MX2011006870A - Variantes de inmunoglobulina con union alterada a proteina a. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan imnunoglobulinas variantes con una o más modificaciones aminoacídicas en la región VH que poseen una unión alterada a la proteína A de Staphylococcus aureus, y métodos para usar las mismas.

Description

VARIANTES DE INMUNOGLOBULINA CON UNIÓN ALTERADA A PROTEÍNA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una solicitud no provisional presentada bajo 37 CFR 1.53(b) (1), reivindicando prioridad bajo 35 USC 119 (e) a la solicitud provisional número 61/140565 presentada el 23 de diciembre de 2008, el contenido del cuál se incorpora aquí por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente con el campo de biología molecular. Más específicamente, la presente invención se relaciona con variantes de inmunoglobulina IgG con propiedades biológicas alteradas y métodos para usar las mismas .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Con el paso del tiempo, el uso de inmunoglobulinas como agentes terapéuticos ha aumentado notablemente. Las moléculas de inmunoglobulina (Ig) constituyen una parte importante del sistema inmunitario y son del gran interés porque éstas (1) reaccionan con una familia diversa de ligandos, (2) poseen diferentes funciones efectoras y (3) tienen gran importancia biológica. En la actualidad, los usos dé fármacos con base en anticuerpos incluyen el tratamiento contra el cáncer, enfermedades autoinmunitarias así como diversas enfermedades sistémicas e infecciosas. También, las inmunoglobulinas son útiles como instrumentos de diagnóstico in ivo, por ejemplo, en procedimientos de formación de imágenes para diagnóstico.

La IgG es la clase de inmunoglobulina más frecuente en humanos y otros mamíferos y se utiliza en diversos tipos de inmunoterapias y procedimientos de diagnóstico. El humano IgGl es el anticuerpo el más comúnmente usado con objetivos terapéuticos. Un área de la investigación activa es anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo en contra de patógenos, incluyendo Staphylococcus aureus . A pesar de su potencial, uno de los problemas con la terapia de inmunoglobulina que apunta con acción selectiva hacia S. aureus ha sido la unión de anticuerpos a la proteína A de S. aureus. La unión de IgG a la proteína A ha sido estudiada y las posiciones implicadas en la unión tanto a la proteína A como a FcRn se han identificado (ver, p.ej, Riechmann & Davies, J. RMN biomolecular 6:141-52 (1995), Artandi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU 89:94-98 (1992), WO 93/22332). Sería ventajoso tener inmunoglobulinas modificadas que muestran la unión alterada a la proteína A. La presente invención se encarga a estos y otros necesidades, como será evidente mediante la revisión de la siguiente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona novedosas variantes de IgG y usos de las mismas. En la invención se proporcionan diversas variantes de IgG .

En un aspecto, la invención proporciona la IgG variante que comprende una región VH de IgG de humano que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con relación a una región VH de IgG natural de humano a uno o más residuos aminoacidicos 17, 19, 57, 66, 70, 79, 81, 82a, 82b, numerado según el índice EU como en Kabat, donde la IgG variante ha alterado la unión a la proteína A de Staphylococcus aureus . En algunas modalidades, la IgG variante ha aumentado la unión a la proteína A, p.ej un con una región VH de IgG de humano que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con relación a una región VH de IgG natural a uno o más residuos aminoacidicos 70, 79, y 82b (p.ej. S70A, Y79A, o S82bA) . En algunas modalidades, la IgG variante ha disminuido la unión a la proteína A, p.ej un con una región VH de IgG de humano que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con relación a una región VH de IgG natural a uno o más residuos aminoacidicos 17, 19, 57,· 66, 81, y 82a (p.ej. S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A, o N82aA) . En algunas modalidades, la IgG variante es IgG de humano o humanizada. En algunas modalidades, la IgG variante es IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas modalidades, la IgG variante se une con una proteína de Staphylococcus aureus además de la proteína A. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una IgG variante de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la invención proporciona un kit que comprende una IgG variante de la invención en un recipiente, e instrucciones de uso.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente Descripción Detallada, las figuras, y las reivindicaciones .

Cualquier modalidad descrita aquí o cualquier combinación de las mismas aplica a cualquier IgGs variantes y métodos de la invención descrita aquí .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 y 2 muestran ELISAs de la unión de Fabs de anti-Her2 variante a Her2.

Las Figuras 3 y 4 muestran ELISAs de la unión de Fabs de anti-Her2 variante a la proteína A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con novedosas variantes de dominios IgG, incluyendo los encontrados en anticuerpos y proteínas de fusión, que han alterado la unión a la proteína A de aureus. Estas variantes comprenden una región VH de IgG de humano, o fragmento de lo mismo que se une con la proteína A, que contiene una o más modificaciones aminoacídicas con relación a una región VH natural de humano qué modificaciones alteran su afinidad para la proteína A.

Los métodos y los procedimientos descritos o referidos aquí son generalmente bien entendidos y comúnmente empleados usando la metodología convencional por los expertos en la técnica, el como, por ejemplo, las metodologías extensamente utilizadas descritas en Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds . , (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology. A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed. , 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed. , 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenu Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental I munology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al . , eds . , 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds . , 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Imunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies : A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

A menos que se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente entendido por el experto común en la técnica a la cual esta invención pertenece. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed. , J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed. , John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), proporcionan un experto en la técnica con una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud. Todas las referencias citadas aquí, incluyendo solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan por referencia en su totalidad.

Definiciones Con objetivos de interpretar esta especificación, las siguientes definiciones se aplicarán y siempre que adecuado, los términos usados en el singular también incluirán el plural y viceversa. Hay que entender que la terminología usada aquí es para la descripción de modalidades particulares sólo, y no es conceptualizada para limitar. En caso de que cualquier definición establecida después de conflictos con cualquier documento incluido aquí por referencia, la definición establecida después debe preceder.

Durante todo la presente especificación y reivindicaciones, numerar de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es el del índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5to Servicio de Salud pública de editor, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991) . El "índice EU como en Kabat" se refiere a la enumeración de residuos del anticuerpo de IgGl EU de humano.

Por "el" o "polipéptido natural polipeptídico progenitor" como se utiliza aquí se supone un polipéptido no modificado, un polipéptido de origen natural, o una versión modificada manipulada genéticamente de un polipéptido de origen natural que carece uno o más de las modificaciones aminoacídicas descritas aquí y que se diferencia en la unión de prote na A comparado con la proteína variante como aquí descrito. El polipéptido progenitor puede comprender una región VH de secuencia de origen natural o una región VH con modificaciones de secuencia aminoacídica preexistentes (como adiciones, eliminación y/o substituciones). El polipéptido progenitor también puede comprender aminoácidos artificiales como se describe después . El polipéptido progenitor puede referirse al polipéptido sí mismo, composiciones que comprenden el polipéptido progenitor, o la secuencia aminoacídica que lo codifica para. Polipéptido progenitor, incluye, entre otras cosas, la inmunoglobulina progenitora, la inmunoglobulina natural, el anticuerpo progenitor y el anticuerpo natural .

En consecuencia, usando los términos, "inmunoglobulina de origen," " igG de origen", "inmunoglobulina natural" o "IgG natural" como se utilizan aquí, significan una inmunoglobulina no modificada, una inmunoglobulina de origen natural, o una versión modificada manipulada genéticamente de una inmunoglobulina de origen natural que carece uno o más de las modificaciones aminoacídicas descritas aquí y que se diferencia en la unión de proteína A comparado con la IgG variante como aquí descrito. La inmunoglobulina progenitora puede comprender una región VH de secuencia de origen natural o una región VH con modificaciones de secuencia aminoacídica preexistentes (como adiciones, eliminación y/o substituciones) . La inmunoglobulina progenitora también puede comprender aminoácidos artificiales como se describe después. La inmunoglobulina progenitora puede referirse a la inmunoglobulina sí mismo, composiciones que comprenden la inmunoglobulina progenitora, o la secuencia aminoacídica que lo codifica para.

Por "el anticuerpo progenitor" o "el anticuerpo natural" como se utiliza aquí se supone un anticuerpo no modificado, un anticuerpo de origen natural, o una versión modificada manipulada genéticamente de un anticuerpo de origen natural que carece uno o más de las modificaciones aminoacídicas descritas aquí y que se diferencia en la unión de proteína A comparado con la IgG variante como aquí descrito. El anticuerpo progenitor puede comprender una región VH de secuencia de origen natural o una región VH con modificaciones de secuencia aminoacídica preexistentes (como adiciones, eliminación y/o substituciones) . El anticuerpo progenitor también puede comprender aminoácidos artificiales como se describe después. El anticuerpo progenitor puede referirse al anticuerpo sí mismo, composiciones que comprenden el anticuerpo progenitor, o la secuencia aminoacídica que lo codifica para.

Por "la variante", "la proteína variante" o "la variante protéica" como se utiliza aquí se suponen una proteína que se diferencia de aquella de una proteína progenitora en virtud de al menos una modificación aminoacídica . La variante protéica puede referirse a la proteína sí mismo, una composición que comprende la proteína, o la secuencia de amino que lo codifica para. En ciertas modalidades, la variante protéica tiene al menos una modificación aminoacídica comparado con el polipéptido progenitor, p.ej de aproximadamente un hasta aproximadamente diez modificaciones aminoacídicas . La secuencia variante protéica aquí poseerá preferentemente al menos aproximadamente el 80 % de la homología con una secuencia protéica progenitora, y con mayor preferencia al menos aproximadamente el 90 % de la homología, más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de la homología. Las variantes protéicas también pueden comprender aminoácidos artificiales, como definido después. El término "protéica de variante" incluye la variante de inmunoglobulina y la variante de anticuerpo como se describe aquí.

El término "variante de inmunoglobulina," "inmunoglobulina variante," "igG variante" o "variante de IgG" como se utiliza aquí se suponen una secuencia de inmunoglobulina que se diferencia de aquella de una secuencia de inmunoglobulina progenitora o natural en virtud de al menos una modificación aminoacídica.

Por el término "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante" como se utiliza aquí, se supone un anticuerpo que se diferencia de un anticuerpo progenitor en virtud de al menos una modificación aminoacídica . En ciertas modalidades, el anticuerpo variante tiene una o más modificaciones aminoacídicas en la región VH con relación al anticuerpo natural. En ciertas modalidades, un anticuerpo variante es una IgG variante .

Por "la posición" como se utiliza aquí se supone una posición en la secuencia de una proteína. Las posiciones pueden ser numeradas secuencialmente, o según un formato establecido, por ejemplo el índice EU como en Kabat.

Una "modificación aminoacídica" se refiere a un cambio de la secuencia aminoacídica de una secuencia aminoacídica predeterminada. Las modificaciones ejemplificantes incluyen una sustitución aminoacídica, inserción y/o eliminación. En ciertas modalidades, la modificación aminoacídica es una substitución.

Una "modificación aminoacídica en" una posición especificada, p.ej en la región Fe, se refiere a la substitución o la eliminación del residuo especificado, o la inserción de al menos un residuo aminoacídico adyacente el residuo especificado. Por la inserción "adyacente" a un residuo especificado se supone la inserción dentro de unios a dos residuos de lo mismo. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal al residuo especificado.

Una "sustitución aminoacídica" se refiere al reemplazo de al menos un residuo aminoacídico existente en . una secuencia aminoacídica predeterminada con otro diferente residuo aminoacídico "de reemplazo" . El residuo de reemplazo o los residuos pueden ser "residuos aminoacídicos de origen natural" (es decir codificó por el código genético) y seleccionado del grupo que comprende: alanina (Ala) ; arginina (Arg) ; asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteína (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (lie) : leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilananina (Phe) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) ; treoriina (Thr) ; triptófano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . La substitución con residuos aminoacídicos uno o más que ocurren artificialmente también es abarcada por la definición de una sustitución aminoacídica aquí .

Un "residuo aminoacídico que ocurre artificialmente" se refiere a un residuo, además de aquellos residuos aminoacídicos de origen natural enumerados antes, que es capaz de ligar covalentemente residuos (s) aminoacídicos adyacentes en una cadena polipeptídica . Los ejemplos de residuos aminoacídicos que ocurren artificialmente incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuo aminoacídico, como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991); Patente dé E.U. núm. 6 586 207; WO 98/48032; WO 03/073238; número de Publicación de E.U. 2004-0214988A1; WO 05135727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal oí the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; and J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States oí America 99:11020-11024.

