JP2022116326A - ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製 - Google Patents

ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製 Download PDF

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Abstract

【課題】プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡおよびプロテインＧの両方との結合が低減または喪失したヘテロ二量体免疫グロブリンバリアントまたはその断片、ならびにその精製方法を提供する。【解決手段】エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる群から選択され、免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、免疫グロブリン定常領域がＣＨ２および／またはＣＨ３領域であるならば、前記低減が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも３０％である、免疫グロブリンまたはその断片を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、全般的に、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法に関する。プロ
テインＡまたはＧに対する親和性を喪失させる特異的置換を、ヘテロ二量体免疫グロブリ
ンの一方の重鎖に導入できる。本発明のさらなる態様では、プロテインＡに対する親和性
を喪失させる置換をヘテロ二量体免疫グロブリンの一方の重鎖に導入でき、プロテインＧ
に対する親和性を喪失させる置換をヘテロ二量体免疫グロブリンの他方の重鎖に導入し、
そのことによりプロテインＡおよびプロテインＧ親和性クロマトグラフィーの組み合わせ
を用いてヘテロ二量体免疫グロブリンを容易に精製するための方法を提供する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンを生成するための方法は当該技術において知られており、
最も単純な方法の１つは、単一細胞中で２つの異なる免疫グロブリン鎖を発現させること
に依拠する（ＷＯ９５／３３８４４、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ＨおよびＴｈｉｅｒｆｅｌｄ
ｅｒ Ｓ）。工学的操作なしで、この単純な方法は、対象のヘテロ二量体を超えるホモ二
量体種の形成により制限される（Ｋｕｆｅｒら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．、２２（５）：２３８～２４４頁）。重鎖ヘテロ二量体形成を増加させる補
完的技術を用いる場合（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ＡＭら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．、１６（７）：６７７～６８１頁）、より多いヘテロ二量体生成が達成できる
が、著しい量の望ましくないホモ二量体がまだ生成される（Ｊａｃｋｍａｎ Ｊら、（２
０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８５（２７）：２０８５０～９頁、Ｋｌｅｉｎ
Ｃら、（２０１２）ＭＡｂｓ、４（６）：６５３～６３頁）。
親和性試薬に対するヘテロ二量体の差次的親和性に基づいてホモ二量体からヘテロ二量
体を容易に回収する技術が知られている。差次的親和性技術の最初の例は、２種の異なる
動物由来の２つの異なる重鎖であって、そのうちの一方が親和性試薬プロテインＡと結合
しない重鎖の使用を含んだ（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ Ｈら、（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１５５（１）：２１９～２２５頁）。同じ著者らは、２つの異なるヒト免疫グロブ
リンアイソタイプ（ＩＧＨＧ１およびＩＧＨＧ３）を起源とする２つの異なる重鎖であっ
て、そのうちの１つが親和性試薬プロテインＡと結合しない重鎖の使用についても記載し
た（ＩＧＨＧ３；ＵＳ６，５５１，５９２ Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ Ｈらを参照されたい）
。後者の技術の変形が、ＷＯ１０／１５１７９２（Ｄａｖｉｓ Ｓら）に記載され、これ
は、一方のヘテロ二量体重鎖における試薬プロテインＡに対する親和性を排除するための
、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、２０１（１）：２５～３４頁）により記載された２つのアミノ酸置換Ｈ４
３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆの使用を含んだ。
プロテインＡに基づく現在の差次的精製技術の欠点は、重鎖中に存在し、そのことによ
り精製方法に干渉するさらなるプロテインＡ結合部位を創出する可能性があるＶＨ３ドメ
インの寄与についてこの技術が対処していないことである。
上記の既知の差次的精製技術は、ヘテロ二量体からホモ二量体を分離することを可能に
する勾配モードのクロマトグラフィーを好ましく用いる。捕捉－溶出モードを用いて対象
のヘテロ二量体から重鎖の２つのホモ二量体を容易に分離するために、２つの異なる精製
方法を逐次的に行う必要がある。
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＩｇＧ－ＣＨ１親和性試薬との結合を低減す
るためのヘテロ二量体抗体の一方のＣＨ１ドメインの改変に基づく差次的精製技術の組み
合わせが提案されている（ＰＣＴパンフレットＷＯ１３／１３６１８６ Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｎら）。しかし、この技術の欠点は、少なくとも一方の重鎖が、両方のホモ二量体を除
去するためにＣＨ１領域を包含する必要があり、そのことによりこの技術の範囲が制限さ
れることである。よって、抗原結合部位の改変を回避するように免疫グロブリンのＦｃ領
域に限定された領域と理想的に結合して、第２の親和性試薬との結合の差を創出し、かつ
任意の抗原結合の土台に修正できる、差次的プロテインＡ精製技術を補完する技術に対す
る必要性が存在する。
細菌の表面のプロテインＡおよびプロテインＧと結合することが知られているガンマア
イソタイプの自然に存在するヒト免疫グロブリン（ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨ
Ｇ４；Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、（１９９７）、既出ならびにＮｅｚｌｉｎ ＲおよびＧｈ
ｅｔｉｅ Ｖ、（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第８２巻：１５５～２１５頁）では、各重鎖は、ＣＨ２－ＣＨ３
ドメイン界面に２つの細菌の表面タンパク質それぞれに対する結合部位を保有する。重鎖
においてプロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はオーバーラップするので、
プロテインＧ結合を低減させるまたは喪失させる特異的置換は、上記のプロテインＡベー
スの方法と同様の方法で重鎖のヘテロ二量体を精製するために有用である。さらに、プロ
テインＧに基づく差次的親和性方法は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製の新しい方策
を提供する。両方の差次的親和性方法を組み合わせることは、高い純度で、いずれの形の
勾配溶出も行うことなく重鎖のヘテロ二量体を容易に調製するために有利である。このア
プローチでは、重鎖のヘテロ二量体は、プロテインＡと結合するがプロテインＧとの結合
が低減されているかまたは結合しない一方の重鎖を有し、他方の重鎖は、プロテインＧと
結合するが、プロテインＡとの結合が低減されているかまたは結合しない。
プロテインＡまたはＧ結合に関与するアミノ酸残基は、細菌の表面タンパク質との複合
体中の免疫グロブリンの実験的に解明された結晶構造（プロテインデータバンク（ＰＤＢ
）データベース；ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）から導き出すことができるが、プロテインＡ
、プロテインＧおよびＦｃＲｎ受容体に対する結合部位は同じＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界
面にてオーバーラップするので、プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかに対する親
和性に対する効果、さらにＦｃＲｎ親和性に与えるその影響の点で、いずれの置換による
結果も予測することは不可能である。
重鎖がホモ二量体である、自然に存在する免疫グロブリンとは対照的に、本発明のヘテ
ロ二量体免疫グロブリンは、２つの異なる重鎖（重鎖のヘテロ二量体）を有し、それらに
限定されないが、全長二重特異性抗体、一価ＦＡＢ－Ｆｃ融合体および二重特異性ｓｃＦ
ｖ／ＦＡＢ Ｆｃ融合体を含む。
本発明は、全般的に、プロテインＧ、プロテインＡまたはプロテインＧおよびプロテイ
ンＡの両方との結合が低減または喪失した新規な免疫グロブリンおよびヘテロ二量体免疫
グロブリンバリアントに関する。本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の
方法も包含する。
第１の態様では、本発明は、
エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
免疫グロブリン定常領域が、
ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域
からなる群から選択され、
免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低
減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域がＣＨ２および／またはＣＨ３領域であるならば、前記低減が、
未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも３０％である、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域を含み、これは、好ましく
はヒトＩＧＨＧ由来である。免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ３領域またはＣＨ２領域を
含むことができ、好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ３およびＣＨ２領域を含
む。
免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域中で、プロテインＧとの結
合を低減するために改変されてよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５１位
、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８２位、３８５位
、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位
および４３８位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。全ての位置は、
ＥＵナンバリングシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、６３（１）：７８～８５頁）に従って番号付けされている
。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、
３１１位、３８０位、３８２位、４２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位お
よび４３８位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、
免疫グロブリン定常領域は、２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８
２Ｌ、４２６Ｍ、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３
４Ｇ、４３４Ｓおよび４３８Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形
態では、免疫グロブリン定常領域は、２５０位にてアミノ酸置換をさらに含む。好ましく
は、このアミノ酸置換は、２５０Ｑでない。免疫グロブリン定常領域は、４２８位にてア
ミノ酸置換を含んでよく、ここで、この置換は、４２８Ｌでない。
一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、１つより多いアミノ酸置換、例えば２５
２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２
６Ｍ／４２８Ｇおよび４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａからなる群から選択され
る置換を含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２０、配列番号２
１および配列番号２２からなる群から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を
含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔも
しくは４２８Ｖから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３
領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含むか、または代わりに、免疫グロブリン定常
領域は、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域およ
び／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含む。より好ましくは、ア
ミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換とであってよいか、または代わりに
、アミノ酸置換は、４３４Ａもしくは４３４Ｓと４２８位でのさらなる置換とであってよ
い。さらにより好ましくは、アミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４Ａまたは４３４Ｓのいず
れかとであってよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２４または配列番
号２５から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を含む。
免疫グロブリン定常領域のＣＨ２および／またはＣＨ３領域中の上記の改変の他に、本
発明の免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域も含んで
よく、ここで、ＣＨ１領域は、プロテインＧとの結合の低減または喪失をもたらすように
改変されている。好ましくは、ＣＨ１領域は、ヒトＩＧＨＧ由来である。
ＣＨ１領域がヒトＩＧＨＧ由来である一実施形態では、ＣＨ１領域は、ＩＧＨＡ１また
はＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられてよい。代わりに、ＣＨ１領域のＣＨ１スト
ランドＧおよび一部のＦＧループは、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域のＣＨ
１ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられてよい。
代替の実施形態では、改変免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域は、２０９位、２１０
位、２１３位および２１４位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含んでよ
い。好ましくは、アミノ酸置換は、２０９位および２１３位にある。代わりに、改変免疫
グロブリン定常領域は、２０９Ｐ／２１０Ｓ、２１３Ｖ／２１４Ｔおよび２０９Ｇ／２１
０Ｎからなる置換の群から選択されるアミノ酸置換を含んでよい。より好ましくは、改変
免疫グロブリン定常領域は、アミノ酸改変２０９Ｇまたは２１３Ｖを含んでよい。具体的
に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号５７、５９または５６のアミノ酸１１８～２２
２を含むバリアントヒトＩＧＨＧ１ ＣＨ１領域を含んでよい。
上記の置換は、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低減する効果
を有する。結合の低減は、少なくとも最小限で１０％であってよい。好ましくは、プロテ
インＧとの結合は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９
０％低減される。プロテインＧとの結合は、１００％まで低減されてよく、これは、喪失
に相当し、このことは、プロテインＧと全く結合しないことを意味する。
上記の置換は、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合親和性を変化させ
る効果を有してよい。しかし、ＦｃＲｎとの結合は、エフェクター機能のために必要であ
り、よって、ＦｃＲｎとの結合の消失は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのようなエフェクター機
能が望まれる場合は、望ましくない。
さらなる実施形態では、本発明は、エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを
含むポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、免疫グロブリン定常領
域が、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる群から選択され、免疫グロブリン定常領域が
、免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改
変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合
親和性を変化させ、
免疫グロブリンまたはその断片が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して、
少なくとも８０％のＦｃＲｎとの結合を保持する、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
代替の実施形態では、本発明は、
（ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む
第１ポリペプチドと、
（ｂ）第２エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域（免疫グ
ロブリン定常領域は、ＣＨ２領域およびＣＨ３からなる群から選択される）とを含む第２
ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第２ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは
その断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合
親和性を変化させ、
改変第２ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に改変を有さない未改変のヘテロ二
量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して、少なくとも８０％のＦｃＲｎとの
結合を保持する、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
親和性試薬は、免疫グロブリン定常領域中のヒトＦｃＲｎに対する結合部位とオーバー
ラップする、免疫グロブリンもしくはヘテロ２量体免疫グロブリンまたはその断片の免疫
グロブリン定常領域中の結合部位と結合してよい。このオーバーラップは、部分的または
完全であってよい。好ましくは、親和性試薬は、細菌の表面タンパク質である。より好ま
しくは、親和性試薬は、プロテインＧである。
一実施形態では、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドの免
疫グロブリンは、その免疫グロブリン定常領域中に、プロテインＧとの結合を低減させる
または喪失させる改変を含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由
来である。このような改変は、本明細書に記載するように、ＣＨ３および／またはＣＨ２
領域中のアミノ酸置換であってよい。
第２の態様では、本発明は、ＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含む
ポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、ＶＨ３領域が、免疫グロブ
リンまたはその断片とプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。免疫グロブリンまたはその断片は、ＶＨ３領
域を少なくとも有する１または複数のさらなるエピトープ結合領域を含んでよい。
免疫グロブリンまたはその断片は、ＶＨ３領域中で、プロテインＡとの結合を低減する
ように改変されてよい。好ましくは、ＶＨ３領域は、６５位にてアミノ酸置換ならびに／
または５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１
９Ｇ／５７Ａ／５９Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。ＶＨ３領域中のア
ミノ酸の位置の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｄａｒｉａｖａｃｈ Ｐら
、（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４（２４）：９０７
４～８頁およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ Ｂら、（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２（１０）：３４１５～９頁に記載されるように、Ｋａｂａｔ Ｅ
Ａら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第
９１号、３２４２頁）に従う。より好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、６５Ｓ、８１Ｅお
よび８２ａＳからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。さらにより好ましくは、Ｖ
Ｈ３領域の改変は、アミノ酸置換６５Ｓを含む。最も好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、
アミノ酸置換８２ａＳを含む。例えば、配列番号３４は、置換Ｇ６５Ｓを有する抗ＨＥＲ
２ Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列である。配列番号４４は、置換Ｇ６５Ｓと、自然に存在す
るヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換されたヒンジ領域とを有する
アイソタイプＩＧＨＧ３の抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖のアミノ酸配列である。配列番
号９５は、置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ＶＨのアミノ酸配列である。配列番号８３
は、ＶＨ配列中に置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
一実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片は、ＶＨ３領域に加えて、免疫グロブ
リン定常領域をさらに含んでよい。免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２および／またはＣ
Ｈ３領域を少なくとも含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨ
Ｇ由来である。ヒトＩＧＨＧは、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４から選択して
よい。さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２または
ＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領
域で置換される。具体的に、免疫グロブリン領域は、配列番号２を有するＦｃ領域を含む
。代替の実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨ
Ｇ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、４３５位（ＥＵ番号付け）にてアミノ
酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、４３５Ｒである。さらに、ＣＨ３領域は、
４３５位および４３６位にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましくは、アミノ酸置換は、
４３５Ｒおよび４３６Ｆである。
代替の実施形態では、本発明は、
（ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域を含む第１ポリペプチドと、
（ｂ）第２エピトープと結合するＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含
む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインＡとの結合
を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドは、ＣＨ３領域を含む
免疫グロブリン定常領域をさらに含んでよい。ＣＨ３領域は、本明細書に記載するように
置き換えまたは改変されてよい。
代わりに、本発明は、
（ａ）プロテインＡと結合し、第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロ
ブリン定常領域とを含む第１ポリペプチドと、
（ｂ）プロテインＡと結合しないかまたはプロテインＡとの結合が低減され、第２エピト
ープと結合するＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常
領域とを含む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、第２ポリペプチドとプロテインＡとの結合を低減させ
るまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
第２ポリペプチドのＶＨ３領域は、ＶＨ３領域を少なくとも有する１または複数のさら
なるエピトープ結合領域を含んでよい。ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは断片の第２ポ
リペプチドは、そのＶＨ３領域中に、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させ
る改変を含んでよい。このような改変は、上記のようなＶＨ３領域中のアミノ酸置換であ
ってよい。
第３の態様では、本発明は、
（ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と、ＣＨ１および／またはＣＨ２お
よび／またはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域とを含む第１ポリペプ
チドと、
（ｂ）ＶＨ３を少なくとも含む第２エピトープと結合するエピトープ結合領域ならびに／
またはＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含
む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第１ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第１親和性試薬との
結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
第２ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第２親和性試薬との
結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
第１親和性試薬は、プロテインＧであり得、第２親和性試薬は、プロテインＡであり得
る。
好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来である。より好ましくは、
第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来であり、第２ポリペプ
チドは、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４から選択される。
第１親和性試薬がプロテインＧである場合、第１ポリペプチドは、ＣＨ３領域またはＣ
Ｈ２領域を含む免疫グロブリン定常領域を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常
領域は、ＣＨ３およびＣＨ２領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、プロテインＧとの
結合を低減するように改変されてよい。好ましくは、改変免疫グロブリン定常領域は、２
５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８２位、３
８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４
３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される位置にて
アミノ酸置換を含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５１位、２５２位、２
５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４２６位、４２８位、４３４位、４
３５位、４３６位および４３８位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む
。より好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０
Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３
Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓおよび４３８Ａからなる群から選択されるアミノ酸置
換を含む。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、２５０位にてアミノ酸置換をさ
らに含む。好ましくは、このアミノ酸置換は、２５０Ｑでない。免疫グロブリン定常領域
は、４２８位にてアミノ酸置換を含んでよく、ここで、この置換は、４２８Ｌでない。
一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、１つより多いアミノ酸置換、例えば２５
２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２
６Ｍ／４２８Ｇおよび４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａからなる群から選択され
る置換を含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２０、配列番号２
１および配列番号２２からなる群から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を
含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔも
しくは４２８Ｖから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３
領域中の任意の位置にてさらなる置換とを含むか、または代わりに、免疫グロブリン定常
領域は、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域およ
び／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含む。より好ましくは、ア
ミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換とであってよいか、または代わりに
、アミノ酸置換は、４３４Ａもしくは４３４Ｓと４２８位でのさらなる置換とであってよ
い。さらにより好ましくは、アミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４Ａまたは４３４Ｓのいず
れかとであってよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２４または配列番
号２５から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を含む。
第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域のＣＨ２および／またはＣＨ３領域中の上
記の改変の他に、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１領域も含んでよく、ここで、ＣＨ１
領域は、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるように改変されている。一
実施形態では、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域は、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来
のＣＨ１領域で置き換えられてよい。代わりに、ＣＨ１領域のＣＨ１ストランドＧおよび
一部のＦＧループは、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域のＣＨ１ストランドＧ
および一部のＦＧループで置き換えられている。
代替の実施形態では、改変免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域は、２０９位、２１０
位、２１３位および２１４位の群から選択される位置にてアミノ酸置換を含んでよい。好
ましくは、アミノ酸置換は、２０９位および２１３位にある。代わりに、改変免疫グロブ
リン定常領域は、２０９Ｐ／２１０Ｓ、２１３Ｖ／２１４Ｔおよび２０９Ｇ／２１０Ｎか
らなる置換の群から選択されるアミノ酸置換を含んでよい。より好ましくは、改変免疫グ
ロブリン定常領域は、アミノ酸改変２０９Ｇまたは２１３Ｖを含んでよい。具体的に、免
疫グロブリン定常領域は、配列番号５７、５９または５６のアミノ酸１１８～２２２を含
むバリアントヒトＩＧＨＧ１ ＣＨ１領域を含んでよい。
第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域に対する改変は、ヘテロ二量体免疫グロブ
リンまたはその断片の第１ポリペプチドとプロテインＧとの結合の１００％までの低減を
もたらしてよく、代わりに、第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域に対する改変は
、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較した場合に、ヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはその断片の第１ポリペプチドとプロテインＧとの結合の喪失
をもたらしてよい。
第２親和性試薬がプロテインＡである場合、第２ポリペプチドは、プロテインＡとの結
合を低減するように改変されたＶＨ３領域を含んでよい。好ましくは、改変ＶＨ３領域は
、６５位にてアミノ酸置換ならびに／または５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６８Ｖ、
８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａからなる群から選択されるア
ミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔナンバリング）。より好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、
６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。さらによ
り好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、アミノ酸置換６５Ｓを含む。最も好ましくは、ＶＨ
３領域の改変は、アミノ酸置換８２ａＳを含む。例えば、配列番号３４は、置換Ｇ６５Ｓ
を有する抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列である。配列番号４４は、置換Ｇ６５Ｓ
と、自然に存在するヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換されたヒン
ジ領域とを有するアイソタイプＩＧＨＧ３の抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ－Ｆｃ重鎖のアミノ酸配
列である。配列番号９５は、置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ＶＨのアミノ酸配列であ
る。配列番号８３は、ＶＨ配列中に置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖのアミノ
酸配列である。
改変ＶＨ３領域に加えて、第２ポリペプチドは、プロテインＡとの結合を低減するよう
に改変された免疫グロブリン定常領域を含んでよい。免疫グロブリン定常領域は、少なく
ともＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領
域は、ヒトＩＧＨＧ由来であり、より好ましくはＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ
４由来である。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２また
はＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３
領域で置換されてよい。代替の実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、Ｉ
ＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、４３５位（ＥＵ
番号付け）にてアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、４３５Ｒである。さ
らに、ＣＨ３領域は、４３５位および４３６位にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましく
は、アミノ酸置換は、４３５Ｒおよび４３６Ｆである。
第２ポリペプチドのＶＨ３領域および免疫グロブリン定常領域に対する改変は、ヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドとプロテインＡとの結合の１０
０％までの低減をもたらしてよく、代わりに、第２ポリペプチドのＶＨ３領域および免疫
グロブリン定常領域に対する改変は、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
片の結合と比較した場合に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプ
チドとプロテインＡとの結合の喪失
をもたらしてよい。
本発明の実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、免疫グロブリンもしくは
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の変化をもたら
してよい。好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、免疫グロブリンまたはヘテロ二量
体免疫グロブリンのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加をもたらす。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、ヒトＦｃＲｎに対する免
疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片の親和性の変化を
もたらしてよい。好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、ＦｃＲｎに対する免疫グロ
ブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの親和性の増加をもたらす。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、免疫グロブリンもしくは
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片とＦｃＲｎとの結合の変化をもたらして
よい。好ましくは、改変は、１０％の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリン
とＦｃＲｎとの結合の保持をもたらす。より好ましくは、改変は、少なくとも２０％、３
０％、４０％、５０％、６０％または７０％の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グ
ロブリンとＦｃＲｎとの結合の保持をもたらす。さらにより好ましくは、改変は、未改変
の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断
片と比較して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の免疫
グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンとＦｃＲｎとの結合の保持をもたらす。Ｆ
ｃＲｎとの結合の保持は、実施例４に記載するような表面プラズモン共鳴を用いて測定で
きる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、ＦｃγＲ３ａに対する免
疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片の特異性または親
和性に影響を与えてよい。好ましくは、改変は、ＦｃγＲ３ａに対する免疫グロブリンま
たはヘテロ二量体免疫グロブリンの特異性または親和性にほとんどまたは全く影響を与え
ない。より好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、ＦｃγＲ３ａに対する免疫グロブ
リンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの特異性または親和性にほとんどまたは全く影響
を与えない。ＦｃγＲ３ａに対する結合特異性または親和性は、実施例４に記載するよう
な表面プラズモン共鳴を用いて測定できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域および／またはＶＨ３領域中の改変は
、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの免疫原性をもたらしてよく、ヒト
において抗薬物抗体応答を誘導できる。好ましくは、改変は、免疫グロブリンまたはヘテ
ロ二量体免疫グロブリンの低い免疫原性だけをもたらすかまたは全く免疫原性をもたらさ
ず、よって低い免疫原性または免疫原性の危険性を示す。本発明で用いる改変の免疫原性
は、実施例に５に記載する方法を用いて予測できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域および／またはＶＨ３領域中の改変は
、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性を変化させてよい。好ま
しくは、プロテインＧ結合を排除する改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グ
ロブリンの熱安定性に与える影響が低い。好ましくは、プロテインＡ結合を排除する改変
は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性に与える影響が低いか
または全く影響を与えない。本発明に従って改変された免疫グロブリンまたはヘテロ二量
体免疫グロブリンの熱安定性は、実施例６に記載するように分析できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、免疫グロブリンまたはヘ
テロ二量体免疫グロブリンの血清半減期に影響を与えることがある。好ましくは、改変は
、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの血清半減期にほとんどまたは全く
影響を与えない。より好ましくは、改変は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％ま
たは５％未満の血清半減期の低減をもたらす。最も好ましくは、改変は、２０％未満の血
清半減期の低減をもたらす。免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの薬物動
態は、実施例７に記載するように測定できる。
本明細書に記載する本発明の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンは、軽
鎖も含んでよい。好ましくは、免疫グロブリンは、以前に決定された抗原結合能を有する
重鎖および軽鎖を含み、すなわち、免疫グロブリンは、既知の抗原と結合する。より好ま
しくは、免疫グロブリンは、共通軽鎖、すなわち異なる重鎖と対形成できる軽鎖を含む。
よって、ヘテロ二量体免疫グロブリン中で、例えば、２つの異なる重鎖が、共通軽鎖（同
一可変および定常領域を有する軽鎖）と対形成してよい．共通軽鎖は、様々な方法を用い
て同定できる。これらの方法は、例えば軽鎖可変配列またはｓｃＦｖ抗体断片を提示する
抗体ディスプレイライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーから、最も頻
繁に用いられる軽鎖可変領域を選択することを含んでよい。代わりに、ヘテロ二量体免疫
グロブリンの両方の重鎖可変領域配列をライブラリー中でプローブとして用いて、両方の
重鎖可変領域と結合する軽鎖を同定できる。
さらなる態様では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法を提供
する。
第１の実施形態は、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であっ
て、
（ｉ）免疫グロブリンの混合物から、１つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、免疫グロブリン定常領域のＣ
Ｈ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二
量体免疫グロブリンとプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉ）免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供するステップと、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＧから溶出するステ
ップと
を含む方法を提供する。
免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法で
あって、
（ｉ）ＣＨ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域中で重鎖の一方を改変して
、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉ）両方の重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
（ｉｉｉ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテイン
Ｇに供するステップと、
（ｉｖ）重鎖のヘテロ二量体をプロテインＧから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
少なくとも１つのＣＨ１領域と１つのＣＨ２および／またはＣＨ３領域とを含む免疫グ
ロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの
方法であって、
（ｉ）ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中で重鎖の一方を改変して、プロテインＧとの結
合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉａ）ヘテロ二量体内に１つだけＣＨ１領域が存在するならば、前記ＣＨ１領域が、
プロテインＧとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記ＣＨ１領域が
