WO2021201202A1 - 多重特異性抗原結合分子を含む組成物における不純物分子の分析方法 - Google Patents
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Definitions
- the present disclosure relates to a method for analyzing impurity molecules in a composition containing a multispecific antigen-binding molecule. More specifically, the present disclosure is a method for quantifying the content of a light chain exchanger molecule caused by the crossing of the light chain of the multispecific antigen-binding molecule in a composition containing the multispecific antigen-binding molecule. Regarding, a step of treating molecules contained in the composition to generate a plurality of types of F (ab) fragments, and a step of measuring the F (ab) fragment and measuring the content or content ratio of each fragment. including.
- Non-common light chain multispecific antigen-binding molecules have two types of heavy chains (H1, H2) and two types of light chains (L1, L2), so they are used in the culture process.
- H1, H2 heavy chains
- L1, L2 light chains
- nine types of impurity molecules are generated by heavy chains or by crossing heavy chains and light chains (Fig. 5).
- a technique called Knobs-into-holes Patent Document 1
- a technique using charge control between heavy chains or between heavy chains and light chains Patent Documents 2 and 3.
- Non-Patent Document 1 a method for analyzing impurity molecules including light chain exchanger molecules.
- each molecule is separated into F (ab)
- mass spectrometric analysis is performed, and the content estimate of each molecule is estimated using the mass spectrometric result and theoretical calculation based on the probability of heavy chain-light chain combination. Is used to calculate.
- this method does not measure the content directly from the analysis result, but only obtains an estimated value using theoretical calculation, so that the light chain exchanger molecule cannot be accurately quantified.
- the invention disclosed in the present disclosure has been made in view of the above circumstances, and in one non-limiting aspect, the target multispecific antigen-binding molecule and the light chain exchanger molecule contained in the composition are defined. It is an object of the present invention to provide an analysis method for quantifying separately.
- the molecules contained in the composition are processed to generate a plurality of types of F (ab) fragments, and each F (ab) fragment is separated by utilizing the charge difference and the like, and the respective contents ( By measuring the content ratio), it is possible to measure the presence or absence of the light chain exchanger molecule in the composition, and the content or content ratio.
- a method for analyzing a light chain exchanger molecule in a composition containing a multispecific antigen-binding molecule contains a first heavy chain variable domain and a first light chain variable domain for the first antigen, a first F (ab) (H1L1), and a second weight for the second antigen.
- the light chain exchanger molecule is a third F (ab) (H1L2) containing a first heavy chain variable domain and a second light chain variable domain, and a second heavy chain variable domain and a first light chain variable domain. It is a molecule (H1L2 / H2L1) containing a fourth F (ab) (H2L1) containing
- the analysis method includes the following steps 1 and 2.
- Step 1 is the method of [1], which comprises the following steps 1-1 and 1-2.
- Step of cleaving the molecule contained in the composition to generate F (ab) '2 fragment 1-2) Cleaving the F (ab) '2 fragment to produce two or more F (ab) fragments Process to generate [3] The method of [2], wherein step 1-1 is a step of cutting the Fc side of the hinge portion of the molecule contained in the composition with a protease. [4] The method of [3], wherein the protease is any or a combination of a bacterial antibody-degrading enzyme, pepsin, ficin.
- step 1-2 is a step of cleaving the disulfide bond of the F (ab) '2 fragment with a reducing agent.
- the reducing agent is any or a combination of TCEP, 2-MEA, Cysteine, Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, 3-mercapto-1,2-propanediol, TBP.
- step 1 is a step of cleaving the F (ab) side of the hinge portion of the molecule contained in the composition with a protease.
- Step 2 measures two or more F (ab) fragments by any one of cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, or a combination thereof.
- the multispecific antigen-binding molecule (H1L1 / H2L2) is a molecule in which amino acid residues are modified so as to provide a difference in isoelectric point between the following impurities (1) to (8). Any method from 1] to [10].
- Heterodimer (H2L2 / H2L1) containing four F (ab) (H2L1) [12] The method of [11], wherein impurities (1) to (8) are removed from the composition containing the multispecific antigen-binding molecule by a purification step utilizing the difference in isoelectric points.
- Bispecific antibodies are ranked 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 13, 15, 16, 19, and 23 by Kabat numbering in heavy chain variable domains. , 25th, 26th, 39th, 42nd, 43rd, 44th, 46th, 68th, 71st, 72nd, 73rd, 75th, 76th, 81st, 82b, 83rd, 85th Amino acid residues at positions 86, 97, 105, 108, 110 and 112, and EU numbering in heavy chain constant domains at positions 137, 196, 203, 214, 217, and 233.
- Bispecific antibodies are antibodies that include F (ab) that binds to blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX and F (ab) that binds to blood coagulation factor X.
- F (ab) that binds to blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX
- F (ab) that binds to blood coagulation factor X.
- the multispecific antigen-binding molecule contains a first heavy chain variable domain and a first light chain variable domain for the first antigen, a first F (ab) (H1L1), and a second weight for the second antigen.
- the light chain exchanger molecule is a third F (ab) (H1L2) containing a first heavy chain variable domain and a second light chain variable domain, and a second heavy chain variable domain and a first light chain variable domain.
- the quality control method includes the following steps 1 to 3. 1) Treatment of a composition containing a multispecific antigen-binding molecule to produce two or more F (ab) fragments 2) Two or more F (ab) by a separation method based on charge or hydrophobic interaction The fragment is measured to determine the content of the light chain exchanger molecule in the composition or the content ratio of the light chain exchanger molecule to the multispecific antigen-binding molecule. Step 3) The light chain exchanger molecule determined in step 2. The step of confirming that the content or content ratio of is equal to or less than the preset allowable value of content / content ratio.
- a method for evaluating the quality of a pharmaceutical composition containing a multispecific antigen-binding molecule contains a first heavy chain variable domain and a first light chain variable domain for the first antigen, a first F (ab) (H1L1), and a second weight for the second antigen.
- the light chain exchanger molecule is a third F (ab) (H1L2) containing a first heavy chain variable domain and a second light chain variable domain, and a second heavy chain variable domain and a first light chain variable domain.
- the quality evaluation method includes the following steps 1 to 3. 1) Treatment of a composition containing a multispecific antigen-binding molecule to produce two or more F (ab) fragments 2) Two or more F (ab) by a separation method based on charge or hydrophobic interaction The fragment is measured to determine the content of the light chain exchanger molecule in the composition or the content ratio of the light chain exchanger molecule to the multispecific antigen-binding molecule. Step 3) The light chain exchanger molecule determined in step 2. The step of confirming that the content or content ratio of is equal to or less than the preset allowable value of content / content ratio.
- step 1 includes the following steps 1-1 and 1-2. 1-1) Step of cleaving the molecule contained in the composition to generate F (ab) '2 fragment 1-2) Cleaving the F (ab) '2 fragment to produce two or more F (ab) fragments Process to generate [20]
- step 1-1 is a step of cutting the Fc side of the hinge portion of the molecule contained in the composition with a protease.
- the protease is any or a combination of bacterial antibody-degrading enzymes, pepsin, ficin.
- step 1-2 is a step of cleaving the disulfide bond of the F (ab) '2 fragment with a reducing agent.
- the reducing agent is any or a combination of TCEP, 2-MEA, Cysteine, Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, 3-mercapto-1,2-propanediol, TBP.
- step 1 is a step of cleaving the F (ab) side of the hinge portion of the molecule contained in the composition with a protease.
- Step 2 measures two or more F (ab) fragments by any one or a combination of cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and reverse phase chromatography.
- [27] The method according to any one of [17] to [26], wherein the two or more types of F (ab) fragments generated in step 1 have different isoelectric points.
- the multispecific antigen-binding molecule (H1L1 / H2L2) is a molecule in which amino acid residues are modified so as to provide a difference in isoelectric point between the following impurities (1) to (8). 17] to [27].
- Heterodimer (H2L2 / H2L1) containing four F (ab) (H2L1) [29] The method of [28], wherein the composition containing the multispecific antigen-binding molecule has impurities (1) to (8) removed by a purification step utilizing the difference in isoelectric points.
- Bispecific antibodies are ranked 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 13, 15, 16, 19, and 23 by Kabat numbering in heavy chain variable domains. , 25th, 26th, 39th, 42nd, 43rd, 44th, 46th, 68th, 71st, 72nd, 73rd, 75th, 76th, 81st, 82b, 83rd, 85th Amino acid residues at positions 86, 97, 105, 108, 110 and 112, and EU numbering in heavy chain constant domains at positions 137, 196, 203, 214, 217, and 233.
- Method. The method of any of [17]-[31], wherein the composition comprising the multispecific antigen binding molecule or bispecific antibody is a pharmaceutical composition.
- a bispecific antibody is an antibody comprising F (ab) that binds to blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX and F (ab) that binds to blood coagulation factor X.
- the analytical method of the present disclosure demonstrates that the content of light chain exchanger molecules can be accurately measured directly from the measurement results by cation exchange chromatography (CEX) or the like. Yes, it is different from the conventional analysis method that obtains an estimated value using theoretical calculation. According to the analysis method of the present disclosure, whether or not the light chain exchanger molecule is contained as an impurity in the composition containing the multispecific antigen-binding molecule which is the target molecule, and if it is contained, the content (containing) thereof. Ratio) can be accurately quantified.
- the molecular form of the multispecific antigen-binding molecule to be analyzed is not limited, and it can be applied not only to bispecific antibodies, but also to bispecific F (ab) '2 fragments, scFv, and the like. It can also be a multispecific antigen-binding molecule having two different Fs (abs), one of which has binding specificity for two or more antigens.
- Heavy chain for blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX (FIX (a)), homodimer consisting of light chain (H1L1 / H1L1), heavy chain for blood coagulation factor X (FX) , A homodimer consisting of a light chain (H2L2 / H2L2), a heavy chain for blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX, and a homodimer consisting of a light chain for blood coagulation factor X ( A homodimer (H2L1 / H2L1) consisting of H1L2 / H1L2), a heavy chain for blood coagulation factor X, and a light chain for blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX was prepared to prepare H1L1, The results of CEX analysis by separating into four types of F (ab) fragments, H2L2, H1L2, and H2L1 are shown.
- Heavy chain for epiregulin (EREG), homodimer consisting of light chain (H1L1 / H1L1), heavy chain for GPC3, homodimer consisting of light chain (H2L2 / H2L2), heavy chain for EREG, and light for GPC3 Homodimers consisting of chains (H1L2 / H1L2), heavy chains for GPC3, and homodimers consisting of light chains for EREG (H2L1 / H2L1) were prepared, and four types of F, H1L1, H2L2, H1L2, and H2L1. (ab) The results of CEX analysis after separation into fragments are shown.
- Heavy chain for IL-6 receptor (IL-6R), homodimer consisting of light chain (H1L1 / H1L1), heavy chain for KLH, homodimer consisting of light chain (H2L2 / H2L2), IL-6R
- a homodimer consisting of a heavy chain for KLH and a light chain for KLH (H1L2 / H1L2), a heavy chain for KLH, and a homodimer consisting of a light chain for IL-6R (H2L1 / H2L1) were prepared to prepare H1L1,
- the results of CEX analysis by separating into four types of F (ab) fragments, H2L2, H1L2, and H2L1 are shown.
- FIG. 6 is a schematic diagram showing impurities (8 types) of a desired bispecific antibody, its light chain exchanger molecule, and other mispairs that can be produced in the process of producing a non-common light chain bispecific antibody.
- the bispecific antibody of interest has two types of F (ab) shown in the figure as H1L1 and H2L2, and may be referred to herein as H1L1 / H2L2.
- the light chain exchanger molecule has two types of F (ab) shown in the figure as H1L2 and H2L1 and may be referred to herein as H1L2 / H2L1.
- the combination of the two F (abs), each containing other mispair impurities, differs from that contained by the bispecific antibody of interest and that contained by its light chain exchanger molecule.
- Above the schematic diagram of each molecule is the theoretical pI (isoelectric point) of each molecule when the anti-FIX (a) / anti-FX bispecific antibody shown in Table 1 is the desired bispecific antibody. The value of point) is shown in parentheses.
- FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a method for producing four types of F (ab) fragments from a target molecule and its light chain exchanger molecule by a one-step treatment.
- antigen-binding molecule refers to a molecule that specifically binds to an antigenic determinant (epitope).
- the antigen binding molecule is an antibody, antibody fragment, or antibody derivative.
- the antigen-binding molecule is a non-antibody protein, or fragment thereof, or a derivative thereof.
- the term "specifically bound” means a state in which one molecule of a specifically bound molecule does not show any significant binding to a molecule other than the other molecule to which one or more of the specifically bound molecules are bound. It means to combine with. It is also used when the antigen-binding domain is specific for a specific epitope among a plurality of epitopes contained in a certain antigen. When the epitope to which the antigen-binding domain binds is contained in a plurality of different antigens, the antigen-binding molecule having the antigen-binding domain can bind to various antigens including the epitope.
- binding to the same epitope means that at least a part of the epitope to which two antigen-binding domains bind overlap.
- the degree of overlap is not limited, but is at least 10% or more, preferably 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, particularly preferably 90% or more. , Most preferably 100% overlap.
- antibody is used in the broadest sense herein and is not limited to, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg,) as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. , Bispecific antibody) and antibody fragments, including various antibody structures.
