JP7068251B2 - T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero-dimeric immunoglobulin)の製造 - Google Patents
T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero-dimeric immunoglobulin)の製造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7068251B2 JP7068251B2 JP2019178516A JP2019178516A JP7068251B2 JP 7068251 B2 JP7068251 B2 JP 7068251B2 JP 2019178516 A JP2019178516 A JP 2019178516A JP 2019178516 A JP2019178516 A JP 2019178516A JP 7068251 B2 JP7068251 B2 JP 7068251B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- protein
- acid sequence
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
、二重特異性抗体の回収率が損なわれる(Jackman Jら、(2010)J Biol Chem、第285巻(27):20850~9頁;Klein Cら、前出)。FAB-アーム交換法及びその派生法は、同一の欠点を有する他、2つの「単一特異性」抗体を最初に分離して生成させるという更なる問題を有する。
して、それよりも弱いアフィニティーを示すプロテインA結合部位を1か所のみ有するにすぎないが(Roben PWら、(1995)J Immunol、第154巻(12):6437~45頁)、公知の差動的プロテインAアフィニティー精製技法を相互作用するのに十分なアフィニティーが認められる。重鎖のヘテロ二量体の精製を取り扱う場合、そのFc領域においてプロテインAに結合しないように工学的に作出された重鎖は、VH3ベースの抗原結合部位を1つ含み、従ってプロテインA結合は、VH3ドメインにより再建されるが、図1には好ましい技術を記載し、また上部のものは有用ではない(図2A)。この事例では、VH3ベースの抗原結合部位内のプロテインA結合を無効にすることで、シンプルな解決策が提供され、所望のヘテロ二量体の初期の構造を保持できるようにする(図2B)。あるいは、重鎖ヘテロ二量体は、Fc領域内でプロテインAに結合する重鎖上に、VH3ベースの抗原結合部位を配置させるように工学的に再構成され得る(図2C;VH3ドメインは、Fcモノマーと比較して、それよりもプロテインAに対するアフィニティーは弱く、従って対象となるヘテロ二量体は、他のホモ二量体種とは異なるpH値、一般的にはpH4において、なおも溶出する一方、プロテインAに結合するホモ二量体種は、この場合2つの付加的プロテインA結合部位を含み、pH値≦3で溶出することに留意する)。
3領域を備える。好ましい実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供するが、この場合、第1及び第2のポリペプチドは、タンパク質-タンパク質界面を有する修飾されたCH3ドメインを備えた工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、第1のポリペプチドのタンパク質-タンパク質界面は、3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、88、及び90(IMGT(登録商標)ナンバリング)からなる群より選択される位置においてアミノ酸置換を含み、並びに第2のポリペプチドのタンパク質-タンパク質界面は、3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88、及び90(IMGT(登録商標)ナンバリング)からなる群より選択される位置において、アミノ酸置換を含む。
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号194のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号195のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号196のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号197のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号198のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号199のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む;又は
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号201のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号202のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号203のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号204のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む;又は
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号352のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号353のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号354のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号355のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号356のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号357のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む。
関連細胞表面抗原に対してT細胞キリングを安全にリダイレクトし得る治療法は、臨床的有効性に改善をもたらす可能性がある。腫瘍学において未だ満たされていない臨床的ニーズの公知領域として、乳癌、転移性乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、但しこれらに限定されない。自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば乾癬、多発性硬化症、及び糖尿病等を治療する際には、疾患原因のT細胞を除去することが、T細胞の分化を阻害することよりも有益であり得る。
i)配列番号206~211、
ii)配列番号212~217、
iii)配列番号218~223、
iv)配列番号224~229、
v)配列番号230~235、
vi)配列番号236~241、
vii)配列番号242~247、
viii)配列番号248~253、
ix)配列番号254~259、
x)配列番号260~265、
xi)配列番号266~271、及び
xii)配列番号272~277
からなる群よりそれぞれ選択される重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列、並びに軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列を含む、本発明によるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
、また非IgG3CH3領域は、プロテインA結合を低下させる/無効にするように、少なくとも1つの置換を含む。
くとも1つのアミノ酸修飾を含む。
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号49のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又はCD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号358のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号105のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号104のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。更に好ましい実施形態では、HER2に結合するエピトープ結合領域は、配列番号107のアミノ酸配列を含むscFvフラグメントを形成するG4
Sリンカーにより連結した重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。好ましくは、scFvフラグメントの可変ドメインは、プロテインAに対する結合を無効にする修飾を含み、この場合、アミノ酸置換は65S(Kabatナンバリング)であり、またscFvフラグメントは、配列番号109のアミノ酸配列を含む、又はこの場合、アミノ酸置換は82aS(Kabatナンバリング)であり、scFvフラグメントは、配列番号111のアミノ酸配列を含む。
り好ましくはヒトIGHV3-23*04(配列番号22)の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、また最も好ましくは、配列番号296のアミノ酸配列を含む。エピトープ結合領域は、ヒトVK1サブクラス、好ましくはヒトVK1-39、より好ましくはヒトIGKV1-39*01(配列番号23)の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含み、また最も好ましくは、配列番号297のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、重鎖可変ドメインは、置換G65S又は置換N82aS(Kabatナンバリング)を含む、プロテインAに対する結合を無効にする修飾を含む。
はそのフラグメントは、21pM以下の効力で、JIMT-1細胞を殺傷する。あるいは、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、2pM以下の効力で、BT-474細胞も殺傷する。更に、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、0.2nM以下の効力で、MDA-MB-231細胞も殺傷する。すべての細胞系統の細胞毒性は、48時間にわたり、10:1のエフェクター:標的細胞比で、ヒトPBMCを用いて実施したRDLアッセイ法で測定した。更に、JIMT-1/PBMC異種移植モデルにおいて、in vivoで試験すると、このヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは強力な抗腫瘍効果を示す。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、JIMT-1細胞異種移植において、0.05mg/kgでJIMT-1細胞を殺傷する。
i)第1のポリペプチドが、配列番号159のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号47の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号160のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
ii)第1のポリペプチドが、配列番号161のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号3の同起源の軽鎖と会合し、及びHER2に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号162のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
iii)第1のポリペプチドが、配列番号163のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号47の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号164のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
iv)第1のポリペプチドが、配列番号165のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号166の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号167のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
v)第1のポリペプチドが、配列番号168のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号89の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号167のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
vi)第1のポリペプチドが、配列番号169のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号119の同起源の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号162のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
vii)第1のポリペプチドが、配列番号170のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号138の同起源の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号171のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
viii)第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号119の同起源の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号177のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
ix)第1のポリペプチドが、配列番号178のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号128の同起源の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号179のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
x)第1のポリペプチドが、配列番号172のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が
配列番号173の同起源の軽鎖と会合し、及びOX40に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号162のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びOX40、
xi)第1のポリペプチドが、配列番号174のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号175の同起源の軽鎖と会合し、及びEGFRに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号171のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR、
xii)第1のポリペプチドが、配列番号180のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号181の同起源の軽鎖と会合し、及びCD20に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号177のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD20。
CD3タンパク質複合体及びHER2、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号310のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号3の軽鎖と会合し、そしてHER2に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びCD38、この場合、第1のポリペプチドは配列番号312のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号132の軽鎖と会合し、そしてCD38に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びCD38、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号313のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号138の軽鎖と会合し、そしてCD38に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びOX40、この場合、第1のポリペプチドは配列番号314のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号315の軽鎖と会合し、そしてOX40に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びOX40、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号316のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号317の軽鎖と会合し、そしてOX40に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びCD20、この場合、第1のポリペプチドは配列番号318のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号319の軽鎖と会合し、そしてCD20に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びCD20、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号320のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号321の軽鎖と会合し、そしてCD20に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びEGFR、この場合、第1のポリペプチドは配列番号322のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号323の軽鎖と会合し、そしてEGFRに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びEGFR、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号324のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号325の軽鎖と会合し、そしてEGFRに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びEGFR、この場合、第1のポリペプチドは配列番号326のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号327の軽鎖と会合し、そしてEGFRに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びEGFR、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号328のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号329の軽鎖と会合し、そしてEGFRに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びCD19、この場合、第1のポリペプチドは配列番号330のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号331の軽鎖と会合し、そしてCD19に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びIgE、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号332のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号333の軽鎖と会合し、そしてIgEに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びIgE、この場合、第1のポリペプチドは配列番号334のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号335の軽鎖と会合し、そしてIgEに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びIgE、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号336のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号337の軽鎖と会合し、そしてIgEに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びIgE、この場合、第1のポリペプチドは配列番号338のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号339の軽鎖と会合し、そしてIgEに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びOX40、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号340のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号173の軽鎖と会合し、そしてOX40に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びCD20、この場合、第1のポリペプチドは配列番号341のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号181の軽鎖と会合し、そしてCD20に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びEGFR、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号342のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号175の軽鎖と会合し、そしてEGFRに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びEGFR、この場合、第1のポリペプチドは配列番号343のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号344の軽鎖と会合し、そしてEGFRに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びIgE、この場合、第1のポリペプチドは、配列番号345のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号346の軽鎖と会合し、そしてIgEに結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する;
CD3タンパク質複合体及びIgE、この場合、第1のポリペプチドは配列番号347のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号348の軽鎖と会合し、そしてIgE
に結合する一方、第2のポリペプチドは、配列番号311のアミノ酸配列を有し、またCD3εに結合する。
ia)第1のポリペプチドの重鎖をコードするDNAベクター及び第2のポリペプチドの重鎖をコードするDNAベクターを調製するステップであって、1つ若しくは両方のDNAベクター、若しくは第3のDNAベクターが、共通する軽鎖、又は第1若しくは第2のポリペプチドの重鎖と会合する軽鎖を任意選択的にコードする前記ステップ、又は
ib)第1及び第2のポリペプチドの重鎖をコードする1つのDNAベクターを調製するステップであって、DNAベクターが、共通する軽鎖、又は第1若しくは第2のポリペプチドの重鎖と会合する軽鎖を任意選択的にコードし、前記DNAベクターが、哺乳動物の宿主細胞内での一過性の発現若しくは安定的な発現に適する前記ステップと、
ii)(i)に由来するDNAベクター(複数可)を哺乳動物の宿主細胞系統にトランスフェクト又は同時トランスフェクトするステップと、
iii)トランスフェクトされた細胞系統、又はそれから安定的に選択されたクローンを培養し、細胞培養物上清を採集するステップと、
iv)細胞培養物上清をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させるステップと、
v)対象とするヘテロ二量体免疫グロブリンを溶出させ、収集するステップと、
を含む前記方法を提供する。
[図面の簡単な説明]
[図1]プロテインAを用いる、好ましい差動的アフィニティー精製技法の概略図である。重鎖は、いずれもVH3ベースの抗原結合部位を含まない。凡例:[(A+)]は、機能性プロテインA結合部位を意味し、また[(A-)]は、非機能性プロテインA結合部位を意味する。溶出pHを示す。
[図2]差動的プロテインAクロマトグラフィーを用いて、1つ又は複数のVH3ドメインを含む重鎖のヘテロ二量体を精製する際に直面する問題を示す概略図である。ヘテロ二量体の少なくとも1つのVH3ドメイン内のプロテインA結合部位の突然変異に基づく解決策の例を示す。
[図2A]重鎖のヘテロ二量体が重鎖内にVH3ドメインを含むが、重鎖がそのFc領域においてプロテインAに結合しない際に直面する問題を示す図である。
[図2B]図2Aに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、重鎖Fc領域においてプロテインAに結合しないヘテロ二量体の重鎖は、そのプロテインA結合部位を無効にするように突然変異したVH3ドメインを含む。
[図2C]図2Aに記載する問題に対する代替的解決策を示す図であり、ヘテロ二量体は1つのVH3ドメインのみを含み、またヘテロ二量体は、そのVH3ドメインが、重鎖Fc領域においてプロテインAに結合する重鎖上に位置するように、工学的に作出されている(解決策としてのVH3ドメイン再配置戦略)。
[図2D]ヘテロ二量体の両方の重鎖がVH3ドメインを含む際に直面する問題を示す図である。
[図2E]図2Dに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、ヘテロ二量体の重鎖は、そのFc領域においてプロテインAに結合しないが、そのプロテインA結合部位を無効にするように突然変異したVH3ドメインを含む。
[図2F]図2Dに記載する精製問題に対する代替的解決策を示す図であり、各VH3ドメインは、そのプロテインA結合部位について無効にされている。四角で囲まれた種は、差動的プロテインAクロマトグラフィープロセス期間中に、これらの種は同時溶出することを示す。pH値のAとBは、約1pH単位異なり、プロテインAに結合する種の効果的な分離を可能にする。一般的に、pH A及びpH BのpH値は、それぞれ4及び3である。すべての図の凡例:[(A+)]は機能的プロテインA結合部位を意味し、また[(A-)]は非機能性プロテインA結合部位を意味する。
[図3]Fc133のプロテインAグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である(HiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム)。移動相の総容積に対する280nmにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のpH及び移動相中に存在する溶出バッファー(B)の割合(%)に関するプロットを破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
[図4]プロテインAグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である。移動相の総容積に対する280nmにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のpH及び移動相中に存在する溶出バッファー(B)の割合(%)に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