En ciertas modalidades, los términos "disminución", "disminuyen la unión de proteína A", "reducen", o "reducen la unión de proteína A" se refiere a una disminución total del 25 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, o el 99 % en la unión de proteína A de una IgG variante de la invención detectada por la técnica convencional los métodos conocidos , como los descritos aquí, comparando con IgG natural o IgG que tienen la región Fe de IgG natural de humano. En ciertas modalidades estos términos alternativamente pueden referirse a una disminución total del de 10 veces (es decir 1 log) , de 100 veces (2 log), de 1,000 veces (o 3 log), de 10,000 veces (o 4 log), o de 100,000 veces (o 5 log). De forma similar, los términos "aumento", "la proteína A de aumento que liga" y lo similar se refiere a un aumento total de 2 veces, de 3 veces, de 4 veces, de 5 veces, de 10 veces, de 100 veces, o de 1,000 veces en la unión de proteína A de una IgG variante de la invención detectada por la técnica convencional métodos conocidos, como los descritos aquí, comparando con IgG natural o IgG que tienen la región Fe de IgG natural de humano .

El término "anticuerpo" aquí se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclónicos (incluyendo anticuerpos monoclónicos de cadena completa) , anticuerpos policlónicos , anticuerpos multiespecífieos (p.ej, anticuerpos biespecífieos ) , y fragmentos de anticuerpo mientras que éstos muestran la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "aislado" u otro polipéptido son el que que se ha identificado y ha separado y/o se ha repuesto de un componente de su medio ambiente natural . Los componentes de contaminante de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con la investigación, de diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas modalidades, un anticuerpo u otro polipéptido se purifica (1) al mayor que el 95 % en peso del anticuerpo u otro polipéptido como se determina mediante, por ejemplo, el método de Lowry, y en algunas modalidades, al mayor que el 99 % en peso; (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia aminoacídica N-terminal o interna por uso de, por ejemplo, un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, azul de Coomassie o tinción de plata. El anticuerpo aislado u otro polipéptido lo incluyen in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente de su medio ambiente natural no se encontrará. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado u otro polipéptido se prepararán por al menos una etapa de purificación.

"Los anticuerpos de origen natural" son glucoproteínas por lo general heterotetraméricas de aproximadamente 150 000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios con regularidad separados . Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante a su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera es alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera es alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una interconexión entre dominios variables de cadena pesada y la cadena ligera.

El término "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia aminoacídica más conservada con relación a la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión al antígeno (parátopo) . El dominio constante contiene el CHl, CH2 y los dominios CH3 de la cadena pesada y el dominio CHL de la cadena ligera.

La "región variable" o "el dominio variable" de un anticuerpo se refieren a los dominios terminales por amino del pesado o la cadena ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede referirse "como VH" . El dominio variable de la cadena ligera puede referirse, "VL" . Estos dominios son generalmente la mayor parte de partes variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión al antígeno (parátopos) .

El término "variable" se refiere al hecho que las ciertas porciones de los dominios variables se diferencian exhaustivamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no es regularmente distribuida durante todo los dominios variables de anticuerpos. Esto se concentra en tres segmentos llamadas regiones hipervariables (HVRs) tanto en la cadena ligera como en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más muy conservadas de dominios variables se llaman las regiones base (FR) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras de origen natural cada uno comprende cuatro regiones de FR, en gran parte adoptando una configuración de lámina de la beta, conectada por tres HVRs, que forman la unión de asas, y en algunos casos ser parte de, la estructura de lámina de la beta. Los HVRs en cada cadena son mantenidos unidos en la proximidad inmediata por las regiones de FR y, con el HVRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (parátopo) de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , Quinta Edición, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland (1991)) . Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos ( inmunoglobulinas ) de cualquier especie vertebrada pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamado kappa ( ) y lambda (?) , basado en las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes .

El término "isotipo" o "subclase" de IgG, como se utiliza aquí, supone cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes.

Según las secuencias aminoacídicas de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas ) pueden ser asignados a diferentes clases. Hay cinco tipos principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden estar divididos adicionalmente en subclases (isotipos), p.ej, IgGl, IgG2, lgG3, lgG4, igAl, e igA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman ?, ?, ?, ?, y ?, respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas y descritas generalmente en, por ejemplo, Abbas et al. Cellular y Mol. Inmunología, 4to editor (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser la parte de una molécula de fusión más mayor, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo con uno o más otras proteínas o péptidos.

El término "modificación de subclase de IgG" como se utiliza aquí se supone una modificación aminoacídica que convierte un aminoácido de un isotipo de IgG al aminoácido correspondiente en un isotipo de IgG diferente, alineado. Por ejemplo, porque IgGl comprende tirosina e lgG2 fenilananina a posición de la Unión Europea 296, una substitución F296Y en IgG2 se considera una modificación de subclase de IgG.

Por "la modificación que ocurre artificialmente" como se utiliza aquí se supone una modificación aminoacídica que no es isotypic. Por ejemplo, porque ninguno de igGs comprende un ácido glutámico en la posición 332, substitución en la posición 332 con el ácido glutámico (332E) en IgGl , IgG2 , IgG3 , o IgG4 se considera una modificación que ocurre artificialmente .

Los términos "anticuerpo de cadena completa, " "el anticuerpo intacto" y "el anticuerpo completo" se usan aquí de modo indistinto para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 según la Unión Europea sistema que numera) del anticuerpo mi eliminarse, por ejemplo, durante purificación del anticuerpo o por ingeniería recomb.inante del ácido nucleico que codifica para el anticuerpo. Los anticuerpos con o sin esta lisina C-terminal son "de cadena completa", "intactos" o "completos" ya que aquellos términos se usan aquí.

Un "anticuerpo desnudo" con los objetivos aquí está un anticuerpo que no es conjugado a una porción citotóxica o radiomarcador .

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que preferentemente comprende el antígeno región de unión de lo mismo. En ciertas modalidades, los fragmentos de anticuerpo comprenden una región Fe o una porción de región Fe que comprende la uno o más modificación de región Fe descrita aquí. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab' , F(ab')2, y fragmentos de Fv; diabodies; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias ; y anticuerpos multiespecífieos conformados de fragmentos de anticuerpo .

La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", a cada uno con un sitio de unión al antígeno (parátopo) individual, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizarse fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento de F(ab')2 que tiene dos sitios que combinan el antígeno y todavía es capaz de entrecruzar el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión al antígeno (parátopo) completo. En una modalidad, una especie Fv bicatenaria comprende un dímero de un pesado - y un dominio variable de cadena ligera en la asociación apretada, no covalente. En Fv monocatenario (el scFv) especies, un pesado - y un dominio variable de cadena ligera puede enlazarse covalentemente por un ligador peptídico flexible el que la luz y las cadenas pesadas pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a esto en una especie Fv bicatenaria. Está en esta configuración que tres HVRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno (parátopo) en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, seis HVRs confieren la especificidad que liga el antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable individual (o mitad de Fv que comprende sólo tres HVRs específico para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y ligar el antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene el pesado - y dominios variables de cadena ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHl) de la cadena pesada. Fab' fragmentos diferencian de fragmentos Fab mediante la adición de unos residuos en el terminal carboxi de la cadena pesada el dominio de CHl que incluye uno o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Fab '-SH está la designación aquí para Fab' donde el residuo (s) de cisteína de los dominios constantes albergan un grupo de tiol libre, los · fragmentos de anticuerpo de F(ab')2 al principio se producen ya que los pares de Fab' fragmentos que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Otras reacciones de adición químicas de fragmentos de anticuerpo también son conocidas.

"Fv monocatenario" o los fragmentos de anticuerpo "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, donde estos dominios se encuentran en una cadena polipeptídica individual. En términos generales, el polipéptido · scFv adicionalmente comprende un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión de antígeno . Para una revisión de scFv, ver, p.ej, Pluckthün, en el The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg y editores de Moore, (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), pps 269-315.

El término "diabodies" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antigeno (parátopos) , qué fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . Usando un ligador que es demasiado corto para permiten el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno (parátopos) . Diabodies puede ser bivalente o biespecífico . Diabodies se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404 097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y los tetracuerpos se describen también en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

El término "anticuerpo monoclónico" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden a la población son idénticos excepto posibles mutaciones, p.ej, mutaciones de origen natural, que pueden encontrarse en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonico" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos individuales. En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonico por lo común incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que liga un objetivo, donde la secuencia polipeptídica de unión al objetivo se obtiene por un proceso que incluye la selección de una secuencia polipeptídica de unión al objetivo individual de una pluralidad de secuencias polipeptídicas . Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon exclusivo de una pluralidad de clones, como un grupo de los clones de hibridoma, clones de fago, o clones de ADN recombinante . Hay que entender que un objetivo seleccionado la secuencia de unión puede ser alterada adicionalmente, por ejemplo-, para mejorar la afinidad para el objetivo, humanizar el objetivo secuencia de unión, mejorar su producción en el cultivo celular, reducir su inmunogenicidad in vivo, crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende el objetivo alterado secuencia de unión también es un anticuerpo monoclonico de esta invención. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlónicas , que por lo común incluyen diferentes anticuerpos dirigidos con especificidad de objetivo contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonico de una preparación de anticuerpo monoclónico es dirigido con especificidad de objetivo contra un determinante individual en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclónico son ventajosas en que éstos son por lo común no contaminados por otras inmunoglobulinas .

El modificador "monoclónico" indica el carácter del anticuerpo como obteniéndose de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser interpretado como el requerimiento de la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclónicos para usarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por una variedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, el método de hibridoma (p.ej, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3) : 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: el Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, Nueva York, 1981)), métodos de ADN recombinante (ver, p.ej, la Patente de EE.UU. No. 4 816 567), las tecnologías de despliegue de fagos (ver, p.ej, a Clackson et al., Naturaleza, 352: 624-628 (1991); marca et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Sotavento et al., J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J.

Immunol. Métodos 284 (1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos de humano o parecidos a un humano en animales que tienen partes o todo el locus de inmunoglobulina de humano o genes que codifican para secuencias de inmunoglobulina de humano (ver, p.ej, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes Estadounidenses Núms. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Interno. El Rev Immunol . 13: 65-93 (1995) .

Los anticuerpos monoclónicos aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" donde una porción del pesado y/o cadena ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciendo a una clase de anticuerpo particular o subclase, mientras el resto de la cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o perteneciendo a otra clase de anticuerpo o subclase, así como fragmentos de los anticuerpos, mientras que éstos muestran la actividad biológica deseada (ver, p.ej, la Patente de EE.UU. No. 4 816 567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos ® PRIMATIZADOS donde la región que liga el antigeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido por, p.ej, inmunizando monos de macaco con el antígeno de interés .

Las formas "humanizadas" (p.ej, murino) de los anticuerpos no humanos son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina de humano (anticuerpo de receptor) donde los residuos de un HVR del receptor son sustituidos por residuos de un HVR de una especie no humana (anticuerpo de donante) , como ratón, rata, conejo, o el primate no humano que tiene la especificidad deseada, afinidad, y/o capacidad. En algunos casos, los residuos de FR de la inmunoglobulina de humano son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos Más aún, humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo de receptor o en el anticuerpo de donante. Estas modificaciones pueden elaborarse para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En términos generales, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo al menos un, y por lo común dos, dominios variables, donde todos o sustancialmente todas las asas hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , por lo común aquella de una inmunoglobulina de humano. Para detalles adicionales, ver, p.ej, a Jones et al., Naturaleza 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta., Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) . Ver también, p.ej, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y Patentes de EE.UU. Números 6,982,321 y 7,087,409.

Un "anticuerpo de humano" es el que que posee una secuencia aminoacídica que corresponde a aquel de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado usando cualquier de los métodos para elaborar anticuerpos de humano como está descritos aquí. Esta definición de un anticuerpo de humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos no humanos que ligan el antígeno. Los anticuerpos de humano pueden producirse usando diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo genotecas de despliegue de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) . También disponible para la preparación de anticuerpos monoclónicos de humano son métodos descritos en Colé et al. , Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1) : 86-95 (1991). También ver a van Dijk y van de inkel, Curr. Opin. Pharmacol . , 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos de humano pueden prepararse administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir los anticuerpos en respuesta a la provocación antigénica, pero cuyo locus endógeno se ha desabilitado , p.ej, ha inmunizado ratones xenomorfos (ver, p.ej, Patentes de EE.UU. Números 6 075 181 y 6 150 584 en cuanto a la tecnología XENOMOUSETM) . También ver, por ejemplo, Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE. UU, 103:3557-3562 (2006) en cuanto a anticuerpos de humano generados vía una tecnología de hibridoma de linfocito B de humano.

El término "región hipervariable" WHVR, " o "HV, " cuando es usado aquí, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman asas estructuralmente definidas. En términos generales, los anticuerpos comprenden seis HVRs; tres en el VH (Hl, H2, H3), y tres en el VL (Ll, L2, L3). En anticuerpos de origen natural, H3 y L3 muestran la mayor parte de diversidad de seis HVRs, y se cree que H3 particularmente desempeña un papel exclusivo en el conferimiento de la especificidad fina a anticuerpos. Ver, p.ej, el Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, editor, Prensa de Humano, Totowa, Nueva Jersey, 2003) . En efecto, los anticuerpos de camélido de origen natural que comprenden una cadena pesada sólo son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Ver, p.ej, Hamers-Casterman et al., -Vature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol . 3:733-736 (1996) .