、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
（ｉｉｂ）ヘテロ二量体内に２つ以上のＣＨ１領域が存在するならば、１つを除く全ての
ＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
または全てのＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
に改変されるステップと、
（ｉｉｉ）重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
（ｉｖ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＧ
に供するステップと、
（ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＧから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
これらの方法に記載する改変重鎖は、本明細書に記載するような、プロテインＧとの結
合を低減させるまたは喪失させる改変を免疫グロブリン定常領域中に含むことができる。
第２の実施形態は、ＶＨ３領域を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精
製する方法であって、
（ｉ）免疫グロブリンの混合物から、１つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、ＶＨ３領域中またはＶＨ３領
域および免疫グロブリン定常領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片とプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉ）免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供するステップと、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＡから溶出するステ
ップと
を含む方法を提供する。
少なくとも１つのＶＨ３領域が存在する免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその
断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
（ｉ）重鎖の一方を改変して、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させるステ
ップと、
（ｉｉａ）ヘテロ二量体内に１つだけＶＨ３領域が存在するならば、前記ＶＨ３領域が、
プロテインＡとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記ＶＨ３領域が
、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
（ｉｉｂ）ヘテロ二量体内に２つ以上のＶＨ３領域が存在するならば、１つを除く全ての
ＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
または全てのＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
に改変されるステップと、
（ｉｉｉ）２つの重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
（ｉｖ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＡ
に供するステップと、
（ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＡから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
これらの方法に記載する改変ＶＨ３領域または改変ＶＨ３および免疫グロブリン定常領
域は、本明細書に記載するような、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる
改変を含むことができる。
第３の実施形態は、重鎖のヘテロ二量体の差次的精製の方法であって、
（ｉ）重鎖の混合物から、第１親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を
含む第１重鎖と、第２親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む第２
重鎖とを有する重鎖のヘテロ二量体またはその断片を単離するステップと、
（ｉｉ）重鎖の混合物を、第１親和性試薬を含む第１カラムに供するステップと、
（ｉｉｉ）重鎖のヘテロ二量体を第１カラムから溶出するステップと、
（ｉｖ）第１カラムからの溶出物を、第２親和性試薬を含む第２カラムに供するステップ
と、
（ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片を第２カラムから溶出するステップと
を含む方法を提供する。
この方法では、第１および第２親和性試薬は、細菌の表面タンパク質に由来する。第１
親和性試薬がプロテインＡである場合、第２親和性試薬は、プロテインＧであるか、また
は第１親和性試薬がプロテインＧである場合、第２親和性試薬は、プロテインＡである。
この方法に記載する改変重鎖は、本明細書に記載するような、プロテインＡおよびプロテ
インＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含むことができる。
ヘテロ二量体は、７０％より大きい純度まで精製してよい。好ましくは、ヘテロ二量体
は、８０％または９０％より大きい純度まで精製される。より好ましくは、ヘテロ二量体
は、９５％より大きい純度まで精製される。さらにより好ましくは、ヘテロ二量体は、９
８％より大きい純度まで精製される。
本発明のさらなる態様は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混
合物から単離する方法であって、
（ｉ）対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離するステ
ップであって、対象の免疫グロブリンまたはその断片が、プロテインＡおよび／またはプ
ロテインＧに対する結合部位を全て喪失しているステップと、
（ｉｉ）第１ステップにおける免疫グロブリンの混合物をプロテインＡまたはプロテイン
Ｇに供するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収
するステップと、場合によって、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片をプロ
テインＡまたはプロテインＧに供するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収する
ステップと
を含み、
ステップ（ｉｉ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供し、ステップ（
ｉｖ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供するか、または
ステップ（ｉｉ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供し、ステップ（
ｉｖ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供する、
方法を提供する。
対象の免疫グロブリンまたはその断片中のプロテインＡに対する結合部位は、ＶＨ３お
よび免疫グロブリン定常領域中に位置する。プロテインＧに対する結合部位は、免疫グロ
ブリン定常領域中に位置する。
一実施形態では、対象の免疫グロブリンまたはその断片は、ホモ二量体免疫グロブリン
であってよい。代替の実施形態では、対象の免疫グロブリンまたはその断片は、ヘテロ二
量体免疫グロブリンであってよい。
好ましくは、対象の免疫グロブリンは、ヘテロ二量体免疫グロブリン、より好ましくは
二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または腫瘍抗原、サイトカイン
、血管増殖因子およびリンパ－血管形成性増殖因子の群から選択される抗原と結合する二
重特異性全長抗体であり得る。好ましくは、抗原は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ｅ
ＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、ＩｇＥおよびＶＬＡ－２からなる群
から選択される。好ましくは、抗原は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ＣＤ３およびＥｐＣＡ
Ｍ、ＣＤ３およびＨＥＲ２、ＣＤ１９およびＩｇＥならびにＣＤ２０およびＩｇＥである
。
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域
を含む二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンである。好ましくは、ＨＥＲ３エピトープ
結合領域は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号８９のアミノ
酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３とを含む
。好ましくは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖
ＣＤＲ１と、配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号９３のアミノ
酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。より好ましくは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域は、
配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号８９のアミノ酸配列を含む
重鎖ＣＤＲ２と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号９１のア
ミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。さらにより好ましくは、ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、ＨＥＲ３と
結合し、ここで、ＨＥＲ３結合領域は、配列番号８６の重鎖配列と配列番号８５の軽鎖配
列とを含む。同等により好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ
二量体免疫グロブリンであり、ＨＥＲ３と結合し、ここで、ＨＥＲ３結合領域は、配列番
号９５の重鎖可変領域配列と配列番号８２の軽鎖可変領域配列とを含む。
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、配列番号８６のアミノ酸配列
を有する重鎖と、配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、ＨＥＲ２およびＨ
ＥＲ３と結合する二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンである。より好ましくは、ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、ＨＥＲ２お
よびＨＥＲ３と結合し、配列番号８７の第１重鎖アミノ酸配列と、配列番号８６の第２重
鎖アミノ酸配列と、配列番号８５の軽鎖アミノ酸配列とを有する。
本明細書に記載する対象の免疫グロブリンを単離する方法は、医療用途、特に診断にお
いて有用であり得る。血清中の対象の免疫グロブリンの量を決定するために対象の免疫グ
ロブリンを患者血清から単離することは、単純なプロセスではない。一実施形態では、免
疫グロブリンの混合物は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を投与された患者または
動物の血清を含むかまたは該血清に由来する。代替の実施形態では、免疫グロブリンの混
合物は、患者または動物の血清であり、ここで、患者または動物は、対象の免疫グロブリ
ンまたはその断片を投与されている。
プロテインＡおよび／またはプロテインＧに対する結合部位の排除は、対象の免疫グロ
ブリンまたはその断片を、そのＶＨ３および／または免疫グロブリン定常領域中で、本明
細書に記載する改変に従って改変することにより達成してよい。
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載するヘテロ二量体免疫グロブリンの精
製方法は、Ｆｃ領域、より具体的にはヘテロ二量体免疫グロブリンのＣＨ３領域の相互作
用を最適化するための当該技術において既知の技術と組み合わせることができる。
例えば、工学的に操作されたＣＨ３ヘテロ二量体ドメイン対については、ヘテロ二量体
Ｆｃ部分を作製するための「腔への隆起のあてはめ（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔ
ｏ－ｃａｖｉｔｙ）」アプローチについて記載するＣａｒｔｅｒらにより最初に報告され
た（米国特許第５，８０７，７０６号；「穴へのノブのあてはめ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ
－ｈｏｌｅｓ）」；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ＡＭら、１９８８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．、１６（７）：６７７～８１頁）。この方法では、第１抗体分子の界面からの１また
は複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン
）で置き換えて、「隆起」を作製する。大きい側鎖と同一または同様のサイズの代償性の
「腔」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはトレオニン）で
置き換えることにより第２抗体分子の界面に創出する。代替の設計が最近開発されたが、
これは、ＷＯ０７／１１０２０５（Ｄａｖｉｓ ＪＨおよびＨｕｓｔｏｎ ＪＳ）により
記載されるように、分子のコア組成を改変することによる新しいＣＨ３モジュール対の設
計、またはＷＯ０７／１４７９０１（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ Ｋら）もしくはＷＯ０９／
０８９００４（Ｋａｎｎａｎ Ｇら）に記載されるように、モジュール間の補完的塩橋の
設計を含む。好ましくは、本発明で用いるヘテロ二量体免疫グロブリンは、ＰＣＴパンフ
レットＷＯ１３／１３１５５５（Ｂｌｅｉｎ Ｓら）に記載されるように、工学的に操作
された免疫グロブリン定常領域を含む。
プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図１Ｂ：Ｆｃ１３３。 同上。図１Ｃ：Ｆｃ１１３。 同上。図１Ｄ：Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ。 プロテインＧ捕捉－溶出モードクロマトグラフィー画分（プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（１）Ｆｃ ＩＧＨＧ１。（２）Ｆｃ１１３。（３）Ｆｃ１３３。（４）Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ｇ）プロテインＧからの溶出。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図３Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図３Ｂ：Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ。 同上。図３Ｃ：Ｆｃ Ｅ３８２Ｒ。 同上。図３Ｄ：Ｆｃ Ｅ３８２Ｙ。 同上。図３Ｅ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｒ。 同上。図３Ｆ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｙ。 同上。図３Ｇ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｗ。 同上。図３Ｈ：Ｆｃ Ｑ４３８Ｒ。 同上。図３Ｉ：Ｆｃ Ｑ４３８Ｙ。 同上。図３Ｊ：Ｆｃ Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ。 同上。図３Ｋ：Ｆｃ Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ。 同上。図３Ｌ：Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ／Ｅ３８２Ｒ。 同上。図３Ｍ：Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ。 同上。図３Ｎ：Ｆｃ Ｓ２５４Ｅ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ。 同上。図３Ｏ：Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ。 同上。図３Ｐ：Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８３Ａ／Ｙ４３６Ａ／Ｑ４３８Ａ。 同上。図３Ｑ：Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ。 同上。図３Ｒ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＡ捕捉－溶出モードクロマトグラフィー画分（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ａ：（１）Ｆｃ ＩＧＨＧ１、（２）Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ、（３）Ｆｃ Ｅ３８２Ｒ、（４）Ｆｃ Ｅ３８２Ｙ、（５）Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ／Ｅ３８２Ｒ、（６）Ｆｃ Ｑ４３８Ｒ、（７）Ｆｃ Ｓ４２６Ｗ、（８）Ｆｃ Ｓ４２６Ｒおよび（９）Ｆｃ Ｓ４２６Ｙ。 同上。図４Ｂ：（１０）Ｆｃ Ｑ４３８Ｙ、（１１）Ｆｃ Ｓ２５４Ｅ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇおよび（１２）Ｆｃ Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ。 同上。図４Ｃ：（１３）Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ、（１４）Ｆｃ Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ、（１５）Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ、（１６）Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ、（１７）Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ／Ｙ４３６Ａ／Ｑ４３８Ａおよび（１８）Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ。図４Ａ～Ｃ：（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ａ）プロテインＡからの溶出。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図５Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図５Ｂ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｈ４３３Ｄ。 同上。図５Ｃ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ。 同上。図５Ｄ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図５Ｅ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図５Ｆ：Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ｓ。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図６Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図６Ｂ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図６Ｃ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ。 同上。図６Ｄ：Ｆｃ Ｎ４３４Ａ。 プロテインＡ捕捉－溶出モードクロマトグラフィー画分（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（１）Ｆｃ ＩＧＨＧ１。（２）Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。（３）Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／ Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ。（４）Ｆｃ Ｍ２４８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ。（５）Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ｓ。（６）Ｆｃ Ｍ２４８Ｌ／Ｎ４３４Ａ。（７）Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｈ４３３Ｄ。（８）Ｆｃ Ｍ２４８Ｇ。（９）Ｆｃ Ｎ４３４Ａ。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ａ）プロテインＡからの溶出。 プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図８Ａ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。 同上。図８Ｂ：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。 同上。図８Ｃ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムおよびＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。 ７つの既知のヒトＶＨフレームワークサブクラスのそれぞれについての代表的なアミノ酸配列。配列は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って整列させた。プロテインＡのドメインＤと相互作用する位置を太字で示す。 プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１０Ａ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ。 同上。図１０Ｂ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｔ５７Ａ。 同上。図１０Ｃ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｔ５７Ｅ。 同上。図１０Ｄ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｇ６５Ｓ。 同上。図１０Ｅ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｒ６６Ｑ。 同上。図１０Ｆ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｔ６８Ｖ。 同上。図１０Ｇ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｑ８１Ｅ。 同上。図１０Ｈ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｎ８２ａＳ。 同上。図１０Ｉ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｒ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ。 ＨＥＲ２抗原に対する選択された抗ＨＥＲ２ ＦＡＢバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。 プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１２Ａ：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３。 同上。図１２Ｂ：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）－Ｆｃ１３３。 同上。図１２Ｃ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３。 同上。図１２Ｄ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）－Ｆｃ１３３。 プロテインＧ 捕捉－溶出モードクロマトグラフィー画分（プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（１）抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）－Ｆｃ１３３。（２）抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３。（３）抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ１３３。（４）抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３。（５）抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）－Ｆｃ１３３。（６）抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ｇ）プロテインＧからの溶出。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４ＡのプロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。 ヒトＩＧＨＭ、ＩＧＨＡ１およびＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインの配列。ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けを用いる。プロテインＧのドメインＩＩＩとの結合に関与する残基を太字で示す。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１６Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１６Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ａ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１６Ｃ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ａ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１６Ｄ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１７Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１７Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－Ａ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１７Ｃ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－Ａ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１７Ｄ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１８Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｃ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｄ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｅ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｆ：抗ＨＥＲ３抗体バリアントについてのＫＤ測定の決定。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。図１９Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１９Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＡ捕捉－溶出モードクロマトグラフィー画分（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図２０Ａ：（１）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（２）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（３）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（４）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ａ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（５）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび（６）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ａ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図２０Ｂ：（７）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－Ａ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（８）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（９）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－Ａ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（１０）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（１１）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（１２）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび（１３）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。図２０Ａおよび図２０Ｂ：（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ａ）プロテインＡからの溶出。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ １３３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１ヘテロ二量体のプロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。 図２１Ａに示すトレースからのクロマトグラフィー画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（１）細胞培養上清。（２）通過画分。（３）ピーク１。（４）ピーク２。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａヘテロ二量体のプロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。 図２２Ａに示すトレースからのクロマトグラフィー画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（１）細胞培養上清。（２）通過画分。（３）ピーク１。（４）ピーク２。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１ヘテロ二量体のプロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。 図２３Ａに示すトレースからのクロマトグラフィー画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（１）細胞培養上清。（２）通過画分。（３）ピーク１。（４）ピーク２。 プロテインＡおよびプロテインＧ捕捉－溶出モードクロマトグラフィーの組み合わせを用いる、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａヘテロ二量体の精製スキーム（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムおよびＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。 図２４Ａに示す精製スキームに従って行ったプロテインＡおよびプロテインＧステップのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（ＦＴＡ）プロテインＡ捕捉－溶出ステップからの通過画分。（Ａ）プロテインＡ捕捉－溶出ステップからの溶出。（ＦＴＧ）プロテインＧ捕捉－溶出ステップからの通過画分。（Ｇ）プロテインＧ捕捉－溶出ステップからの溶出。 プロテインＡおよびＧ捕捉－溶出精製後の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａヘテロ二量体の相対的割合を評価する走査デンシトメトリー分析（４～１２％ ＳＤＳ Ｔｒｉｓ－グリシンポリアクリルアミドゲル）。 プロテインＡおよびプロテインＧ捕捉－溶出モードクロマトグラフィーの組み合わせを用いる、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３ヘテロ二量体の精製スキーム（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムおよびＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。 図２５Ａに示す精製スキームに従って行ったプロテインＡおよびプロテインＧステップのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（ＦＴＡ）プロテインＡ捕捉－溶出ステップからの通過画分。（Ａ）プロテインＡ捕捉－溶出ステップからの溶出。（ＦＴＧ）プロテインＧ捕捉－溶出ステップからの通過画分。（Ａ）プロテインＧ捕捉－溶出ステップからの溶出。 プロテインＡおよびＧ捕捉－溶出精製後の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３ヘテロ二量体の相対的割合を評価する走査デンシトメトリー分析（４～１２％ ＳＤＳ Ｔｒｉｓ－グリシンポリアクリルアミドゲル）。 ヒトＦｃＲｎに対する選択された抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ－Ｆｃバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。 未改変の抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１対照に対する相対的比率として表す、ヒトＦｃＲｎに対する選択された抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ－Ｆｃバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。 ヒトＦｃＲｎに対する選択された抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ－Ｆｃバリアント（記載するとおり）の表面プラズモン共鳴測定。データは、応答単位の数（ＲＵと省略する；Ｙ軸） 対 時間（Ｘ軸）として表す。図２８Ａ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図２８Ｂ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図２８Ｃ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３。 同上。図２８Ｄ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ。 上のプロットは、ヒトＦｃγＲ３ａに対する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａの表面プラズモン共鳴のある測定を示す。データは、応答単位の数（ＲＵと省略する；Ｙ軸） 対 時間（Ｘ軸）として表す。３回の独立した実験から算出した平均ＫＤ値を示す。下のプロットは、上のプロットに基づく、抗体濃度に対して算出されたＲｅｑ値を示す（ここからＫＤ値を決定する）。 上のプロットは、ヒトＦｃγＲ３ａに対する抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１の表面プラズモン共鳴のある測定を示す。データは、応答単位の数（ＲＵと省略する；Ｙ軸） 対 時間（Ｘ軸）として表す。３回の独立した実験から算出した平均ＫＤ値を示す。下のプロットは、上のプロットに基づく、抗体濃度に対して算出されたＲｅｑ値を示す（ここからＫＤ値を決定する）。 置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａならびに置換Ｎ８２ａＳについてのＥｐｉｂａｓｅ（商標）免疫原性の結果を示す表。ＤＲＢ１アロタイプ群との強いおよび中程度の結合のカウントを示す。治療用抗体の選択についての結果も示す。 置換Ｔ２０９Ｇ、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３ＶについてのＥｐｉｂａｓｅ（商標）免疫原性の結果を示す表。それぞれの位置について、全ての可能な置換についての全体的なＤＲＢ１スコアの差を示す。 同上。 示差走査熱量分析を用いるＦｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４ＡおよびＦｃ ＩＧＨＧ１の熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と省略する；Ｙ軸） 対 温度（℃；Ｘ軸）として表す。 示差走査熱量分析を用いる熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と省略する；Ｙ軸） 対 温度（℃；Ｘ軸）として表す。図３３Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図３３Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 示差走査熱量分析を用いる熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と省略する；Ｙ軸） 対 温度（℃；Ｘ軸）として表す。図３４Ａ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図３４Ｂ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３。 同上。図３４Ｃ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ１１３。 ホモ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１またはヘテロ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ免疫グロブリンの雌性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与（急速投与）後の片対数血漿濃度－時間プロファイル。結果は、４匹のラットの平均±ＳＤとして表す。データは、平均血清濃度（平均濃度と省略する、μｇ／ｍｌ；Ｙ軸） 対 時間（時間、Ｘ軸）として表す。 １０ｍｇ／ｋｇのホモ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１またはヘテロ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ免疫グロブリンのＩＶ急速投与後の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＫパラメータのまとめを示す表。（ｔ1/2）は、免疫グロブリン排出半減期に相当する。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）－ＢＴＡ ＩＧＨＧ３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＢＴＢ ＩＧＨＧ１ヘテロ二量体のプロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線－破線で示す。 Ｃａｌｕ－３細胞増殖アッセイ。３ｎＭのヘレグリンベータの存在下でＣａｌｕ－３細胞を、１％血清含有成長培地の存在下の抗体の系列希釈で処理した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）染色を用いて細胞増殖を３日後に測定した。結果は、片対数抗体濃度 対 蛍光単位（５４０ｎｍでの励起、６２０ｎｍでの発光）で表す。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、細胞増殖の阻害の陰性対照として示す。図３８Ａ：ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体および抗ＨＥＲ２と抗ＨＥＲ３抗体との等モル混合物。 同上。図３８Ｂ：ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体およびＤＬ１１ｆ抗体（抗ＥＧＦＲおよび抗ＨＥＲ３二重特異性抗体）。 同上。図３８Ｃ：ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ２と抗ＨＥＲ３抗体との等モル混合物およびＤＬ１１ｆ抗体。
本発明は、全般的に、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡおよびプロテイ
ンＧの両方との結合が低減または喪失した新規なヘテロ二量体免疫グロブリンバリアント
に関する。本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法も包含する。
この明細書を理解する目的のために、以下の定義を用い、適切であればいつでも、単数
形で用いる用語は複数形も包含し、その逆もまた真である。本明細書で用いる術語は、特
定の実施形態について記載する目的のためだけであり、限定することを意図しない。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体のことをいい、
ここで、アミノ酸は、ペプチド結合により組み合わされて、脱水合成により一緒に連結さ
れたアミノ酸の鎖を形成する。ポリペプチドおよびタンパク質は、化学合成または組換え
発現により合成でき、最小限のアミノ酸の長さに限定されない。
本発明によると、タンパク質が単一ポリペプチド鎖から構成される限り、ポリペプチド
の群は「タンパク質」を含む。ポリペプチドは、二量体、三量体およびより高いオリゴマ
ー（すなわち１つより多いポリペプチド分子から構成される）のようなマルチマーをさら
に形成してよい。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一ま
たは非同一であってよい。このようなマルチマーの、対応するより高い次元の構造は、よ
って、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと命名される。ヘテロマル
チマーの例は、その自然に存在する形では２つの同一軽鎖ポリペプチド鎖と２つの同一重
鎖ポリペプチド鎖とから構成される抗体分子である。用語「ポリペプチド」および「タン
パク質」は、改変が例えば糖鎖付加、アセチル化、リン酸化などの翻訳後改変により行わ
れる、自然に改変されたポリペプチド／タンパク質のこともいう。このような改変は、当
該技術において公知である。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、天然
の配列に対する欠失、付加および置換（保存的な性質であり得る）のような改変を含むタ
ンパク質のこともいう。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発によるように計画的で
あってよいか、またはタンパク質を生成する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅による誤りの
ように偶発的であってよい。
用語「免疫グロブリン」は、本明細書で言及する場合、用語「抗体」と交換可能に用い
ることができる。免疫グロブリンは、全長抗体およびその任意の抗原結合断片または単鎖
を含む。免疫グロブリンは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。免疫グロブリン
、具体的に、自然に存在する抗体は、４つのポリペプチド鎖で構成されるＹ字型単位の１
または複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。それぞれの「Ｙ」字型は、それ
らの相対的分子量によりそのように命名される重（Ｈ）鎖の２つの同一コピーと、軽（Ｌ
）鎖の２つの同一コピーとを含有する。それぞれの軽鎖は重鎖と対形成し、それぞれの重
鎖は別の重鎖と対形成する。鎖間ジスルフィド共有結合および非共有相互作用が鎖を一緒
に連結する。免疫グロブリン、具体的に、自然に存在する抗体は、抗原結合部位の２コピ
ーである可変領域を含有する。タンパク質分解酵素であるパパインは、「Ｙ」字型を３つ
の別々の分子、２つのいわゆる「Ｆａｂ」または「ＦＡＢ」断片（Ｆａｂ＝断片－抗原－
結合）と、１つのいわゆる「Ｆｃ」断片または「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝断片－結晶化可能）
に分ける。Ｆａｂ断片は、軽鎖全体と重鎖の一部とから構成される。重鎖は、１つの可変
領域（ＶＨ）と３または４つの定常領域（抗体クラスまたはアイソタイプに依存して、Ｃ
Ｈ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）とから構成される。ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間
の領域は、ヒンジ領域とよばれ、Ｙ字型抗体分子の２つのＦａｂ腕の間の柔軟性を可能に
し、一定の距離で分けられた２つの抗原決定基との結合を受け入れるために、腕が開閉す
ることを可能にする。「ヒンジ領域」は、本明細書で言及する場合、６～６２アミノ酸の
長さの配列領域であり、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧにのみ存在し、２つの重鎖を橋かけ
するシステイン残基を包含する。ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの重鎖はそれぞれ、４つの
領域、すなわち１つの可変領域（ＶＨ）と３つの定常領域（ＣＨ１～３）とを有する。Ｉ
ｇＥおよびＩｇＭは、１つの可変領域と４つの定常領域（ＣＨ１～４）とを重鎖上に有す
る。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）およ
び古典的補体系経路の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子との結合を媒介す
ることがある。各軽鎖は、通常、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結する。各
軽鎖は、１つの可変領域（ＶＬ）と１つの軽鎖定常領域とを含有する。軽鎖定常領域は、
本明細書においてＩＧＫＣと称するカッパ軽鎖定常領域、または本明細書においてＩＧＬ
Ｃと称するラムダ軽鎖定常領域である。ＩＧＫＣは、本明細書において、ＣκまたはＣＫ
と同等に用い、同じ意味を有する。ＩＧＬＣは、本明細書において、ＣλまたはＣＬと同
等に用い、同じ意味を有する。用語「ＩＧＬＣ領域」は、本明細書で用いる場合、全ての
ラムダ軽鎖定常領域、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩ
ＧＬＣ７からなる群から選択される全てのラムダ軽鎖定常領域のことをいう。ＶＨおよび
ＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域（この中に、フレーム
ワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）をよばれるより保存的な領域が散在する）にさらに細分化
できる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、
ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよ
び４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトー
プ結合領域を含有する。
用語「全長抗体」は、本明細書で用いる場合、可変および定常領域を含む、抗体の自然
な生物学的形を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動
物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一
の対から構成される（各対は、１つの軽鎖と１つの重鎖とを有し、各軽鎖は、免疫グロブ
リン領域ＶＬおよび軽鎖定常領域を含み、各重鎖は、抗体クラスまたはアイソタイプに依
存して、免疫グロブリン領域ＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）、ＣＨ３（Ｃγ
３）およびＣＨ４（Ｃγ４）を含む）。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマで
は、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖（各重鎖は、Ｆｃ領域と結合した可変領域を含む）だけか
ら構成されることがある。
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプともよばれるクラスに群
分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣＫ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類され
る。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシ
ロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの抗
体のアイソタイプを規定する。よって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、そ
れらの定常領域の化学的および抗原的特徴により規定される免疫グロブリンのクラスおよ
び／またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは
、ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）、ＩＧＨＧ２（ＩｇＧ２）、ＩＧＨＧ３（ＩｇＧ３）、ＩＧＨ
Ｇ４（ＩｇＧ４）、ＩＧＨＡ１（ＩｇＡ１）、ＩＧＨＡ２（ＩｇＡ２）、ＩＧＨＭ（Ｉｇ
Ｍ）、ＩＧＨＤ（ＩｇＤ）およびＩＧＨＥ（ＩｇＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリ
ン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されたが、スイッチ領域の変化によりタンパク
質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である（Ｂｅｎｓｍａ
ｎａ Ｍら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１６（７）：３１０８
頁）。変化したスイッチ領域を有するにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧ
ＨＧＰ遺伝子は、全ての重鎖定常領域（ＣＨ１～ＣＨ３）およびヒンジについてのオープ
ンリーディングフレームを有する。その重鎖定常領域についての全てのオープンリーディ
ングフレームは、予測される構造特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常領域とよく
合致するタンパク質領域をコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書
において、ＩｇＧＰまたはＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域イプシロ
ンＰ１およびＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１およびＩＧＨＥＰ２）のような、その他の偽免
疫グロブリン遺伝子が報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に
用いられる。ヒトでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および
ＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ
２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含む。
用語「免疫グロブリン断片」は、本明細書で用いる場合、それらに限定されないが、（
ｉ）例えばＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３領域を含む領域、（ｉｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ
’－ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬまたはＣＫ領域とＣＨ１領域とから構成されるＦａｂ
断片、（ｉｉ）ＶＨ領域とＣＨ１領域とから構成されるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一可変領
域から構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ＥＳら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１（
６２４２）：５４４～６頁）、（ｉｖ）２つのＦａｂ断片が連結された二価断片であるＦ
（ａｂ’）2断片、（ｖ）ＶＨ領域とＶＬ領域とが、２つの領域が結合して抗原結合部位
を形成することを可能にするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（
Ｂｉｒｄ ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８７７）：４２３～６頁；
Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、
８５（１６）：５８７９～８３頁）、（ｖｉ）遺伝子融合により構築された多価または多
重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐら
、（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０（１４）：６４４
４～８頁；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩおよびＨｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ、（２０００）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２６：４６１～７９頁）、（ｖｉｉ）Ｆｃ領域と融合したｓ
ｃＦｖ、ダイアボディまたは領域抗体ならびに（ｖｉｉｉ）同じまたは異なる抗体と融合
したｓｃＦｖを含む。
用語「可変領域」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規
定する領域またはドメインのことをいう。自然に存在する抗体では、抗原結合部位は、特
異性を規定する２つの可変領域（一方は重鎖に位置し、本明細書において重鎖可変領域（
ＶＨ）といい、他方は軽鎖に位置し、本明細書において軽鎖可変領域（ＶＬ）という）か
ら構成される。ヒトでは、重鎖可変領域（ＶＨ）は、７つのサブグループＶＨ１、ＶＨ２
、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６およびＶＨ７に分けることができる。いくつかの場合
では、特異性は、ラクダ科で見出される重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体におけることと
同様に、２つの領域のうちの一方のみに排他的にあることがある。Ｖ領域は、通常、約１
１０アミノ酸の長さであり、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲまたは「非
ＣＤＲ領域」）とよばれる比較的不変のアミノ酸配列のひと続きと、それらを分ける７～
１７アミノ酸の長さの非常に変動性の「超可変領域」とよばれるより短い領域とから構成
される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ほぼベータシート立体構造をとり、ル
ープを形成する３つの超可変領域により接続される４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領
域は、ＦＲにより近接して一緒にされ、他の鎖由来の超可変領域と一緒に、抗体の抗原結
合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出を参照されたい）。用語「超可変領
域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可
変領域は、通常「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含み、後者は
、最も高い配列変動性を有し、かつ／または抗原認識に関与する。全ての可変領域につい
て、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出）に従う。
いくつかのＣＤＲ定義が用いられており、それらを本明細書において用いて包含する。
Ｋａｂａｔ定義は、配列変動性に基づき、最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔ ＥＡら
、既出）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ
およびＬｅｓｋ Ｊ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７頁）。Ａ
ｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義との間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより用いられる（Ｍａｒｔｉ
ｎ ＡＣＲら、（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９２６８～９２７２頁；Ｍａｒｔ
ｉｎ ＡＣＲら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１～１５
３頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １：１２
６～１３６頁；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｏｘｆｏｒｄ中のＲｅｅｓ ＡＲら、（１９９６）、１４１～１７２頁）。接触定義は、
最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６
２：７３２～７４５頁）、プロテインデータバンクにおいて入手可能な、入手可能な複合
体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての種の全ての
免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体Ｖ領域についてのＩＭＧＴ番号付けに基づく（ＩＭＧ
Ｔ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰら、（
１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（１）：２０９～１２頁；Ｒｕｉ
ｚ Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２１９～２
１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（
１）：２０７～９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．３１（１）：３０７～１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ．
Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５～２０３頁；Ｋａａｓ Ｑら、（２００
７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅ
ｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３～６４頁）。本発明において言及する全ての相補性決定領
域（ＣＤＲ）は、好ましくは、以下のように定義される（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出に従
う番号付け）：
ＬＣＤＲ１：２４～３４
ＬＣＤＲ２：５０～５６
ＬＣＤＲ３：８９～９８
ＨＣＤＲ１：２６～３５
ＨＣＤＲ２：５０～６５
ＨＣＤＲ３：９５～１０２
可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる。Ｖ
Ｌ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１～２３（ＦＲ１）
、３５～４９（ＦＲ２）、５７～８８（ＦＲ３）および９９～１０７（ＦＲ４）を含む。
ＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１～２５（ＦＲ
１）、３６～４９（ＦＲ２）、６６～９４（ＦＲ３）および１０３～１１３（ＦＲ４）を
含む。
本発明のＣＤＲは、上記の定義に基づき、以下のような可変ドメイン残基：ＬＣＤＲ１
：２４～３６、ＬＣＤＲ２：４６～５６、ＬＣＤＲ３：８９～９７、ＨＣＤＲ１：２６～
３５、ＨＣＤＲ２：４７～６５、ＨＣＤＲ３：９３～１０２を有する「拡張ＣＤＲ」を含
んでよい。これらの拡張ＣＤＲも、Ｋａｂａｔら、既出に従って番号付けされる。ＶＬ領
域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１～２３（ＦＲ１）
、３７～４５（ＦＲ２）、５７～８８（ＦＲ３）および９８～およそ１０７（ＦＲ４）を
含む。ＶＨ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１～２
５（ＦＲ１）、３７～４６（ＦＲ２）、６６～９２（ＦＲ３）および１０３～およそ１１
３（ＦＲ４）を含む。
用語「Ｆａｂ」または「ＦＡＢ」または「Ｆａｂ領域」または「ＦＡＢ領域」は、本明
細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよび軽鎖定常免疫グロブリン領域を含むポリペ
プチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片の関係
におけるこの領域のことをいうことがある。
用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブ
リン領域を除く抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Ｆｃは、ＩｇＡ
、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリン領域、ならびにＩｇＥおよ
びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリン領域と、これらの領域に対してＮ末端の
柔軟性ヒンジのことをいう。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことがあ
る。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリン領域Ｃガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２
およびＣγ３）と、Ｃガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジとを含
む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ
ル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義される（ここで、番号付けは、ＥＵイ
ンデックスに従う）。Ｆｃは、単離されたこの領域またはＦｃポリペプチド、例えば抗体
の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
用語「免疫グロブリン定常領域」は、本明細書で用いる場合、ヒトまたは動物種由来の
免疫グロブリンまたは抗体重鎖定常領域のことをいい、全てのアイソタイプを包含する。
好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒト起源のものであり、それらに限定されない
が、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１、ＩＧＨＧ２ ＣＨ１、ＩＧＨＧ３ ＣＨ１、ＩＧＨＧ４ ＣＨ
１、ＩＧＨＡ１ ＣＨ１、ＩＧＨＡ２ ＣＨ１、ＩＧＨＥ ＣＨ１、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ
１、ＩＧＨＭ ＣＨ１、ＩＧＨＤ ＣＨ１、ＩＧＨＧＰ ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ ＣＨ２、
ＩＧＨＧ２ ＣＨ２、ＩＧＨＧ３ ＣＨ２、ＩＧＨＧ４ ＣＨ２、ＩＧＨＡ１ ＣＨ２、
ＩＧＨＡ２ ＣＨ２、ＩＧＨＥ ＣＨ２、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ２、ＩＧＨＭ ＣＨ２、Ｉ
ＧＨＤ ＣＨ２、ＩＧＨＧＰ ＣＨ２、ＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧ
ＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧ
ＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３、ＩＧＨＧ
Ｐ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ４およびＩＧＨＭ ＣＨ４からなる群から選択される。好ま
しい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトＩＧＨＥ ＣＨ２、ＩＧＨＭ ＣＨ２、ＩＧＨ
Ｇ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨ
Ａ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ
ＣＨ３およびＩＧＨＧＰ ＣＨ３からなる群から選択される。より好ましい「免疫グロブ
リン定常領域」は、ヒトＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３
、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、
ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３およびＩＧＨＧＰ ＣＨ３からなる群から選択され
る。
用語「エピトープ結合領域」は、免疫グロブリン分子と１または複数のエピトープとの
特異的結合を許容する最小限のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片を含む
。自然に存在する抗体は、抗原結合（ｂｉｎｄｉｎｇまたはｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位ま
たはパラトープとしても知られる２つのエピトープ結合領域を有する。自然に存在する抗
体中のエピトープ結合領域は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインのＣＤＲ領域内に限定さ
れ、ここで、アミノ酸媒介エピトープ結合がみられる。自然に存在する抗体に加えて、人
工ＶＨドメインもしくはＶＬドメインまたはそれらの断片およびそれらの組み合わせを工
学的に操作して、エピトープ結合領域を得ることができる（Ｈｏｌｔ ＬＪら、（２００
３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１（１１）：４８４～４９０頁；Ｐｏｌｏ
ｎｅｌｌｉ Ｌら、（２００８）ＰＬｏＳ ＯＮＥ、３（６）：ｅ２３７１）。非免疫グ
ロブリンベースのエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域（Ｂｉｎｚ ＨＫら、
（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３（１０）：１２５７～１２６８頁）ま
たはペプチド模倣物（Ｍｕｒａｌｉ ＲおよびＧｒｅｅｎｅ ＭＩ（２０１２）Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、５（２）：２０９～２３５頁）を工学的に操作するための「土
台」として用いられる人工タンパク質ドメインで見出すことができる。好ましくは、用語
「エピトープ結合領域」は、１または複数の重鎖可変ドメインと１または複数の相補的軽
鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、これらは一緒に、免疫グロブリン分子と１または
複数のエピトープとの特異的結合を許容する結合部位を形成する。
本明細書で用いる場合、用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ま
しくはヒトにおいて抗原または免疫原性活性を有するポリペプチドまたはタンパク質また
は非タンパク質分子の断片を含む。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗
体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原活性を有するエピト
ープは、当業者に公知の任意の方法、例えばイムノアッセイにより決定されるように、抗
体またはポリペプチドが特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。
抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。好ましくは、用語「エピトープ」は、
本明細書で用いる場合、少なくとも約３から５、好ましくは約５から１０または１５で、
約１，０００以下のアミノ酸（またはそれらの間の任意の整数）のポリペプチド配列のこ
とをいい、該配列は、この配列に応答して作製される抗体が結合する、それ自体またはよ
り大きい配列の一部としての配列を規定する。断片の長さについて臨界的な上限はなく、
ほぼ全長のタンパク質配列、または１もしくは複数のエピトープを含む融合タンパク質さ
え含むことがある。主題の発明において用いるエピトープは、それが由来する親タンパク
質の一部分と全く同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。よって、用語「エピト
ープ」は、天然の配列と同一の配列と、欠失、付加および置換（通常、保存的な性質）の
ような天然の配列に対する改変とを包含する。タンパク質抗原のエピトープは、それらの
構造およびエピトープ結合部位との相互作用に基づいて２つのカテゴリー、すなわち立体
構造エピトープおよび直鎖状エピトープに分けられる（Ｇｏｌｄｓｂｙ Ｒら、（２００
３）「Ａｎｔｉｇｅｎｓ（第３章）」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版）、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．５７～７５頁、ＩＳＢＮ０－７
１６７－４９４７－５）。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続な区画で
構成される。これらのエピトープは、３Ｄ表面の特徴および抗原の形状または３次元構造
に基づいてパラトープと相互作用する。ほとんどのエピトープは、立体構造エピトープで
ある。対照的に、直鎖状エピトープは、それらの１次構造に基づいてパラトープと相互作
用する。直鎖状エピトープは、抗原由来のアミノ酸の連続する配列で形成される。
用語「ヘテロ二量体免疫グロブリン」または「ヘテロ二量体断片」または「ヘテロ二量
体」または「重鎖のヘテロ二量体」は、本明細書で用いる場合、第１および第２領域のよ
うな第１および第２ポリペプチドを少なくとも含む免疫グロブリン分子またはその一部を
含み、ここで、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。好ま
しくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１鎖
は、第２鎖と同一でない少なくとも１つの領域を有し、両方の鎖は、それらの非同一領域
により集合、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、
少なくとも２つの異なるリガンド、抗原または結合部位に対する結合特異性を有し、すな
わち二重特異的である。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、本明細書で用いる場合、それら
に限定されないが、全長二重特異性抗体、二重特異性Ｆａｂ、二重特異性Ｆ（ａｂ’）2
、Ｆｃ領域と融合した二重特異性ｓｃＦｖ、Ｆｃ領域と融合したダイアボディ、およびＦ
ｃ領域と融合したドメイン抗体を含む。
用語「ホモ二量体免疫グロブリン」または「ホモ二量体断片」または「ホモ二量体」ま
たは「重鎖のホモ二量体」は、本明細書で用いる場合、第１および第２領域のような第１
および第２ポリペプチドを少なくとも含む免疫グロブリン分子またはその一部を含み、こ
こで、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する。好ましく
は、ホモ二量体免疫グロブリンは、２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１鎖は、第
２鎖と同一の少なくとも１つの領域を有し、両方の鎖は、それらの同一領域により集合、
すなわち相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリン断片は、少なくとも２つ
の領域を含み、ここで、第１領域は、第２領域と同一であり、両方の領域は、それらのタ
ンパク質－タンパク質界面により集合、すなわち相互作用する。
本発明に含まれる全ての免疫グロブリン定常領域について、番号付けは、ＩＭＧＴ（登
録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標）；既出）に従うことができる。
ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３およびＩＧＨＧ４からなる群から選択される全て
のヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常領域について、番号付けは、「Ｅ
Ｕナンバリングシステム」（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、６３（１）：７８～８５頁）に従うことができる。ＩＧＨ
Ｇ１のヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３定常領域についての完全な対応は、ＩＭ
ＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）；既出）で見出すことができる。
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＫＣ）について、番号付けは、「ＥＵナ
ンバリングシステム」（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、既出）に従うことができる。ヒトＣＫ
領域についての完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標））；既出）
で見出すことができる。
ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧ
ＬＣ６およびＩＧＬＣ７）について、番号付けは、「Ｋａｂａｔナンバリングシステム」
（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出）に従うことができる。ヒトＩＧＬＣ領域についての完全な
対応は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）；既出）で見出すことができる。
ヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリン重鎖定常領域は、本明細書で言及する場合、以下の領域
境界、ＣＨ１領域（ＥＵ番号付け：１１８～２１５）、ヒンジγ１領域（ＥＵ番号付け：
２１６～２３０）、ＣＨ２領域（ＥＵ番号付け：２３１～３４０）およびＣＨ３領域（Ｅ
Ｕ番号付け：３４１～４４７）を有する。本明細書で言及するヒトＣＫ領域は、残基１０
８から２１４（ＥＵ番号付け）にわたる。本明細書で言及するヒトＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ
２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７領域は、残基１０８～２１５（Ｋａｂａｔ
ナンバリング）にわたる。
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、本明細書で用いる場合、自然のアミノ酸
および自然でないアミノ酸を含む。好ましくは、自然のアミノ酸が含まれる。
用語「改変」または「アミノ酸改変」は、本明細書において、ポリペプチド配列中のア
ミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。用語「置換」または「アミノ酸置換」また
は「アミノ酸残基置換」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列中の第１アミノ酸残基
を第２アミノ酸残基で置換することをいい、ここで、第１アミノ酸残基は、第２アミノ酸
残基とは異なり、すなわち置換アミノ酸残基は、置換されたアミノ酸とは異なる。例えば
、置換Ｒ９４Ｋは、９４位のアルギニンがリジンで置き換えられたバリアントポリペプチ
ドのことをいう。例えば、９４Ｋは、９４位のリジンでの置換を示す。本明細書での目的
のために、複数の置換を、典型的に、斜線またはコンマで分ける。例えば「Ｒ９４Ｋ／Ｌ
７８Ｖ」または「Ｒ９４Ｋ，Ｌ７８Ｖ」は、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む二重バリ
アントのことをいう。「アミノ酸挿入」または「挿入」により、本明細書で用いる場合、
親のポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入－９
４は、９４位での挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」により、本明細書で用い
る場合、親のポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、
Ｒ９４－は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
ある種の実施形態では、プロテインＡとの結合における用語「減少する」、「低減する
」または「低減」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは
野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののよう
な当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその
断片とプロテインＡとの結合の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７
０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％、１００％（喪失）までの
全体的な減少のことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、１０倍
（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（または３ｌｏｇ）、１０
，０００倍（または４ｌｏｇ）または１００，０００倍（または５ｌｏｇ）の全体的な減
少のことをいうことがある。
プロテインＡとの結合についての用語「喪失する」、「排除する」、「喪失」または「
排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒト
ＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術
において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロ
テインＡとの結合の１００％の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断
片とプロテインＡとの結合の完全な消失のことをいう。
同様に、プロテインＧとの結合における用語「減少する」、「低減する」または「低減
」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇ
Ｇ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術にお
いて既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテイ
ンＧとの結合の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、
８５％、９０％、９５％、９７％または９９％、１００％（喪失）までの全体的な減少の
ことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、１０倍（すなわち１ｌ
ｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（または３ｌｏｇ）、１０，０００倍（ま
たは４ｌｏｇ）または１００，０００倍（または５ｌｏｇ）の全体的な減少のことをいう
ことがある。
プロテインＧとの結合についての用語「喪失する」、「排除する」、「喪失」または「
排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒト
ＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術
において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロ
テインＧとの結合の１００％の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断
片とプロテインＧとの結合の完全な消失のことをいう。
同様に、親和性試薬との結合における用語「減少する」、「低減する」または「低減」
は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ
Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術におい
て既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬
との結合の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５
％、９０％、９５％、９７％または９９％、１００％（喪失）までの全体的な減少のこと
をいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、１０倍（すなわち１ｌｏｇ
）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（または３ｌｏｇ）、１０，０００倍（または
４ｌｏｇ）または１００，０００倍（または５ｌｏｇ）の全体的な減少のことをいうこと
がある。
親和性試薬との結合についての用語「喪失する」、「排除する」、「喪失」または「排
除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩ
ｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術に
おいて既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性
試薬との結合の１００％の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断片と
親和性試薬との結合の完全な消失のことをいう。
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノ
クローナル抗体である。ある種の実施形態では、二重特異性抗体は、親の抗体と比べてＶ
Ｈ領域中に１または複数のアミノ酸改変を有する二重特異性抗体である。ある種の実施形
態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってよい。二重特異性抗体は、標
的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性薬剤を局在化するために用いてもよい。これら
の抗体は、標的抗原と結合する腕と、例えばサポリン、抗インターフェロン－α、ビンカ
アルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射活性同位体ハプテンのような細
胞傷害性薬剤と結合する腕とを保有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片と
して調製できる。二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術において知られている。伝
統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、免疫グロブリン重鎖－軽鎖の２つの対の同時発
現に基づき、ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕ
ｅｌｌｏ、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７～４０頁）。免疫グロブリン重鎖
および軽鎖の無作為な取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は
、異なる抗体分子の混合物をおそらく生成し、これらの抗体のうち１つだけが正しい二重
特異性構造を有する。正しい分子の精製は、親和性クロマトグラフィーステップにより通
常行われるが、面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９およ
びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ、１０：３６５５～９頁に開示さ
れている。異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体－抗原結合部位）を有す
る抗体可変領域を、免疫グロブリン定常領域配列と融合させる。融合体は、例えば、ヒン
ジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域を有す
る。ある種の実施形態では、軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（
ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と所
望であれば免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、
適切な宿主生物に該ベクターを同時トランスフェクトする。このことにより、構築におい
て用いる３つのポリペプチド鎖の比率が等しくない場合に最適な収率が得られる実施形態
において、３つのポリペプチド断片の相互割合を柔軟に調節できる。しかし、等しい比率
の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすか、または比率が特に重
要でない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクタ
ーに挿入することが可能である。
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロ
コンジュゲート中の抗体の一方はアビジンと結合でき、他方はビオチンと結合できる。こ
のような抗体は、例えば、免疫系の細胞を不要な細胞に標的化させること（ＵＳ４，６７
６，９８０）およびＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３
７３およびＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡
便な架橋法を用いて作製してよい。適切な架橋剤は、いくつかの架橋技術とともに、当該
技術において公知である（ＵＳ４，６７６，９８０を参照されたい）。２価を超える抗体
も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製できる（Ｔｕｔｔ Ａら（１９９１）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０～９頁を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍抗原、サイトカイン、血管増殖因子およびリ
ンパ－血管形成性増殖因子からなる群から選択される抗原と結合する二重特異性ヘテロ二
量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性全長抗体を提供する。好ましくは
、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、Ｈ
ＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、Ｉ
ｇＥおよびＶＬＡ－２からなる群から選択される抗原と結合する。好ましくは、二重特異
性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、ＨＥＲ２およ
びＨＥＲ３と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはそ
の断片または二重特異性抗体は、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ、またはＣＤ３およびＨＥＲ２
と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片また
は二重特異性抗体は、ＣＤ１９およびＩｇＥ、またはＣＤ２０およびＩｇＥと結合する。
用語「細菌の表面タンパク質」は、自然に存在する免疫グロブリンもしくはそれらの断
片および／または工学的に操作された可変ドメインもしくはＦａｂ断片もしくはＦｃ領域
のような人工免疫グロブリンもしくはそれらの断片と結合する、溶媒とアクセス可能な細
菌の表面に繋留または埋め込まれたタンパク質を含む。別の態様では、細菌の表面タンパ
ク質は、可溶性バリアントとして遊離され得る。さらに、本発明の目的のために、「細菌
の表面タンパク質」は、天然配列に対して欠失、付加および置換（保存的な性質であり得
る）のような改変を含み、自然に存在する免疫グロブリンもしくはそれらの断片および／
または人工免疫グロブリンもしくはそれらの断片との結合を保持するタンパク質を含む。
免疫グロブリンと相互作用する既知の細菌の表面タンパク質の例は、グラム陽性細菌で
見出され、ここで、これらのタンパク質は、細菌が独特の場所にてとどまるか、または免
疫系を回避するための手段として働く。免疫グロブリンまたはそれらの断片と結合するい
くつかの細菌の表面タンパク質は、抗体の分析、精製および調製、またはその他の診断お
よび生物学的研究用途において用いられている。免疫グロブリンまたはそれらの断片と結
合する細菌の表面タンパク質は、それらに限定されないが、以下の例を含む。
プロテインＡ：プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのいく
つかの株により生成される細胞壁成分であり、単一ポリペプチド鎖から構成される。プロ
テインＡ遺伝子生成物は、病原体の細胞壁とタンデムな様式で結合する５つの相同反復か
ら構成される。５つのドメインはおよそ５８アミノ酸の長さであり、ＥＤＡＢＣと表示さ
れ、それぞれ免疫グロブリン結合活性を示す（Ｔａｓｈｉｒｏ ＭおよびＭｏｎｔｅｌｉ
ｏｎｅ ＧＴ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５（４）：
４７１～４８１頁）。５つの相同免疫グロブリン結合ドメインは、３らせんの束に折り畳
まれる。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、最も顕著にはＩｇＧと結合
できる（Ｈｏｂｅｒ Ｓら、（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ
．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、８４８（１）：４０～４７頁）
。プロテインＡは、ほとんどの免疫グロブリンの重鎖とＦｃ領域内で結合するが、ヒトＶ
Ｈ３ファミリーの場合にＦａｂ領域内でも結合する（Ｊａｎｓｓｏｎ Ｂら、（１９９８
）ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０（１）：６９～７８
頁）。プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギおよびモルモットを含む様々な種由来のＩ
ｇＧと結合するが、ヒトＩｇＧ３と結合しない（Ｈｏｂｅｒ Ｓら、（２００７）既出）
。ヒトＩｇＧ３がプロテインＡと結合できないことは、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域中のＨ４
３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換により説明できる（ＥＵ番号付け、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、
（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１（１）：２５～３４頁）。Ｉ
ｇＧの他に、プロテインＡは、ＩｇＭおよびＩｇＡとも相互作用する。
プロテインＡが抗体とこのような高い親和性で結合する能力は、生物薬におけるその工
業的規模での使用のための動機づけとなる。生物薬における抗体の生成のために用いるプ
ロテインＡは、通常、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え生成され、天然プロテインＡと本質的
に同じように機能する（Ｌｉｕ ＨＦら、（２０１０）ＭＡｂｓ、２（５）：４８０～４
９９頁）。
最も一般的に、組換えプロテインＡは、抗体の精製のための定常相クロマトグラフィー
樹脂に結合させる。最適な結合は、ｐＨ８．２にて生じるが、結合は、中性または生理的
条件（ｐＨ７．０～７．６）でも良好である。溶出は、通常、酸性ｐＨ（グリシン－ＨＣ
ｌ、ｐＨ２．５～３．０）に向かうｐＨシフトにより達成される。このことは、タンパク
質構造に永続的に影響を与えることなく、ほとんどのタンパク質－タンパク質および抗体
－抗原結合相互作用を効率的に解離する。それにもかかわらず、いくつかの抗体およびタ
ンパク質は、低ｐＨにより損傷を受け、１／１０容量のアルカリ性緩衝液、例えば１Ｍ
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることにより回収後に直ちに中和して、低ｐＨ条件
下にある期間を最小限にすることが最適である。
様々な市販のプロテインＡクロマトグラフィー樹脂が存在する。これらの媒体間の主な
違いは、支持マトリクスのタイプ、プロテインＡリガンド修飾、孔サイズおよび粒子サイ
ズである。これらの因子の違いは、圧縮率、化学的および物理的頑強性、拡散抵抗および
吸着剤の結合能の違いを生じる（Ｈｏｂｅｒ Ｓら、（２００７）、既出）。プロテイン
Ａクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定されないが、実施例において用いるよう
に、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ
樹脂およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ樹脂を含む。
プロテインＧ：プロテインＧは、ＣおよびＧ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから単離され
た細菌細胞壁タンパク質である。異なるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから単離された天然の
プロテインＧのＤＮＡ配列決定により、免疫グロブリン結合ドメインならびにアルブミン
および細胞表面結合のための部位が同定された。株に依存して、免疫グロブリン結合領域
およびアルブミン結合領域はともに、２～３つの独立して折り畳まれた単位から構成され
る（Ｔａｓｈｉｒｏ ＭおよびＭｏｎｔｅｌｉｏｎｅ ＧＴ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５（４）：４７１～４８１頁）。Ｇ１４８株由来のプ
ロテインＧは、それぞれＡＢＤ１、ＡＢＤ２およびＡＢＤ３ならびにＣ１、Ｃ２およびＣ
３と表示される、３つのアルブミンおよび免疫グロブリン結合ドメインから構成される（
Ｏｌｓｓｏｎ Ａら、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６８（２）：３１
９～３２４頁）。Ｃ１、Ｃ２およびＣ３と表示される各免疫グロブリン結合ドメインは、
およそ５５残基であり、約１５残基のリンカーにより分けられている。プロテインＧ免疫
グロブリン結合ドメインの全ての実験的に解明された３Ｄ構造は、いずれのジスルフィド