- Binding activity is the sum of non-covalent interactions between one or more binding sites of a molecule (eg, an antibody) and a molecule's binding partner (eg, an antigen). It refers to the strength of.
- the binding activity is not strictly limited to a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen).
- the binding activity refers to a unique binding affinity (“affinity”). If the members of the binding pair are capable of both monovalent and multivalent binding, the binding activity is the sum of these binding forces.
- binding activity of the molecule X to its partner Y can generally be expressed by the dissociation constant (KD) or the "analyte binding amount per unit ligand amount". Binding activity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein.
- the antigen-binding molecule and antibody analyzed by the methods of the present disclosure can be tested for their antigen-binding activity by known methods such as ELISA, Western blot and the like.
- mutant antibodies eg, mutant antibodies that contain naturally occurring mutations, or mutant antibodies that occur during the production of monoclonal antibody preparations, such variants are usually few. Except for the amount present), it binds to the same and / or the same epitope.
- polyclonal antibody preparations which typically contain different antibodies against different determinants (epitopes)
- each monoclonal antibody in the monoclonal antibody preparation is for a single determinant on the antigen.
- the modifier "monoclonal” should not be construed as requiring the production of an antibody by any particular method, indicating the characteristic of the antibody that it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies.
- the monoclonal antibody used according to the present invention is not limited to these, but is a hybridoma method, a recombinant DNA method, a phage display method, and a transgenic animal containing all or a part of the human immunoglobulin locus. It may be made by a variety of methods, including methods that utilize, such methods and other exemplary methods for making monoclonal antibodies are described herein.
- Natural antibody refers to an immunoglobulin molecule with various naturally occurring structures.
- a native IgG antibody is a heterotetrameric glycoprotein of approximately 150,000 daltons composed of two identical disulfide-bonded light chains and two identical heavy chains.
- VH variable region
- CH2, and CH3 constant domains
- each light chain has a variable region (VL), also called a variable light chain domain or a light chain variable domain, followed by a stationary light chain (CL) domain.
- VH variable region
- VL variable region
- the light chain of an antibody may be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of its constant domain.
- full-length antibody “complete antibody,” and “whole antibody” are used interchangeably herein and have a structure substantially similar to that of a native antibody, or are defined herein.
- an antigen binding domain refers to a region that specifically binds to and is complementary to a part or all of an antigen.
- an antigen-binding molecule comprises an antigen-binding domain. When the molecular weight of an antigen is large, the antigen-binding domain can bind only to a specific portion of the antigen. The specific portion is called an epitope.
- the antigen binding domain comprises an antibody fragment that binds to a particular antigen.
- Antigen binding domains can be provided by the "variable domain" of one or more antibodies.
- the antigen binding domain comprises an antibody light chain variable region (VL) and an antibody heavy chain variable region (VH).
- antigen binding domains examples include “scFv (single chain Fv)", “single chain antibody”, “Fv”, “scFv2 (single chain Fv 2)", “Fab” or “Fab' , Etc. can be mentioned.
- the antigen binding domain comprises a non-antibody protein or fragment thereof that binds to a particular antigen.
- the antigen binding domain comprises a hinge region.
- variable region refers to the heavy or light chain domain of an antibody that is involved in binding an antigen-binding molecule or antibody to an antigen.
- the heavy and light chain variable domains of native antibodies are similar, with each domain usually containing four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR).
- FR conserved framework regions
- HVR hypervariable regions
- antibodies that bind to a particular antigen may be isolated by screening complementary libraries of VL or VH domains using the VH or VL domains from antibodies that bind to that antigen, respectively. See, for example, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
- hypervariable region are hypervariable in sequence (“complementarity determining regions” or “CDRs” (complementarity determining regions)) and / or are structurally defined. Refers to each region of the variable domain of an antibody that forms a loop (“hypervariable loop”) and / or contains antigen contact residues (“antigen contact”). Usually, the antibody contains 6 HVRs: 3 for VH (H1, H2, H3) and 3 for VL (L1, L2, L3).
- Illustrative HVRs herein include: (a) At amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3) The resulting hypervariable loop (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) At amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3).
- the resulting CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
- HVR residues and other residues in the variable domain are numbered herein according to Kabat et al., Supra.
- variable domain FR refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues.
- a variable domain FR usually consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4.
- sequences of HVR and FR usually appear in VH (or VL) in the following order: FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.
- the constant region as one embodiment of the present invention is preferably an antibody constant region, more preferably an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 type antibody constant region, and even more preferably a human IgG1, IgG2. , IgG3, IgG4 type antibody constant region.
- the constant region as another embodiment of the present invention is preferably a heavy chain constant region, more preferably an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 type heavy chain constant region, and even more preferably a human. It is a heavy chain constant region of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 types.
- the amino acid sequences of human IgG1 constant region, human IgG2 constant region, human IgG3 constant region and human IgG4 constant region are known.
- constant regions of human IgG1, human IgG2, human IgG3, and human IgG4 antibodies a plurality of allotype sequences due to gene polymorphisms are described in Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242. In any of these cases.
- the constant region in which the amino acid of the present invention is modified may contain other amino acid mutations and modifications as long as it contains the amino acid mutation of the present invention.
- the term "hinge region” refers to linking the CH1 and CH2 domains in a wild-type antibody heavy chain, eg, from around 216 to 230 according to the EU numbering system, or around 226 according to the Kabat numbering system. It means the antibody heavy chain polypeptide portion from to the 243rd position.
- the cysteine residue at position 220 of the EU numbering in the hinge region is known to form a disulfide bond with the cysteine residue at position 214 in the antibody light chain.
- the cysteine residue at EU numbering 226 and the cysteine residue at 229 in the hinge region form a disulfide bond.
- the hinge region herein includes the wild-type as well as variants in which amino acid residues have been substituted, added, or deleted in the wild-type.
- the term "Fc region” is used to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least part of the constant region.
- the term includes the Fc region of a native sequence and the mutant Fc region.
- the human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain.
- the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) in the Fc region may or may not be present.
- the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, follow the EU numbering system (also known as the EU index) described in MD 1991.
- Antibody Fragment and “Antibody Fragment” refer to a molecule other than the complete antibody, which comprises a part of the complete antibody that binds to the antigen to which the complete antibody binds.
- antibody fragments are, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2 ; diabody; linear antibody; single chain antibody molecule (eg, scFv). ); Single chain Fab (scFab); Single domain antibody; and multispecific antibody formed from antibody fragments.
- Fv (variable fragment) refers to a pair of a light chain variable region (VL) of an antibody and a heavy chain variable region (VH) of an antibody. It means the smallest unit of an antigen-binding domain derived from an antibody consisting of.
- VL light chain variable region
- VH heavy chain variable region
- scFv single chain antibody
- single chain antibody single chain antibody
- sc (Fv) 2 include a variable region derived from both heavy and light chains within a single polypeptide chain. Means an antibody fragment that lacks a constant region.
- single chain antibodies further include a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows them to form the desired structure that appears to allow antigen binding.
- Single-chain antibodies are discussed in detail by Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg, and Moore, Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994). Similarly, see International Patent Application Publication WO 1988/001649 and US Pat. Nos. 4,946,778 and 5,260,203.
- the single chain antibody can also be bispecific and / or humanized.
- ScFv is an antigen-binding domain in which VH and VL constituting Fv are linked by a peptide linker (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883).
- the peptide linker can keep VH and VL in close proximity.
- sc (Fv) 2 is a single-chain antibody in which four variable regions of two VL and two VHs are linked by a linker such as a peptide linker to form a single chain (J Immunol. Methods (1999) 231 (1-). 2), 177-189).
- the two VHs and VLs may be derived from different monoclonal antibodies.
- bispecific sc (Fv) 2) that recognizes two types of epitopes present in the same antigen as disclosed in Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374 is also preferable.
- sc (Fv) 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by linking scFv with a linker such as a peptide linker.
- two VHs and two VLs are VH, VL, VH, VL ([ Examples of the antibody are characterized in that they are arranged in the order of VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]), but the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited to the above configuration. It may be arranged in any order. For example, the following order structure can be mentioned.
- F (ab) As used herein, "F (ab)” (also referred to as Fab, Fab') refers to a light chain consisting of VL (light chain variable region) and CL (light chain constant region) and a heavy chain VH (heavy chain variable region). It is composed of a portion consisting of CH1 (region) and CH1 ( ⁇ 1 region in the heavy chain constant region), and can have a structure in which the portion of the heavy chain and the light chain are bonded by a disulfide bond in the C-terminal region. Also, F (ab) may include part of the hinge region. F (ab) as an antibody fragment may simply be referred to as F (ab) or may be referred to as an F (ab) fragment.
- F (ab) as part of an antigen-binding molecule is also simply referred to as F (ab), but is referred to as the F (ab) moiety or F (ab) region to distinguish it from the F (ab) fragment.
- F (ab) may or may not have antigen-binding activity.
- the two F (ab) contained in the multispecific antigen binding molecule both have antigen binding activity.
- the antigen-binding activity of one or both of the two F (abs) contained in the light chain exchanger molecule (H1L2 / H2L1) of the multispecific antigen-binding molecule is the multispecific antigen-binding. It is weaker than the antigen-binding activity of the two F (ab) contained in the molecule. In certain embodiments, one or both of the two F (abs) contained in the light chain exchanger molecule of the multispecific antigen binding molecule has no antigen binding activity.
- F (ab') 2 is an antibody fragment having a structure in which two F (ab) are bound (also referred to as F (ab') 2 fragment). Alternatively, it refers to a part of the antigen-binding molecule (also called F (ab') 2 part or F (ab') 2 region).
- the bond between the two F (ab) in F (ab') 2 is, for example, a disulfide bond in the immunoglobulin hinge region, but is not limited to this.
- F (ab') 2 includes part of the hinge region.
- F (ab') 2 contains two light chains and two constant regions of the CH1 and part of the CH2 domain such that disulfide bonds are formed between the two heavy chains. Includes heavy chain portion.
- F (ab') 2 may or may not have antigen-binding activity.
- all F (ab') 2 contained in the multispecific antigen binding molecule have antigen binding activity.
- the antigen-binding activity of F (ab') 2 contained in the light chain exchanger molecule of the multispecific antigen-binding molecule is F (ab') 2 contained in the multispecific antigen-binding molecule. Weaker than the antigen-binding activity of.
- F (ab') 2 contained in the light chain exchanger molecule of the bispecific antibody has no antigen binding activity.
- the antigen binding molecules provided herein are multispecific antigen binding molecules (eg, bispecific antigen binding molecules).
- a multispecific antigen-binding molecule is a monoclonal antigen-binding molecule that has binding specificity at at least two different sites.
- one of the binding specificities is for a particular antigen, such as blood coagulation factor IX (FIX), epiregulin (EREG), IL-6 receptor (IL-6R), etc.
- FIX blood coagulation factor IX
- EREG epiregulin
- IL-6R IL-6 receptor
- the other is for any other antigen (eg, blood coagulation factor X (FX), GPC3, KLH, etc.).
- the multispecific antigen binding molecule may bind to two different epitopes on one antigen.
- the multispecific antigen binding molecule comprises one antigen binding site that has binding specificity for two or more different antigens.
- a multispecific antigen binding molecule comprises a first antigen binding site for two or more different antigens and a second antigen binding site for one antigen.
- the multispecific antigen-binding molecule is a molecule having two different antigen-binding sites and having binding specificity for three or more different antigens.
- the multispecific antigen binding molecule can be prepared as a full-length antibody or as an antibody fragment.
- Multispecific antigen-binding molecules manipulate electrostatic steering effects to create Fc heterodimer molecules (WO2009 / 089004A1); cross-linking two or more antibodies or fragments (WO2009 / 089004A1). See US Pat. No.
- the composition comprising the multispecific antigen binding molecule provided herein is treated with F (ab'. ) Generate a fragment.
- “treating” or “treating” the composition means that the composition is cleaved with a multispecific antigen-binding molecule and / or a light chain exchanger molecule to produce F (ab).
- the treatment is performed, and can be carried out by a method known to those skilled in the art.
- To "cleave" a molecule means, for example, to separate the bonds between amino acid residues and disulfide bonds in the molecule.
- a protease can be added to the composition to cleave the multispecific antigen-binding molecule and / or the light chain exchanger molecule.
- Proteases are GingisKHAN® (Kgp), FabRICATOR® (IdeS), FabRICATOR® Z (IdeZ), FabALACTICA® (IgdE), FabULOUS® (SpeB).
- Bacterial antibody-degrading enzymes such as Genovis), pepsin, papain, Lys-C, etc. can be used.
- the Fc side of the hinge portion of the multispecific antigen-binding molecule and / or the light chain exchanger molecule can be cleaved, and the F (ab) side can be cleaved.
- an F (ab) fragment is generated by cutting (see FIG. 7). After the F (ab) fragment is generated in this way, the F (ab) fragment can be obtained by adsorbing the Fc fragment on the protein A column and removing it.
- an F (ab') 2 fragment is generated (see FIG. 6).
- F (ab') 2 fragment Acquisition of the F (ab') 2 fragment is also possible by reacting the antibody with ficin under conditions that produce the F (ab') 2 fragment.
