KR101812811B1 - 단백질 ａ에 대해 변경된 결합을 갖는 이뮤노글로불린 변이체 - Google Patents

Abstract

본원은 VH 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖고, 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A에 대해 변경된 결합을 갖는 변이체 이뮤노글로불린, 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

단백질 Ａ에 대해 변경된 결합을 갖는 이뮤노글로불린 변이체 {IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH ALTERED BINDING TO PROTEIN A}

관련 출원

본 출원은 35 USC 119(e)하에서 2008년 12월 23일자로 출원된 가출원 제61/140565호에 대한 우선권을 주장하는, 37 CFR 1.53(b)(1)하에 출원된 정식 출원으로, 가출원의 내용은 본원에 참고로 포함된다.

기술 분야

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 변경된 생물학적 특성을 갖는 IgG 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

수년에 걸쳐 치료제로서의 이뮤노글로불린의 사용은 크게 증가했다. 면역계의 중요 부분을 이루는 이뮤노글로불린 (Ig) 분자는 (1) 이들이 다양한 부류의 리간드와 반응하고, (2) 이들이 여러가지 이펙터 기능을 보유하며, (3) 이들이 생물학적으로 매우 중요하기 때문에 높은 관심을 받고 있다. 오늘날, 항체 기재의 약물의 용도는 암, 자가면역 질환 및 또한 다양한 전신 및 감염성 질환의 치료를 포함한다. 또한, 이뮤노글로불린은 예를 들어 진단 영상화 절차에서의 생체내 진단 도구로서 유용하다.

IgG는 인간 및 다른 포유동물에서 가장 일반적인 이뮤노글로불린 클래스이고, 다양한 유형의 면역요법 및 진단 절차에 사용된다. 인간 IgG₁은 치료 목적을 위해서 가장 흔히 사용되는 항체이다. 활발히 진행되고 있는 연구들 중 한 영역은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 비롯한 병원체에 대한 항체이다. 그의 잠재력에도 불구하고, S. 아우레우스를 표적으로 하는 이뮤노글로불린 요법과 관련된 문제점 중 하나는 S. 아우레우스 단백질 A에의 항체의 결합이었다. 단백질 A에의 IgG의 결합이 연구되어 왔고, 단백질 A 및 FcRn 둘 모두에의 결합과 관련이 있는 위치가 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann & Davies, J. Biomolecular NMR 6:141-52 (1995)], [Artandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:94-98 (1992)], WO 93/22332 참조). 단백질 A에 대해 변경된 결합을 나타내는 변형된 이뮤노글로불린을 갖는 것이 유익할 것이다. 본 발명은 이러한 필요성 및 기타 필요성에 관한 것으로, 하기하는 개시내용을 검토할 때 명백해질 것이다.

발명의 개요

본 발명은 신규 IgG 변이체 및 그의 용도를 제공한다. 수많은 IgG 변이체가 본 발명에서 제공된다.

한 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 IgG V_H 영역과 비교하여 아미노산 잔기 17, 19, 57, 66, 70, 79, 81, 82a, 82b (카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링됨) 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG V_H 영역을 포함하는 변이체 IgG를 제공하며, 상기 변이체 IgG는 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A에 대해 변경된 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 IgG는 단백질 A에 대해 증가된 결합을 가지며, 예를 들어 이는 야생형 IgG V_H 영역과 비교하여 아미노산 잔기 70, 79, 및 82b 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 (예를 들어, S70A, Y79A, 또는 S82bA) 인간 IgG V_H 영역을 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 IgG는 단백질 A에 대해 감소된 결합을 가지며, 예를 들어 이는 야생형 IgG V_H 영역과 비교하여 아미노산 잔기 17, 19, 57, 66, 81, 및 82a 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 (예를 들어, S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A, 또는 N82aA) 인간 IgG V_H 영역을 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 IgG는 인간 또는 인간화 IgG이다. 일부 실시양태에서, 변이체 IgG는 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄이다. 일부 실시양태에서, 변이체 IgG는 단백질 A 이외의 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 변이체 IgG 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 용기 내에 본 발명의 변이체 IgG, 및 사용 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기하는 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 이들의 임의의 조합은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 및 모든 변이체 IgG 및 방법에 적용된다.

도 1 및 2는 Her2에 대한 변이체 항-Her2 Fab의 결합의 ELISA를 나타낸다.
도 3 및 4는 단백질 A에 대한 변이체 항-Her2 Fab의 결합의 ELISA를 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 S. 아우레우스 단백질 A에 대해 변경된 결합을 갖는, 항체 및 융합 단백질에서 발견되는 것을 비롯한 IgG 도메인의 신규한 변이체에 관한 것이다. 이들 변이체는 단백질 A에 결합하는 인간 IgG V_H 영역, 또는 그의 단편을 포함하며, 야생형 인간 V_H 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하고, 그러한 변형은 단백질 A에 대한 그의 친화성을 변경시킨다.

본원에서 기재하거나 언급하는 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고 있으며, 당업자에 의해 통상적인 방법론, 예를 들어 광범위하게 사용되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al., eds., (2003))]; 일련의 문헌 [METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]에 기재되어 있는 방법론에 따라 보편적으로 사용되고 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당업자에게 본 출원에서 사용된 많은 용어에 관한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개공보를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.

정의

본 명세서를 이해하기 위해 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 경우에는 언제라도 단수로 사용된 용어들이 복수도 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하고자 하는 목적으로만 사용되는 것이며, 이는 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 기재된 임의의 정의가 본원에서 참고문헌으로 포함된 임의의 문헌과 모순되는 경우에는 하기 정의가 우선한다.

본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 이뮤노글로불린 중쇄 내의 잔기에 대한 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)])에서와 같은 EU 지수의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG₁ EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

본원에서 사용되는 "모 폴리펩티드" 또는 "야생형 폴리펩티드"는 비변형된 폴리펩티드, 자연 발생 폴리펩티드, 또는 본원에서 개시하는 하나 이상의 아미노산 변형이 없고 본원에서 개시하는 변이체 단백질과 비교하여 단백질 A 결합이 상이한, 조작에 의해 변형된 버전의 자연 발생 폴리펩티드를 의미한다. 모 폴리펩티드는 천연 서열 V_H 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 갖는 V_H 영역을 포함할 수 있다. 모 폴리펩티드는 또한 하기 기재된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체, 모 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 모 폴리펩티드는 모 이뮤노글로불린, 야생형 이뮤노글로불린, 모 항체 및 야생형 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본원에서 사용되는 "모 이뮤노글로불린", "모 IgG", "야생형 이뮤노글로불린" 또는 "야생형 IgG"는 비변형된 이뮤노글로불린, 자연 발생 이뮤노글로불린, 또는 본원에서 개시하는 하나 이상의 아미노산 변형이 없고 본원에서 개시하는 변이체 IgG와 비교하여 단백질 A 결합이 상이한, 조작에 의해 변형된 버전의 자연 발생 이뮤노글로불린을 의미한다. 모 이뮤노글로불린은 천연 서열 V_H 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 갖는 V_H 영역을 포함할 수 있다. 모 이뮤노글로불린은 또한 하기 기재된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 자체, 모 이뮤노글로불린을 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 "모 항체" 또는 "야생형 항체"는 비변형된 항체, 자연 발생 항체, 또는 본원에서 개시하는 하나 이상의 아미노산 변형이 없고 본원에서 개시하는 변이체 IgG와 비교하여 단백질 A 결합이 상이한, 조작에 의해 변형된 버전의 자연 발생 항체를 의미한다. 모 항체는 천연 서열 V_H 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 갖는 V_H 영역을 포함할 수 있다. 모 항체는 또한 하기 기재된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모 항체는 항체 자체, 모 항체를 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "변이체", "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체"는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 상기 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 변이체는 모 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 본원에서의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 적어도 약 80％의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90％의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95％의 상동성을 가질 것이다. 단백질 변이체는 또한 하기 정의된 바와 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 용어 "단백질 변이체"는 본원에 기재된 바와 같은 이뮤노글로불린 변이체 및 항체 변이체를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "이뮤노글로불린 변이체", "변이체 이뮤노글로불린", "변이체 IgG" 또는 "IgG 변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 또는 야생형 이뮤노글로불린 서열과 상이한 이뮤노글로불린 서열을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 항체와 상이한 항체를 의미한다. 특정 실시양태에서, 변이체 항체는 야생형 항체와 비교하여 V_H 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 항체는 변이체 IgG이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "위치"는 단백질의 서열 내 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 넘버링될 수도 있고, 또는 확립된 포맷, 예를 들어 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링될 수도 있다.

"아미노산 변형"은 소정의 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변화를 지칭한다. 예시적인 변형은 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변형은 치환이다.

명시된 위치, 예를 들어 Fc 영역의 명시된 위치"에서의 아미노산 변형"은 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 명시된 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 명시된 잔기에 "인접한" 삽입은, 그의 1개 내지 2개 잔기 이내의 삽입을 의미한다. 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.

"아미노산 치환"은 소정의 아미노산 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체시키는 것을 지칭한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩된 것)일 수 있고, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile):류신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나 이상의 비자연 발생 아미노산 잔기에 의한 치환 또한 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 포함된다.

"비자연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 쇄 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는, 상기 열거된 자연 발생 아미노산 잔기들 이외의 잔기를 지칭한다. 비자연 발생 아미노산 잔기의 예로는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]; 미국 특허 제6,586,207호; WO 98/48032; WO 03/073238; 미국 출원 번호 2004-0214988A1; WO 05135727A2; WO 05/74524A2; [J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027]; [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137]; 및 [J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024]에 기재된 것들이 포함된다.

특정 실시양태에서, 용어 "감소", "단백질 A 결합 감소", "축소" 또는 "단백질 A 결합 축소"는 본원에서 기재하는 바와 같은 표준 당업계 공지의 방법에 의해 검출된 본 발명의 변이체 IgG의 단백질 A 결합에 있어서, 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 전체적으로 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 또는 99％ 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 이러한 용어는 이와 달리 전체적으로 10배 (즉 1 로그), 100배 (2 로그), 1,000배 (또는 3 로그), 10,000배 (또는 4 로그), 또는 100,000배 (또는 5 로그) 감소를 지칭할 수 있다. 유사하게, 용어 "증가", "단백질 A 결합 증가" 등은 본원에서 기재하는 바와 같은 표준 당업계 공지의 방법에 의해 검출된 본 발명의 변이체 IgG의 단백질 A 결합에 있어서, 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 전체적으로 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 100배, 또는 1,000배 증가를 지칭한다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한다.

"단리된" 항체 또는 다른 폴리펩티드는 천연 환경 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 이것의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 다른 폴리펩티드는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체 또는 다른 폴리펩티드의 95 중량％를 초과하는 정도, 일부 실시양태에서는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 예를 들어 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 정도로 정제하였다. 단리된 항체 또는 다른 폴리펩티드는 재조합 세포 내의 계내 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 그의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체 또는 다른 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 다양한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.

용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 이뮤노글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 C_H1, C_H2 및 C_H3 도메인 및 경쇄의 C_HL 도메인을 함유한다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "V_H"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "V_L"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘다에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 베타 시트 배위를 취하며 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이것은 베타 시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 상기 베타 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포성 세포독성에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)라고 불리는 2개의 분명하게 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 IgG "이소형" 또는 "서브클래스"는 그의 불변 영역의 화학 및 항원 특징으로 정의되는 임의의 서브클래스의 이뮤노글로불린을 의미한다.

중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체 및 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "IgG 서브클래스 변형"은 한 IgG 이소형의 1개의 아미노산을 상이한 정렬 IgG 이소형에서의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, EU 위치 296에서 IgG₁은 티로신을 포함하고 IgG₂는 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG₂에서의 F296Y 치환은 IgG 서브클래스 변형으로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비자연 발생 변형"은 이소형이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG 어느 것도 위치 332에서 글루탐산을 포함하지 않기 때문에, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄에서 위치 332가 글루탐산으로 치환된 것 (332E)은 비자연 발생 변형으로 간주된다.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "온전한 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 실질적으로 무손상 형태인 항체를 지칭한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 항체의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 이러한 C-말단 리신을 갖거나 갖지 않는 항체는 본원에서 사용되는 용어로서 "전장", "무손상" 또는 "온전한" 것이다.

본원의 목적상, "네이키드(naked) 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사선표지와 접합되지 않은 항체이다.

"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 본원에 개시된 하나 이상의 Fc 영역 변형을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc 영역의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각 단일 항원 결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 도메인과 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv를 검토하기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 내에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H) (V_H-V_L)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody) 역시 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것으로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선별 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화성 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생성 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 이것의 특이성에 더하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.

수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간 유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어 WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,807호; 동 제5,545,806호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 및 동 제5,661,016호; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 또한 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 항체의 항원 결합 영역이 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 항원으로 면역화하여 생성된 항체로부터 유래된 프라이메이티지드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.

비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 HVR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기를 상응하는 비인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 증진되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대하여는 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 제6,982,321호 및 동 제7,087,409호를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 그것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 로커스는 무력화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스(xenomice)에 항원을 투여하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 동 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]도 참조한다.

용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; V_H 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 V_L 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 표시한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 각각의 HVR로부터의 잔기를 이하에 나타낸다.

HVR은 다음과 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 캄필레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.

카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)을 지칭하는데 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 EU 지수). "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG₁ EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는다면, 항체 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는다면, 항체 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, PCT 공개공보 번호 WO2006073941 참조).

"친화성 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는, 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화성 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 갖는다. 친화성 성숙 항체는 당업계에 공지된 특정 절차를 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 V_H 및 V_L 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙을 설명하고 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.

항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.

본원에서의 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 정의하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이것의 카르복실 말단까지의 스트레치인 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인 C_H2 및 C_H3을 포함한다.

인간 IgG의 "V_H 도메인"은 통상적으로 대략 아미노산 1에서 대략 아미노산 113까지에 이른다.

인간 IgG Fc 영역의 "C_H2 도메인" ("Cγ2" 도메인이라 지칭되기도 함)은 통상적으로 대략 아미노산 231에서 대략 아미노산 340까지에 이른다. C_H2 도메인은 또 다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 C_H2 도메인 사이에 배치된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 C_H2 도메인의 안정화를 도울 수 있다고 추정되었다. 문헌 [Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)].

"C_H3 도메인"은 Fc 영역 내의 C_H2 도메인에 대해 C-말단인 잔기들의 스트레치 (즉, IgG의 대략 아미노산 잔기 341에서 대략 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Fc 수용체 결합; C1q 결합; CDC; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하고, 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하며, 여기에는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.

"결합 친화성"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같은 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 회합 상수 (Ka)와 상호적인 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계 공지의 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고/하거나 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고/하거나 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 결합 친화성 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 아래에 기재한다.

특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 "K_D", "K_d", "Kd" 또는 "Kd 값"은 25℃에서 약 10 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩으로 비아코어(BIACORE)^®-2000 또는 비아코어^®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정한다. 간략하게 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, 폴리펩티드, 예를 들어 전장 항체의 연속 희석물을 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈-20(TWEEN-20)™ 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 중에서 주입한다. 간단한 일-대-일 랑뮈르 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 온-레이트(on-rate)가 10⁶M^-1s^-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 구비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 "온-레이트", "회합의 속도", "회합 속도" 또는 "k_on"은 또한 비아코어^®-2000 또는 비아코어^®-3000 시스템 (비아코어, 인크., 뉴욕주 피스카타웨이 소재)을 사용하여 상기한 바와 같이 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만 및/또는 약 10％ 미만이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과 및/또는 약 50％ 초과이다.

"정제된"은 분자가 이것을 함유하는 샘플의 적어도 95 중량％, 또는 적어도 98 중량％의 농도로 샘플 내에 존재함을 의미한다.

"단리된" 핵산 분자는 예를 들어 그의 천연 환경에서 그와 통상적으로 회합되는 1종 이상의 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 그 핵산 분자를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 추가로 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터", 또는 단순히 "재조합 벡터"라 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 생성된 변형(들), 예를 들어 표지와의 접합을 포함할 수 있다. 또 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡(cap)", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 연결이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기가 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결부가 제조되도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 1개 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 당업계에 일반적으로 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적인 연결부로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 또는 에테르 (-O-) 연결부를 임의로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C)이거나, 또는 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜임)로 대체된 실시양태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오티드 (반드시 이러한 것은 아님)인 짧은, 일반적으로 단일 가닥인 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.

표현 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA가 상기 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 용이하게 하도록 배치될 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상 세포 및 전달 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 내용물이 정확히 일치하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "코돈 세트"는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용되는 여러가지 뉴클레오티드 트리플렛 서열 세트를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 세트는, 예를 들어 고체 상 합성에 의해 합성될 수 있고, 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오티드 트리플렛들의 모든 가능한 조합을 나타내며 원하는 군의 아미노산을 코딩할 서열을 포함한다. 코돈 명칭의 표준 형태는, 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재된 IUB 코드의 것이다. 코돈 세트는 전형적으로, 3개의 대문자를 이탤릭체로써 나타낸 것인데, 예를 들어 NNK, NNS, XYZ, DVK 등이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비무작위 코돈 세트"는 이에 따라 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 선택 기준을 부분적으로, 바람직하게는 완전하게 충족시키는 선택된 아미노산을 코딩하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "퇴보"를 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 TRIM 접근법 (문헌 [Knappek et al., (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86)]; [Garrard & Henner (1993) Gene 128:103])이 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드 세트는 시판 핵산 합성기 (예를 들어, 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 구입가능함)를 이용하여 합성할 수도 있고, 또는 구입 (예를 들어, 메릴랜드주 록빌 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터 구입함)할 수도 있다. 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 복수개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 그 차이는 전체 서열 내 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형과 혼성화될 수 있는 서열을 갖고, 또한 예를 들어 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수도 있지만 반드시 그러한 것은 아니다.

표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al., (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게 설명하면, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 병렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "라이브러리"는 복수개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 변이체 IgG), 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하며, 이 서열은 본 발명의 방법에 따라 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에 있어서 상이하다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(％)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭(gap)을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청(Copyright Office) (미국 20559 워싱턴 디.씨. 소재)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용되도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 ％ (별법적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:

100 x X/Y의 비율

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에서 기재한 바와 같이 구한다.

용어 "제약 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제제가 투여될 대상체에게 허용될 수 없게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균성일 수 있다.

"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 그에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)™를 포함한다.

항체

본 출원은 IgG의 생물학적 특성을 변경시키는 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG 이뮤노글로불린에 관한 것이다. 본 출원의 변이체 이뮤노글로불린은 야생형 항체와 비교하여 단백질 A에 대해 변경된 결합을 나타내는 항체를 포함한다.

항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 일반적으로, 천연 항체는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 다양한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.

중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 이뮤노글로불린은 여러 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄; IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 나뉠 수 있다. 다양한 인간 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄ 동종이형이 기재된 바 있다 (문헌 [M.-P. LeFranc and G. LeFranc in: "The Human IgG Subclasses," F. Shakib (ed.), pp. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990)]에서 검토됨). IgG 클래스의 상이한 이소형, 예를 들어 IgG₁, IgG_2s, IgG₃ 및 IgG₄는 독특한 물리적, 생물학적 및 임상적 특성을 갖는다. 인간 IgG₁은 치료 목적을 위해 가장 흔히 사용되는 항체이고, 대다수의 조작 연구가 이와 관련하여 구축되어 있다.

항체 단편

본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특히 관심 대상은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 Fc 영역을 포함하는 변이체 이뮤노글로불린 (IgG)의 단편이다. 항체 단편은 통상의 수단, 예컨대 효소 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.

항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이러한 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

인간화 항체

본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 인간화 변이체 IgG이다. 비인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인의 것이다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신 초가변 영역 서열을 사용함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536])을 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이후, 설치류와 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크로서 수용한다. 예를 들어, 문헌 [Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296]; [Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901]을 참조한다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 여러가지 상이한 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al., (1993) J. Immunol., 151:2623]을 참조한다.

추가로, 항원에 대한 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

인간 항체

특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 야생형 IgG와 비교하여 V_H 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 인간 변이체 IgG이다. 인간 항체는 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기한 바와 같이 공지의 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 구축할 수 있다. 별법적으로, 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되어 있다.

면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선(germ-line) 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제시킨다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.

유전자 셔플링은 또한 비인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비인간 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"이라고도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원에 의한 선별 결과로서, 인간 쇄가 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비인간 쇄의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위를 복원한 비인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되고, 즉, 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비인간 쇄를 대체하기 위해 상기 과정을 반복하는 경우에 인간 항체가 수득되었다 (1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.

이중특이적 항체

이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 야생형 항체와 비교하여 V_H 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 표적 항원 발현 세포에 편재하도록 사용될 수 있다. 이들 항체는 표적 항원 결합 아암, 및 세포독성제, 예컨대 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐에 결합하는 아암을 보유한다. 특정 항체에서, 결합 특이성은 IL-4 및 IL-13에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일자로 공개된 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체 항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, C_H2 및 C_H3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (C_H1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에는 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2종 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 널리 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 1개 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또 다른 단편의 상보적 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].

다가 항체

다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 한 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)은 VD₁-(X₁)_n-VD₂-(X₂)_n-Fc (여기서, VD₁은 제1 가변 도메인이고, VD₂는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X₁ 및 X₂는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 V_H-C_H1-가요성 링커-V_H-C_H1-Fc 영역 쇄; 또는 V_H-C_H1-V_H-C_H1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 2개 이상 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 C_L 도메인을 추가로 포함한다.

단일 도메인 항체

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역을 포함하는 단일 도메인 항체이다. 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다.

항체 변형체

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 이뮤노글로불린의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 특정 실시양태에서, 변형은 본 발명의 변이체 IgG에 대한 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 결합 친화성, 생체내 반감기 및/또는 기타 생물학적 특성을 추가로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변형은 본원에 기재되지 않은 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 변이체 IgG의 변형된 아미노산 서열은 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 원하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.

문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발의 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 지칭된다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적인 또는 다른 변형을 도입함으로써 정련시킨다. 이에 따라, 아미노산 서열 변형을 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 및 또한 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변형은 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 항체의 글리코실화 정도가 증가되거나 감소되도록 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로 탄수화물 모이어티를 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당, N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.

항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 통해 수행될 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

변이체 IgG의 Fc 영역에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 2분지의 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al., (1997) TIBTECH 15:26-32]을 참조한다. 상기 올리고사카라이드는 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 및 또한 2분지형 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG에서의 올리고사카라이드의 변형은 특정의 추가로 개선된 특성을 갖는 변이체 IgG가 생성되도록 이루어질 수 있다.

예를 들어, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변형체가 제공된다. 이러한 변형체에서는 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 US 2003/0157108 (프레스타, 엘.(Presta, L.)); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변형체에 관한 문헌의 예로는: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]가 포함된다. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는, 단백질 푸코실화 결핍성인 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (프레스타, 엘); 및 WO 2004/056312 A1 (아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)가 포함된다.

이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변형체, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 2분지형 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 것이 추가로 제공된다. 이러한 항체 변형체에서는 푸코실화가 감소되고/되거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (장-마이레트(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제6,602,684호 (움마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 (움마나 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변형체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변형체에서는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형체는 예를 들어 WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 (라주, 에스.(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764 (라주, 에스.)에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능이 아니라 일부 이펙터 기능을 보유하여 생체내 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변형체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 원하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합은 없지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 없을 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 제5,500,362호 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 별법적으로, 비방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동세포계수를 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96^® 비방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 검정을 수행할 수도 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해서 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 결정 역시 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).

하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 기타 항체 변형체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만 FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명되거나 아미노산 클래스를 언급하며 아래에 추가로 기재된 보다 실질적인 변화가 제공된다. 아미노산 치환을 관심 항체 내로 도입하고, 생성물을 예를 들어 원하는 활성, 예컨대 개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 개선된 ADCC 또는 CDC 등에 대해 스크리닝할 수 있다.

항체의 생물학적 특성에 있어서의 변형은, (a) 치환 영역에서 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 폴리펩티드 주쇄의 구조에 영향을 미치거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 수행될 수 있다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):

(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)

별법적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하여 이루어진다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로 또는 나머지 (비보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.

치환적 변형의 한가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반하였다. 특정 실시양태에서, 모 항체는 야생형 대응 변이체 IgG (예를 들어, 아미노산 서열에 임의의 추가의 변경이 없는 본 발명의 변이체 IgG)이다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 항체는 이들이 생성된 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어, 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환적 변형은 친화성 성숙 항체이고, 이는 파지 디스플레이에 기초한 친화성 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성시킬 수 있다. 간략하게 설명하면, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6개 또는 7개 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 파지 외피 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부에 대한 융합체로서 디스플레이시킨다. 이어서, 파지 디스플레이된 항체를 이들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해서는 항원 항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 본원에서 상술된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 일단 이러한 변형된 항체가 생성되면, 항체의 패널을 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 본원에 기재된 기술로 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.

변형된 항체 (예를 들어, 변형된 변이체 IgG)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이러한 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변형체의 경우), 또는 이전에 제조된 변형된 항체 또는 변형되지 않은 버전의 항체의 올리고뉴클레오티드 매개 (또는 부위 지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원 명세서 및 당업계의 교시내용에 따라, 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 변형체는 야생형 대응 변이체 IgG (예를 들어, 아미노산 서열에 임의의 추가의 변경이 없는 본 발명의 변이체 IgG)와 비교하여 하나 이상의 변경을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고, 추가의 변경을 포함하는 이러한 항체 변형체는 야생형 대응 변이체 IgG와 비교하여 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특징을 보유할 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면 내에서의 변형을 포함하는 항체 변형체를 제공하며, 이러한 변형은 이종이량체화를 용이하게 하고/하거나 촉진시킨다. 이들 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내로의 돌출부 도입 및 제2 Fc 폴리펩티드 내로의 공동의 도입을 포함하고, 여기서 상기 돌출부는 상기 공동 내에 위치하여 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시킬 수 있다. 이러한 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호에 기재되어 있다.

또 다른 측면에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).

항체 유도체

특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 세포독성제와 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포독성제와 결합된 변이체 IgG는 세포에 의해 내재화되어 여기에 결합되는 세포를 사멸시키는데 있어서의 접합체의 치료 효능이 증가된다.

특정 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

변이체 IgG의 제조

변이체 IgG는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG 서열은 구성원 서열을 코딩하고 원한다면 이후에 숙주 세포로 클로닝되고 발현 및 검정될 수 있는 핵산을 생성하는데 사용된다. 이는 널리 공지된 절차를 이용하여 수행되고, 여기에 이용될 수 있는 다양한 방법이 문헌 [Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)], 및 [Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)]에 기재되어 있다. 변이체 IgG를 코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 혼입시켜서 단백질을 발현시킬 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 제어 또는 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 즉 기능적 관계로 배치된 단백질, 선별가능한 마커, 임의의 융합 파트너 및/또는 추가의 요소를 포함한다. 변이체 IgG는 변이체 IgG를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 이것을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 상기 단백질의 발현을 유도하거나 야기하는데 적절한 조건하에 배양하여 생성될 수 있다. 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포 및 효모를 포함하지만 이에 제한되지 않는 광범위하게 다양한 적절한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 다양한 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수할 수 있는 ATCC 세포주 카탈로그에 기재되어 있다. 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.

특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 발현 후에 정제되거나 단리된다. 항체는 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 단리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 크로마토그래피 기술, 전기영동, 면역학적, 침전, 투석, 여과, 농축 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다. 당업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 다양한 천연 단백질이 항체, 예를 들어 특정 박테리아 단백질에 결합하고, 이들 단백질을 정제에 이용할 수 있다. 종종, 정제는 특정 융합 파트너에 의해 가능해질 수 있다. 예를 들어, GST 융합체가 사용되는 경우에는 글루타티온 수지를 이용하거나, His-태그가 사용되는 경우에는 Ni⁺² 친화성 크로마토그래피를 이용하거나, 또는 플래그-태그가 사용되는 경우에는 고정된 항-플래그 항체를 사용하여 단백질을 정제할 수 있다. 적합한 정제 기술에서의 일반적인 지침에 대하여는, 문헌 [Antibody Purification: Principles and Practice, 3^rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994]을 참조한다.

변이체 IgG의 스크리닝

본 발명의 변이체 IgG는 시험관내 검정, 생체내 및 세포 기재의 검정을 사용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법 및 선별 기술을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 자동화 및 고처리량 스크리닝 기술을 스크리닝 절차에 이용할 수 있다. 스크리닝은 융합 파트너 또는 표지, 예를 들어 면역 표지, 동위원소 표지, 또는 소분자 표지, 예컨대 형광 또는 열량측정 염료를 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 기능적 및/또는 생물물리학적 특성을 시험관내 검정으로 스크리닝할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질을 기능성, 예를 들어 그의 반응 촉매 능력 또는 그의 표적에 대한 결합 친화성에 대해 스크리닝한다.

스크리닝 방법의 하위세트는 라이브러리의 유리한 구성원을 선별하는 것이다. 상기 방법은 본원에서 "선별 방법"이라 지칭되고, 이러한 방법은 본 발명에서 변이체 IgG를 스크리닝하는데 이용된다. 선별 방법을 이용하여 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 경우, 일부 선별 기준을 충족시키는 유리한 라이브러리 구성원만을 증식, 단리 및/또는 관찰한다. 본 발명에서 단백질 라이브러리를 스크리닝하는데 이용될 수 있는 다양한 선별 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 다른 선별 방법은 디스플레이에 의존적이지 않은 방법, 예컨대 생체내 방법을 포함한다. "방향적 진화(directed evolution)" 방법이라 지칭되는 하위세트의 선별 방법은 선별 동안 때때로 새로운 돌연변이가 혼입된 유리한 서열을 합체하거나 브레딩하는 것을 포함하는 방법이다.

특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 1종 이상의 세포 기재 또는 생체내 검정으로 스크리닝된다. 이러한 검정에서, 정제되거나 정제되지 않은 단백질은 세포가 라이브러리에 속한 개개의 변이체 또는 변이체의 풀에 노출되도록 전형적으로 외부에서 첨가된다. 이러한 검정은 전형적으로, 언제나 그러한 것은 아니지만, 변이체 IgG의 기능; 즉 변이체 IgG가 그의 표적에 결합하고 일부 생화학적 사건, 예를 들어 이펙터 기능, 리간드/수용체 결합 억제, 아폽토시스 등을 매개하는 능력을 기초로 한다. 이러한 검정은 종종 IgG에 대한 세포의 반응, 예를 들어 세포 증식, 세포 이동, 혈관신생, 세포 생존, 세포 사멸, 세포 형태의 변화, 또는 전사 활성화, 예컨대 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 발현을 모니터링하는 것을 수반하였다. 예를 들어, 이러한 검정은 IgG 변이체가 ADCC, ADCP 또는 CDC를 유발하는 능력을 측정할 수 있다. 일부 검정의 경우에, 표적 세포에 추가하여 추가의 세포 또는 성분, 예를 들어 혈청 보체, 또는 이펙터 세포, 예컨대 말초혈 단핵구 (PBMC), NK 세포, 대식세포 등의 첨가가 필요할 수 있다. 이러한 추가의 세포는 임의의 유기체, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이 유래의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 혈관신생을 억제할 수 있고, 이러한 활성을 모니터링하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 표적을 발현하는 특정 세포주의 아폽토시스을 야기할 수 있거나, 또는 이것이 검정에 첨가된 면역 세포에 의한 표적 세포에 대한 공격을 매개할 수도 있다. 세포 사멸 또는 생존을 모니터링하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 염료, 면역화학, 세포화학 및 방사능 시약의 사용을 포함한다. 전사 활성화는 또한 세포 기재의 검정으로 기능을 검정하는 방법으로서 이용될 수 있다. 별법적으로, 세포 기재의 스크리닝은 변이체를 코딩하는 핵산으로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 사용하여 수행된다. 즉, 변이체 IgG가 세포에 외부에서 첨가되지 않는다.

변이체 IgG의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 온전한 유기체 실험에서 특징규명될 수 있다. 종종, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 동물에서 질환 또는 질환 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 약물의 약력학, 독성 및 기타 특성을 측정하기 위해서 약물이 시험된다. 상기 동물은 질환 모델이라 지칭될 수 있다. 종종, 치료제는 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식편 마우스 및 트랜스제닉 마우스 (예를 들어, 넉인(knockin) 및 넉아웃)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 마우스에서 시험된다. 이러한 실험은 치료제로 사용될 단백질의 잠재력을 결정하기 위한 의미있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물이 시험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 원숭이는 인간과의 유전학적 유사성으로 인해 적합한 치료 모델일 수 있고, 따라서 변이체 IgG의 효능, 독성, 약력학 또는 기타 특성을 시험하는데 사용될 수 있다. 약물로서 승인받기 위해서는 인간에서의 시험이 궁극적으로 필요하기 때문에 이러한 실험이 고려되는 것이 당연하다. 따라서, 변이체 IgG는 이것의 치료 효능, 독성, 면역원성, 약력학 및/또는 기타 임상적 특성을 결정하기 위해 인간에서 시험될 수 있다.

변이체 IgG의 치료 용도

변이체 IgG는 광범위한 생성물에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG 변이체는 치료용, 진단용 또는 연구용 시약이다. 변이체 IgG는 모노클로날 또는 폴리클로날인 항체 조성물에서 사용될 수 있다.

변이체 IgG는 S. 아우레우스에 감염된 환자를 치료하는 것을 비롯해서, 그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌 다양한 치료 목적을 위해 사용될 수 있다.

투여량, 제제 및 지속시간

변이체 IgG 조성물은 양호한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제제화되어 투여량에 따라 분배되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유동물, 개개의 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문인에게 공지된 기타 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 질환의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 변이체 IgG, 예를 들어 항체의 적절한 투여량 (단독으로 사용되거나 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우의 투여량)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 환자의 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 변이체 IgG는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다.

본원에서의 제약 제제는 또한 치료할 특정 적응증에 필요한 경우에는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.

질환의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 변이체 IgG의 적절한 투여량 (단독으로 사용되거나 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우의 투여량)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 변이체 IgG가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상적 병력 및 변이체 IgG에 대한 환자의 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 간에 약 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 15 mg/kg)의 변이체 IgG가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 1일 투여량 중 하나는 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 높은 값의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라서 질환 증상이 원하는 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 한 실시양태에서, 치료는 상태에 따라 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 방법으로 측정하여 질환이 치료될 때까지 지속된다. 변이체 IgG의 예시적인 투여량 중 하나는 약 0.05 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg 중 하나 이상의 용량 (또는 이들의 임의의 조합)을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 3주마다, 8주마다 또는 12주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 환자에게 항체를 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 투여함). 특정 실시양태에서, 보다 높은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투약법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량으로 투여한 후에 약 2 mg/kg씩의 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.

특정 실시양태에서, 환자를 변이체 IgG 및 1종 이상의 다른 치료제(들)의 조합물로 치료한다. 조합 투여에는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하여 공동투여 또는 동시에 투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속적으로 투여하는 것이 포함되는데, 임의로 양 (또는 모든) 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 존재한다. 변이체 IgG와 조합하여 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 치료할 상태의 최대 관리를 달성하도록 투여량 투여 및 조정이 이루어진다. 용량은 사용될 치료제의 유형 및 치료받을 특정 환자와 같은 인자에 따라 추가로 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 억제제들의 조합은 단일 억제제의 효능을 강화시킨다. 용어 "강화시킨다"는 일반적인 또는 승인된 용량의 치료제의 효능 개선을 지칭한다.

본 발명의 변이체 IgG (및 임의의 추가의 치료제)는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 피하, 복강내, 뇌척수내, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우에는 병변내 투여로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG, 예를 들어 항체는 특히 변이체 IgG의 투여량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 대상체에게 예를 들어 볼루스로서 또는 시간 경과에 따른 연속 주입에 의해 정맥내 투여된다.

본 발명의 변이체 IgG, 예를 들어 항체의 결합 표적의 위치는 변이체 IgG의 제조 및 투여시에 고려될 수 있다. 변이체 IgG의 결합 표적이 뇌에 위치한 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 변이체 IgG를 제공한다. 물리적 방법, 지질 기재의 방법, 줄기 세포 기재의 방법, 및 수용체 및 채널 기재의 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하는 당업계 공지의 접근법이 여러가지 존재한다.

변이체 IgG, 예를 들어 항체를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 물리적 방법은 혈액-뇌 장벽을 아예 피해가는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 개구부를 생성하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 피해가는 방법은 뇌로의 직접 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 세포간 주입/대류-증진 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내 전달 장치의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 길포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical)의 글리아델 웨이퍼즈(Gliadel Wafers)™ 참조)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 장벽에 개구부를 생성하는 방법에는 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)])), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어, 미국 특허 제5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호 및 제5,686,416호 참조), 및 변이체 IgG를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의한, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 2003/0083299 참조)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

혈액-뇌 장벽을 가로질러 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 수송하는 지질 기재의 방법은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀 내에 변이체 IgG를 캡슐화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20020025313 참조), 및 변이체 IgG를 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20040131692 참조)로 코팅하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

혈액-뇌 장벽을 가로질러 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 수송하는 줄기 세포 기재의 방법은 신경 선조 세포 (NPC)를 관심 항체를 발현하도록 유전자 조작한 후에 줄기 세포를 치료할 개체의 뇌로 이식하는 것을 포함한다. 문헌 [Behrstock et al., (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005 advanced online publication] (신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전자 조작된 NPC를 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식한 경우에 파킨슨병의 증상이 감소됨을 보고함)을 참조한다.

혈액-뇌 장벽을 가로질러 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 수송하는 수용체 및 채널 기재의 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2005/0089473 참조); ABC 약물 수송자의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2003/0073713 참조); 트랜스페린에 의한 항체 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조정 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2003/0129186 참조), 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 제5,004,697호 참조)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 포함하는 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 변이체 IgG를 임의의 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)])와 혼합하여 수용액제, 동결건조된 제제 또는 기타 건조된 제제의 형태로 저장되도록 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 본 발명의 이뮤노글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 용품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일이 넘는 기간 동안 분자를 방출할 수 있게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 이뮤노글로불린이 오랜 시간 동안 신체 내에 유지되는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화가 야기될 수 있다. 관련 메카니즘에 따라, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.

조합 요법

본원에 기재된 치료제는 다른 치료제와 동시에 투여될 수 있고, 즉, 본원에 기재된 치료제는 다른 요법 또는 치료제, 예를 들어 소분자, 기타 생물학적 작용제, 방사선 요법, 수술 등과 공동 투여될 수 있다.

제조품

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 언급된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 보유하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합하여 보유하며, 멸균 입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 라벨 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 특정 실시양태에서, 제조품은 (a) 본 발명의 변이체 IgG를 포함하는 조성물이 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 치료제를 포함하는 조성물이 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 상기 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 단독으로 또는 기타 치료 화합물과 조합되어 키트로서 포장될 수 있다. 이러한 키트는 환자에게 단위 용량을 투여하는 데에 도움을 주는 임의의 성분, 예를 들어 분말 형태를 재구성하기 위한 바이알, 주사용 시린지, 주문제작된 IV 전달 시스템, 흡입기 등을 포함할 수 있다. 추가로, 단위 용량 키트는 조성물의 제조 및 투여를 위한 지침서를 함유할 수 있다. 키트는 1명의 환자를 위한 1회용 단위 용량으로서 제조될 수 있거나, 특정 환자를 위해 여러회 사용하도록 (일정한 용량으로, 또는 요법이 진행됨에 따라 개개의 화합물의 효력이 달라질 수 있도록) 제조될 수 있거나; 또는 키트는 다수의 환자에게 투여하는데 적합한 다중 용량을 함유할 수 있다 ("벌크 포장"). 키트 성분은 카툰, 블리스터 팩, 병, 튜브 등에 조립될 수 있다.

실시예

다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제시된 일반적인 설명을 기초로 하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.

실시예 1: 항-Her2 변이체의 생산

인간화 항-Her2 (미국 특허 제5,821,337호에 기재되어 있는 4D5 또는 huMAb4D5-8) IgG₁ 중쇄 및 경쇄의 Fab 영역을 인간 IgG₁ 불변 도메인을 함유하는 2개의 pRK에 기초한 일시적 형질감염 플라스미드에서 별개로 클로닝하였다. 이어서, 쿤켈(Kunkel)에 기초한 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여, V_H 도메인에서 나머지가 돌연변이된 항-Her2 IgG₁ 변이체를 생성하였다. 본 연구에서 생성한 항-Her2 변이체는 S17A, R19A, S21A, T57A, T57K, R66A, T68A, S70A, Y79A, Q81A, N82aA, 및 S82bA이었다 (모두 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링함).

변이체의 중쇄 및 야생형 경쇄를 함유하는 플라스미드로 제조사의 프로토콜에 따라 퓨진(FUGENE)® (로슈(Roche), 스위스 바젤 소재)을 이용하여 아데노바이러스 형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293을 공동 형질감염시켰다. 형질감염 복합체와 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 형질감염된 세포를 5 mM 글루타민을 함유하는 혈청 무함유 배지 1.3x GEM N 배지로 배양하였다. 상청액을 모으고, 1 M 트리스 pH 8.0 및 5 M 염화 나트륨 (NaCl)으로 조건화하여 최종 농도를 30 mM 트리스 및 50 mM NaCl로 하였다. 이어서 조건화된 상청액을 단백질 L 수지-팩킹된 칼럼 (써모 사이언티픽(Thermo scientific), 일리노이주 록포드 소재) 상에 로딩하였다. 로딩 후, 칼럼을 30 mM 트리스 및 150 mM NaCl (pH 8)을 함유하는 완충제로 세척하였다. 결합된 Fab를 0.1 M 글리신 완충제 (pH 3.0)로 용출시켰다. 다음으로, 정제된 Fab를 농축시키고, 슈퍼덱스(Superdex)®-200 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 (GE 헬스케어(GE healthcare), 영국 챌폰트 세인트 자일스 소재)에 주입하여 임의의 응집체를 제거하였다. 단량체 분획을 함께 풀링하고, 결합 연구에 사용하였다. 280 nM에서 흡광도를 판독하여 항-HER2 야생형 및 항-HER2 변이체 Fab 농도를 계산하고, 흡광도 1.5는 Fab가 1 mg/ml인 것으로 추정하였다.

실시예 2: 단백질 A 결합 연구

단백질 A에 대한 항-Her2 변이체의 결합은 ELISA로 연구하였다. 맥시소르프(MaxiSorp)™ ELISA 플레이트 (써모 사이언티픽, 일리노이주 록포드 소재)를 1 ㎍/ml의 단백질 A (써모 사이언티픽, 일리노이주 록포드 소재) 또는 Her2의 세포외 도메인 (제넨테크, 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)을 이용하여 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS, 0.5％ BSA, 10 ppm 프로클린 (pH 7.2)으로 1시간 동안 실온에서 차단한 다음, 세척 완충제 (PBS/0.05％ 트윈™ 20/pH 7.2)로 세척하였다. 검정 완충제 (PBS, pH 7.4, 0.5％ BSA, 0.05％ 트윈 20, 10 ppm 프로클린) 중의 야생형 Fab 및 변이체의 연속 4배 희석물 (1000 nM에서 출발)을 단백질 A로 코팅한 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 한편, 검정 완충제 중의 야생형 Fab 및 변이체의 연속 4배 희석물 (50 nM에서 출발)을 Her2로 코팅한 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 진탕하면서 실온에서 3 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 4회 세척하고, 결합된 항체를 검정 완충제 중에서 1:10,000로 희석한 염소 항-인간 IgG (F(ab')₂ 특이적-HRP (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 팬실베니아주 웨스트 그로브 소재)를 이용하여 실온에서 0.5 시간 동안 진탕하면서 검출하였다. 이어서 플레이트를 다시 4회 세척한 후, 발색을 위해 테트라메틸 벤지딘 기질 (모스(Moss), 메릴랜드주 파사데나 소재)을 첨가하였다. 2 분 후에 1 M 인산 (H₃PO₄)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트를 분자 장치 마이크로플레이트 판독기 상에서 450-620 nm의 파장에서 판독하였다.

그 결과, 모든 변이체가 Her2에 대해 야생형과 동일한 결합 친화성을 보유하는 것으로 나타났다 (도 1 및 2). 도 3-4의 결과는 특정 변이체가 야생형에 비해 단백질 A에 대해 감소된 결합을 나타내는 것을 보여주며 [S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A, 및 N82aA], 그 밖의 것들은 본질적으로 동일한 수준의 결합을 나타냈고 [S21A 및 T68A], 또 다른 그 밖의 것들은 증가된 결합을 나타내었다 [S70A, Y79A, 및 S82bA]. WT Fab의 EC₅₀은 약 15 nM인 것으로 추정되었다. 이들 변이체 각각에 대한 EC₅₀의 추정치를 하기 표 2에 나타낸다.

전술된 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 설명 및 실시예로서 약간 상세하게 기재되었지만, 상기 기재 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (12)

1. 야생형 인간 IgG V_H 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG V_H 영역을 포함하는 변이체 항-Her2 IgG로서, 여기서 항-Her2 IgG가 huMAb4D5-8이고, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링된 S70A, Y79A, 및 S82bA로 이루어진 군에서 선택되어 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A에 대해 증가된 결합을 갖는 변이체 항-Her2 IgG.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 야생형 인간 IgG V_H 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG V_H 영역을 포함하는 변이체 항-Her2 IgG로서, 여기서 항-Her2 IgG가 huMAb4D5-8이고, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링된 S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A, 및 N82aA로 이루어진 군에서 선택되어 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A에 대해 감소된 결합을 갖는 변이체 항-Her2 IgG.
8. 제1항 또는 제7항에 있어서, 인간 또는 인간화 IgG인 변이체 항-Her2 IgG.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

Images