JP2012513414A - プロテインaに対する結合が変化した免疫グロブリン変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法規則1.53(b)に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法119(e)に基づき、2008年12月23日に出願の仮出願第61/140565号の優先権を主張し、出典明記によりその内容全体を援用するものである。
本発明は一般に分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、生物学的性質が変化したIgG免疫グロブリン変異体及びその使用方法に関する。
IgGは、ヒト及び他の哺乳動物において最も一般的な免疫グロブリンクラスであり、様々なタイプの免疫療法及び診断法で利用される。ヒトIgG1は、治療的目的のために最も一般的に用いられる抗体である。活動中の研究のある領域は、黄色ブドウ球菌を含む病原体に対する抗体である。その可能性にもかかわらず、黄色ブドウ球菌を標的とする免疫グロブリン療法に関する問題の一つは、黄色ブドウ球菌プロテインAに対する抗体の結合であった。プロテインAに対するIgGの結合が研究されており、プロテインA及びFcRnへの結合に関与する位置が同定された(例として、Riechmann & Davies, J. Biomolecular NMR 6:141-52 (1995)、Artandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:94-98 (1992)、国際公開93/22332を参照)。プロテインAに対して変更した結合を表す変性免疫グロブリンを有することは有益であろう。本発明はこれら及び他の必要性に対処するものであり、以下の開示の概要により明らかであろう。
一態様では、本発明は、野生型ヒトIgG VH領域と比較して、カバットにあるEUインデックスに従って番号付けした一又は複数のアミノ酸残基17、19、57、66、70、79、81、82a、82bに一又は複数のアミノ酸置換を含むヒトIgG VH領域を含む変異体IgGであって、このとき変異体IgGが黄色ブドウ球菌プロテインAに対する変更した結合を有する変異体IgGを提供する。いくつかの実施態様では、変異体IgGはプロテインAに対して増加した結合を有しており、例えば野生型IgG VH領域と比較して、アミノ酸残基70、79及び82b(例えばS70A、Y79A又はS82bA)の一又は複数に一又は複数のアミノ酸置換を含むヒトIgG VH領域を有するものである。いくつかの実施態様では、変異体IgGはプロテインAに対して低減した結合を有しており、例えば野生型IgG VH領域と比較して、アミノ酸残基17、19、57、66、81及び82a(例えばS17A、R19A、T57A、T57K、R66A、Q81A又はN82aA)の一又は複数に一又は複数のアミノ酸置換を含むヒトIgG VH領域を有するものである。いくつかの実施態様では、変異体IgGはヒト又はヒト化のIgGである。いくつかの実施態様では、変異体IgGはIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である。いくつかの実施態様では、変異体IgGは、プロテインA以外の黄色ブドウ球菌タンパク質と結合する。いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の変異体IgGと薬学的に許容可能な担体とを含有してなる薬学的組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、容器に本発明の変異体IgGと使用のための指示書とを具備するキットを提供する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかである。
本明細書において記載される任意の実施態様又はその何かの組合せは、本明細書に記載の本発明の何れか及びすべての変異型IgG及び方法に適用する。
本発明は、抗体及び融合タンパク質に見られるものを含め、黄色ブドウ球菌プロテインAに対して変更した結合を有する、IgGドメインの新規の変異体に関する。これら変異体は、野生型ヒトVH領域と比較して、修飾がプロテインAに対するその親和性を変更する一又は複数のアミノ酸修飾を含む、プロテインAに結合するヒトIgG VH領域ないしはその断片を含む。
本明細書中に記載又は参照される技術及び手順は、当業者に一般に十分理解され、従来の方法論を用いて共通して実施される。例えばその例は以下に記載される方法論を広く利用したものである。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003));the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987));Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994);Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999);Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997);Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995);及び、Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)。
本出願を理解するために、以下の定義を適用し、必要な場合はいつでも、単数で使用した用語には複数形も含まれ、その逆もそうである。ここで用いた用語は特定の実施態様のみを表すためのものであり、限定されるものではないと解すべきである。以下に示すいずれかの定義が出典明記によって本明細書中に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下の定義を調節してもよい。
したがって、ここで使用する「親免疫グロブリン」、「親IgG」、「野生型免疫グロブリン」又は「野生型IgG」とは、無修飾免疫グロブリン、天然に生じる免疫グロブリン、又はここで開示するアミノ酸修飾の一又は複数を欠き、ここで開示する変異体IgGと比較してプロテインA結合が異なる天然に生じる免疫グロブリンの操作した修飾型を意味する。親免疫グロブリンは、天然配列VH領域又は、既存のアミノ酸配列修飾(例えば付加、欠失及び/又は置換)を有するVH領域を含んでよい。また、親免疫グロブリンは、後述する非天然のアミノ酸を含んでよい。親免疫グロブリンは、免疫グロブリン自体、親免疫グロブリンを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指しうる。