- An F (ab') 2 fragment can be obtained by partially digesting an antigen-binding molecule (for example, a fully monoclonal antibody) with these proteases and then adsorbing and removing the Fc fragment on a protein A column. The disulfide bond of the F (ab') 2 fragment can then be cleaved with a reducing agent to produce an F (ab) fragment (also referred to as a Fab'fragment) (see FIG. 6).
- a reducing agent TCEP, 2-MEA, Cysteine, Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, 3-mercapto-1,2-propanediol, TBP and the like can be used.
- host cell refers to cells into which foreign nucleic acids have been introduced, including progeny of such cells. ..
- Host cells include “transformants” and “transformants”, which include primary transformants and progeny derived from those cells regardless of the number of passages.
- the offspring do not have to be exactly the same in the content of the parent cell and nucleic acid and may contain mutations.
- Variant progeny with the same function or biological activity as those used when the original transformed cells were screened or selected are also included herein.
- vector refers to a nucleic acid molecule that can augment another nucleic acid to which it is linked.
- the term includes a vector as a self-replicating nucleic acid structure and a vector incorporated into the genome of the host cell into which it has been introduced. Certain vectors can result in the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are also referred to herein as "expression vectors.”
- Antigen-binding molecules can be prepared using recombinant methods and configurations, as described, for example, in US Pat. No. 4,816,567.
- an isolated nucleic acid encoding an antigen-binding molecule is used.
- Such nucleic acids may encode an amino acid sequence comprising the VL of the antigen binding molecule and / or an amino acid sequence comprising VH (eg, the light chain and / or heavy chain of the antigen binding molecule).
- One or more vectors containing such nucleic acids eg, expression vectors
- a host cell containing such a nucleic acid or vector is used.
- the host cell comprises (1) a vector containing a nucleic acid encoding an amino acid sequence containing VL of the antigen-binding molecule and an amino acid sequence containing VH of the antigen-binding molecule, or (2) antigen binding. It comprises a first vector containing a nucleic acid encoding an amino acid sequence containing VL of a molecule and a second vector containing a nucleic acid encoding an amino acid sequence containing VH of an antigen binding molecule (eg, transformed).
- the host cell is a eukaryotic cell (eg, Chinese hamster ovary (CHO) cell) or a lymphoid cell (eg, Y0, NS0, Sp2 / 0 cell).
- a eukaryotic cell eg, Chinese hamster ovary (CHO) cell
- a lymphoid cell eg, Y0, NS0, Sp2 / 0 cell.
- the host cell containing the nucleic acid encoding the antigen-binding molecule is cultured as described above, and optionally, the antigen-binding molecule is used as the host cell (or host).
- a method for making an antigen-binding molecule which comprises recovering from a cell culture medium), is provided.
- the nucleic acid encoding the antigen-binding molecule is isolated and inserted into one or more vectors for further cloning and / or expression in the host cell.
- Such nucleic acids will be readily isolated and sequenced using conventional procedures (eg, oligonucleotides capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of antigen-binding molecules. By using a probe).
- Suitable host cells for cloning or expression of the vector encoding the antigen-binding molecule include the prokaryotic or eukaryotic cells described herein.
- the antigen-binding molecule may be made in bacteria, especially if glycosylation and Fc effector functions are not required. See, for example, US Pat. Nos. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523 for expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria. (In addition, see Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, which describes the expression of antibody fragments in E. coli. ) After expression, the antigen-binding molecule may be isolated from the bacterial cell paste in a soluble fragment and can be further purified.
- Eukaryotes as well as filamentous fungi or yeasts, including strains of fungi and yeasts whose glycosylation pathways are "humanized", resulting in the production of antigen-binding molecules with partial or complete human glycosylation patterns, etc.
- Eukaryotic microorganisms are suitable cloning or expression hosts for antigen-binding molecular coding vectors. See Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) and Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).
- invertebrates and vertebrates are also suitable host cells for the expression of glycosylated antigen-binding molecules.
- invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains have been identified that are used for conjugation with insect cells, especially for transformation of Spodoptera frugiperda cells.
- Plant cell cultures can also be used as hosts. See, for example, U.S. Pat. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, and 6,417,429 (described PLANTIBODIES TM technology for producing antigen-binding molecules in transgenic plants). ..
- Vertebrate cells can also be used as hosts.
- a mammalian cell line adapted to grow in a suspended state would be useful.
- Another example of a useful mammalian host cell line is the SV40-transformed monkey kidney CV1 strain (COS-7); human fetal kidney strain (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977). ); 293 or 293 cells described in, etc.); Mammal hamster kidney cells (BHK); Mammalian cell line cells (TM4 cells described in Mather, Biol. Reprod.
- Monkey kidney cells (CV1) ); African green monkey kidney cells (VERO-76); Human cervical cancer cells (HELA); Canine kidney cells (MDCK); Buffalo rat hepatocytes (BRL 3A); Human lung cells (W138); Human hepatocytes (W138) Hep G2); Mammalian breast cancer (MMT 060562); TRI cells (for example, described in Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC5 cells; and FS4 cells.
- Other useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells, including DHFR-CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl.
- Multispecific antigen-binding molecule H1L1 / H2L2 and its light chain exchanger molecule (H1L2 / H2L1)
- the first F (ab) containing or consisting of a first heavy chain variable domain (VH contained in H1) and a first light chain variable domain (VL contained in L1) is H1L1
- the second F (ab) containing or consisting of a second heavy chain variable domain (VH contained in H2) and a second light chain variable domain (VL contained in L2) is called H2L2, and is called H1L1 and H2L2.
- Multispecific antigen-binding molecules containing the above are called H1L1 / H2L2.
- the third F (ab) containing or consisting of the first heavy chain variable domain (VH contained in H1) and the second light chain variable domain (VL contained in L2) is H1L2, the second.
- a molecule containing or consisting of a heavy chain variable domain (VH contained in H2) and a first light chain variable domain (VL contained in L1) is called H2L1 and contains H1L2 and H2L1. That is, the light chain exchanger molecule of H1L1 / H2L2 is called H1L2 / H2L1. Therefore, the light chain exchanger molecule in the present specification is an inverted combination of two different heavy chains and two different light chains constituting the target multispecific antigen-binding molecule (causing mispair).
- the light chain exchanger molecule H1L2 / H2L1 can be included as an impurity in a composition comprising the multispecific antigen binding molecule H1L1 / H2L2.
- the multispecific antigen binding molecule H1L1 / H2L2 comprises or consists of a first heavy chain variable (VH) domain and a CH1 domain with a heavy chain moiety (H1) and a first light chain variable (VL).
- a first F (ab) (called H1L1) containing or consisting of a domain and a light chain portion (L1) comprising or consisting of a CL domain, and a second heavy chain variable (VH) domain and CH1.
- F (ab) (called H2L2).
- H1L2 a third F (referred to as H1L2) containing or consisting of a second light chain variable (VL) domain and a light chain portion (L2) comprising or consisting of a CL domain
- H2L1 a third F (ab) containing or consisting of a second light chain variable (VL) domain and a light chain portion (L2) comprising or consisting of a CL domain
- H2L1 a third F (ab) containing or consisting of a second light chain variable (VL) domain and a light chain portion (L2) comprising or consisting of a CL domain
- H2L1 a third F (referred to as H1L2) containing or consisting of a second light chain variable (VL) domain and a light chain portion (L2) comprising or consisting of a CL domain
- H2L1 a third F (referred to as H1L2) containing or consisting of a second light chain variable (VL) domain and a light chain portion (L2) comprising or consist
- both H1L1 and H2L2 have antigen-binding activity.
- H2L1, which is the fourth F (ab) may or may not have antigen-binding activity, respectively.
- one or both of H1L2 and H2L1 have antigen-binding activity.
- the antigen-binding activity of one or both of H1L2 and H2L1 is weaker than the antigen-binding activity of one or both of H1L1 and H2L2.
- one or both of H1L2 and H2L1 have no antigen-binding activity.
- the present disclosure relates to impurity molecules (eg, light chain exchanger molecules) in compositions containing multispecific antigen binding molecules.
- impurity molecules eg, light chain exchanger molecules
- the present disclosure provides a method for detecting an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule) in a composition comprising a multispecific antigen binding molecule.
- the disclosure provides a method of measuring the content and / or content ratio of an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule) in a composition comprising a multispecific antigen binding molecule.
- the present disclosure provides a method for analyzing a multispecific antigen-binding molecule and an impurity molecule in a composition comprising a multispecific antigen-binding molecule and an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule).
- the disclosure provides a method of detecting an impurity molecule in a composition comprising a multispecific antigen binding molecule and an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule).
- the present disclosure describes the content and / or content of multispecific antigen-binding molecules and impurity molecules in a composition comprising a multispecific antigen-binding molecule and an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule).
- a method for measuring the present disclosure measures the content and / or content ratio of a multispecific antigen-binding molecule in a composition comprising a multispecific antigen-binding molecule and an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule).
- the disclosure provides a method of measuring the purity of a multispecific antigen-binding molecule in a composition comprising a multispecific antigen-binding molecule and an impurity molecule (eg, a light chain exchanger molecule).
- the methods of the present disclosure include steps 1-2: 1) The step of treating a composition containing a multispecific antigen-binding molecule to produce a plurality of F (ab) fragments; and 2) the plurality of F (ab) fragments by a separation method based on a charge or hydrophobic interaction. To determine the content of the light chain exchanger molecule in the composition or the content ratio of the light chain exchanger molecule to the multispecific antigen-binding molecule.
- step 1 is a step of cleaving the F (ab) side of the hinge portion of the molecule contained in the composition with a protease.
- step 1 is treated with a protease that cleaves the F (ab) region side of the immunoglobulin hinge region (the hinge portion of the antigen binding molecule) under conditions that produce an F (ab) fragment.
- ab Includes generating fragments.
- proteases include papain, Lys-C, GingisKHAN® (Genovis), FabALACTICA® (Genovis), ficin.
- step 1 comprises the following steps 1-1 and 1-2: 1-1) A step of cleaving the molecule contained in the composition to produce an F (ab) '2 fragment; and 1-2) Cleaving the F (ab)' 2 fragment to produce two or more types of F (ab) The process of producing a fragment.
- step 1-1 is a step of cleaving the Fc side of the hinge portion of the molecule contained in the composition with a protease.
- step 1-1 comprises treatment with a protease that cleaves the Fc region side of the immunoglobulin hinge region (the hinge portion of the antigen binding molecule) under conditions that produce an F (ab) '2 fragment. ..
- step 1-2 is the step of cleaving the disulfide bond of the F (ab) '2 fragment with a reducing agent.
- reducing agents include TCEP, 2-MEA, Cysteine, Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, 3-mercapto-1,2-propanediol, TBP.
- the treatment with the reducing agent is carried out under conditions that cleave the disulfide bond at the hinge portion (immunoglobulin hinge region) of the F (ab) '2 fragment, such conditions are known to those of skill in the art. ..
- step 2 can be performed by a separation method based on charge or hydrophobic interaction known to those skilled in the art.
- separation methods include cation exchange (CEX) chromatography, anion exchange (AEX) chromatography, hydrophobic interaction chromatography (HIC), and reverse phase chromatography. Not limited to.
- the two or more types of F (ab) fragments generated in step 1 have different isoelectric points.
- at least one amino acid residue constituting the F (ab) fragment of H1L1, H2L2, H1L2, H2L1 is modified so that the isoelectric point of each F (ab) fragment is different. It is configured.
- the multispecific antigen binding molecule comprises the following impurities (1)-(8): (1) A homodimer (H1L1 / H1L1) of the first F (ab) (H1L1) containing the first heavy chain variable domain and the first light chain variable domain. (2) A homodimer (H2L2 / H2L2) of a second F (ab) (H2L2) containing a second heavy chain variable domain and a second light chain variable domain. (3) A homodimer (H1L2 / H1L2) of a third F (ab) (H1L2) containing a first heavy chain variable domain and a second light chain variable domain.
- Heterodimer (H2L2 / H2L1) containing four F (ab) (H2L1) It is a molecule in which amino acid residues are modified so as to provide a difference in isoelectric point between and.
- the composition containing the multispecific antigen-binding molecule has impurities (1) to (8) removed by a purification step utilizing the difference in isoelectric points.
- the multispecific antigen-binding molecule is a bispecific antibody.
- the bispecific antibody comprises a first and second heavy chain with a pI (isoelectric point) difference.
- Such heavy chains include heavy chain variable domains with pI differences and / or heavy chain constant domains with pI differences.
- Examples of the heavy chain constant domain having a pI difference include the heavy chain constant region of an antibody having a pI difference.
- a pI difference can be introduced into the second heavy chain, only amino acids due to the difference in isoelectric points between these subclasses in the heavy chain constant region in the first and second heavy chains, or theirs.
- Non-wild human constant regions can be created by simultaneously modifying adjacent amino acids that do not affect the isoelectric point, and pI differences can be introduced into the two constant regions.
- Modifications to introduce the pI difference into the constant region include, for example, EU numbering of the heavy chain constant region, H chain 137th, 196th, 203rd, 214th, 217th, 233rd, 268th, 274th. , 276th, 297th, 355th, 392th, 419th, 435th.
- the 297th sugar chain addition site is also listed as a modification site for introducing the pI chain.
- the amino acid residue at a specific position in the heavy chain variable domain in the first and second heavy chains can be modified to introduce a pI difference into the two heavy chain variable domains. ..