[図4A]抗HER2 FAB-Fc133(HiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム)。
[図4B]抗HER2 scFv-Fc 133(HiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム)。
[図4C]抗HER2 FAB(HiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム、及びHiTrap(商標)MabSelect(商標)プロテインAカラム)。
[図5]7つの公知のヒトVHフレームワークサブクラスそれぞれについて、代表的なアミノ酸配列を示す図である。配列を、Kabatナンバリングに基づき整列させた。プロテインAのドメインDと相互作用するヒトVH3-23フレームワークサブクラス内の位置を太字で示す。
[図6]プロテインAグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である(HiTrap(商標)MabSelect(商標)プロテインAカラム)。移動相の総容積に対する280nmにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のpH、及び移動相中に存在する溶出バッファー(B)の割合(%)に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
[図6A]抗HER2 FAB。
[図6B]抗HER2 FAB T57A。
[図6C]抗HER2 FAB T57E。
[図6D]抗HER2 FAB G65S。
[図6E]抗HER2 FAB R66Q。
[図6F]抗HER2 FAB T68V。
[図6G]抗HER2 FAB Q81E。
[図6H]抗HER2 FAB N82aS。
[図6I]抗HER2 FAB R19G/T57A/Y59A。
[図7]HER2抗原に対する選択された抗HER2 FAB変異体の平衡解離定数(KD)を示す図である。
[図8]プロテインAグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である(HiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム)。移動相の総容積に対する280nmにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のpH及び移動相中に存在する溶出バッファー(B)の割合(%)に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
[図8A]抗HER2 scFv(G65S)-Fc133。
[図8B]抗HER2 scFv(N82aS)-Fc133。
[図8C]抗HER2 FAB(G65S)-Fc133。
[図8D]抗HER2 FAB(N82aS)-Fc133。
[図9]これらの図は、すべて安定なヒトフレームワーク上のOKT3ヒト化と関連する。
[図9A]ヒトIgG1抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。OKT3キメラ抗体に対する相対的HPB-ALL染色強度:(-)は非結合、(+)より弱い結合、(++)中等度の結合、及び(+++)類似した結合を表す。
[図9B]ヒトIgG1抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。OKT3キメラ抗体に対する相対的HPB-ALL染色強度:(-)は非結合、(+)より弱い結合、(++)中等度の結合、及び(+++)類似した結合を表す。
[図9C]ヒトIgG1抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。OKT3キメラ抗体に対する相対的HPB-ALL染色強度:(-)は非結合、(+)より弱い結合、(++)中等度の結合、及び(+++)類似した結合を表す。
[図9D]選択された抗体候補品のDSCプロファイル。
[図9E]scFv-Fc融合体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。OKT3キメラ抗体に対する相対的HPB-ALL染色強度:(-)は非結合、(+)より弱い結合、(++)中等度の結合、及び(+++)類似した結合を表す。
[図9F]選択されたscFv-Fc候補品のDSCプロファイル。
[図10]これらの図は、すべて安定なヒトフレームワーク上のSP34ヒト化と関連する。
[図10A]ヒトIgG1抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。
[図10B]scFv-Fc融合タンパク質(ヒトIgG1アイソタイプのFc)としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ヒトとカニクイザルCD3ε1-26_Fc融合タンパク質に対するSP34キメラ抗体の相対的SPRデータ:(-)は非結合、(+)より弱い結合、(++)中等度の結合、(+++)強いが同等ではない結合、及び(++++)類似した結合を表す。
[図11]これらの図は、すべて抗ヒトCD38抗体と関連する。
[図11A]SPRにより測定した、HB-7キメラ抗体とヒトCD38抗原の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGと共有結合しており、200RUのHB-7キメラ抗体を捕捉した。ヒトCD38タンパク質(ポリ-ヒスチジンタグを有するヒトCD38細胞外ドメイン)を、HBS-P中にて、125、31、7.8、3.9、1.9、1、及び0.5nM、流速30μl/分で注入した。
[図11B]SPRにより測定した、ヒト化HB-7最良適合抗体(best-fit antibody)とヒトCD38抗原の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGと共有結合しており、200RUのヒト化HB-7最良適合抗体を捕捉した。ヒトCD38タンパク質(ポリ-ヒスチジンタグを有するヒトCD38細胞外ドメイン)を、HBS-P中にて、50、25、12.5、6.25、及び0.39nM、流速30μl/分で注入した。
[図11C]SPRにより測定した、ヒト化9G7最良適合抗体とヒトCD38抗原の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGと共有結合しており、200RUのヒト化9G7最良適合抗体を捕捉した。ヒトCD38タンパク質(ポリ-ヒスチジンタグを有するヒトCD38細胞外ドメイン)を、HBS-P中にて、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19、及び0.1nM、流速30μl/分で注入した。
[図11D]SPRにより測定した、ヒト化9G7最良フレームワーク抗体とヒトCD38抗原の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGと共有結合しており、200RUのヒト化9G7最良フレームワーク抗体を捕捉した。ヒトCD38タンパク質(ポリ-ヒスチジンタグを有するヒトCD38細胞外ドメイン)を、HBS-P中にて、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19、及び0.1nM、流速30μl/分で注入した。
[図11E]SPRにより測定した、ヒト767抗体とヒトCD38の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGと共有結合しており、200RUのヒト767抗体を捕捉した。ヒトCD38タンパク質(ポリ-ヒスチジンタグを有するヒトCD38細胞外ドメイン)を、HBS-P中にて、500、250、125、62.5、31.25、及び15.6nM、流速30μl/分で注入した。アフィニティーを、次の式:Req=KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)に基づき、分析物濃度(C)に対する平衡レスポンス(Req)のプロットから取得し、50%飽和濃度はKDである。すべてのSPRデータは、時間(X軸)に対するレスポンスユニットの数(略号RU;Y軸)として表す。
[図11F]HB-7キメラ抗体及びヒト化HB-7最良適合抗体のDSCプロファイルを示す図である。
[図11G]9G7キメラ抗体及びヒト化9G7最良適合抗体のDSCプロファイルを示す図である。
[図11H]ヒト化9G7最良フレームワーク抗体のDSCプロファイルを示す図である。
[図11I]ヒトクローン767抗体のDSCプロファイルを示す図である。
[図11J]9G7ヒト化抗体に関する要約表である。
[図12]代替的フォーマットのBEAT HER2/CD3抗体に関する概略図である。
[図12A]BEAT HER2/CD3-1(フォーマットA)及びBEAT HER2/CD3-2(フォーマットB)抗体を示す図である。
[図12B]BEAT HER2/CD3-3(フォーマットC)及びBEAT HER2/CD3(SP34)(フォーマットD)抗体を示す図である。
[図12C]BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)(フォーマットE)抗体を示す図である。凡例:[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味する。[(A-)]は、非機能的プロテインA結合部位を意味する。
[図13]BEAT HER2/CD3-1抗体のプロテインA精製プロファイルを示す図である(280nmにおける吸収トレース)。カラム:1mlのMabSelect SuRe。流速:1ml/分。泳動バッファー:0.2M NaH 2 PO 4 、pH6。溶出バッファーNo1:20mM酢酸Na、pH4(20ml)。溶出バッファーNo2:0.1Mグリシン、pH3(20ml)。中和:1/10容量の1Mトリス、pH8。
[図14]BEAT HER2/CD3-1抗体調製物のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す図である。
[図15A]N82aS置換型BEAT HER2/CD3-1抗体のSDS-PAGE分析を示す図である。凡例:[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味し、また[(A-)]は、非機能的プロテインA結合部位を意味する。溶出pHを示す。
[図15B]N82aS非置換型BEAT HER2/CD3-1抗体変異体のSDS-PAGE分析を示す図である。凡例:[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味し、また[(A-)]は、非機能的プロテインA結合部位を意味する。溶出pHを示す。
[図16A]SPRにより測定した、BEAT HER2/CD3-1抗体とヒトCD3ε抗原の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、7400RUのヒトCD3γ-ε-Fc融合タンパク質に共有結合させた。BEAT HER2/CD3-1抗体を、HBS-P中にて、5000、2500、1250、625、312.5、及び156.25nM、流速10μl/分で注入した。データを、時間(X軸)に対するレスポンスユニット(略号RU;Y軸)の数として表す。アフィニティーを、下記の式:Req=KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)に基づき、分析物濃度(C)に対する平衡レスポンス(Req)のプロットから取得したが、50%飽和濃度はKDである。
[図16B]SPRにより測定した、BEAT HER2/CD3-1抗体とヒトHER2抗原の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGと共有結合しており、150RUのBEAT HER2/CD3-1抗体を捕捉した。HER2-hisを、HBS-P中にて、1000、333、111、37、12、4.1、1.4、0.5、及び0.15nM、流速30μl/分で注入した。データを、時間(X軸)に対するレスポンスユニット(略号RU;Y軸)の数として表す。
[図16C]BEAT HER2/CD3-1及び-2抗体のDSCプロファイルを、プロファイルA及びBにそれぞれ示す。
[図17]BEAT HER2/CD3抗体によるT細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-MTS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は10:1。48時間インキュベーションしたドナー3例の平均値。抗体濃度はnM表示。
[図17A]BEAT HER2/CD3-1、及びBEAT HER2/CD3-2抗体、標的細胞:BT-474。
[図17B]BEAT HER2/CD3-1、及びBEAT HER2/CD3-2抗体、標的細胞:JIMT-1。
[図17C]BEAT HER2/CD3-1、及びBEAT HER2/CD3-2抗体、標的細胞:MDA-MB-231。
[図17D]BEAT HER2/CD3(SP34)抗体、標的細胞:NCI-N87。
[図17E]BEAT HER2/CD3(SP34)抗体、標的細胞:HT-1080。
[図17F]BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体、標的細胞:NCI-N87。
[図17G]BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体、標的細胞:HT-1080。
[図18]ヒトPBMCが補給されたJIMT-1異種移植を示す図である。
[図18A]ヒトPBMCは腫瘍増殖を妨害しないことを示す図である。
[図18B]BEAT HER2/CD3-1処理及び未処理マウスの腫瘍容積(mm 3 )を、ヒトPBMCドナー4例、マウス5匹のコホートについて示す図である。
[図18C]BEAT HER2/CD3-1処理及び未処理マウスの腫瘍容積(mm 3 )を、ヒトPBMCドナー4例、マウス5匹のコホートについて示す図である。
[図19]BEAT CD38-HB7最良適合/CD3(フォーマットA)、及びBEAT CD38-767/CD3(フォーマットB)抗体を示す概略図である。[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味する。[(A-)]は、非機能的プロテインA結合部位を意味する。
[図20A]SPRにより測定した、BEAT CD38-HB7最良適合/CD3抗体とヒトCD38抗原の間での抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、プロテインGに共有結合しており、200RUのBEAT CD38-HB7最良適合/CD3抗体を捕捉した。ヒトCD38タンパク質(ポリ-ヒスチジンタグ付きのタンパク質)を、HBS-P中にて、50、25、12.5、6.25、及び0.39nM、流速30μl/分で注入した。データを、時間(X軸)に対するレスポンスユニットの数(略号RU;Y軸)として表す。
[図20B]BEAT CD38-HB7最良適合/CD3抗体のDSCプロファイルを示す図である。
[図21]BEAT CD38-HB7最良適合/CD3抗体によるT細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-FACS法。エフェクター細胞:精製後のヒトT細胞。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、10:1。48時間インキュベーションしたドナー2例の平均値。標的細胞:RPMI8226。抗体濃度はnM表示。
[図22]BEAT CD38-767/CD3(SP34)抗体によるT細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-FACS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、10:1。24時間インキュベーションしたドナー3例の平均値。標的細胞:Daudi。抗体濃度はnM表示。
[図23]BEAT OX40/CD3抗体を示す概略図である。凡例:[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味する。[(A-)]は、非機能的プロテインA結合部位を意味する。
[図24]BEAT OX40/CD3抗体によるT細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-MTS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、20:1。48時間インキュベーションしたドナー3例の平均値。標的細胞:組換え安定CHO[OX40]細胞。抗体濃度はnM表示。
[図25]BEAT EGFR/CD3抗体を示す概略図である。凡例:[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味する。[(A-)]は、非機能的プロテインA結合部位を意味する。
[図26]BEAT EGFR/CD3抗体によるT細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-MTS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、10:1。48時間インキュベーションしたドナー4例の平均値。標的細胞:HT-29細胞。抗体濃度はnM表示。
[図27]BEAT CD38-HB7最良適合/CD3(SP34)(フォーマットA)及びBEATCD38-9G7最良適合/CD3(SP34-κ2)(フォーマットB)抗体を示す概略図である。[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味する。
[図28]BEAT CD38-HB7最良適合/CD3(SP34)抗体によるT細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-FACS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、10:1。24時間インキュベーションしたドナー3例の平均値。標的細胞:Daudi細胞。抗体濃度はnM表示。
[図29]SPRにより測定した、BEAT CD38-9G7最良適合/CD3(SP34-κ2)抗体とヒトCD3ε1-26_Fc融合タンパク質の間の抗体-抗原相互作用を示す図である。CM5センサーチップは、500RUのヒトCD3ε1-26_F融合タンパク質に共有結合させた。BEAT CD38-9G7最良適合/CD3(SP34-κ2)抗体を、HBS-P中にて、50、25、12.5、6.2、3.1、0.8、及び0.4nM、流速30μl/分で注入した。データを、時間(X軸)に対するレスポンスユニットの数(略号RU;Y軸)として表す。
[図30]BEAT CD38/CD3(SP34-κ2)抗体による、T細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-FACS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、10:1。24時間インキュベーションしたドナー3例の平均値。標的細胞:Daudi細胞。抗体濃度はnM表示。
[図31]BEAT CD20/CD3(SP34)抗体を示す概略図である。[(A+)]は、機能的プロテインA結合部位を意味する。
[図32]BEAT CD20/CD3(SP34)抗体による、T細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法:RDL-FACS法。エフェクター細胞:ヒトPBMC。エフェクター細胞:標的対象細胞の比は、10:1。24時間インキュベーションしたドナー3例の平均値。標的細胞:Daudi細胞。抗体濃度はnM表示。
ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ-三量体等と呼ばれる。ヘテロ多量体の例として、抗体分子が挙げられ、これは、その本来の形態において、2つの同一の軽鎖ポリペプチド、及び2つの同一の重鎖ポリペプチドから構成される。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、天然に修飾されたポリペプチド/タンパク質とも呼ばれ、そのような修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾により有効となる。かかる修飾は、当技術分野において周知されている。更に、本発明の目的に照らせば、「ポリペプチド」とは、修飾、例えば本来の配列に対する欠損、付加、及び置換等(これらは、本来保存的であり得る)を含むタンパク質を意味する。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるように計画的であり得る、又はタンパク質を生成する宿主の突然変異等又はPCR増幅に起因する過誤により、偶発的であり得る。
形を3つの異なる分子に分割し、2つは、いわゆる「Fab」又は「FAB」フラグメント(Fab=抗原結合フラグメント)、及び1つは、いわゆる「Fc」フラグメント又は「Fc領域」(Fc=結晶化可能なフラグメント)である。Fabフラグメントは、軽鎖の全部及び重鎖の一部から構成される。重鎖は、1つの可変領域(VH)と、3又は4つの定常領域(抗体クラス又はアイソタイプに応じてCH1、CH2、CH3、及びCH4)を含有する。CH1とCH2領域の間の領域は、ヒンジ領域と呼ばれ、Y字形抗体分子の2つのFabアーム間において可撓性を付与し、一定の距離で隔てられた2つの抗原決定基にうまく結合するように、2つのアームが開閉できるようにする。本明細書で引用する場合、「ヒンジ領域」とは、長さ6~62個のアミノ酸からなる配列領域であり、IgA、IgD、及びIgG中にのみ存在し、2本の重鎖を架橋するシステイン残基を含む。IgA、IgD、及びIgGの重鎖は、それぞれ4つの領域、すなわち1つの可変領域(VH)と3つの定常領域(CH1~3)を有する。IgE及びIgMは、1つの可変領域と4つの定常領域(CH1~4)を重鎖上に有する。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び補体系古典的経路の第1成分(C1q)を含む、宿主組織又は因子との結合に関与している可能性がある。各軽鎖は、1つの共有結合性のジスルフィド結合により、重鎖と通常結合する。各軽鎖は、1つの可変領域(VL)と1つの軽鎖定常領域を備える。軽鎖定常領域は、本明細書ではIGKCと呼ぶκ軽鎖定常領域である、又は本明細書ではIGLCと呼ぶλ軽鎖定常領域である。IGKCは、本明細書ではCκ又はCKと等価で用いられ、また同一の意味を有する。IGLCは、本明細書ではCλ又はCLと等価で用いられ、また同一の意味を有する。用語「IGLC領域」は、本明細書で用いる場合、すべてのλ軽鎖定常領域、例えばIGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6、及びIGLC7からなる群より選択されるすべてのλ軽鎖定常領域を意味する。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR又はFW)と呼ばれる、より保存性の領域と共に点在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され得る。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かい、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で配列している。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトープ結合領域を含む。工学的に作出された免疫グロブリンは、異なるエピトープ結合領域フォーマット、例えばscFv、FAB、又はdAbフラグメント等を含み得る。これらのフラグメントは、IgG Fc領域への遺伝子融合により、抗体様の構造に通常組み立てられる。工学的に作出された免疫グロブリンは、ヘテロ二量化増強法を使用して又は使用しないで、ホモ又はヘテロ二量体として構築され得るが、モノ又は二重特異性結合特性を有し得る。
あらゆるクラス及び/又はサブクラスを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプとして、IGHG1(IgG1)、IGHG2(IgG2)、IGHG3(IgG3)、IGHG4(IgG4)、IGHA1(IgA1)、IGHA2(IgA2)、IGHM(IgM)、IGHD(IgD)、及びIGHE(IgE)が挙げられる。いわゆるヒト免疫グロブリン擬ガンマーIGHGP遺伝子は、配列化されているが、スイッチ領域の変化に起因してタンパク質をコードしない追加のヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を表す(Bensmana Mら、(1988)Nucleic Acids Res、第16巻(7):3108頁)。スイッチ領域が変化しているにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン擬ガンマーIGHGP遺伝子は、すべての重鎖定常領域(CH1~CH3)及びヒンジについて、オープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常領域に関するすべてのオープンリーディングフレームは、予測された構造的特徴を有するすべてのヒト免疫グロブリン定常領域とよく一致するタンパク質領域をコードする。この更なる擬ガンマーアイソタイプは、本明細書では、IgGP又はIGHGPと呼ぶ。その他の擬免疫グロブリン遺伝子、例えばヒトグロブリン重鎖定常領域εP1及びP2擬遺伝子(IGHEP1及びIGHEP2)等も報告されている。IgGクラスが、治療目的で最も一般的に用いられる。ヒトでは、このクラスは、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む。マウスでは、このクラスは、サブクラスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、及びIgG3を含む。
プチドリンカーにより結合し、2つの領域が会合して抗原結合部位を形成するのを可能にしている単鎖Fvフラグメント(scFv)(Bird REら、(1988)Science、第242巻(4877):423~6頁;Huston JSら、(1988)Proc Natl Acad Sci、米国、第85巻(16):5879~83頁)、(vi)「二重特異性抗体」又は「三重特異性抗体」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性フラグメント(Holliger Pら、(1993)Proc Natl Acad Sci、米国、第90巻(14):6444~8頁;Tomlinson I、及びHolliger P、(2000)Methods Enzymol、第326巻:461~79頁)、(vii)scFv、二機能性抗体又はFc領域と融合した領域抗体、並びに(viii)同一の抗体又は異なる抗体と融合したscFvが含まれるが、但しこれらに限定されない。
の可変ドメインは、4つのFRを含み、主としてβ-シートコンフィギュレーションの構成を採り、ループを形成する3つの高度可変領域により連結される。各鎖内の高度可変領域は、FRにより接近して共に保持され、また他の鎖に由来する高度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat EAら、前出を参照)。用語「高度可変領域」とは、本明細書で用いる場合、抗原結合に関わる抗体のアミノ酸残基を意味する。高度可変領域は、後ろになるほど配列変動が最も高くなる及び/又は抗原認識に関与する「相補性決定領域(complementary determining region)」又は「CDR」に由来するアミノ酸残基を一般的に含む。可変領域のナンバリングは、すべてKabatに基づく(Kabat EAら、前出)。
Functional Genomics & Proteomics、第6巻(4):253~64頁)。すべての相補性決定領域(CDR)は、本発明で引用する場合、好ましくは以下のように定義される(Kabat EAら、前出によるナンバリング):LCDR1:24~34、LCDR2:50~56、LCDR3:89~98、HCDR1:26~35、HCDR2:50~65、HCDR3:95~102。
CH2、IGHEP1 CH2、IGHM CH2、IGHD CH2、IGHGP CH2、IGHG1 CH3、IGHG2 CH3、IGHG3 CH3、IGHG4 CH3、IGHA1 CH3、IGHA2 CH3、IGHE CH3、IGHEP1 CH3、IGHM CH3、IGHD CH3、IGHGP CH3、IGHE CH4
及び IGHM CH4からなる、但しこれらに限定されない群から選択される。好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのIGHE CH2、IGHM CH2、IGHG1 CH3、IGHG2 CH3、IGHG3 CH3、IGHG4 CH3、IGHA1 CH3、IGHA2 CH3、IGHE CH3、IGHM CH3、IGHD
CH3 及び IGHGP CH3からなる群より選択される。より好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのIGHG1 CH3、IGHG2 CH3、IGHG3 CH3、IGHG4 CH3、IGHA1 CH3、IGHA2 CH3、IGHE CH3、IGHM CH3、IGHD CH3、及びIGHGP CH3からなる群より選択される。
