的抗體重鏈或輕鏈的結構域(domain)。自然抗體的重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH以及VL)通常具有相似的結構，每一結構域包括四個保守的框架區(framework region，FR)及三個高度變異區(hypervariable region，HVR)(請參照，例如，Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007))。單一VH或VL域可能足以賦予抗原結合的特異性。此外，與特定抗原結合的抗體，可使用來自與所述抗原結合之抗體的VH或VL域以分別篩選互補的VL或VH域的資料庫進行分離，請參照，例如，Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)。
“框架”或“FR”指的是高度變異區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域的FR一般由四個FR域所組成：FRl、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般依照以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
用語“高度變異區”或“HVR”於本文中指的是抗體可變域在序列上高度變異(“互補決定區”或“CDR”)、及/或形成結構上定義的環(“高度變異環(hypervariable loop)”)、及/或包含抗原接觸殘基(“抗原接觸”)的各區域。一般而言，抗體包括六個HVR：三個於VH中(H1、H2、H3)，三個於VL中(L1、L2、L3)。本文中示例性的HVR包含：
(a) 出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(Hl)、53-55(H2)以及96-101(H3)的高度變異環(Chothia，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) 出現於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)的CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) 出現於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)以及93-101(H3)的抗原接觸(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；以及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)以及94-102(H3)。
相對於參考多肽序列(reference polypeptide sequence)的“百分比(%)胺基酸序列相同性”定義為，在比對序列及在必要時引入缺口(gap)以達到最大的百分比序列相同性之後，且不將任何保守取代視為序列相同性的部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可使用本技術領域內的各種方式達到以測定百分比胺基酸序列相同性為目的之比對，例如，使用公開可取得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體或GENETYX(註冊商標)(Genetyx Co., Ltd.)。本技術領域之人員可決定用於比對序列的適當參數，包含在所比較的序列的全長內達到最大比對所需的任一演算法。
ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫，且原始程式碼已隨用戶文件提交美國版權辦公室，Washington D.C., 20559，它在美國版權辦公室註冊在美國版權註冊號TXU510087之下。ALIGN-2程式可於Genentech, Inc., South San Francisco, California公開取得，或者可從原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用在UNIX作業系統上，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變動。在利用ALIGN-2以進行胺基酸序列比較的情況下，給定的胺基酸序列A比上、與或相對給定的胺基酸序列B的%胺基酸序列相同性(或者其可表達為給定的胺基酸序列A，其比上、與或相對給定的胺基酸序列B具有或包括特定%胺基酸序列相同性)以下列方式計算：
100乘以分數X/Y，
其中X為在所述程式的A及B的比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評分為相同匹配(match)的胺基酸殘基數目，以及其中Y為B中的胺基酸殘基的總數。應理解的是，在胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時，A比上B的%胺基酸序列相同性將不等於B比上A的%胺基酸序列相同性。除非具體地另外說明，本文中使用的所有%胺基酸序列相同性值均為如前述段落中所述，利用ALIGN-2電腦程式所取得。
與參考抗體“結合相同抗原決定基的抗體”指的是在競爭分析(competition assay)中，將參考抗體與其抗原的結合阻斷50%或更多之抗體，相反地，在競爭分析中參考抗體將抗體與其抗原的結合阻斷50%或更多。本文提供示例性的競爭分析。
II. 抗體
本揭露的抗體與源自人類IgG重鏈恆定區之第一經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合，第一經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第一經修飾的IgG重鏈恆定區中。