- a heavy chain variable domain having such a pI difference for example, an amino acid residue at a specific position in the first heavy chain variable domain has an electric charge, and an amino acid residue at that position in the second heavy chain variable domain is used.
- the group may have or have no charge opposite to the amino acid residue at that position in the first heavy chain variable domain.
- bispecific antibodies are Kabat numbered 1st, 3rd, 5th, 8th, 10th, 12th, 13th, 15th, 16th, 19th, etc. in heavy chain variable domains.
- the bispecific antibody combines F (ab) that binds to blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX and F (ab) that binds to blood coagulation factor X. It is an antibody containing.
- composition comprising a multispecific antigen binding molecule or bispecific antibody is a pharmaceutical composition.
- the method of the present disclosure is a quality control method (or quality evaluation method) for a pharmaceutical composition, which comprises the following steps 1 to 3. 1) A step of treating a composition containing a multispecific antigen-binding molecule to generate a plurality of F (ab) fragments; 2) The plurality of F (ab) fragments are measured by a separation method based on charge or hydrophobic interaction, and the content of the light chain exchanger molecule in the composition or the light chain exchanger molecule with respect to the multispecific antigen-binding molecule is measured. The step of determining the content ratio of Process to do
- the present disclosure provides a drug substance whose quality is guaranteed by the above quality control method (or quality evaluation method).
- ⁇ F (ab) of multispecific antigen-binding molecule and its light chain exchanger molecule a heavy chain portion (H1) containing a first heavy chain variable (VH) domain and a CH1 domain, and a light chain portion (L1) containing a first light chain variable (VL) domain and a CL domain.
- the first F (ab) containing is called H1L1
- the second light chain variable (VL) domain and CL domain is called H2L2.
- a homodimer containing only H1L1 in the Fab portion is represented as H1L1 / H1L1, and a homodimer containing only H2L2 is represented as H2L2 / H2L2.
- a multispecific antigen-binding molecule containing H1L1 and H2L2 in the Fab portion is represented as H1L1 / H2L2. It also contains a heavy chain portion (H1) containing a first heavy chain variable (VH) domain and a CH1 domain, and a light chain portion (L2) containing a second light chain variable (VL) domain and CL domain.
- the third F (ab) is H1L2, a heavy chain portion (H2) containing a second heavy chain variable (VH) domain and a CH1 domain, and a light chain portion containing a first light chain variable (VL) domain and a CL domain.
- the fourth F (ab) including (L1) is called H2L1.
- a homodimer containing only H1L2 in the Fab portion is represented as H1L2 / H1L2, and a homodimer containing only H2L1 is represented as H2L1 / H2L1.
- H1L2 / H2L1 a molecule containing H1L2 and H2L1 in the Fab portion, that is, a light chain exchanger molecule of the multispecific antigen-binding molecule H1L1 / H2L2 is called H1L2 / H2L1.
- the amino acid sequences of each homodimer, multispecific antigen-binding molecule, and light chain exchanger molecule used in this example are shown in Table 1 below.
- Example 1 Separation of F (ab) fragment contained in anti-FIX (a) / anti-FX bispecific antibody and its impurity molecule (light chain exchanger molecule) Anti-FIX (a) shown in Table 1. ) An expression vector encoding each homodimer consisting of a heavy chain and a light chain of an antibody and an anti-FX antibody was introduced into HEK cells, cultured for 4 days, and then the culture supernatant was collected. Purification with a protein A column produced samples containing the homodimers H1L1 / H1L1, H2L2 / H2L2, H1L2 / H1L2, and H2L1 / H2L1.
- FabRICATOR Genovis
- TCEP Thermo Fisher Scientific
- a final concentration of 5 mM was added to prepare a sample containing F (ab) fragments of H1L1, H2L2, H1L2, and H2L1.
- This sample was subjected to CEX analysis according to the method shown in Example 5. The results are shown in FIG. Peaks from each F (ab) fragment were observed at different elution times. That is, the F (ab) domains H1L1, H2L2, H1L2, and H2L1 contained in anti-FIX (a) / anti-FX bispecific antibodies and light chain exchanger molecules were eluted at different retention times.
- Example 2 Separation of anti-EREG / anti-GPC3 bispecific antibody and F (ab) fragment contained in its impurity molecule (light chain exchanger molecule) Anti-EREG antibody and anti-GPC3 antibody shown in Table 1.
- An expression vector encoding each homoantibody consisting of a heavy chain and a light chain was introduced into HEK cells, cultured for 4 days, and then the culture supernatant was collected. Purification with a protein A column produced samples containing the homodimers H1L1 / H1L1, H2L2 / H2L2, H1L2 / H1L2, and H2L1 / H2L1.
- Example 3 Separation of anti-IL-6R / anti-KLH bispecific antibody and F (ab) fragment contained in its impurity molecule (light chain exchanger molecule) Anti-IL-6R antibody shown in Table 1.
- An expression vector encoding each homoantibody consisting of a heavy chain and a light chain of the anti-KLH antibody was introduced into HEK cells, cultured for 4 days, and then the culture supernatant was collected. Purification with a protein A column produced samples containing the homodimers H1L1 / H1L1, H2L2 / H2L2, H1L2 / H1L2, and H2L1 / H2L1.
- Example 4 Quantification of the content ratio of impurity molecules in a mixed sample of anti-IL-6R / anti-KLH bispecific antibody and its impurity molecule (light chain exchanger molecule) Anti-IL-listed in Table 1.
- Expression vectors encoding 6R / anti-KLH bispecific antibody (H1L1 / H2L2) and its light chain exchanger molecule (H1L2 / H2L1) were introduced into HEK cells, respectively, cultured for 4 days, and then the culture supernatant was collected. bottom. Purification with a protein A column produced anti-IL-6R / anti-KLH bispecific antibody H1L1 / H2L2 and light chain exchanger molecule H1L2 / H2L1.
- CEX analysis of a sample containing F (ab) Analysis was performed using a Prominence (Shimadzu Corporation) device. 20 mM MES-NaOH, pH 5.5 was used for mobile phase A, and 20 mM MES-NaOH, 500 mM NaCl, pH 5.5 were used for mobile phase B, respectively.
- a ProPAC WCX-10 4 ⁇ 250 mm (Thermo Fisher Scientific) column was attached and equilibrated under conditions of a flow rate of 0.5 mL / min, B 1%, and a column temperature of 25 ° C. 10 ⁇ g of the prepared sample containing each F (ab) was injected into the column. Cation exchange chromatography (CEX) was performed by increasing B% at a rate of 1% / min while feeding at a flow rate of 0.5 mL / min. Peak detection was performed using an absorbance value of 280 nm.
- the method of the present disclosure can accurately measure the content or ratio of impurity molecules (for example, light chain exchanger molecules) in a composition containing a multispecific antigen-binding molecule, and estimates the values using theoretical calculations. It is useful compared to conventional analytical methods that only obtain.
- impurity molecules for example, light chain exchanger molecules
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Abstract
本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における軽鎖交換体分子の含有量を測定する分析方法を提供する。本開示の分析方法は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理して複数種のF(ab)フラグメントを調製する工程、および当該F(ab)フラグメントを電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により測定して、各フラグメントの含有量（含有比率）を求める工程を含む。
Description
本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子の分析方法に関する。より具体的には、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物において、当該多重特異性抗原結合分子の軽鎖の掛違いにより生じた軽鎖交換体分子の含有量を定量する方法に関し、組成物に含まれる分子を処理して複数種のF(ab)フラグメントを生成する工程と、当該F(ab)フラグメントを測定して、各フラグメントの含有量または含有比率を測定する工程とを含む。
非共通軽鎖の多重特異性抗原結合分子（特に二重特異性抗体）では、2種類の重鎖（H1, H2）と2種類の軽鎖（L1, L2）を有すため、培養工程において目的分子（H1L1/H2L2）の他に、重鎖同士、または重鎖と軽鎖の掛違いによる不純物分子が9種生成される（図５）。これらの不純物分子を抑制するために、Knobs-into-holesと呼ばれる技術（特許文献１）や、重鎖間または重鎖-軽鎖間の電荷制御を利用した技術（特許文献２、特許文献３）が知られている。また、生成された不純物分子について、重鎖、軽鎖のアミノ酸残基に改変を導入し、目的分子と不純物分子とのpI差を利用して、クロマトグラフィーにより分離して除去する技術が知られている（特許文献４）。
しかし、pI差を利用した分離方法では、不純物分子のうち8種までは分離可能であるが、H1, H2とペアになるべきL1, L2が反転した残り1種の不純物分子（H1L2/H2L1、以下「軽鎖交換体分子」と呼ぶ）については、理論pIを含む物理的性質が目的分子と共通するため、分離することができない。したがって、精製工程を終えて得られた組成物中の軽鎖交換体分子の含有の有無、および含有量または含有比率を正確に測定する手法が品質管理上求められる。
しかし、pI差を利用した分離方法では、不純物分子のうち8種までは分離可能であるが、H1, H2とペアになるべきL1, L2が反転した残り1種の不純物分子（H1L2/H2L1、以下「軽鎖交換体分子」と呼ぶ）については、理論pIを含む物理的性質が目的分子と共通するため、分離することができない。したがって、精製工程を終えて得られた組成物中の軽鎖交換体分子の含有の有無、および含有量または含有比率を正確に測定する手法が品質管理上求められる。
Yinらは、軽鎖交換体分子を含む不純物分子の分析方法を開示する（非特許文献１）。この文献では、各分子をF(ab)に分離し、質量分析を行い、その質量分析結果と重鎖-軽鎖の組合せの確率に基づく理論計算を使って、各分子の含有量の推定値を算出する方法を用いる。しかし、この方法は、分析結果から直接的に含有量を測るのでなく、理論計算を用いて推定値を得るに留まるため、軽鎖交換体分子の正確な定量ができない。
Yin et.al.,MABS2016, VOL. 8, NO. 8, 1467-1476
本開示中の発明は上記のような状況に鑑みてなされたものであり、非限定的な一態様において、組成物中に含まれる目的の多重特異性抗原結合分子と軽鎖交換体分子を区別して定量する分析方法を提供することを目的とする。
非限定的な一態様において、本発明者らは、鋭意研究の結果、多重特異性抗原結合分子および軽鎖交換体分子に含まれるF(ab)フラグメントの組み合わせの違いを利用して、組成物中に含まれる多重特異性抗原結合分子および軽鎖交換体分子の含有量（含有比率）を測定する分析方法を見出した。具体的には、組成物に含まれる分子を処理して複数種のF(ab)フラグメントを生成し、その電荷差等を利用して各F(ab)フラグメントを分離し、それぞれの含有量（含有比率）を測定することで、組成物中の軽鎖交換体分子の含有の有無、および含有量または含有比率を測定することを可能にしたものである。
本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
[１] 多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、軽鎖交換体分子の分析方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
分析方法は以下の工程１～２を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程
[２] 工程１は、以下の工程１－１と１－２を含む、[１]の方法。
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
[３] 工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である、[２]の方法。
[４] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、ペプシン、フィシンのいずれか又はこれらの組合せである、[３]の方法。
[５] 工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である、[２]～[４]のいずれかの方法。
[６] 還元剤がTCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPのいずれか又はこれらの組み合わせである、[５]の方法。
[７] 工程１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のF(ab)側を切断する工程である、[１]の方法。
[８] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、パパイン、Lys-Cのいずれか又はこれらの組合せである、[７]の方法。
[９] 工程２は、陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィーのいずれか又はこれらの組合せにより、2種以上のF(ab)フラグメントを測定する工程である、[１]～[８]のいずれかの方法。