ントが含まれる。天然由来の抗体は、抗原結合、又は複合部位、又はパラトープとしても公知である2つのエピトープ結合領域を有する。天然由来の抗体中のエピトープ結合領域は、VH及び/又はVLドメインのCDR領域内に限局しており、そこでアミノ酸媒介性のエピトープ結合が見出される。天然由来の抗体に付加して、人工的なVHドメイン、又はVLドメイン、又はそのフラグメント、及びその組み合わせを工学的に作出して、エピトープ結合領域を提供することができる(Holt LJら、(2003)Trends
Biotechnol、第21巻(11):484~490頁;Polonelli Lら、(2008)PLoS ONE、第3巻(6):e2371頁)。非免疫グロブリンに基づくエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域を工学的に作出するための「スキャフォールド」として用いられる人工タンパク質ドメイン(Binz HKら、(2005)Nat Biotechnol、第23巻(10):1257~1268頁)、又はペプチド模倣体(Murali R、及びGreene MI(2012)Pharmaceuticals、第5巻(2):209~235頁)に見出すことができる。好ましくは、用語「エピトープ結合領域」には、免疫グロブリン分子が1つ又は複数のエピトープと特異的に結合可能にする結合部位を共に形成する、1つ又は複数の重鎖可変ドメインと1つ又は複数の相補的な軽鎖可変ドメインとの組み合わせが含まれる。本発明に例示するようなエピトープ結合領域の例として、scFv及びFABが挙げられる。
異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、2本のポリペプチド鎖を含み、第1の鎖は、第2の鎖とは非同一の少なくとも1つの領域を有し、また両方の鎖はその非同一領域を介して会合する、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、少なくとも2つの異なるリガンド、抗原、又は結合部位に対して結合特異性を有する、すなわち二重特異性である。ヘテロ二量体免疫グロブリンには、本明細書で用いる場合、完全長二重特異性抗体、二重特異性Fab、二重特異性F(ab’)2、Fc
領域と融合した二重特異性scFv、Fc領域と融合した二機能性抗体、及びFc領域と融合したドメイン抗体が含まれるが、但しこれらに限定されない。
り検出される。
、VEGFR1、VEGFR2、NCAM、CD133、CD123、ADAM17、MCSP、PSCA、FOLR1、CD19、CD20、CD38、EpCAM、HER2、HER3、EGFR、PSMA、IgE、インテグリンa4b1、CCR5、LewisY、FAP、MUC-1、Wue-1、MSP、EGFRvIII、Pグリコプロテイン、AFP、ALK、BAGEタンパク質、CD30、CD40、CTLA4、ErbB3、ErbB4、メソテリン、OX40、CA125、CAIX、CD66e、cMet、EphA2、HGF/SF、MUC1、ホスファチジルセリン、TAG-72、TPBG、β-カテニン、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、カスパーゼ-8、CDK4、サイクリン-B1、CYP1B1、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、ゲージ-1、ゲージ-2、GloboH、グリピカン-3、GM3、gp100、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、MAGE6、MAGE12、MART-1、ML-IAP、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR-85、NY-ESO1、p15、p53、PAP、PAX3 PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、RAGEタンパク質、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、スルビビン、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ、ウロプラキンn-3、PSMAからなる群より選択される疾患関連抗原とに結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはそのフラグメント、又は二重特異性抗体は、CD3とHER2、又はCD3とCD38、又はCD3とOX40とに結合する。
Sら、(2007)前出)。ヒトIgG3がプロテインAに結合できないのは、ヒトIgG3のFc領域内にはH435R及びY436F置換が存在することにより説明可能である(EUナンバリング、Jendebergら、(1997)J.Immunol.Methods、第201巻(1):25~34頁)。IgGの他に、プロテインAは、IgM及びIgAとも相互作用する。
に結合する能力は、その機能的な事前スクリーニングをし易くするので、VH3ベースの分子は幅広く開発されており、従って多くの合成若しくはドナーベースのファージディスプレーライブラリ、又は抗体の探索で用いられる遺伝子組換え動物技術は、VH3サブクラスに基づく。更に、VH3ベースの分子は、その他の公知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも発現及び安定性において良好であることから、頻繁に選択される。
質(その他のタンパク質、脂質、炭水化物、DNA、顔料等)は、カラムを通過可能である一方、標的タンパク質は通常吸着する。吸着剤そのものがクロマトグラフィーカラムに通常充填される;しかし、吸着段階は、バッチ結合モードにおいて、撹拌されたスラリーとして吸着剤を用いることにより実施可能である。吸着後の次の段階は洗浄段階であり、この段階では、残留汚染物質を除去するために、吸着剤が洗浄される。結合したタンパク質は、次に半純粋又は純粋の形態で溶出する。溶出は、タンパク質が、固定リガンドともはや相互作用できず、遊離するように、バッファー又は塩組成を変更することにより通常達成される。いくつかの事例では、対象とするタンパク質は、アフィニティー樹脂に結合しない場合もあり、またアフィニティークロマトグラフィーは、望ましくない汚染物質を結合させるのが目的であり、従って対象とするタンパク質を単離するために未結合分画が収集される。アフィニティークロマトグラフィーは、固定化したベッド又は流動化したベッド内でも実施可能である。
本発明は、上記のような重鎖及び軽鎖CDRを含み、またヒト遺伝子IGHV3-23*04(配列番号22)の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を更に含むCD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号18のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体OKT3の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、7つ以下、好ましくは6つ以下、好ましくは5つ以下、好ましくは4つ以下、より好ましくは3つ以下、なおいっそうより好ましくは2つ以下、最も好ましくは1つを超えないアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施形態では、本開示は、CD3タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供し、この場合、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は、34、48、49、58、69、71、及び73からなる群より選択されるアミノ酸の位置においてアミノ酸置換を含み:また、各群メンバーのアミノ酸の位置は、Kabatナンバリングに基づき示される。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、I34M、V48I、A49G、R58N、R58Y、I69L、A71T、及びT73Kからなる群より選択される。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、34、49、及び71からなる群より選択されるアミノ酸の位置にある。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、I34M、A49G、及びA71Tからなる群より選択される。
ましくは5つ以下、好ましくは4つ以下、より好ましくは3つ以下、なおいっそうより好ましくは2つ以下、最も好ましくは1つを超えないアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施形態では、本開示は、CD3タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供し、この場合、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は、4、33、34、46、47、66、71、及び96からなる群より選択されるアミノ酸の位置においてアミノ酸置換を含む。好ましくは、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、M4L、V33M、A34N、L46R、L47W、R66G、F71Y、及びP96Fからなる群より選択される。軽鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、4、46、及び47からなる群より選択されるアミノ酸の位置にある。軽鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、M4L、L46R、L47W、及びF71Yからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、CD3タンパク質複合体と結合する第1のポリペプチドのエピトープ結合領域は、上記のような重鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾、及び上記のような軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾を含み得る。
ヘテロ二量体免疫グロブリンを生成する方法は、当技術分野において公知であり、最も単純な方法の1つは、2つの異なる免疫グロブリン鎖の単細胞内発現法に準拠する(国際公開第95/33844号、Lindhofer H、及びThierfelder S)。工学を用いないこの単純な方法は、対象とするヘテロ二量体よりもホモ二量体種が形成されることにより制限される(Kufer Pら、(2004)Trends Biotechnol.、第22巻(5):238~244頁)。重鎖のヘテロ二量化を強化する相補的な技術を用いると(Merchant AMら、(1998)Nat.Biotechnol.、第16巻(7):677~681頁)、より多くのヘテロ二量体の生成を実現し得るが、なおも有意な量の望ましくないホモ二量体の生成を引き起こす(Jackman Jら、(2010)J Biol Chem.、第285巻(27):20850~9頁;Klein Cら、(2012)MAbs、第4巻(6):653~63頁)。従って、本発明は、BEAT(登録商標)技術に記載されている方法を利用するが(PCT公開番号:国際公開第2012/131555号)、同方法は、先行技術の方法よりも優れたヘテロ二量体化を示すバイオミミクリーという独自の概念に基づく。BEAT技術は、天然由来のホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメインの対間の界面交換に基づき、Fcベースの二重特異性抗体のための構成ブロックとして利用可能である新規のヘテロ二量体を生み出す。
面は、3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、88、及び90(IMGT(登録商標)ナンバリング)からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、並びに第2のポリペプチドのタンパク質-タンパク質界面は、84.4の位置及び3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、88、及び90(IMGT(登録商標)ナンバリング)からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む。
内で置換される更なるアミノ酸残基は、3A、20K、22V、26T、79Y、85.1S、86V、及び90Nであり、また第2の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質-タンパク質界面内で、85.1及び86の位置において置換されるアミノ酸残基は、85.1A、85.1S、又は85.1A、及び86Sであり、並びに第2の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質-タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、3E、5A、7F、20T、22V、26T、81D、84L、84.2E、84.4Q、88R、及び90Rである(IMGT(登録商標)ナンバリング)。
そして第2の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質-タンパク質界面内で、26の位置において置換されるアミノ酸残基は、26T及び26E、並びにその保存的なアミノ酸置換からなる群より選択されるが、但しアミノ酸の位置は、IMGT(登録商標)ナンバリングに基づき表される。
第1のステップ(実施例1)として、プロテインAとの結合を低減する又は無効にする置換を、FAB又はscFvフラグメントに基づくホモ二量体免疫グロブリンについてアッセイした。プロテインAとの結合を低減する又は無効にするための置換を有するVH3サブクラスの可変重鎖ドメインが重鎖内に存在すると、プロテインAに基づくあらゆる差動的アフィニティー法は妨害されることが判明した。このような重要な障害に対する解決策は、プロテインAに基づく差動的アフィニティー法において、プロテインAがVH3サブクラスと結合するのを低減する又は無効にするフレームワーク置換の形態で見出された。
を得た。更に、BEAT抗体の安全性プロファイルを改善するために、Fc領域の下部ヒンジ領域内に2つの置換L234A及びL235A(EUナンバリング)を工学的に作出することにより、Fc受容体結合を低減又は除去した。
一過性哺乳動物細胞発現用の発現ベクターの構築
異なるポリペプチド鎖を一部又は全部コードするcDNAを、GENEART AG(Regensburg、ドイツ)により最初に遺伝子合成し、これを標準的な分子生物学技法を用いて修飾した。PCR生成物を、適するDNA制限酵素で消化、精製を行い、そしてCMVプロモーター及び同じDNA制限酵素で予め消化しておいたウシホルモンポリアデニル化物(ポリ(A))を担持する修飾されたpcDNA3.1プラスミド(Invitrogen AG社、Zug、スイス)にライゲートした。すべてのポリペプチド鎖を、この発現ベクターに独立にライゲートし、同ベクターにおいて、マウスVJ2Cリーダーペプチドにより分泌を行わせた。
抗体、ScFv-Fc融合タンパク質、BEAT抗体、及び抗原は、別途明示しない限り、以下に記載するように発現した。一過性発現の場合、工学的に作出された鎖それぞれについて等量のベクターを、ポリエチレンイミン(PEI;Sigma社、Buchs、スイス)を用いて、懸濁順応化(suspension-adapted)HEK293-EBNA細胞(ATCC-LGL標準品、Teddington、英国;カタログ番号:CRL-10852)に同時トランスフェクトした。一般的に、密度が1ml当たり細胞0.8~1.2百万個である懸濁状態の細胞100mlをDNA-PEI混合物と共にトランスフェクトする。各工学的に作出された鎖の遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、免疫グロブリン構築物が、細胞を4~5日間、更に培養することにより産生され、培養培地(0.1%プルロニック酸、4mMグルタミン、及び0.25μg/mlジェネテシンが補充されたEX-CELL293、HEK293-無血清培地(Sigma社))中への分泌が可能となる。分泌された免疫グロブリンを含有する細胞を含まない培養物上清を、遠心分離とその後の滅菌濾過により調製し、更なる分析で用いた。
Fc133フラグメント及びホモ二量体scFv-Fc免疫グロブリンの精製
捕捉溶出モードクロマトグラフィー
上清を、精製前に、0.1容量(V)の1Mトリス-HCl、pH8.0で調整した。プロテインGセファロース(商標)4 Fast Flow(GE Healthcare Europe GmbH社、Glattbrugg、スイス;カタログ番号17-0618-01)を、調整後の上清に添加した。混合物を、4℃、オーバーナイトでインキュベーションした。インキュベーション後、結合したタンパク質を、10CVのPBS、pH7.4で洗浄し、4カラムボリューム(CV)の0.1Mグリシン、pH3.0で溶出し、そして0.1Vの1Mトリス-HCl、pH8.0で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をSDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4~12%アクリルアミド、Invitrogen AG社、Basel、スイス)により非還元条件下で分析した。
生成後、Fc133フラグメントを含有する細胞培養物上清を、プロテインGセファロース(商標)4 Fast Flow(上記)を用いて、捕捉溶出モードクロマトグラフィーで最初に精製した。捕捉溶出モードクロマトグラフィーから得られた溶出物質を、1
mlのHiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム(プロテインA結合部位突然変異体)にその後負荷した。カラムを0.2Mリン酸クエン酸バッファー、pH8.0で事前に平衡化し、そしてAKTApurifier(商標)クロマトグラフィーシステム(カラム及び装置はいずれもGE Healthcare Europe GmbH社;カラムカタログ番号:11-0034-93)上、流速1ml/分で稼働させた。様々な量の2つのバッファー(泳動バッファー(A):0.2Mリン酸クエン酸バッファー、pH8.0、及び溶出バッファー(B):0.04Mリン酸クエン酸バッファー、pH3.0)を混合しながら、pHリニアグラジエントにより溶出を実施した。リニアグラジエントを、0%Bから100%Bまで5カラムボリューム(CV)で実施した。溶出分画を0.1Vの1Mトリス-HCl、pH8.0で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画を、SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、Invitrogen AG社、Basel、スイス)により非還元条件下で分析した。
生成後、細胞培養物上清を、0.1Vの1Mトリス-HCl、pH8.0で調整した。プロテインL樹脂(Genecript、Piscataway、米国)を調整後の上清に添加し、4℃、オーバーナイトでインキュベーションした。インキュベーション後、結合したタンパク質を10CVのPBS、pH7.4で洗浄し、4CVの0.1Mグリシン、pH3.0で溶出し、そして最終的に0.1Vの1Mトリス-HCl、pH8.0で中和した。プロテインA結合を評価するために、プロテインL精製後のFABを、1mlのHiTrap MabSelect(商標)カラム(GE Healthcare Europe GmbH社、Glattbrugg、スイス)に、pH8.0(クエン酸/Na2HPO4バッファー)にて注入した。様々な量の2つのバッファー(泳動バッファー(A):0.2Mリン酸クエン酸バッファーpH8.0、及び溶出バッファー(B):0.04Mリン酸クエン酸バッファー、pH3.0)を混合して、pHリニアグラジエントにより溶出を実施した。リニアグラジエントを、0%Bから100%Bまで5CVで実施した。溶出分画を0.1Vの1Mトリス-HCl、pH8.0で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画を、SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4~12%アクリルアミド、Invitrogen AG社、Basel、スイス)により非還元条件下で分析した。
精製スキームには、上記手順に基づき、捕捉溶出モードクロマトグラフィーと、その後のグラジエントモードクロマトグラフィーが含まれた。
生成後、細胞を含まない上清を、0.2Mリン酸クエン酸バッファー、pH6.0中で事前に平衡化した1mlのHiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)プロテインAカラム上に負荷し、そしてAKTApurifier(商標)クロマトグラフィーシステム(いずれもGE Healthcare Europe GmbH社;カラムカタログ番号:11-0034-93)上、流速1ml/分で稼働させた。泳動バッファーは、0.2Mリン酸クエン酸バッファー、pH6であった。対象とするヘテロ二量体の溶出を、20mMクエン酸ナトリウムバッファー、pH4を用いて実施する一方、ホモ二量体種を0.1Mグリシン、pH3.0で溶出した。溶出の後に280nmでのOD読み取りが続いた;対象とするヘテロ二量体を含有する分画をプールし、0.1容量の1Mトリス、pH8.0(Sigma社)で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画を、SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、Invitrogen AG社、Basel、スイス)により非還元条件下で分析した。
抗体の熱安定性を、熱量測定法を用いて比較した。熱量測定を、VP-DSC示差走査式マイクロカロリメーター(differential scanning microcalorimeter)(MicroCal-GE Healthcare Europe GmbH社、Glattbrugg、スイス)上で実施した。細胞容積は0.128mlであり、加熱速度は1℃/分であり、また過剰圧力は64p.s.i.に保った。すべてのタンパク質フラグメントは、PBS(pH7.4)中、1~0.5mg/mlの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量を、同一のバッファーを含有するがタンパク質が省略された複製サンプルとの比較により見積もった。部分的なモル熱容量及び融解曲線を、標準手順を用いて分析した。サーモグラムはベースライン補正し、またソフトウェアOrigin v7.0内の非二状態モデル(Non-Two State model)を用いて更に分析する前に、濃度について標準化した。
非還元型サンプル調製
40μgの脱塩されたタンパク質サンプルを、5mMヨードアセトアミド(Sigma社)を含有するSDSサンプルバッファー(Beckman Coulter International S.A.社、Nyon、スイス;IgG純度キット、カタログ番号:A10663)内で緩衝化した。10kDaの内部標準をサンプルに添加した。サンプル混合物を70℃で10分間加熱した。
サンプル調製後、220nmに設定したフォトダイオードアレイ検出器(DAD)が取り付けられたProteomeLab PA 800(Beckman Coulter
International S.A.社、Nyon、スイス)上で、サンプルを測定した。ID50μm×30.2cm(検出器までの有効長さ20.2cm)のベア溶融シリカキャピラリー(Bare-fused silica Capillary)を分離メディアとして用いた。サンプル注入及び分離を、逆極性を用いて、SDS-分子量ゲルバッファー中にて、5及び15kVの一定電圧でそれぞれ実施した。2Hzの速度でデータを記録したが、電流は、分離期間中安定であった。キャピラリー及びサンプルを25℃にサーモスタット制御した。
プロテインA結合が無効にされたFABフラグメントのSPR試験
IGHG1 Fcフラグメントと融合したヒトHER2細胞外領域をコードするcDNAを、上記重鎖及び軽鎖発現ベクターと類似した発現ベクターにクローン化し、そしてPEI法を用いてHEK293E細胞に一時的にトランスフェクトした(PCT公開番号:国際公開第2012131555号を参照)。実施例1に記載するように、上清を0.1Vの1Mトリス-HCl、pH8.0で調整し、抗原をプロテインA捕捉溶出クロマトグ
ラフィーにより精製した。SPR実験の場合、モノクロナールマウス抗ヒトIgG (Fc)抗体センサーチップを用いたが、これは、Fc融合組換えHER2抗原を正しい向きで捕捉するのを可能にした(ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号BR-1008-39、GE Healthcare Europe GmbH社)。測定をBIAcore(商標)2000装置(GE Healthcare Europe GmbH社、Glattbrugg、スイス)上で記録した。抗HER2 FABの異なる希釈物(50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39nM)を、30μl/分で4分間、センサーチップ上に注入した。測定毎に、7分間の解離後、3MのMgCl2溶液を、30μl/分で1分間、再生目的で注入した。データ(センサーグラム:fc
2-fc1)を1:1ラングミュアで近似した。各測定開始時に、捕捉されたHER2-Fcの実験変動を説明するために、すべての近似においてRmax値をローカルに設定した。二重で測定を実施し、参照用としてゼロ濃度サンプルを含めた。実験データと個々の結合モデルとの間の近似の質を評価するために、Chi2及び残差の両方の値を用いた。
SPR分析を、異なる抗体(マウス及びヒト化抗体)の結合キネティクスに関する結合解離速度定数(association and dissociation rate
constant)を測定するのに用いた。抗体の結合キネティクスを、BIAcore 2000装置(BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH社、Glattbrugg、スイス)上、室温で測定し、BiaEvaluationソフトウェア(バージョン4.1、BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH社)を用いて分析した。CM5センサーチップ(GE Healthcare Europe GmbH社、カタログ番号:BR-1000-14)上で、市販のアミンカップリングキット(GE Healthcare Europe GmbH社、カタログ番号:BR-1000-50)を用いて対象とするリガンドと個々に結合させて測定を実施した。プロテインGリガンドは、Pierce社製(Thermo Fisher Scientific-Perbio Science S.A.、Lausanne、スイス、カタログ番号:21193)であった。
FACS染色では、HPB-ALL細胞(DSMZ、Braunschweig、ドイツ、カタログ番号:ACC483)を、CD3陽性細胞系として用いた。HPB-ALLを10%のFCS及び100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンが補充されたRPMI 1640内で維持した。OKT3キメラ抗体及びヒト化変異体の希釈系列、100μlを、4×105個のHPB-ALL細胞と共に、1%のBS
A及び0.1%のアジ化ソーダが補充されたPBS(FACSバッファーと呼ばれる)内、氷上で、45分間インキュベーションした。無関係のヒトIgG1を、アイソタイプコントロールとして、またOKT3キメラ抗体を陽性対照として用いた。洗浄後、細胞を、1/200に希釈した抗ヒトFc-PE(EBioscience社、Vienna、オーストリア)と共に、氷上で45分間インキュベーションした。次に、細胞を再度洗浄し、FACSバッファー、200μl中に再懸濁した。各サンプルの相対的な平均蛍光強度を、FACSCalibur(BD Biosciences社、Allschwil、スイス)上で測定し、結果をOKT3キメラ抗体と比較したHBP-ALLの相対的な染
色強度として図9にまとめる。
ヒトHER2陽性細胞系統
HER2抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010108127号に記載されている。本明細書で用いられるHER2陽性ヒト細胞系統は、以下の通りであった:
BT474(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:HTB-20)
培養条件:150cm2の組織培養フラスコ(TPP、Trasadingen、スイス
;カタログ番号:90150)中、10%の熱失活したFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG社、カタログ番号:10378-016)、1%のピルビン酸ナトリウム溶液(PAA Laboratories社、Pasching、オーストリア;カタログ番号:S11-003)、1%のMEM非必須アミノ酸(PAA Laboratories社、カタログ番号:M11-00dsmz3)、及び1%のGlutaMAX-1(Invitrogen AG社、カタログ番号:35050-038)が補充されたRPMI培地。細胞を1週間に2回継代した。
JIMT-1(DSMZ、Braunschweig、ドイツ、カタログ番号:ACC589)