於本揭露又一態樣中，與源自人類IgG重鏈恆定區之第一經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合的抗體為單株抗體，包含嵌合(chimeric)、人源化(humanized)或人類抗體。在一實施例中，所述抗體為抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體(diabody)、或F(ab’)2 片段。在另一實施例中，抗體為全長IgG抗體，例如，完整的IgG1、IgG2、IgG3及IgG4抗體或如本文中所定義的其它抗體種類或同型。
A. 第一經修飾的IgG重鏈恆定區
在一實施例中，第一經修飾的IgG重鏈恆定區可形成二聚體(dimer)，例如，於自然存在的IgG中的重鏈恆定區，或可形成半聚體(halfmer)，例如，Ishino, T. et al., J. Biol. Chem. 288:16529-37 (2013)中所報導的單體(monomeric)Fc中的重鏈恆定區。
在一實施例中，第一經修飾的IgG重鏈恆定區可源自於人類IgG重鏈恆定區的一部分。在一較佳實施例中，第一經修飾的IgG重鏈恆定區包括對應於人類IgG重鏈的CH3區的至少一區域。在此實施例中，抗體結合的抗原決定基可位於所述對應於人類IgG重鏈的CH3區的至少一區域的範圍內。在一更佳實施例中，第一經修飾的IgG重鏈恆定區包括對應於人類IgG重鏈的CH2區及CH3區的至少一些區域。在此實施例中，抗體結合的抗原決定基可位於所述對應於人類IgG重鏈的CH2區及CH3區的至少一些區域的範圍內。在又一更佳實施例中，第一經修飾的IgG重鏈恆定區包括對應於人類IgG重鏈的Fc區的至少一區域。在此實施例中，抗體結合的抗原決定基可位於所述對應於人類IgG重鏈的Fc區的至少一區域的範圍內。
在一實施例中，當第一經修飾的IgG重鏈恆定區為人類經修飾的IgG重鏈時，所述人類經修飾的IgG重鏈可擇自於人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4重鏈所組成的群組。在一較佳實施例中，人類IgG重鏈為人類IgG1或IgG4重鏈。
在一較佳實施例中，根據EU編號系統第445位的胺基酸於第一經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
經修飾的IgG重鏈恆定區中的一組修飾，即，缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，同時保留根據EU編號系統第445位之未經醯胺化的胺基酸，例如較佳的第一經修飾的IgG重鏈恆定區中的組，於本文中稱為“IgG delta-GK”或“delta-GK”。
在一更佳實施例中，所述抗體實質上不結合至包括delta-GK-醯胺的IgG重鏈恆定區，其為源自人類IgG重鏈恆定區之第二經修飾的IgG重鏈恆定區。第二經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第二經修飾的IgG重鏈恆定區中且為經醯胺化的。
在所有的這些中，抗體可從具有delta-GK-醯胺的經修飾的IgG重鏈恆定區，區分出於人類經修飾的IgG重鏈恆定區中根據EU編號系統第445位具有未經醯胺化的胺基酸的經修飾的IgG重鏈恆定區。
在一實施例中，抗體對第二經修飾的IgG重鏈恆定區的結合活性低於酵素免疫吸附法的偵測極限。
在另一實施例中，抗體對第一經修飾的IgG重鏈恆定區的結合活性於酵素免疫吸附法中為可偵測的。
B.抗體實質上不與其結合的人類IgG重鏈恆定區
在一實施例中，抗體實質上不結合至(i) 具有“未經刪除的C末端”的第三經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，或未經修飾的人類IgG重鏈恆定區，或(ii) 源自人類IgG重鏈恆定區的第四經修飾的IgG重鏈恆定區，其包括“delta-K”。
於(i)中所述包括未經刪除的C末端的第三經修飾的IgG重鏈恆定區或未經修飾的人類IgG重鏈恆定區中，根據EU編號系統第445位、第446位及第447位的胺基酸保留。
於(ii)中所述具有delta-K的第四經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第447位的離胺酸，根據EU編號系統第445位及第446位的胺基酸保留於(ii)中所述第四經修飾的IgG重鏈恆定區中。
在所有的這些中，抗體可從具有未經刪除的C末端或delta-K的經修飾的IgG重鏈恆定區、或未經修飾的人類IgG重鏈恆定區，區分出第一經修飾的IgG重鏈恆定區。
在一實施例中，抗體對擇自於第三經修飾的IgG重鏈恆定區、第四經修飾的IgG重鏈恆定區、及未經修飾的人類IgG重鏈恆定區所組成的群組的至少一IgG重鏈恆定區的結合活性，低於酵素免疫吸附法的偵測極限。
C. YG55
由於抗體藉由其可變區與其抗原結合，因此可變區對於抗體的結合特異性是重要的。此外，一般已知高度變異區(HVR)對於抗體的結合特異性為最重要的區域。
發明人藉由篩選，取得上述抗體中所涵蓋的抗體，如“實施例”中所說明，其中之一命名為“YG55”，而本揭露的範圍並不限於此特定抗體YG55。根據上述一般知識，發明人鑑定出YG55的所有HVR。YG55包括(a)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2、(c)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3、(d)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1、(e)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2、以及(f)包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，本揭露提供一抗體，包括至少一、二、三、四、五、或六個HVR，其擇自於(a)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2、(c)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3、(d)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1、(e)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2、以及(f)包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，本揭露提供一抗體，包括至少一個、至少二個、或全部三個的VH的HVR序列，其擇自於(a)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；以及(c)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3。