ブリッジも、堅く結合した補欠分子族も有さない、非常に密に詰まった球状構造を示す（
Ｓａｕｅｒ－Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ＡＥら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、３（３）：
２６５～２７８頁；Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ（１９９２）Ｎａｔ
ｕｒｅ、３５９（６３９７）：７５２～７５４頁；Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌ
ｅｙ ＤＢ（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３（５）：９０６～９１８頁；Ｌ
ｉａｎ ＬＹら、（１９９４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１（６）：３５５～
３５７頁）。構造は、アルファ－らせんにより接続された２つの逆平行ベータヘアピンで
構成された４本鎖ベータシートを含む。
ＣおよびＧ群由来の連鎖球菌株は、プロテインＡとは対照的に、ＩｇＧ３を含むＩｇＧ
の全てのヒトサブクラスとの結合を示す。プロテインＧは、マウス、ウサギおよびヒツジ
を含むいくつかの動物ＩｇＧとも結合する（Ｂｊｏｒｃｋ ＬおよびＫｒｏｎｖａｌｌ
Ｇ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３（２）：９６９～９７４頁；Ａｋｅｒｓｔ
ｒｏｍ Ｂら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５（４）：２５８９～２５９２
頁；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ＢおよびＢｊｏｒｃｋ Ｌ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２６１（２２）：１０２４０～１０２４７頁；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ＳＲら、（
１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６７（３）：８７０～８８０頁）。よって、プ
ロテインＧは、プロテインＡと比較して、異なる種のサブクラスに対する、より広い結合
スペクトルを示す。
さらに、プロテインＧは、ＩｇＧのＦａｂ部分と高い親和性で結合する。連鎖球菌プロ
テインＧの結合ドメインの構造は、単独（ＮＭＲによる、Ｌｉａｎ ＬＹら、（１９９４
）既出）およびＩｇＧ１ Ｆａｂとの複合体（ｘ線結晶解析による、Ｄｅｒｒｉｃｋ Ｊ
ＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ（１９９２）既出ならびにＤｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉ
ｇｌｅｙ ＤＢ（１９９４）既出）の両方で決定されている。全ての実験的に解明された
３Ｄ構造は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ１ドメイン内での結合を示した。
プロテインＡと同様に、Ｅ．ｃｏｌｉで生成される組換えプロテインＧは、抗体を精製
するために日常的に用いられる。アルブミンおよび細胞表面結合ドメインは、非特異的結
合を低減するために組換えプロテインＧから取り除かれており、よって、粗試料からＩｇ
Ｇを分離するために用いることができる。プロテインＡと同様に、組換えプロテインＧは
、抗体の精製のための定常相クロマトグラフィー樹脂に結合させる。最適な結合は、ｐＨ
５にて生じるが、結合は、ｐＨ７．０～７．２においても良好である。プロテインＡにつ
いてと同様に、溶出も、酸性ｐＨ（グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５～３．０）に向かうｐ
Ｈシフトにより達成される。プロテインＧクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定
されないが、実施例において用いるように、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのプロテインＧ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂およびＨｉＴｒａｐ（商標）
プロテインＧ ＨＰカラムを含む。
プロテインＬ：プロテインＬは、細菌Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇ
ｎｕｓに元々由来するが、現在では組換え生成される、免疫グロブリン結合タンパク質で
ある（Ｂｊｏｒｃｋ Ｌ（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０（４）：１１９４～
１１９７頁；Ｋａｓｔｅｒｎ Ｗら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７（
１８）：１２８２０～１２８２５頁）。プロテインＬは、抗体の抗原結合部位に干渉する
ことなく、カッパ軽鎖相互作用により結合する独特の能力を有する（Ｎｉｌｓｏｎ ＢＨ
ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６４（１）：３３～４０頁）
。このことにより、プロテインＬは、他の抗体結合タンパク質よりも広い範囲の免疫グロ
ブリンクラスおよびサブクラスと結合する能力を有する。プロテインＬは、全てのクラス
の免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）と結合する。プロテ
インＬは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ断片とも結合する（Ｎｉｌｓｏｎ Ｂ
Ｈら、（１９９３）既出；Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ＳＰら、（１９９５）Ｂｉｏｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ、５（６）：３５９～３６７頁）。プロテインＬは、カッパＩ、ＩＩＩおよび
ＩＶサブクラスのヒト可変ドメインならびにマウスカッパＩサブクラスと結合する（Ｎｉ
ｌｓｏｎ ＢＨら、（１９９２）既出）。プロテインＬクロマトグラフィー樹脂の例は、
それらに限定されないが、実施例において用いるように、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔのプロテ
インＬ樹脂を含む。
Ｍ１タンパク質およびプロテインＨ：Ｍ１タンパク質およびプロテインＨは、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのある種の株の表面に同時に存在する表面タンパ
ク質である。プロテインＨは、ＩｇＧのＦｃ領域に対する親和性を有する（Ａｋｅｓｓｏ
ｎ Ｐら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７（６）：５２３～５３１頁；Ａ
ｋｅｓｓｏｎ Ｐら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００（Ｐｔ３）：８７７～
８８６頁）。プロテインＨは、ヒト、サルおよびウサギ由来のＩｇＧのＦｃ領域と結合す
る（Ａｋｅｓｓｏｎ Ｐら、（１９９０）、既出；Ｆｒｉｃｋ ＩＭら、（１９９５）Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．、１４（８）：１６７４～１６７９頁）。Ｍタンパク質も、フィブリノゲン
と結合することが知られており（Ｋａｎｔｏｒ ＦＳ（１９６５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、
１２１：８４９～８５９頁）、以前の研究により、ＡＰＩ株由来のＭ１タンパク質がアル
ブミンおよびポリクローナルＩｇＧに対する親和性を有することが示されている（Ｓｃｈ
ｍｉｄｔ ＫＨおよびＷａｄｓｔｒｏｍ Ｔ（１９９０）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｋｔ
ｅｒｉｏｌ．、２７３（２）：２１６～２２８頁）。
細菌の表面タンパク質は、親和性試薬の例である。その他の例は、それらに限定されな
いが、人工的に作製されたタンパク質、例えば抗体およびそれらの断片、例えばＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＫａｐｐａＳ
ｅｌｅｃｔおよびＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ親和性樹脂またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標
）ＩｇＧ－ＣＨ１を含む。
用語「ヒトＦｃＲｎ」は、ＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１（ＩｇＧ Ｆｃ
断片受容体トランスポーターアルファ鎖またはＦｃＲｎ膜貫通アルファ鎖ともよばれる；
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース受託番号Ｐ５５８９９）から構成されるヒトヘテロ二量体タ
ンパク質を含み、ベータ２－ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース受託番号Ｐ
６１７６９）と非共有的に結合する。ヒトＦｃＲｎは、ＩｇＧについてのＭＨＣクラスＩ
関連受容体であり、その発現は、げっ歯類および全ての年齢のヒトにおける上皮細胞、内
皮細胞、マクロファージおよび樹状細胞を含む多様な細胞型において同定されている（Ｒ
ｏｏｐｅｎｉａｎ ＤＣおよびＡｋｉｌｅｓｈ Ｓ（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、７（９）：７１５～７２５頁）。ヒトＦｃＲｎは、内皮細胞でのエンドサイ
トーシスの経路において出現することにより、成体でのＩｇＧの再利用において役割を演
じる（Ｔｅｓａｒ ＤＢおよびＢｊｏｒｋｍａｎ ＰＪ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２０（２）：２２６～２３３頁）。酸性のエンドソームに
あるＦｃＲｎ受容体は、内在化したＩｇＧと結合し、それを細胞表面にて再生する。Ｉｇ
Ｇは、ＦｃＲｎ受容体から、血液の塩基性ｐＨにて放出され、そのことによりリソソーム
分解を逃れる。この機構は、他のアイソタイプと比較してより長い血液中のＩｇＧの半減
期を説明する。ＦｃＲｎは、免疫グロブリン分子と２：１複合体を形成し、すなわち、２
つのＦｃＲｎ分子は、１つのＦｃ領域と結合するか、またはＦｃ領域由来の２つの重鎖は
それぞれ、１分子のＦｃＲｎと結合する（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ＤＣおよびＡｋｉｌｅｓ
ｈ Ｓ（２００７）既出）。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域と、ＣＨ２ドメインとＣＨ３
ドメインとの間の接合部にて結合する。ＦｃＲｎの機能にとって重要なことは、ＩｇＧの
ｐＨ依存性結合である。ｐＨ６．０では、ＦｃＲｎはＩｇＧと結合するが、ＩｇＧとＦｃ
Ｒｎとの結合は、ｐＨ７．５にて検出不能である。ＦｃＲｎ／ＩｇＧ相互作用の厳密なｐ
Ｈ依存性は、６．０～６．５のｐＨ範囲にわたって脱プロトン化する、ヒスチジンのイミ
ダゾール側鎖の関与を示唆する。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの３１０位および４３５位
での表面とアクセス可能なヒスチジン残基の変異は、ＩｇＧとＦｃＲｎとの結合を著しく
低減させまたは喪失させた。ヒトＦｃＲｎ、プロテインＡおよびプロテインＧ結合部位は
、ヒトＩｇＧのＦｃ領域中でオーバーラップする（Ｎｅｚｌｉｎ ＲおよびＧｈｅｔｉｅ
Ｖ（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ．第８２巻：１５５～２１５頁）。
用語「クロマトグラフィー」は、タンパク質液体クロマトグラフィーのことをいい、タ
ンパク質の混合物を分析および精製するために頻繁に用いられる液体クロマトグラフィー
の一形態である高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含む。他の形態の
クロマトグラフィーと同様に、混合物中の異なる成分が、２つの物質、多孔質の固体（定
常相）の中を通過する移動流体（移動相）に対して異なる親和性を有するので、分離が可
能である。ＦＰＬＣでは、移動相は、水性溶液または「緩衝液」である。緩衝液の流速は
、重力流の下で運転できるか、または一定の速度に通常保たれる容積型ポンプにより制御
できる。一方、緩衝液の組成は、２つ以上の外部の貯水槽から異なる割合で流体を引き出
すことにより変動できる。定常相は、ビーズ、通常、架橋アガロースで構成される樹脂で
あり、円柱形のガラスまたはプラスチックカラムに充填される。ＦＰＬＣ樹脂は、用途に
応じて広い範囲のビーズサイズおよび表面リガンドで入手可能である。
最も一般的なＦＰＬＣ方策であるイオン交換または親和性クロマトグラフィーでは、緩
衝液Ａ（ランニング緩衝液）中で対象のタンパク質が樹脂と結合するが、緩衝液Ｂ（溶出
緩衝液）中で解離して溶液に戻るように樹脂が選択される。１または複数種の対象のタン
パク質を含有する混合物を、１００％緩衝液Ａに溶解し、カラムにロードする。対象のタ
ンパク質は樹脂と結合し、その他の成分は緩衝液中で運び出される。緩衝液の全流速は一
定に保つ。しかし、緩衝液Ｂ（「溶出」緩衝液）の割合を、０％から１００％まで徐々に
または段階的な様式でプログラムされた濃度変化（「勾配」）に従って増加させることが
できる。このプロセス中のある時点で、結合したタンパク質のそれぞれは、解離して、排
出液中に出現する。典型的な実験室ＦＰＬＣ検出システムは、１または２つの高精度ポン
プ、制御ユニット、カラム、検出システムおよび分画回収器から構成される。システムを
手動で運転することが可能であるが、これらの構成要素は、通常、パーソナルコンピュー
タまたはより古いユニットでは、マイクロコントローラと連結されている。これらの半自
動化ＦＬＰＣシステムを用いて運転する場合（例えばＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫ
ＴＡシステムを用いる場合）、排出液は、通常、塩濃度（導電率により）およびタンパク
質濃度（２８０ｎｍの波長での紫外光の吸収により）を測定する２つの検出器を通過する
。紫外線の吸収 対 用いた移動相の全容量を記録するプロットは、精製プロセスを視覚
的に表示する。これらのプロットは、クロマトグラムまたはクロマトグラフィートレース
とよばれる。各タンパク質が溶出されるにつれて、該タンパク質は、タンパク質濃度の「
ピーク」として（かついわゆるクロマトグラムまたはクロマトグラフィートレース中の図
形的な「ピーク」としても）排出液中に出現し、これをさらなる使用のために回収できる
。
ＦＰＬＣは、１９８２年にＰｈａｒｍａｃｉａ（現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に
よりスウェーデンにおいて開発および販売され、ＨＰＬＣまたは高性能液体クロマトグラ
フィーと対比するために高速高性能液体クロマトグラフィーと元々よばれた。ＦＰＬＣは
、一般的に、タンパク質に対してのみ用いられる。しかし、樹脂および緩衝液の広い選択
肢があるために、ＦＰＬＣは、より広い用途を有する。ＨＰＬＣとは対照的に、用いる緩
衝液圧力は比較的低く、典型的に５バール未満であるが、流速は比較的高く、典型的に１
～５ｍｌ／分である。ＦＰＬＣは、カラム中のミリグラム量の混合物の全容量５ｍｌ以下
での分析から、カラム中のキログラム量の精製タンパク質の何リットルもの容量での工業
的生成まで容易にスケールアップできる。溶出タンパク質またはその混合物は、異なる分
析技術、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析および当該技術において既知のその他の既知
の分析技術によりさらに分析できる。
「親和性クロマトグラフィー」のプロセスは、定常相に架橋され、特異的分子または分
子のクラスに対する結合親和性を有するリガンドとしての親和性試薬の使用を含む。リガ
ンドは、生体分子、例えばタンパク質リガンドであり得るか、または合成分子であり得る
。両方のタイプのリガンドは、良好な特異性を有する傾向にある。生成において最も一般
的に用いられるタンパク質リガンドは、親和性試薬プロテインＡである。親和性クロマト
グラフィーでは、溶液（例えば対象のタンパク質を含有する粗細胞上清）をカラムにロー
ドすると、標的タンパク質は、通常、吸着されるが、混入物（その他のタンパク質、脂質
、炭水化物、ＤＮＡ、色素など）はカラムを通過できる。吸着剤自体は、通常、クロマト
グラフィーカラムに充填されるが、吸着段階は、バッチ結合モードで撹拌したスラリーと
して吸着剤を用いることにより行うことができる。吸着の後の次の段階は、洗浄段階であ
り、ここでは、吸着剤を洗浄して残存混入物を除去する。結合したタンパク質は、次いで
、半純粋または純粋な形で溶出される。溶出は、タンパク質が固定化リガンドともはや相
互作用できず、遊離されるように緩衝液または塩組成を変化させることにより、通常、達
成される。いくつかの場合では、対象のタンパク質は、親和性樹脂と結合しないことがあ
り、親和性クロマトグラフィーは、不要な混入物との結合に充てられ、よって、未結合の
画分を回収して、対象のタンパク質を単離する。親和性クロマトグラフィーは、固定床ま
たは流動床で行うことができる。
用語「勾配モードクロマトグラフィー」は、「溶出」緩衝液（緩衝液Ｂ）の割合を０％
から１００％まで徐々にまたは段階的な様式で増加させるクロマトグラフィー法のことを
いう。
用語「捕捉－溶出モードクロマトグラフィー」または「捕捉－溶出精製モード」または
「捕捉－溶出精製」は、「溶出」緩衝液（緩衝液Ｂ）の割合を０％から１００％まで徐々
にまたは段階的な様式で増加させないが、捕捉の後に１００％で直接用いて、場合によっ
てランニング緩衝液（緩衝液Ａ）を用いる洗浄ステップを行うクロマトグラフィー法のこ
とをいう。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製
二重特異性抗体の生成の最も一般的な方法の１つは、単一細胞中で２つの別個の抗体を
発現させることである。このような方法は、別個の抗体の重鎖がホモおよびヘテロ二量体
の両方を形成するので、複数の種を生じる。必要なのはヘテロ二量体だけであるので、こ
れらを、ホモおよびヘテロ二量体の混合物から分離する必要がある。本発明は、通常のプ
ロテインＡおよびプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを利用することにより、ホモお
よびヘテロ二量体の混合物からヘテロ二量体免疫グロブリンを分離するための高度に効率
的な方法を提供する。
第１ステップ（実施例１）として、プロテインＡまたはプロテインＧ結合を喪失させる
置換を設計し、両方の単量体が置換を有するホモ二量体免疫グロブリンＦｃ断片において
試験した。プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる新しい置換を選択し、最
小限の数である２まで低減した。
第２ステップ（実施例２）では、ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＡまたはＧとの結
合を低減させるまたは喪失させる置換を、ＦＡＢまたはｓｃＦｖ断片に基づくホモ二量体
免疫グロブリン中でアッセイした。このことにより、両方の技術についての重要なネック
となるところを同定できた。プロテインＡとの結合を低減またはなくすための置換を有す
る重鎖内にＶＨ３サブクラスの可変重鎖ドメインが存在することにより、プロテインＡに
基づくいずれの差次的親和性方法も妨げられることがわかった。一方、プロテインＧとの
結合を低減またはなくすための置換を有する重鎖内にガンマＣＨ１定常ドメインが存在す
ることにより、プロテインＧに基づく新しい差次的親和性方法が妨げられる。これらの主
な障害に対する解決法は、プロテインＡに基づく差次的親和性方法についてプロテインＡ
とＶＨ３サブクラスとの結合を低減させるまたは喪失させるフレームワーク置換の形で、
かつプロテインＧに基づく新しい差次的親和性方法についてプロテインＧとガンマＣＨ１
ドメインとの結合を低減させるまたは喪失させるＣＨ１ベースの置換の形で見出された。
最後のステップ（実施例３）では、プロテインＡおよびＧ差次的親和性方法をともに、
それら自体でかつ上記の溶液との組み合わせで用いて、ヘテロ二量体免疫グロブリンを精
製することに成功した。より重要なことには、プロテインＡおよびＧ差次的親和性方法を
組み合わせて、逐次的に用いた場合に、２つの逐次的な捕捉および直接溶出のクロマトグ
ラフィーステップのみに依拠して、勾配溶出を必要とせずにヘテロ二量体免疫グロブリン
の精製ができたことを示した。
ヒトＦｃＲｎとの結合は、免疫グロブリンを分解から保護し、免疫グロブリンの半減期
を増加させるので、プロテインＡまたはＧとの結合を喪失させるＦｃ領域中の変異がＦｃ
Ｒｎとの結合を破壊しないことが必須である。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定（実施例４）から、本明細書に示すプロテインＧに
基づく新しい差次的親和性方法において用いる置換が、ヒトＦｃＲｎ結合の＞９０％の保
持を可能にしたが、プロテインＡに基づく以前に記載された差次的親和性方法は、ヒトＦ
ｃＲｎ結合を約７５％だけ保持したことが見出された。プロテインＧに基づく新しい差次
的親和性方法を作製することヒト治療用のヘテロ二量体免疫グロブリンを開発する場合に
選択される技術。免疫グロブリンのＦｃ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換は、Ｆ
ｃとヒトＦｃγＲ３ａとの結合に影響を与えなかった。
実施例５から７は、ガンマ免疫グロブリンのＦｃ領域およびＣＨ１領域中のプロテイン
Ｇ結合を排除する置換の特徴を決定する。実施例８は、本発明に基づく治療用ヘテロ二量
体免疫グロブリンの設計および機能的試験を示す。
実施例
方法：
一般的な方法
発現ベクターの構築
適当なｃＤＮＡ鋳型を用いる標準的なオーバーラップＰＣＲ技術により、ｃＤＮＡコー
ド配列中に変異を導入した。ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ ＤＮＡ制限
酵素で消化し、精製し、同じＤＮＡ制限酵素で予め消化した、ＣＭＶプロモーターおよび
ウシホルモンポリアデニル化を保有する改変ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にライゲーションした。軽鎖を
、同じ発現ベクターに独立してライゲーションした。全ての発現ベクターにおいて、分泌
は、ネズミＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより駆動された。
組換え抗体およびその断片の発現
一過性発現のために、等量の工学的に操作した各鎖のベクターを、懸濁馴化ＨＥＫ－Ｅ
ＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－１０８５２）にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて
同時トランスフェクトした。典型的に、１ｍｌあたり０．８～１．２百万細胞の密度の１
００ｍｌの細胞懸濁物にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物をトランスフェクトする。工学的に操作し
た各鎖遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、細胞を４～５
日間さらに培養して培養培地（０．１％プルロニック酸、４ｍＭグルタミンおよび０．２
５μｇ／ｍｌジェネテシンを補ったＥＸ－ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３血清フリー培地
（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））中に分泌させることにより、免
疫グロブリン構築物を生成する。分泌された免疫グロブリンを含有する細胞フリー培養上
清は、遠心分離の後にろ過することにより調製し、さらなる分析に用いた。
実施例１の方法：プロテインＡまたはＧ結合が排除されたＦｃ断片の精製および試験
捕捉－溶出モードクロマトグラフィー
上清を、０．１容量（Ｖ）の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて前処理した
後に精製した。プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（プ
ロテインＡ結合部位変異体）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂（プロテ
インＧ結合部位変異体）（ともにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ
、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから；それぞれカタログ番号１７－０
６１８－０１および１７－５４３８－０１）を、前処理した上清にそれぞれ加えた。混合
物を一晩４℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、結合したタンパク質
を１０ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、４カラム容量（ＣＶ）の０．１Ｍグリシンｐ
Ｈ３．０で溶出し、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、
通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス－トリス４～１２％
アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
により非還元条件下で分析した。
勾配モードクロマトグラフィー
生成の後に、ホモ二量体Ｆｃバリアントを含有する細胞培養上清を、まず、プロテイン
Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（プロテインＡ結合部位変異体
）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（プロテインＧ結合部
位変異体）（以下を参照されたい、ともにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ
ＧｍｂＨの樹脂；それぞれカタログ番号１７－０６１８－０１および１７－５４３８－０
１）を用いる捕捉－溶出モードクロマトグラフィーで精製した。捕捉－溶出モードクロマ
トグラフィーから溶出された物質を、続いて、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅ
ｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（プロテインＡ結合部位変異体）または
１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム（プロテインＧ結合部位変異体
）にロードした。両方のカラムを、０．２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ８．０で予め
平衡化し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）クロマトグラフィーシステム（ともにＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨから；それぞれカタログ番号１１－０
０３４－９３および１７－０４０４－０１）上で、１ｍｌ／分の流速にて操作した。溶出
は、様々な量の２種の緩衝液（ランニング緩衝液（Ａ）：０．２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩
衝液ｐＨ８．０および溶出緩衝液（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．
０（実施例１．１）または０．０２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ２．６（実施例１．
２）を組み合わせるｐＨ直線勾配を用いて行った。直線勾配は、０％Ｂから１００％Ｂま
で５カラム容量（ＣＶ）で（実施例１．１）、または１０ＣＶ（実施例１．２）で進めた
。溶出画分を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過
画分および溶出画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス－トリス４～１２％アク
リルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によ
り非還元条件下で分析した。
実施例２の方法：プロテインＡまたはＧ結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリンの精
製および試験
実施例２．１：プロテインＡ結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリン
プロテインＡ結合が排除されたＦＡＢ断片の精製および試験。
生成の後に、細胞培養上清を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で前処
理した。プロテインＬ樹脂（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）を
前処理した上清に加え、一晩４℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、
結合したタンパク質を１０ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、４ＣＶの０．１Ｍグリシ
ンｐＨ３．０で溶出し、最後に、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和
した。プロテインＡ結合を評価するために、プロテインＬ精製ＦＡＢを１ｍｌ ＨｉＴｒ
ａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ
ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にｐＨ８．０（クエン酸
／Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液）にて注入した。溶出は、様々な量の２種の緩衝液（ランニング緩
衝液（Ａ）：０．２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ８．０および溶出緩衝液（Ｂ）：０
．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０）を組み合わせるｐＨ直線勾配を用いて行
った。直線勾配は、０％Ｂから１００％Ｂまで５ＣＶで進めた。溶出画分を、０．１Ｖの
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、Ｓ
ＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス－トリス４～１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した
。
プロテインＡ結合が排除されたＦＡＢ断片のＳＰＲ試験
ＩＧＨＧ１ Ｆｃ断片と融合したヒトＨＥＲ２細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、上
記の重鎖および軽鎖発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、ＰＥＩ法（Ｐ
ＣＴパンフレットＷＯ１２／１３１５５５を参照されたい）を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞
に一過的にトランスフェクトした。上清を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８
．０で前処理し、実施例１に記載したように抗原をプロテインＡ捕捉－溶出クロマトグラ
フィーにより精製した。ＳＰＲ実験のために、モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ
）抗体センサチップを用いた。これは、Ｆｃと融合した組換えＨＥＲ２抗原を正しい向き
で捕捉することを可能にした（ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９
、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（
商標）２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔ
ｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録した。異なる希釈の抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ
（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５７、０．７８、０．３９ｎＭ）を
センサチップ上に４分間、３０μｌ／分にて注入した。各測定について、７分間の解離の
後に、３Ｍ ＭｇＣｌ2溶液を１分間、３０μｌ／分にて再生のために注入した。データ
（センサグラム：ｆｃ２－ｆｃ１）を、１：１ラングミュアを用いてフィットさせた。捕
捉されたＨＥＲ２－ｃの各測定の初めの実験的変動を埋め合わせるために、全てのフィッ
ティングにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。測定は、１点につき２個の試料を用
いて行い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２および残差の値をともに用いて、
実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
ＦｃおよびＶＨ３ドメイン中でプロテインＡが排除されたＶＨ３ベースのホモ二量体免疫
グロブリンの精製および試験。
勾配モードクロマトグラフィーおよび捕捉－溶出モードクロマトグラフィーは、実施例
１について記載した手順に従って行った。
実施例２．２：プロテインＧ結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリン
クロマトグラフィー
勾配モードクロマトグラフィーおよび捕捉－溶出モードクロマトグラフィーは、実施例
１について記載した手順に従って行った。
プロテインＧ結合が排除されたＦＡＢ断片のＳＰＲ試験
アミノ酸配列ＳＡＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１００）と融合したヒトＨＥＲ３細胞外
領域をコードするｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１８６０（ＥＲＢＢ３＿ＨＵ
ＭＡＮ）残基２０～６３２、配列番号７３、本明細書においてＨＥＲ３抗原という；Ｕｎ
ｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
、４１（データベース版）：Ｄ４３～７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒ
ｇ／）を、上記の重鎖および軽鎖発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、
ＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトした。生成の後に、細胞
フリー上清を調製し、ろ過し、滅菌し、０．１容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８で
前処理し、Ｎｉ2+－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅ
ｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７－５３１８－０２）で精製した。
ＳＰＲ実験のために、抗体バリアントを、プロテインＡ結合ＣＭ５研究グレードセンサ
チップ（チップ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ；Ｃａｔ．Ｎｏ
：ＢＲ－１０００－１４；プロテインＡ Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ７８３７）上に
捕捉し、分析物として組換えＨＥＲ３抗原を用いた。測定は、以下のように行った：（捕
捉）１５０ＲＵの抗体、（流速）３０μｌ／分ＨＢＳ－Ｐ緩衝液、（再生）グリシンｐＨ
１．５、（注入）５分間、（解離）８分間、（注入したＨＥＲ３抗原濃度）５０、２５、
１０、５、１および０．５ｎＭ、（データフィッティング）物質移動なしの１：１結合。
捕捉された抗体の各測定の初めの実験的変動を埋め合わせるために、全てのフィッティン
グにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。測定は、１点につき３個の試料を用いて行
い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２および残差の値をともに用いて、実験デ
ータと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
実施例３の方法：プロテインＡまたはＧ結合が排除されたヘテロ二量体免疫グロブリンの
精製および試験
実施例３．１および３．２：プロテインＡまたはＧを用いるヘテロ二量体免疫グロブリン
の１ステップ精製
生成の後に、細胞培養上清を、０．１Ｖの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4を用いてｐＨ６．０
に調節し、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラム
（実施例３．１）または１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム（実施
例３．２）に１ｍｌ／分にてロードした。ロードした後に、結合したタンパク質を、０．
１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０を用いて十分に洗浄した。溶出は、２種の
緩衝液（ランニング緩衝液（Ａ）：０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０お
よび溶出緩衝液（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０）を組み合わせ
る２種の均一濃度勾配を用いて行った。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、以下：実施例３
．１において５５％Ｂ、実施例３．２において示す第１および第２の場合において９０％
Ｂおよび８０％Ｂのように変動する第１均一濃度勾配を７０ＣＶにわたって用いて溶出し
た。非排除ホモ二量体分子は、全ての実施例において２０ＣＶにわたって１００％Ｂの第
２均一濃度勾配で溶出した。溶出画分を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．
０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビ
ス－トリス４～１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗ
ｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した。
実施例３．３：プロテインＡおよびプロテインＧを用いるヘテロ二量体免疫グロブリンの
逐次的精製。
生成の後に、細胞培養上清を、０．１Ｖの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4を用いてｐＨ６．０
に調節し、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムに１ｍ
ｌ／分にてロードした。ロードした後に、結合したタンパク質を、０．１２５Ｍリン酸塩
クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０を用いて十分に洗浄した。プロテインＧ結合部位を有さない
ヘテロ二量体免疫グロブリンおよびホモ二量体免疫グロブリンを、１０ＣＶの０．０４Ｍ
リン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０で溶出した。ヘテロおよびホモ二量体混合物を含有
する画分をプールし、１０Ｖの０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０でさら
に希釈した。希釈混合物を、次いで、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラム（
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）にロードし、結合したタンパク質を、０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸
塩緩衝液ｐＨ６．０を用いて十分に洗浄した。ヘテロ二量体免疫グロブリンを、１０ＣＶ
の０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０で溶出した。溶出画分を、０．１Ｖの
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、Ｓ
ＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス－トリス４～１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した
。
実施例４の方法：ヒトＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体３ａについてのＳＰＲ実験
ヒトＦｃＲｎについてのＳＰＲ実験
簡単に述べると、組換えヒトＦｃＲｎをＣＨＯ－Ｓ細胞で発現させた。ヒトＦｃＲｎア
ルファ鎖およびベータ２ミクログロブリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ（それぞれＵ
ｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ５５８９９（ＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１）残
基２４～２９７およびＰ６１７６９（ベータ－２－ミクログロブリン）残基２１～１１９
）を、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有する２つの別々の哺乳動物発現ベクターにクロ
ーニングした。ＣＨＯ－Ｓ細胞を、以前に記載したＰＥＩ法を用いて安定的に同時トラン
スフェクトし、安定クローンを、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下での成長
により選択した。成長培地は、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（Ｌｏｎｚａ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、
Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。精製の前で生成の後の上清を、０．２Ｍ ＮａＨ2
ＰＯ4、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０で前処理して、ｐＨを６．０に調節した。Ｆｃ
Ｒｎを、ヒトＩｇＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
を用いて精製し、ＰＢＳ ｐＨ７．４で溶出した。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０
００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇ
ｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録した。各免疫グロブリンバリアントを、ＣＭ５セン
サチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇ
ｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上に、製造者により提供される標準的なプロトコールを用
いてアミン結合により固定化して、およそ１５００ＲＵの応答に達した。ＦｃＲｎは、エ
ンドソーム中で免疫グロブリンのＦｃ領域と酸性ｐＨにて結合するが（ｐＨ６．０）、血
液の塩基性ｐＨで結合を示さず（ｐＨ７．４）、よって、全ての測定は、２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０－０．１Ｍ ＮａＣｌ（ランニング緩衝液）を用いて行った
。異なる希釈のヒトＦｃＲｎ（６０００、３０００、１５００、７５０、３７５、１８７
．５、９３．８、４６．９ｎＭ）を３分間、１０μｌ／分にて注入した。３分間の解離の
後に、ＰＢＳ ｐＨ７．４を１分間、３０μｌ／分にて表面再生のために注入した。ＫＤ
値を、定常状態親和性モデルを用いて決定した。平衡定数は、濃度の範囲にわたる定常状
態応答 対 ヒトＦｃＲｎの濃度を１：１結合モデル（化学量論（ｎ）＝１）にフィッテ
ィングさせることにより決定した。測定は、１点につき３個の試料を用いて行い、参照の
ためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２および残差の値をともに用いて、実験データと個別
の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
ヒトＦｃガンマ受容体３ａについてのＳＰＲ実験
ヒトＦｃガンマ受容体３ａ（ＦｃγＲ３ａと省略する、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０
８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）残基１７～１９２）をクローニングし、上記のＨＥ
Ｒ３抗原と同様に発現させた。精製を、０．１ＭグリシンｐＨ３の溶出ステップを用いる
Ｉｇ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕ
ｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７－０９６９－０１）で行った。ＦｃγＲ３ａを
、ゲルろ過（ＳＵＰＥＲＤＥＸ７５ １０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７－５１７４－０１）によりさらに精製して
、痕跡量のＩｇＧ混入物を除去した。測定は、以下のように行った：（チップ）１７００
０ＲＵの抗体と結合したＣＭ５チップ、（流速）１０μｌ／分ＨＢＳ－Ｐ、（再生）なし
、（注入）８分間、（解離）１０分間、（注入したＦｃγＲ３ａ濃度）２５００、１２５
０、６２５、３１２、１５６、７８および３９ｎＭ、（データフィッティング）定常状態
親和性。
実施例５の方法：プロテインＡおよびＧ排除置換の免疫原性予測
プロテインＡおよびプロテインＧ排除変異の予測される免疫原性を、ＬｏｎｚａのＥｐ
ｉｂａｓｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて調べた。
実施例６の方法：プロテインＡおよびＧ排除置換の熱安定性分析
免疫グロブリンの熱安定性を、熱量分析により比較した。測定は、ＶＰ－ＤＳＣ示差走
査マイクロ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ Ｇ
ｍｂＨ）で行った。セル容量は０．１２８ｍｌであり、昇温速度は１℃／分であり、過剰
圧力は６４ｐ．ｓ．ｉ．に保った。全てのタンパク質断片は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で
１～０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質を除い
た同一緩衝液を含有する、１点につき２個の試料との比較により見積もった。部分モル熱
容量および融解曲線は、標準的な手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン
補正し、濃度を標準化した後に、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ ｖ７．０（ＭｉｃｒｏＣａ
ｌ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）において非２状態モデルを
用いてさらに分析した。
実施例７の方法：プロテインＧ排除置換の薬物動態分析
薬物動態分析は、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで行った。各群は、４匹の
ラットを含んだ。ラットに１０ｍｇ／ｋｇの抗体を静脈内急速投与注射により与えた。血
液試料を注射の０．２５時間、１時間、４時間、６時間ならびに１、２、４、７、１０、
１４、２１、２８、３５および４２日後に回収した。
抗体の血清レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。２μｇ／ｍｌの濃度に
てＨＥＲ２抗原で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆し、一晩４℃にてインキュベート
した。プレートをＢＳＡでブロックした後に、血清試料、参照標準物質（１１の系列希釈
）および品質管理試料をプレートに加え、１時間室温にてインキュベートした。洗浄して
未結合抗体を除去した後に、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ＿Ｆ（ａ
ｂ’）2断片特異的検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、販売者