培養条件:10%の熱失活したFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG社、カタログ番号:10378-016)、1%のピルビン酸ナトリウム溶液(PAA Laboratories社、カタログ番号:S11-003)、1%のMEM非必須アミノ酸(PAA Laboratories社、カタログ番号:M11-003)、及び1%のGlutaMAX-1(Invitrogen AG社、カタログ番号:35050-038)が補充されたダルベッコ改変必須培地(Dulbecco’s modified essential medium)(DMEM(1×))+GlutaMAX-1(Invitrogen AG社、カタログ番号:31966-012)。細胞を1週間に2~3回継代した。
MDA-MB-231(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:HTB-26)。
培養条件:JIMT-1と同一の培養条件。
HT-1080(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-121)。
培養条件:10%の熱失活したFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG社、カタログ番号:10378-016)、及び1%のグルタミン(Invitrogen AG社、カタログ番号:25030-024)が補充されたEMEM培地内で、HT1080細胞を培養した。細胞は、1週間に3回分裂するように培養する(1/6希釈)。
NCI-N87(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-5822)。
培養条件:NCI-N87細胞は、10%の熱失活したFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG社、カタログ番号:10378-016)、1%のピルビン酸ナトリウム溶液(PAA Laboratories社、Pasching、オーストリア;カタログ番号:S11-003)、1%のMEM非必須アミノ酸(PAA Laboratories社、カタログ番号:M11-00dsmz3)、及び1%のグルタミン(Invitrogen AG社、カタログ番号:25030-024)を含むRPMI1640培地内で培養する。細胞は、1週間に2回分裂する(1/3希釈)。
CD38抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2005103083号、同第2008047242号、同第2011154453号、及び同第2012092612号に記載されている。本明細書で用いられるCD38陽性ヒト細胞系統は、以下の通りであった:
安定な組換えCHO[CD38]細胞
ヒトCD38をコードする遺伝子をSource Biosciences社に発注した(Berlin、ドイツ、カタログ番号.:IRAU37D11、4309086)。Kozak配列、開始コドンとこれに続くシグナルペプチド(マウスVリーダー)を5’末端に、及びNheI制限部位を3’末端に付加するプライマーを用いて、ヒトCD38を増幅した。アンプリコンをNheIとHindIIIを用いて切り出し、そしてpT1の発現カセットにクローン化し、pcDNA3.1(Invitrogen AG社)由来のベクターを社内で開発した。pT1の発現カセットは、2つのIRES(配列内リボソーム進入部位)を用いて、多シストロン性mRNA上で、対象遺伝子の発現をGFP及びPAC(ピュロマイシン耐性遺伝子)の発現と結びつける。プラスミドのミディプレップを調製し、クローン化したCD38のオープンリーディングフレームを、DNA配列決定により確認した。CHO-S細胞懸濁物(Invitrogen AG)を、ポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、Polyplus-transfection、Illkirch、フランス)を用いて、50mlのバイオリアクターフォーマット(TubeSpin50バイオリアクター、TPP、Trasadingen、スイス)中でトランスフェクトした。この目的のために、指数増殖細胞を、OptiMEM培地(Invitrogen AG社、カタログ番号.:31985-047)に播種した。JetPEI(登録商標):DNA複合体を細胞に添加した。エンドサイトーシスを目的として、細胞をJetPEI(登録商標):DNA複合体と共に、振盪(200RPM)しながら37℃で5時間インキュベーションした後、4mMのGlnが補充された1容量の培養培地PowerCHO2(Lonza社、RUWAG Lifescienceの販売業者、Bettlach、スイス、カタログ番号:BE12-771Q)を、細胞懸濁物に添加した。次に、37℃、5%のCO2及び80%の湿度にて、振盪プラットフォーム上で細胞をインキュベーションした。トランスフェクション後1日経過して、ピュロマイシン(Sigma社、カタログ番号:P8833-25mg)を含有する選択培地中、異なる濃度で、細胞を96ウェルプレートに播種した。静的条件下での選択から約14日後に、TubeSpin50バイオリアクターを用いて、46個の高GFP発現細胞プール品を、懸濁培養物として増殖させた。懸濁にうまく順応したら、細胞をFACSによりCD38について分析した。均質なCD38染色プロファイルを有する安定なCHO[CD38]クローンを選択し、本発明で用いた。
その他のCD38陽性細胞系統として下記のものが含まれた:
NCI-H929(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-9068)。
Namalwa(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-1432)。
U266(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:TIB-196)。
RPMI 8226(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-155)。
培養条件:10%の熱失活したFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG)、及び1%のGlutaMAX-1(Invitrogen AG)が補充されたRPMI1640培地。
Raji(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-86)。
Daudi(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-213)。
OX40抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2013008171号に記載されている。
末梢血液単核球(PBMC)及びHBP-ALLは、ヒトOX40陽性細胞系統の例である。
安定な組換えCHO[OX40]細胞を本発明で用いた。ヒトOX40をコードする合成cDNAを担持する組換えCHO細胞系統を、上記安定な組換えCHO[CD38]細胞系統のプロトコールと類似したプロトコールを用いて工学的に作出した。
CD20抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010095031号に記載されている。CD20+癌細胞の例として、Daudi癌細胞系統(ATCC-LGL標準品; カタログ番号:CCL-213)が挙げられ、このようなBリンパ芽球癌細胞は、20%のFBS及び1%のP/S;1%のL-Glut;1%のNa-Pyr及び1%のNEAAが補充されたRPMI1640培地(Sigma社)内で培養する。細胞は、5%のCO2を補給しながら37℃で培養する。
EGFR抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010108127号に記載されている。EGFR+癌細胞の例として、HT-29癌細胞系統(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:HTB-38)が挙げられ、このような結腸直腸癌細胞は、10%のFBS及び1%のP/S;1%のL-Glut;1%のNa-Pyr及び1%のNEAAが補充されたマッコイの5A培地(Sigma社)内で培養する。細胞は、5%のCO2を補給しながら37℃で培養する。
CD19抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010/095031号に記載されている。Namalwa(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-1432)及びRaji ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-86)は、ヒトCD20陽性細胞系統の例である。
PCT公開番号:国際公開第2010/033736号の71頁には、インターロイキン-4(IL-4)及び抗CD40抗体の添加による、ヒトPBMCをIgE産生B細胞にクラス変換する方法について記載する。
ヒトCD3γ-ε-Fc融合タンパク質
26残基ペプチドリンカー(配列:GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS;配列番号186)により、ヒトCD3ε細胞外領域(UniProt受け入れ番号:P07766、残基22~118(配列番号185))と融合したヒトCD3γ細胞外領域(UniProt受け入れ番号:P09693残基23~103(配列番号184);UniProtコンソーシアム(2013)Nucleic acids Res.、第41巻(データベース版):D43-7;http://www.uniprot.org/)をコードするcDNAを、GENEART AG(Regensburg、ドイツ)により最初に合成した。この合成遺伝子を、標準的なオーバーラップPCR法を用いてヒトIgG1 Fc部分に融合させ、またヒトIgG1 Fc cDNAテンプレートもGeneart AGから取得した。得られたcDNAを、上記修飾されたpcDNA3.1プラスミドにクローン化した。
ヒトCD3εペプチド 1-26(UniProt受け入れ番号:P07766、アミ
ノ酸23~48、配列番号188)をコードするcDNA、及びカニクイザルCD3εペプチド1-26(UniProt受け入れ番号:Q95LI5、アミノ酸22~47、配列番号189)をコードするcDNAを、ヒト及びカニクイザルCD3ε細胞外領域について、GENEART A.G.から取得した合成cDNAからそれぞれPCR増幅した。その後、標準的なオーバーラップPCR法を用いて、増幅生成物をヒトIgG1 Fc部分に融合させた。ヒトIgG1 Fc cDNAテンプレートを、Geneart AGから取得した。得られたcDNAを上記の修飾されたpcDNA3.1プラスミドにクローン化した。
HER2可溶性細胞外領域の調製法は、PCT公開番号:国際公開第2012131555号に記載されている。ポリ-ヒスチジンタグと融合したヒトHER2可溶性細胞外領域(本明細書では、HER2-hisと呼ぶ)、又はヒトIgG1 Fc領域と融合したヒトHER2可溶性細胞外領域(本明細書では、HER2-Fcと呼ぶ)を調製した。
ヒトCD38に関するcDNAを、Source Biosciences(Erwin-Negelein-Haus、ドイツ、カタログ番号.:IRAU37D11、4309086)から取得し、その細胞外領域(UniProt 受け入れ番号:P28907残基43~300)を、PCR増幅し、pcDNA3.1(Invitrogen AG社)に由来する内作の発現ベクターにクローン化した。この発現ベクターは、kozak配列及び開始コドンとこれに続くマウスVJ2Cリーダーペプチドを5’末端に、並びに6-His-タグをその多重クローニング部位の3’末端に含んだ。6-His-タグ(配列番号192)と融合したヒトCD38の可溶性細胞外領域を発現させ、以下の通り精製した:HEK細胞、0.1%のプルロニック酸(Invitrogen AG社)、発現ベクター、及びポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、Polyplus-transfection社、Illkirch、フランス)を含有する1容量のRPMI1640培地(PAA Laboratories社、カタログ番号:E15-039)を、37℃、5%のCO2、及び80%の湿度においてシェイカーフラスコ内でイン
キュベーションした。4時間後に、6mMのグルタミンが補充された1容量のExCell293培地を混合物に添加し、そしてインキュベーションを合計5日間、更に継続した。生成後、遠心分離により細胞を含まない上清を調製し、そして0.2μmフィルターを用いて濾過し、トリス1M、pH8.7を用いてpHを7.4(4℃)に調整した。Ni-Sepharose Excellビーズ(GE Healthcare社、カタログ番号:17-3712-03)を溶液に添加し、4℃、撹拌下、オーバーナイトでインキュベーションした。重力流精製するために、溶液を、Econo-Column(Bio-Rad Laboratories AG社、Reinach、スイス、カタログ番号:737-4252)に負荷した。PBS(2×)、20mMのイミダゾール中でビーズを洗浄し、そしてタンパク質を、PBS、500mMのイミダゾール中で溶出した。溶出した分画をプールし、そして4℃での2回の透析ステップによりPBSにバッファー交換した。精製されたヒトCD38細胞外領域を、0.22μmのシリンジフィルターを用い
て濾過した。
上記のような方法を用いて、6-His-タグ(配列番号193)と融合したカニクイザルCD38抗原の可溶性細胞外領域について、クローン化、発現、及び精製を行った。
ヒトOX40の可溶性細胞外領域を調製する方法は、PCT公開番号:国際公開第2013008171号に記載されている。
EGFR可溶性細胞外領域抗原の調製の例は、PCT公開番号:国際公開第2012131555号に記載されている。
末梢血液単核球の調製
末梢血液単核球(PBMC)を生成するために、ヒト白血球を含有する血液フィルターを、スイス、La Chaux-de-Fondsの血液収集センター(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie、rue Sophie-Mairet 29、CH-2300)から収集した。10U/mlのliquemin(Drossapharm AG社、Lucern、スイス)を含有するPBS、60mlを用いて、逆流置換により細胞をフィルターから取り出した。次に、製造業者の説明書に従い、50mLのBlood-Sep-Filterチューブ(Brunschwig、Basel、スイス)でPBMCを精製した。チューブを800g、室温で20分間遠心分離し(ブレーキ操作無し)、細胞を界面から収集した。細胞を、FBS又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含まないRoswell Park Memorial Institute(RPMI、PAA
Laboratories社、Pasching、オーストリア)培地で3回洗浄した。PBMCをRDL培地(10%の熱失活したウシ胎仔血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたRPMI)内で細胞10e6個/mLに再懸濁し、アッセイ前に、5%のCO2インキュベータ内、37℃、オーバーナイトで培養した。
T細胞の精製を、PBMC単離後、製造業者の説明書に従い、pan-T cellアイソレーションキットII(Myltenyi Biotec GmbH社、Bergisch Gladbach、ドイツ、カタログ番号:130-091-156)を用いて直接実施した。精製後、T細胞をRDL培地内で細胞10e6個/mLに再懸濁し、アッセイ前に、5%のCO2インキュベータ内、37℃、オーバーナイトで培養した。
非常に類似した結果をもたらした2つの異なる読み取り法を、リディレクテッドキリングを定量化するのに用いた。
フローサイトメトリー法は、本明細書ではRDL-FACS法と呼ぶが、同法はSchlereth Bら((2005)Cancer Res、第65巻:2882~2889頁)、Moore PAら((2011)Blood、第117巻(17):4542~51頁)、及びFriedrich Mら((2012)Mol Cancer Ther、第11巻:2664~2673頁)に記載されるように、蛍光-サイトメトリーに基づく。標的細胞を捕集、計測し、1回洗浄した後、PBS+1μMのカルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル(CFSE、Sigma社)中、細胞5×10e6個/mLで再懸濁した。細胞を、5分毎に穏やかに撹拌しながら15分間、37℃でインキュベーションした。CFSEを負荷した細胞を、RDL培地で3回洗浄し、RDL培地内で細胞2×10e5個/mLに再懸濁した。PBMCを捕集、計測し、そしてRDL培地内
で細胞2×10e6個/mLに再懸濁した。抗体連続希釈物(3×溶液)を、RDL培地内で調製した。標的細胞(50μl/ウェル)、T細胞(50μl/ウェル)、及び3×抗体溶液(50μl/ウェル)を、平底96ウェルプレート(TPP、Trasadingen、スイス)に分配した。エフェクター:標的物の比は10:1であった。プレートを、5%のCO2インキュベータ中、37℃で48時間インキュベーションした。インキ
ュベーション後、プレートを300gで3分間遠心分離し、プレートをフリッキングして上清を廃棄した。プレートを、200μlのPBSで1回洗浄し、再度遠心分離し、そしてPBSを廃棄した。予備加温したaccutase溶液(Invitrogen AG社)を添加し、プレートを37℃で10分間インキュベーションした。100μLのRDL培地を添加した後、上下にピペッティングして、脱離した接着細胞を再懸濁した。溶液を、底部がU字形の96ウェルプレート(TPP)に移した。底部がU字形のプレートを、300gで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、そして1/40希釈で7-AAD(Becton Dickinson AG社、Allschwil、スイス)が補充された冷却FACSバッファー(PBS+2%のFBS+10%のバーセネート液)、200μl内で、細胞を再懸濁した。プレートを、Guava easyCyte(商標)フローサイトメーター(Millipore AG社、Zug、スイス)上に速やかに確保した。各ウェルについて、Flowjo(登録商標)ソフトウェア(Miltenyi Biotec GmbH社、Bergisch Gladbach、ドイツ)を用いて、CFSE陽性7ADD陰性母集団についてゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベーションした条件を用いて、特異的細胞毒性の割合(%)をサンプル毎に決定した。Prismソフトウェア(GraphPad software社、La Jolla、CA、米国)を用いた非線形可変スロープ回帰法(nonlinear variable slope regression method)を利用して、EC50値を決定した。特異的リダイレクト溶解(specific re-directed lysis)(RDL)の割合(%)を、抗体を含まない条件の特異的細胞毒性の割合(%)を、試験抗体を添加した条件での割合(%)から減じることにより計算した。
ション後、上清を廃棄し、プレートを200μLのPBSで3回洗浄してPBMCを取り出し、次に100μlのRDL培地を各ウェルに添加した。読み取りをCellTiter96(登録商標)キット(Promega AG社、Dubendorf、スイス)を用いて、製造業者の説明書に従い実施した。要するに、10~20μlのMTS試薬を、各ウェルに添加し、そしてプレートを、5%のCO2インキュベータ内、37℃で2~6
時間インキュベーションした。次に、BioTek synergyプレートリーダー(BioTek AG社、Luzern、スイス)上で、490nmの吸収を読み取った。特異的キリングの割合(%)を以下の式を用いて計算した:特異的キリング=100×[(SD-Sp)/(SD-MD)]。SDは、標的細胞を単独でインキュベーションした自然死条件において測定された吸収である。Spは、各試験条件で測定された吸収である
(標的細胞+PBMC+抗体)。MDは、標的細胞を3回の凍結及び解凍サイクルにより溶解させた最大死亡条件において測定された吸収である。特異的リダイレクト溶解(RDL)の割合(%)は、抗体を含まない条件の特異的細胞毒性の割合(%)を、試験抗体を添加した条件の特異的細胞毒性の割合(%)から減じて計算した。Prismソフトウェア(GraphPad software社)を用いた非線形可変スロープ回帰法を利用して、EC50値を決定した。
JIMT-1異種移植
細胞系統及び試薬
乳癌JIMT-1細胞系統を、DSMZ(カタログ番号:ACC589)から取得した。10%の熱失活したウシ胎仔血清(FBS)(AMIMED、London、英国、カタログ番号:Z10834P)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG社、カタログ番号:10378-016)、1%のピルビン酸ナトリウム溶液(PAA Laboratories社、カタログ番号:S11-003)、1%のMEM非必須アミノ酸(PAA Laboratories社、カタログ番号:M11-003)、及び1%のGlutaMAX(商標)-1(Invitrogen AG社、カタログ番号:35050-038)が補充されたGlutaMAX(商標)-1(Invitrogen AG社、カタログ番号:31966-021)を含むDMEM(1×)内で細胞を維持した。StemPro Accutase(Invitrogen AG社、カタログ番号:A11105-01)を用いて、細胞を1週間に2回分裂させた。
Laboratoire de Serologie、rue Sophie-Mairet 29、CH-2300)から入手したヒト白血球を含有する血液フィルターから収集した。10U/mlのliquemin(Drossapharm AG社、Lucern、スイス)を含有するPBS、60mlを用いて、逆流置換により細胞をフィルターから取り出した。次に、製造業者の説明書に従い、50mLのBlood-Sep-Filterチューブ(Brunschwig社、Basel、スイス)でPBMCを単離した:チューブを800g、室温で20分間遠心分離し(ブレーキ操作無し)、細胞を界面から収集した。細胞を、FBSを含まないRoswell Park Memorial Institute培地(RPMI、Invitrogen AG社、カタログ番号:21875-091)で3回洗浄した。PBMCを、10%のFBS(AMIMED)、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG社)が補充されたRPMI培地内で細胞10e6個/mlに再懸濁し、そして5%のCO2の下、37℃
、オーバーナイトで培養した。標的細胞を捕集、計測し、1回洗浄した後、PBS内で細胞5×10e6個/mlに再懸濁した。
T細胞、B細胞、及びナチュラルキラー細胞の欠損により特徴付けられる5週齢免疫不全NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj (NOD/SCID)メスマウス(Janvier Labs社、St Berthevin、フランス)を対象としてin vivo実験を実施した。標準齧歯類マイクロアイソレータケージ(20±1℃の室温、50±10%の相対湿度、12時間明光-暗光リズム)内、滅菌状態の標準化された環境条件下でマウスを維持した。マウスには照射済み食料、床敷き、及び0.22μm濾過済み飲料水を与えた。管轄する州当局(Neuchatel Canton、スイス)から許可を得て、スイス動物保護法令に従い、すべての実験を実施した。腫瘍容積が2000mm3を上回ったときに、動物保護法令を順守してマウスを安楽死させた
。溶媒対照群と対応する治療群の平均腫瘍容積について、統計分析を一元配置ANOVA
及びボンフェローニパラメトリック検定により実施した。
免疫グロブリン定常領域におけるプロテインA結合を無効にする方法は公知である(Lindhofer H.ら、(1995)J Immnol、第155巻(1):219~225頁;米国特許第6,551,592号;Jendeberg L.ら、(1997)J Immunol Methods、第201巻(1):25~34頁;PCT公開番号:国際公開第2010151792号)。完全長ホモ二量体免疫グロブリンにおけるプロテインA無効法の使用を評価するために、IGHG1-IGHG3 Fc混合フォーマットに基づく抗HER2ホモ二量体免疫グロブリン、及び対応するFc133対照フラグメントを調製した。抗HER2ホモ二量体免疫グロブリンは、天然の抗体と同様にフォーマット化し、またFc133フラグメントと融合した、抗HER2特異的FABフラグメントから構成された(Fc配列は、天然のヒトIGHG3アイソタイプに由来し、ヒンジ配列は、ヒンジ配列全体にわたり、天然のヒトIGHG1アイソタイプと置換されており、略号はFc133であり、配列番号1を有する-この場合、名称内の数字は、ヒンジ/CH2/CH3の順序で、各ドメインの免疫グロブリンγアイソタイプサブクラスに対応する;対応する完全長抗HER2免疫グロブリンは、本明細書では、抗HER2 FAB-Fc133と呼ぶ;重鎖は配列番号2、及び軽鎖は配列番号3を有する)。トランスフェクション後、抗HER2 FAB-Fc133ホモ二量体、及びFc133フラグメントを、プロテインA結合について、材料及び方法のセクションに記載するプロトコールに従い、グラジエントクロマトグラフィーによりアッセイした。図3及び図4Aに示す通り、Fc133フラグメントは、市販のMabSelect SuRe(商標)プロテインA樹脂(GE Healthcare Europe GmbH社)に結合しなかったが、一方抗HER2 FAB-Fc133ホモ二量体は結合することができた。
scFv-Fc分子として再フォーマット化したが、この場合、scFvユニットは15個のアミノ酸リンカーが融合した親免疫グロブリン可変ドメインから構成された(本明細書では抗HER2 scFv-Fc133と略す;重鎖は配列番号4を有する)。従って、得られた抗HER2 scFv-Fc133ホモ二量体は、親抗HER2 FAB-Fc133ホモ二量体免疫グロブリンと同一であったが、CH1及びCK定常ドメインを欠いた。図4Bに示す通り、scFv-Fc133ホモ二量体は、親抗HER2ホモ-二量体免疫グロブリンで認められたように、プロテインA結合性を示した。この所見から、抗HER2 FABフラグメントの可変ドメインは、ホモ二量体免疫グロブリンのFc部
分内のプロテインA結合を無効にする方法の有効性阻害に関与しているという結論が導かれる。より重要なこととして、ホモ二量体免疫グロブリンの可変ドメイン内でのプロテインA結合は、プロテインAの差動的精製技法に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨害するものと結論付けられた。
FABフラグメントを、プロテインLクロマトグラフィーを用いて、捕捉溶出モードで最初に精製した;両カラムに関するプロトコールは、材料及び方法のセクションに記載するプロトコールに準拠した)に負荷してアッセイすることにより妥当性確認した。図4Cに示す通り、VH3ベースの抗HER2 FABのみが、MabSelect(商標)カラムに結合し、MabSelect SuRe(商標)樹脂は、VH3ベースのFABフラグメントに対する結合性を欠くことが確認された;少なくとも単量体VH3ベースのFABフラグメントが関係する限り、及びプロテインAに結合しない工学的に作出されたFc領域を有するVH3ベースのホモ二量体免疫グロブリンについてこれまでに認められた結果と更に対比した場合。反対に、抗HER2 FABは、MabSelect(商標)カラムに対して強い結合性を示し、プロテインAへの結合が認められない又は低下したVH3ベースのFAB変異体についてアッセイの可能性をもたらした。
フラグメントにおいてプロテインA結合を無効にする際には、置換G65S、Q81E、及びN82aSが好ましいが、それは、このような突然変異では、非プロテインA結合性VHサブクラスに見出される配列等価残基が置換しており、これにより免疫原性を低下させる可能性があるためである。
ヒトCD3抗原に対する抗原結合部位
二重特異性が関与するT細胞リダイレクトキリングを行わせるために、ヒトCD3εサブユニットを選択した。
本発明で用いた抗ヒトCD3ε抗原結合部位は、マウスOKT3抗体(ムロモナブ(Muromonab)-CD3、商標名Orthoclone OKT3、Janssen-Cilag社より市販され、その後中止された;マウス可変重鎖及び軽鎖ドメインは、配列番号18及び19をそれぞれ有する)に由来する。OKT3マウス可変ドメインをヒト化し、scFv及びFABフラグメントとしてフォーマット化した。