Varias delineaciones de HVR se encuentran en uso y son abarcadas aquí . Las Regiones determinantes de complementariedad Kabat (CDR) se basan en la variabilidad de secuencia y son el más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)) . Chothia se refiere en cambio a la posición de las asas estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. .196:901-917 (1987)) . AbM HVRs representan un compromiso entre Kabat HVRs y Chothia asas estructurales, y se usan por el software de modelado de anticuerpo de AbM de Oxford Molecular. El "contacto" HVRs se basa en un análisis de las estructuras de cristal complejas disponibles. Los residuos de cada uno de estos HVRs se observan después.

Asa Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl † H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B Hl F H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 + Numeración de Kabat F Numeración de Chothia HVRs puede comprender "HVRs prolongado" como sigue: 24-36 o 24-34 (Ll), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en el VL y 26-35 (Hl) , 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos de dominio variable son numerados según Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones .

Los residuos "de FR" o "marco" están aquellos residuos de dominio variable además de los residuos HV como aquí definido.

El término "enumeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "posición aminoacídica que numera como en Kabat," y variaciones de lo mismo, se refiere al sistema que numera usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema que numera, la secuencia aminoacídica lineal actual puede contener a menos o aminoácidos adicionales correspondiente a un acortamiento de, o inserción en, un FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto aminoacídico individual (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (p.ej residuos 82a, 82b, y 82c, etc. según Kabat) después de la cadena pesada residuo de FR 82. El Kabat numerar de residuos puede determinarse para un anticuerpo determinado por la alineación a regiones de la homología de la secuencia del anticuerpo con Kabat "convencional" secuencia numerada.

El Kabat numerando del sistema es generalmente usado al referirse a un residuo en el dominio variable (aproximadamente residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) {p.ej, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest . 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)) . El sistema que numera de la "Unión Europea" o "índice EU" es generalmente usado al referirse a un residuo en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (p.ej, el índice EU mencionó en Kabat et al., supra). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la enumeración de residuos del anticuerpo IgGl EU de humano. A menos que no declarado otra cosa aguí, las referencias a cantidades de residuo en el dominio variable de anticuerpos significan la enumeración de residuos por Kabat sistema que numera. A menos que no declarado otra cosa aquí, las referencias a cantidades de residuo en el dominio constante de anticuerpos significan la enumeración de residuos por la Unión Europea sistema que numera (ver p.ej, Publicación PCT Número WO2006073941 ) .

El " anticuerpo madurado de una "afinidad es un con una o más modificaciones en el uno o más HVRs de lo mismo que dan como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo para el antígeno, comparado con un anticuerpo progenitor que no posee a aquellos modificación (ones) . En una modalidad, una afinidad el anticuerpo madurado tiene afinidades picomolares nanomolares o ni siquiera para el antígeno con especificidad de objetivo. La afinidad anticuerpos madurados puede producirse usando ciertos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, marca et al. Bio / Tecnología 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por el arrastre de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de HVR y/o residuos de marco se describe por, por ejemplo, Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci . EE. UU 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gen 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7):3310-9 (1995); y Hawkins y Al-, J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992).

Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia de origen natural o región Fe de variante de secuencia aminoacídica) de un anticuerpo, y varía con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras · de anticuerpo incluyen: unión de Clq y citotoxicidad de dependiente de complemento (CDC) ; unión al receptor Fe; citotoxicidad regulada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación lentificadora de receptores de superficie celular (p.ej receptor de Linfocito B) ; y activación de linfocito B.

El término "región Fe" aquí se utiliza definen una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fe de secuencia de origen natural y regiones Fe variantes. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pudieran variar, la región Fe de cadena pesada de IgG de humano es por lo general definida para estirar de un residuo aminoacídico en la posición Cys226, o de Pro230, al término del carboxilo de lo mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 según la Unión Europea sistema que numera) de la región Fe puede eliminarse, por ejemplo, durante producción o purificación del anticuerpo, o por recombinantemente técnico el ácido nucleico que codifica para una cadena pesada del anticuerpo. En consecuencia, una composición de anticuerpos intactos puede comprender a poblaciones de anticuerpo con todos los residuos K447 retirados, las poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 retirados, y las poblaciones de anticuerpo que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. En ciertas modalidades, la región Fe de una inmunoglobulina comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3.

El "dominio VH" de un IgG de humano, por lo general se extiende desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 113.

El "dominio CH2" de una región Fe de IgG de humano (también referido a como el dominio "de Cy2 " ) por lo general se extiende de todo el aminoácido 231 hasta aproximadamente aminoácido 340. El dominio CH2 es exclusivo en que no es estrechamente formado pares con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidrato ramificadas ligadas a N son interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula de natural intacta IgG. Ha sido especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto del apareamiento de dominio del dominio y ayuda estabilizan el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985).

El "dominio CH3" comprende la extensión de residuos C-terminales a un dominio CH2 en una región Fe (es decir de todo el residuo aminoacídico 341 hasta aproximadamente residuo aminoacídico 447 de IgG) .

Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una región Fe de secuencia de origen natural. "Las funciones efectoras" e emplificantes incluyen la unión al receptor Fe; unión de Clq; CDC; ADCC; fagocitosis; regulación lentificadora de receptores de superficie celular (p.ej receptor de Linfocito B; BCR) , etc. Las funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión (p.ej, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos.

Una "región Fe variante" comprende una secuencia aminoacídica que se diferencia de aquella de una región Fe de secuencia de origen natural en virtud de al menos una modificación aminoacídica, El término, "receptor de Fe" o "FcR" describen un receptor que se une con la región Fe de un antic erpo . En algunas modalidades, FcR es un humano de origen natural FcR. En algunas modalidades, FcR es el que que liga un anticuerpo • IgG (un receptor gamma) e incluye receptores del FcDRI, FcDRII, y subclases FcDRlll, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de aquellos receptores. Los receptores de FcDRII incluyen FcDRIIA (un "receptor de activación") y FcDRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias aminoacídicas similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de lo mismo. La activación del receptor FcDRIIA contiene un inmunoreceptor motivo de activación basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico . La inhibición del receptor FcDRIIB contiene un inmunoreceptor motivo de inhibición basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico. (ver, p.ej, Daéron, Annu. El Rev Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs son revisados, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo a aquellos para identificarse en el futuro, son abarcados por el término "FcR" aquí.

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula con especificidad de objetivo en la presencia de complemento. La activación de la vía de complemento clásica es iniciada por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase adecuada) , que se unen con su antígeno cognado. Evaluar la activación de complemento, un ensayo de CDC, p.ej, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202:163 (1996), puede llevarse a cabo. Las variantes polipeptídicas con secuencias aminoacídicas de región Fe alteradas (polipéptidos con una región Fe variante) y Clq aumentado o disminuido capacidad de unión se describen, p.ej, en la Patente de E.U. núm. 6 194 551 Bl y WO 1999/51642. También ver, p.ej, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la resistencia del total de suma de interacciones no covalentes entre un sitio de unión individual de una molécula (p.ej, un anticuerpo) y su colaborador de unión {p.ej, un antigeno). A menos que no indicado otra cosa, como se utiliza aquí, "la afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que reflexiona un 1:1 interacción entre miembros de un par de unión (p.ej, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su colaborador Y puede ser generalmente representada por la constante de disociación ( d) , el recíproco de la asociación constante (Ka) . La afinidad puede cuantificarse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos aquí. Los anticuerpos de afinidad baja generalmente ligan el antígeno de una manera lenta y/o tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de elevada afinidad generalmente ligan el antígeno más rápido y/o tienden a permanecer ligados más largo. Una variedad de métodos de medir la afinidad de unión se conoce en la técnica, cualquier de los cuales puede usarse con objetivos de la presente invención. Las modalidades ilustrativas y ejemplificantes específicas para medir la afinidad de unión se describen en el siguiente.

En ciertas modalidades, "KD" , "Kd", "Kd" o "el valor de Kd" según esta invención se cuantifican usando ensayos de resonancia plasmonica de superficie usando un BIACORE ©-2000 o un BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, Nueva Jersey) a 25°C con el antígeno inmovilizado chips de CM5 a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextrán carboximetilados (CM5, BIACORE, Inc.) son activados con el clorhidrato de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y iV-hidroxisuccinimida ( HS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio de 10 mm, pH 4.8, a 5ug/ml (~0.2u ) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5µ1 /minute para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína copulada. Después de la inyección de antígeno, la etanolamina de 1 m se inyecta para bloquear grupos sin reaccionar. Para cuantificaciones de cinética, las diluciones en serie del polipéptido, p.ej, anticuerpo de cadena completa, se inyectan en PBS con surfactante de TWEEN-20 del 0.05 % (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25µ1/????. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disolución (k0ff) se calculan usando Langmuir de uno a uno simple modelo de unión (la versión 3.2 de software de Evaluación de BIACORE) ajustándose simultáneamente la asociación y disolución sensorgrams . La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon- ^er, p.ej, a Chen et al., J". Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la constante de afinidad o de asociación excede 10^ m"1 s-1 por el ensayo de resonancia plasmónica de superficie antes, entonces la constante de afinidad o de asociación puede determinarse mediante usar un método de inactivación de fluorescencia que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 rail; la emisión = 340nm, 16nm pase de la banda) a 25°C de un 20nm anticuerpo de antiantígeno en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones cada vez mayores del antígeno como se cuantifica en un espectrómetro, como un flujo finalización espectrofotómetro equipado (Instrumentos de Aviv) o un espectrofotómetro de TM de SLM-AMINCO de 8000 series (ThermoSpectronic) con tubo de laboratorio agitado.

Una "constante de afinidad o de asociación" , una "velocidad de la asociación" , una "velocidad de asociación" o "kon" según esta invención también puede determinarse como se describe antes usando un BIACORE ®-2000 o un BIACORE ®-3000 sistema (BIAcore, Inc., Piscataway, Nueva Jersey) .

El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo," como se utiliza aquí, denota un grado suficientemente elevado de parecido entre dos valores numéricos el que el experto en la técnica tomaría en cuenta que la diferencia entre los dos valores es de poco o ningún biológico y/o significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica cuantificada por los valores (p.ej, valores de Kd) . En ciertas modalidades, la diferencia entre los dos valores es, por . e emplo, menos que aproximadamente el 50 %, menos que aproximadamente el 40 %, menos que aproximadamente el 30 %, menos que aproximadamente el 20 %, ylo menos que aproximadamente el 10 % como una función del valor de referencia / valor de comparación.

La frase "reducida sustancialmente, " o "sustancialmente diferente," como se utiliza aquí, denota un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos el que el experto en la técnica tomaría en cuenta que la diferencia entre los dos valores es de la significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica cuantificada por los valores (p.ej, valores de Kd) . En ciertas modalidades, la diferencia entre los dos valores es, por ejemplo, mayor que aproximadamente el 10 %, mayor que aproximadamente el 20 %, mayor que aproximadamente el 30 %, mayor que aproximadamente el 40 % , y/o mayor que aproximadamente el 50 % como una función del valor para la molécula de referencia / molécula de comparación.

"Purificado" significa que una molécula se encuentra en una muestra a una concentración de al menos el 95 % en peso, o al menos el 98 % en peso de la muestra donde está contenida .

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de otra al menos una molécula de ácido nucleico con la cual generalmente tiene que ver, por ejemplo, en su medio ambiente natural. Una molécula de ácido nucleico aislada adicionalmente incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que generalmente expresan para la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico se encuentra extracromosómicamente o a una posición cromosómica que es diferente de su posición cromosómica natural .

El término "vector", como se utiliza aquí, pretende se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual esto se ha unido. Un tipo del vector es un "plásmido", que se refiere a un ADN bicatenario circular los segmentos de ADN hacia donde adicionales pueden ligarse. Otro tipo del vector es un vector de fago. Otro tipo del vector es un vector viral, los segmentos de ADN donde adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Los ciertos vectores tienen capacidad de la replicación autónoma en una célula hospedera hacia donde éstos se introducen (p.ej, los vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos) . Otros vectores (p.ej, vectores de mamífero no episómicos) pueden estar integrados en el genoma de una célula hospedera mediante la introducción en la célula hospedera, y así son replicados junto con el genoma hospedero. Los Más aún, ciertos vectores tienen capacidad de dirigir la expresión de genes a los cuales éstos son funcionalmente unidos. Los vectores son referidos a aquí como "vectores recombinantes de expresión, " o simplemente, "vectores de expresión." En términos generales, los vectores de expresión de la utilidad en métodos de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos . En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden usar de modo indistinto ya que el plásmido es la forma el más comúnmente usada del vector.