在一實施例中，抗體包括包含序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3。在另一實施例中，抗體包括包含序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3、以及包含序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。在又一實施例中，抗體包括包含序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3、包含序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3、以及包含序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；以及(c)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3
在另一態樣中，本揭露提供一抗體，包括至少一個、至少二個、或全部三個的VL的HVR序列，其擇自於(a)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及(c)包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及(c)包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，本揭露的抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少二個、或全部三個的VH的HVR序列，所述VH的HVR序列擇自於(i)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2、以及(iii)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少二個、或全部三個的VL的HVR序列，所述VL的HVR序列擇自於(i)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2、以及(iii)包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，本揭露的抗體包括(a)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包括擇自於序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，於本文中所述的抗體包括一重鏈可變域(VH)序列，其對於序列辨識號：1的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列相同性。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但於本文中所述包含那些序列的抗體保有與第一經修飾的IgG重鏈恆定區結合的能力。在某些實施例中，於序列辨識號：1中，總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或刪除。在某些實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗體包括序列辨識號：1的VH序列，其包含那序列的轉譯後修飾(post-translational modification)。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，其擇自於：(a)包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2、以及(c)包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾包含但不限於，藉由焦谷化(pyroglutamylation)將重鏈或輕鏈的N末端中的麩醯胺酸(glutamine)或谷胺酸(glutamate)修飾為焦谷胺酸(pyroglutamic acid)。
在另一態樣中，提供一抗體，其中所述抗體包括一輕鏈可變域(VL)序列，其對於序列辨識號：5的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列相同性。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但於本文中所述包含那些序列的抗體保有與第一經修飾的IgG重鏈恆定區結合的能力。在某些實施例中，於序列辨識號：5中，總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或刪除。在某些實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗體包括序列辨識號：5的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，其擇自於：(a)包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及(c)包括擇自於序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於，藉由焦谷化將重鏈或輕鏈的N末端中的麩醯胺酸或谷胺酸修飾為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供一抗體，其中所述抗體包括以上提供的任一實施例中的VH，以及以上提供的任一實施例中的VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：1及序列辨識號：5中的VH及VL序列，包含那些的序列轉譯後修飾。轉譯後修飾包含但不限於，藉由焦谷化將重鏈或輕鏈的N末端中的麩醯胺酸或谷胺酸修飾為焦谷胺酸。