ein Eng、第10巻(8):959~66頁)により記載されている方法に従った。当該方法は、Herceptin(登録商標)抗体(rhuMAbHER2、huMAB4D5-8、トラスツズマブ又は商標名Herceptin(登録商標);米国特許公開第5,821,337号;可変重鎖及び軽鎖ドメインは、配列番号20及び21をそれぞれ有する)に見出される、VH/VLドメインの極めて安定な対を利用し、また固定化されたフレームワーク上でのヒト化プロセスのワークフローに従う(Almagro JC及びFransson J(2008)、Front Biosci、第13巻:1619~33頁)。Herceptin(登録商標)抗体は、生殖細胞系統フレームワークVH3及びVK1の極めて安定なヒトファミリーに本来由来するので、これら2つのファミリーに由来する生殖細胞系統フレームワークは、固定化されたフレームワークの供給源として同じように利用可能である。あるいは、ヒトVK3生殖細胞系統軽鎖フレームワークファミリーは、良好な安定特性も有するので、これをVK1の代わりに利用可能である(Ewert Sら、(2003)J Mol Biol、第325巻:531~553頁)。マウス抗体に付加して、ヒト抗体も、安定性を改善するために、この固定化されたフレームワーク法を用いて工学的に作出可能である。配列番号22、23、及び24をそれぞれ有するヒト生殖細胞系統フレームワークIGHV3-23*04、IGKV1-39*01、及びIGKV3-20*01を使用するのが好ましい(IMGT(登録商標)(international ImMunoGeneTics information system)に基づき引用;Lefranc MPら、(1999)Nucleic Acids Res、第27巻(1):209~12頁;Ruiz Mら、(2000)Nucleic Acids Res、第28巻(1):219~21頁;Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res、第29巻(1):207~9頁;Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res、第31巻(1):307~10頁;Lefranc MPら、(2005)Dev Comp Immunol、第29巻(3):185~203頁;Kaas Qら、(2007)Briefings in Functional Genomics & Proteomics、第6巻(4):253~64頁;http://www.imgt.org)。
、及び/又は免疫原性に影響を及ぼすと推定される場合、その影響に関するそのような置換の相補性に基づいた。
マウス抗体SP34は、1985年に最初に記載されている(Pessano Sら、(1985)EMBO J、第4巻(2):337~44頁)。これは、HPB-ALL細胞由来の変性タンパク質抽出物で免疫化したマウスから得られたハイブリドーマより生成され、抗体はヒト特異性及びカニクイザルに対する交差反応性を有する。ヒト及びカニクイザルCD3εサブユニット上SP34エピトープは公知である。
と略す)が有するヒトCD3ε1-26_Fc融合タンパク質に対する結合性は低かった(SPRによる評価、材料及び方法のセクション、並びに図10Aを参照)。
HER2陽性癌細胞を殺傷するように、T細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒト乳癌を治療するのに有用である。抗HER2抗体が記載されており(Blumenthal GMら、(2013)Clin Cancer Res、第19巻(18):4911~6頁)、その一部はクリニックで現在用いられている、又はヒトを対象とした臨床試験において現在調査されている(Tsang RY及びFinn RS(2012)Br J Cancer、第106巻(1):6~13頁)。
CD38は、II型膜貫通型糖タンパク質であり、造血細胞上及び固体組織内に通常見
出される。CD38も、様々な悪性血液病において発現している。CD38陽性癌細胞を殺傷するようにT細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、多発性骨髄腫、B細胞慢性リンパ性白血病、B細胞急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性/骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、NK-細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む様々な悪性血液病を治療するのに有用である。いくつかの抗CD38抗体は、研究試薬又は治療候補品として記載されている(PCT公開番号:国際公開第2006099875号)。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトCD38抗体として、OKT-10及びHB-7マウスハイブリドーマが挙げられる(Hoshino Sら、(1997)J Immunol、第158巻(2):741~7頁)。
FACSによるヒト化HB-7最良適合抗体(重鎖は配列番号118、及び軽鎖は配列番号119を有する)染色CHO[CD38]組換え細胞(データは示さない)。
ヒト化HB-7最良適合抗体は、SPRによりアッセイしたとき、CD38細胞外領域に対して、HB-7キメラ抗体(重鎖は配列番号120、及び軽鎖は配列番号121を有する)の結合アフィニティーと類似した結合アフィニティーを有した(それぞれ3.6及び2.5nMのKD;図11A(キメラ)及び図11B(ヒト化))。驚くべきことに、ヒト化HB-7最良適合抗体は、熱量測定プロファイルから判断されるように、FABフラグメントの安定性について、HB-7キメラ抗体と比較して、それよりも有意な改善(+14.6℃)を示した(76.4℃(キメラ)と91.0℃(ヒト化)、図11F)。
セスの出発点として選択した。CDRグラフティング後、第1の抗体プロトタイプ(ヒトIgG1アイソタイプとしてフォーマット化、重鎖は配列番号124、及び軽鎖は配列番号125)は、ヒトCD38に対して強い結合性を示し、SPRにより判断されたように、マウス親抗体の1/3に低下したにすぎなかった(配列番号126の重鎖、及び配列番号127の軽鎖を有する9G7キメラ抗体;9G7キメラ抗体(データは示さない)及び第1のヒト化プロトタイプ(データは示さない)のそれぞれについて0.3nM及び1nMのKD)。抗体の可変軽鎖内にF36Y復帰突然変異を導入するとアフィニティーは2倍改善した(Kabatナンバリング)(得られた抗体は、本明細書では、配列番号124の重鎖及び配列番号128の軽鎖を有するヒト化9G7最良適合抗体と呼ぶ;ヒトCD38に対して0.5nMのKD、図11C)。ヒト化9G7最良適合抗体は、カニクイザルCD38抗原に対する高いアフィニティーも示し(3.2nMのKD、データは示さない)、また9G7キメラ抗体よりもFAB熱安定性(DSCスキャンから得たFAB Tm)が改善した(ヒト化9G7最良適合抗体及びの9G7キメラ抗体について、それぞれ94℃と82.2℃;図11Gを参照)。ヒト化9G7最良適合抗体は、配列番号129の重鎖可変ドメイン、及び配列番号130の軽鎖可変ドメインを有する。
全体を通じて、抗原は50nMの濃度で捕捉される)、結合したファージを回収する一方、未結合のファージを洗い流した。Marksら(Marks JDら、(1991)J
Mol Biol、第222巻(3):581~97頁)の記載に従い、結合したファージを回復させ、選択プロセスを3回反復した。第2及び第3ラウンドのパニングから得た1000を超えるクローンを発現させ、ヒト及びカニクイザルCD38抗原に対するELISA法により分析した。陽性クローンについてDNA配列決定を実施し、いくつかの特有のクローンを、ヒトCD38を発現する細胞系統に結合するその能力について更に分析した。ストレプトアビジンビーズ上に固定化されたヒトCD38抗原のビオチン標識バージョンに基づく第1ラウンドのパニング、及びストレプトアビジンビーズ上に固定化されたカニクイザルCD38抗原のビオチン標識バージョンに基づく第2ラウンドのパニングの後に、配列番号135の可変重鎖配列、及び配列番号136の可変軽鎖を有する1つの好ましいscFvフラグメント(クローン番号767)を、ヒト及びカニクイザルCD38の両方に結合するその能力から選択した。ヒトIgG1抗体としてフォーマット化した際に、クローン767は、ヒトCD38について約300nM(図11E)、及びカニクイザルCD38について約1.2μM(データは示さない)のKDを有した(クローン767IgG1抗体は、本明細書では、配列番号137の重鎖、及び配列番号138の軽鎖を有するヒト767抗体と呼ぶ)。FAB熱安定性(DSCスキャンから得たFAB Tm)は70.2℃であった(図11I)。クローン767VHドメインは、VH3ドメインサブクラスに属する。
CD3及びOX40を標的とする二重特異性抗体は、活性化Tリンパ球の標的化及び枯渇化を可能にする。この組み合わせでは、CD3及びOX40分子の両方を発現させる活性化したTリンパ球が、急速な細胞消失を引き起こす相互殺傷プロセスに関わるようになる。二重特異性抗体によりヒトCD3及びOX40の両方が同時に関与するようになれば、病原性T細胞を短期間に有効に除去し得る。OX40は、受容体のTNFRスーパーファミリーメンバーであり、またラット由来の活性化CD4+T細胞上で発現する50kDaの糖タンパク質として、1987年に初めて同定された(Paterson DJら、(1987)Mol.Immunol.、第24巻:1281~90頁)。CD28とは異なり、OX40は、無感作T細胞上では構成的に発現しないが、T細胞受容体(TCR)の関与後に誘発される。OX40は、二次共刺激分子であり,活性化後24~72時間経過して発現する;そのリガンドであるOX40Lも休止期抗原提示細胞(resting antigen presenting cell)上では発現しないが、その活性化後に発現する。
メントから同定した。これらのCDRグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフト(mingraft)と呼ぶ。次に、これまでのアライメントから同定されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフト(maxgraft)と呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列をまとめる:
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化抗OX40VH;ヒト化抗OX40/ミングラフトVHと略す(配列番号278)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化抗OX40VH;ヒト化抗OX40/マックスグラフトVHと略す(配列番号279)。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化抗OX40VL;ヒト化抗OX40/ミングラフトVLと略す(配列番号280)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化抗OX40VL;ヒト化抗OX40/マックスグラフトVLと略す(配列番号281)。
CD20発現性B細胞を殺傷するようにT細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒトリンパ腫、癌を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトCD20抗体が、研究試薬又は治療候補品として記載されている。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトCD20抗体として、リツキシマブキメラ抗体及びそのヒト化変異体が挙げられる(リツキシマブキメラ抗体、商標名リツキサン(Rituxan)(登録商標)、PCT公開番号:国際公開第1994011026号;配列番号143のマウスVHドメイン及び配列番号144のマウスVLドメイン。
得られた配列をまとめる:
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化リツキシマブVH;ヒト化リツキシマブ/ミングラフトVHと略す(配列番号282)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化リツキシマブVH;ヒト化リツキシマブ/マックスグラフトVHと略す(配列番号283)。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化リツキシマブVL;ヒト化リツキシマブ/ミングラフトVLと略す(配列番号284)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化リツキシマブVL;ヒト化リツキシマブ/マックスグラフトVLと略す(配列番号285)。
EGFR陽性癌細胞を殺傷するようにT細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒト癌、好ましくはヒト膵癌及びヒト結腸癌を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトEGFR抗体が、研究試薬又は治療候補品として記載されている。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトEGFR抗体として、セツキシマブキメラ抗
体及びそのヒト化変異体が挙げられる(セツキシマブキメラ抗体、商標名アービタックス(Erbitux)(登録商標)、C225、IMC-C225;PCT公開番号:国際公開第199640210号;配列番号145のマウスVHドメイン及び配列番号146のマウスVLドメイン。
得られた配列をまとめる:
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化アービタックスVH;ヒト化アービタックス/ミングラフトVHと略す(配列番号286)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化アービタックスVH;ヒト化アービタックス/マックスグラフトVHと略す(配列番号287)。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化アービタックスVL;ヒト化アービタックス/ミングラフトVLと略す(配列番号288)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化アービタックスVL;ヒト化アービタックス/マックスグラフトVLと略す(配列番号289)。
得られた配列をまとめる:
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化ベクチビックスVH;ヒト化ベクチビックス/ミングラフトVHと略す(配列番号292)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化ベクチビックスVH;ヒト化ベクチビックス/マックスグラフトVHと略す(配列番号293)。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化ベクチビックスVL;ヒト化ベクチビックス/
ミングラフトVLと略す(配列番号294)。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化ベクチビックスVL;ヒト化ベクチビックス/マックスグラフトVLと略す(配列番号295)。
CD19発現性B細胞を殺傷するようにT細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒト血液及び骨髄の癌を治療するのに有用である。ヒトCD19分子は、プレB細胞、発生初期のB細胞(すなわち、未成熟B細胞)、最終的に形質細胞に分化した成熟B細胞、及び悪性B細胞を含む、但しこれらに限定されないヒトB細胞表面上で発現する構造的に異なる細胞表面受容体である。CD19は、ほとんどのプレB細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキンスリンパ腫、B細胞慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病、有毛状細胞性白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及びヌル急性リンパ芽球性白血病の一部で発現している(Nadler LMら、(1983)J Immunol、第131巻:244~250頁;Anderson KCら、(1984)Blood、第63巻:1424~1433頁;Loken MRら、(1987)Blood、第70巻:1316~1324頁;Uckun FMら、(1988)Blood、第71巻:13~29頁;Scheuermann RH、及びRacila E、(1995)Leuk Lymphoma、第18巻:385~397頁)。形質細胞上でのCD19の発現は、分化したB細胞腫瘍、例えば多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンシュトレーム型腫瘍(Waldenstrom’s tumor)等上で発現し得ることを更に示唆する(Grossbard MLら、(1998)Br J Haematol、第102巻:509~15頁;Treon SPら、(2003)Semin Oncol、第30巻:248~52頁)。
膜結合型のIgE陽性B細胞を殺傷するようにT細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる炎症性疾患、例えば喘息又は線維症等を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトIgE抗体が、研究試薬又は治療候補品として記載されている。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトIgE抗体として、オマリズマブ抗体(商標名ゾレア(Xolair)(登録商標)、米国特許商標庁公開番号:米国第6,761,889号、同第6,329,509号、及び同第20080003218A1号;Presta
LGら、(1993)J Immunol、第151巻:2623~2632頁;配列番号298のヒト化VHドメイン、及び配列番号299のヒト化VLドメイン)、及びその変異体が挙げられる。
した。これらのCDRグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフトと呼ぶ。次に、これまでのアライメントから識別されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフトと呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。
得られた配列をまとめる:
復帰突然変異を有さない安定化オマリズマブVH;安定化オマリズマブ/ミングラフトVHと略す(配列番号300)。
すべての考え得る復帰突然変異を有する安定化オマリズマブVH;安定化オマリズマブ/マックスグラフトVHと略す(配列番号301)。
復帰突然変異を有さない安定化オマリズマブ;安定化オマリズマブ/ミングラフトVLと略す(配列番号302)。
考え得る復帰突然変異をすべて有する安定化オマリズマブVL;安定化オマリズマブ/マックスグラフトVLと略す(配列番号303)。
得られた配列をまとめる:
復帰突然変異を有さない安定化Bsw17VH;安定化Bsw17/ミングラフトVHと略す(配列番号306)。
すべての考え得る復帰突然変異を有する安定化Bsw17VH;安定化Bsw17/マックスグラフトVHと略す(配列番号307)。
復帰突然変異を有さない安定化Bsw17VL;安定化Bsw17/ミングラフトVLと略す(配列番号308)。
考え得る復帰突然変異をすべて有する安定化Bsw17VL;安定化Bsw17/マックスグラフトVLと略す(配列番号309)。
3.1 BEAT(登録商標)技術及びビルトイン式精製システム
BEAT抗体は、「ノブ・イントゥ・ホール(knob into hole)」技術よりも優れたヘテロ二量化を示すバイオミミクリーという特有の概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である(PCT公開番号:国際公開第2012131555号)。BEATプラットフォームは、天然のホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメインの対において、その間の3D上、等価の位置にある界面アミノ酸の置換に基づき、Fcベースの二重特異性抗体のための構成ブロックとして利用可能である新規のヘテロ二量体を生み出す。当該技術は、任意のタイプの抗原結合スキャフォールドを用いて、Fcベースの二重特異性抗体を
設計できるようにする。scFv-FABフォーマットは、本明細書ではFcベースの二重特異性抗体を設計するのに用いられ、両方の抗原結合部位について、共通する軽鎖を開発する必要がない。
的として、ヒトCD3εを標的とするBEAT抗体を、その下部ヒンジ領域におけるFc-受容体結合について無効にした。Fc受容体結合は、L234A及びL235A置換を用いて無効又は抑制されたが(EUナンバリング;Strohl WRら、(2009)Curr Opin Biotechnol、第20巻(6):685~91頁);上記置換はLALA置換と多くの場合呼ばれる。
HER2/CD3標的BEAT抗体の例
抗HER2及び抗CD3εアームは、天然の抗体の場合と同様に、BEAT鎖と融合したscFvフラグメントからなる重鎖として、又はBEAT鎖と融合したFABフラグメントからなるscFv-Fcタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、またG65S又はN82aS置換(Kabatナンバリング)を用いて、内部に残留するプロテインA結合を適宜無効にした。ヒトHER2抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化した:
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトHER2アームについて、実施例2.1及び2.2にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、第1のBEAT HER2/CD3抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、N82aS置換(Kabatナンバリング)を有する可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号47)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号159)から構成された。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAとは結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、VHドメインを、N82aS置換を含むように突然変異させ、これにより、重鎖内の追加的なプロテインA結合部位をすべて除去した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトHER2アームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号160)から構成された。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT HER2/CD3-1抗体と呼ぶ(図12AフォーマットA)。
は、上記BEAT HER2/CD3(SP34)抗HER2アームと同等である(図12BフォーマットDを参照)。重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAと結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したので、N82aS置換を含むようにVHドメインを突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位をすべて除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体と呼ぶ(図12CフォーマットE)。
これらのBEAT抗体は、両アームのいずれもがVH3ドメインを含むように設計されたので、少なくとも1つのVH3ドメインにおいてプロテインA結合を無効にしさえすれば、好ましい差動的精製法の1つを用いて、対象とするヘテロ二量体を容易に精製することができた(図2Eを参照)。BEAT HER2/CD3-1抗体に関する差動的プロテインA精製トレースの例を図13に示すが、また図14は、精製されたヘテロ二量体のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。ホモ二量体汚染物質の含有量はほんのわずかであることが、このプロファイルから同定され得る。FAB部分を担持するようにフォーマット化された重鎖のホモ二量体は、プロテインAに結合しないので、見出されなかった。scFvフラグメントを担持するようにフォーマット化された重鎖のホモ二量体は、わずかな割合(2.5%)で認められ、単一のプロテインAクロマトグラフィーステップ後のヘテロ二量体含有量として97%を実現した。BEAT HER2/CD3-2、BEAT HER2/CD3-3、BEAT HER2/CD3(SP34)、及びBEAT
HER2/CD3(SP34-κ1)抗体は、単一のプロテインAクロマトグラフィーステップ後に、類似したレベルの均質性及び純度まで精製された。BEAT HER2/CD3-3抗体は、プロテインAクロマトグラフィー後、ある割合のジスルフィド結合したヘテロ二量体凝集物を示したが(27%)、陽イオン交換クロマトグラフィーにより除去された。
HER2/CD3-1抗体を、上記のN82aS置換を含めないで工学的に作出した。図15A及び15Bは、BEAT HER2/CD3-1及びその非N82aS置換バージョンについて、それらのプロテインAクロマトグラフィー溶出分画のSDS-PAGE分析をそれぞれ示す。pH4では、非N82aS置換バージョンの溶出分画は、FABアームを担持するようにフォーマット化された重鎖のホモ二量体に対応する追加バンドを示す(図15B)一方、N82aS置換BEAT HER2/CD3バージョンでは認められないが(図15A)、それは、FABアームを担持するようにフォーマット化された重鎖は、そのFc領域(ヒトIgG3アイソタイプに基づくFc領域)においてプロテインAと結合しないためであり、これから唯一推測され得ることとして、このホモ二量体種に見出されるVH3ベースの可変ドメインは、プロテインA結合に関係することが挙げられる。この結果は、VH3ベースの重鎖ヘテロ二量体内でのプロテインA結合の無効の有用性を明確に物語っている。
BEAT HER2/CD3抗体の作用機序は、細胞傷害性T細胞の細胞表面上のCD3抗原と標的の対象となる細胞上に発現するHER2抗原を架橋することにより、細胞傷害性T細胞キリングを、標的対象となる細胞に標的化することに基づく。
HER2/CD3-1又は-2抗体又は対照抗体の連続希釈物の存在下で48時間、個別に培養した。このアッセイでは、供血から得たヒトPBMCを、細胞傷害性Tリンパ球の供給源として用いた。エフェクター:標的細胞の比として10:1をすべてのアッセイにおいて用いた。陰性対照は、抗体処理を行わないサンプルの形態で提供した(標的細胞及びヒトPBMCのみ)。インキュベーション期間後に、細胞毒性を、RDL-FACS法又はRDL-MTS法を用いて測定した(材料及び方法のセクションを参照)。結果より、対照抗体は、特異的T細胞媒介型細胞毒性を引き起こさないことが明らかであった。対照的に、BEAT HER2/CD3-1及び-2抗体は、非常に強力な、用量依存性
の腫瘍標的細胞死を誘発した。最大キリングはほぼ100%であった。両法の読み取りは、近い結果を示した。ドナー間変動では、方法間のEC50に約10倍の相違が認められた。測定されたEC50は、標的細胞系統によるHER2抗原発現量と相関した。
JIMT-1異種移植
BEAT HER2/CD3-1抗体のin vivo有効性を、JIMT-1/PBMC異種移植モデルを用いて調査した。供血から得たヒトPBMCを細胞傷害性Tリンパ球の供給源として用いた。Herceptin(登録商標)耐性乳癌JIMT-1細胞を、非刺激ヒトPBMC(4つの異なるドナー)と1:1の比で混合し、その後免疫不全(NOD/SCID)マウスの皮下に注入した。移植後、2週間にわたり週3回、動物をBEAT HER2/CD3-1抗体で、経静脈的に処理した。抗体処理は、移植後3時間経過して開始し、その後2、4、7、9、及び11日目に継続して行った。
抗CD38及び抗CD3εアームは、天然の抗体の場合と同様に、BEAT鎖と融合したscFvフラグメントからなる重鎖として、又はBEAT鎖と融合したFABフラグメントからなるscFv-Fcタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、またG65S又はN82aS置換(Kabatナンバリング)を用いて、内部に残留するプロテインA結合を適宜無効にした。ヒトCD38抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化した:
ヒト化HB7最良適合VH及びVL配列を用いて、ヒトCD38抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の第1の例を、以下のようにフォーマット化した:
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトCD38アームについて実施例2.1及び2.3にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT CD38/CD3抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号119)と会合したγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号169)から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号162)から構成された。この重鎖には、ヒトIgG3 Fc領域の一部が含まれ、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したので、VHドメインを、N82aS置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位をすべて除去した。このアームは、上記BEAT HER2/CD3-2抗CD3εアームと同等である(図12AフォーマットBを参照)。二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT CD
38-HB7最良適合/CD3抗体と呼ぶ(図19フォーマットA)。