[１０] 工程１で生成する2種以上のF(ab)フラグメントはそれぞれ等電点が異なる、[１]～[９]のいずれかに記載の方法。
[１１] 多重特異性抗原結合分子(H1L1/H2L2)は、以下の不純物（１）～（８）との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である、[１]～[１０]のいずれかの方法。
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1）
[１２] 多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている、[１１]の方法。
[１３] 多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である、[１]～[１２]のいずれかの方法。
[１４] 二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である、[１３]の方法。
[１５] 多重特異性抗原結合分子または二重特異性抗体を含む組成物は医薬組成物である、[１]～[１４]のいずれかの方法。
[１６] 二重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子に結合するF(ab)と、血液凝固第X因子に結合するF(ab)とを含む抗体である、[１３]または[１４]の方法。
[１７] 多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物の品質管理方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
品質管理方法は以下の工程１～３を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程
３）工程２で求められた軽鎖交換体分子の含有量または含有比率が、予め設定された含有量／含有比率の許容値以下であることを確認する工程
[１８] 多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物の品質評価方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
品質評価方法は以下の工程１～３を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程
３）工程２で求められた軽鎖交換体分子の含有量または含有比率が、予め設定された含有量／含有比率の許容値以下であることを確認する工程
[１９] 工程１は、以下の工程１－１と１－２を含む、[１７]または[１８]の方法。
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
[２０] 工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である、[１９]の方法。
[２１] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、ペプシン、フィシンのいずれか又はこれらの組合せである、[２０]の方法。
[２２] 工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である、[１９]～[２１]のいずれかの方法。
[２３] 還元剤がTCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPのいずれか又はこれらの組み合わせである、[２２]の方法。
[２４] 工程１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のF(ab)側を切断する工程である、[１７]または[１８]の方法。
[２５] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、パパイン、Lys-Cのいずれか又はこれらの組合せである、[２４]の方法。
[２６] 工程２は、陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィーのいずれか又はこれらの組合せにより、2種以上のF(ab)フラグメントを測定する工程である、[１７]～[２５]のいずれかの方法。
[２７] 工程１で生成する2種以上のF(ab)フラグメントはそれぞれ等電点が異なる、[１７]～[２６]のいずれかに記載の方法。
[２８] 多重特異性抗原結合分子(H1L1/H2L2)は、以下の不純物（１）～（８）との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である、[１７]～[２７]のいずれかの方法。
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1）
[２９] 多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている、[２８]の方法。
[３０] 多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である、[１７]～[２９]のいずれかの方法。
[３１] 二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である、[３０]の方法。
[３２] 多重特異性抗原結合分子または二重特異性抗体を含む組成物は医薬組成物である、[１７]～[３１]のいずれかの方法。
[３３] 二重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子に結合するF(ab)と、血液凝固第X因子に結合するF(ab)とを含む抗体である、[３０]または[３１]の方法。
[３４] [１７]～[３３]のいずれかの品質管理方法または品質評価方法により品質の担保された、医薬品原体。
[１] 多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、軽鎖交換体分子の分析方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
分析方法は以下の工程１～２を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程
[２] 工程１は、以下の工程１－１と１－２を含む、[１]の方法。
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
[３] 工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である、[２]の方法。
[４] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、ペプシン、フィシンのいずれか又はこれらの組合せである、[３]の方法。
[５] 工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である、[２]～[４]のいずれかの方法。
[６] 還元剤がTCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPのいずれか又はこれらの組み合わせである、[５]の方法。
[７] 工程１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のF(ab)側を切断する工程である、[１]の方法。
[８] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、パパイン、Lys-Cのいずれか又はこれらの組合せである、[７]の方法。
[９] 工程２は、陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィーのいずれか又はこれらの組合せにより、2種以上のF(ab)フラグメントを測定する工程である、[１]～[８]のいずれかの方法。
[１０] 工程１で生成する2種以上のF(ab)フラグメントはそれぞれ等電点が異なる、[１]～[９]のいずれかに記載の方法。
[１１] 多重特異性抗原結合分子(H1L1/H2L2)は、以下の不純物（１）～（８）との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である、[１]～[１０]のいずれかの方法。
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1）
[１２] 多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている、[１１]の方法。
[１３] 多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である、[１]～[１２]のいずれかの方法。
[１４] 二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である、[１３]の方法。
[１５] 多重特異性抗原結合分子または二重特異性抗体を含む組成物は医薬組成物である、[１]～[１４]のいずれかの方法。
[１６] 二重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子に結合するF(ab)と、血液凝固第X因子に結合するF(ab)とを含む抗体である、[１３]または[１４]の方法。
[１７] 多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物の品質管理方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
品質管理方法は以下の工程１～３を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程
３）工程２で求められた軽鎖交換体分子の含有量または含有比率が、予め設定された含有量／含有比率の許容値以下であることを確認する工程
[１８] 多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物の品質評価方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
品質評価方法は以下の工程１～３を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程
３）工程２で求められた軽鎖交換体分子の含有量または含有比率が、予め設定された含有量／含有比率の許容値以下であることを確認する工程
[１９] 工程１は、以下の工程１－１と１－２を含む、[１７]または[１８]の方法。
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
[２０] 工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である、[１９]の方法。
[２１] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、ペプシン、フィシンのいずれか又はこれらの組合せである、[２０]の方法。
[２２] 工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である、[１９]～[２１]のいずれかの方法。
[２３] 還元剤がTCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPのいずれか又はこれらの組み合わせである、[２２]の方法。
[２４] 工程１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のF(ab)側を切断する工程である、[１７]または[１８]の方法。
[２５] プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、パパイン、Lys-Cのいずれか又はこれらの組合せである、[２４]の方法。
[２６] 工程２は、陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィーのいずれか又はこれらの組合せにより、2種以上のF(ab)フラグメントを測定する工程である、[１７]～[２５]のいずれかの方法。
[２７] 工程１で生成する2種以上のF(ab)フラグメントはそれぞれ等電点が異なる、[１７]～[２６]のいずれかに記載の方法。
[２８] 多重特異性抗原結合分子(H1L1/H2L2)は、以下の不純物（１）～（８）との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である、[１７]～[２７]のいずれかの方法。
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1）
[２９] 多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている、[２８]の方法。
[３０] 多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である、[１７]～[２９]のいずれかの方法。
[３１] 二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である、[３０]の方法。
[３２] 多重特異性抗原結合分子または二重特異性抗体を含む組成物は医薬組成物である、[１７]～[３１]のいずれかの方法。
[３３] 二重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子に結合するF(ab)と、血液凝固第X因子に結合するF(ab)とを含む抗体である、[３０]または[３１]の方法。
[３４] [１７]～[３３]のいずれかの品質管理方法または品質評価方法により品質の担保された、医薬品原体。
非限定的な一態様において、本開示の分析方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー（CEX）等による測定結果から直接的に、軽鎖交換体分子の含有量を正確に測定できることを実証したものであり、理論計算を用いて推定値を得る従来の分析方法と異なる。
本開示の分析方法により、目的分子たる多重特異性抗原結合分子を含む組成物において、軽鎖交換体分子が不純物として含まれているか否か、また含まれている場合にはその含有量（含有比率）を正確に定量することが可能となった。分析対象の多重特異性抗原結合分子の分子形は限定されず、二重特異性抗体のほか、二重特異性のF(ab)’2フラグメントやscFv等にも適用可能である。また、2つの異なるF(ab)を有し、その一方のF(ab)が2つ以上の抗原に対し結合特異性を有する多重特異性抗原結合分子とすることもできる。
本開示の分析方法により、目的分子たる多重特異性抗原結合分子を含む組成物において、軽鎖交換体分子が不純物として含まれているか否か、また含まれている場合にはその含有量（含有比率）を正確に定量することが可能となった。分析対象の多重特異性抗原結合分子の分子形は限定されず、二重特異性抗体のほか、二重特異性のF(ab)’2フラグメントやscFv等にも適用可能である。また、2つの異なるF(ab)を有し、その一方のF(ab)が2つ以上の抗原に対し結合特異性を有する多重特異性抗原結合分子とすることもできる。
Ｉ．定義
抗原結合分子
本明細書で用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基（エピトープ）に特異的に結合する分子を指す。一態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、または抗体誘導体である。一態様において、抗原結合分子は、非抗体タンパク質、またはその断片、もしくはその誘導体である。
抗原結合分子
本明細書で用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基（エピトープ）に特異的に結合する分子を指す。一態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、または抗体誘導体である。一態様において、抗原結合分子は、非抗体タンパク質、またはその断片、もしくはその誘導体である。
本明細書において「特異的に結合する」とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態で結合することをいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
本開示において、「同じエピトープに結合する」とは、2つの抗原結合ドメインが結合するエピトープが少なくとも一部重複することを意味する。重複する程度は、限定されないが、少なくとも10％以上、好ましくは20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは100％重複する。
抗体
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
「結合活性（binding activity）」は、分子（例えば、抗体）の1個またはそれ以上の結合部位と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。ここで、結合活性は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用に厳密に限定されない。例えば、結合対のメンバーが１価での１：１相互作用を反映する場合、結合活性は固有の結合アフィニティ（「アフィニティ」）のことをいう。結合対のメンバーが、１価での結合および多価での結合の両方が可能である場合、結合活性は、これらの結合力の総和となる。分子XのそのパートナーYに対する結合活性は、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。結合活性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。
一局面において、本開示の方法により分析される抗原結合分子および抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験され得る。
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
本明細書において「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合し且つ相補的である領域をいう。本明細書において、抗原結合分子は抗原結合ドメインを含んで成る。抗原の分子量が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。一態様において、抗原結合ドメインは特定の抗原に結合する抗体断片を含む。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の「可変ドメイン」より提供され得る。非限定的な一態様において、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「Fab'」等が挙げられる。別の態様において、抗原結合ドメインは特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む。特定の態様において、抗原結合ドメインはヒンジ領域を含む。
可変ドメイン
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原結合分子や抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原結合分子や抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
定常領域
本発明の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは抗体定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域である。また本発明の別の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは重鎖定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域である。ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4抗体の定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。なお本発明のアミノ酸が改変された定常領域は、本発明のアミノ酸変異を含むものである限り、他のアミノ酸変異や修飾を含んでもよい。
本発明の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは抗体定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域である。また本発明の別の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは重鎖定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域である。ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4抗体の定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。なお本発明のアミノ酸が改変された定常領域は、本発明のアミノ酸変異を含むものである限り、他のアミノ酸変異や修飾を含んでもよい。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインおよびCH2ドメインを連結する、例えばEUナンバリングシステムによれば216位あたりから230位あたりまでの、またはKabatナンバリングシステムによれば226位あたりから243位あたりまでの、抗体重鎖ポリペプチド部分を意味する。天然型IgG抗体において、ヒンジ領域におけるEUナンバリング220位のシステイン残基は、抗体軽鎖における214位のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが知られている。さらに、２つの抗体重鎖の間では、ヒンジ領域におけるEUナンバリング226位のシステイン残基どうし、および229位のシステイン残基どうしがジスルフィド結合を形成することが知られている。本明細書におけるヒンジ領域は、野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
抗体断片
「抗体断片」および「抗体フラグメント」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；単鎖Fab（scFab）；シングルドメイン抗体；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