El "polinucleótido" , o "ácido nucleico," como se utiliza aquí, se refiere a polímeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluye el ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleotidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por la polimerasa de ADN o ARN o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleotidos modificados, como nucleotidos metilados y sus análogos. Si presente, la modificación a la estructura nucleotídica puede ser conferida antes o después de la unidad del polímero. La secuencia de nucleotidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos . Un polinucleótido puede comprender la modificación (ones) elaborada después de la síntesis, como la conjugación a un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "gorras", substitución de uno o más de los nucleotidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas el como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados [p.ej, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y con enlaces cargados {p.ej, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.), los que contienen porciones colgantes, el como, por ejemplo, proteínas (p.ej, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señalización, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (p.ej, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (p.ej, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquiladores, a aquellos con enlaces modificados (p.ej, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) Así como formas no modificadas de los polinucleótidos (s) . Adicionalmente, cualquier de los grupos de hidroxilo generalmente presentan en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos de fosfonato, grupos de fosfato, protegidos por grupos protectores convencionales, o activó para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede ser conjugado a sólido o semisoportes sólidos. Los 5' y 3' terminal ¡vaya! pueden ser fosforilados o sustituidos con aminas o porciones de grupo orgánicas que coronan de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden ser derivatizados a grupos protectores convencionales . Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de ribosa o azúcares de desoxirribosa que son generalmente conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2 '-O-methyl-, 2 '-O-allyl-, 2 '- fluoro-o 2 ' -azido-ribose, análogos de azúcar carbocíclicos , a - azúcares anoméricos, azúcares epiméricos, como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, pseudoheptulosas , análogos acíclicos, y análogos nucleosídicos básicos, como el metilrribósido . Los uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser sustituidos por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, entre otras cosas, modalidades donde el fosfato es sustituido por P (0) S ("tioato"), P (S) S ( "ditioato" ) , (0) NR2 ("amidato"), P (0) R, P (0) 0', CO, o el CH2 ( " formacetalo" ) , donde cada R o R' son indistintamente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) opcionalmente conteniendo un éter (-0-) enlace, arilo, alquenilo, cicloalquilo , cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en una necesidad polinucleotídica ser idéntico. La descripción precedente aplica a todos los polinucleótidos referidos a aquí, incluyendo ARN y ADN.

El "oligonucleótido" , como se utiliza aquí, generalmente se refiere a polinucleótidos cortos, generalmente monocatenarios, generalmente sintéticos que son generalmente, pero no necesariamente, menos que aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción antes para polinucleótidos es igualmente y completamente aplicable a oligonucleótidos .

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora ligada funcionalmente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen a un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión al ribosoma. Las células eucarióticas se conocen para utilizar a promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores .

El ácido nucleico es "ligado funcionalmente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia nucleoacídica . Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor se liga funcionalmente al ADN para un polipéptido si esto se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o el potenciador se ligan funcionalmente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se liga funcionalmente a una secuencia codificadora si se coloca para facilitar la traducción. En términos generales, "ligado funcionalmente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguos, y, en caso de un líder secretor, contiguos y en la lectura de la fase. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se lleva a cabo por el ligamiento sitios de restricción a convenientes. Si los sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótido sintéticos o los ligadores se usan de acuerdo con la práctica convencional .

Como se utiliza aquí, las expresiones "célula", "línea celular," y "cultivo celular" se usan de modo indistinto y todas las designaciones incluyen la progenie. Así, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sometida primaria y cultivos derivados a partir de eso sin hacer caso de la cantidad de transferencias. Esto también es entendido que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debida de deliberar o mutaciones involuntarias. La progenie de mutante que tienen la misma función o actividad biológica que detectado para en la célula al principio transformada se incluye. Donde las designaciones distintas son conceptual!zadas , será traslúcido del contexto.

Como se utiliza aquí, "conjunto de codón" se refiere a un conjunto de diferentes secuencias de triplete nucleotídicas usadas a codificar para aminoácidos variantes deseados. Un conjunto de oligonucleótidos puede sintetizarse, por ejemplo, por la síntesis en fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes nucleotídicos proporcionados por el conjunto de codón y esto codificará para el grupo deseado de aminoácidos. Una forma convencional de la designación de codón es la del código de IUB, que se conoce en la técnica y descrito aquí.

Un conjunto de codón por lo común es representado por 3 mayúsculas en la cursiva, eg. NNK, NNS, XYZ, DVK y lo similar. Un "conjunto de codón no aleatorio", como se utiliza aquí, se refiere a un conjunto de codón que codifica para aminoácidos selectos que realizan parcialmente, preferentemente completamente, los criterios para la selección aminoacídica como se describe aquí. La síntesis de oligonucleótidos con "la degeneración" nucleotídica seleccionada a ciertas posiciones es conocida en que la técnica, por ejemplo el enfoque NETO (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Los conjuntos de oligonucleótidos que tienen ciertos conjuntos de codón puede sintetizarse usando sintetizadores de ácido nucleico comerciales (disponible de, por ejemplo, Applied Biosystems, Críe la Ciudad, California), o puede obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, Maryland) . Por lo tanto, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tiene un conjunto de codón particular incluirá por lo común una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el conjunto de codón dentro de la secuencia total. Los oligonucleótidos, usados como según la invención, tienen secuencias que permiten la hibridación a una plantilla de ácido nucleico de dominio variable y también, pero hace no necesariamente, puede incluir sitios de enzima de restricción útiles para, por ejemplo, clonando objetivos.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. (Proteína de 1995 Eng, 8 ( 10 ): 1057-1062 ) . Brevemente, estos anticuerpos comprenden a un par de tándem segmentos de Fd (VH-CHl-VH-CHl) que, conjuntamente con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman a un par de antígeno regiones de unión. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecífieos o monoespecíficos .

Como se utiliza aquí, "genoteca" se refiere a una pluralidad de anticuerpo o secuencias de fragmento de anticuerpo (por ejemplo, las igGs variantes de la invención) , o los ácidos nucleicos que codifican para estas secuencias, las secuencias son diferentes en la combinación de aminoácidos variantes que se introducen en estas secuencias según los métodos de la invención.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia aminoacídica" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos aminoacídicos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr identidad de secuencia de por ciento máxima, y no tomar en cuenta cualquier sustitución conservadora como parte de identidad de secuencia. La alineación con objetivos de determinar la identidad de secuencia aminoacídica de por ciento puede lograrse de diversos modos que se incluyen dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando el software disponible al público, como el software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la ¦ alineación máxima sobre las de cadena completa de las secuencias que se comparan. Con objetivos aquí, sin embargo, los valores de identidad de secuencia aminoacídica de % se generan usando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2. El programa de computadora ALIGN-2 de comparación de secuencia es publicado por Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con la documentación de usuario en la Oficina de derechos de autor de E.U. , Washington D.C., 20559, donde es registrado bajo el Registro de Derechos de autor de E.U. núm. TXU510087. ALIGN-2 programa es disponible al público de Genentech, Inc., San Francisco del Sur, California, o puede ser compilado del código fuente. ALIGN-2 programa debería ser compilado para el uso en un sistema operativo UNIX, UNIX preferentemente digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia se configuran por ALIGN-2 programa y no varían.

En situaciones donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia aminoacídica, la identidad de secuencia aminoacídica de % de una secuencia aminoacídica determinada un a, con, o contra una secuencia aminoacídica determinada B (que puede ser alternativamente expresado como una secuencia aminoacídica determinada un que tiene o comprende una cierta identidad de secuencia aminoacídica de % a, con, o contra una secuencia aminoacídica determinada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y donde X es la cantidad de residuos aminoacídicos marcados como correspondencias idénticas por el programa ALIGN de alineación de secuencia la alineación del 2 en que programa de A y B, y donde Y es la cantidad total de residuos aminoacídicos en B. Esto se valorará que donde la longitud de la secuencia aminoacídica A no es igual a la longitud de la secuencia aminoacídica B, la identidad de secuencia aminoacídica de % de un a B no igualará la identidad de secuencia aminoacídica de % de B a A. A menos que específicamente no declarado otra cosa, todos los valores de identidad de secuencia aminoacídica de % usados aquí se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando ALIGN-2 programa de computadora.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que tiene forma para permitir a la actividad biológica del principio activo ser efectiva, y que no contiene ningunos componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación se administraría. Las formulaciones pueden ser estériles.

Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas .

"Los portadores" como se utiliza aquí incluyen portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, o estabilizadores que son no tóxicos a la célula o mamífero que se expone además en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el portador fisiológicamente aceptable es una solución amortiguada de pH acuosa. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores, como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; dé bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) polipéptido; proteínas, como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos , como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; alcoholes polihídricos , como manitol o sorbitol; contraiones que forman la sal, como sodio; y/o surfactantes no iónicos, como TWEEN ™, polietilenglicol (PEG) , y PLURONICS IM Anticuerpos La presente solicitud se relaciona con inmunoglobulinas de igG variante que incluyen modificaciones aminoacídicas que alteran las propiedades biológicas de IgG. Las inmunoglobulinas variantes de la presente solicitud incluyen anticuerpos que muestran la unión alterada a la proteína A comparado con los anticuerpos naturales .

Los anticuerpos son proteínas que muestran la especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos de origen natural son glucoproteínas por lo general heterotetraméricas de aproximadamente 150 000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios con regularidad separados . Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante a su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera es alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera es alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una interconexión entre dominios variables de cadena pesada y la luz .

Según la secuencia aminoacídica de la región constante de sus cadenas pesadas , los anticuerpos o las inmunoglobulinas pueden ser asignados a diferentes clases. Hay cinco tipos principales de inmunoglobulinas: igA, igD, IgE, IgG e IgM, y varios de éstos pueden estar divididos adicionalmente en subclases (isotipos), p.ej. IgGl, IgG2, IgG3 , e IgG4; IgAl e IgA2. Una variedad del humano IgGl, IgG2, lgG3 , y alotipos lgG4 se ha descrito (revisado por la Temperatura de fusión LeFranc y G. LeFranc en: "The Human IgG Subclasses," F. Shakib (ed.), pp. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990) ) . Los diferentes isotipos de la clase de IgG, incluyendo IgGl, IgG2s, IgG3, e IgG4, tienen propiedades físicas, biológicas, y clínicas exclusivas. El humano IgGl es el anticuerpo el más comúnmente usado con objetivos terapéuticos, y la mayoría de estudios técnicos se ha construido en este contexto.

Fragmentos de anticuerpo La presente invención abarca fragmentos de anticuerpo.

Del particular interés son anticuerpos que comprenden las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras . En ciertas modalidades, los fragmentos de anticuerpo son los fragmentos de inmunoglobulinas variantes (IgGs) que comprende regiones Fe . Los fragmentos de anticuerpo pueden generarse por medios tradicionales, como la digestión enzimática, o por técnicas de recombinación genética.

Diversos métodos se han revelado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan vía la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, p.ej, Morimoto et al., Diario de Métodos Bioquímicos y Biofísicos 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Ciencia, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por células hospederas recombinantes . Fab, Fv y los fragmentos de anticuerpo de ScFv pueden expresarse todos en y secretado de E. coli, así permitiendo la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las genotecas de fago de anticuerpo. En ciertas modalidades. Fab fragmentos de ' -SH puede ser directamente recuperado de E. coli y químicamente copulado para formar F (ab' ) 2 fragmentos (Cárter et al., Bio / Tecnología 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, F (ab') 2 fragmentos pueden ser aislados directamente del cultivo de célula hospedera recombinante . Otros métodos para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes al practicante experto. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", p.ej, como se describe en la Patente Estadounidense Número 5 641 870, por ejemplo. Los anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos .

Anticuerpos humanizados La invención abarca anticuerpos humanizados. En ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados son igGs variantes humanizadas con una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fe con relación a IgG natural . Diversos métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos aminoacídicos introducidos en ello de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos son comúnmente referidos como residuos "de importación", que son por lo común obtenidos de un dominio variable "de importación" . La humanización puede ser esencialmente llevada a cabo llevando a cabo el método de invierno y compañeros de trabajo (Jones et al. (1986) Naturaleza 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Naturaleza 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Ciencia 239:1534-1536), sustituyendo secuencias de región hipervariable para las secuencias correspondientes de un anticuerpo de humano. En consecuencia, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. No. 4,816,567) donde sústancialmente menor que un dominio variable de humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos por lo común de humano donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La opción de dominios variables de humano, ambos ligero y pesado, para usarse en la fabricación de los anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. Según el llamado método "mejor y adecuado", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se detecta contra la genoteca completa de secuencias de dominio variable de humano conocidas . La secuencia de humano que es la más cercana a aquel del roedor es aceptada entonces como el marco de humano para el anticuerpo humanizado. Ver, p.ej, Sims et al. (1993) J. Immunol . 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos de humano de un subgrupo particular de luz o cadenas pesadas . El mismo marco se puede usar para varios diferentes anticuerpos humanizados. Ver, p.ej, a Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU, 89:4285; presta, et al. (1993) J". Immunol., 151:2623.