ここで使用する「親抗体」又は「野生型抗体」とは、無修飾抗体、天然に生じる抗体、又はここで開示するアミノ酸修飾の一又は複数を欠き、ここで開示する変異体IgGと比較してプロテインA結合が異なる天然に生じる免疫グロブリンの操作した修飾型を意味する。親抗体は、天然配列VH領域又は、既存のアミノ酸配列修飾(例えば付加、欠失及び/又は置換)を有するVH領域を含んでよい。また、親抗体は、後述する非天然のアミノ酸を含んでよい。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指しうる。
ここで使用する「免疫グロブリン変異体」、「変異免疫グロブリン」、「変異体IgG」又は「IgG変異体」なる用語は、少なくとも一のアミノ酸修飾により、親又は野生型の免疫グロブリン配列のアミノ酸と異なる免疫グロブリン配列を意味する。
ここで使用する「抗体変異体」又は「変異抗体」とは、少なくとも一のアミノ酸修飾により、親抗体と異なる抗体を意味する。ある実施態様では、変異抗体は、野生型抗体と比較してVH領域に一又は複数のアミノ酸修飾を有する。ある実施態様では、変異抗体は変異体IgGである。
「アミノ酸修飾」とは、すでに決定されているアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化のことを指す。典型的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入及び/もしくは欠失が含まれる。ある実施態様では、アミノ酸修飾は置換である。
特定位置、例えば、Fc領域「におけるアミノ酸修飾」とは、特定された残基の置換もしくは欠失、又は特定され残基に隣接する少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定された残基に「隣接する」挿入とは、1又は2残基以内の挿入を意味する。その挿入は、特定された残基のN末端側、もしくはC末端側の場合があり得る。
「アミノ酸置換」とは、すでに決定されているアミノ酸配列に存在する少なくとも一のアミノ酸残基を他の異なる「置換」アミノ酸残基で置き換えることを指す。置換残基もしくは残基群は「天然に生じるアミノ酸残基」(即ち、遺伝コードでコードされるもの)でよく、アラニン(Ala);アルギニン(Arg);アスパラギン(Asn);アスパラギン酸(Asp);システイン(Cys);グルタミン(Gln);グルタミン酸(Glu);グリシン(Gly);ヒスチジン(His);イソロイシン(Ile);ロイシン(Leu);リジン(Lys);メチオニン(Met);フェニルアラニン(Phe);プロリン(Pro);セリン(Ser);トレオニン(Thr);トリプトファン(Trp);チロシン(Tyr);及びバリン(Val)からなる群から選択されてよい。ここでのアミノ酸置換の定義には、一又は複数の非天然型アミノ酸残基の置換も包含される。
「単離された」抗体又は他のポリペプチドとは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、抗体又は他のポリペプチドは、(1)例えばローリー法で測定した場合95%を超える抗体又は他のポリペプチド、ある実施態様では99重量%を超えるまで、(2)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分なほど、あるいは、(3)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで十分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体又は他のポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツでの抗体又は他のポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体又は他のポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
「定常ドメイン」なる用語は、抗原結合部位を含有する免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のCH1、CH2及びCH3ドメイン、及び軽鎖のCHLドメインを含有する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、3つのHVRにより連結されたβシート配置を主にとる4つのFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のHVRは、FRによって近接して結合され、他の鎖のHVRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えばADCCへの抗体の関与を示す。
ここで使用するIgG「アイソタイプ」又は「サブクラス」は、その定常領域の化学的及び抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの何れかのサブクラスを意味する。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等.Cellular and Mol. Immunology, 第4版(2000)(W.B. Saunders, Co., 2000)に概説されている。抗体は、抗体と1以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された融合大分子の一部であり得る。
ここで使用する「非天然の修飾」は、アイソタイプでないアミノ酸修飾を意味する。例えば、IgGのいずれもが位置332にグルタミン酸を含んでいないので、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の位置332でのグルタミン酸による置換(332E)は非天然の修飾とみなす。
本明細書中の「ネイキッド抗体」は、細胞障害性部分又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。ある実施態様では、抗体断片は、Fc領域、又はここで開示される一又は複数のFc領域修飾を含むFc領域の一部を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片;ダイアボディ;線形抗体;単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