「抗体断片」および「抗体フラグメント」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；単鎖Fab（scFab）；シングルドメイン抗体；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
Fv（variable fragment）
本明細書において、「Fv（variable fragment）」という用語は、抗体の軽鎖可変領域（VL（light chain variable region））と抗体の重鎖可変領域（VH（heavy chain variable region））とのペアからなる抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位を意味する。1988年にSkerraとPluckthunは、バクテリアのシグナル配列の下流に抗体の遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性を保持した状態で大腸菌のペリプラズム画分から調製されることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvは、抗原に対する結合を有する態様でVHとVLが会合していた。
本明細書において、「Fv（variable fragment）」という用語は、抗体の軽鎖可変領域（VL（light chain variable region））と抗体の重鎖可変領域（VH（heavy chain variable region））とのペアからなる抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位を意味する。1988年にSkerraとPluckthunは、バクテリアのシグナル配列の下流に抗体の遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性を保持した状態で大腸菌のペリプラズム画分から調製されることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvは、抗原に対する結合を有する態様でVHとVLが会合していた。
scFv、単鎖抗体、またはsc(Fv)2
本明細書において、「scFv」、「単鎖抗体」、または「sc(Fv)2」という用語は、単一のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻, Rosenburg、及び、Moore編, Springer-Verlag, New York, 269～315（1994）においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO1988/001649および米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照。特定の態様において、単鎖抗体はまた、二重特異性であるか、かつ／またはヒト化され得る。
本明細書において、「scFv」、「単鎖抗体」、または「sc(Fv)2」という用語は、単一のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻, Rosenburg、及び、Moore編, Springer-Verlag, New York, 269～315（1994）においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO1988/001649および米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照。特定の態様において、単鎖抗体はまた、二重特異性であるか、かつ／またはヒト化され得る。
scFvはFvを構成するVHとVLとがペプチドリンカーによって連結された抗原結合ドメインである（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチドリンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
sc(Fv)2は二つのVLと二つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによって連結され一本鎖を構成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。この二つのVHとVLは異なるモノクローナル抗体から由来することもあり得る。例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような同一抗原中に存在する二種類のエピトープを認識する二重特異性（bispecific sc(Fv)2）も好適に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって作製され得る。例えば、scFvをペプチドリンカー等のリンカーで結ぶことによって作製され得る。
本明細書におけるsc(Fv)2を構成する抗原結合ドメインの構成としては、二つのVH及び二つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられるが、二つのVHと2つのVLの順序は特に上記の構成に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような、順序の構成も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
F(ab)
本明細書において、「F(ab)」（Fab、Fab’とも呼ばれる）は、VL（軽鎖可変領域）およびCL（軽鎖定常領域）からなる軽鎖と、重鎖のVH（重鎖可変領域）およびCH1（重鎖定常領域中のγ1領域）からなる部分とから構成され、重鎖の当該部分と軽鎖がC末端領域でジスルフィド結合により結合した構造をとり得る。また、F(ab)はヒンジ領域の一部を含み得る。抗体断片としてのF(ab)は、単にF(ab)と呼ばれるか、またはF(ab)フラグメントと呼ばれ得る。抗原結合分子（例えば、抗体）の一部分としてのF(ab)も同様に単にF(ab)と呼ばれるが、F(ab)フラグメントと区別してF(ab)部分またはF(ab)領域と呼ばれることもある。
本明細書において、F(ab)は、抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子（H1L1/H2L2）に含まれる2種のF(ab)は、いずれも抗原結合活性を有する。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子の軽鎖交換体分子（H1L2/H2L1）に含まれる2種のF(ab)の一方または両方の抗原結合活性は、当該多重特異性抗原結合分子に含まれる2種のF(ab)の抗原結合活性よりも弱い。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子の軽鎖交換体分子に含まれる2種のF(ab)の一方または両方は、抗原結合活性を有さない。
本明細書において、「F(ab)」（Fab、Fab’とも呼ばれる）は、VL（軽鎖可変領域）およびCL（軽鎖定常領域）からなる軽鎖と、重鎖のVH（重鎖可変領域）およびCH1（重鎖定常領域中のγ1領域）からなる部分とから構成され、重鎖の当該部分と軽鎖がC末端領域でジスルフィド結合により結合した構造をとり得る。また、F(ab)はヒンジ領域の一部を含み得る。抗体断片としてのF(ab)は、単にF(ab)と呼ばれるか、またはF(ab)フラグメントと呼ばれ得る。抗原結合分子（例えば、抗体）の一部分としてのF(ab)も同様に単にF(ab)と呼ばれるが、F(ab)フラグメントと区別してF(ab)部分またはF(ab)領域と呼ばれることもある。
本明細書において、F(ab)は、抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子（H1L1/H2L2）に含まれる2種のF(ab)は、いずれも抗原結合活性を有する。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子の軽鎖交換体分子（H1L2/H2L1）に含まれる2種のF(ab)の一方または両方の抗原結合活性は、当該多重特異性抗原結合分子に含まれる2種のF(ab)の抗原結合活性よりも弱い。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子の軽鎖交換体分子に含まれる2種のF(ab)の一方または両方は、抗原結合活性を有さない。
F(ab’)2
本明細書において、「F(ab’)2」（F(ab)’2とも呼ばれる）は、2つのF(ab)が結合した構造をとる抗体断片（F(ab’)2フラグメントとも呼ばれる）または抗原結合分子中の一部分（F(ab’)2部分もしくはF(ab’)2領域とも呼ばれる）を指す。F(ab’)2における2つのF(ab)の結合は、例えばイムノグロブリンヒンジ領域におけるジスルフィド結合であるが、これに限定されない。一態様において、F(ab’)2はヒンジ領域の一部を含む。一態様において、F(ab’)2は、二本の軽鎖、ならびに、2つの重鎖部分間でジスルフィド結合が形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む二本の重鎖部分を含む。
本明細書において、F(ab’)2は、抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子に含まれるF(ab’)2は、いずれも抗原結合活性を有する。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子の軽鎖交換体分子に含まれるF(ab’)2の抗原結合活性は、当該多重特異性抗原結合分子に含まれるF(ab’)2の抗原結合活性よりも弱い。特定の態様において、二重特異性抗体の軽鎖交換体分子に含まれるF(ab’)2は、抗原結合活性を有さない。
本明細書において、「F(ab’)2」（F(ab)’2とも呼ばれる）は、2つのF(ab)が結合した構造をとる抗体断片（F(ab’)2フラグメントとも呼ばれる）または抗原結合分子中の一部分（F(ab’)2部分もしくはF(ab’)2領域とも呼ばれる）を指す。F(ab’)2における2つのF(ab)の結合は、例えばイムノグロブリンヒンジ領域におけるジスルフィド結合であるが、これに限定されない。一態様において、F(ab’)2はヒンジ領域の一部を含む。一態様において、F(ab’)2は、二本の軽鎖、ならびに、2つの重鎖部分間でジスルフィド結合が形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む二本の重鎖部分を含む。
本明細書において、F(ab’)2は、抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子に含まれるF(ab’)2は、いずれも抗原結合活性を有する。例示的な一態様において、多重特異性抗原結合分子の軽鎖交換体分子に含まれるF(ab’)2の抗原結合活性は、当該多重特異性抗原結合分子に含まれるF(ab’)2の抗原結合活性よりも弱い。特定の態様において、二重特異性抗体の軽鎖交換体分子に含まれるF(ab’)2は、抗原結合活性を有さない。
多重特異性抗原結合分子
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗原結合分子）である。多重特異性抗原結合分子は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗原結合分子である。特定の態様において、結合特異性の1つは、ある特定の抗原（例えば、血液凝固第IX因子（FIX）、エピレギュリン（EREG）、IL-6受容体（IL-6R）など）に対するものであり、もう1つは他の任意の抗原（例えば、血液凝固第X因子（FX）、GPC3、KLHなど）へのものである。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、ある１つの抗原上の異なった2つのエピトープに結合してもよい。また、特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、2つ以上の異なる抗原に対して結合特異性を有する1つの抗原結合部位を含む。一例として、多重特異性抗原結合分子は、2つ以上の異なる抗原に対する第1の抗原結合部位と、1つの抗原に対する第2の抗原結合部位とを含む。当該多重特異性抗原結合分子は、2つの異なる抗原結合部位を有し、かつ3つ以上の異なる抗原に対して結合特異性をもつ分子である。多重特異性抗原結合分子は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗原結合分子）である。多重特異性抗原結合分子は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗原結合分子である。特定の態様において、結合特異性の1つは、ある特定の抗原（例えば、血液凝固第IX因子（FIX）、エピレギュリン（EREG）、IL-6受容体（IL-6R）など）に対するものであり、もう1つは他の任意の抗原（例えば、血液凝固第X因子（FX）、GPC3、KLHなど）へのものである。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、ある１つの抗原上の異なった2つのエピトープに結合してもよい。また、特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、2つ以上の異なる抗原に対して結合特異性を有する1つの抗原結合部位を含む。一例として、多重特異性抗原結合分子は、2つ以上の異なる抗原に対する第1の抗原結合部位と、1つの抗原に対する第2の抗原結合部位とを含む。当該多重特異性抗原結合分子は、2つの異なる抗原結合部位を有し、かつ3つ以上の異なる抗原に対して結合特異性をもつ分子である。多重特異性抗原結合分子は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗原結合分子を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗原結合分子は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
組成物の処理によるF(ab)フラグメント、F(ab’)2フラグメントの生成
特定の態様においては、本明細書で提供される多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、F(ab)フラグメントを生成する。当該態様において、組成物を「処理し」または「処理する」とは、組成物に対し、多重特異性抗原結合分子および／または軽鎖交換体分子を切断してF(ab)を生成するため処理を施すことであり、当業者に公知の方法で実施できる。分子を「切断する」とは、例えば、分子中のアミノ酸残基同士の結合やジスルフィド結合を分離することを指す。
処理の方法としては、例えば、組成物にプロテアーゼを添加し、多重特異性抗原結合分子および／または軽鎖交換体分子を切断することができる。プロテアーゼは、GingisKHAN（登録商標）（Kgp）、FabRICATOR（登録商標）（IdeS）、FabRICATOR（登録商標）Z（IdeZ）、FabALACTICA（登録商標）（IgdE）、FabULOUS（登録商標）（SpeB）（いずれもGenovis）などに代表される細菌由来の抗体分解酵素や、ペプシン、パパイン、Lys-Cなどを用いることができる。
プロテアーゼの処理により、多重特異性抗原結合分子および／または軽鎖交換体分子のヒンジ部のFc側を切断することもできるし、F(ab)側を切断することもできる。
F(ab)側を切断する場合は、切断によりF(ab)フラグメントを生成する（図７参照）。このようにしてF(ab)フラグメントを生成した後に、FcフラグメントをプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、F(ab)フラグメントを取得することができる。
一方、Fc側を切断する場合、F(ab’)2フラグメントを生成する（図６参照）。F(ab’)2フラグメントの取得は、F(ab’)2フラグメントを生成する条件下で抗体をフィシンと反応させることによっても可能である。これらのプロテアーゼにて抗原結合分子（例えば完全モノクローナル抗体）を部分消化した後に、FcフラグメントをプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、F(ab’)2フラグメントを取得することができる。
次いで、還元剤によりF(ab’)2フラグメントのジスルフィド結合を切断し、F(ab)フラグメント（Fab’フラグメントとも呼ばれる）を生成することができる（図６参照）。還元剤は、TCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBP等をもちいることができる。
特定の態様においては、本明細書で提供される多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、F(ab)フラグメントを生成する。当該態様において、組成物を「処理し」または「処理する」とは、組成物に対し、多重特異性抗原結合分子および／または軽鎖交換体分子を切断してF(ab)を生成するため処理を施すことであり、当業者に公知の方法で実施できる。分子を「切断する」とは、例えば、分子中のアミノ酸残基同士の結合やジスルフィド結合を分離することを指す。
処理の方法としては、例えば、組成物にプロテアーゼを添加し、多重特異性抗原結合分子および／または軽鎖交換体分子を切断することができる。プロテアーゼは、GingisKHAN（登録商標）（Kgp）、FabRICATOR（登録商標）（IdeS）、FabRICATOR（登録商標）Z（IdeZ）、FabALACTICA（登録商標）（IgdE）、FabULOUS（登録商標）（SpeB）（いずれもGenovis）などに代表される細菌由来の抗体分解酵素や、ペプシン、パパイン、Lys-Cなどを用いることができる。
プロテアーゼの処理により、多重特異性抗原結合分子および／または軽鎖交換体分子のヒンジ部のFc側を切断することもできるし、F(ab)側を切断することもできる。
F(ab)側を切断する場合は、切断によりF(ab)フラグメントを生成する（図７参照）。このようにしてF(ab)フラグメントを生成した後に、FcフラグメントをプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、F(ab)フラグメントを取得することができる。
一方、Fc側を切断する場合、F(ab’)2フラグメントを生成する（図６参照）。F(ab’)2フラグメントの取得は、F(ab’)2フラグメントを生成する条件下で抗体をフィシンと反応させることによっても可能である。これらのプロテアーゼにて抗原結合分子（例えば完全モノクローナル抗体）を部分消化した後に、FcフラグメントをプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、F(ab’)2フラグメントを取得することができる。
次いで、還元剤によりF(ab’)2フラグメントのジスルフィド結合を切断し、F(ab)フラグメント（Fab’フラグメントとも呼ばれる）を生成することができる（図６参照）。還元剤は、TCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBP等をもちいることができる。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗原結合分子は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。そのような製造の非限定的な例において、抗原結合分子をコードする単離された核酸が用いられる。そのような核酸は、抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合分子の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が用いられてもよい。例示的な態様において、このような核酸またはベクターを含む宿主細胞が用いられる。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核細胞である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、抗原結合分子の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗原結合分子を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗原結合分子を作製する方法が提供される。
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗原結合分子は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。そのような製造の非限定的な例において、抗原結合分子をコードする単離された核酸が用いられる。そのような核酸は、抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合分子の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が用いられてもよい。例示的な態様において、このような核酸またはベクターを含む宿主細胞が用いられる。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核細胞である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、抗原結合分子の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗原結合分子を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗原結合分子を作製する方法が提供される。
抗原結合分子の組み換え製造のために、抗原結合分子をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗原結合分子の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
抗原結合分子をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗原結合分子は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗原結合分子は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗原結合分子の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗原結合分子コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗原結合分子の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗原結合分子を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR－ CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗原結合分子産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