：ＭＩＬＡＮ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ ＡＧ、Ｒｈｅｉｎｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ：１０９－０３５－００６）を加え、製造者の推奨に従って標準的
な比色テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ．、Ｌａｕｓａｎｎ
ｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３４０２１）により発色させた。４５０
ｎｍの吸光度の値をプレートリーダで記録し、血清試料中の抗体の濃度を、４パラメータ
回帰モデルを用いて試料プレート中で作製した参照標準曲線を用いて算出した。薬物動態
パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）バージョン５．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてノンコン
パートメント解析により評価した。
実施例８の方法：プロテインＡ置換の機能解析
ファージディスプレイライブラリー構築およびスクリーニング
抗ＨＥＲ３抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーから単離できる。この目的
のために、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをスクリーニングした。ここで用
いたライブラリーは、それぞれ可変重鎖および軽鎖のＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３に
制限される多様性を有する、合成起源のものからであった。ライブラリー構築は、以下に
記載するいくらかの改変を加えたＳｉｌａｃｃｉ Ｍ．ら（２００５、Ｐｒｏｔｅｏｍｉ
ｃｓ、５（９）：２３４０～５０頁）のプロトコールに従った。
ライブラリーのために用いた抗体の土台は、軽鎖可変生殖系列ドメインＤＰＫ２２と一
緒に集合させた重鎖可変生殖系列ドメインＤＰ４７に基づいた。Ｇ４Ｓペプチド反復（Ｇ
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳ；配列番号９４）に基づくフレキシブルリンカーを、２つ
の可変ドメインを集合させるために用いた。５つのサブライブラリーをクローニングした
が、これらはそれぞれ、それぞれ８または９または１０または１１または１２残基の長さ
のＣＤＲ－Ｈ３を有する可変重鎖ドメインに対応する以下の配列Ｋ（Ｘ）ｎＦＤＹ（Ｋａ
ｂａｔ残基９４～１０２）（ここで、Ｘは、無作為の自然に存在するアミノ酸であり、ｎ
は、５または６または７または８または９である）を有する、ＣＤＲ－Ｈ３を有する１つ
の重鎖可変生殖系列ドメインＤＰ４７と、以下の配列ＣＱＱＸＧＸＸＰＸＴＦ（配列番号
９６）またはＣＱＱＸＸＧＸＰＸＴＦ（配列番号９７）またはＣＱＱＸＸＸＸＰＸＴＦ（
配列番号９８）（Ｋａｂａｔ残基８８～９８）（ここで、Ｘは、無作為の自然に存在する
アミノ酸である）の１つを有する、ＣＤＲ－Ｌ３を有する３つの異なる軽鎖可変生殖系列
ドメインＤＰＫ２２の集合から得られる可変軽鎖ドメインのプールとの集合から得られた
。ＤＰ４７－ＤＰＫ２２ ｓｃＦｖ断片のそれぞれのサブライブラリーは、１×１０ｅ９
から３．７×１０ｅ９の間の多様性を有し、一旦組み合わせると、５つのサブライブラリ
ーは、１．０５×１０ｅ１０の全多様性に達した。
ヒトＨＥＲ３を認識するＳｃＦｖ断片を、上記の合成ファージディスプレイライブラリ
ーから、組換え由来ヒトＨＥＲ３抗原についての一連の反復選択サイクルで単離した（上
記の方法の項を参照されたい）。抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニン
グする方法は、既知である（Ｖｉｔｉ Ｆ．ら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．、３２６：４８０～５０５頁）。簡単に述べると、プラスチックイムノチューブ
を予め被覆した固定化抗原（２０μｇ／ｍｌの濃度にてＰＢＳ中で一晩）を、ライブラリ
ーとインキュベートした。チューブをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。結
合したファージをトリエチルアミンで溶出し、Ｓｉｌａｃｃｉ Ｍ．ら、既出に記載され
るようにレスキューした。この選択プロセスを３回反復した。２回目および３回目の選択
による１０００を超えるクローンを発現させ、標的抗原に対してＥＬＩＳＡにより分析し
た。陽性クローンをＤＮＡ配列決定に供し、ユニーククローンのいくつかを、ヒトＨＥＲ
３を発現する株化細胞と結合する能力についてさらに分析した。
単離ｓｃＦｖ断片のほとんどがヒトＨＥＲ３の第１および第２ドメインに特異的であっ
たので、組換えファージのライブラリープールをヒトＨＥＲ３細胞外領域の第１ドメイン
の組換え形に対して枯渇させるさらなる選択を行った（アミノ酸配列ＳＡＨＨＨＨＨＨＨ
Ｈ（配列番号１００）と融合したヒトＨＥＲ３ドメイン１は、ＨＥＲ３細胞外領域につい
て記載したように発現させた、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１８６０（ＥＲＢＢ３＿Ｈ
ＵＭＡＮ）残基２０～２０９、配列番号７４）。この選択スキームにより、ヒトＨＥＲ３
の第４ドメインに特異的なｓｃＦｖ断片の単離が可能になった。まとめると、ここで報告
する選択により、ヒトＨＥＲ３に対するナノモル親和性を、広いエピトープカバー範囲と
ともに有するｓｃＦｖ断片が得られた。高い熱安定性を示すｓｃＦｖ断片を、未処理の細
菌上清由来の分泌ｓｃＦｖ断片を熱負荷に供した後に抗原ＥＬＩＳＡを行う「クック－ア
ンド－バインド（ｃｏｏｋ－ａｎｄ－ｂｉｎｄ）ＥＬＩＳＡ」により単離した（Ｍｉｌｌ
ｅｒ ＢＲら、（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５２５：２７９～８
９頁）。好ましいｓｃＦｖ断片を、これらの選択から単離した。異なる選択によるほとん
どのｓｃＦｖ断片は、ＦＡＣＳにより、ＨＥＲ３陽性株化細胞と結合することが見出され
た。
ヒトＨＥＲ３陽性株化細胞
ＨＥＲ３抗原を表面で発現するヒト細胞は、ＰＣＴパンフレットＷＯ１０／１０８１２
７（Ｆｕｈ Ｇら）に記載されている。Ｃａｌｕ－３（ＡＴＣＣ－ＬＧＬ ｓｔａｎｄａ
ｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＨＴＢ－５５）、ＢｘＰＣ３（Ａ
ＴＣＣ－ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＣＲＬ－１６８７）およびＭＤＡ
－ＭＢ－１７５－ＶＩＩ（ＡＴＣＣ－ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＨＴ
Ｂ－２５）は、ヒトＨＥＲ３陽性株化細胞の例である。ここでは、Ｃａｌｕ－３株化細胞
を主に用いて、ファージディスプレイにより単離されたｓｃＦｖ断片について確認した。
細胞培養条件
Ｃａｌｕ－３細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）および１％Ｇｌｕｔａｍａｘ／ペ
ニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）を補ったＲＰＭＩ培地で
維持した。
細胞増殖アッセイ
Ｃａｌｕ－３細胞を９６ウェルプレート（１０，０００細胞／ウェル）に播種した。以
下の日に、１％ＦＣＳを含有する培地で希釈した抗体または組み合わせ抗体または二重特
異性抗体で細胞を処理した。最終濃度３ｎＭのベータヘレグリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ、Ｃａｔ．Ｎｏ：３９６－ＨＢ）を、抗体とのインキュベー
ションの１時間後に加えた。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅ
ｃ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＵＦ１０２）を７２時間
後にウェルに加え、細胞を２４時間までインキュベートした後に、５４０ｎｍの励起波長
および６２０ｎｍの発光波長にてＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダ（Ｂｉ
ｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ、Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
）で蛍光を読み取った。
ホモ二量体Ｆｃ断片中でプロテインＡまたはＧとの結合を低減または排除する変異。
プロテインＡまたはプロテインＧとの結合が低減またはなくなったＦｃバリアントを同
定するために、工学的に操作したバリアントを設計し、スーパー抗原結合部位のコピーが
ともに変異されているホモ二量体として発現させた。このことにより、スーパー抗原に対
する結合がほとんどまたは全く残っていない（差次的精製の概念はこのことに基づく）ホ
モ二量体免疫グロブリンを導く置換を選択できた。
１．１ プロテインＡと結合しないかまたは結合が低減されたホモ二量体Ｆｃ断片
混合ＩＧＨＧ１－ＩＧＨＧ３フォーマットの使用をさらに調べるために、３つのＩＧＨ
Ｇ１－ＩＧＨＧ３混合Ｆｃバリアントを調製し、プロテインＡ結合についてアッセイした
。
第１バリアントは、ヒンジ配列が自然に存在するヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒ
ンジ配列全体で置換された、自然に存在するヒトＩＧＨＧ３アイソタイプを起源とする配
列を有した（Ｆｃ１３３と省略する（名称中の数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序で
の各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応する）；配列番号１
）。
第２Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメイン配列全体が自然に存在するヒトＩＧＨＧ３ ア
イソタイプ由来のＣＨ３ドメイン配列全体で置換された、自然に存在するヒトＩＧＨＧ１
アイソタイプを起源とする配列を有した（Ｆｃ１１３と省略する（名称中の数字は、ヒン
ジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラ
スに対応する）；配列番号２）。
第３バリアントは、ＵＳ２０１００３３１５２７に記載される置換Ｈ４３５ＲおよびＹ
４３６Ｆが導入された、自然に存在するＩＧＨＧ１アイソタイプを起源とする配列を有し
た（ＥＵ番号付け；Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆと省略する；配列番号３）。
さらに、ヒトＩＧＨＧ１ Ｆｃ断片（Ｆｃ ＩＧＨＧ１と省略する；配列番号４）を調
製し、陽性対照として用いた。
ホモ二量体Ｆｃバリアントおよび対照Ｆｃ断片を、プロテインＡ結合について、方法の
項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図１は、
３つのバリアントおよびＦｃ ＩＧＨＧ１対照断片のクロマトグラフィープロファイルを
示す。
３つのバリアントはいずれもプロテインＡ結合を保持しなかったが、Ｆｃ ＩＧＨＧ１
対照断片は強い結合を示した。ヒトＩＧＨＧ３ ＣＨ３ドメインの自然に存在する配列を
包含するホモ二量体Ｆｃバリアントは、プロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合
しないと結論付けた。
プロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界面でオ
ーバーラップするので、上記のＦｃバリアントを、プロテインＧ結合について、方法の項
に記載したプロトコールに従う捕捉－溶出精製モードにおいて試験した。結果を図２に示
す。３つのバリアントは全て、プロテインＧ結合を保持した。
１．２ プロテインＧと結合しないかまたは結合が低減されたホモ二量体Ｆｃ断片
免疫グロブリン重鎖中の重要なプロテインＧ結合残基を同定するために、プロテインＧ
のＣ２ドメインとの複合体中のヒトＦｃ断片の構造を、合理的設計のための出発点として
用いた（ＰＤＢコード：１ＦＣＣ、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ＦＣ
ら、（１９７７）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、８０（２）：３１９～３２４頁およびＢ
ｅｒｍａｎ ＨＭら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２８（１）：
２３５～２４２頁；Ｓａｕｅｒ－Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ＡＥら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ、３（３）：２６５～２７８頁）。ＰＩＳＡサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂ
ｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｓｄ－ｓｒｖ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／ｐｉｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；Ｔｉ
ｎａ ＫＧら、（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５（ウェブサー
バ版）：Ｗ４７３～４７６）を用いる両方の分子間の界面の分析により、Ｆｃ断片中の１
８のプロテインＧ相互作用残基の部分集合が同定され、そのうちＬ２５１、Ｍ２５２、Ｉ
２５３、Ｓ２５４、Ｑ３１１、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ４２６、Ｍ４２８、Ｎ４３４、Ｈ
４３５、Ｙ４３６およびＱ４３８が主に貢献した（ＥＵ番号付け）。残基Ｌ２５１、Ｉ２
５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｈ４３５およびＹ４３６は、これらの残基がＦｃＲｎ結合の
ために必須であることが当該技術において知られていることに基づいて（Ｒｏｏｐｅｎｉ
ａｎ ＤＣおよびＡｋｉｌｅｓｈ Ｓ、（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
、７（９）：７１５～２５頁）、元々の候補リストから省いた。物理化学的特性に加えて
、置換の性質を、プロテインＧ結合および非結合免疫グロブリンヒトアイソタイプ間の配
列比較に基づいて合理化した（ガンマアイソタイプ 対 ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＡ２および
ＩＧＨＭ；Ｂｊｏｒｃｋ ＬおよびＫｒｏｎｖａｌｌ Ｇ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１３３（２）：９６９～９７４頁）。
ヒトＩＧＨＧ１のＦｃ断片（配列番号４）の関係において、標準的ＰＣＲベースの突然
変異誘発技術により変異を導入した。作製した置換は、それらに限定されないが、以下の
変更を含んだ：Ｅ３８０Ｙ（配列番号５）、Ｅ３８２Ｒ（配列番号６）、Ｅ３８２Ｙ（配
列番号７）、Ｓ４２６Ｍ（配列番号８）、Ｓ４２６Ｒ（配列番号９）、Ｓ４２６Ｙ（配列
番号１０）、Ｓ４２６Ｗ（配列番号１１）、Ｑ４３８Ｒ（配列番号１２）、Ｑ４３８Ｙ（
配列番号１３）ならびに組み合わせＥ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ（配列番号１４）、Ｅ３８０
Ｍ／Ｅ３８２Ｌ（配列番号１５）、Ｅ３８０Ｙ／Ｅ３８２Ｒ（配列番号１６）、Ｍ２５２
Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ（配列番号１７）、Ｓ２５４Ｅ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ（
配列番号１８）およびＳ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ（配列番号１９）。
ホモ二量体Ｆｃバリアントおよび対照Ｆｃ断片を、プロテインＧ結合について、方法の
項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。
試験した単一置換またはそれらの組み合わせはいずれも、プロテインＧ ＨＰカラムと
の結合の完全な排除を導かなかった（図３）。Ｓ２５４位、Ｅ３８０位およびＥ３８２位
での置換を組み合わせた変異体（図３Ｍ）を用いて結合の小さい低減が観察され、これら
を、Ｍ２５２位、Ｍ４２８位、Ｙ４３６位およびＱ４３８位でのさらなる置換との４また
は５つの群によりさらに調べた。２つの新しい組み合わせを、次いで、調製した：Ｍ２５
２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ／Ｙ４３６Ａ／Ｑ４３８Ａ（配列番号２０）およびＳ２５
４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ（配列番号２１）。さらに、Ｓ
４２６位およびＭ４２８位での以前に調べられた置換をＨ４３３位およびＮ４３４位での
置換とさらに組み合わせた第３の組み合わせ：Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／Ｈ４３３Ｄ／Ｎ
４３４Ａ（配列番号２２）を調製した。
この新しいセットのホモ二量体Ｆｃバリアントは、プロテインＧ結合についても、方法
の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。３つ全
てのホモ二量体Ｆｃ組み合わせ変異体は、プロテインＧカラムとの結合の完全な排除を示
し、ローディングステップ中に溶出された。
プロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界面でオ
ーバーラップするので、上記のＦｃバリアントを、プロテインＡ結合について、方法の項
に記載したプロトコールに従う捕捉－溶出精製モードにおいて試験した。結果を図４に示
す。３つのバリアントは全て、プロテインＡと結合し、よって、全てのバリアントがプロ
テインＡ結合を保持したことが示された。
ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＧ結合を排除する最小限の数の置換を同定するため
に、Ｓ４２６、Ｍ４２８、Ｈ４３３およびＮ４３４からなる４つのアミノ酸の位置の群を
対で調べ、いくつかの場合においては異なるアミノ酸で置換した。以下の組み合わせを調
製した：Ｓ４２６Ｍ／Ｈ４３３Ｄ（配列番号２３）、Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ（配列番号
２４）、Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ｓ（配列番号２５）、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ（配列番号
２６）およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（配列番号２７）。ホモ二量体Ｆｃバリアントおよ
び対照Ｆｃ断片を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う
勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図５から、Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａ、
またはＭ４２８ＧおよびＮ４３４Ｓ置換を有するホモ二量体Ｆｃ組み合わせ変異体だけが
、プロテインＧカラムとの結合の完全な排除を示し、ローディングステップ中に溶出され
たことがわかる。ヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリンの血清半減期を延長することが当該技術
において知られており、ここで示す置換の組み合わせＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（Ｚａｌｅ
ｖｓｋｙ Ｊら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８（２）：１５７～１５９頁）は、
プロテインＧ結合のいずれの低減も導かなかったことに触れておく価値がある（図５Ｃ）
。
最後に、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを、プロテインＧ結合の低減または排除に向
かうそれらの個別の貢献の点で評価した。２つのホモ二量体Ｆｃバリアント（一方のバリ
アントはＭ４２８Ｇ置換（配列番号２８）を有し、他方のバリアントはＮ４３４Ａ置換（
配列番号２９）を有する）を調製し、上記のようにアッセイした。驚くべきことに、Ｍ４
２８Ｇ置換もＮ４３４Ａ置換も、プロテインＧ結合の低減または排除を導かなかった（図
６）。よって、これらの結果から、ホモ二量体Ｆｃ断片中でプロテインＧ結合の完全な排
除を誘導するために、Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａ置換の組み合わせが必要十分であると
結論付けた。
プロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界面でオ
ーバーラップするので、上記のＦｃバリアントを、プロテインＡ結合について、方法の項
に記載したプロトコールに従う捕捉－溶出精製モードにおいて試験した。結果を図７に示
す。全てのバリアントがプロテインＡ結合を保持した。
プロテインＡまたはＧとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体Ｆｃ断片を有
するホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインＡまたはＧとの結合を低減または排除する
変異
２．１ プロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリ
ン
ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＡ結合を排除する方法は、実施例１．１に示した。
全長ホモ二量体免疫グロブリン中でのプロテインＡ排除法の使用を評価するために、混合
ＩＧＨＧ１－ＩＧＨＧ３ Ｆｃフォーマットに基づく抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリ
ンを調製した。抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンは、自然に存在する抗体と同様にフ
ォーマットされ、上記のＦｃ１３３断片と融合した抗ＨＥＲ２特異性を有するＦＡＢ断片
（本明細書において抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３と省略する；配列番号３０の重鎖お
よび配列番号３１の軽鎖）から構成されていた。トランスフェクションの後に、抗ＨＥＲ
２ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３ホモ二量体を、プロテインＡ結合について、方法の項に記載した
プロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図８Ａに示すように、
抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３ホモ二量体は、市販のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（
商標）プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）と
まだ結合した。Ｆｃ１３３バリアントはプロテインＡと結合しないことが以前に示されて
いるので、さらなる実験を行って、結合に対するＦＡＢ領域の貢献について調べた。
ＦＡＢ定常ドメインの貢献を評価するために、上記の抗ＨＥＲ２ホモ二量体を、ｓｃＦ
ｖ単位が、１５アミノ酸リンカーと融合した親の免疫グロブリン可変ドメインから構成さ
れる抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子として再フォーマットした（本明細書において抗Ｈ
ＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ１３３と省略する；配列番号３２の重鎖）。得られた抗ＨＥＲ２
ｓｃＦｖ－Ｆｃ１３３ホモ二量体は、よって、親の抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３ホ
モ二量体免疫グロブリンと同一であるが、ＣＨ１およびＣＫ定常ドメインを欠いた。図８
Ｂに示すように、ｓｃＦｖ－Ｆｃ１３３ホモ二量体は、親の抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グ
ロブリンで観察されたことと同様に、プロテインＡ結合を示した。この知見により、抗Ｈ
ＥＲ２ ＦＡＢ断片の可変ドメインが、ホモ二量体免疫グロブリンのＦｃ部分中のプロテ
インＡ結合を排除する方法の有効性を妨げる原因であるという結論が導かれた。より重要
なことには、ホモ二量体免疫グロブリンの可変ドメイン中のプロテインＡ結合は、プロテ
インＡ差次的精製技術に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げると結論付けた
。
プロテインＡの５つ全てのドメインは、ＶＨ３可変ドメインサブクラス由来の可変重鎖
ドメインと結合することが知られており（Ｊａｎｓｓｏｎ Ｂら、（１９９８）ＦＥＭＳ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０（１）：６９～７８頁）、この
特徴は、抗体分子全体のパパイン消化の後のＶＨ３ベースのＦＡＢ断片の調製を妨げるこ
とが知られている（なぜなら、プロテインＡがＶＨ３ベースのＦＡＢおよびＦｃ断片の両
方と結合するからである）。ホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリンまたはそのｓｃＦｖ－
Ｆｃバージョン中で見出される重鎖可変ドメインは、ＶＨ３－２３サブクラスに属し、工
学的に操作されたＦｃ部分内にプロテインＡ結合部位を有さないにもかかわらず、これら
のホモ二量体分子がなぜプロテインＡと結合するかを説明した。
ＶＨ３ベースの免疫グロブリンまたはその断片は、生物工学産業にとって非常に重要で
ある。ＶＨ３ベースの分子は、プロテインＡと結合する能力がそれらの機能的プレスクリ
ーニングを容易にするので、広く開発されており、よって、抗体発見のために用いられる
多くの合成またはドナーベースのファージディスプレイライブラリーまたはトランスジェ
ニック動物技術は、ＶＨ３ドメインサブクラスに基づく。さらに、ＶＨ３ベースの分子は
、その他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現および安定性のために、
頻繁に選択される。ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片と結合しない組換えバージョンのプロテイ
ンＡが開発され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）の商品名の下でＧＥ Ｈｅａｌ
ｔｈｃａｒｅにより市販されている。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムを上で論じた２つのホモ二量体抗ＨＥＲ
２免疫グロブリンのプロテインＡ結合の評価のためにここで用いたので、ＭａｂＳｅｌｅ
ｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムは、プロテインＡ差次的精製技術を用いる場合、少なくと
も１つのＶＨ３可変ドメインを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のために適切で
ないと結論付けた。なぜなら、Ｆｃ領域中にプロテインＡ結合を有さないホモ二量体種は
、それらのＶＨ３ドメインによりプロテインＡとまだ結合するからである。
ＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンまたはその断片を排除または低減する置換を
調べるために、ＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントをプロテインＡ結合についてアッセイす
る必要がある。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂の種はＶＨ３ドメインサブク
ラス結合を欠くことが知られているが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）として知られる別の
市販のプロテインＡ樹脂は、ＶＨ３ドメインサブクラスと結合する（これもまたＧＥ ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅからである）ので、ＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントをプロテインＡ
結合について分析するために選択した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂の使用は、ＶＨ３－２３可変ドメインサブクラスのも
のであることが知られている以前に記載した親の抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンに
由来する組換え抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ２ ＦＡＢと省略す
る；配列番号３３の重鎖および配列番号３１の軽鎖）を調製し、該断片を、ＭａｂＳｅｌ
ｅｃｔ（商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムでアッセイすること
により確認した（ＶＫサブクラスＩに基づく軽鎖を有する、ＦＡＢ断片は、まず、プロテ
インＬクロマトグラフィーを用いて捕捉－溶出モードで精製した後に、プロテインＡ勾配
クロマトグラフィーをＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ
（商標）カラムで行った、両方のカラムのプロトコールは、方法の項に記載したプロトコ
ールに従った）。図８Ｃに示すように、ＶＨ３ベースの抗ＨＥＲ２ ＦＡＢだけがＭａｂ
Ｓｅｌｅｃｔ（商標）カラムと結合し、このことにより、単量体ＶＨ３ベースのＦＡＢ断
片に少なくとも関する限り、そしてプロテインＡとの結合がない工学的に操作されたＦｃ
領域を有するＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンについて以前に観察された結果と
さらに対照的に、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂がＶＨ３ベースのＦＡＢ断
片との結合を欠くことが確認された。逆に、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ
（商標）カラムとの強い結合を示し、このことは、プロテインＡと結合しないかまたは結
合が低減されたＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントについてアッセイする可能性をもたらし
た。
ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片中のプロテインＡ結合を排除するために、ＶＨ３ドメイン中
の重要なプロテインＡ結合残基を、プロテインＡのＤドメインとの複合体中のヒトＦＡＢ
断片の結晶構造（ＰＤＢコード：１ＤＥＥ；ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ；Ｇｒａｉｌｌｅ
Ｍら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１０）：５
３９９～５４０４頁）から同定した。この分析は、合理的設計のための出発点として用い
、ここでは、行った置換の性質が、ヒト起源のプロテインＡ結合ＶＨサブクラスとプロテ
インＡ非結合ＶＨサブクラスとの間の配列比較に基づいた。図９は、各ヒト重鎖可変ドメ
インサブクラスについての１つの代表的なフレームワークのアラインメントを示す。アミ
ノ酸１５位、１７位、１９位、５７位、５９位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０
位、８１位、８２ａ位および８２ｂ位（Ｋａｂａｔナンバリング）を、１ＤＥＥ構造中の
プロテインＡのＤドメインとＶＨ３ベースのＦＡＢ断片との間のタンパク質－タンパク質
相互作用界面の一部として同定した。ヒトＶＨサブクラスのうち、ＶＨ３は、プロテイン
Ａと結合する唯一のサブクラスであり、その他のサブクラス中の等価なアミノ酸配列の位
置の残基を、おそらく免疫原性を低減しながらプロテインＡ結合を排除または低減する観
点で、置換の供給源として選択した。なぜならこれらの置換は、プロテインＡ非結合ヒト
ＶＨサブクラス中で見出される同じ等価なアミノ酸の位置でのある残基の、別の自然に存
在する残基への置き換えを含んでいたからである。
上記の抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ断片配列中に、標準的なＰＣＲベースの突然変異誘発技術に
より変異を導入し、以下の置換を作製した：Ｇ６５Ｓ（配列番号３４の重鎖および配列番
号３１の軽鎖）、Ｒ６６Ｑ（配列番号３５の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、Ｔ６８Ｖ
（配列番号３６の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、Ｑ８１Ｅ（配列番号３７の重鎖およ
び配列番号３１の軽鎖）、Ｎ８２ａＳ（配列番号３８の重鎖および配列番号３１の軽鎖）
および組み合わせＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ（配列番号３９の重鎖および配列番号３
１の軽鎖）。
さらに、Ｔ５７Ａ置換（配列番号４０の重鎖および配列番号３１の軽鎖）およびＴ５７
Ｅ置換（配列番号４１の重鎖および配列番号３１の軽鎖）を作製した。Ｔ５７Ａは、ＷＯ
２０１０／０７５５４８においてプロテインＡ結合を排除することが以前に示され、Ｔ５
７Ｅは、電荷交換（正荷電アミノ酸から負荷電アミノ酸への変更）を工学的に作製するた
めに設計した。ＶＫサブファミリーＩに基づく軽鎖を有するので、ＦＡＢ変異体を、まず
、プロテインＬクロマトグラフィーを用いて捕捉－溶出モードで精製し、さらに、プロテ
インＡ結合について、方法の項に記載したように勾配モードの下で操作するＭａｂＳｅｌ
ｅｃｔ（商標）カラムを用いてアッセイした。図１０は、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｅ、Ｇ６５Ｓ
、Ｑ８１Ｅ、Ｎ８２ａＳおよび組み合わせＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａだけが、ＭＡｂ
Ｓｅｌｅｃｔ（商標）樹脂との抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ結合を排除または低減したことを示す
。置換Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１ＥおよびＮ８２ａＳは、ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片中のプロテイ
ンＡ結合を排除する場合に好ましい。なぜなら、これらの変異は、プロテインＡ非結合Ｖ
Ｈサブクラスで見出される配列等価残基について置換することにより、おそらく免疫原性
を低減するからである。
抗体の親和性および特異性は、ＣＤＲ領域に本質的に限定されるが、フレームワーク置
換は、いくつかのヒト化抗体の場合に示されるように、抗体特性に影響を与えることがあ
る。上記の置換がＶＨ３由来抗体の特異性および／または親和性に影響を与えるかを評価
するために、好ましいＦＡＢ変異体のうち２つを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により
ＨＥＲ２抗原結合についてアッセイした。組換えＨＥＲ２抗原を用いるＳＰＲ測定を、方
法の項に記載したように行った。好ましい変異体はともに、元のＦＡＢ分子と比較して同
一のＨＥＲ２抗原との結合を示し（図１１）、このことは、置換が特異性または親和性の
点で影響を与えなかったことを証明した。よって、抗原結合を著しく失うことなくＶＨ３
由来抗体分子中のプロテインＡ結合を工学的に操作するために、これらの置換を広く用い
ることができることが期待される。
これらの好ましい置換のうちの２つを、以前に記載した抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロ
ブリンおよび抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子に導入し、バリアントを、ＭａｂＳｅｌｅ
ｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂との結合についてアッセイした。以下のバリアントを調製し
た：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３（配列番号４２の重鎖）、抗ＨＥＲ
２ ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）－Ｆｃ１３３（配列番号４３の重鎖）、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ
（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３（配列番号４４の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、および抗
ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）－Ｆｃ１３３（配列番号４５の重鎖および配列番号３１
の軽鎖）。
図１２は、４つ全ての変異体についてのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）クロマ
トグラフィーのプロファイルを示す。全てのバリアントは、ここで、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ
ＳｕＲｅ（商標）カラムとの結合の低減または結合がほとんどないことを示し、以前に
同定した置換を用いてプロテインＡ結合がうまく除去されたことを示した。より重要なこ
とには、プロテインＡ差次的精製技術と組み合わせた場合に、プロテインＡに対するＶＨ
３ベースのＦＡＢの親和性を排除または低減する置換は、少なくとも１つのＶＨ３可変ド
メインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能にすると結論付けた。
上記のバリアントは、方法の項に記載したプロトコールに従う捕捉－溶出精製モードで
プロテインＧ結合について試験した。結果を図１３に示す。全てのバリアントは、プロテ
インＧ結合を保持した。
２．２プロテインＧとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリン
ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＧ結合を排除する方法は、実施例１．２に示した。
全長ホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインＧ排除法の使用を評価するために、Ｆｃ
Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片に基づく抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリンを調製した。
抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリンは、自然に存在する抗体と同様にフォーマットされ
、上記のＦｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片と融合した抗ＨＥＲ３特異性を有するＦＡＢ
断片（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する
、配列番号４６の重鎖および配列番号４７の軽鎖）から構成されていた。トランスフェク
ションの後に、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａホモ二量体を、プロ
テインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィー
によりアッセイした。図１４に示すように、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ
４３４Ａホモ二量体は、市販のプロテインＧ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）とまだ結合した。Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片はプロ
テインＧと結合しないことが以前に示されているので、結合に対するＦＡＢ領域の貢献が
疑われた。このような貢献は、ホモ二量体免疫グロブリンのＦｃ部分中のプロテインＧ結
合を排除する方法の有効性を妨げ、より重要なことには、この新しい差次的精製技術に基
づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げる。
全てのヒト免疫グロブリンガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片は、ＣＨ１ドメイン内
でプロテインＧと結合することが知られている（Ｎｅｚｌｉｎ ＲおよびＧｈｅｔｉｅ
Ｖ、（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｖｏｌ．８２：１５５～２１５頁）。ヒト免疫グロブリンアイソタイプのう
ち、ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＭを起源とするＣＨ１ドメインは、プロテイン
Ｇと結合しないことが知られている（Ｂｊｏｒｃｋ ＬおよびＫｒｏｎｖａｌｌ Ｇ、既
出）。ガンマアイソタイプ由来のＣＨ１ドメインと、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＡ２または
ＩＧＨＭ由来のＣＨ１ドメインとの間のアミノ酸配列の違いは、ガンマアイソタイプ由来
のＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合を低減または排除しながら、おそらく低い免疫原
性を有する置換の合理的設計を可能にする。図１５は、ＩＧＨＧ１由来のヒトＣＨ１ドメ
インと、ヒトＩＧＨＡ１およびヒトＩＧＨＭ由来のＣＨ１ドメイン配列とのＩＭＧＴ配列
アラインメントを示す（ＩＭＧＴ（登録商標）、既出）。ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け
は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの３Ｄ構造の比較解析に基づくので、こ
れは、ＣＨ１ドメイン間の３Ｄ等価位置を規定する。よって、ＩＧＨＧ１のＣＨ１ドメイ
ン内のプロテインＧ結合を低減または排除する置換を、図１５に示す配列アラインメント
から選択した。どの３Ｄ位置を置換するかを選択するための別のインプットは、複合体中
のマウスＦＡＢ断片およびプロテインＧの第３ドメインの結晶構造の解析であった（ＰＤ
Ｂコード１ＩＧＣ、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ、既出；Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇ
ｌｅｙ ＤＢ、（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３：９０６～９１８頁）。Ｃ
Ｈ１ドメイン結晶構造内の２つのベータ鎖（ストランドＡ（ＥＵ番号付け１２２から１３
６）およびストランドＧ（ＥＵ番号付け２１２から２１５）、図１５）およびループ構造
（ＦＧループ（ＥＵ番号付け２０１から２１１）、図１５）は、ほとんどのタンパク質－
タンパク質相互作用を媒介するように見受けられ、工学的作業の焦点となった。
ヒトＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来置換の使用を評価するために、以下の変異体を、上
記の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａホモ二量体免疫グロブリンの背
景で調製した：ＩＧＨＧ１由来のＣＨ１ドメイン全体がＩＧＨＡ１由来のＣＨ１ドメイン
全体で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１）
－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号４８の重鎖および配列番号４７の
軽鎖）、ＩＧＨＧ１由来のＣＨ１ドメイン全体がＩＧＨＭ由来のＣＨ１ドメイン全体で置
き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ）－Ｆｃ Ｍ
４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号４９の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、Ｉ
ＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦＧループ配列が、
ＩＧＨＡ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦＧループ配列で
置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ａ－Ｆ
Ｇ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する、配列番号５０の重鎖および配列番
号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部の
ＦＧループ配列がＩＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦ
Ｇループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧ
ＨＭ－Ａ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５１の重鎖
および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列がＩＧＨＡ
１ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗
ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ａ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列
番号５２の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＧ
および一部のＦＧループ配列がＩＧＨＡ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦ
Ｇループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧ
ＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５３の重鎖お
よび配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列がＩＧＨＭ
ＣＨ１ドメインストランドＡ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥ
Ｒ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ－Ａ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５
４の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ならびにＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランド
Ｇおよび一部のＦＧループ配列がＩＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦ
Ｇループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧ
ＨＭ－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５５の重鎖およ
び配列番号４７の軽鎖）。トランスフェクションの後に、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃバリ
アントを、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロ
マトグラフィーによりアッセイした。図１６および図１７は、それぞれＩＧＨＡ１および
ＩＧＨＭベースのバリアントについてのプロテインＧ結合プロファイルを示す。これらの
結果から、ＩＧＨＧ１由来のＣＨ１ドメイン配列全体をＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭのいず
れか由来のＣＨ１ドメイン配列全体で置き換えることにより、ガンマＦＡＢベースのホモ
二量体免疫グロブリン（ここで、Ｆｃ領域も、プロテインＧと結合しないかまたは結合が
低減している）中のプロテインＧ結合の完全な排除が可能になると結論付けた。さらに、
単一鎖交換による排除が、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のストランドＧをＦＧループの
一部とともに用いた場合にのみ成功したが、ストランドＡでの置き換えは、プロテインＧ
結合にほとんどまたは全く影響を与えなかったことがわかった。
ガンマアイソタイプＦＡＢ断片中のプロテインＧ結合を排除する最小限の数の置換を同
定するために、ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列の分析に由来す
るさらなる置換を調べた。以下の置換の対を試験した：Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ（ＦＧル
ープ）、Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ（ストランドＧ）、Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ（ＦＧルー
プ）およびＤ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ（ストランドＧ）（ＥＵ番号付け；ＩＭＧＴ１１５位
、１１６位、１１８位、１１９位および１２０位にそれぞれ相当するＥＵ２０９位、２１
０位、２１２位、２１３位および２１４位）。最初の２つの組み合わせは、ＩＧＨＡ１
ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列に対するＩＧＨＧ１ ＣＨ１ド
メインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列の分析に由来し、置換の他の２対は、Ｉ
ＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列に対するＩＧＨＧ１
ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列の解析に由来した。バリアント
は、上記のようにフォーマットされ、以下のように記載できる：配列番号５６の重鎖およ
び配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ）－Ｆｃ
Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、配列番号５７の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥ
Ｒ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、配列番号５
８の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４
Ｎ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、ならびに配列番号５９の重鎖および配列番号４７
の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ
４３４Ａ。
ホモ二量体免疫グロブリンバリアントを、次いで、プロテインＧ結合について、方法の
項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図１８は
、ＩＧＨＡ１由来置換についての勾配クロマトグラフィープロファイルを示し、Ｔ２０９
Ｐ／Ｋ２１０ＳおよびＫ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ置換はともに、プロテインＧ結合を完全に
排除できた。ＩＧＨＭベースの置換の場合、Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ置換だけがプロテイ
ンＧ結合の完全な排除を導き、Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ置換は、プロテインＧ結合に影響
を与えなかった（図１９）。これらの結果から、置換Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ、Ｋ２１３
Ｖ／Ｋ２１４ＴおよびＴ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ（ＥＵ番号付け）は、ガンマアイソタイプ
ＦＡＢベースのホモ二量体免疫グロブリン（ここで、Ｆｃ領域も、プロテインＧと結合し
ないかまたは結合が低減している）中のプロテインＧ結合を排除できると結論付けた。よ
り重要なことには、ガンマアイソタイプＦＡＢとプロテインＧとの結合を排除または低減
する置換は、実施例１．２に記載するプロテインＧ差次的精製技術と組み合わせた場合に
、少なくとも１つのＣＨ１ドメインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能
にする。
上記のバリアントを、プロテインＡ結合について、捕捉－溶出精製モードで試験した。
結果を図２０に示す。全てのバリアントは、プロテインＡ結合を保持した。
ガンマアイソタイプ由来のＣＨ１ドメイン配列はアミノ酸２０９位および２１０位にて
不変であるので、本明細書で示す２０９位および２１０位の置換は、全てのガンマアイソ
タイプＣＨ１ドメイン中のＣＨ１ドメインとプロテインＧとの結合を排除できると期待さ
れる。２つの位置のうち、２０９位は、ＣＨ１－プロテインＧ相互作用において主な役割
を演じると期待される。ＰＤＢｓｕｍオンラインツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ
．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／、Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ＲＡら、（１９９７）Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２２（１２）：４８８～４９０頁）を用いる１ＩＧＣ中
の水素結合ネットワークの分析は、Ｔ２０９の側鎖とプロテインＧ由来のアミノ酸側鎖（
残基Ｔ２１、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）との間の重要な水素結合相互作用を明らか
にした。Ｋ２１０も、プロテインＧ由来のアミノ酸（Ｅ２０、１ＩＧＣの配列に従う番号
付け）との間に水素結合相互作用することが示されたが、この相互作用は主鎖原子のみに
関与するので、アミノ酸置換により破壊されにくいと期待される。
Ｋ２１３位は、ガンマアイソタイプ間で保存されているが、ＩＧＨＧ１中のＫ２１４は
、ＩＧＨＧ３およびＩＧＨＧ４中のＲ２１４に相当する（これは、保存的アミノ酸変化で
ある。なぜなら、正電荷がこの位置で維持されるからである）。ＩＧＨＧ２中で、２１４
位はトレオニンであり、よって、非保存的変化である。Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ置換はプ
ロテインＧとＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインとの結合を排除したので（本明細書で示すとお
り）、２１３位の置換は、全てのガンマアイソタイプ中のプロテインＧ結合を排除するた
めに十分であると期待される。２０９位と同様に、Ｋ２１３の側鎖も、プロテインＧ由来
のアミノ酸側鎖（残基Ｔ１６、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）との重要な水素結合相互
作用を媒介するが、Ｋ２１０と同様に、Ｋ２１４は、プロテインＧ由来のアミノ酸（Ｋ１
５およびＴ１６、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）と、主鎖原子が関与する水素結合相互
作用だけを行い、この相互作用は、よって、アミノ酸置換により破壊されにくいと期待さ
れる。
ガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片内のプロテインＧ結合を排除する単一置換を同定
するために、以下の単一置換を調べた：Ｔ２０９Ｐ、Ｋ２１３Ｖ（ともにＩＧＨＡ１由来
置換）およびＴ２０９Ｇ（ＩＧＨＭ由来置換）。
バリアントは、上記のようにフォーマットされ、以下のように記載できる：配列番号７
５の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ）－Ｆｃ
Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、配列番号７６の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥ
Ｒ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、ならびに配列番号７７の
重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４
２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。
図１８Ｃおよび１８Ｄは、ＩＧＨＡ１由来置換についての勾配クロマトグラフィープロ
ファイルを示し、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３Ｖ置換はともに、プロテインＧ結合を完全に
排除できた。ＩＧＨＭベースの置換の場合、Ｔ２０９Ｇは、プロテインＧ結合の完全な排
除を導いた（図１８Ｅ）。これらの結果から、置換Ｔ２０９Ｐ、Ｋ２１３ＶおよびＴ２０
９Ｇ（ＥＵ番号付け）は、ホモ二量体免疫グロブリン（ここで、Ｆｃ領域も、プロテイン
Ｇと結合しないかまたは結合が低減している）内のガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片
中のプロテインＧ結合を排除できると結論付けた。より重要なことには、実施例１．２に
記載するプロテインＧ差次的精製技術と組み合わせた場合に、プロテインＧとのＦＡＢ結
合を排除または低減する置換は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインを有するヘテロ二量体
免疫グロブリンの調製を可能にする。
上記の置換が得られた抗体中の抗原特異性および／または親和性に影響を与えるかを評
価するために、上記の３つ全てのＣＨ１単一変異抗体を、ＨＥＲ３抗原結合についてＳＰ
Ｒによりアッセイした。組換えＨＥＲ３抗原についての測定は、方法の項において記載し
たように行った。３つ全ての変異体は、対照抗体と比較して同一の抗原結合を示し（図１
８Ｆ）、このことは、置換が特異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明し
た。よって、抗原結合を著しく失うことなくガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片内のプ
ロテインＧ結合を工学的に操作するために、これらの置換を広く用いることができること
が期待される。
プロテインＡおよび／またはＧについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリ
ンの精製。
ホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインＡまたはプロテインＧ結合を排除または低減
する方法は、実施例１および２に示した。これらの方法は、それら自体または組み合わせ
でのヘテロ二量体免疫グロブリンの精製を可能にするために開発した。
それら自体で用いる場合、これらの方法はともに、一方の重鎖が他方の重鎖と比較した
場合にプロテインＡまたはＧとの結合が低減されているかまたは結合しない重鎖のヘテロ
二量体の分離を可能にするために、勾配モードクロマトグラフィーを必要とする。組み合
わせで用いる場合、これらの方法は、２回の捕捉－溶出クロマトグラフィーステップ（順
序は特に限定されないが、一方はプロテインＡに対して、そして他方はプロテインＧに対
して）を連続して行うことにより重鎖のヘテロ二量体の調製のために簡便に用いることが
できる。両方の技術を包含するヘテロ二量体免疫グロブリンは、プロテインＡと結合でき
るがプロテインＧとの結合が低減されたかまたは結合しない１つの重鎖と、それと対にな
った、プロテインＧと結合できるがプロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しな
い別の重鎖とから構成される。対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、そのホモ
二量体種（プロテインＡと結合しないかまたはプロテインＧと結合しない２種の可能性の
あるホモ二量体種）の両方に対して差次的精製特性を有する。
重要なことには、これら２つの方法の組み合わせだけが、捕捉－溶出モードでのヘテロ
二量体免疫グロブリンの均質な調製を可能にする。なぜなら、各親和性ステップにて、２
種のホモ二量体免疫グロブリン混入物の一方（なぜなら、これは親和性樹脂と結合しない
からである）が、勾配モードクロマトグラフィーを使用することなく効率的に除去される
からである。このことは、特に興味深い。なぜなら、捕捉－溶出モードクロマトグラフィ
ーは、工業的規模の調製にとって好ましいからである。よって、これら２つの技術と、プ
ロテインＡクロマトグラフィーとその後のプロテインＧクロマトグラフィー（またはその
逆）との逐次的使用との組み合わせにより、いずれの形の勾配クロマトグラフィーも行う
必要なく捕捉－溶出モードで、最高の純度（９５％を超える、より好ましくは９８％を超
える）のヘテロ二量体免疫グロブリンの調製が可能になる。
３．１ プロテインＡについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリン
ヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のためのプロテインＡ排除法の使用を評価するため
に、混合ＩＧＨＧ１－ＩＧＨＧ３ Ｆｃフォーマットに基づく抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンを調製した。
重鎖のヘテロ二量体に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンを作製する場合、自然に存在
する重鎖は同一の分子量を有するので、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によりホモ二量体からヘテ
ロ二量体を同定することは不可能である。その結果、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの移動度に差を持
たせ、ヘテロ二量体形成の同定を容易にするために、一方の重鎖がＦＡＢ断片を保有し、
他方の重鎖がｓｃＦｖ断片を保有するｓｃＦｖ－ＦＡＢフォーマットを用いた。
抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、上記のＦｃ１３３断
片と融合した抗ＨＥＲ３特異性を有するＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡ
Ｂ－Ｆｃ１３３と省略する；配列番号６０の重鎖および配列番号４７の軽鎖）から構成さ
れていた。重要なことには、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３重鎖中で見出される可変重
鎖ドメインは、ＶＨサブクラス２に属し、プロテインＡと結合しない。抗ＨＥＲ２重鎖は
、実施例２に記載したようにフォーマットされ、自然に存在するＩＧＨＧ１アイソタイプ
由来のＦｃ部分を有する抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖（本明細書において抗ＨＥＲ２
ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１と省略する；配列番号６１の重鎖）から構成されていた。
重要なことには、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖中で見出される可変重鎖ドメインは、
ＶＨサブクラス３（ＶＨ３）に属し、プロテインＡと結合する。
抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３重鎖と抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖
との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よっ
て、プロテインＡとの結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３
重鎖は、そのＦｃ領域中でプロテインＡ結合が排除され、その可変重鎖ドメイン中にプロ
テインＡ結合部位が存在しない）と、プロテインＡに対する２つの結合部位を有する１つ
の重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１ Ｆｃ領域中で見
出される自然のプロテインＡ結合部位を有し、ＶＨ３ドメイン中に存在する第２プロテイ
ンＡ結合部位を有する）とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計で
２つのプロテインＡ結合部位を有する対象の抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロ
ブリンとともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＡに対する結合
部位を有さず、第２の種は、合計で４つを有する）の生成をもたらす。ヘテロ二量体種と
ホモ二量体種との間でプロテインＡ結合部位の数が異なることにより、以下に示すように
、３つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。
生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインＡ結合について、方
法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図２
１に示すように、３つ全ての種は、プロテインＡ勾配クロマトグラフィーにより分離され
、結合部位を有さない種はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムと
結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインＡ結合部
位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
この直前の実施例は、１つのＶＨ３ドメインだけが存在する重鎖のヘテロ二量体を精製
するためにプロテインＡ排除法を実行する場合、ＶＨ３ドメインがプロテインＡと結合し
かつＦｃ領域において改変されていない重鎖の一部となるように工学的に操作されている
場合にのみ、ヘテロ二量体精製が成功できることを示す。
各重鎖が１つのＶＨ３ドメインを保有する重鎖のヘテロ二量体を扱う場合、実施例２．
１に示す置換を用いて少なくとも１つのＶＨ３ドメインまたは両方においてプロテインＡ
結合を変異させることにより、この差次的精製技術の基礎であるプロテインＡ結合部位不
均衡を保存できる。
３．２ プロテインＧについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリン
ヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のためのプロテインＧ排除法の使用を評価するため
に、ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＧ結合を排除する最小限の数の置換に基づく抗Ｈ
ＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを調製した。実施例３．１と同様に、ｓｃ
Ｆｖ－ＦＡＢフォーマットを用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテロ二量
体同定を容易にした。
抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、実施例２．１で用い
た抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖと上記のＦｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片とから構成されたｓ
ｃＦｖ－Ｆｃ型の重鎖（本明細書において抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ
４３４Ａと省略する；配列番号６２の重鎖）に相当した。
抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、自然に存在するＩＧ
ＨＧ１ Ｆｃ断片と融合した抗ＨＥＲ３特異性を有するＦＡＢ断片（本明細書において抗
ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１と省略する；配列番号６３の重鎖および配列番号４
７の軽鎖）から構成されていた。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆ
ｃ ＩＧＨＧ１重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫
グロブリンは、よって、プロテインＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ
２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａは、そのＦｃ部分中でプロテインＧ結合が
排除され、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわ
ちＣＨ１ドメインは存在しない）と、プロテインＧに対する２つの結合部位を有する１つ
の重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ １Ｆｃ領域中で見出
される自然のプロテインＧ結合部位を有し、そのＣＨ１ドメイン中に存在する第２プロテ
インＧ結合部位を有する）とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計
で２つのプロテインＧ結合部位を有する対象の抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グ
ロブリンとともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＧに対する結
合部位を有さず、第２の種は、合計で４つを有する）の生成をもたらす。ヘテロ二量体種
とホモ二量体種との間でプロテインＧ結合部位の数が異なることにより、３つ全ての分子
を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。生成の後に、３つ
全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプ
ロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図２２に示すように、３
つ全ての種は分離され、結合部位を有さない種はプロテインＧ ＨＰカラムと結合しなか
ったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインＧ結合部位を有する
ホモ二量体種の前に溶出された。
上記の実験では、ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製のためのプロテインＧ排除法の使
用は、プロテインＧ結合を排除する置換を保有する重鎖がＣＨ１ドメインを有さないフォ
ーマットに限定される。なぜなら、ＦＡＢフォーマットを用いることは、不要なホモ二量
体種のプロテインＧ結合を本質的に回復するからである。ＦＡＢ断片のＣＨ１ドメイン中
のプロテインＧ結合部位を排除することにより、Ｆｃ領域中のプロテインＧ結合を排除す
る置換を保有する重鎖内にＦＡＢ断片が存在するヘテロ二量体免疫グロブリンを調製でき
る。この例を以下に示す。
直前の実験と同様に、抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを、ｓｃＦｖ
－ＦＡＢフォーマットを用いて調製して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテロ
二量体同定を容易にした。
抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例３．１に記載した抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１
重鎖（配列番号６１の重鎖）であった。抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２．２に記載した抗Ｈ
ＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番
号５３の重鎖および配列番号４７の軽鎖）であった。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－Ｆ
Ｇ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／
ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧに対する結合部位を有さ
ない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ
４３４Ａ重鎖は、そのＦｃ領域およびＣＨ１ドメインの両方においてプロテインＧ結合が
排除されている）と、プロテインＧに対する結合部位を１つだけ有する１つの重鎖（抗Ｈ
ＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１Ｆｃ領域中で見出される自然の
プロテインＧ結合部位を有し、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位
は存在せず、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない）とを有すると期待された。この特定
の重鎖組み合わせは、１つだけのプロテインＧ結合部位を有する対象の抗ＨＥＲ２／ＨＥ
Ｒ３ヘテロ二量体免疫グロブリンとともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方は
プロテインＧに対する結合部位を有さず、第２の種は、合計で２つを有する）の生成をも
たらす。ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧ結合部位の数が異なること
により、３つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能に
なる。生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインＧ結合について
、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。
図２３に示すように、３つ全ての種は分離され、結合部位を有さない種はプロテインＧ
ＨＰカラムと結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテ
インＧ結合部位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
３．３ プロテインＡおよびプロテインＧについての差次的精製を有するヘテロ二量体免
疫グロブリン
プロテインＡまたはプロテインＧでのヘテロ二量体免疫グロブリンの差次的精製の方法
を、逐次的様式で組み合わせて、捕捉－溶出モードで、すなわちいずれの形の勾配クロマ
トグラフィーも行う必要なくヘテロ二量体免疫グロブリンを容易に精製できる。２つの例
を以下に示す。
実施例３．１および３．２と同様に、抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリ
ンを、ｓｃＦｖ－ＦＡＢフォーマットを用いて調製して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ移動度の差を
作製し、ヘテロ二量体同定を容易にした。抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例３．２に記載した抗
ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号６２の重鎖）であっ
た。抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例３．１に記載した抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３重鎖（
配列番号６０の重鎖および配列番号４７の軽鎖）であった。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆ
ｃ１３３重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブ
リンは、よって、プロテインＧに対する２つの結合部位を有するがプロテインＡに対する
結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３重鎖は、そのＦｃ領域
中でプロテインＡ結合が排除され、その可変ドメインはＶＨ２サブクラスに属するのでプ
ロテインＡと結合せず、さらに、２つのプロテインＧ結合部位（一方はそのＦｃ部分中に
、他方はそのＣＨ１ドメイン中）が存在する）と、プロテインＡに対する２つの結合部位
を有するがプロテインＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ
－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖は、そのＦｃ領域中でプロテインＧ結合が排除され
、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわちＣＨ１
ドメインは存在しない；２つのプロテインＡ結合部位（一方はそのＦｃ部分中に、他方は
そのＶＨドメイン中）も存在する（なぜなら後者はＶＨ３サブクラスに属するからである
）とを有すると期待された。他方、２種のホモ二量体免疫グロブリンの一方は、プロテイ
ンＧに対する結合部位を有さず、プロテインＡに対する４つの結合部位を有する（抗ＨＥ
Ｒ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖のホモ二量体）が、他方のホモ二量
体免疫グロブリン種は、プロテインＡに対する結合部位を有さず、プロテインＧに対する
４つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３重鎖のホモ二量体）。
ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧおよびＡ結合部位の数が異なるこ
とにより、３つ全ての分子を、プロテインＡでの捕捉－溶出クロマトグラフィーステップ
とその後のプロテインＧでの第２捕捉－溶出クロマトグラフィーステップを用いて効率的
に分離することが可能になる。
生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、一連の２つの捕捉－溶出クロマ
トグラフィーステップ、すなわちまずプロテインＡおよび次いでプロテインＧ（ともに方
法の項に記載したプロトコールに従う）により精製した。図２４に示すように、３つ全て
の種は分離された。各精製ステップにて、捕捉－溶出モードで、ホモ二量体免疫グロブリ
ン種のうち一方は、親和性樹脂と結合しないので、効率的に除去された。非還元ＳＤＳ－
ポリアクリルアミド（４～１２％）ゲルバンドの走査デンシトメトリー分析により、精製
された調製物中でヘテロ二量体の割合を評価することが可能である。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ
ＳＰイメージングシステム（Ｗｉｔｅｃ ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）および製造者により提供されるプロトコールを用いて、対象のヘテロ二量体免疫グロ
ブリンが、均質に＞９９％の純度で精製されたことがわかった（図２４Ｃ）。
最終の実施例では、プロテインＡおよびＧ差次的精製法の例を、ＶＨ３ドメイン中のプ
ロテインＡ結合を排除する補完的方法およびＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合を排除
する補完的方法と組み合わせた。
直前の実施例と同様に、抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを、ｓｃＦ
ｖ－ＦＡＢフォーマットを用いて調製して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテ
ロ二量体同定を容易にした。抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例２．１に記載した抗ＨＥＲ２ ｓ
ｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３重鎖（配列番号４２の重鎖）であった。抗ＨＥＲ３重鎖
は、実施例２．２に記載した抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４
２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号５３の重鎖および配列番号４７の軽鎖）であった。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ
１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥ
Ｒ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧに対する１つの結
合部位を有するがプロテインＡに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓ
ｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３３重鎖は、そのＦｃ領域およびＶＨ３ドメイン中でプロテ
インＡ結合が排除され、さらに、そのＦｃ領域中に１つのプロテインＧ結合部位が存在す
るが、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわちＣ
Ｈ１ドメインは存在しない）と、プロテインＡに対する１つの結合部位を有するがプロテ
インＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ
／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖は、そのＦｃ領域およびＣＨ１ドメイン中で
プロテインＧ結合が排除され、そのＦｃ部分中に１つのプロテインＡ結合部位が存在し、
その可変ドメインは、ＶＨ２サブクラスに属するのでプロテインＡと結合しない）とを有
すると期待された。他方、２種のホモ二量体免疫グロブリンの一方は、プロテインＧに対
する結合部位を有さず、プロテインＡに対する２つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ３ Ｆ
ＡＢ（ＩＧＨＡ１－ＦＧ／Ｇ）－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖のホモ二量体）が、
他方のホモ二量体免疫グロブリン種は、プロテインＡに対する結合部位を有さず、プロテ
インＧに対する２つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）－Ｆｃ１３
３重鎖のホモ二量体）。
ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧおよびＡ結合部位の数が異なるこ
とにより、３つ全ての分子を、プロテインＡでの捕捉－溶出クロマトグラフィーステップ
とその後のプロテインＧでの第２捕捉－溶出クロマトグラフィーステップを用いて効率的
に分離することが可能になる。
生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、一連の２つの捕捉－溶出クロマ
トグラフィーステップ、すなわちまずプロテインＡおよび次いでプロテインＧ（ともに方
法の項に記載したプロトコールに従う）により精製した。図２５に示すように、３つ全て
の種は分離された。各精製ステップにて、捕捉－溶出モードで、ホモ二量体免疫グロブリ
ン種のうち一方は、親和性樹脂と結合しないので、効率的に除去された。非還元ＳＤＳ－
ポリアクリルアミド（４～１２％）ゲルバンドの走査デンシトメトリー分析により、精製
された調製物中でヘテロ二量体の割合を評価することが可能である。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ
ＳＰイメージングシステム（Ｗｉｔｅｃ ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）および製造者により提供されるプロトコールを用いて、対象のヘテロ二量体免疫グロ
ブリンが、均質に＞９９％の純度で精製されたことがわかった（図２５Ｃ）。
この直前の実施例は、ＶＨ３ドメイン中のプロテインＡ結合を排除する補完的方法と、
ＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合を排除する補完的方法とを用いて、ヘテロ二量体免
疫グロブリン内のプロテインＡおよびＧ部位の数を調整できることを示す。これらの補完
的技術を用いて、よって、差次的精製を可能にする結合部位の数を最小限に減らして、そ
のことにより、より穏やかな溶出条件を用いることが可能になる。これは、ヘテロ二量体
の全体的な回収の点で有利であると期待される特徴である。
プロテインＡおよびＧ排除変異の表面プラズモン共鳴分析
４．１ ヒト新生児Ｆｃ受容体との結合
新生児Ｆｃ受容体との結合は、分解から免疫グロブリンを保護し、それらの半減期を増
加させる。よって、プロテインＡまたはＧとの結合を排除または低減するＦｃ領域中で作
製した置換が新生児受容体との結合を破壊しないことが必須である。
本明細書で用いる置換がヒトＦｃＲｎ結合に与える影響を評価するために、ＳＰＲ実験
をホモ二量体免疫グロブリンに対して行った。工学的に操作されたＦｃ領域を保有する一
方の工学的に操作された重鎖と、１つの未改変のＦｃ領域を保有する他方の重鎖とを有す
る重鎖のヘテロ二量体は、ＳＰＲ実験において用いることができない。なぜなら、未改変
の重鎖由来の結合シグナルが、工学的に操作された重鎖に導入された可能性があるいずれ
の負の影響も埋め合わせる可能性があるからである。
ホモ二量体免疫グロブリンは、全て、ＰＣＴパンフレットＷＯ１０／０９５０３１に開
示されるヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を起源とする同じ可変重鎖と可変軽鎖ドメインを用い
てフォーマットした。
ＳＰＲ測定を行う場合、二価分子、例えばホモ二量体免疫グロブリンをセンサチップ上
に固定化することが最良である。二価分子を分析物として用いるならば、ＳＰＲ測定は、
親和性に加えてアビディティー成分を有する。ソフトウェア分析は、二価の結合化をモデ
ル化し、親和性定数を抽出できるが、可能である場合はいつでも一価分析物を用いて作業
することにより、いずれのアビディティーの偏りも回避することが常に好ましい。この目
的に沿うために、各ホモ二量体免疫グロブリンを、ＣＭ５センサチップ上に直接結合させ
た。ベータ２－ミクログロブリンタンパク質と非共有的に結合したアルファ鎖から構成さ
れるヒトＦｃＲｎの可溶型の細胞外領域を調製し、分析物として用いた。
ヒトＦｃＲｎ生成およびＳＰＲ測定の実験手順の詳細は、方法の項で見出すことができ
る。
重要なことには、全てのバリアントは、ｐＨ６．０にて結合を示し、ｐＨ依存性放出を
保持した。ヒトＦｃＲｎに対するこれらの親和性および相対的親和性をそれぞれ図２６お
よび２７に示し、ＳＰＲセンサグラムの例を図２８に示す。
図２６は、プロテインＡまたはプロテインＧ排除に基づく方法において用いた置換につ
いてのＫＤ値を示す。未改変のＩＧＨＧ１対照免疫グロブリンは、約２０００ｎＭのＫＤ
を有したが、これは、天然ヒトＩＧＨＧ１抗体とヒトＦｃＲｎとの結合について以前に報
告されたＫＤ値と一致する値である（１７００～２５００ｎＭ、Ｚａｌｅｖｓｋｙ Ｊら
、（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２８（２）：１５７～１５９）。プロ
テインＡ排除法において用いた全てのＩＧＨＧ１－ＩＧＨＧ３ベースの置換は、より上の
範囲または天然ヒトＩＧＨＧ１抗体とヒトＦｃＲｎとの結合について観察される値よりも
高いＫＤ値を有した（抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ１３３、抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ
１１３および抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）。この観察は、未
改変のＩＧＨＧ１対照免疫グロブリンのものに対する相対的結合の点で種々のバリアント
の結合を表した場合に、明白であった（図２７）。最小限の置換の対Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３
６Ｆを含むプロテインＡ法で用いた置換は、天然ヒトＩＧＨＧ１対照について観察された
結合の７３から７７％だけを保持したが、プロテインＧ法において用いた最小限の置換の
対は、９３％の保持を達成した（Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ）。これらの測定から、プロテ
インＧでの差次的精製の方法が、ヒトＦｃＲｎ結合を維持しながらヘテロ二量体免疫グロ
ブリンを精製するために最も効率的な方法であると結論付けることができる。驚くべきこ
とに、置換Ｎ４３４Ａは、Ｍ４２８Ｇ置換の負の影響を埋め合わせることがわかった（相
対的比率がそれぞれ３．１３および０．４５）。
４．２ ヒトＦｃガンマ受容体３ａとの結合
ｈＦｃγＲ３ａに対する抗体親和性は、抗体のＦｃ領域に限定される。Ｆｃ工学操作研
究は、Ｆｃ置換がｈＦｃγＲ３ａと結合し、かつ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のよう
なエフェクター機能を誘発する抗体の能力に大きい影響を与えることができることを示し
ている（Ｓｔｒｏｈｌ ＷＲら（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．、２０（６）：６８５～９１頁）。
置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４ＡがｈＦｃγＲ３ａ親和性に影響を与えたかを評価する
ために、ホモ二量体抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ抗体およびアイ
ソタイプ対照抗体（ホモ二量体抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１抗体）を、ｈＦ
ｃγＲ３ａ結合について、ＳＰＲによりアッセイした。組換えｈＦｃγＲ３ａについての
測定を行い、結果を図２９に示す。両方の抗体は、ＫＤ値が近く、このことは、置換が特
異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明した。よって、ｈＦｃγＲ３ａ結
合を著しく失うことなくガンマアイソタイプＦｃ領域内のプロテインＧ結合を工学的に操
作するために、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを広く用いることができることが期待さ
れる。
プロテインＡおよびＧ排除置換の免疫原性予測
多くの認可済みキメラ、ヒト化および完全ヒト抗体は、著しい抗薬物抗体応答をヒトに
おいて誘導する。中和抗薬物抗体は、薬物－標的相互作用に干渉して、有効性の減少をも
たらす。いくつかの場合では、抗薬物抗体は、免疫複合体の形成により毒性を導くことが
ある。コンピュータモデルおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞シミュレーション試験を開発
して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを予測した。
プロテインＡおよびプロテインＧ排除変異の予測される免疫原性を、ＬｏｎｚａのＥｐ
ｉｂａｓｅプラットフォーム（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて調べた。免疫原性を予測するた
めの構造的バイオインフォーマティクスアプローチであるＥｐｉｂａｓｅ（商標）ｖ．３
技術を用いて、標的アミノ酸配列中の可能性のあるＴ細胞エピトープを探索した。この技
術は、ＨＬＡ受容体とのペプチドの実験的に得られる結合親和性とともに、ＨＬＡ受容体
の最新の３Ｄ構造の特徴を統合する。実際上、このｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ法は、アミノ酸配
列を１０アミノ酸の長さのペプチド（１０マー）に切断し、４３のＤＲＢ１アロタイプ由
来のＨＬＡクラスＩＩ受容体とのその結合強度の量の見積を算出する。ヒト抗体生殖系列
アミノ酸配列に相当する自己ペプチドは、分析から除外される。
ＩｇＧ Ｆｃ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａな
らびにＶＨ３ドメインサブクラス中のプロテインＡ結合を排除する置換Ｎ８２ａＳについ
ての免疫原性予測を調べた。
Ｆｃ ＩＧＨＧ１領域と融合した実施例２．１で言及した抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ断片の
アミノ酸配列（配列番号６１）を対照配列として用い、さらに改変して、Ｅｐｉｂａｓｅ
のためのさらに２つのインプット配列を設計した：置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを有
する第２アミノ酸配列ならびに置換Ｎ８２ａＳを有する第３アミノ酸配列。
置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを包含するように作製した１６のｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ
ペプチドのうち、１つのペプチドだけが、ＤＲＢ１*１５およびＤＲＢ１*１６についての
強いエピトープであると見られ（ＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬ（配列番号９９））、その他のＤ
ＲＢ１アロタイプは、この特定のペプチドと中程度の結合を示したかまたは全く結合を示
さなかった。１６のうち２つのペプチドが、いくつかのＤＲＢ１アロタイプに対する中程
度の親和性を有すると予測された。
置換Ｎ８２ａＳを包含するように作製したペプチドは、強いＤＲＢ１結合を示さなかっ
た。さらに、強く結合すると予測された対照配列由来の１つのペプチドだけが、置換Ｎ８
２ａＳを導入した場合に中程度の親和性で結合した。これらの結果を図３０にまとめ、参
照抗体としてのＬｏｎｚａから提供されるその他の治療用抗体と比較する。
ＩｇＧ ＦＡＢ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換Ｔ２０９Ｇ、Ｔ２０９Ｐおよ
びＫ２１３Ｖについての免疫原性予測を調べた。これらの置換はＥｐｉｂａｓｅを用いて
直接試験せず、代わりに、無作為化分析を行って、それらの免疫原性能力を評価した。こ
の分析では、Ｅｐｉｂａｓｅは、全ての可能性のある置換について相対的スコアを与える
。スコアが高いほど、この置換について予測される結合がより強い。全体的なＤＲＢ１ス
コアは、重要なエピトープカウント、影響されるアロタイプの数、および影響されるアロ
タイプの頻度を考慮に入れる。ここで、置換は、ＣＨ１ ＩＧＨＧ１の関係において分析
した（図３１）。好ましい置換Ｋ２１３Ｖは、他の２つのアミノ酸置換と比較して非常に
低い免疫原性能力を示した。２０９位の置換は、より高いスコアを与えたが、非常に低い
免疫原性の危険性をまだ示した。
全体的に、本実施例で用いた全ての置換は、ヒト治療において現在用いられているヒト
またはヒト化抗体と比較して、低い免疫原性能力を示した。
プロテインＡおよびＧ排除置換の熱安定性分析
ヒトＩｇＧサブクラスについての融解プロファイルは、知られており（Ｇａｒｂｅｒ
ＥおよびＤｅｍａｒｅｓｔ ＳＪ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ
．Ｃｏｍｍｕｎ．、３５５（３）：７５１～７頁）、全てのプロファイルは、ＣＨ２、Ｃ
Ｈ３およびＦＡＢ領域の独立したアンフォールディングに相当する３つのアンフォールデ
ィング推移を含むことが示されている。４つのヒトＩｇＧサブクラスのうち、ＩＧＨＧ１
は最も安定なＣＨ３ドメイン（約８５℃）を有する。その他のＩｇＧサブクラス由来のＣ
Ｈ３ドメインは、安定性がより低いが、生理的条件下で約７０℃未満で融解するものは知
られていない。同様に、全てのサブクラスは、約７０℃の融解温度を有するＣＨ２ドメイ
ンを有することが知られている。
６．１ プロテインＧ排除置換の熱安定性分析
図３２は、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを有するヒトホモ二量体Ｆｃ領域（γ１ヒ
ンジ領域とγ１ ＣＨ２ドメインとγ１ ＣＨ３ドメインとを包含する鎖の二量体）、な
らびに非置換対照Ｆｃ領域の融解プロファイルを示す。６１．６℃のＴｍを有する第１推
移は、ＣＨ２ドメインの融解を表すが、７９．１℃のＴｍを有する第２推移は、ＣＨ３ド
メインの融解を表す。これらの２つの推移は、対照Ｆｃ領域について観察される２つの推
移とよく対照する。これらの結果から、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａは、熱安定性の
点で与える影響が小さいと結論付けた。なぜなら、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、それ
ぞれ５．９℃および５．２℃の熱安定性を失ったからである。
置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａの影響を、ホモ二量体免疫グロブリンの関係において
も調べた。実施例２．２の置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを有する抗ＨＥＲ３ホモ二量
体免疫グロブリンの融解プロファイルを、図３３Ａに示す。このプロファイルは、同じ置
換を有するホモ二量体Ｆｃ領域について得られたプロファイルと比較して、８２℃のＴｍ
を有するさらなる第３の推移を示す（図３２）。このさらなる推移は、ＦＡＢ領域の融解
を表すが、その他の２つの推移は、上記のようにＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融解を表
す。６５℃のＴｍを有する第１の推移は、ＣＨ２ドメインの融解を表し、７９℃のＴｍを
有する第２の推移は、ＣＨ３ドメインの融解を表す。この結果から、置換Ｍ４２８Ｇおよ
びＮ４３４Ａも、ホモ二量体免疫グロブリン内で熱安定性に与える影響が小さいと結論付
けた。なぜなら、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、図３４Ａに示す抗ｈＣＤ１９抗体のよ
うな非置換の等価な免疫グロブリンの融解プロファイルと比較して、それぞれ６．１℃お
よび４℃の熱安定性を失ったからである。
最後に、ガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片内のプロテインＧ結合を排除する置換Ｔ
２０９Ｇ、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３Ｖの影響も、ホモ二量体免疫グロブリンの関係にお
いて調べた。実施例２．２のＦｃ置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａと組み合わせて置換Ｔ
２０９ＧまたはＴ２０９ＰまたはＫ２１３Ｖを有する抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリ
ンの融解プロファイルを、図３３Ａおよび３３Ｂに示す。これらのプロファイルは、ＦＡ
Ｂ熱安定性が、置換Ｔ２０９ＧおよびＫ２１３Ｖ（それぞれ－３．６℃および－３．４℃
）によってわずかに影響されただけであったが、置換Ｔ２０９Ｐは、最大の影響を有し、
消失が１０．８℃であったことを示す。置換Ｔ２０９ＧおよびＫ２１３Ｖは、よって、免
疫グロブリンを置換してＦＡＢ領域内でプロテインＧ結合を排除する場合に好ましい。
６．２ プロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリ
ンの熱安定性分析
Ｆｃ領域中のプロテインＡ結合を低減または排除するガンマアイソタイプＣＨ２および
ＣＨ３ドメインの異なる組み合わせの熱安定性を、ホモ二量体免疫グロブリンフォーマッ
トの関係において調べた。実施例４で論じた抗ｈＣＤ１９ホモ二量体免疫グロブリンの融
解プロファイルを図３４に示す。これらのプロファイルは、２つの推移を示し、第１の推
移は、ＣＨ２ドメインの融解を表し（約７０℃）、第２の推移は、ＦＡＢ領域の融解を表
し、これは、ＣＨ３ドメインの融解について期待される推移（約８２℃）とオーバーラッ
プする。これらの結果から、ドメインの組み合わせＦｃ１１３およびＦｃ１３３（ここで
、数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソ
タイプサブクラスに対応する）ならびにそれらのＩＧＨＧ１対照（図３４Ａ）は、ほぼ同
一の融解プロファイルを有し（－０．８から－２．１℃の差）、よって、これらのドメイ
ンの組み合わせは、ホモ二量体免疫グロブリンフォーマット内で熱安定性の点でわずかな
影響だけを有したと結論付けた。
プロテインＧ排除置換の薬物動態分析
ヘテロ二量体抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ２抗体および関連するホモ二量体抗ＨＥＲ２対照抗体
の薬物動態を調べた。
抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ヘテロ二量体免疫グロブリンは、実施例３．２の抗ＨＥＲ２／Ｈ
ＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンについて記載したように構築および精製し、抗ＨＥＲ
２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号６２）と抗ＨＥＲ２ ＦＡ
Ｂ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖（配列番号７８の重鎖および配列番号３１の軽鎖）との共有結
合により得られた。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧとの結合部位
を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａは、その
Ｆｃ部分中でプロテインＧ結合が排除され、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテイ
ンＧ結合部位は存在しない、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない）と、プロテインＧに
対する２つの結合部位を有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖
は、ＩＧＨＧ１ Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＧ結合部位を有し、そのＣＨ
１ドメイン中に存在する第２プロテインＧ結合部位を有する）とを有すると期待された。
重要なことには、この特定の重鎖組み合わせは、１つの特異性、すなわちＨＥＲ２に対す
る特異性だけを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの生成をもたらした。
ホモ二量体抗ＨＥＲ２対照抗体は、２コピーの抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ－Ｆｃ ＩＧＨＧ１
重鎖（配列番号７８の重鎖および配列番号３１の軽鎖）の共有的集合から得られ、トラス
ツズマブとして知られる市販の抗ＨＥＲ２抗体と同一であった（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、
ｈｕＭＡＢ４Ｄ５－８、商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；米国特許第５，８２１
，３３７号）。
ＨＥＲ２に対する特異性だけを有する一方の重鎖中のプロテインＧ結合が排除されたこ
のヘテロ二量体免疫グロブリンを設計して、薬物動態分析において、同じ特異性を有する
ホモ二量体免疫グロブリンと直接比較ができるようにした。同じ特異性を有することによ
り、ヘテロ二量体免疫グロブリンと関連するホモ二量体免疫グロブリン対照とは、同様の
レベルの標的に関連する分解を有すると期待された。
薬物動態測定（図３５）は、ヘテロおよびホモ二量体抗体について、近い血清半減期を
示した。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、およそ１９４±１５時間（約８日）の血清半減
期を有したのに比較して、対照ホモ二量体免疫グロブリンについて２４９±５８時間（約
１０日）であった（図３６）。
プロテインＡ置換の機能分析
ＨＥＲ３は、乳癌および卵巣癌を含む様々なヒトのがんの腫瘍発生に関与する（Ｈｓｉ
ｅｈ ＡＣおよびＭｏａｓｓｅｒ ＭＭ（２００７）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、９７：４
５３～４５７頁；Ｂａｓｅｌｇａ ＪおよびＳｗａｉｎ ＳＭ（２００９）Ｎａｔ Ｒｅ
ｖ Ｃａｎｃｅｒ、９（７）：４６３～７５頁）。いくつかの抗ＨＥＲ３抗体が記載され
、いくつかは、ヒト臨床試験で調べられている（ＭＭ－１２１抗体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、ＰＣＴパンフレットＷＯ０８／１００６
２４）およびＵ３－１２８７またはＡＭＧ－８８８（Ｕ３ ＰｈａｒｍａＡＧ／Ｄａｉｉ
ｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ／Ａｍｇｅｎ、ＰＣＴパンフレットＷＯ０７／０７７０２８）。
ＨＥＲ３および別のがん抗原を標的にする二重特異性抗体は、従来のもの、すなわち「
一重特異性」抗ＨＥＲ３抗体よりも大きい治療的影響を有する可能性がある。腫瘍学にお
けるある特に魅力的な標的の組み合わせは、２つのＨＥＲファミリーメンバーを同時に標
的にすることである。増殖因子受容体のＨＥＲファミリーのうち、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ
３、またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３を、二重特異性抗体を用いて同時に標的にすることに
ついて、記載されている（Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｇら（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ
、２０（４）：４７２～８６頁；ＭｃＤｏｎａｇｈ ＣＦら（２０１２）Ｍｏｌ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、１１（３）：５８２～９３頁）。
ＨＥＲ３およびＨＥＲ２抗原は、腫瘍学における２つの好ましい標的であるので、ＨＥ
Ｒ２およびＨＥＲ３を同時に標的にする重鎖のヘテロ二量体を、本発明のプロテインＡ差
次的精製技術を用いて生成することについて調べた。重鎖ヘテロ二量体形成を改善するた
めに、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を同時に標的にするヘテロ二量体免疫グロブリンもＢＥＡ
Ｔ（登録商標）技術を使用した。
ＢＥＡＴ抗体は、「穴へのノブのあてはめ」法よりも優れたヘテロ二量体形成を示す生
体模倣の独特の概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である（ＰＣＴパンフレットＷＯ１２／１
３１５５５ Ｂｌｅｉｎ Ｓら）。ＢＥＡＴプラットフォームは、二重特異性抗体を設計
するための基礎単位として用いることができる新しいヘテロ二量体を創出するための、自
然に存在するホモまたはヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づく。
この技術は、任意のタイプの抗原結合の土台に基づく二重特異性抗体の設計を可能にする
。ｓｃＦｖ－ＦＡＢフォーマットをここで用いて、抗原結合部位に対する共通軽鎖を開発
する必要なく二重特異性抗体を設計する。
実施例２および３に記載した抗ＨＥＲ３抗体由来の可変重鎖および軽鎖ドメインは、Ｐ
ＣＴパンフレットＷＯ０７／０７７０２８（Ｒｏｔｈｅ Ｍら）において最初に報告され
た。この可変重鎖ドメインは、ＶＨ２サブクラスに属するのでプロテインＡと結合しない
ので、ＶＨ３サブクラスに基づく別の抗ＨＥＲ３抗体を開発して、二重特異性ヘテロ二量
体免疫グロブリンを開発する場合のＶＨ３ドメイン中のプロテインＡ排除の有用性を証明
した。
この目的のために、ｓｃＦｖ－ファージディスプレイライブラリーを、方法の項に記載
したようにスクリーニングした。ある好ましいｓｃＦｖ断片は、高い熱安定性を示し、親
和性成熟のためにさらに選択した（配列番号７９）。ファージディスプレイを用いて抗体
を親和性成熟させる技術は、知られている（Ｂｅｎｈａｒ Ｉ（２００７）Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．、７（５）：７６３～７９頁）。多様性は、ｓｃＦｖ
遺伝子配列内に、ＣＤＲ－Ｈ１（Ｋａｂａｔ残基：３１および３２）およびＣＤＲ－Ｈ２
（Ｋａｂａｔ残基：５２、５３、５６および５８）中の同時のＮＮＫ多様化により導入し
、全てのその他のＣＤＲは一定に保った。得られた親和性成熟ライブラリーは、２．５×
１０ｅ７の多様性を有し、ビオチン化抗原およびストレプトアビジン捕捉を用いる３回の
選択を行ったが、ここでは漸減量の抗原とともに非ビオチン化抗原との競合を用いた。１
つの好ましい親和性成熟ｓｃＦｖ断片（配列番号８０、配列番号８１のＶＨドメイン、配
列番号８２のＶＬドメイン）は、ＨＥＲ３に対してナノモル以下の親和性を有し（ＳＰＲ
により測定、データは示さず）、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンにフォーマット
するためにさらに選択した。
この親和性成熟ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ３サブクラスに基づいたので、置換Ｎ８２ａＳ（
Ｋａｂａｔナンバリング、配列番号８３）を用いてプロテインＡ結合をまず排除し、次い
で、ＦＡＢ断片にフォーマットした（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ
）と省略する）。配列番号８４の重鎖および配列番号８５の軽鎖を有する、得られた抗Ｈ
ＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）断片を、次いで、実施例２．１に記載した抗ＨＥＲ２ホモ
二量体免疫グロブリン由来の上記の抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ断片を有する二重特異性ＢＥＡ
Ｔ抗体の設計に用いた。
ＢＥＡＴ抗体は重鎖ヘテロ二量体であるので、２つの異なる重鎖を区別する必要がある
。これらは、本明細書において、ＢＴＡ鎖およびＢＴＢ鎖という。ＢＴＡおよびＢＴＢ鎖
は、本明細書で用いる場合、抗原結合部位と、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１
またはＩｇＧ３アイソタイプを起源とするＣＨ２ドメインと、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ
３アイソタイプを起源とする改変ＣＨ３ドメインとを包含する。ＢＴＡおよびＢＴＢ鎖は
、適当であれば、プロテインＡおよび／またはＧ結合を非対称的に排除できる。
ＢＥＡＴ抗体の抗ＨＥＲ３部分は、上記の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）断片と、
ＣＨ１γ１領域と、γ１ヒンジ領域と、γ３ ＣＨ２領域と、γ３ベースのＢＴＡ ＣＨ
３ドメインとを包含した（配列番号８５を有する同族軽鎖と集合した配列番号８６の完全
重鎖配列、本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）－ＢＴＡ ＩＧＨＧ３重
鎖という）。γ３ベースのＢＴＡ ＣＨ３ドメインは、ＷＯ１２／１３１５５５、既出に
配列番号７５（ＣＨ３－ＢＴアルファＩＧＨＧ３ドメイン）として記載されている。
ヘテロ２量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２部分は、上記の抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ断
片と、ＣＨ１γ１領域と、γ１ヒンジ領域と、γ１ ＣＨ２領域と、γ１ベースのＢＴＢ
ＣＨ３ドメインとを包含した（配列番号８７の完全重鎖配列、本明細書において抗ＨＥ
Ｒ２ ｓｃＦｖ－ＢＴＢ ＩＧＨＧ１重鎖という）。γ１ベースのＢＴＢ ＣＨ３ドメイ
ンは、ＷＯ１２／１３１５５５、既出に配列番号１４（置換Ｆ４０５Ａを有するＣＨ３－
ＢＴベータドメイン）として記載されている。
これらの２つの重鎖（その同族軽鎖と集合したもの）の集合により得られるヘテロ二量
体免疫グロブリンは、本明細書においてＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３という。
まとめると、本明細書に記載するＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３は、抗ＨＥＲ３ ＦＡ
Ｂ（Ｎ８２ａＳ）－ＢＴＡ ＩＧＨＧ３重鎖と抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＢＴＢ ＩＧＨＧ
１重鎖との共有結合により得られ、よって、プロテインＡに対する結合部位がない１つの
重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）－ＢＴＡ ＩＧＨＧ３重鎖は、そのＦｃ領域中
でプロテインＡ結合が排除され、その可変重鎖ドメイン中に存在するプロテインＡ結合部
位は、置換Ｎ８２ａＳを用いて排除されている）と、プロテインＡに対する２つの結合部
位を有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＢＴＢ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１
Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＡ結合部位を有し、そのＶＨ３ドメイン中に
存在する第２プロテインＡ結合部位を有した）とを有すると期待された。この特定の重鎖
組み合わせは、合計で２つのプロテインＡ結合部位を有する対象のＢＥＡＴ ＨＥＲ２／
ＨＥＲ３とともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＡに対する結
合部位を有さず、第２の種は、合計で４つを有する）の生成をもたらした。
ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＡ結合部位の数が異なることにより
、３つ全ての分子を図３７に示すようにプロテインＡ勾配クロマトグラフィーにより効率
的に分離することが可能になった（実施例３に記載したものと同じ方法）。
ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３が、肺癌株化細胞Ｃａｌｕ－３のヘレグリン誘発増殖を
阻害できるかを決定するために、増殖アッセイの阻害を、方法の項に記載したように行っ
た。図３８Ａは、ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３が、用量依存的様式で、抗ＨＥＲ２およ
び抗ＨＥＲ３対照抗体（それぞれトラスツズマブおよびＷＯ０７／０７７０２８、既出に
記載される上記の抗ＨＥＲ３、データは示さず）またはそれらの組み合わせよりも大きい
程度でヘレグリン誘発細胞増殖を阻害したことを証明する。さらに、ＢＥＡＴ ＨＥＲ２
／ＨＥＲ３は、ＷＯ１０／１０８１２７、既出に記載されるＤＬ１１ｆ抗体、抗ＥＧＦＲ
および抗ＨＥＲ３二重特異性抗体よりも大きい程度でヘレグリン誘発細胞増殖を阻害した
（図３８ＢおよびＣ）。

Claims (148)

  1. エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
    を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
    免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる群から選
    択され、
    免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低
    減させるまたは喪失させる改変を含み、
    免疫グロブリン定常領域がＣＨ２および／またはＣＨ３領域であるならば、前記低減が、
    未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも３０％である、
    免疫グロブリンまたはその断片。
  2. 免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩＧＨＧ由来である、請求項１に記載の免疫グロブリ
    ンまたはその断片。
  3. 免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ３領域を含む、請求項１または請求項２に記載の免疫
    グロブリンまたはその断片。
  4. 免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ２領域を含む、請求項１または請求項２に記載の免疫
    グロブリンまたはその断片。
  5. （ｉ）免疫グロブリン定常領域の改変が、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、
    ２５５位、３１１位、３８０位、３８２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、
    ４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリング
    システム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含むか、または
    （ｉｉ）免疫グロブリン定常領域の改変が、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、
    ３１１位、３８０位、３８２位、４２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位お
    よび４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸
    置換を含むか、または
    （ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域の改変が、２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ
    、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ
    、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓおよび４３８Ａ（ＥＵナンバリングシステム）からなる
    群から選択されるアミノ酸置換を含む、
    請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  6. 免疫グロブリン定常領域の改変が、２５０位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ
    酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、２５０Ｑ（ＥＵナンバリングシステム）でない
    、請求項５に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  7. アミノ酸置換が、４２８Ｌ（ＥＵナンバリングシステム）でない、請求項５に記載の免
    疫グロブリンまたはその断片。
  8. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、
    ２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび
    ４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ
    からなる群から選択されるアミノ酸置換（ＥＵナンバリングシステム）、あるいは
    （ｉｉ）４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔおよび４２８Ｖからなる群から選択されるアミノ
    酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選
    択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置に
    てさらなる置換とを含む（ＥＵナンバリングシステム）、
    請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  9. 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４３４Ａもしくは４
    ３４Ｓと４２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのさらなる置換とを含む、請求項８に
    記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  10. 免疫グロブリン定常領域の改変が、４２８Ｇおよび４３４Ａまたは４３４Ｓ（ＥＵナン
    バリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項９に記載の免疫グロブリ
    ンまたはその断片。
  11. 免疫グロブリン定常領域の改変が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの
    結合を、未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも１０％低減
    する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  12. 免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記
    載の免疫グロブリンまたはその断片。
  13. 改変が、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域中にあり、免疫グロブリンまたはその断
    片とプロテインＧとの結合を喪失させる、請求項１２に記載の免疫グロブリンまたはその
    断片。
  14. 免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩＧＨＧ由来である、請求項１２または請求項１３に
    記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  15. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、
    （ｉ）ＣＨ１領域が、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられてい
    るか、またはＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループが、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨ
    Ｍ由来のＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられているか、あるいは
    （ｉｉ）改変が、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位（ＥＵナンバリングシス
    テム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
    請求項１４に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  16. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、
    （ｉ）改変が、２０９位および２１３位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ酸置換
    を含むか、または
    （ｉｉ）改変が、
    ２０９Ｐ／２１０Ｓ、
    ２１３Ｖ／２１４Ｔおよび
    ２０９Ｇ／２１０Ｎ
    からなる置換の群（ＥＵナンバリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、
    請求項１５に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  17. （ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含
    む第１ポリペプチドと、
    （ｂ）第２エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む
    第２ポリペプチドであって、免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域か
    らなる群から選択される第２ポリペプチドと
    を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
    第２ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは
    その断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
    免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合
    親和性を変化させ、
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片が、免疫グロブリン定常領域中に改変を有さ
    ない未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して、少なくとも
    ８０％のＦｃＲｎとの結合を保持する、
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  18. 親和性試薬が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域中の結合部位と部分的ま
    たは完全にオーバーラップする部位と結合する、請求項１７に記載のヘテロ二量体免疫グ
    ロブリンまたはその断片。
  19. 親和性試薬が、細菌の表面タンパク質である、請求項１７または請求項１８に記載のヘ
    テロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  20. 親和性試薬が、プロテインＧである、請求項１７、１８または１９に記載のヘテロ二量
    体免疫グロブリンまたはその断片。
  21. 免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩＧＨＧ由来である、請求項１７から２０のいずれか
    一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  22. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８
    ２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３
    ６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される
    位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４
    ２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位（ＥＵナンバリングシ
    ステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、
    ４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓお
    よび４３８Ａ（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたは
    その断片。
  23. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、２５０位（ＥＵナンバリングシ
    ステム）にてアミノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、２５０Ｑ（ＥＵナンバリン
    グシステム）でない、請求項２２に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  24. アミノ酸置換が、４２８Ｌ（ＥＵナンバリングシステム）でない、請求項２２に記載の
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  25. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、
    ２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび
    ４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ
    からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換（ＥＵナンバリングシステム）、あるいは
    （ｉｉ）４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔおよび４２８Ｖからなる群から選択されるアミノ
    酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選
    択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置に
    てさらなる置換とを含む（ＥＵナンバリングシステム）、
    請求項１７から２２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片
    。
  26. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇと４３４
    位でのさらなる置換とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換
    ４３４Ａもしくは４３４Ｓと４２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのさらなる置換と
    を含む、請求項２５に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  27. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇおよび４
    ３４Ａまたは４３４Ｓ（ＥＵナンバリングシステム）を含む、請求項２６に記載のヘテロ
    二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  28. 第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域を含む、請求項１７から２
    ７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  29. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、１または複数のＣＨ１領域をさらに含
    む、請求項１７から２７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその
    断片。
  30. 第１ポリペプチドおよび／または第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、改変
    ＣＨ１領域を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインＧとの結合を低減
    させるまたは喪失させる、請求項２８または請求項２９に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
    リンまたはその断片。
  31. （ｉ）免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩＧＨＧ由来であり、ＣＨ１領域の改変が、Ｉ
    ＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域でのＣＨ１領域の置き換えを含むか、または
    ＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループが、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ
    １ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられているか、あるいは
    （ｉｉ）ＣＨ１領域の改変が、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位（ＥＵナン
    バリングシステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
    請求項３０に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  32. ＣＨ１領域の改変が、
    （ｉ）２０９位および２１３位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２０９Ｐ／２１０Ｓ、
    ２１３Ｖ／２１４Ｔおよび
    ２０９Ｇ／２１０Ｎ
    からなる置換の群（ＥＵナンバリングシステム）から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項３１に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  33. （ｉ）免疫グロブリン定常領域の改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片ま
    たは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリン
    もしくはその断片またはヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のｉｎ ｖｉｖｏ
    半減期を増加させるか、あるいは
    （ｉｉ）免疫グロブリン定常領域の改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片ま
    たは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリン
    もしくはその断片またはヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のヒトＦｃＲｎに
    対する親和性を増加させる、
    請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリンもしくはその断片、または請求
    項１７から３２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片。
  34. 免疫グロブリン定常領域の改変が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して
    、免疫グロブリンまたはその断片とヒトＦｃＲｎとの結合の少なくとも１０％の保持をも
    たらす、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片、ある
    いは免疫グロブリン定常領域の改変が、表面プラズモン共鳴により測定して、未改変のヘ
    テロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヘテロ二量体免疫グロブリンまた
    はその断片とヒトＦｃＲｎとの結合の少なくとも８０％の保持をもたらす、請求項１７か
    ら３２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  35. エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
    を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
    免疫グロブリン定常領域が、
    ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる群から選択され、免疫グロブリン定常領域が、免疫
    グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含
    み、
    免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合
    親和性を変化させ、
    免疫グロブリンまたはその断片が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して、
    少なくとも８０％のＦｃＲｎとの結合を保持する、
    免疫グロブリンまたはその断片。
  36. 親和性試薬が、免疫グロブリン定常領域中のヒトＦｃＲｎに対する結合部位と部分的ま
    たは完全にオーバーラップする部位と結合する、請求項３５に記載の免疫グロブリンまた
    はその断片。
  37. 親和性試薬が、細菌の表面タンパク質である、請求項３５または請求項３６に記載の免
    疫グロブリンまたはその断片。
  38. 親和性試薬が、プロテインＧである、請求項３５、３６または３７に記載の免疫グロブ
    リンまたはその断片。
  39. ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であって、
    （ｉ）免疫グロブリンの混合物から、１つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
    またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、免疫グロブリン定常領域のＣ
    Ｈ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二
    量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させ
    るステップと、
    （ｉｉ）免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供するステップと、
    （ｉｉｉ）ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＧから溶出するステ
    ップと
    を含む方法。
  40. 免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラ
    フィーの方法であって、
    （ｉ）ＣＨ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域中で重鎖の一方を改変して
    、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
    （ｉｉ）両方の重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
    （ｉｉｉ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテイン
    Ｇに供するステップと、
    （ｉｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＧから溶出するステップと
    を含む方法。
  41. 少なくとも１つのＣＨ１領域と１つのＣＨ２および／またはＣＨ３領域とを含む免疫グ
    ロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの
    方法であって、
    （ｉ）ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中で重鎖の一方を改変して、プロテインＧとの結
    合を低減させるまたは喪失させるステップと、
    （ｉｉａ）ヘテロ二量体内に１つだけＣＨ１領域が存在するならば、前記ＣＨ１領域が、
    プロテインＧとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記ＣＨ１領域が
    、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
    （ｉｉｂ）ヘテロ二量体内に２つ以上のＣＨ１領域が存在するならば、１つを除く全ての
    ＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
    未改変のＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
    または全てのＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
    に改変されるステップと、
    （ｉｉｉ）重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
    （ｉｖ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＧ
    に供するステップと、
    （ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＧから溶出するステップと
    を含む方法。
  42. 改変重鎖が、ヒトＩＧＨＧ由来の改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項３９、４
    ０または４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ３領域を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ２領域を含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８
    ２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３
    ６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される
    位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４
    ２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位（ＥＵナンバリングシ
    ステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、
    ４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓお
    よび４３８Ａ（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項４２、４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 免疫グロブリン定常領域の改変が、２５０位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ
    酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、２５０Ｑ（ＥＵナンバリングシステム）でない
    、請求項４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. アミノ酸置換が、４２８Ｌ（ＥＵナンバリングシステム）でない、請求項４５に記載の
    方法。
  48. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、
    ２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび
    ４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ
    からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換（ＥＵナンバリングシステム）、あるいは
    （ｉｉ）４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔおよび４２８Ｖからなる群から選択されるアミノ
    酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選
    択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置に
    てさらなる置換とを含む（ＥＵナンバリングシステム）、
    請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４３４Ａもしくは４
    ３４Ｓと４２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのさらなる置換とを含む、請求項４８
    に記載の方法。
  50. 免疫グロブリン定常領域の改変が、４２８Ｇおよび４３４Ａまたは４３４Ｓ（ＥＵナン
    バリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域を含む、請求項４２から５０のいずれか一項に
    記載の方法。
  52. 免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域中の改変が、免疫グロブリンまたはその断片とプ
    ロテインＧとの結合を喪失させる、請求項５１に記載の方法。
  53. 免疫グロブリン定常領域が、
    （ｉ）改変ＣＨ１領域を含むＩＧＨＧ由来の免疫グロブリン定常領域であって、ＣＨ１領
    域が、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられているか、またはＣ
    Ｈ１ストランドＧおよび一部のＦＧループが、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１
    ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられている免疫グロブリン定常領域、あ
    るいは
    （ｉｉ）改変ＣＨ１領域であって、改変が、２０９位、２１０位、２１３位および２１４
    位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む
    改変ＣＨ１領域
    を含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法。
  54. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、改変が、
    （ｉ）２０９位および２１３位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２０９Ｐ／２１０Ｓ、
    ２１３Ｖ／２１４Ｔおよび
    ２０９Ｇ／２１０Ｎ
    からなる置換の群（ＥＵナンバリングシステム）から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. ＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含むポリペプチドを含む免疫グロ
    ブリンまたはその断片であって、
    ＶＨ３領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合を低減させるまた
    は喪失させる改変を含む、免疫グロブリンまたはその断片。
  56. ポリペプチドが、ＶＨ３領域を少なくとも有する１または複数のさらなるエピトープ結
    合領域を含む、請求項５５に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  57. ＶＨ３領域の改変が、
    （ｉ）６５位にてアミノ酸置換ならびに／もしくは５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６
    ８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔナンバリ
    ング）からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群から選択
    されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）
    を含む、請求項５５または５６に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  58. ポリペプチドが、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４から選択されるヒトＩＧＨ
    ＧのＣＨ２および／またはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域をさらに
    含む、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  59. （ｉ）免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置き換えられて
    いるＣＨ３領域を含むか、または
    （ｉｉ）免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換４３５Ｒ（ＥＵナンバリングシステム
    ）を含むＣＨ３領域を含むか、または
    （ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵナン
    バリングシステム）を含むＣＨ３領域を含む、
    請求項５８に記載の免疫グロブリンまたはその断片。
  60. （ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域を含む第１ポリペプチドと、
    （ｂ）第２エピトープと結合するＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含
    む第２ポリペプチドと
    を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
    第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインＡとの結合
    を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  61. （ａ）プロテインＡと結合し、第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グ
    ロブリン定常領域とを含む第１ポリペプチドと、
    （ｂ）プロテインＡと結合しないかまたはプロテインＡとの結合が低減され、第２エピト
    ープと結合するＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常
    領域とを含む第２ポリペプチドと
    を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
    第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、第２ポリペプチドとプロテインＡとの結合を低減させ
    るまたは喪失させる改変を含む、
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  62. 第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、ＶＨ３領域を少なくとも有する１または複数のさら
    なるエピトープ結合領域を含む、請求項６０または請求項６１に記載のヘテロ二量体免疫
    グロブリンまたはその断片。
  63. 第２ポリペプチドのＶＨ３領域の改変が、
    （ｉ）６５位にてアミノ酸置換ならびに／もしくは５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６
    ８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔナンバリ
    ング）からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群から選択
    されるＶＨ３アミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）
    を含む、請求項６０、６１または６２に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
    片。
  64. 第２ポリペプチドが、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４から選択されるヒトＩ
    ＧＨＧのＣＨ２および／またはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含
    む、請求項６０から６３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその
    断片。
  65. 第２ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、
    （ｉ）ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置き換えられているＣＨ３領域、または
    （ｉｉ）アミノ酸置換４３５Ｒ（ＥＵナンバリングシステム）を含むＣＨ３領域、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵナンバリングシステム）を含むＣ
    Ｈ３領域
    を含む、請求項６４に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  66. （ｉ）改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片または未改変のヘテロ二量体
    免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリンもしくはその断片またはヘ
    テロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるか、あ
    るいは
    （ｉｉ）改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片または未改変のヘテロ二量体
    免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリンもしくはその断片またはヘ
    テロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のヒトＦｃＲｎに対する親和性を増加させる
    か、あるいは
    （ｉｉｉ）改変が、表面プラズモン共鳴により測定して、未改変の免疫グロブリンもしく
    はその断片または未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免
    疫グロブリンもしくはその断片またはヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片とヒ
    トＦｃＲｎとの結合の少なくとも１０％の保持をもたらす、
    請求項５８から５９のいずれか一項に記載の免疫グロブリンもしくはその断片、または請
    求項６４から６５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片
    。
  67. ＶＨ３領域を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であって
    、
    （ｉ）免疫グロブリンの混合物から、１つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
    またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、ＶＨ３領域中またはＶＨ３領
    域および免疫グロブリン定常領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリン
    またはその断片とプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
    （ｉｉ）免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供するステップと、
    （ｉｉｉ）ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＡから溶出するステ
    ップと
    を含む方法。
  68. 少なくとも１つのＶＨ３領域が存在する免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその
    断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
    （ｉ）重鎖の一方を改変して、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させるステ
    ップと、
    （ｉｉａ）ヘテロ二量体内に１つだけＶＨ３領域が存在するならば、前記ＶＨ３領域が、
    プロテインＡとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記ＶＨ３領域が
    、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
    （ｉｉｂ）ヘテロ二量体内に２つ以上のＶＨ３領域が存在するならば、１つを除く全ての
    ＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
    未改変のＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
    または全てのＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
    に改変されステップと、
    （ｉｉｉ）２つの重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
    （ｉｖ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＡ
    に供するステップと、
    （ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＡから溶出するステップと
    を含む方法。
  69. ＶＨ３改変が、
    （ｉ）６５位にてアミノ酸置換ならびに／もしくは５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６
    ８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔナンバリ
    ング）からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群から選択
    されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）
    を含む、請求項６７または請求項６８に記載の方法。
  70. 改変重鎖が、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４から選択されるヒトＩＧＨＧの
    ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含む、請求
    項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 免疫グロブリン定常領域が、
    （ｉ）ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置き換えられているＣＨ３領域、または
    （ｉｉ）アミノ酸置換４３５Ｒ（ＥＵナンバリングシステム）を含むＣＨ３領域、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵナンバリングシステム）を含むＣ
    Ｈ３領域
    を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. （ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と、ＣＨ１および／またはＣＨ２
    および／またはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域とを含む第１ポリペ
    プチドと、
    （ｂ）ＶＨ３を少なくとも含む第２エピトープと結合するエピトープ結合領域ならびに／
    またはＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含
    む第２ポリペプチドと
    を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
    第１ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第１親和性試薬との
    結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
    第２ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第２親和性試薬との
    結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  73. 第１親和性試薬が、プロテインＧである、請求項７２に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
    リンまたはその断片。
  74. 第２親和性試薬が、プロテインＡである、請求項７２に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
    リンまたはその断片。
  75. 第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩＧＨＧ由来であり、第２ポリペ
    プチドが、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４から選択される、請求項７２に記載
    のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  76. 第１ポリペプチドの改変が、免疫グロブリン定常領域中の改変を含む、請求項７２から
    ７５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  77. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８
    ２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３
    ６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される
    位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４
    ２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位（ＥＵナンバリングシ
    ステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、
    ４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓお
    よび４３８Ａ（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項７６に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  78. 免疫グロブリン定常領域中の改変が、２５０位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミ
    ノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、２５０Ｑ（ＥＵナンバリングシステム）でな
    い、請求項７６または請求項７７に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  79. アミノ酸置換が、４２８Ｌ（ＥＵナンバリングシステム）でない、請求項７７に記載の
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  80. 免疫グロブリン定常領域中の改変が、
    （ｉ）２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、
    ２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび
    ４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ
    からなる群から選択されるアミノ酸置換（ＥＵナンバリングシステム）、あるいは
    （ｉｉ）４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔおよび４２８Ｖからなる群から選択されるアミノ
    酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選
    択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置に
    てさらなる置換とを含む（ＥＵナンバリングシステム）、
    請求項７６または請求項７７に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  81. 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４３４Ａもしくは４
    ３４Ｓと４２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのさらなる置換とを含む、請求項８０
    に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  82. 免疫グロブリン定常領域の改変が、４２８Ｇおよび４３４Ａまたは４３４Ｓ（ＥＵナン
    バリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８１に記載のヘテロ二量
    体免疫グロブリンまたはその断片。
  83. 第１ポリペプチドが、ＣＨ１領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、請求項７２か
    ら８２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  84. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含む、請求項８３に記載のヘテロ二量体
    免疫グロブリンまたはその断片。
  85. ＣＨ１領域が、ヒトＩＧＨＧ由来であり、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領
    域で置き換えられているか、またはＣＨ１が、ＩＧＨＧ由来であり、ストランドＧおよび
    一部のＦＧループが、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１ストランドＧおよび一部
    のＦＧループで置き換えられている、請求項８３に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンま
    たはその断片。
  86. ＣＨ１領域の改変が、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位（ＥＵナンバリン
    グシステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、請求項８４に記載
    のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  87. ＣＨ１領域の改変が、
    （ｉ）２０９位および２１３位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２０９Ｐ／２１０Ｓ、
    ２１３Ｖ／２１４Ｔおよび
    ２０９Ｇ／２１０Ｎ
    からなる置換の群（ＥＵナンバリングシステム）から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項８６に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  88. ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合の前記低減が、未
    改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して１００％までである
    、請求項７２から８７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
    片。
  89. 第２ポリペプチドが、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４から選択されるＣＨ３
    領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、請求項７４から８８のいずれか一項に記載の
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  90. （ｉ）ＣＨ３領域が、ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置き換えられているか、また
    は
    （ｉｉ）免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換４３５Ｒ（ＥＵナンバリングシステム
    ）を含むＣＨ３領域を含むか、または
    （ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵナン
    バリングシステム）を含むＣＨ３領域を含む、
    請求項８９に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  91. 第２ポリペプチドが、ＶＨ３領域を少なくとも有する１または複数のさらなるエピトー
    プ結合領域を含む、請求項７２から９０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
    リンまたはその断片。
  92. 第２ポリペプチドの改変が、ＶＨ３領域中の改変を含む、請求項７２から９１のいずれ
    か一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  93. ＶＨ３領域の改変が、
    （ｉ）６５位にてアミノ酸置換ならびに／もしくは５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６
    ８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔナンバリ
    ング）からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群から選択
    されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）
    を含む、請求項９２に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  94. ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合の前記低減が、未
    改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して１００％までである
    、請求項８９から９３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
    片。
  95. （ｉ）改変が、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヘテ
    ロ二量体免疫グロブリンまたはその断片のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるか、または
    （ｉｉ）改変が、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヒト
    ＦｃＲｎに対するヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の親和性を増加させるか、
    または
    （ｉｉｉ）第１および／または第２ポリペプチド中の改変が、表面プラズモン共鳴により
    測定して、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヘテロ二量
    体免疫グロブリンまたはその断片とヒトＦｃＲｎとの結合の少なくとも１０％の保持をも
    たらす、
    請求項７２から９４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片
    。
  96. 重鎖のヘテロ二量体の差次的精製の方法であって、
    （ｉ）重鎖の混合物から、第１親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を
    含む第１重鎖と、第２親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む第２
    重鎖とを含む重鎖のヘテロ二量体を単離するステップと、
    （ｉｉ）重鎖の混合物を、第１親和性試薬を含む第１カラムに供するステップと、
    （ｉｉｉ）重鎖のヘテロ二量体を第１カラムから溶出するステップと、
    （ｉｖ）第１カラムからの溶出物を、第２親和性試薬を含む第２カラムに供するステップ
    と、
    （ｖ）重鎖のヘテロ二量体を第２カラムから溶出するステップと
    を含む方法。
  97. 第１および第２親和性試薬が、細菌の表面タンパク質に由来する、請求項９６に記載の
    方法。
  98. 第１親和性試薬が、プロテインＡであり、第２親和性試薬が、プロテインＧであるか、
    または第１親和性試薬が、プロテインＧであり、第２親和性試薬が、プロテインＡである
    、請求項９６または請求項９７に記載の方法。
  99. 第１重鎖の改変が、ヒトＩＧＨＧ由来の改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項９
    ６に記載の方法。
  100. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４からなる群
    から選択される、請求項９９に記載の方法。
  101. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ３領域を含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ２領域を含む、請求項１００に記載の方法。
  103. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８
    ２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３
    ６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される
    位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４
    ２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位（ＥＵナンバリングシ
    ステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、
    ４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓお
    よび４３８Ａ（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項９９から１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 免疫グロブリン定常領域の改変が、２５０位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ
    酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、２５０Ｑ（ＥＵナンバリングシステム）でない
    、請求項１０３に記載の方法。
  105. アミノ酸置換が、４２８Ｌ（ＥＵナンバリングシステム）でない、請求項１０３に記載
    の方法。
  106. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、
    ２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび
    ４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ
    からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換（ＥＵナンバリングシステム）、あるいは
    （ｉｉ）４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔおよび４２８Ｖからなる群から選択されるアミノ
    酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選
    択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置に
    てさらなる置換とを含む（ＥＵナンバリングシステム）、
    請求項９９から１０３のいずれか一項に記載の方法。
  107. 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４３４Ａまたは４３
    ４Ｓと４２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのさらなる置換とを含む、請求項１０６
    に記載の方法。
  108. 免疫グロブリン定常領域の改変が、４２８Ｇおよび４３４Ａまたは４３４Ｓ（ＥＵナン
    バリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域を含む、請求項１００に記載の方法。
  110. 改変が、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域中にあり、免疫グロブリンまたはその断
    片とプロテインＧとの結合を喪失させる、請求項１０９に記載の方法。
  111. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、（ｉ）ＣＨ１領域が、ＩＧＨＡ１
    もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられているか、またはＣＨ１ストランドＧ
    および一部のＦＧループが、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１ストランドＧおよ
    び一部のＦＧループで置き換えられているか、あるいは
    （ｉｉ）改変が、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位（ＥＵナンバリングシス
    テム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
    請求項１０９または請求項１１０に記載の方法。
  112. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、改変が、
    （ｉ）２０９位および２１３位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２０９Ｐ／２１０Ｓ、
    ２１３Ｖ／２１４Ｔおよび
    ２０９Ｇ／２１０Ｎ
    からなる置換の群（ＥＵナンバリングシステム）から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 第２重鎖の改変が、ヒトＩＧＨＧ由来の改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項９
    ６に記載の方法。
  114. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４から選択さ
    れるヒトＩＧＨＧのＣＨ２および／またはＣＨ３領域を少なくとも含む、請求項１１３に
    記載の方法。
  115. 免疫グロブリン定常領域が、
    （ｉ）ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置き換えられているＣＨ３領域、または
    （ｉｉ）アミノ酸置換４３５Ｒ（ＥＵナンバリングシステム）を含むＣＨ３領域、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵナンバリングシステム）を含むＣ
    Ｈ３領域
    を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 第２重鎖の改変が、改変ＶＨ３領域を含む、請求項９６に記載の方法。
  117. ＶＨ３改変が、
    （ｉ）６５位にてアミノ酸置換ならびに／もしくは５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６
    ８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔナンバリ
    ング）からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群から選択
    されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）
    を含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. （ｉ）重鎖のヘテロ二量体が、９５％より大きい純度まで精製されるか、または
    （ｉｉ）重鎖のヘテロ二量体が、９８％より大きい純度まで精製される、
    請求項９６から１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 重鎖の１または複数が、軽鎖をさらに含む、請求項９６から１１８のいずれか一項に記
    載の方法。
  120. 対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離する方法であ
    って、
    （ｉ）対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離するステ
    ップであって、対象の免疫グロブリンまたはその断片が、プロテインＡおよび／またはプ
    ロテインＧに対する結合部位を全て喪失しているステップと、
    （ｉｉ）第１ステップにおける免疫グロブリンの混合物をプロテインＡまたはプロテイン
    Ｇに供するステップと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収
    するステップと、場合によって、
    （ｉｖ）第２ステップにおけるステップ（ｉｉｉ）からの未結合の対象の免疫グロブリン
    またはその断片をプロテインＡまたはプロテインＧに供するステップと、
    （ｖ）ステップ（ｉｖ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収する
    ステップと
    を含み、
    ステップ（ｉｉ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供し、ステップ（
    ｉｖ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供するか、または
    ステップ（ｉｉ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供し、ステップ（
    ｉｖ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供する、
    方法。
  121. 対象の免疫グロブリンまたはその断片中のプロテインＡに対する結合部位が、ＶＨ３お
    よび免疫グロブリン定常領域中に位置する、請求項１２０に記載の方法。
  122. 対象の免疫グロブリンまたはその断片中のプロテインＧに対する結合部位が、免疫グロ
    ブリン定常領域中に位置する、請求項１２０に記載の方法。
  123. 対象の免疫グロブリンもしくはその断片が、ホモ二量体免疫グロブリンであるか、また
    は対象の免疫グロブリンもしくはその断片が、ヘテロ二量体免疫グロブリンである、請求
    項１２０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 免疫グロブリンの混合物が、対象の免疫グロブリンまたはその断片を投与された患者ま
    たは動物からの血清を含むかまたは該血清に由来する、請求項１２０から１２３のいずれ
    か一項に記載の方法。
  125. 対象の免疫グロブリンまたはその断片が、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４か
    ら選択されるヒトＩＧＨＧの改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１２０から１２
    ４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ３領域を含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. 改変免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ２領域を含む、請求項１２５に記載の方法。
  128. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８
    ２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３
    ６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される
    位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４
    ２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位（ＥＵナンバリングシ
    ステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、
    ４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓお
    よび４３８Ａ（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸置換
    を含む、請求項１２５から１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 免疫グロブリン定常領域の改変が、２５０位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ
    酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、２５０Ｑ（ＥＵナンバリングシステム）でない
    、請求項１２５から１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. アミノ酸置換が、４２８Ｌ（ＥＵナンバリングシステム）でない、請求項１２８に記載
    の方法。
  131. 免疫グロブリン定常領域の改変が、
    （ｉ）２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、
    ２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび
    ４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ
    からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換（ＥＵナンバリングシステム）、あるいは
    （ｉｉ）４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔおよび４２８Ｖからなる群から選択されるアミノ
    酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選
    択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置に
    てさらなる置換とを含む（ＥＵナンバリングシステム）、
    請求項１２５から１２８のいずれか一項に記載の方法。
  132. 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換
    とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換４３４Ａまたは４３
    ４Ｓと４２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのさらなる置換とを含む、請求項１３１
    に記載の方法。
  133. 免疫グロブリン定常領域の改変が、４２８Ｇおよび４３４Ａまたは４３４Ｓ（ＥＵナン
    バリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. 免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１領域を含む、請求項１２５に記載の方法。
  135. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、
    （ｉ）ＣＨ１領域が、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられてい
    るか、またはＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループが、ＩＧＨＡ１もしくはＩＧＨ
    Ｍ由来のＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられているか、あるいは
    （ｉｉ）改変が、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位（ＥＵナンバリングシス
    テム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
    請求項１３４に記載の方法。
  136. 免疫グロブリン定常領域が、改変ＣＨ１領域を含み、
    （ｉ）改変が、２０９位および２１３位（ＥＵナンバリングシステム）にてアミノ酸置換
    を含むか、または
    （ｉｉ）改変が、
    ２０９Ｐ／２１０Ｓ、
    ２１３Ｖ／２１４Ｔおよび
    ２０９Ｇ／２１０Ｎ
    からなる置換の群（ＥＵナンバリングシステム）から選択されるアミノ酸置換を含む、
    請求項１３５に記載の方法。
  137. 対象の免疫グロブリンまたはその断片が、
    （ｉ）改変を含む改変免疫グロブリン定常領域であって、ＣＨ３領域が、ヒトＩＧＨＧ３
    由来のＣＨ３領域で置き換えられている改変免疫グロブリン定常領域、または
    （ｉｉ）４３５Ｒ（ＥＵナンバリングシステム）の位置にてアミノ酸置換を含む改変ＣＨ
    ３領域を含む免疫グロブリン定常領域、または
    （ｉｉｉ）４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵナンバリングシステム）の位置にてアミノ酸置
    換を含む改変ＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域
    を含む、請求項１２５に記載の方法。
  138. 対象の免疫グロブリンまたはその断片が、ＶＨ３領域をさらに含む、請求項１２０から
    １２４のいずれか一項に記載の方法。
  139. ＶＨ３領域が、
    （ｉ）６５位にてアミノ酸置換ならびに／もしくは５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６
    ８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔナンバリ
    ング）からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉ）６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群から選択
    されるアミノ酸置換、または
    （ｉｉｉ）アミノ酸置換６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）
    を含む、請求項１３８に記載の方法。
  140. 第２ポリペプチドが、第２エピトープと結合するエピトープ結合領域を含み、第２エピ
    トープが、ＨＥＲ３である、請求項６０、６１または７２のいずれか一項に記載のヘテロ
    二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  141. エピトープ結合領域が、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号
    ８９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤ
    Ｒ３とを含む、請求項１４０に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  142. エピトープ結合領域が、配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、
    請求項１４０または請求項１４１に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  143. エピトープ結合領域が、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列をさらに
    含む、請求項１４２に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  144. エピトープ結合領域が、配列番号８３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項１
    ４３に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  145. エピトープ結合領域が、配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖部分を含む、請求項１
    ４３に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  146. 第２ポリペプチドが、配列番号８６の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１４０に記載の
    ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  147. 第２ポリペプチドが、配列番号８６の重鎖アミノ酸配列を含み、ヘテロ二量体免疫グロ
    ブリンまたはその断片が、配列番号８５の軽鎖アミノ酸配列を含む第３ポリペプチドをさ
    らに含む、請求項１４０に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。
  148. 第１ポリペプチドが、ＨＥＲ２と結合し、配列番号８７のアミノ酸配列を含み、ヘテロ
    二量体免疫グロブリンまたは断片が、第２ポリペプチドを含み、第３ポリペプチドをさら
    に含み、第２および第３ポリペプチドが、ＨＥＲ３と結合し、配列番号８６および８５の
    アミノ酸配列を含む、請求項６０、６１または７２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体
    免疫グロブリン。
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