Es adicionalmente y generalmente deseable que los anticuerpos sean humanizados con la retención de la elevada afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un método, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias parenterales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y están familiarizado a los expertos en la técnica. Los programas de computadora están disponibles que ilustran y muestran estructuras estructurales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas . La inspección de estas pantallas permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de ligar su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinado del receptor e importar secuencias de modo que la característica de anticuerpo deseada, como la afinidad aumentada para el antígeno (s) con especificidad de objetivo, se logre. En términos generales, los residuos de región hipervariable están directamente y el más sustancialmente implicados en la influencia en la unión de antígeno.

Anticuerpos de humano En ciertas modalidades, los anticuerpos de humano de la presente invención son IgGs variantes de humano con una o más modificaciones aminoacídicas en la región VH con relación a IgG natural. Los anticuerpos de humano pueden construirse combinando' la secuencia (s) de dominio variable de clon de Fv seleccionada de genotecas de despliegue de fagos derivadas por el humano con secuencias (s) de dominio constante de humano conocidas como se describe antes. Alternativamente, los anticuerpos monoclónicos de humano pueden elaborarse por el método de hibridoma. La mieloma de humano y las líneas celulares de heteromieloma de ratón y de humano para la producción de anticuerpos monoclónicos de humano se han descrito, por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technigues and Applications, pps 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) .

Es posible ahora producir animales transgénicos (p.ej ratones) que tienen capacidad, mediante inmunización, de producir un repertorio lleno de anticuerpos de humano en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, esto se ha descrito que la eliminación homozigótica de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) gen en quimérico y ratones de mutante de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógena. Trasladarse de la matriz de gen de inmunoglobulina de línea germinal de humano en los ratones de mutante de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos de humano mediante provocación de antígeno. Ver, p.ej, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci EE. uu, 90 : 2551 ( 1993 ) ; Jakobovits et al., Naturaleza, 362 : 255 ( 1993 ) ; Bruggermann et al., Año en Iwmunol . , 7: 33 ( 1993 ) .

El arrastre génico también puede utilizarse derivan anticuerpos de humano del no humano, p.ej de roedor, anticuerpos, donde el anticuerpo de humano tiene afinidades similares y especificidades al anticuerpo no humano inicial. Según este método, que también es la llamada "impresión de epítopo", la región variable pesada p la región variable de cadena ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por métodos de despliegue de fagos como se describe aguí es sustituido por un repertorio de genes de dominio V de humano, creando a una población de cadena de cadena/humano no humana scFv o quimeras de Fab. La selección con el antígeno da como resultado el aislamiento de una cadena de cadena/humano no humana scFv quimérico o Fab donde la cadena de humano restaura el sitio de unión al antígeno (parátopo) destruido mediante la eliminación de la cadena no humana correspondiente en el clon de despliegue de fagos primario, es decir el epítopo gobierna (imprime) la opción del colaborador de cadena de humano. Cuando el proceso se repite a fin de sustituir la cadena no humana restante, un anticuerpo de humano se obtiene (ver el P.C. WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos por la injerta de CDR, este método proporciona anticuerpos completamente de humano, no que tenga ningún FR o residuos de CDR del origen no humano .

Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclónicos que tienen especificidades de unión para al menos dos diferentes antígenos. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos biespecíficos con una o más modificaciones aminoacídicas en la región VH con relación al anticuerpo natural. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos de humano o humanizado. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse localizan a agentes citotóxicos a células que expresan para un antígeno con especificidad de objetivo. Estos anticuerpos poseen un brazo con especificidad de objetivo y de unión al antígeno y un brazo que liga a un agente citotóxico, el como, p.ej, saporina, antiinterferón - , vinca alcaloide, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo. En ciertos anticuerpos, las especificidades de unión son para IL-4 e IL-13. Los anticuerpos 'biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de cadena completa o fragmentos de anticuerpo .

Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades ( ilstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). A causa del surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo un tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que es por lo general hecha por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática, y las producciones de producto son bajas. Los procedimientos similares se describen en WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655 (1991).

Según un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de antígeno del anticuerpo) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos la parte de la bisagra, CH2 , y regiones CH3. En ciertas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1) , conteniendo el sitio necesario para la unión de cadena ligera, se encuentra en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, de ser deseado, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y son co-transfectados en un organismo hospedero adecuado. Esto prevé la gran flexibilidad en la regulación de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en modalidades cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la estructura proporcionan las producciones óptimas. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificadoras para dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de ninguna significancia particular.

En una modalidad de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuesto por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena ligera de la cadena pesada de inmunoglobulina híbrido (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubre aquella esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica prevé un modo fácil de la separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales de generar anticuerpos biespec ficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Métodos en Enzimología, 121:210 (1986).

Según otro enfoque, la interconexión entre un par de moléculas de anticuerpo puede manipularse genéticamente para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo celular recombinante . La interconexión comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, uno o más pequeñas cadenas secundarias aminoacídicas de la interconexión de la primera molécula de anticuerpo son sustituidas por cadenas secundarias más mayores (p.ej tirosina o triptófano) . "Las cavidades" compensadoras del tamaño idéntico o similar a cadena (s) secundarias mayor se forman en la interconexión de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo cadenas secundarias aminoacídicas mayores por más pequeños (p.ej alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo a aumentar la producción del heterodímero sobre otros productos finales no deseados , como homodímeros .

Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heterocon ugados " . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a la avidina, otro a la biotina. Los anticuerpos han sido, por ejemplo, propuestos para apuntar con acción selectiva hacia células de sistema inmunitario a células no deseadas (Patente de E.U. núm. 4 676 980 ) , y para el tratamiento de la infección de VIH (WO 91 / 003 60 , WO 92 / 00373 , y EP 03089 ) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse usando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de E.U. núm. 4 676 980 , junto con varios métodos de entrecruzamiento .

La tecnología "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU, 90 : 6444- 6448 ( 1993 ) han proporcionado un mecanismo alternativo a elaborar fragmentos de anticuerpo' biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) por un ligador que es demasiado corto para permiten el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento son obligados a aparearse con los dominios de VL y VH complementarios de otro fragmento, así formando dos siti'os de unión al antígeno (parátopos). Otra estrategia de elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de Fv monocatenario (sFv) dímeros también se ha descrito; Ver a Gruber et al., J. Immunol., 152 : 5368 ( 1994 ) .

Los anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, los anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) .

Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser interiorizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa para un antígeno al cual los anticuerpos ligan. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distinto a de la clase de IgM) con tres o más sitios de unión al antigeno (parátopos) (anticuerpos p.ej tetravalentes), que puede ser fácilmente producido por la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica para las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antigeno (parátopos) . En ciertas modalidades, el dominio de dimerización comprende (o comprende) una región Fe o una región de bisagra. En este caso, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más terminal de amino de sitios de unión al antígeno (parátopos) a la región Fe. En ciertas modalidades, un anticuerpo multivalente comprende (o comprende) tres hasta aproximadamente ocho sitios de unión al antígeno (parátopos) . En un la modalidad, un anticuerpo multivalente comprende (o comprende) cuatro sitios de unión al antígeno (parátopos) . El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipept dica (por ejemplo, dos cadenas polipeptídicas) , donde la cadena (s) polipeptídicas comprende dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena (s) polipeptídicas puede comprender vDl-(Xl) n-VD2-(X2) n-Fc, donde VDl es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipeptidica de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la cadena (s) polipeptídicas puede comprender: cadena de región VH-CHl-VH-CHl-Fc del ligador VH-CHl-flexible . El anticuerpo multivalente aquí puede comprender al menos adicionalmente dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente aquí puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos hasta aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, adicionalmente comprenden un dominio CL.

Anticuerpos de dominio individual En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de dominio individual que comprende una región Fe. En ciertas modalidades, el anticuerpo de dominio individual tiene una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fe con relación a igG natural . Un anticuerpo de dominio individual es una cadena polipeptídica individual que comprende todos o una porción del dominio variable de cadena pesada o todos o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo.

Modificaciones de anticuerpo En ciertas modalidades, la modificación (ones) de secuencia aminoacídica de las inmunoglobulinas descritas aquí es contemplada. En ciertas modalidades, las modificaciones comprenden una o más modificaciones aminoacídicas a las IgGs variantes de la presente invención. En ciertas modalidades, esto puede desearse para alterar adicionalmente la afinidad de unión, semivida in vivo y/o otras propiedades biológicas de las IgGs variantes de la presente invención. En ciertas modalidades, las modificaciones aminoacídicas comprenden una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fe no descrita aquí. Las secuencias aminoacídicas modificadas de las IgGs variantes pueden prepararse cambios al introducirse adecuados en la secuencia nucleotídica que codifica para el anticuerpo, o por la síntesis peptídica. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, la eliminación de, y/o inserciones en y/o substituciones de, residuos dentro de las secuencias aminoacídicas del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción, y substitución puede elaborarse para llegar al constructo final, a condición de que el constructo final posea las características deseadas. Las modificaciones aminoacídicas pueden introducirse en la secuencia aminoacídica de anticuerpo sometida en el período de tiempo que la secuencia se elabora.

Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que se prefieren posiciones para la mutagénesis se llama "la mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Pozos (1989) Ciencia, 244:1081-1085. Aquí, un residuo o el grupo de residuos con especificidad dé objetivo se identifican {p.ej, residuos cargados, como arg, áspid, su, lys, y glu) y sustituido por un neutro o negativamente cargaron que el aminoácido (p.ej, alanina o polialanina) afectara la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas posiciones aminoacídicas que demuestran la sensibilidad funcional frente a las substituciones entonces son refinadas al introducirse adicionalmente u otras modificaciones a, o para, los sitios de substitución. Así, mientras el sitio para introducir una modificación de secuencia aminoacídica es predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí no tiene que ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación a un sitio determinado, ala exploración o mutagénesis aleatoria se lleva a cabo en el codón con especificidad de objetivo o región y las inmunoglobulinas expresadas para se detectan para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia aminoacídica incluyen amino - y/o fusiones terminales por el carboxilo que abarcan de longitud de un residuo de polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones de intrasecuencia de residuos aminoacídicos en forma individual o múltiple. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo methionyl N-terminal. Otras modificaciones insertional de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el N-o el extremo C-terminus del anticuerpo a una enzima (p.ej para el ADEPTO) o un polipéptido que aumenta la semivida sérica del anticuerpo.

En ciertas modalidades, la IgG variante de la presente invención es alterada que aumentan o disminuyen el grado al cual el anticuerpo está glucosilado. La glucosilación de polipéptidos es por lo común ligada a N o ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión de una porción de carbohidrato a cadena secundaria de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a cadena secundaria de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilacion potencial. La glucosilacion ligada a 0 se refiere a la unión de una de N-acetilgalactosamina de azúcares, galactosa, o xilosa a hidroxiaminoácido, el más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también puedan usarse.

La adición o la eliminación de sitios de glucosilación al anticuerpo son convenientemente llevadas a cabo alterando la secuencia aminoacidica el que uno o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glucosilación ligados a N) se forma o retirado. La modificación también puede elaborarse mediante la adición, eliminación, o la substitución de uno o más serina o residuos de treonina de la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación ligados a O) .

El carbohidrato unido a la región Fe de las IgGs variantes puede ser alterado. Los anticuerpos de origen natural producidos por células de mamífero por lo común comprenden un oligosacárido ramificado, biantenario que es generalmente unido por un N-enlace a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, p.ej, a Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, p.ej, ma osa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa unida a GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas modalidades, las modificaciones del oligosacárido en una IgG variante de la invención pueden elaborarse a fin de crear IgGs variantes con propiedades ciertas además mejoradas, Por ejemplo, las modificaciones de anticuerpo se proporcionan que tienen una estructura de carbohidrato que carece de la fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Las modificaciones pueden haber mejorado la función de ADCC . Ver, p.ej, número de Publicación de Patente de E.U. EE.UU 2003/0157108 (Presta., L.) ; 2004/0093621 estadounidense (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Los ejemplos de publicaciones modificaciones de anticuerpo relacionadas con, "defucosiladas " o "deficientes por la fucosa" incluyen: 2003/0157108 estadounidense; WO 2000/61739; WO 2001/29246; 2003/0115614 estadounidense; 2002/0164328 estadounidense; 2004/0093621 estadounidense; 2004/0132140 estadounidense; 2004/0110704 estadounidense; 2004/0110282 estadounidense; 2004/0109865 estadounidense; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140 ; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces anticuerpos defucosilados de producir incluyen células de CHO Lecl3 deficientes en la fucosilacion protéica (Ripka et al. Arco. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); Pat Appl estadounidense, Ningún 2003/0157108 estadounidense Al, Presta., L; y WO 2004/056312 Al, Adams eü al., sobre todo al Ejemplo 11), e inactivan los genes líneas celulares, como gen alfa-1 , 6-fucosiltransferaso, FUT8, inactivación de genes células de CHO (ver, p.ej. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4):680-688 (2006); y WO2003/085107) .

Las modificaciones de anticuerpo son proveídas adicionalmente de oligosacáridos bisecados, p.ej, donde un oligosacárido biantenario unido a la región Fe del anticuerpo es bisecado por GlcNAc . Las variantes de anticuerpo pueden haber reducido la fucosilación y/o haber mejorado la función de ADCC. Los ejemplos de las modificaciones de anticuerpo se describen, p.ej, en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de E.U. núm. 6 602 684 (Umaña et al.); y 2005/0123546 estadounidense (Umaña et al.). Las modificaciones de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe se proporcionan también. Las módificaciones de anticuerpo pueden haber mejorado la función de CDC. Las modificaciones de anticuerpo se describen, p.ej, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

En ciertas modalidades, la invención contempla unas modificaciones de anticuerpo que posee a unos, pero no todas las funciones efectoras, que la elaboran un candidato deseable por muchas solicitudes donde la vida media del anticuerpo in vivo es importante que las aún ciertas funciones efectoras (como el complemento y ADCC) sean innecesarias o deletéreas. En ciertas modalidades, las actividades de Fe del anticuerpo se cuantifican sólo para asegurarse de que las propiedades deseadas se mantienen. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo pueden llevarse a cabo para confirmar la reducción/reducción de CDC y/o actividades ADCC. Por ejemplo, el receptor de Fe (FcR) los inmunoensayos pueden llevarse a cabo para asegurarse de que el anticuerpo carece de FcDR que liga (por lo tanto probablemente careciendo de la actividad de ADCC) , pero mantiene FcRn capacidad de unión. Las células primarias para regular ADCC, células de K, expresan para Fe .RUI sólo, mientras que los monocitos expresan para Fe . RI, Fe .RII y Fe .RUI. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. El Rev Immunol . 9:457-92 (1991) . Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la Patente de EE.UU. No. 5 500 362 (ver, p.ej. Hellstrom, yo., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU 83 : 7059-7063 (1986)) y Hellstrom, yo et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU 82:1499-1502 (1985); 5 821 337 (ver a Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) . Alternativamente, los métodos de ensayos no radiactivos pueden emplearse (ver, por ejemplo, ACTI ™ ensayo de citotoxicidad no radiactivo para la citometría de flujo (Vista de Montaña de CellTechnology, Inc, California); y CytoTox 96 ensayo de citotoxicidad no radiactivo ® (Prosúper, Madison, Wisconsin) ) . Las células efectoras útiles para los ensayos incluyen la sangre periférica células mononucleares (PBMC) y Asesino Natural (NK) células. Alternativamente, o además, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, p.ej, en un modelo experimental en animal como descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU 95:652-656 (1998). Los inmunoensayos de Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de ligar Clq y por lo tanto carece de la actividad CDC. Para evaluar la activación de complemento, un ensayo de CDC puede llevarse a cabo (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Iwmunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Sangre 103:2738-2743 (2004)). La unión de FcRn y las determinaciones de depuración/vida media in vivo también pueden llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, a Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12) .1759-1769 (2006)).

Otras modificaciones de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacidicas se proporcionan. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen las regiones hipervariables , pero las modificaciones de FR también son contempladas. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el titulo de "substituciones preferidas." Más cambios sustanciales, las "substituciones ejemplificantes denominadas" se proporcionan en la Tabla 1, o como adicionalmente descrito después en la referencia a clases aminoacidicas . Las sustituciones aminoacídicas pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos detectados, p.ej, para una actividad deseada, como la unión de antígeno mejorada, inmunogenicidad disminuida, ADCC mejorado o CDC, etc.

TABLA 1 Residuo original Substituciones Substituciones ejemplificantes preferidas Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys ; Gln Arg Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp ; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; lie; Val; Met ; Ala; Phe He Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; He Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Tyr Pro (P) He; Ala; Tyr Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Tr ,- Phe; Thr ; Phe Val, (V) Ser He; Leu; Met; Ala; Norleucina Leu Phe; Las modificaciones en las propiedades biológicas de un anticuerpo pueden llevarse a cabo seleccionando substituciones que afectan (a) la estructura de la estructura primaria polipeptídica en el área de la substitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio con especificidad de objetivo, o (c) el volumen de cadena secundaria. Los aminoácidos pueden ser agrupados según el parecido en las propiedades de sus cadenas secundarias (en A. L. Lehninger, en Bioquímica, segundo editor, pps 73-75, Digno Editores, Nueva York (1975)): (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P), P e (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polar sin carga: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) ácido: Asp (D) , Glu (E) (4) alcalino: Lys (K) , Arg (R) , His(H) Alternativamente, los residuos de origen natural pueden dividirse en grupos basados en propiedades de cadena secundaria comunes : (1) hidrofóbico : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) neutro hidrofílico: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) alcalino: His, Lys, Arg; (5) los residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán el cambio de un miembro de una de estas clases para otra clase. Los residuos sustituidos también .pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadora o, en los sitios (no conservados) restantes.

Un tipo de la modificación sustitutiva implica substituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo progenitor (p.ej un anticuerpo humanizado o de humano) . En ciertas modalidades, el anticuerpo progenitor es la IgG variante de ejemplar natural {p.ej, una IgG variante de la invención sin cualquier modificación adicional en su secuencia aminoacídica) . En términos generales, los anticuerpos resultantes seleccionados para el siguiente desarrollo tendrán modificado (p.ej, mejorado) propiedades biológicas con relación al anticuerpo progenitor del cual éstos se generan. Modifcatión sustitutivo ejemplificante es una afinidad anticuerpo madurado, que puede ser convenientemente generado usando métodos de maduración de afinidad basados en el despliegue de fagos. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (p.ej 6-7 sitios) son mutados para generar todas las posibles sustituciones aminoacídicas a cada sitio. Los anticuerpos así generados se muestran de partículas de fago filamentosas como fusiones con al menos la parte de un fago recubre la proteína (p.ej, el gen III producto de M13) envasado dentro de cada partícula. Los anticuerpos mostrados por el fago son detectados entonces para su actividad biológica (p.ej afinidad de unión) . A fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para la modificación, explorando la mutagénesis (p.ej, exploración de alanina) puede llevarse a cabo para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen considerablemente a la unión de antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso para analizar una estructura de cristal del complejo de anticuerpo del antígeno para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Los residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos por la substitución según métodos conocidos en la técnica, incluyendo los elaborados aquí. Una vez que los anticuerpos modificados se generan, el panel de anticuerpos se somete a la prueba de detección usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos aquí, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el siguiente desarrollo.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para la secuencia aminoacídica del anticuerpo modificado {p.ej, IgG variante modificada) se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, entre otras cosas, el aislamiento de una fuente natural (en caso de modificaciones de secuencia aminoacídica de origen natural) o preparación por el regulado por el oligonucleótido (o dirigido al sitio) mutagénesis, mutagénesis de PCR, y mutagénesis por inserción de un cásete de un anticuerpo modificado preparado anteriormente o una versión no modificada del anticuerpo.

De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que en ciertas modalidades, una modificación de anticuerpo de la invención puede comprender una o más modificaciones comparando con la IgG variante de ejemplar natural (p.ej, una IgG variante de la invención sin cualquier modificación adicional en su secuencia aminoacídica) . Estas modificaciones de anticuerpo que comprenden modificaciones adicionales mantendrían sin embargo sustancialmente las mismas características requeridas para la utilidad terapéutica comparando con la IgG variante de ejemplar natural.

En otro aspecto, la invención proporciona modificaciones de anticuerpo que comprenden modificaciones en la interconexión de polipéptidos de Fe que comprenden la región Fe, donde las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido de Fe y una cavidad en un segundo polipéptido de Fe, donde la protuberancia tiene capacidad de ubicarse en la cavidad para promover' la formación de complejos de los primeros y segundos polipéptidos de Fe. Los métodos de generar anticuerpos con estas modificaciones se conocen en la técnica, p.ej, como se describe en la Patente Estadounidense Número 5 731 168.

Incluso en otro aspecto, esto puede desearse para crear la cisteína anticuerpos manipulados genéticamente, p.ej, "thioMAbs", los donde uno o más residuos de un anticuerpo son sustituidos con residuos de cisteína. En ciertas modalidades, los residuos sustituidos ocurren sitios a accesibles del anticuerpo. Sustituyendo aquellos residuos con la cisteína, los grupos de tiol reactivos son así colocados los sitios a accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otras porciones, como porciones de fármaco o porciones de fármaco del ligador, como se describe adicionalmente aquí. En ciertas modalidades, cualquiera o más de los siguientes residuos pueden ser sustituidos con la cisteína: V205 (Kabat numerar) de la cadena ligera; A118 (Unión Europea numerar) de la cadena pesada; y S400 (Unión Europea numerar) de la región Fe de cadena pesada.

Derivados de anticuerpo En ciertas modalidades, las IgGs variantes de la presente invención pueden modificarse aún más para contener porciones no proteicas adicionales que se conocen en la técnica y disponible en el acto. En ciertas modalidades, la igG variante puede ser conjugada con un agente citotóxico. En ciertas modalidades , la IgG variante a la cual el agente citotóxico es ligado es interiorizada por la célula, dando como resultado la mayor eficacia terapéutica del conjugado en la eliminación de la célula a la cual esto liga.

En ciertas modalidades, las porciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo son polímeros hidrosolubles .

Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, entre otras cosas, el poliétilenglicol (PEG) , los copolímeros del etilenglicol / propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrán, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de anhídrido de etileno / copolímero de anhídrido maléico, poliaminoácidos (homopolimeros o copolímeros aleatorios), y dextrán o poli (n-vinil pirrolidona) poliétilenglicol, homopolimeros de propropilenglicol , copolímeros de óxido de óxido/etileno de prolipropileno, polioles polioxietilados (p.ej, glicerol) , alcohol polivinílico, y mezclas de lo mismo. El propionaldehído de poliétilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si más de un polímero está fijado, éstos pueden ser las moléculas iguales o diferentes. En términos generales, la cantidad y/o el tipo de polímeros usados para la derivatización pueden determinarse con base en consideraciones incluyendo, entre otros, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo para ser mejorado, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

En otra modalidad, los conjugados de un anticuerpo y porción no proteica que puede ser selectivamente calentada por la 'exposición a la radiación se proporcionan. En una modalidad, la porción no proteica es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU 102: 11600-11605 (2005)) . La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, entre otras cosas, longitudes de onda que no dañan células ordinarias, pero que calientan la porción no proteica a una temperatura en donde las células proximales a la porción no proteica por el anticuerpo son eliminadas.

Fabricación de IgGs variantes Las IgGs variantes pueden elaborarse por cualquier método conocido en la técnica. En ciertas modalidades, las secuencias de IgG variante se utilizan crean ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de miembro, y esto puede ser clonado entonces en células hospederas, expresó para y realizó ensayos de evaluación, de ser deseado. Estas prácticas se llevan a cabo usando procedimientos bien conocidos, y una variedad de métodos que pueden encontrar uso en se describen en Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001), y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) . Los ácidos nucleicos que codifican para las IgGs variantes pueden incorporarse en un vector de expresión a fin de expresar para la proteína. Los vectores de expresión o por lo común incluyen una proteina ligada funcionalmente, es decir colocado en una relación funcional, con secuencias de control o reguladoras, marcadores seleccionables, cualquier colaborador de fusión, y/o elementos adicionales. Las IgGs variantes pueden producirse cultivando una célula hospedera transformada con el ácido nucleico, preferentemente un vector de expresión, conteniendo el ácido nucleico que codifica para las IgGs variantes, en las condiciones adecuadas de inducir o causar la expresión de la proteina. Una amplia variedad de células hospederas adecuadas se puede usar, incluyendo entre otros células de mamífero, bacterias, células de insecto, y levadura. Por ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden encontrar el uso se describe en el catálogo de línea celular ATCC, disponible de la Colección Americana de Tipos de Cultivo . Los métodos de introducir el ácido nucleico exógeno en células hospederas son conocidos en la técnica, y variarán con la célula hospedera usada.

En ciertas modalidades, las IgGs variantes se purifican o aislado después de la expresión. Los anticuerpos pueden ser aislados o purificados en una variedad de modos conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos de purificación convencionales incluyen métodos cromatográficos , electroforéticos , inmunológicos, precipitación, diálisis, filtración, concentración, y métodos de cromatoenfoque . Como es conocido en la técnica, una variedad de proteínas naturales ligan anticuerpos, por ejemplo ciertas proteínas bacterianas, y estas proteínas pueden encontrar el uso en la purificación. A menudo, la purificación puede ser permitida por un colaborador de fusión particular. Por ejemplo, las proteínas pueden purificarse usando la resina de glutatión si una fusión GST se emplea, cromatografía de afinidad de Ni+2 si un His - la etiqueta se emplea, o anticuerpo de antibandera inmovilizado si una etiqueta de la bandera se usa. Para la dirección general en métodos de purificación adecuados, ver el Antibody Purification: Principies- and Practice, 3a Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994.