「Fv」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Fv種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv(scFv)種では、柔軟なペプチドリンカーによって1の重鎖及び1の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Fv種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの3つのHVRは相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つのHVRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのHVRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、scFvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはscFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975);Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995);Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4816567号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991);Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992);Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004);Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004);及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第98/24893号;国際公開第96/34096号;国際公開第96/33735号;国際公開第91/10741号;Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993);Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993);米国特許第5545807号;同第5545806号;同第5569825号;同第5625126号;同第5633425号;同第5661016号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992);Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994);Morrison, Nature 368: 812-813 (1994);Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
多数のHVRの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(CDR)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM HVRは、カバットHVRとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」HVRは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらHVRのそれぞれからの残基を以下に示す。
「フレームワーク」又は「FR」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
カバット番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基を指す場合に用いられる(軽鎖のおよそ残基1−107及び重鎖の残基1−113)(例えばKabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「EU番号付けシステム」又は「EUインデックス」は一般に、イムノグロブリン重鎖定常領域を指す場合に用いられる(例えば上掲のKabat et al.において報告されたEUインデックス)。「カバットにおけるEUインデックス」はヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けする残基を意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、EU番号付けシステムによる残基番号付けを意味する(例えば国際公開WO2006073941を参照のこと)。
「Fc領域」なる用語は、天然配列Fc領域及び変異形Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226の位置又はPro230からの位置のアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Fc領域のC末端リジン(EU番号付けシステムによれば残基447)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのK447残基が除去された抗体群、K447残基が除去されていない抗体群、及びK447残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。ある実施態様では、免疫グロブリンのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2及びCH3を含む。
ヒトのIgG Fc領域の「CH2ドメイン」(「Cγ2」ドメインとも称する)は、通常およそアミノ酸231からおよそアミノ酸340に伸展する。CH2ドメインは、他のドメインと密接には対にならない点で固有である。むしろ、2つのN連結分岐型糖鎖は、完全な天然のIgG分子の2つのCH2ドメイン間に配置する。糖質はドメイン−ドメイン対形成のための置換を提供し、CH2ドメインの安定を促しうることが推測されている。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)。
「CH3ドメイン」は、Fc領域のCH2ドメインのC末端に残基の伸展を含む(すなわちIgGのおよそアミノ酸残基341からおよそアミノ酸残基447まで)。
「変異体Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾により、天然配列のFc領域とは異なるアミノ酸配列を含むものである。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「kon」は、〜10反応単位(RU)の固定した抗原CM5チップを用いて25℃のBIAcore(登録商標)-2000又はBIAcore(登録商標)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