在一態樣中，提供一抗體，其中抗體與包括下列所述者的一抗體競爭結合第一經修飾的IgG重鏈恆定區，
(a) 包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；
(b) 包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；
(c) 包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3；
(d) 包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；
(e) 包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及
(f) 包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，提供一抗體，其中抗體與包括下列所述者的一抗體結合至相同的抗原決定基，
(a) 包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1；
(b) 包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2；
(c) 包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3；
(d) 包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1；
(e) 包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及
(f) 包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
D. 重組的方法及組成物
可使用重組的方法及組成物產生抗體，例如，如美國專利號4,816,567中所述。在一實施例中，提供編碼為本文中所述的抗體的分離的核酸。此類核酸可編碼為包括抗體的VL及/或VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕及/或重鏈)。在又一實施例中，提供包括此類核酸的一或多個載體(例如，表達載體)。在又一實施例中，提供包括此類核酸的宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞包括(例如，已經轉化(transformed)具有)：(1)載體，包括編碼為包括抗體的VL的胺基酸序列及包括抗體的VH的胺基酸序列的核酸分子，或(2)第一載體，包括編碼為包括抗體的VL的胺基酸序列的核酸分子，以及第二載體，包括編碼為包括抗體的VH的胺基酸序列的核酸分子。在一實施例中，宿主細胞為真核生物，例如，中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或淋巴球細胞(例如，Y0、NS0及Sp2/0細胞)。在一實施例中，提供本文中所述抗體的製備方法，其中所述方法包括：在適於抗體表達的條件下，培養如前文提供之包括編碼為抗體的核酸分子的宿主細胞，以及可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
為了重組生產如本文中所述抗體，例如，如上文所述之編碼為抗體的核酸，被分離並插入至一或多個載體中用於進一步於宿主細胞中選殖及/或表達。為了Fc區域的重組生產，編碼Fc區域的核酸被分離並插入至一或多個載體中用於進一步選殖及/或在宿主細胞中表達。使用常規流程可容易地分離及定序此類核酸(例如，使用寡核苷酸探針，其能夠特異性地結合至編碼為抗體的重鏈及輕鏈的基因)。
用於選殖或表達編碼抗體的載體的合適的宿主細胞包含如本文所述的原核或真核細胞。例如，可於細菌中生產抗體，特別是當不需糖化及Fc效應物(effector)功能時。關於於細菌中表達抗體片段及多肽，請參照，例如，美國專利號5,648,237、美國專利號5,789,199及美國專利號5,840,523。(請亦參照，Charlton，Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254，其描述於大腸桿菌中的抗體片段的表達)。於表達之後，抗體可從可溶級分(fraction)中的細菌細胞糊(cell paste)中分離，並可進一步純化。
除了原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母，為編碼抗體的載體的合適的選殖或表達宿主，包含糖化途徑已經“人源化”的真菌及酵母菌株(strain)，導致具有部分或全部人類糖化模式的抗體產生。請參照Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
適於糖化抗體的表達的宿主細胞亦可源自多細胞生物(無脊椎生物及脊椎生物)。無脊椎生物細胞的例子包含植物及昆蟲細胞。多種桿狀病毒株已被確認，其可與昆蟲細胞一起使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染(transfection)。