Prueba de detección de IgGs variantes Las IgGs variantes de la presente invención pueden detectarse usando una variedad de métodos, incluyendo entre otros a aquellos que usan ensayos in vitro, ensayos in vivo y basados en la célula, y tecnologías de selección. La automatización y las tecnologías de detección de alto rendimiento pueden utilizarse en los procedimientos de detección. La prueba de detección puede emplear el uso de un colaborador de fusión o marcador, por ejemplo un marcador inmunitario, marcador isotópico, o marcador de molécula pequeña, como un tinte fluorescente o calorimétrico.

En la cierta modalidad, las propiedades funcionales y/o biofísicas de IgGs variantes se detectan en un ensayo in vi tro. En ciertas modalidades, la proteína se detecta para la funcionalidad, por ejemplo su capacidad de catalizar una reacción o su afinidad de unión a su objetivo.

Un subconjunto de métodos de detección es aquellos que seleccionan para miembros favorables de una genoteca. Los métodos son aquí referidos como "métodos de selección, " y estos métodos encuentran el uso en la presente invención para detectar IgGs variantes. Cuando las genotecas protéicas se detectan usando un método de selección, sólo aquellos miembros de una genoteca que son favorables, es que cumplen algunos criterios de selección, son propagados, aislados, y/o observados . Una variedad de métodos de selección se conoce en la técnica que puede encontrar el uso en la presente invención para detectar genotecas protéicas . Otros métodos de selección que pueden encontrar el uso en la presente invención incluyen métodos que no se basan en la pantalla, como métodos in vivo. Un subconjunto de métodos de selección referidos como "evolución dirigida" métodos es aquellos que incluyen el apareamiento o empanar de secuencias favorables durante la selección, a veces con la incorporación de nuevas mutaciones .

En ciertas modalidades, las IgGs variantes se detectan usando uno o más ensayos basados en la célula o in vivo. Para los ensayos, las proteínas purificadas o no purificadas son por lo común adicionadas exógenamente el que las células se exponen a variantes individuales o grupos de variantes que pertenecen a una genoteca. Estos ensayos están por lo común, pero no siempre, basados en la función de la IgG variante; es decir la. capacidad de la IgG variante de unirse con su objetivo y regular algún episodio bioquímico, por ejemplo función efectora, ligando/receptor inhibición de unión, apoptosis, y lo similar. Los ensayos a menudo implican monitorizar respuesta de células a IgG, por ejemplo proliferación celular, .migración celular, angiogénesis , supervivencia celular, muerte celular, cambian de la morfología celular, o activación transcripcional, como la expresión celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, los ensayos pueden medir la capacidad de variantes de IgG para provocan como respuesta ADCC, ADCP, o CDC. Para algunos ensayos las células adicionales o los componentes, que es además de las células con especificidad de objetivo, necesitarían agregarse, por ejemplo complemento sérico, o células efectoras, como monocitos de sangre periférica (PBMCs) , células de NK, macrofagos, y lo similar. Las células adicionales pueden ser de cualquier organismo, preferentemente humanos, ratones, rata, conejo, y mono. En ciertas modalidades , los anticuerpos pueden inhibir la angiogénesis y los métodos para monitorizar la actividad son conocidos en la técnica. En aún otra modalidad, los anticuerpos pueden causar apoptosis de ciertas líneas celulares que expresan para el objetivo, o éstos pueden regular el ataque contra células con especificidad de objetivo por células inmunitarias que tienen agregado al ensayo. Los métodos para monitorizar la muerte celular o la viabilidad se conocen en la técnica, e incluyen el uso de tintes, reactivos inmunoquímicos , citoquímicos , y radiactivos. La activación transcripcional también puede funcionar como un método para realizar ensayos de evaluación la función en ensayos basados en la célula. Alternativamente, las detecciones basadas en la célula se llevan a cabo usando células que han sido transformadas o transíectadas con ácidos nucleicos que codifican para las variantes. Es decir las IgGs variantes no son adicionadas exogenamente a las células .

Las propiedades biológicas de las IgGs variantes pueden caracterizarse en célula, tejido, y experimentos de organismo completos. Los fármacos a menudo son analizados en animales, incluyendo entre otros ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos, y monos, a fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra un modelo de enfermedad o enfermedad, o medir farmacocinética de un fármaco, toxicidad, y otras propiedades . Los animales pueden referirse como modelos de enfermedad. La terapéutica a menudo es analizada en ratones, incluyendo entre otros ratones desnudos, ratones de SCID, ratones de xenoinjerto, y ratones transgénicos (incluyendo inserciones de secuencias génicas inactivadoras e inactivaciones de genes) . La experimentación puede proporcionar datos significativos a la determinación del potencial de la proteína para usarse como un terapéutico. Cualquier organismo, preferentemente mamíferos, se puede usar para pruebas. Por ejemplo debido a su parecido genético para humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados, y así poderse usar para analizar la eficacia, toxicidad, farmacocinética, u otra propiedad de las IgGs variantes. Las pruebas del en humanos se requieren por último para la aprobación como fármacos, y así por supuesto estos experimentos son contemplados. Así las IgGs variantes pueden analizarse en humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, inmunogenicidad, farmacocinética, y/o otras propiedades clínicas .

Usos terapéuticos de IgGs variantes Las IgGs variantes pueden encontrar el uso en una amplia gama de productos. En ciertas modalidades la variante de IgG es un terapéutico, un de. diagnóstico, o un reactivo de investigación. La IgG variante puede encontrar el uso en una composición de anticuerpo que es monoclónica o policlónica.

Las IgGs variantes se pueden usar con diversos objetivos terapéuticos, incluyendo entre otros el tratamiento de pacientes con infecciones de S. aureus.

Dosis, Formulaciones y Duración La composición de IgG variante se formulará, dosificada, y administrada en una forma consistente con la práctica médica adecuada. Los factores para la consideración en este contexto incluyen, entre otros, el trastorno particular que se somete a tratamiento, el mamífero particular que se somete a tratamiento, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de administración, y otros factores conocidos a médicos. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis adecuada de una IgG variante, p.ej. Un anticuerpo, de la invención (cuando usado por sí solo o combinado con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad para someterse a tratamiento, el tipo de anticuerpo, la seriedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con objetivos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. La IgG variante es apropiadamente administrada al paciente en algún momento o sobre una serie de tratamientos .

Las formulaciones farmacéuticas aquí también pueden contener más de un compuesto activo si es necesarid para la indicación particular que se somete a tratamiento, preferen emente aquellos con actividades complementarias que no afectan negativamente entre sí. Las moléculas apropiadamente se encuentran combinadas en cantidades que son efectivas con el objetivo intencionado.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosis adecuada de una IgG variante de la invención (cuando usado por sí solo o combinado con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad para someterse a tratamiento, el tipo de anticuerpo, la seriedad y el curso de la enfermedad, si la IgG variante se administra con objetivos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historial clínico del paciente y respuesta a la IgG variante, y la discreción del médico que atiende. En ciertas modalidades, la IgG variante es apropiadamente administrada al paciente en algún momento o sobre una serie de tratamientos. Según el tipo y la severidad de la enfermedad, sobre lpg/kg a 20 mg./kgs (p.ej, 0. lmg/kg-15mg/kg) de la IgG variante puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, si, por ejemplo, por uno o más administraciones separadas, o por la infusión continua. Una dosis diaria común podría abarcar desde sobre lug/kg a 100 mg./kgs o más, según los factores mencionados antes. Para administraciones repetidas más de varios días o más largo, según la condición, el tratamiento se mantendrían generalmente hasta que una supresión deseada de síntomas de enfermedad ocurra. En una modalidad, según la condición, el tratamiento se mantiene hasta que la enfermedad se someta a tratamiento, como se cuantifica por los métodos descritos aquí o conocido en la técnica. Una dosis ejemplificante de la IgG variante estaría en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg./kgs hasta aproximadamente 20 mg./kgs. Así, las uno o más dosis de aproximadamente 0.5 mg./kgs, 2.0 mg./kgs, 4.0 mg./kgs, 7.5 mg./kgs, 10 mg./kgs o 15 mg./kgs (o cualquier combinación de las mismas) pueden administrarse al paciente. Las dosis pueden administrarse intermitentemente, p.ej, cada tres, cada ocho o cada doce semanas {p.ej, el que el paciente recibe de aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte, o p.ej, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). En ciertas modalidades, una inicial la dosis mayor de carga, seguida de uno o más dosis más bajas puede administrarse. En ciertas modalidades, el programa de dosificación comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg./kgs, seguidos de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg./kgs del anticuerpo. Sin embargo, otros esquemas de administración de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia es fácilmente monitorizado por métodos y ensayos convencionales.

En ciertas modalidades, el paciente se somete a tratamiento con una combinación de la IgG variante y uno o más otro agente (s) terapéutico. La administración combinada incluye la administración simultánea o la administración concurrente, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica individual, y administración consecutiva en el orden, donde opcionalmente hay un período de tiempo mientras ambos (o todos) agentes activos simultáneamente ejercen sus actividades biológicas. Las cantidades efectivas de agentes terapéuticos administrados combinado con una IgG variante estarán en la discreción de los médicos o veterinario. La administración de dosis y el ajuste se llevan a cabo para lograr el manejo máximo de las condiciones de someterse a tratamiento. La dosis dependerá además de los factores como el tipo del agente terapéutico para usarse y el paciente específico que se somete a tratamiento. En ciertas modalidades, la combinación de los inhibidores potencia la eficacia de un inhibidor individual. El término "potenciar" se refiere a una mejora de la eficacia de un agente terapéutico a su dosis común o aprobada.

La IgG variante de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse por cualesquiera medios adecuados, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal , intracerebral espinal, intrapulmonar, e intranasal, y, de ser deseado para el tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. En ciertas modalidades, la IgG variante, p.ej, un anticuerpo, es apropiadamente administrada por la infusión de pulso, particularmente con rehusar dosis de la IgG variante. La dosificación puede ser por cualquier ruta adecuada, p.ej por inyecciones, como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En ciertas modalidades, la IgG variante se administra a un paciente intravenosamente, p.ej, como bolo o por la infusión continua por el período del período de tiempo.

La posición del objetivo de unión de una IgG variante, p.ej, un anticuerpo, de la invención puede obtenerse en la consideración en preparación y administración de la IgG variante. Cuando el objetivo de unión de una IgG variante se ubica en el cerebro, las ciertas modalidades de la invención preven la IgG variante para refutar la barrera hematoencefálica. Varios enfoques conocidos de la técnica existen para transportar moléculas a través de la barrera hematoencefálica, incluyendo, · entre otros, métodos físicos, métodos basados en el lípido, métodos basados en la célula pluripotencial, y receptor y métodos basados en el canal.

Los métodos físicos de transportar una IgG variante, p.ej, un anticuerpo, a través de la barrera hematoencefálica incluyen, entre otras cosas, burlando la barrera hematoencefálica completamente, o creando aberturas en la barrera hematoencefálica . Los métodos de engaño incluyen, entre otras cosas, la inyección directa en el cerebro (ver, p.ej, Papanastassiou et al., Terapia génica 9 : 398-406 ( 2002 ) ), la administración de infusión intersticial/potenciada por convección (ver, p.ej, Bobo et al., Proc. Nati. Acad. Sci.- EE. UU 91 : 2076-2080 ( 1994 ) ) , e implantación de un dispositivo de administración en el cerebro (ver, p.ej, a Gilí et al., Naturaleza Med. 9 : 589 -595 ( 2003 ) ; y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical) . Los métodos de crear aberturas en la barrera incluyen, entre otras cosas, el (ver, p.ej, el Número de Publicación de Patente Estadounidense 2002 / 0038086 ) , presión osmótica {p.ej, por la administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A. La implicación de la Barrera hematoencefálica y su Manipulación, Vols 1 & 2 , Prensa de Pleno, Nueva York ( 1989 ) ) , permeabilización por, p.ej, bradicinina o permeabilizador a-7 (ver, p.ej, Patentes Estadounidenses Núms. 5 112 596 , 5 268 164 , 5 506 206 , y 5 686 416 ) , y la transfeccion de neuronas · que se sientan a horcajadas sobre la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican para la IgG variante (ver, p.ej, el Número de Publicación de Patente Estadounidense 2003 / 0083299 ) .

Los métodos basados en el lípido de transportar una IgG variante, p.ej, un anticuerpo, a través de la barrera hematoencefálica incluyen, entre otras cosas, encapsulando la IgG variante en liposomas que se acoplan a fragmentos de unión de anticuerpo que se unen con receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (ver, p.ej, la Solicitud de Patente Estadounidense Número 20020025313), y el recubrimiento de la IgG variante en partículas de lipoproteína de baja densidad (ver, p.ej, la Solicitud de Patente Estadounidense Número 20040204354) o la apolipoproteína E (ver, p.ej, la Solicitud de Patenté Estadounidense Número 20040131692) .