多重特異性抗原結合分子（H1L1/H2L2）およびその軽鎖交換体分子（H1L2/H2L1）
本明細書において、第一の重鎖可変ドメイン(H1に含まれるVH)と第一の軽鎖可変ドメイン(L1に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第一のF(ab)をH1L1、第二の重鎖可変ドメイン(H2に含まれるVH)と第二の軽鎖可変ドメイン(L2に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第二のF(ab)をH2L2と呼び、H1L1とH2L2を含む多重特異性抗原結合分子をH1L1/H2L2と呼ぶ。また、第一の重鎖可変ドメイン(H1に含まれるVH)と第二の軽鎖可変ドメイン(L2に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第三のF(ab)をH1L2、第二の重鎖可変ドメイン(H2に含まれるVH)と第一の軽鎖可変ドメイン(L1に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第四のF(ab)をH2L1と呼び、H1L2とH2L1を含む分子、すなわちH1L1/H2L2の軽鎖交換体分子を、H1L2/H2L1と呼ぶ。したがって、本明細書における軽鎖交換体分子とは、目的とする多重特異性抗原結合分子を構成する2つの異なる重鎖と2つの異なる軽鎖との組合せが反転して（ミスペアを起こして）生成された不純物分子である。
非限定的な一態様において、軽鎖交換体分子H1L2/H2L1は、多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2を含む組成物中に不純物として含まれ得る。
一態様において、多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2は、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H1)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L1)とを含むまたはこれらからなる第一のF(ab)（H1L1を呼ぶ）、ならびに第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H2)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L2)とを含むまたはこれらからなる第二のF(ab)（H2L2と呼ぶ）を含む。
一態様において、多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2の軽鎖交換体分子であるH1L2/H2L1は、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H1)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L2)とを含むまたはこれらからなる第三のF(ab)（H1L2と呼ぶ）、ならびに第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H2)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L1)とを含むまたはこれらからなる第四のF(ab)（H2L1と呼ぶ）を含む。
第一のF(ab)であるH1L1、および第二のF(ab)であるH2L2は、それぞれ抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。好ましい例示的な一態様において、H1L1およびH2L2は、いずれも抗原結合活性を有する。
第三のF(ab)であるH1L2、および第四のF(ab)であるH2L1は、それぞれ抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。非限定的な一態様において、H1L2およびH2L1の一方または両方は、抗原結合活性を有する。例示的な一態様において、H1L2およびH2L1の一方または両方の抗原結合活性は、H1L1およびH2L2の一方または両方の抗原結合活性と比べて弱い。特定の態様において、H1L2およびH2L1の一方または両方は、抗原結合活性を有さない。
本明細書において、第一の重鎖可変ドメイン(H1に含まれるVH)と第一の軽鎖可変ドメイン(L1に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第一のF(ab)をH1L1、第二の重鎖可変ドメイン(H2に含まれるVH)と第二の軽鎖可変ドメイン(L2に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第二のF(ab)をH2L2と呼び、H1L1とH2L2を含む多重特異性抗原結合分子をH1L1/H2L2と呼ぶ。また、第一の重鎖可変ドメイン(H1に含まれるVH)と第二の軽鎖可変ドメイン(L2に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第三のF(ab)をH1L2、第二の重鎖可変ドメイン(H2に含まれるVH)と第一の軽鎖可変ドメイン(L1に含まれるVL)を含むまたはこれらからなる第四のF(ab)をH2L1と呼び、H1L2とH2L1を含む分子、すなわちH1L1/H2L2の軽鎖交換体分子を、H1L2/H2L1と呼ぶ。したがって、本明細書における軽鎖交換体分子とは、目的とする多重特異性抗原結合分子を構成する2つの異なる重鎖と2つの異なる軽鎖との組合せが反転して（ミスペアを起こして）生成された不純物分子である。
非限定的な一態様において、軽鎖交換体分子H1L2/H2L1は、多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2を含む組成物中に不純物として含まれ得る。
一態様において、多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2は、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H1)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L1)とを含むまたはこれらからなる第一のF(ab)（H1L1を呼ぶ）、ならびに第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H2)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L2)とを含むまたはこれらからなる第二のF(ab)（H2L2と呼ぶ）を含む。
一態様において、多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2の軽鎖交換体分子であるH1L2/H2L1は、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H1)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L2)とを含むまたはこれらからなる第三のF(ab)（H1L2と呼ぶ）、ならびに第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含むもしくはこれらからなる重鎖部分(H2)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含むもしくはこれらからなる軽鎖部分(L1)とを含むまたはこれらからなる第四のF(ab)（H2L1と呼ぶ）を含む。
第一のF(ab)であるH1L1、および第二のF(ab)であるH2L2は、それぞれ抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。好ましい例示的な一態様において、H1L1およびH2L2は、いずれも抗原結合活性を有する。
第三のF(ab)であるH1L2、および第四のF(ab)であるH2L1は、それぞれ抗原結合活性を有してもよいし、有さなくてもよい。非限定的な一態様において、H1L2およびH2L1の一方または両方は、抗原結合活性を有する。例示的な一態様において、H1L2およびH2L1の一方または両方の抗原結合活性は、H1L1およびH2L2の一方または両方の抗原結合活性と比べて弱い。特定の態様において、H1L2およびH2L1の一方または両方は、抗原結合活性を有さない。
多重特異性抗原結合分子および軽鎖交換体分子を含む組成物の分析方法
一局面において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の分析方法を提供する。本局面の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の検出方法を提供する。別の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の含有量および/または含有比率を測定する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における、多重特異性抗原結合分子および不純物分子の分析方法を提供する。本局面の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における、不純物分子の検出方法を提供する。本局面の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における多重特異性抗原結合分子および不純物分子の含有量および/または含有比率を測定する方法を提供する。別の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における多重特異性抗原結合分子の含有量および/または含有比率を測定する方法を提供する。別の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における多重特異性抗原結合分子の純度を測定する方法を提供する。
一局面において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の分析方法を提供する。本局面の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の検出方法を提供する。別の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の含有量および/または含有比率を測定する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における、多重特異性抗原結合分子および不純物分子の分析方法を提供する。本局面の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における、不純物分子の検出方法を提供する。本局面の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における多重特異性抗原結合分子および不純物分子の含有量および/または含有比率を測定する方法を提供する。別の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における多重特異性抗原結合分子の含有量および/または含有比率を測定する方法を提供する。別の一態様において、本開示は、多重特異性抗原結合分子および不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）を含む組成物における多重特異性抗原結合分子の純度を測定する方法を提供する。
一態様において、本開示の方法は、以下の工程１～２を含む：
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、複数のF(ab)フラグメントを生成する工程；ならびに
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により前記複数のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、複数のF(ab)フラグメントを生成する工程；ならびに
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により前記複数のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程。
特定の態様において、工程１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のF(ab)側を切断する工程である。特定の態様において、工程１は、F(ab)フラグメントを生成する条件下で、イムノグロブリンヒンジ領域（抗原結合分子のヒンジ部）のF(ab)領域側を切断するプロテアーゼにより処理して、F(ab)フラグメントを生成することを含む。そのようなプロテアーゼの非限定的な例として、パパイン、Lys-C、GingisKHAN（登録商標）（Genovis）、FabALACTICA（登録商標）（Genovis）、フィシンを挙げることができる。
別の特定の態様において、工程１は、以下の工程１－１と１－２を含む：
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程；ならびに
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程。
特定の態様において、工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である。特定の態様において、工程１－１は、F(ab)’2フラグメントを生成する条件下での、イムノグロブリンヒンジ領域（抗原結合分子のヒンジ部）のFc領域側を切断するプロテアーゼによる処理を含む。そのようなプロテアーゼの非限定的な例として、ペプシン、FabRICATOR（登録商標）（Genovis）、FabRICATOR（登録商標）Z（Genovis）、FabULOUS（登録商標）（Genovis）、フィシンを挙げることができる。
特定の態様において、工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である。そのような還元剤の非限定的な例として、TCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPを挙げることができる。一態様において、当該還元剤による処理は、F(ab)’2フラグメントのヒンジ部（イムノグロブリンヒンジ領域）におけるジスルフィド結合を切断する条件下で行われ、そのような条件は当業者に公知である。
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程；ならびに
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程。
特定の態様において、工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である。特定の態様において、工程１－１は、F(ab)’2フラグメントを生成する条件下での、イムノグロブリンヒンジ領域（抗原結合分子のヒンジ部）のFc領域側を切断するプロテアーゼによる処理を含む。そのようなプロテアーゼの非限定的な例として、ペプシン、FabRICATOR（登録商標）（Genovis）、FabRICATOR（登録商標）Z（Genovis）、FabULOUS（登録商標）（Genovis）、フィシンを挙げることができる。
特定の態様において、工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である。そのような還元剤の非限定的な例として、TCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPを挙げることができる。一態様において、当該還元剤による処理は、F(ab)’2フラグメントのヒンジ部（イムノグロブリンヒンジ領域）におけるジスルフィド結合を切断する条件下で行われ、そのような条件は当業者に公知である。
特定の態様において、工程２は、当業者に公知の、電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により行うことができる。そのような分離法としては、例えば、陽イオン交換（CEX）クロマトグラフィー，陰イオン交換（AEX）クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC），逆相クロマトグラフィーを挙げることができるが、これらに限定されない。
特定の態様において、工程１で生成される2種以上のF(ab)フラグメントはそれぞれ等電点が異なる。一態様において、H1L1, H2L2, H1L2, H2L1のF(ab)フラグメントを構成する少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されることにより、それぞれのF(ab)フラグメントの等電点に差異がでるように構成されている。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子(H1L1/H2L2)は、以下の不純物（１）～（８）：
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1）
との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている。
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1）
との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である。一態様において、二重特異性抗体は、pI（等電点）差を有する第一および第二の重鎖を含む。そのような重鎖は、pI差を有する重鎖可変ドメインおよび／またはpI差を有する重鎖定常ドメインを含む。
pI差を有する重鎖定常ドメインとしては、pI差を有する抗体の重鎖定常領域が挙げられ、元来pIに差のあるIgG1、IgG2、IgG3、IgG4の重鎖定常領域を用いて第一および第二の重鎖にpI差を導入することもできるし、第一および第二の重鎖中の重鎖定常領域における、これらサブクラス間の等電点の違いに起因するアミノ酸のみ、あるいはそれらの等電点には影響しない隣接するアミノ酸を同時に改変することにより非野生型ヒト定常領域を作製し、２つの定常領域にpI差を導入することもできる。定常領域にpI差を導入するための改変箇所としては、例えば重鎖定常領域のEUナンバリングで、H鎖137番目、196番目、203番目、214番目、217番目、233番目、268番目、274番目、276番目、297番目、355番目、392番目、419番目、435番目が挙げられる。また、重鎖定常領域の糖鎖を除去することによりpI差が生じることから、糖鎖付加部位の297番目もpI鎖を導入するための改変箇所として挙げられる。
重鎖可変ドメインについても同様に、第一および第二の重鎖中の重鎖可変ドメインにおける特定の位置のアミノ酸残基を改変し、２つの重鎖可変ドメインにpI差を導入することができる。そのようなpI差を有する重鎖可変ドメインとしては、例えば、第一の重鎖可変ドメインの特定の位置のアミノ酸残基が電荷を有し、第二の重鎖可変ドメインの当該位置のアミノ酸残基は、第一の重鎖可変ドメインにおける当該位置のアミノ酸残基とは反対の電荷を有するか、または電荷を有しないものを挙げることができる。
特定の態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である。特定の態様において、二重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子に結合するF(ab)と、血液凝固第X因子に結合するF(ab)とを含む抗体である。
pI差を有する重鎖定常ドメインとしては、pI差を有する抗体の重鎖定常領域が挙げられ、元来pIに差のあるIgG1、IgG2、IgG3、IgG4の重鎖定常領域を用いて第一および第二の重鎖にpI差を導入することもできるし、第一および第二の重鎖中の重鎖定常領域における、これらサブクラス間の等電点の違いに起因するアミノ酸のみ、あるいはそれらの等電点には影響しない隣接するアミノ酸を同時に改変することにより非野生型ヒト定常領域を作製し、２つの定常領域にpI差を導入することもできる。定常領域にpI差を導入するための改変箇所としては、例えば重鎖定常領域のEUナンバリングで、H鎖137番目、196番目、203番目、214番目、217番目、233番目、268番目、274番目、276番目、297番目、355番目、392番目、419番目、435番目が挙げられる。また、重鎖定常領域の糖鎖を除去することによりpI差が生じることから、糖鎖付加部位の297番目もpI鎖を導入するための改変箇所として挙げられる。
重鎖可変ドメインについても同様に、第一および第二の重鎖中の重鎖可変ドメインにおける特定の位置のアミノ酸残基を改変し、２つの重鎖可変ドメインにpI差を導入することができる。そのようなpI差を有する重鎖可変ドメインとしては、例えば、第一の重鎖可変ドメインの特定の位置のアミノ酸残基が電荷を有し、第二の重鎖可変ドメインの当該位置のアミノ酸残基は、第一の重鎖可変ドメインにおける当該位置のアミノ酸残基とは反対の電荷を有するか、または電荷を有しないものを挙げることができる。
特定の態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である。特定の態様において、二重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子に結合するF(ab)と、血液凝固第X因子に結合するF(ab)とを含む抗体である。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子または二重特異性抗体を含む組成物は医薬組成物である。
特定の態様において、本開示の方法は、以下の工程１～３を含む、医薬組成物の品質管理方法（または品質評価方法）である。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、複数のF(ab)フラグメントを生成する工程；
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により前記複数のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程；ならびに
３）工程２で求められた軽鎖交換体分子の含有量または含有比率が、予め設定された不純物分子の含有量／含有比率の許容値以下であることを確認する工程