亦可使用植物細胞培養物作為宿主。請參照，例如，美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429(描述用於在基因轉殖植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，可使用適應於懸浮液(suspension)中生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它例子為經SV40轉化的猴腎臟CVl細胞系(COS-7)；人類胚胎腎臟細胞系(293或293細胞，例如，如Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述)；幼倉鼠腎臟細胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠支持細胞(sertoli cell)( 例如，如Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所述的TM4細胞)；猴腎臟細胞(CVl)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(human cervical carcinoma cell，HELA)；犬腎臟細胞(canine kidney cell，MDCK)；水牛鼠肝臟細胞(buffalo rat liver cell，BRL 3A)；人類肺臟細胞(W138)；人類肝臟細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，例如，如Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其包含DHFR- CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如，Y0、NS0及Sp2/0。適合用於抗體產生的特定哺乳動物宿主細胞系的綜述請參照，例如，Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)。
E.分析
本文中所提供的抗體可藉由本技術領域習知的各種分析法，進行辨識、篩選或表徵它們的物理/化學性質及/或生物活性。
F.結合分析及其它分析
在一態樣中，可藉由習知方法，例如，ELISA、西方點墨法等，測試本揭露的抗體對其抗原的結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析(competition assay)以辨識與“實施例”中使用的YG55競爭結合第一經修飾的IgG重鏈恆定區的抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合的抗原決定基(例如，線性或構象(conformational)抗原決定基)與“實施例”中使用的YG55結合的抗原決定基相同。用於定位(map)抗體結合的抗原決定基之詳細示例性方法於Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)中提供。
在一示例性競爭分析中，固定的第一經修飾的IgG重鏈恆定區培養於一溶液中，所述溶液包括與第一經修飾的IgG重鏈恆定區結合的第一標記抗體以及經測試其與第一抗體競爭結合第一經修飾的IgG重鏈恆定區的能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於B細胞或融合瘤上清液中。作為控制組，固定的第一經修飾的IgG重鏈恆定區培養於包括第一標記抗體但不包括第二未標記抗體的溶液中。在允許第一抗體與第一經修飾的IgG重鏈恆定區結合的條件下培養之後，移除過量未結合的抗體，以及測量與固定的IgG重鏈恆定區結合的標記量。若相對於控制組樣品，在測試樣品中與固定的IgG重鏈恆定區結合的標記量實質上減少，那麼其表示第二抗體與第一抗體競爭結合第一經修飾的IgG重鏈恆定區。請參照，Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
III. 組成物
在一態樣中，本揭露中的組成物為用於在樣品中偵測或捕捉多肽的組成物，所述組成物包括於“II. 抗體”中所述的抗體。所述多肽包括源自人類IgG重鏈恆定區的第五經修飾的IgG重鏈恆定區，第五經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，且根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第五經修飾的IgG重鏈恆定區中。
在一較佳實施例中，根據EU編號系統第445位的胺基酸於第五經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
第五經修飾的IgG重鏈恆定區可包括其它胺基酸取代或修飾，只要它包括缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸之修飾且保留根據EU編號系統第445位的胺基酸。
此外，使用本揭露中的組成物偵測或捕捉的多肽在其結構方面並未特定限制，只要所述多肽包括第五經修飾的IgG重鏈恆定區於C末端。使用本揭露中的組成物偵測或捕捉的多肽可為例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的抗體、抗體片段、融合蛋白、或包括第五經修飾的IgG重鏈恆定區的任一其它形式的多肽。
IV. 方法
在一態樣中，本揭露中的方法為用於在樣品中偵測或捕捉多肽的方法，所述方法包括將於“II. 抗體”中所述的抗體與樣品接觸。所述多肽包括源自人類IgG重鏈恆定區的第六經修飾的IgG重鏈恆定區，第六經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，且根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於第六經修飾的IgG重鏈恆定區中。
在一較佳實施例中，根據EU編號系統第445位的胺基酸於第六經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
第六經修飾的IgG重鏈恆定區可包括其它胺基酸取代或修飾，只要它包括缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸之修飾且保留根據EU編號系統第445位的胺基酸。
此外，藉由本揭露中的方法偵測或捕捉的多肽在其結構方面並未特定限制，只要所述多肽包括第六經修飾的IgG重鏈恆定區於C末端。藉由本揭露中的方法偵測或捕捉的多肽可為例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的抗體、抗體片段、融合蛋白、或包括第六經修飾的IgG重鏈恆定區的任一其它形式的多肽。
[實施例]
實施例1
delta-GK Fc的製備
使用FreeStyleTM 293表達系統(Invitrogen)表達人類IgG4衍生的delta-GK Fc片段。藉由親和層析(MabSelect SuRe，GE)從收穫的細胞培養基中純化表達的Fc片段。於最後步驟中，將緩衝液更換為D-PBS(-)。
實施例2
抗-delta-GK抗體的產生
藉由以下所述者製備、選擇及分析抗-delta-GK抗體。
以於實施例1中表達的人類IgG4衍生的delta-GK Fc片段皮內地(intradermally)免疫NZW兔(100-200 micro g/劑量/頭)，在3個月的期間中重複地給予所述劑量6次，接著進行血液及脾臟的收集。為了選擇B細胞，製備IgG4 delta-GK抗體(具有遺傳缺失的IgG4 C末端GK的IgG4抗體)以及野生型IgG4抗體。根據WO2016098356A1中所述的流程，使用細胞分類器(cell sorter)分類Delta-GK特異性B細胞，接著進行塗盤及培養。在培養之後，收集B細胞培養上清液用於進一步分析，且將相應的B細胞沉澱物(pellet)冷凍保存。
使用B細胞培養上清液，藉由ELISA評估對IgG delta-GK的特異性結合。於此初步篩選中，四種抗體被使用作為抗原，以評估針對delta-GK的C末端序列的結合特異性：具有遺傳缺失的IgG1 C末端K的IgG1抗體(IgG1 delta-K)、具有遺傳缺失的IgG1 C末端GK的IgG1抗體(IgG1 delta-GK)、具有遺傳缺失的IgG4 C末端K的IgG4抗體(IgG4 delta-K)、以及具有遺傳缺失的IgG4 C-末端GK的IgG4抗體(IgG4 delta-GK)。結果顯示，只有一個來自單一B細胞株的培養上清液樣品顯示與IgG1 delta-GK及IgG4 delta-GK兩者的特異性結合(第1圖)。
Delta-GK Fc在結構上比起delta-K Fc，較相似於delta-GK-醯胺 Fc。我們亦使用前述來自陽性B細胞株的選擇的培養上清液表徵與delta-GK Fc及delta-GK-醯胺Fc的特異性結合。以前述IgG1 delta-K或IgG4 delta-K藉由PAM處理製備IgG1 delta-GK-醯胺以及IgG4 delta-GK-醯胺，並藉由常規方法進行純化。於此二次篩選中，於ELISA分析中四種抗體被使用作為抗原，以評估針對delta-GK的C末端序列的結合特異性：IgG1 delta-GK、IgG1 delta-GK-醯胺、IgG4 delta-GK、以及IgG4 delta-GK-醯胺。令人驚訝地，測試的單一B細胞培養上清液顯示對delta-GK分子具有極高的特異性(第2圖)。
根據這些篩選結果，使用ZR-96 Quick-RNA套組(ZYMO RESEARCH，目錄號R1053)將選擇的殖株的RNA從其冷凍保存的細胞沉澱物中萃取出。取得編碼為選擇的殖株所產生的抗體中的抗體重鏈可變區的DNA，並藉由逆轉錄PCR擴增，接著與編碼為兔IgG重鏈恆定區的DNA(序列辨識號：9)重組。亦取得編碼為抗體輕鏈可變區的DNA，並藉由逆轉錄PCR擴增，接著與編碼為兔Igk輕鏈恆定區的DNA(序列辨識號：10)重組。從這些重組體產生稱為“YG55”的抗-delta-GK抗體，其具有兩個重鏈及兩個輕鏈。重鏈及輕鏈的VH、VL及HVR序列如表1所述。使用FreeStyleTM 293表達系統表達YG55，並從培養上清液進行純化。
實施例3
抗-delta-GK單株抗體YG55的特性分析(characterization)
於基因選殖(cloning)及抗體表達之後，藉由如前述二次篩選中的ELISA分析評估YG55的特異性。抗體基因的選殖為成功的，導致YG55保留相同的特異性，如命中的(陽性)B細胞株所示(第3圖)。此高度特異性的結合亦藉由表面電漿共振分析(surface plasmon resonance assay)進行確認。藉由結晶結構分析鑑定特異性結合模體(motif)以及其抗原決定基。
[表1]
無。
[第1圖] 第1圖顯示初步篩選的ELISA結果，鑑定出的單一命中的(single hit)(陽性)B細胞株可與IgG1 delta-GK以及IgG4 delta-GK特異性地結合，且並未與IgG1 delta-GK以及IgG4 delta-GK結合。使用抗鑰孔蟲戚血藍蛋白(anti-keyhole limpet hemocyanin，KLH)兔單株抗體作為同型(isotype)對照組。
[第2圖] 第2圖顯示二次篩選的ELISA結果，鑑定出的單一命中的(陽性)B細胞株可與IgG1 delta-GK以及IgG4 delta-GK特異性地結合，且並未與IgG1 delta-GK-醯胺以及IgG4 delta-GK-醯胺結合。使用抗KLH兔單株抗體作為同型對照組。
[第3圖] 第3圖顯示經純化的單株抗體的ELISA結果，YG55可與IgG1 delta-GK以及IgG4 delta-GK特異性地結合，且並未與IgG1 delta-GK-醯胺以及IgG4 delta-GK-醯胺結合。使用抗KLH兔單株抗體作為同型對照組。

Claims (13)

  1. 一種抗體，其與一第一經修飾的IgG重鏈恆定區特異性地結合，該第一經修飾的IgG重鏈恆定區源自人類IgG重鏈恆定區，其中該第一經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於該第一經修飾的IgG重鏈恆定區中。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸於該第一經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的(amidated)。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之抗體，其與一第二經修飾的IgG重鏈恆定區實質上不結合，該第二經修飾的IgG重鏈恆定區源自人類IgG重鏈恆定區，其中該第二經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於該第二經修飾的IgG重鏈恆定區中，且為經醯胺化的。