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトCD38アームについて実施例2.1及び2.3にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT CD38/CD3抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号138)と会合したγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号170)から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号171)から構成された。この重鎖には、ヒトIgG3 Fc領域の一部が含まれ、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、VHドメインを、G65S置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位をすべて除去した。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT CD38-767/CD3抗体と呼ぶ(図19フォーマットB)。
にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT CD38/CD3を工学的に作出する。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号312)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号313)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
抗OX40及び抗CD3εアームは、天然の抗体の場合と同様に、BEAT鎖と融合したscFvフラグメントからなる重鎖として、又はBEAT鎖と融合したFABフラグメントからなるscFv-Fcタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、またG65S又はN82aS置換(Kabatナンバリング)を用いて、内部に残留するプロテインA結合を適宜無効にした。ヒトOX40抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化した:
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号314)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号316)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
マウスリツキシマブ抗体VH及びVL配列を用いた、ヒトCD20抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化した:
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトCD20アームについて、実施例2.1及び2.5にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT CD20/CD3を工学的に作出した。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号318)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号320)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
抗EGFR及び抗CD3εアームは、天然の抗体の場合と同様に、BEAT鎖と融合したscFvフラグメントからなる重鎖として、又はBEAT鎖と融合したFABフラグメントからなるscFv-Fcタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、またG65S又はN82aS置換(Kabatナンバリング)を用いて、内部に残留するプロテインA結合を適宜無効にした。ヒトEGFR抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化した:
EGFR/CD3を工学的に作出する。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号175)と会合したγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含む、マウスアービタックス抗体可変ドメイン(配列番号145及び146をそれぞれ有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン)に基づくBEAT重鎖(配列番号174)から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号171)から構成された。この重鎖には、ヒトIgG3 Fc領域の一部が含まれ、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、VHドメインを、G65S置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位をすべて除去した。このアームは、上記BEAT CD38-767/CD3抗CD3εアームと同等である(図19フォーマットBを参照)。二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT EGFR/CD3抗体
と呼ぶ(図25)。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号322)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号324)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT EGFRセツキシ-ミングラフト/CD3(SP34-κ2)抗体と呼ぶ。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号326)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号328)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
抗CD19及び抗CD3重鎖は、天然の抗体の場合と同様に、第1のBEAT鎖と融合したscFvフラグメントからなる重鎖のcFv-Fcタイプとして、又は第1のBEA
T鎖と融合したFABフラグメントからなる重鎖としてフォーマット化され得る。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、またG65S又はN82aS置換(Kabatナンバリング)を用いて、内部に残留するプロテインA結合を適宜無効にした。国際公開第2010095031号に記載されている抗CD19VH及びVL配列を用いた、ヒトCD19抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化する:
CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号330)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
抗IgE及び抗CD3重鎖は、天然の抗体の場合と同様に、第1のBEAT鎖と融合したscFvフラグメントからなる重鎖のscFv-Fcタイプとして、又は第1のBEAT鎖と融合したFABフラグメントからなる重鎖としてフォーマット化され得る。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、またG65S又はN82aS置換(Kabatナンバリング)を用いて、内部に残留するプロテインA結合を適宜無効にした。
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトIgE抗原結合部位について、実施例2.1及び2.8にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT IgE/CD3抗体を工学的に作出する。
IgEを細胞表面上で発現する細胞系統は、PCT公開番号:国際公開第2010/033736号に記載されており、リダイレクトされたT細胞キリングを、実施例3.2.1に記載するアッセイ法と類似したアッセイ法で評価するのに利用可能である。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域
、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号333)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号332)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号335)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号334)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号337)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号336)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号339)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号338)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、従ってプロテインAに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、VH3フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、VHドメインは、G65S置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインA結合部位はすべて除去されている。
CD38/CD3標的BEAT抗体の例
ヒト化HB7/最良適合VH及びVL配列を用いた、ヒトCD38抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマット化した:抗ヒトCD3ε及び抗ヒトCD38アームについて、実施例2.1及び2.3にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT CD38/CD3を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖ドメイン、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及びその同起源の軽鎖(配列番号119)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号176)から構成された。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したので、プロテインAと結合しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号177)から構成された。この重鎖及び軽鎖会合体は、PCT公開番号:国際公開第2008119565号に記載される抗ヒトCD3ε抗体(SP34)のヒト化バージョンを含んだ。このBEAT抗体フォーマットは、本明細書では、BEAT CD38-HB7最良適合/CD3(SP34)抗体(図27フォーマットA)と呼ぶ。
CD38-HB7最良適合/CD3(SP34)抗体による、Daudi細胞のT細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイ法では、エフェクター細胞としてヒトPBMCを、エフェクター細胞:標的細胞の比として10:1で用い、そして24時間のインキュベーション期間後、RDL-FACS読み取り法を用いた(材料及び方法のセクションを参照)。結果より、BEAT CD38-HB7最良適合/CD3(SP34)抗体は、EC50が1.8pM(ドナー3例の平均値)であるように、Daudi CD38+細胞系統に対してT細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明白である。
CD38+細胞系統に対してT細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明らかである。
ヒト化抗OX40抗体VH及びVL配列(PCT公開番号:国際公開第2013008171号)を用いた、ヒトOX40抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマット化する:
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトOX40抗原結合部位について、実施例2.1及び2.4にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT OX40/CD3を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトOX40アームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及び同起源の軽鎖(配列番号173)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号340)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインAと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT OX40/CD3(SP34-κ2)抗体と呼ぶ。
マウスリツキシマブ抗体VH及びVL配列を用いた、ヒトCD20抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化した:
抗ヒトCD3ε及び抗ヒトCD20アームについて、実施例2.1及び2.5にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT CD20/CD3を工学的に作出した。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖 (配列番号177)から構成された。このアームは、上記BEAT CD38-HB7最良適合/CD3抗CD3εアームと同等である(図27フォーマットAを参照)。このscFvフラグメントには、PCT公開番号:国際公開第2008119565号(配列番号182及び183をそれぞれ有するVH及びVLドメイン)に記載される抗ヒトCD3ε SP34抗体のヒト化バージョンが含まれた。このBEAT抗体フォーマットは、本明細書では、BEAT CD20/CD3(SP34)抗体と呼ぶ(図31)。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD20アームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及び同起源の軽鎖(配列番号181)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号341)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変
ドメインを有するので、プロテインAと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT CD20/CD3(SP34-κ2)抗体と呼ぶ。
マウスアービタックス抗体VH及びVL配列を用いた、ヒトEGFR抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマット化する:抗ヒトCD3ε及び抗ヒトEGFR抗原結合部位について実施例2.1及び2.6にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT EGFR/CD3を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及び同起源の軽鎖(配列番号175)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号342)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインAと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及び同起源の軽鎖(配列番号344)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号343)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインAと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT EGFRパニ/CD3(SP34-κ2)抗体と呼ぶ。
ヒト化オマリズマブ抗体VH及びVL配列を用いた、ヒトIgE抗原及びヒトCD3εの両方を標的とするBEAT抗体の例を、以下のようにフォーマット化する:抗ヒトCD3ε及び抗ヒトIgE抗原結合部位について実施例2.1及び2.8にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、BEAT IgE/CD3を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域
、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及び同起源の軽鎖(配列番号346)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号345)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインAと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT IgEオマリ/CD3(SP34-κ2)抗体と呼ぶ。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ3CH2領域、及び同起源の軽鎖(配列番号348)と会合したγ3ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号347)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を含み、また非VH3ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインAと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3εアームは、scFvフラグメント、CH1γ1領域、γ1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EUナンバリング)を有するγ1CH2領域、及びγ1ベースのBEAT CH3ドメインを含むBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT IgE bsw17/CD3(SP34-κ2)抗体と呼ぶ。
Claims (3)
- i)第1のポリペプチドが、配列番号159のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号47の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号160のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
ii)第1のポリペプチドが、配列番号161のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号3の軽鎖と会合し、及びHER2に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号162のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
iii)第1のポリペプチドが、配列番号163のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号47の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号164のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
iv)第1のポリペプチドが、配列番号165のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号166の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号167のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
v)第1のポリペプチドが、配列番号168のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号89の軽鎖と会合し、及びCD3εに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号167のアミノ酸配列を有し、及びHER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2、
vi)第1のポリペプチドが、配列番号169のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号119の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号162のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
vii)第1のポリペプチドが、配列番号170のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号138の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号171のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
viii)第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号119の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号177のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
ix)第1のポリペプチドが、配列番号178のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号128の軽鎖と会合し、及びCD38に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号179のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38、
x)第1のポリペプチドが、配列番号172のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号173の軽鎖と会合し、及びOX40に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号162のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びOX40、
xi)第1のポリペプチドが、配列番号174のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号175の軽鎖と会合し、及びEGFRに結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号171のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR、
xii)第1のポリペプチドが、配列番号180のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号181の軽鎖と会合し、及びCD20に結合し、並びに第2のポリペプチドが、配列番号177のアミノ酸配列を有し、及びCD3εに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD20、
と結合する、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその免疫グロブリンフラグメント。 - 請求項1に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその免疫グロブリンフラグメントをin vitroで製造する方法であって、
ia)第1のポリペプチドをコードするDNAベクター及び第2のポリペプチドをコードするDNAベクターを調製するステップであって、1つ若しくは両方のDNAベクター、若しくは第3のDNAベクターが、第1のポリペプチドと会合する軽鎖をコードする前記ステップ、又は
ib)第1及び第2のポリペプチドをコードする1つのDNAベクターを調製するステップであって、DNAベクターが、第1のポリペプチドと会合する軽鎖をコードし、前記DNAベクターが、哺乳動物の宿主細胞内での一過性の発現若しくは安定的な発現に適する前記ステップと、
ii)(ia)又は(ib)に由来するDNAベクターを哺乳動物の宿主細胞系統にトランスフェクト又は同時トランスフェクトするステップと、
iii)トランスフェクトされた細胞系統、又はそれから安定的に選択されたクローンを培養し、細胞培養物上清を採集するステップと、
iv)細胞培養物上清をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させるステップと、
v)対象とするヘテロ二量体免疫グロブリンを溶出させ、収集するステップと、
を含む前記方法。 - ステップ(v)から得た精製後の材料に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその免疫グロブリンフラグメントが、キャピラリー電気泳動により決定したときに、少なくとも95%の純度を有する、請求項2に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13191386 | 2013-11-04 | ||
EP13191386.5 | 2013-11-04 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016527425A Division JP2016538275A (ja) | 2013-11-04 | 2014-11-04 | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero−dimeric immunoglobulin)の製造 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020023516A JP2020023516A (ja) | 2020-02-13 |
JP7068251B2 true JP7068251B2 (ja) | 2022-05-16 |
Family
ID=49513866
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016527425A Pending JP2016538275A (ja) | 2013-11-04 | 2014-11-04 | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero−dimeric immunoglobulin)の製造 |
JP2017542276A Active JP6994942B2 (ja) | 2013-11-04 | 2015-05-06 | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン |
JP2019178516A Active JP7068251B2 (ja) | 2013-11-04 | 2019-09-30 | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero-dimeric immunoglobulin)の製造 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016527425A Pending JP2016538275A (ja) | 2013-11-04 | 2014-11-04 | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero−dimeric immunoglobulin)の製造 |
JP2017542276A Active JP6994942B2 (ja) | 2013-11-04 | 2015-05-06 | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US9493563B2 (ja) |
EP (3) | EP3066133A1 (ja) |
JP (3) | JP2016538275A (ja) |
KR (2) | KR20160090308A (ja) |