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、複数のF(ab)フラグメントを生成する工程；
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により前記複数のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程；ならびに
３）工程２で求められた軽鎖交換体分子の含有量または含有比率が、予め設定された不純物分子の含有量／含有比率の許容値以下であることを確認する工程
特定の態様において、本開示は、上記品質管理方法（または品質評価方法）により品質の担保された医薬品原体を提供する。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
＜多重特異性抗原結合分子およびその軽鎖交換体分子のF(ab)＞
本実施例において、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H1)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L1)とを含む第一のF(ab)をH1L1と呼び、第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H2)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L2)とを含む第二のF(ab)をH2L2と呼ぶ。Fab部分にH1L1のみを含むホモ二量体をH1L1/H1L1と、H2L2のみを含むホモ二量体をH2L2/H2L2と表す。また、Fab部分にH1L1とH2L2を含む多重特異性抗原結合分子をH1L1/H2L2と表す。また、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H1)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L2)とを含む第三のF(ab)をH1L2、第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H2)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L1)とを含む第四のF(ab)をH2L1と呼ぶ。Fab部分にH1L2のみを含むホモ二量体をH1L2/H1L2と、H2L1のみを含むホモ二量体をH2L1/H2L1と表す。また、Fab部分にH1L2とH2L1を含む分子、すなわち多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2の軽鎖交換体分子を、H1L2/H2L1と呼ぶ。本実施例において用いた各ホモ二量体および多重特異性抗原結合分子、軽鎖交換体分子のアミノ酸配列を以下の表１に示す。
本実施例において、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H1)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L1)とを含む第一のF(ab)をH1L1と呼び、第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H2)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L2)とを含む第二のF(ab)をH2L2と呼ぶ。Fab部分にH1L1のみを含むホモ二量体をH1L1/H1L1と、H2L2のみを含むホモ二量体をH2L2/H2L2と表す。また、Fab部分にH1L1とH2L2を含む多重特異性抗原結合分子をH1L1/H2L2と表す。また、第一の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H1)と、第二の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L2)とを含む第三のF(ab)をH1L2、第二の重鎖可変（VH）ドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖部分(H2)と、第一の軽鎖可変（VL）ドメインおよびCLドメインを含む軽鎖部分(L1)とを含む第四のF(ab)をH2L1と呼ぶ。Fab部分にH1L2のみを含むホモ二量体をH1L2/H1L2と、H2L1のみを含むホモ二量体をH2L1/H2L1と表す。また、Fab部分にH1L2とH2L1を含む分子、すなわち多重特異性抗原結合分子H1L1/H2L2の軽鎖交換体分子を、H1L2/H2L1と呼ぶ。本実施例において用いた各ホモ二量体および多重特異性抗原結合分子、軽鎖交換体分子のアミノ酸配列を以下の表１に示す。
＜実施例１＞抗FIX(a)/抗FX二重特異性抗体およびその不純物分子（軽鎖交換体分子）に含まれるF(ab)フラグメントの分離
表1に記載されている抗FIX(a)抗体および抗FX抗体の重鎖、軽鎖からなる各ホモ二量体をコードする発現ベクターをHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、ホモ二量体H1L1/H1L1、H2L2/H2L2、H1L2/H1L2、およびH2L1/H2L1を含む試料が作製された。その後、試料にFabRICATOR（Genovis）が添加され，酵素処理が行われた。さらに，終濃度5 mMとなるTCEP（Thermo Fisher Scientific）が添加され、H1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について、実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図１に結果を示す。各F(ab)フラグメントに由来するピークが異なる溶出時間で観測された。すなわち、抗FIX(a)/抗FX二重特異性抗体および軽鎖交換体分子に含まれるF（ab）ドメインであるH1L1、H2L2、H1L2、H2L1が異なる保持時間で溶出された。
表1に記載されている抗FIX(a)抗体および抗FX抗体の重鎖、軽鎖からなる各ホモ二量体をコードする発現ベクターをHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、ホモ二量体H1L1/H1L1、H2L2/H2L2、H1L2/H1L2、およびH2L1/H2L1を含む試料が作製された。その後、試料にFabRICATOR（Genovis）が添加され，酵素処理が行われた。さらに，終濃度5 mMとなるTCEP（Thermo Fisher Scientific）が添加され、H1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について、実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図１に結果を示す。各F(ab)フラグメントに由来するピークが異なる溶出時間で観測された。すなわち、抗FIX(a)/抗FX二重特異性抗体および軽鎖交換体分子に含まれるF（ab）ドメインであるH1L1、H2L2、H1L2、H2L1が異なる保持時間で溶出された。
＜実施例2＞抗EREG/抗GPC3二重特異性抗体およびその不純物分子（軽鎖交換体分子）に含まれるF(ab)フラグメントの分離
表1に記載されている抗EREG抗体および抗GPC3抗体の重鎖、軽鎖からなる各ホモ抗体をコードする発現ベクターをHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、ホモ二量体H1L1/H1L1、H2L2/H2L2、H1L2/H1L2、およびH2L1/H2L1を含む試料が作製された。その後、試料にGingisKHAN（Genovis）が添加され、H1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について、実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図2に結果を示す。各F(ab)フラグメントに由来するピークが異なる溶出時間で観測された。すなわち、抗EREG/抗GPC3二重特異性抗体および軽鎖交換体分子に含まれるF(ab)ドメインであるH1L1、H2L2、H1L2、H2L1が異なる保持時間で溶出された。
表1に記載されている抗EREG抗体および抗GPC3抗体の重鎖、軽鎖からなる各ホモ抗体をコードする発現ベクターをHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、ホモ二量体H1L1/H1L1、H2L2/H2L2、H1L2/H1L2、およびH2L1/H2L1を含む試料が作製された。その後、試料にGingisKHAN（Genovis）が添加され、H1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について、実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図2に結果を示す。各F(ab)フラグメントに由来するピークが異なる溶出時間で観測された。すなわち、抗EREG/抗GPC3二重特異性抗体および軽鎖交換体分子に含まれるF(ab)ドメインであるH1L1、H2L2、H1L2、H2L1が異なる保持時間で溶出された。
＜実施例3＞抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体およびその不純物分子（軽鎖交換体分子）に含まれるF(ab)フラグメントの分離
表1に記載されている抗IL-6R抗体および抗KLH抗体の重鎖、軽鎖からなる各ホモ抗体をコードする発現ベクターをHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、ホモ二量体H1L1/H1L1、H2L2/H2L2、H1L2/H1L2、およびH2L1/H2L1を含む試料が作製された。その後、試料にGingisKHAN（Genovis）が添加され、H1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について、実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図3に結果を示す。各F(ab)フラグメントに由来するピークが異なる溶出時間で観測された。すなわち、抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体および軽鎖交換体分子に含まれるF(ab)ドメインであるH1L1、H2L2、H1L2、H2L1が異なる保持時間で溶出された。
表1に記載されている抗IL-6R抗体および抗KLH抗体の重鎖、軽鎖からなる各ホモ抗体をコードする発現ベクターをHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、ホモ二量体H1L1/H1L1、H2L2/H2L2、H1L2/H1L2、およびH2L1/H2L1を含む試料が作製された。その後、試料にGingisKHAN（Genovis）が添加され、H1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について、実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図3に結果を示す。各F(ab)フラグメントに由来するピークが異なる溶出時間で観測された。すなわち、抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体および軽鎖交換体分子に含まれるF(ab)ドメインであるH1L1、H2L2、H1L2、H2L1が異なる保持時間で溶出された。
＜実施例4＞抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体とその不純物分子（軽鎖交換体分子）の混合試料中における不純物分子の含有比率の定量
表1に記載されている抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体（H1L1/H2L2）およびその軽鎖交換体分子（H1L2/H2L1）をコードする発現ベクターをそれぞれHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体H1L1/H2L2と、軽鎖交換体分子H1L2/H2L1とが作製された。これらを、二重特異性抗体と軽鎖交換体分子との質量比が90：10となるように混合して試料が調製された。この試料にGingisKHAN（Genovis）が添加され，二重特異性抗体および軽鎖交換体分子から分解されたH1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について，実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図4に結果を示す。H1L1，H2L2，H1L2，H2L1の各F(ab)フラグメントに由来するピークが観測された。不純物分子由来であるH1L2およびH2L1のピークエリア値を全体のピークエリア値で割ったもの，すなわち（H1L2のピーク面積＋H2L1のピーク面積）/（H1L1のピーク面積＋H2L2のピーク面積＋H1L2のピーク面積＋H2L1のピーク面積）の計算式により，不純物分子の含有比率は10%と算出された。
表1に記載されている抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体（H1L1/H2L2）およびその軽鎖交換体分子（H1L2/H2L1）をコードする発現ベクターをそれぞれHEK細胞に導入し、4日間培養したのちに培養上清を回収した。プロテインＡカラムによる精製を行い、抗IL-6R/抗KLH二重特異性抗体H1L1/H2L2と、軽鎖交換体分子H1L2/H2L1とが作製された。これらを、二重特異性抗体と軽鎖交換体分子との質量比が90：10となるように混合して試料が調製された。この試料にGingisKHAN（Genovis）が添加され，二重特異性抗体および軽鎖交換体分子から分解されたH1L1、H2L2、H1L2、H2L1のF(ab)フラグメントを含む試料が調製された。
この試料について，実施例5に示す方法に従ってCEX分析が実施された。図4に結果を示す。H1L1，H2L2，H1L2，H2L1の各F(ab)フラグメントに由来するピークが観測された。不純物分子由来であるH1L2およびH2L1のピークエリア値を全体のピークエリア値で割ったもの，すなわち（H1L2のピーク面積＋H2L1のピーク面積）/（H1L1のピーク面積＋H2L2のピーク面積＋H1L2のピーク面積＋H2L1のピーク面積）の計算式により，不純物分子の含有比率は10%と算出された。
＜実施例5＞F(ab)を含む試料のCEX分析
Prominence（島津製作所）装置を用いて分析が行われた。移動相Aに20 mM MES-NaOH, pH 5.5が，移動相Bに20 mM MES-NaOH, 500 mM NaCl, pH 5.5がそれぞれ用いられた。ProPAC WCX-10 4×250 mm（Thermo Fisher Scientific）カラムが取り付けられ，流速0.5 mL/min，B 1%，カラム温度25℃の条件で平衡化された。調製された各F(ab)を含む試料10 μg分がカラムにインジェクションされた。0.5 mL/minの流速で送液しながらB%を1 %/minの速度で上昇させることで陽イオン交換クロマトグラフィー（CEX）が実施された。ピークの検出は280 nmの吸光値を用いて行われた。
Prominence（島津製作所）装置を用いて分析が行われた。移動相Aに20 mM MES-NaOH, pH 5.5が，移動相Bに20 mM MES-NaOH, 500 mM NaCl, pH 5.5がそれぞれ用いられた。ProPAC WCX-10 4×250 mm（Thermo Fisher Scientific）カラムが取り付けられ，流速0.5 mL/min，B 1%，カラム温度25℃の条件で平衡化された。調製された各F(ab)を含む試料10 μg分がカラムにインジェクションされた。0.5 mL/minの流速で送液しながらB%を1 %/minの速度で上昇させることで陽イオン交換クロマトグラフィー（CEX）が実施された。ピークの検出は280 nmの吸光値を用いて行われた。
本開示の方法は、多重特異性抗原結合分子を含む組成物における不純物分子（例えば軽鎖交換体分子）の含有量または含有比率を正確に測定することができ、理論計算を用いて推定値を得るに留まる従来の分析方法と比べて有用である。
Claims (15)
- 多重特異性抗原結合分子を含む組成物における、軽鎖交換体分子の分析方法であって、
多重特異性抗原結合分子は第一の抗原に対する第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の抗原に対する第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）とを含む分子(H1L1/H2L2)であり、
軽鎖交換体分子は第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含む分子(H1L2/H2L1)であり、
分析方法は以下の工程１～２を含む方法。
１）多重特異性抗原結合分子を含む組成物を処理し、2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程
２）電荷又は疎水性相互作用に基づく分離法により2種以上のF(ab)フラグメントを測定し、組成物中の軽鎖交換体分子の含有量、または多重特異性抗原結合分子に対する軽鎖交換体分子の含有比率を求める工程 - 工程１は、以下の工程１－１と１－２を含む、請求項１に記載の方法。
１－１）組成物に含まれる分子を切断してF(ab)’2フラグメントを生成する工程
１－２）F(ab)’2フラグメントを切断して2種以上のF(ab)フラグメントを生成する工程 - 工程１－１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のFc側を切断する工程である、請求項２に記載の方法。
- プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、ペプシン、フィシンのいずれか又はこれらの組合せである、請求項３に記載の方法。
- 工程１－２は、還元剤により、F(ab)’2フラグメントのジスルフィド結合を切断する工程である、請求項２～４のいずれかに記載の方法。
- 還元剤がTCEP、2-MEA、Cysteine、Dithiothreitol、2-Mercaptoethanol、3-mercapto-1,2-propanediol、TBPのいずれか又はこれらの組み合わせである、請求項５に記載の方法。
- 工程１は、プロテアーゼにより、組成物に含まれる分子のヒンジ部のF(ab)側を切断する工程である、請求項１に記載の方法。
- プロテアーゼが細菌由来の抗体分解酵素、パパイン、Lys-Cのいずれか又はこれらの組合せである、請求項７に記載の方法。
- 工程２は、陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィーのいずれか又はこれらの組合せにより、2種以上のF(ab)フラグメントを測定する工程である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
- 工程１で生成する2種以上のF(ab)フラグメントはそれぞれ等電点が異なる、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
- 多重特異性抗原結合分子(H1L1/H2L2)は、以下の不純物（１）～（８）との間で等電点に差を設けるようアミノ酸残基が改変された分子である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
（１）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）のホモ二量体（H1L1/H1L1）
（２）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）のホモ二量体（H2L2/H2L2）
（３）第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）のホモ二量体（H1L2/H1L2）
（４）第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）のホモ二量体（H2L1/H2L1）
（５）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H1L2）
（６）第一の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第一のF(ab)（H1L1）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H1L1/H2L1）
（７）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第一の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第三のF(ab)（H1L2）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H1L2）
（８）第二の重鎖可変ドメインと第二の軽鎖可変ドメインを含む第二のF(ab)（H2L2）と、第二の重鎖可変ドメインと第一の軽鎖可変ドメインを含む第四のF(ab)（H2L1）とを含むヘテロ二量体（H2L2/H2L1） - 多重特異性抗原結合分子を含む組成物は、等電点の差を利用した精製工程により不純物（１）～（８）が除去されている、請求項１１に記載の方法。
- 多重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
- 二重特異性抗体は、重鎖可変ドメインにおけるKabatナンバリングによる１位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、19位、23位、25位、26位、39位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、81位、82b位、83位、85位、86位、97位、105位、108位、110位及び112位のアミノ酸残基、及び、重鎖定常ドメインにおけるEUナンバリングによる137位、196位、203位、214位、217位、233位、268位、274位、276位、297位、355位、392位、419位及び435位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が改変された抗体である、請求項１３に記載の方法。
- 多重特異性抗原結合分子または二重特異性抗体を含む組成物は医薬組成物である、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
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