  4. 如申請專利範圍第1至3項任一項所述之抗體，其與下列(i)或(ii)實質上不結合： (i) 一第三經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，或一未經修飾的人類IgG重鏈恆定區，其中根據EU編號系統第445位、第446位及第447位的胺基酸保留於該第三經修飾的IgG重鏈恆定區或該未經修飾的人類IgG重鏈恆定區中；以及 (ii) 一第四經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，其中該第四經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位及第446位的胺基酸保留於該第四經修飾的IgG重鏈恆定區中。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之抗體，其中該抗體對該第二經修飾的IgG重鏈恆定區的結合活性低於一酵素免疫吸附法的偵測極限。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之抗體，其中該抗體對擇自於該第三經修飾的IgG重鏈恆定區、該第四經修飾的IgG重鏈恆定區、及該未經修飾的人類IgG重鏈恆定區所組成的群組的至少一IgG重鏈恆定區的結合活性低於一酵素免疫吸附法的偵測極限。
  7. 如申請專利範圍第1至6項任一項所述之抗體，其中該抗體對該第一經修飾的IgG重鏈恆定區的結合活性於一酵素免疫吸附法中為可偵測的。
  8. 如申請專利範圍第1至7項任一項所述之抗體，其中該抗體與包括下列所述者的一抗體競爭結合該第一經修飾的IgG重鏈恆定區， (a) 包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1； (b) 包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2； (c) 包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3； (d) 包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1； (e) 包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及 (f) 包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
  9. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之抗體，其中該抗體與包括下列所述者的一抗體結合至相同的抗原決定基， (a) 包括序列辨識號：2的胺基酸序列的HVR-H1； (b) 包括序列辨識號：3的胺基酸序列的HVR-H2； (c) 包括序列辨識號：4的胺基酸序列的HVR-H3； (d) 包括序列辨識號：6的胺基酸序列的HVR-L1； (e) 包括序列辨識號：7的胺基酸序列的HVR-L2；以及 (f) 包括序列辨識號：8的胺基酸序列的HVR-L3。
  10. 一種組成物，其用於在一樣品中偵測或捕捉一多肽，其中該組成物包括如申請專利範圍第1至9項任一項所述之抗體，且該多肽包括一第五經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，其中該第五經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於該第五經修飾的IgG重鏈恆定區中。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之組成物，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸於該第五經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
  12. 一種方法，其用於在一樣品中偵測或捕捉一多肽，其中該方法包括將如申請專利範圍第1至8項任一項所述之抗體與該樣品接觸，且該多肽包括一第六經修飾的IgG重鏈恆定區，其源自人類IgG重鏈恆定區，其中該第六經修飾的IgG重鏈恆定區缺少根據EU編號系統第446位的甘胺酸以及根據EU編號系統第447位的離胺酸，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸保留於該第六經修飾的IgG重鏈恆定區中。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中根據EU編號系統第445位的胺基酸於該第六經修飾的IgG重鏈恆定區中為未經醯胺化的。
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HUE029649T2 (en) * 2007-08-10 2017-02-28 Janssen Biotech Inc Immunoglobulin cleavage fragments as disease indicators and preparations for detecting and binding such fragments
HUE029635T2 (en) * 2007-09-26 2017-03-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method for modifying an isoelectric point of an antibody by amino acid substitution in CDR
CN101939425B (zh) * 2007-09-26 2014-05-14 中外制药株式会社 抗il-6受体抗体
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MX2018005036A (es) * 2015-10-29 2018-08-01 Hoffmann La Roche Anticuerpos y metodos de uso de anti-regiones de fragmentos cristalizables (fc) variantes.
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