CN (3) | CN105873953A (ja) |
AP (1) | AP2016009222A0 (ja) |
AU (3) | AU2014343636A1 (ja) |
BR (2) | BR112016009919A2 (ja) |
CA (2) | CA2929256C (ja) |
CL (1) | CL2016001068A1 (ja) |
EA (1) | EA036577B1 (ja) |
HK (1) | HK1244013A1 (ja) |
IL (2) | IL245381B (ja) |
MA (1) | MA40889A (ja) |
MX (1) | MX2016005781A (ja) |
MY (1) | MY176522A (ja) |
NZ (1) | NZ720161A (ja) |
PE (1) | PE20160724A1 (ja) |
PH (1) | PH12016500823A1 (ja) |
SG (2) | SG11201603244VA (ja) |
WO (2) | WO2015063339A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201603433B (ja) |
Families Citing this family (152)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
EP4218801A3 (en) | 2006-03-31 | 2023-08-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
US11046784B2 (en) | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
SI2202245T1 (sl) | 2007-09-26 | 2016-10-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Postopek modificiranja izoelektrične točke protitelesa preko aminokislinske substitucije v CDR |
ES2687808T3 (es) | 2007-09-26 | 2018-10-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Región constante de anticuerpo modificado |
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
CA2806252C (en) | 2010-07-29 | 2019-05-14 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
KR101398363B1 (ko) | 2010-11-17 | 2014-05-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 |
PL2647707T3 (pl) | 2010-11-30 | 2019-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Środek terapeutyczny wywołujący cytotoksyczność |
BR112013023918A2 (pt) * | 2011-03-25 | 2016-12-13 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para produzir uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para construir uma interface proteína-proteína de um domínio de uma proteína de múltiplos domínios e uso de um domínio doador de um primeiro e de um segundo membro de uma super-família de imunoglobulina de ocorrência natural |
CN104822704B (zh) * | 2012-06-14 | 2020-02-14 | 医疗生物科学有限公司 | 针对分化簇3(cd3)的人源化的抗体 |
IN2015MN00139A (ja) * | 2012-09-25 | 2015-10-16 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
EP3620473A1 (en) | 2013-01-14 | 2020-03-11 | Xencor, Inc. | Novel heterodimeric proteins |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
EP2945969A1 (en) | 2013-01-15 | 2015-11-25 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
EP2970505A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-10-19 | California Inst Biomedical Res | SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
AU2014232416B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-09-28 | Xencor, Inc. | Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
EP3050896B1 (en) | 2013-09-27 | 2021-07-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
JP2016538275A (ja) | 2013-11-04 | 2016-12-08 | グレンマーク ファーマシューティカルズ, エセ.アー. | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero−dimeric immunoglobulin)の製造 |
WO2015095392A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Genentech, Inc. | Anti-cd3 antibodies and methods of use |
CN111410691B (zh) | 2014-03-28 | 2024-02-13 | Xencor公司 | 结合至cd38和cd3的双特异性抗体 |
ES2900898T3 (es) | 2014-04-07 | 2022-03-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpos biespecíficos inmunoactivadores |
CA2947157A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function |
MX2017003022A (es) | 2014-09-12 | 2017-05-12 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados. |
US11773166B2 (en) | 2014-11-04 | 2023-10-03 | Ichnos Sciences SA | CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production |
MA40894A (fr) * | 2014-11-04 | 2017-09-12 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production |
WO2016086196A2 (en) * | 2014-11-26 | 2016-06-02 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
LT3223845T (lt) | 2014-11-26 | 2021-08-25 | Xencor, Inc. | Heterodimeriniai antikūnai, kurie suriša cd3 ir cd20 |
EP3237449A2 (en) | 2014-12-22 | 2017-11-01 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
SG11201706774WA (en) * | 2015-02-27 | 2017-09-28 | Icell Gene Therapeutics Llc | Chimeric antigen receptors (cars) targeting hematologic malignancies, compositions and methods of use thereof |
WO2016141387A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
US11142587B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide hetero-oligomer |
GB201506868D0 (en) * | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method for protein purification |
CA2984794A1 (en) | 2015-05-07 | 2016-11-10 | Agenus Inc. | Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof |
AU2016280102B2 (en) | 2015-06-16 | 2022-06-16 | Genentech, Inc. | Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use |
TW201718647A (zh) | 2015-06-16 | 2017-06-01 | 建南德克公司 | 抗-cll-1抗體及使用方法 |
EP3310811B1 (en) | 2015-06-16 | 2021-06-16 | Genentech, Inc. | Anti-cd3 antibodies and methods of use |
CA2985718A1 (en) | 2015-06-24 | 2016-12-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity |
WO2017222593A1 (en) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Icell Gene Therapeutics Llc | Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof |
TWI833684B (zh) | 2015-06-25 | 2024-03-01 | 美商生物細胞基因治療有限公司 | 嵌合抗原受體(car)、組合物及其使用方法 |
US11173179B2 (en) | 2015-06-25 | 2021-11-16 | Icell Gene Therapeutics Llc | Chimeric antigen receptor (CAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof |
CN108135968A (zh) | 2015-08-28 | 2018-06-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 嵌合多肽组装体及其制备和使用方法 |
PE20231655A1 (es) | 2015-10-02 | 2023-10-17 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos biespecificos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y metodos de uso |
AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
CN117069855A (zh) | 2015-10-25 | 2023-11-17 | 赛诺菲 | 用于预防或治疗hiv感染的三特异性和/或三价结合蛋白 |
US11649293B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for enhancing humoral immune response |
US11660340B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function |
EP3383430A4 (en) | 2015-12-02 | 2019-12-18 | Agenus Inc. | ANTIBODIES AND METHOD FOR USE THEREOF |
US10227410B2 (en) | 2015-12-07 | 2019-03-12 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA |
CN110698560B (zh) * | 2015-12-24 | 2021-11-26 | 凯惠科技发展(上海)有限公司 | 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用 |
MX2018007781A (es) * | 2015-12-28 | 2018-09-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc). |
CN109476741B (zh) | 2016-03-25 | 2023-02-24 | 拜奥穆尼克斯制药 | 与cd38和pd-l1结合的分子 |
KR20180134378A (ko) | 2016-04-13 | 2018-12-18 | 사노피 | 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질 |
KR20240036142A (ko) | 2016-04-13 | 2024-03-19 | 사노피 | 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질 |
US12054550B2 (en) | 2016-04-28 | 2024-08-06 | Biomunex Pharmaceuticals | Bispecific antibodies targeting EGFR and HER2 |
US10787518B2 (en) | 2016-06-14 | 2020-09-29 | Xencor, Inc. | Bispecific checkpoint inhibitor antibodies |
MX2018016404A (es) | 2016-06-21 | 2019-10-15 | Teneobio Inc | Anticuerpos de union a cd3. |
KR20190020341A (ko) | 2016-06-28 | 2019-02-28 | 젠코어 인코포레이티드 | 소마토스타틴 수용체 2에 결합하는 이종이량체 항체 |
EP3487867A2 (en) * | 2016-07-22 | 2019-05-29 | Amgen Inc. | Methods of purifying fc-containing proteins |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
RS65595B1 (sr) | 2016-09-14 | 2024-06-28 | Teneoone Inc | Antitela koja vezuju cd3 |
NZ751956A (en) * | 2016-09-23 | 2022-01-28 | Merus Nv | Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell |
CN106632681B (zh) * | 2016-10-11 | 2017-11-14 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用 |
AU2017342560B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-03-17 | Xencor, Inc. | IL15/IL15Ralpha heterodimeric Fc-fusion proteins |
EP3538152A4 (en) | 2016-11-09 | 2020-09-30 | Agenus Inc. | ANTI-OX40 ANTIBODIES, ANTI-GITR ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEREOF |
US11466094B2 (en) | 2016-11-15 | 2022-10-11 | Genentech, Inc. | Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies |
US11434299B2 (en) | 2016-12-21 | 2022-09-06 | Teneobio, Inc. | Anti-BCMA heavy chain-only antibodies |
CN106749678A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-05-31 | 北京普瑞金科技有限公司 | Her2 car重组慢病毒载体及其构建方法与应用 |
CN111094355A (zh) | 2017-03-27 | 2020-05-01 | 拜奥穆尼克斯制药 | 稳定的多特异性抗体 |
AU2018259039A1 (en) * | 2017-04-24 | 2019-11-07 | Ichnos Sciences SA | T cell redirecting bispecific antibodies for the treatment of EGFR positive cancers |
EP3409322A1 (en) | 2017-06-01 | 2018-12-05 | F. Hoffmann-La Roche AG | Treatment method |
IL271128B1 (en) | 2017-06-05 | 2024-06-01 | Numab Therapeutics AG | New anti-3CD antibodies |
WO2018224441A1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Numab Innovation Ag | Novel anti-cd3 antibodies |
KR20200014379A (ko) * | 2017-06-05 | 2020-02-10 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 비대칭 ch2-ch3 영역 돌연변이를 갖는 조작된 다중특이성 항체 및 다른 다량체 단백질 |
WO2018237037A2 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Teneobio, Inc. | HEAVY CHAIN ANTIBODY ONLY ANTI-BCMA |
WO2018237006A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Teneoone, Inc. | ANTIBODIES ONLY TO HEAVY ANTI-BCMA CHAINS |
JP2020529832A (ja) | 2017-06-30 | 2020-10-15 | ゼンコア インコーポレイテッド | IL−15/IL−15Rαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーFc融合タンパク質 |
US11472880B2 (en) | 2017-08-14 | 2022-10-18 | Morphosys Ag | Humanized antibodies for CD3 |
CA3075399A1 (en) * | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes |
CA3078800A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-18 | Sanofi | Anti-cd38 antibodies and methods of use |
KR20200078527A (ko) | 2017-11-08 | 2020-07-01 | 쿄와 기린 가부시키가이샤 | CD40과 EpCAM에 결합하는 이중특이적 항체 |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
KR20200085828A (ko) | 2017-11-08 | 2020-07-15 | 젠코어 인코포레이티드 | 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체 |
SG11202005732XA (en) | 2017-12-19 | 2020-07-29 | Xencor Inc | Engineered il-2 fc fusion proteins |
CA3087061A1 (en) * | 2017-12-27 | 2019-07-04 | Teneobio, Inc. | Cd3-delta/epsilon heterodimer specific antibodies |
CA3088649A1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-07-25 | Lakepharma, Inc. | Bispecific antibody that binds cd3 and another target |
KR20200118065A (ko) | 2018-02-08 | 2020-10-14 | 제넨테크, 인크. | 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 사용 방법 |
AU2019235523A1 (en) | 2018-03-14 | 2020-10-29 | Novimmune Sa | Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof |
CN110305217B (zh) * | 2018-03-27 | 2022-03-29 | 广州爱思迈生物医药科技有限公司 | 双特异性抗体及其应用 |
CA3096052A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein |
CN112437777A (zh) | 2018-04-18 | 2021-03-02 | Xencor股份有限公司 | 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白 |
US11524991B2 (en) | 2018-04-18 | 2022-12-13 | Xencor, Inc. | PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof |
SG11202010580TA (en) * | 2018-05-23 | 2020-12-30 | Pfizer | Antibodies specific for cd3 and uses thereof |
WO2019224385A2 (en) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Combined bispecific antibody and immuno-oncology therapies |
WO2019244107A1 (en) * | 2018-06-21 | 2019-12-26 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Compositions including cd3 antigen binding fragments and uses thereof |
EP3837552A1 (en) | 2018-08-17 | 2021-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method and chromatography system for determining amount and purity of a multimeric protein |
EP3620785A1 (en) * | 2018-09-07 | 2020-03-11 | Ares Trading S.A. | Electrophoresis-based characterization of fc fusion proteins |
EP3856347A1 (en) * | 2018-09-25 | 2021-08-04 | Ichnos Sciences SA | Antibody quantification in biological samples |
SG11202103192RA (en) | 2018-10-03 | 2021-04-29 | Xencor Inc | Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
WO2020076853A1 (en) | 2018-10-09 | 2020-04-16 | Sanofi | Trispecific anti-cd38, anti-cd28, and anti-cd3 binding proteins and methods of use for treating viral infection |
KR20210086651A (ko) * | 2018-10-26 | 2021-07-08 | 테네오바이오, 인코포레이티드 | Cd38에 결합하는 중쇄 항체 |
US20220088071A1 (en) * | 2018-11-30 | 2022-03-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | A BW6 Specific CAR Designed To Protect Transplanted Tissue From Rejection |
WO2020132574A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | CentryMed Pharmaceutical Inc. | Protease cleavable bispecific antibodies and uses thereof |
CN114173875A (zh) | 2019-03-01 | 2022-03-11 | Xencor股份有限公司 | 结合enpp3和cd3的异二聚抗体 |
AU2020236015A1 (en) | 2019-03-14 | 2021-09-09 | Genentech, Inc. | Treatment of cancer with HER2XCD3 bispecific antibodies in combination with anti-HER2 MAB |
KR102239781B1 (ko) * | 2019-04-08 | 2021-04-13 | 주식회사 녹십자 | Gpnmb 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도 |
US11613576B2 (en) | 2019-04-09 | 2023-03-28 | Sanofi | Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof |
WO2020232247A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Provention Bio, Inc. | Methods and compositions for preventing type 1 diabetes |
KR20220020810A (ko) | 2019-06-14 | 2022-02-21 | 테네오바이오, 인코포레이티드 | Cd22와 cd3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체 |
WO2020264321A1 (en) * | 2019-06-26 | 2020-12-30 | The Johns Hopkins University | Methods and materials for targeted expansion of immune effector cells |
CN110551221B (zh) * | 2019-07-02 | 2021-03-05 | 广州爱思迈生物医药科技有限公司 | 一种双特异性抗体及其制备方法与应用 |
EP3999115A4 (en) * | 2019-07-12 | 2023-11-22 | LipUm AB | NEW BSSL ANTIBODIES |