ここで用いる「実質的に低減する」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が2つの数値の差異に、該値(例えばKd値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、2つの数値が有意に異なっていることを意味する。ある実施態様では、前記2つの値間の差異は、参照/比較分子の値の、例えば約10%より大きく、約20%より大きく、約30%より大きく、約40%より大きく、及び/又は約50%より大きい。
「単離された」核酸分子は、例えば天然の環境に通常付随している少なくとも一の他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子を通常発現するが、その核酸分子がその天然の染色体位置と異なる染色体位置にあるか又は染色体外に存在する、細胞に含まれる核酸分子を含む。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約200未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合しているか、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合しているか、又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
ここで用いる「ライブラリ」は、本発明の方法によって配列内に導入する変異アミノ酸の組合せが異なっている配列をコードする核酸、又は抗体ないしは抗体断片配列(例えば、本発明の変異型IgG)の複数を指す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。
「無菌の」製剤は、防腐性であるか、又は生きているすべての微生物及びそれらの胞子を含まない。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩等のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEENTM、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICSTMを含む。
本出願は、IgGの生物学的性質を変えるアミノ酸修飾を含む変異体IgG免疫グロブリンに関する。本出願の変異体免疫グロブリンには、野生型抗体と比較してプロテインAに対して変化した結合を表す抗体が含まれる。
抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を表すタンパク質である。天然抗体は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられてよい。免疫グロブリンにはIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMの5つの主なクラスがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4;IgA1及びIgA2にさらに分類されうる。様々なヒトのIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のアロタイプが記載されている(M.-P. LeFranc and G. LeFranc in: "The Human IgG Subclasses," F. Shakib (ed.), pp. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990)によって概説される)。IgG1、IgG2s、IgG3及びIgG4を含むIgGクラスの異なるアイソタイプは、固有の物理的、生物学的、及び臨床上の性質を有する。ヒトIgG1は治療目的のために最も一般的に用いられる抗体であり、これに関連して大多数の工学研究がなされてきた。
本発明は抗体断片を包含する。重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗体に特に関心がある。ある実施態様では、抗体断片は、Fc領域を含む変異体免疫グロブリン(IgG)の断片である。抗体断片は、酵素消化等の従来の手段によって、又は、組換え技術によって生成されてよい。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Fab、Fv及びScFv抗体断片は全て、大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。ある実施態様では、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。また、抗体断片は、例えば米国特許第5641870号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
本発明はヒト化抗体を包含する。ある実施態様では、ヒト化抗体は、野生型IgGと比較してFc領域内に一又は複数のアミノ酸修飾を有するヒト化変異体IgGである。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が従来技術に既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、一般に「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は、基本的にヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等(1986)Nature 321:522-525;Riechmann等(1988)Nature, 332:323-327;Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基が、及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
ある実施態様では、本発明のヒト抗体は、野生型IgGと比較してVH領域内に一又は複数のアミノ酸修飾を有するヒト変異体IgGである。ヒト抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したFvクローン可変ドメイン配列を既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)に記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体は、野生型抗体と比較してVH領域に一又は複数のアミノ酸修飾を有する二重特異性抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体はヒト又はヒト化の抗体である。また、二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に細胞障害性薬剤を局所化するために用いられうる。これらの抗体は標的抗原結合アーム及び細胞傷害剤、例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテンを結合するアームを有する。ある抗体では、結合特異性はIL−4及びIL−13に対するものである。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製されてもよい。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が1993年5月13日に公開の国際公開第93/08829号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片の製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。ある実施態様では、二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオでは、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ある実施態様では、多価抗体は3から約8の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。かかる一実施態様では、多価抗体は4つの抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(例えば2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖は、VH-CH1-可動性リンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここでの多価抗体は、少なくとも2つ(例えば4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここでの多価抗体は、例えば約2から約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。ここで考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によってはCLドメインを更に含む。
ある実施態様では、本発明の抗体はFc領域を含む単一ドメイン抗体である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体は、野生型IgGと比較してFc領域内に一又は複数のアミノ酸修飾を有する。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。
ある実施態様では、ここに記載する免疫グロブリンのアミノ酸配列修飾(一又は複数)が考慮される。ある実施態様では、修飾は、本発明の変異体IgGへの一又は複数のアミノ酸修飾を含む。ある実施態様では、本発明の変異体IgGの結合親和性、インビボ半減期及び/又は他の生物学的性質をさらに変えることが望ましい。ある実施態様では、アミノ酸修飾は、本明細書中に記載されないFc領域内の一又は複数のアミノ酸修飾を含む。変異体IgGの修飾したアミノ酸配列は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾には、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び/又は挿入及び/又は置換が含まれる。最終コンストラクトが所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列中に導入されうる。
(1)無極性:Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F),Trp(W),Met(M)
(2)無電荷極性:Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D),Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K),Arg(R),His(H)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
一つの種類の置換による修飾は、親抗体(例えばヒト化抗体又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。ある実施態様では、親抗体は、野生型相対物変異体IgG(例えばそのアミノ酸配列内に任意の他の変更を持たない本発明の変異体IgG)である。一般に、更なる開発用に選択される得られた抗体は、それらが生産された親抗体に対して変更された(例えば改善された)生物学的特性を有しているであろう。例示的な置換修飾は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟法を使用して簡便に生産されうる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば6〜7の部位)を変異させることにより、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質(例えば、M13の遺伝子III産物)の少なくとも一部への融合物として、糸状のファージ粒子から表示される。ついで、ファージディスプレイされた抗体は、その生物的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、系統的変異導入法(例えばアラニンスキャニング)を行って、抗原結合に有意に貢献する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又は付加的に、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することにより、抗体と抗原との接触点を同定することが有効である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに説明するものを含む当該分野で知られている技術による置換の候補である。そのような修飾した抗体がひとたび生成されたら、ここに記載のものを含む当該分野で知られている技術を用いて抗体のパネルのスクリーニングを行い、更なる開発のために一又は複数の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を選択することができる。
本明細書及び従来技術の教示によれば、ある実施態様では、本発明の抗体修飾は、対応する野生型の変異体IgGと比較して、一又は複数の変更を有する(例えばそのアミノ酸配列内に任意の他の変更を持たない本発明の変異体IgG)と考えられる。更なる変更を含むこれらの抗体修飾は、それにもかかわらず、対応する野生型の変異体IgGと比較して、治療的有用性のために必要な実質的に同じ特徴を保持する。
ある実施態様では、本発明の変異体IgGは、当分野で公知で、すぐに利用できる更なる非タンパク部分を含むようにさらに修飾されうる。ある実施態様では、変異体IgGは細胞障害性剤とコンジュゲートされうる。ある実施態様では、細胞障害性剤が結合している変異体IgGは細胞によって内部移行され、その結果、結合する細胞を殺傷する際の該コンジュゲートの治療上の有効性が高まる。
ある実施態様では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
変異体IgGは、当分野で公知の任意の方法によって作製されうる。ある実施態様では、変異体IgG配列を用いて、メンバー配列をコードする核酸を作製し、必要に応じて、その後宿主細胞にクローニングし、発現させ、アッセイする。これらの実務は周知の手順を使用して実施され、ここで利用されうる様々な方法は、Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)及びCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)に記述される。変異体IgGをコードする核酸は、タンパク質を発現させるために、発現ベクターに組み込まれてよい。発現ベクターには、一般的に、作用可能なように連結、すなわち機能的に関連するように配置されたタンパク質を、コントロール又は調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナー及び/又は他の要素が含まれる。変異体IgGは、変異体IgGをコードする核酸を含む核酸、好ましくは発現ベクターにて形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導又は引き起こすために適切な条件下で培養することによって、製造されうる。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞及び酵母を含むがこれらに限らず、多種多様な適切な宿主細胞が使われてよい。例えば、利用法を見つけうる様々な細胞株は、ATCC細胞株カタログに記載されており、アメリカ培養細胞系統保存機関から入手可能である。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって異なるであろう。
本発明の変異体IgGは、インビトロアッセイ、インビボ及び細胞ベースのアッセイ、及び選別技術を用いるものを含むがこれらに限定されず様々な方法を用いてスクリーニングされうる。オートメーション及びハイスループットのスクリーニング技術がスクリーニング手順において利用されてよい。スクリーニングは、融合パートナー又は標識、例えば免疫標識、同位体標識、又は小分子標識、例えば蛍光又は熱量測定色素を使用してよい。
ある実施態様では、変異体IgGの機能的及び/又は生物物理学的な性質は、インビトロアッセイにおいてスクリーニングされる。ある実施態様では、タンパク質は、機能性、例えば反応を触媒する能力又はその標的に対する結合親和性についてスクリーニングされる。
変異体IgGは幅広い生成物に利用されうる。ある実施態様では、IgG変異体は治療用、診断用、又は研究用の試薬である。変異体IgGは、モノクローナル又はポリクローナルである抗体組成物に利用されうる。
黄色ブドウ球菌に感染した患者の治療を含むがこれに限らず、変異体IgGは、様々な治療的目的のために使われてよい。
変異体IgG組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、投薬され、投与される。ここで考慮する要因には、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子が含まれる。疾患の予防又は治療のために、本発明の変異体IgG、例えば抗体の適切な投薬量(単独で使用される場合、又は一又は複数の他の治療薬と併用される場合)は、治療する疾患のタイプ、抗体の種類、疾患の重篤度と経過、抗体が予防目的か又は治療目的で投与されるかどうか、過去の治療、患者の臨床歴、抗体に対する応答性、及び担当医の裁量に依存する。変異体IgGは、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
また、本明細書中の薬学的製剤は、治療する特定の症状に必要とされる、好ましくは互いに悪影響を与えない補完的活性を有する二以上の活性な化合物を含んでよい。このような分子は、意図する目的のために有効である量で組み合わせて好適に存在する。
血液脳関門を越えて変異体IgG、例えば抗体を搬送する幹細胞に基づく方法は、対象の抗体を発現するように神経前駆細胞(NPC)を遺伝的に操作し、次いで、治療する個体の脳に幹細胞を移植することを伴う。詳細なオンライン文献であるBehrstock等 (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005(神経栄養因子GDNFを発現するように遺伝子操作したNPCが齧歯類及び霊長類のモデルの脳に移植した場合にパーキンソン病の症状を低減したことを報告している)を参照。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本明細書において記述される治療法は、他の治療法と同時に投与されてよく、すなわち、ここに記載の治療法は、例えば小分子、他の生物製剤、放射線療法、手術などを含む他の治療法(一又は複数)と同時に投与されてよい。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び/又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。ある実施態様では、製造品は、(a)本発明の変異体IgGを含有する組成物を中に収容する第一の容器と、(b)更なる治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを具備しうる。製造品はさらに、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を具備しうる。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
ある実施態様では、変異体IgGは、単独で、又は、他の治療的化合物と組み合わせて、キットとして包装されてよい。キットは、単位用量の患者への投与を補助する任意の構成成分、例えば粉末形態を再構成するためのバイアル、注入用のシリンジ、カスタマイズされたIV運搬システム、吸入器などを具備しうる。加えて、単位用量キットは、組成物の調製及び投与のための指示を具備してよい。キットは、一患者のための使い捨て単位用量、(一定用量で、又は、個々の化合物が療法経過につれて作用強度が異なるように)特定の患者のための複数回使用として製造されてもよいし、キットは、複数の患者への投与に適した複数用量を含んでいてもよい(「大量包装」)。キット構成成分は、カートン、ブリスター包装、瓶、チューブなどに組み立てられてよい。
ヒト化抗Her2(米国特許第5821337号に記載される4D5又はhuMAb4D5-8)IgG1重鎖及び軽鎖のFab領域を、ヒトIgG1定常ドメインを含む2つのpRKベースの一過性形質移入プラスミドに別々にクローニングした。次いで、キュンケルベースの部位特異的突然変異誘発を用いて、VHドメイン内の残基を変異させた抗Her2 IgG1変異体を生成した。この試験で生成した抗Her2変異体は、S17A、R19A、S21A、T57A、T57K、R66A、T68A、S70A、Y79A、Q81A、N82aA及びS82bAであった(すべてカバットのEUインデックスに従って番号付けした)。
変異体の重鎖及び野生型軽鎖を含有しているプラスミドを、製造プロトコールに従ってFUGENE(登録商標)(Roche, Basel, Switzerland)を使用して、アデノウイルス形質移入ヒト胚腎臓細胞株293に、同時形質移入した。形質移入複合体と共に24時間インキュベートした後に、形質移入した細胞を、5mM グルタミンを有する無血清培地1.3×GEM N培地にて培養した。上清を回収し、1M トリスpH8.0及び5M 塩化ナトリウム(NaCl)にて調整し、終濃度30mM トリス及び50mM NaClとした。次いで、調整した上清を、プロテインL樹脂-充填カラム(Thermo scientific, Rockford, IL)に流し込んだ。流した後、カラムを、30mM トリス及び150mM NaCl pH8を含むバッファにて洗浄した。結合したFabを、0.1M グリシンバッファpH3.0にて溶出させた。次に、精製したFabを濃縮し、Superdex(登録商標)-200のサイズ排除クロマトグラフィカラム(GE healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom)に投入し、任意の凝集塊を取り除いた。単量体分画を合わせてプールし、結合試験に使用した。抗HER2野生型及び抗HER2変異体Fab濃度は、280nMの吸光度読み取り値を用いて算出し、1.5の吸光度を1mg/mlのFabと推測した。
プロテインAへの抗Her2変異体の結合をELISAにより試験した。MaxiSorpTMELISAプレート(Thermo scientific, Rockford, IL)は、1μg/mlのプロテインA(Thermo scientific, Rockford, IL)又はHer2の細胞外ドメイン(Genentech, South San Francisco, CA)にて終夜コートした。プレートは、PBS、0.5%BSA、10ppm Proclin、pH7.2にて室温で1時間かけてブロックし、次いで、洗浄バッファ(PBS/0.05%TweenTM20/pH7.2)にて洗浄した。野生型Fab及び変異体の段階的な4倍希釈物(1000nMから始まる)を含むアッセイバッファ(PBS、pH7.4、0.5%BSA、0.05%Tween20、10ppm Proclin)を、プロテインAにてコートした96ウェルのプレートに添加した。一方、野生型Fab及び変異体の段階的4倍希釈物(50nMから始まる)を含むアッセイバッファを、Her2にてコートした96ウェルのプレートに添加した。振盪しながら室温で3時間インキュベートした後、プレートを4回洗浄し、結合した抗体を、アッセイバッファにて1:10000に希釈したヤギ抗ヒトIgG(F(ab')2特異的)-HRP(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)にて、振盪しながら室温で0.5時間かけて検出した。次いで、プレートを更に4回洗浄し、その後発色させるためにテトラメチルベンジジン基質(Moss, Pasadena, MD)を添加した。1M リン酸(H3PO4)の添加によって反応は2分後に停止した。プレートは、Molecularデバイスマイクロプレート読み取り機にて450−620nmの波長を読み取った。
Claims (12)
- 野生型ヒトIgG VH領域と比較して、カバットにあるEUインデックスに従って番号付けしたアミノ酸残基17、19、57、66、70、79、81、82a、82bの一又は複数に一又は複数のアミノ酸置換を含むヒトIgG VH領域を含んでなる変異体IgGであって、このとき変異体IgGが黄色ブドウ球菌プロテインAに対する変更した結合を有する変異体IgG。
- プロテインAに対して増加した結合を有する、請求項1に記載の変異体IgG。
- 変異体IgGが、野生型IgG VH領域と比較して、アミノ酸残基70、79及び82bの一又は複数に一又は複数のアミノ酸置換を含むヒトIgG VH領域を含んでなる、請求項2に記載の変異体IgG。
- 前記の一又は複数のアミノ酸置換がS70A、Y79A及びS82bAからなる群から選択される、請求項3に記載の変異体IgG。
- プロテインAに対して減少した結合を有する、請求項1に記載の変異体IgG。
- 変異体IgGが、野生型IgG VH領域と比較して、アミノ酸残基17、19、57、66、81及び82aの一又は複数に、一又は複数のアミノ酸置換を含むヒトIgG VH領域を含んでなる、請求項5に記載の変異体IgG。
- 前記の一又は複数アミノ酸置換がS17A、R19A、T57A、T57K、R66A、Q81A及びN82aAからなる群から選択される、請求項6に記載の変異体IgG。
- ヒト又はヒト化のIgGである、請求項1に記載の変異体IgG。
- IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である、請求項8に記載の変異体IgG。
- 変異体IgGがプロテインA以外の黄色ブドウ球菌タンパク質と結合する、請求項1に記載の変異体IgG。
- 請求項1又は10に記載の変異体IgGと薬学的に許容可能な担体とを含有してなる薬学的組成物。
- 請求項1又は10に記載の変異体IgGを、使用説明書と共に容器に具備するキット。
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