La célula pluripotencial métodos con base de transportar una IgG variante, p.ej, un anticuerpo, a través de la barrera hematoencefálica implica células progenitoras de los nervios que manipulan genéticamente (NPCs) para expresar para el anticuerpo de interés y luego implantar de las células pluripotenciales en el cerebro del paciente para someterse a tratamiento. Ver Behrstock et al. (2005) Gene Ther. El 15 de diciembre de 2005 la publicación en línea avanzada (mencionando que NPCs manipuló genéticamente para expresar para el factor neurotrófico GDNF síntomas reducidos de la enfermedad de Parkinson cuando implantado en los cerebros de modelos de primate y roedor) .

El receptor y los métodos basados en el canal de transportar una IgG variante, p.ej, un anticuerpo, a través de la barrera hematoencefálica incluyen, entre otras cosas, usando blo ueadores de glucocorticoide que aumentan la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (ver, p.ej, la Publicación Núm. 2002/0065259, 2003/0162695 de Solicitud de Patente Estadounidense, y 2005/0124533); los canales de potasio de activación (ver, p.ej, la Solicitud de Patente Estadounidense Número 2005/0089473), la inhibición de transportadores de fármaco de ABECÉ {ver, p.ej, la Solicitud de Patente Estadounidense Número 2003/0073713); los anticuerpos de recubrimiento con una transferrina y la actividad de modulación de uno o más receptores de transferrina (ver, p.ej, la Solicitud de Patente Estadounidense Número 2003/0129186) , y cationizar los anticuerpos (ver, p.ej, la Patente de EE.UU. No. 5 004 697) .

Las formulaciones farmacéuticas que comprenden una IgG variante, p.ej, un anticuerpo, de la invención se preparan para el almacenamiento que mezcla la IgG variante que tiene el nivel deseado de la pureza con portadores opcionales fisiológicamente aceptables, excipientes o estabilizadores (Remington : The Science and Practice of Pharmacy la 20ma edición (2000)), en la forma de soluciones acuosas, formulaciones secadas liofilizadas u otras. Los portadores aceptables, los excipientes, o los estabilizadores son no tóxicos a receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido áscórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio ; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butilo o alcohol bencílico; parabenos de alquilo, como metilo o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; de 3 pentanoles; y m cresol) ; de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) polipéptidos ; proteínas, como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos , como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o . dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman la sal, como sodio; complejos metálicos (p.ej, Zn-complejos-proteínicos ) ; y/o surfactantes no iónicos, como TWEE ?, PLURONICS ? o polietilenglicol (PEG) .

Los principios activos también pueden ser entrampados en la microcápsula preparada, por ejemplo, por métodos de formación de coacervado o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Los métodos se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy la 2 Orna edición (2000) .

Las formulaciones para usarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente llevado a cabo, p.ej mediante filtración membranas de filtración a través de estériles.

Las preparaciones de liberación prolongada pueden prepararse. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, qué matrices tienen formas de artículos formados, p.ej, películas, o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o alcohol poli (vinílico) ) , poliláctidos (Patente Estadounidense Número 3 773 919), copolímeros de ácido L-glutámico e D-etil-L-glutamato, acetato etilenvinílico no degradable, copolímeros de ácido glicólico acidoláctico degradables, como el LUPRÓN ? de liberación lenta (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido glicólico acidoláctico y acetato de leuprolido) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras los polímeros, como el acetato etilenvinílico y el ácido glicólico acidoláctico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, los ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos . Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo mucho tiempo, éstos pueden desnaturalizar o agregado a consecuencia de la exposición a la humedad a 37DC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios de inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden ser ideadas para la estabilización según el mecanismo complicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de unión S-S intermolecular a través de intercambio de disulfuro del tiol, la estabilización puede lograrse modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Terapias combinadas La terapéutica descrita aquí puede administrarse con otra terapéutica concomitantemente, es decir, la terapéutica descrita aquí puede administrarse conjuntamente con otras terapias o terapéutica, incluyendo por ejemplo, moléculas pequeñas, otro compuestos biológicos, terapia de radiación, cirugía, etc.

Artículos fabricados En otro aspecto de la invención, un artículo fabricado que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos antes se proporciona. El artículo fabricado comprende un recipiente y un marcador o inserto de envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tal como de cristal o plástico. El recipiente mantiene una composición que es por sí mismo o combinada con otra composición efectiva para tratamiento, prevención y/o diagnosticar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . El inserto de envase o marcador indica que la composición se usa para tratar la condición de opción. En ciertas modalidades, el artículo fabricado puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en la presente, donde la composición comprende una IgG variante de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en la presente, donde la composición comprende a un agente terapéutico adicional. El artículo fabricado puede comprender adicionalmente un inserto de envase que indica que las composiciones poderse usar para tratar una condición particular. Alternativamente, o además, el artículo fabricado puede comprender adicionalmente un- segundo (o tercero) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostático para inyección (B FI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución dextrosa. Esto puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y punto de vista de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

En ciertas modalidades, la IgG variante puede ser envasada por sí solo o combinada con otros compuestos terapéuticos como un kit. El kit puede incluir componentes opcionales que ayudan en la administración de la dosis unitaria a pacientes, como viales para reconstituir formas en polvo, jeringas para la inyección, personalizada IV sistemas de administración, inhaladores, etc. Además, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para preparación y administración de las composiciones. El kit puede ser elaborado como una dosis unitaria de uso individual para usos del paciente, múltiples para un paciente particular (a una dosis constante o donde los compuestos individuales pueden variar en la potencia mientras que la terapia progresa) ; o el kit puede contener dosis múltiples adecuadas para la administración a pacientes múltiples ("envase de volumen"). Los componentes de kit pueden ser ensamblados en cartones, envases tipo burbuja, frascos, tubos, y lo similar.

EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de invención. Se entiende que diversas otras modalidades pueden ser llevadas a la práctica, proporcionadas la descripción general proporcionada antes .

Ejemplo 1: Producción de Variantes Anti-Her2 Las regiones Fab de anti-Her2 humanizado (4D5 o huMAb4D5-8 descrito en la Patente de EE.UU. No. 5 821 337) IgGl pesados y ligeros son clonados por separado en dos plásmidos de transfección transitorios pRK-con-base que contienen dominios constantes de humano IgGl Kunkel la mutagénesis dirigida al sitio con base es usada entonces para generar anti-Her2 IgGl variantes donde los residuos en el dominio VH son mutados . Las variantes anti-Her2 generadas en este estudio son S17A, R19A, S21A, T57A, T57K, R66A, T68A, S70A, Y79A, Q81A, N82aA, y S82bA (todos numerados según el índice EU como en Kabat) .

Los plásmidos que contienen la cadena pesada de las variantes y la cadena ligera natural son co-transfectados en la línea celular 293 de riñon humano embrionario transformada en el adenovirus usando FUGENE ® (Roche, Basilea, Suiza) según el protocolo de fabricación. Después de 24 horas de la incubación con los complejos de transfección, la célula transfectada es cultivada con medios libres séricos 1.3x GEMA N Medio con glutamina de 5 mm. Los sobrenadantes se recolectan, y condicionado con 1M pH de TRIS 8.0 y 5M cloruro de sodio (NaCl) para proporcionar una concentración final de 30 mm TRIS y NaCl de 50 mm. El sobrenadante condicionado es cargado entonces en una Proteína L columna de relleno de la resina (Thermo scientific, Rockford, IL) . Después de la carga, la columna se lava con el amortiguador que contiene 30 mm TRIS y pH de NaCl de 150 mm 8. Fab ligado se eluye con el pH de amortiguador de glicina 0.1M 3.0. Después, Fab purificados se concentran e inyectado sobre una columna de cromatografía por exclusión de tamaños de Superdex®-200 (GE healthcare, Chalfont St. Giles, el Reino Unido) para retirar cualquier agregado. Las fracciones monoméricas son combinadas conjuntamente y usadas para los estudios de unión. De origen natural de Anti-HER2 y las concentraciones de Fab variantes anti-HER2 se calculan usando la absorbancia que lee a 280nM, y se estima que una absorbancia de 1.5 es lmg/ml de Fab.

Ejemplo 2: Estudios de Unión a Proteína A La unión de variantes anti-Her2 a la proteína A es estudiada por ELISA. Las placas de ELISA, MaxiSorp™ (Thermo scientific, Rockford, IL) se recubren durante la noche con cualquiera IDg/ml de la proteína A (Thermo scientific, Rockford, IL) o el dominio extracelular de Her2 (Genentech, San Francisco del Sur, California) . Las placas son bloqueadas con PBS, BSA del 0.5 %, lOppm Proclin, pH 7.2 durante 1 hr a temperatura ambiente y luego lavadas con el amortiguador de lavado (% de PBS/0.05 Tween ™ 20/pH 7.2). Diluciones de 4 veces consecutivas (comenzando a 1000 nM) de Fab natural y variantes en el amortiguador de ensayo (PBS, pH 7.4, BSA del 0.5 %, Tween del 0.05 % 20, lOppm Proclin) se agregan a las placas de 96 pocilios recubiertas con la proteína A. Mientras tanto, diluciones de 4 veces consecutivas (comenzando a 50 nM) de Fab natural y variantes en el amortiguador de ensayo se agregan a las placas de 96 pocilios recubiertas con Her2. Después de tres horas de la incubación a temperatura ambiente con agitación, las placas se lavan 4. veces, y el anticuerpo ligado se detecta con la cabra IgG no humano (F(ab')2 específico) -HRP (Jackson ImmunoResearch, Arboleda de Oeste, Pensilvania) diluido 1:10,000 en el amortiguador de ensayo durante 0.5 hr a temperatura ambiente con agitación. Las placas son lavadas entonces 4 veces nuevamente, seguidas mediante la adición del sustrato de bencidina de tetrametilo (Moss, Pasadena, MD) para el desarrollo en color. La reacción es detenida después de 2 minutos mediante la adición de 1M ácido fosfórico (H3P04) . Las placas se leen en un lector de microplaca de Dispositivos Molecular a una longitud de onda de 450-620 nm.

Los resultados muestran que todas las variantes mantuvieron la misma afinidad de unión a Her2 que las de origen natural (Figuras 1 y 2) . Los resultados de Figuras 3-4 muestran que las ciertas variantes muestran la unión reducida a la proteína A con relación a de origen natural [S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A, y N82aA] , mientras que los otros muestran esencialmente el mismo nivel de ligar [S21A y T68A] y todavía los otros muestran la unión aumentada [S70A, Y79A, y S82bA] . Se estima que la CE 50 del PESO Fab es de aproximadamente 15nM. Las estimaciones de EC50 para cada una de estas variantes se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Unión de variantes a proteína A Aunque la invención anterior se haya descrito en algunos detalles por vía de ilustración y ejemplo con objetivos de la claridad de la comprensión, las descripciones y los ejemplos no deberían ser interpretados como limitar el alcance de la invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una IgG variante que comprende una región VH de IgG de humano que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con relación a una región VH de IgG natural de humano a uno o más residuos aminoacídicos 17, 19, 57, 66, 70, 79, 81, 82a, 82b, numerados según el índice EU como en Kabat, donde la IgG variante ha alterado la unión a la proteína A de Staphylococcus aureus .

2. La IgG variante según la reivindicación 1 , que tiene una mayor unión a la proteína A.

3. La IgG variante según la reivindicación 2 , donde la IgG variante comprende una región VH de IgG de humano que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con relación a una región VH de IgG natural en uno o más residuos aminoacídicos 70, 79, y 82b.

4. La IgG variante según la reivindicación 3 , donde una o más de las sustituciones aminoacídicas se seleccionan a partir del grupo que comprende S70A, Y79A, y S82bA.

5. La IgG variante según la reivindicación 1, que tiene una menor unión a la proteína A.

6. La IgG variante según la reivindicación 5, donde la IgG variante comprende una región VH de IgG de humano que comprende una o más sustituciones aminoacídicas con relación a una región VH de IgG natural en uno o más residuos aminoacídicos 17, 19, 57, 66, 81, y 82a.

7. La IgG variante según la reivindicación 6, donde una o más de las sustituciones aminoacídicas se seleccionan a partir del grupo que comprende S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A, y N82aA.

8. La IgG variante según la reivindicación 1, que es IgG de humano o humanizada.

9. La IgG variante según la reivindicación 8, que es Igd, IgG2, IgG3 o IgG4.

10. La IgG variante según la reivindicación 1, donde la IgG variante se une con una proteína de Staphylococcus aureus además de la proteína A.

11. Una composición farmacéutica que comprende la IgG variante según la reivindicación 1 o 10, y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Un kit que comprende la IgG variante según la reivindicación 1 o 10, en un recipiente, e instrucciones de uso .