EP3791931A1 (en) * | 2019-09-13 | 2021-03-17 | Ichnos Sciences SA | Bispecific antibodies for the treatment of solid tumors |
EP4039707A4 (en) * | 2019-09-30 | 2022-11-16 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | CD3-TARGETING ANTIBODY, BISPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF |
CN112876563B (zh) * | 2019-11-29 | 2022-08-16 | 康诺亚生物医药科技(成都)有限公司 | 药物组合物及其制备方法和应用 |
CN115003695A (zh) * | 2019-12-26 | 2022-09-02 | 爱必乐生物公司 | 一种使用蛋白a亲和层析法纯化生物活性肽的方法 |
TW202140570A (zh) * | 2020-01-23 | 2021-11-01 | 瑞士商天演藥業公司 | 具有Fc突變之異二聚蛋白質 |
TW202140561A (zh) | 2020-02-14 | 2021-11-01 | 日商協和麒麟股份有限公司 | 與cd3結合之雙特異性抗體 |
EP4106880A4 (en) * | 2020-02-17 | 2024-07-03 | Univ Texas | HUMAN 4-1BB AGONIST ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF |
WO2021222595A2 (en) * | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Virtuoso Binco, Inc. | Multispecific antibodies targeting cd38 and epcam and uses thereof |
CN116096754A (zh) | 2020-05-04 | 2023-05-09 | 免疫里森公司 | 前体三特异性抗体构建体及其使用方法 |
WO2021231976A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3 |
BR112022025381A2 (pt) | 2020-06-11 | 2023-01-24 | Provention Bio Inc | Métodos e composições para prevenir diabetes tipo 1 |
AU2021302126A1 (en) | 2020-06-30 | 2023-02-09 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | Binding protein having h2l2 and hcab structures |
US11197910B1 (en) | 2020-08-19 | 2021-12-14 | Vitruviae LLC | Fusion proteins for the diagnosis, prophylaxis and treatment of infectious diseases |
US11124568B1 (en) * | 2020-08-19 | 2021-09-21 | Vitruviae LLC | CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases |
KR102607909B1 (ko) | 2020-08-19 | 2023-12-01 | 젠코어 인코포레이티드 | 항-cd28 조성물 |
CA3187085A1 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Manuel Baca | Multi-specific antigen binding molecules targeting hiv and methods of use |
WO2022087211A1 (en) * | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Janux Therapeutics, Inc. | Antibodies targeting her2 and cd3 and uses thereof |
WO2022148736A1 (en) * | 2021-01-05 | 2022-07-14 | Transgene | Vectorization of muc1 t cell engager |
CN116963774A (zh) | 2021-01-28 | 2023-10-27 | 瑞泽恩制药公司 | 用于治疗细胞因子释放综合征的组合物和方法 |
AU2022232375A1 (en) | 2021-03-09 | 2023-09-21 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6 |
EP4305065A1 (en) | 2021-03-10 | 2024-01-17 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3 |
WO2022200443A1 (en) * | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Janssen Pharmaceutica Nv | TRISPECIFIC ANTIBODY TARGETING CD79b, CD20, AND CD3 |
CN114763387B (zh) * | 2021-04-15 | 2024-06-25 | 北京大学深圳研究生院 | 一种基于结构优化蛋白活性的三特异性抗体制备方法 |
WO2023046322A1 (en) * | 2021-09-24 | 2023-03-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof |
WO2023201226A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for universal tumor cell killing |
WO2023240109A1 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof |
WO2024071008A1 (ja) * | 2022-09-26 | 2024-04-04 | 愛知県 | 抗原分子の単離方法 |
WO2024088987A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy for the treatment of cancer |
WO2024131731A1 (zh) * | 2022-12-19 | 2024-06-27 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | "κ/λ"Fab-Fab串联多特异性结合蛋白及其制备和应用 |
US20240277844A1 (en) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009511521A (ja) | 2005-10-11 | 2009-03-19 | ミクロメット・アクチェンゲゼルシャフト | 交差種特異的(cross−species−specific)抗体を含む組成物および該組成物の使用 |
WO2011078332A1 (ja) | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
JP2012513414A (ja) | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | プロテインaに対する結合が変化した免疫グロブリン変異体 |
WO2012131555A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Hetero-dimeric immunoglobulins |
JP2012531439A (ja) | 2009-06-26 | 2012-12-10 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 天然の免疫グロブリン形式を有する容易に単離される二重特異性抗体 |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2413974A1 (fr) | 1978-01-06 | 1979-08-03 | David Bernard | Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
WO1991000360A1 (en) | 1989-06-29 | 1991-01-10 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
KR0149181B1 (ko) | 1990-06-29 | 1998-08-17 | 데이비드 알, 맥지 | 형질전환된 미생물에 의한 멜라닌의 제조방법 |
AU675916B2 (en) | 1991-06-14 | 1997-02-27 | Genentech Inc. | Method for making humanized antibodies |
US6329509B1 (en) | 1991-08-14 | 2001-12-11 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
NZ258392A (en) | 1992-11-13 | 1997-09-22 | Idec Pharma Corp | Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona |
US5747654A (en) | 1993-06-14 | 1998-05-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity |
DE4419399C1 (de) | 1994-06-03 | 1995-03-09 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
WO1996040210A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Imclone Systems Incorporated | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors |
EP0826696B1 (de) | 1996-09-03 | 2002-05-29 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität |
US5994511A (en) | 1997-07-02 | 1999-11-30 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides |
US6172213B1 (en) | 1997-07-02 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides |
CA2445611A1 (en) | 2001-05-31 | 2002-12-05 | Chiron Corporation | P-cadherin as a target for anti-cancer therapy |
ES2541489T3 (es) | 2004-02-06 | 2015-07-21 | Morphosys Ag | Anticuerpos humanos anti-CD38 y usos para ellos |
CN101218256B (zh) | 2005-03-23 | 2017-04-19 | 根马布股份公司 | 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体 |
EP1914242A1 (en) | 2006-10-19 | 2008-04-23 | Sanofi-Aventis | Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer |
CN104497143B (zh) | 2007-03-29 | 2020-08-25 | 健玛保 | 双特异性抗体及其制造方法 |
HUE040467T2 (hu) | 2007-04-03 | 2019-03-28 | Amgen Res Munich Gmbh | Keresztfaj-specifikus kötõdomén |
JP5785493B2 (ja) | 2008-09-17 | 2015-09-30 | ゼンコア インコーポレイテッド | IgE媒介性疾患を治療するための新規組成物および方法 |
BRPI1005984A2 (pt) | 2009-02-23 | 2016-10-04 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga ao cd19 humano, acido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga à cd12 humano, composição, imunoconjugado, uso de um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo, artigo de manufatura e kit |
MY152068A (en) | 2009-03-20 | 2014-08-15 | Genentech Inc | Bispecific anti-her antibodies |
CN103097417B (zh) | 2010-04-20 | 2019-04-09 | 根马布股份公司 | 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法 |
WO2011154453A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Genmab A/S | Antibodies against human cd38 |
JOP20210044A1 (ar) | 2010-12-30 | 2017-06-16 | Takeda Pharmaceuticals Co | الأجسام المضادة لـ cd38 |
CA2831957A1 (en) | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Amgen Inc. | Novel egfr binding proteins |
WO2012143524A2 (en) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Genmab A/S | Bispecific antibodies against her2 and cd3 |
WO2012158818A2 (en) | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Fabion Pharmaceuticals, Inc. | Multi-specific fab fusion proteins and methods of use |
PE20142243A1 (es) | 2011-07-11 | 2015-01-11 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Anticuerpos que se unen a ox40 y sus usos |
HUE044633T2 (hu) | 2011-10-27 | 2019-11-28 | Genmab As | Heterodimer fehérjék elõállítása |
IN2015MN00139A (ja) * | 2012-09-25 | 2015-10-16 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | |
TR201815254T4 (tr) * | 2013-01-02 | 2018-11-21 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Tl1a'ya bağlanan anti̇korlar ve bunlarin kullanimlari |
EP2970505A4 (en) * | 2013-03-14 | 2016-10-19 | California Inst Biomedical Res | SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF |
JP6594855B2 (ja) * | 2013-03-15 | 2019-10-23 | ゼンコア インコーポレイテッド | ヘテロ二量体タンパク質 |
WO2015016946A1 (en) | 2013-08-02 | 2015-02-05 | Schneider Electric USA, Inc. | Electric vehicle charging station handle input |
JP2016538275A (ja) * | 2013-11-04 | 2016-12-08 | グレンマーク ファーマシューティカルズ, エセ.アー. | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero−dimeric immunoglobulin)の製造 |
EP2982693A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-10 | Affimed Therapeutics AG | CD3 binding domain |
MA40894A (fr) | 2014-11-04 | 2017-09-12 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production |
US11773166B2 (en) * | 2014-11-04 | 2023-10-03 | Ichnos Sciences SA | CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production |
AU2017384528A1 (en) * | 2016-12-19 | 2019-07-04 | Ichnos Sciences SA | Novel TNFR agonists and uses thereof |
AU2018259039A1 (en) * | 2017-04-24 | 2019-11-07 | Ichnos Sciences SA | T cell redirecting bispecific antibodies for the treatment of EGFR positive cancers |
US20240092903A1 (en) * | 2020-06-12 | 2024-03-21 | Ichnos Sciences SA | Antibody formulation diluent |
-
2014
- 2014-11-04 JP JP2016527425A patent/JP2016538275A/ja active Pending
- 2014-11-04 CN CN201480072262.7A patent/CN105873953A/zh active Pending
- 2014-11-04 SG SG11201603244VA patent/SG11201603244VA/en unknown
- 2014-11-04 NZ NZ720161A patent/NZ720161A/en unknown
- 2014-11-04 EP EP14793557.1A patent/EP3066133A1/en not_active Withdrawn
- 2014-11-04 CN CN201910984166.4A patent/CN110627907B/zh active Active
- 2014-11-04 BR BR112016009919A patent/BR112016009919A2/pt active Search and Examination
- 2014-11-04 KR KR1020167015063A patent/KR20160090308A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-11-04 AP AP2016009222A patent/AP2016009222A0/en unknown
- 2014-11-04 AU AU2014343636A patent/AU2014343636A1/en not_active Abandoned
- 2014-11-04 EA EA201690803A patent/EA036577B1/ru unknown
- 2014-11-04 US US14/532,923 patent/US9493563B2/en active Active
- 2014-11-04 SG SG10201909806S patent/SG10201909806SA/en unknown
- 2014-11-04 EP EP16206413.3A patent/EP3176185A1/en active Pending
- 2014-11-04 CA CA2929256A patent/CA2929256C/en active Active
- 2014-11-04 MX MX2016005781A patent/MX2016005781A/es active IP Right Grant
- 2014-11-04 PE PE2016000581A patent/PE20160724A1/es unknown
- 2014-11-04 MY MYPI2016701558A patent/MY176522A/en unknown
- 2014-11-04 WO PCT/EP2014/073738 patent/WO2015063339A1/en active Application Filing
-
2015
- 2015-05-05 MA MA040889A patent/MA40889A/fr unknown
- 2015-05-06 WO PCT/EP2015/060003 patent/WO2016071004A1/en active Application Filing
- 2015-05-06 CA CA2966124A patent/CA2966124C/en active Active
- 2015-05-06 JP JP2017542276A patent/JP6994942B2/ja active Active
- 2015-05-06 BR BR112017009264-6A patent/BR112017009264A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-05-06 EP EP15720336.5A patent/EP3215540A1/en not_active Withdrawn
- 2015-05-06 KR KR1020177015253A patent/KR20170092562A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-05-06 US US15/524,482 patent/US20180112011A1/en not_active Abandoned
- 2015-05-06 AU AU2015342169A patent/AU2015342169A1/en not_active Abandoned
- 2015-05-06 CN CN201580072185.XA patent/CN107207595A/zh active Pending
-
2016
- 2016-05-01 IL IL245381A patent/IL245381B/en unknown
- 2016-05-03 PH PH12016500823A patent/PH12016500823A1/en unknown
- 2016-05-04 CL CL2016001068A patent/CL2016001068A1/es unknown
- 2016-05-19 ZA ZA2016/03433A patent/ZA201603433B/en unknown
- 2016-06-23 US US15/190,268 patent/US20170145115A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-04-23 IL IL251850A patent/IL251850A0/en unknown
-
2018
- 2018-03-12 HK HK18103439.3A patent/HK1244013A1/zh unknown
- 2018-05-21 US US15/984,822 patent/US11851502B2/en active Active
-
2019
- 2019-07-16 US US16/512,672 patent/US20200102403A1/en not_active Abandoned
- 2019-09-30 JP JP2019178516A patent/JP7068251B2/ja active Active
- 2019-11-01 AU AU2019257534A patent/AU2019257534B2/en active Active
-
2020
- 2020-07-17 US US16/931,506 patent/US11891454B2/en active Active
-
2022
- 2022-01-21 US US17/581,624 patent/US20220213227A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009511521A (ja) | 2005-10-11 | 2009-03-19 | ミクロメット・アクチェンゲゼルシャフト | 交差種特異的(cross−species−specific)抗体を含む組成物および該組成物の使用 |
JP2012513414A (ja) | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | プロテインaに対する結合が変化した免疫グロブリン変異体 |
JP2012531439A (ja) | 2009-06-26 | 2012-12-10 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 天然の免疫グロブリン形式を有する容易に単離される二重特異性抗体 |
WO2011078332A1 (ja) | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
WO2012131555A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Hetero-dimeric immunoglobulins |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7068251B2 (ja) | T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン(hetero-dimeric immunoglobulin)の製造 | |
JP7403505B2 (ja) | Cd3/cd38 t細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法 | |
US12006367B2 (en) | CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production | |
OA17758A (en) | Production of T cell retargeting heterodimeric immunoglobulins. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191029 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191029 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201110 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210205 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210507 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210907 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211201 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220304 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220405 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220428 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7068251 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |