JPH11507640A - Ｒｓｖ ｆ−タンパク質に特異的な高親和性ヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト脾臓細胞にインビトロ初回抗原刺激とＳＣＩＤマウスでのブースター抗原投与とを組み合わせた、特にＲＳＶ融合タンパク質に特異的なヒト抗体を生成するための非常に効率的な方法が教示される。この方法は、所望の抗原に対する特異性および親和性の高い抗体を含有する大部分がＩｇＧイソタイプである非常に高いヒト抗体力値を提供する。この方法は、治療および診断目的のためのヒトモノクローナル抗体を産生させること並びに組み合わせヒト抗体遺伝子ライブラリーの生成のためのヒト細胞を救済するのに適している。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対してそれぞれ≦２×１０^-9モルの親和性を有する２つのヒトモノクローナル抗体、ＲＦ−１およびＲＦ−２並びにその対応アミノ酸配列およびＤＮＡ配列が教示される。これら抗体は、ＲＳＶ感染の治療または予防のためおよび分析対象物中のＲＳＶの診断のために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的な高親和性ヒトモノクローナル抗体 発明の背景 呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）は、一般的に気管の上部および株に感 染するニューモウイルス属のパラミクソウイルスである。これは接触伝染性が強 いので、２才までに高いパーセントの子供が感染する。さらに、４才までに、事 実上すべてのヒトがＲＳＶの免疫をもっている。 典型的には、ＲＳＶ感染はマイルドであり、気管の上部に局部的にとどまり、 特別の治療を必要としない普通の風邪に似た症状を起こさせる。しかしながら、 ある種の患者、例えば子供、老人または潜在的な心肺疾患のある、免疫抑制され た人では、このウイルスは、下部の気管に広がり入院や呼吸支持が必要になるこ とがある。これらのある場合に、ＲＳＶ感染は永久的な肺損傷を起こさせ、生命 を脅かすことさえある。合衆国だけでも、ＲＳＶにより毎年約９０,０００人が 入院し、約４５００人が死亡している。 ＲＳＶは、結合糖タンパク質、Ｇ、に関連する血清学的差異に主として基づく ２つの主要な菌株の亜群ＡおよびＢであると思われる。主要な表面糖タンパク質 、すなわち、９０kＤ Ｇタンパク質、は分離物間のアミノ酸レベルで５０％まで が異なり得る（Johnson et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1987),84,5625-5629） 。反対に、治療の標的であるかもしれない、７０kＤ融合（Ｆ）タンパク質は、 異なるＲＳＶ菌株にわたって非常によく保存されていて、すなわち、アミノ酸レ ベルで約８９％である（Johnson et al，J．Gen．Virol.(1988),69,2623-2628,J ohnson et al，J．Virol.(1987),10,3163-3166，P.L．Collins，Plenum Press， NY(1991),103-162）。さらに、所与の型のＦ−タンパク質から誘導された抗体は 他の型と交差反応する。 Ｆ−タンパク質はヘテロ二量体であり、直鎖の前駆体から産生され、それぞれ ４８および２３kＤのジスルフィド結合フラグメントからなる（Walsh et al，J ．Gen．Virol,(1985),66,401-415）。ポクローナル抗体によるシンシチウム形成 の 阻害は２３kＤフラグメントとの重要な反応に関係している。 既述のように、ＲＳＶ感染は通常マイルドであるが、ある種の人には生命の危 険があり得る。現在、重いＲＳＶ感染は抗ウイルス剤のリババリンの投与によっ て処置されている。しかしながら、リババリンはＲＳＶ感染の制御に何等かの効 果があるが、その使用はいくつかの理由により好ましくない。例えば、非常に高 価であり、病院でのみ投与され得る。他の公知のＲＳＶ治療はＲＳＶ感染の症状 を処置するのみであり、気管支炎の患者にはエーロゾル気管支拡張剤の使用およ び気管支炎およびＲＳＶ肺炎の患者にはコルチコステロイド治療を含む。 今日まで、ＲＳＶワクチンは抗ウイルス防御抗体を増強するためであり、非常 に成績が悪い。例えば、ホルマリン不活性化ＲＳＶに基づくワクチンは約２５年 前に試験され、事実、融合阻害活性を欠く抗体を誘導し（Murphy et al，Clinic al Microbiology(1988),26,1595-1597）、時には病気を悪化させさえする。これ は防御抗体を誘導するためのホルマリン不活性化ウイルスが無能力であることで 説明され得る。高抗体力価がワクチン被投与者に測定されたが、特定の防御力価 は対照群より低かった。これはホルマリン不活性化ＲＳＶが防御抗体を誘導する のに要求される必要なコンホメーションのエピトープを示し得ないからかもしれ ない。 今日まで有効なＲＳＶワクチンは知られていないが、抗体治療が感染しやすい 患者のＲＳＶ感染に対する防衛をもたらし得、存在するＲＳＶ感染そのものを排 除さえし得るとのいくつかの臨床的証拠は存在する。例えば、新生児には重い気 管支炎の発生率は低く、母親の防衛物質の存在が寄与しているとの仮説が立てら れている（Ogilvie et al，J．Med Virol(1981),7,263-271）。また、再感染に 免疫を持っている子供は再感染した子供より統計学的に高抗−Ｆ−タンパク質力 価を有している。さらに、高力価ＲＳＶ−免疫ドナーから製造された静脈内免疫 グロブリン（ＩＶＩＧ）は鼻のＲＳＶ流出を減少させ、酸素処理（oxygenation ）を改善する（Hemming et al，Anti．Viral Agents and Chemotherapy(1987),3 1,1882-1886）。また、最近の研究では、ＲＳＶ強化免疫グロブリン（ＲＳＶＩ Ｇ）を投与することによってウイルスが退治され肺損傷が防御されることが示唆 され ている（Groothuis et al，The New England J．Med．(1993),329,1524-1530，K ．McIntosh，The New England J．Med.(1993),329,1572-1573，J．R．Groothuis ，AntiViral Research,(1994),23,1-10，Siber et al，J．Infectious Diseases (1994),169,1368-1373，Siber et al，J．Infectious Diseases(1992),165:456- 463）。 同様に、動物実験では、ウイルス中和抗体での抗体治療がＲＳＶ感染に対する 防衛をもたらし得、存在するＲＳＶ感染そのものを排除さえし得ることが示唆さ れている。例えば、インビトロの中和マウスモノクローナル抗体はマウスを感染 から守り、確立したＲＳＶ感染を取り除くと報告されている（Taylor et al，J ．Immunology,(1984),52,137-142，Stott et al.，"Immune Responses，Virus I nfections and Disease，I.R.L．Press，London(1989),85-104"）。 また、ＲＳＶのＦ−タンパク質のモノクローナル抗体はインビボおよびインビ トロの両方のＲＳＶモデルで高い効果を示している（Tempest et al，Bio/Techn ology,(1991),9,266-271，Crowe et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1994),91,138 6-1390，Walsh et al，Infection and Immunity,(1984),43,756-758，Barbas II I，et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1992),89,10164-10168，Walsh，et al，J． Gen．Virol.(1986),67,505-513）。動物実験では、５２０−２０００μg/kg体重 の低い抗体濃度で殆ど元の状態に回復すると報告されている（Crowe et al，Pro c．Natl．Acad．Sci.(1994),91,1386-1390）。さらに、これらの抗体は実験室株 および野生株を含むＡおよびＢ株の両方を中和すると記載されている。これらの 抗体は注射（Groothuis et al，The New England J．Med.(1993),329,1524-1530 ，Siber et al，J．Infectious Diseases(1994),169,1368-1373）またはエーロ ゾル（Crowe et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1994),91,1386-1390）のいずれか により投与される。 ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対する潜在的な治療モノクローナル抗体の異なる２ つの型がかって文献に記載され、ヒト化ネズミ抗体（Tempest et al，Bio/Techn ology,(1991),9,266-271）または真性なヒト抗体（Ｆabフラグメント）(Barbas III，et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1992),89,10164-10168）である。 ヒト化ネズミ抗体は独特のヒトＦc上に、交差株中和ネズミ抗−Ｆ−タンパク質 抗体を接合するＣＤＲおよび可変部の構造領域によって産生される。ヒトＦabフ ラグメントはＨＩＶ陽性ドナー（免疫易感染）から得られたヒト骨髄細胞を用い て順列組み合わせライブラリー技術によって産生された。ヒト化およびヒトＲＳ Ｖ抗体のインビボの治療的力価は、それぞれ５および２mg/kg体重である。しか しながら、ヒト化抗体はシンシチウム阻害活性で試験されたが、ヒト抗−ＲＳＶ Ｆabフラグメントはそのウイルス中和活性の測定で評価されていることに注意 すべきである。従って、ヒト化およびヒト抗−ＲＳＶ抗体について報告された結 果は直接比較できない。 順列組み合わせライブラリー技術によって生産されたＦabフラグメントはエー ロゾルにおいて有効であると報告されている。これは恐らく分子の大きさが比較 的小さいためである。ＲＳＶワクチンの主な投与群は幼児であるから、これらの 結果は非常に勇気づけられるものである。従って、エーロジルは特に望ましい投 与法である。 しかながら、ＲＳＶに特異的なヒト化およびＦabフラグメントの以前の公開報 告にもかかわらず、いまだ、改善された治療的能力を有する改良された抗−ＲＳ Ｖ抗体、特に、ＲＳＶ感染を効果的に中和し妨害するＲＳＶ Ｆ−タンパク質に 高い親和性と特異性を有する抗−ＲＳＶ抗体の必要性は高い。 抗体治療は主に２種類の異なる作用：(i)完全な非標識抗体または標識抗体を 用いる受動的免疫治療、および(ii)自己免疫におけるネットワークバランスの再 確立の抗−イデオタイプを用いる能動的免疫治療に再区分される。 能動的免疫治療において、はだかの抗体は、抗原を中和するために、すなわち 標的膜関連抗原にエフェクター機能を目的として投与される。中和はリンホカイ ン、ホルモンまたはアナフィラトキシン、すなわち、Ｃ５aによるものである。 エフェクター機能は補体結合、マクロファージ活性化およびレクルートメント、 および抗体依存性細胞伝達細胞毒性(ＡＤＣＣ)を含む。はだかの抗体は白血病の 治療に用いられ（Ritz et al，S.F．Blood,(1981),58,141-152）、ＧＤ２に対す る抗体は神経芽細胞腫（Schulz et al，Cancer Res.(1984),44,5914）および黒 色腫（Irie et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.,(1986),83:8694）の治療に用いら れてきた。また、高抗−ＲＳＶ力価をもつ静脈免疫ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ ）抗体は最近ＲＳＶ感染により生じる呼吸困難の治療に実験的に用いられている （Hemming et al，Anti．Viral Agents and Chemotherapy(1987),31,1882-1886, Groothuis et al.，The New England J．Med.(1993),329,1524-1530，K．McInto sh，The New England J．Med.(1993),329,1572-1573，J．R．Groothuis，Antivi ral Research,(1994),23,1-10，Siber et al，J．Infectious Diseases(1994),1 69,1368-1373）。 モノクローナル抗体の治療効果は例えば、および抗原に結合する抗体の量、反 応性、特異性および種類などを含む要因によって変化する。また、抗体のインビ トロの半減期は重要な治療要因である。 さらに、抗体の治療能力に著しく影響を与える別の要因は起源のそれらの属で ある。現在、免疫治療に用いられるモノクローナル抗体はほとんど例外なくげっ 歯類起源のものであり（Schulz et al，Cancer Res.(1984),44,5914，Miller et al，Blood(1981),58,78-86，Lanzavecchia et al，J．Edp．Med.(1988),167,34 5-352，Sikora et al，Br．Med．Bull.(1984),40:240，Tsujisaki et al，Cance r Research(1991),51:2599）、多くはげっ歯類モノクローナル抗体の生産には十 分 256:495，Galfre et al，Nature,(1977),266:550）。しかしながら、げっ歯類モ ノクローナル抗体は治療効果はあるが、ヒト抗体に関しては制限と欠点が存在し 得る。例えば、それらはしばしば宿主のエフェクター機能（ＣＤＣＣ、ＡＤＣＣ など）の次善の刺激を誘発する。また、ネズミ抗体はヒト抗−ネズミ抗体（ＨＡ ＭＡ）応答を誘発し得る（Schroff et al，Can．Res.(1985),45:879-885，Shawl er et al,J．Immunol.(1985),135:1530-1535）。これは短命な抗体半減期をもた らし得（Dillman et al，Mod.(1986),5,73-84，Miller et al，Blood(1981),62: 988-995）、またある場合には、血清病およびアナフィラキシーなどの有毒副作 用を生じさせ得る。 ある種の患者には、例えば、重い免疫抑制患者（例えば、強い化学的または放 射性伝達癌治療を受けた患者）（Irie et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.(1986), 83:8694，Dillman et al，Mod.(1986),5,73-84，Koprowski et al，Proc．Natl ．Acad．Sci.(1984),81:216-219)）の場合、ネズミモノクローナル抗体の使用は 特別の負の副作用を生じさせる。反対に、正常または高活性免疫系の患者ではネ ズミ抗体は少なくともある種の疾病症状に対して特別の効果を示し得る。 ネズミモノクローナル抗体の限界を越えるために、組換技術が、キメラ抗体（ Morrison et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1984),81:216-219，Boulianne et al ，Nature,(1984),312,644-646）、「ＣＤＲ接合」によるヒト化抗体（Riechmann et al，Nature(1984),332-327）および、抗原性を軽減または除去するために他 のアミノ酸で特定の表面残基の置換による「みかけの」抗体の産生に適用されて きた。 しかしながら、このような抗体は臨床的に成功裡に用いられてきたが（Gillis et al，J．Immunol．Meth(1989),25:191）、それらは製造が面倒であることが 判明した。これは、最適抗体認識および親和性に対する必要条件の知識が十分に 解明されていなかったことによる。また、ヒトのフレームワークとマウスＣＤＲ 領域はしばしば、抗体活性に負に作用して立体的に相互作用する。さらに、この ような抗体は時にまた患者の強いＨＡＭＡ応答を誘発する。 ヒト抗体はそれらのネズミの対応物に対して大きな利点；ヒト抗体は最適のエ フェクター機能を誘発し、それらはＨＡＭＡ応答を誘発せず、宿主抗原特異的抗 体は、余りに微小であるため外因性免疫系では認識できない治療的に価値のある エピトープの確認を可能にし得る（ennox et al，"Monoclonal Antibodies in C linical Medicine,"London: Academic Press(1982)）を示す。 ヒト抗体は非常に望ましいが、それらの製造は、倫理的配慮およびヒト抗体の 従来の産生方法がしばしば効率が悪いという事実を含む種々の要因によって厄介 である。例えば、ヒトの患者は一般に、倫理的および安全性への配慮から、殆ど の抗原で十分に免疫化され得ない。従って、特定の抗原に対して、１０⁸モル以 上の有用な親和性をもつヒトモノクローナル抗体分離の報告はほとんどない（Mc Cabe et al，Cancer Research,(1988),48,4348-4353）。また、ドナー初回 抗原刺激細胞からの抗−ウイルス性ヒトモノクローナル抗体の分離は厄介である ことが判明した。例えば、ゴルニーは、ＨＩＶ陽性ドナーからの末梢血液単核細 胞（ＰＭＢＣ's）のＥＢＶ形質転換培養物の１４,３２９のうちのたった７つが 、安定で抗−ＨＩＶ抗体産生細胞株に特異的であったと報告している（Gorny et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1989),86:1624-1628）。 今日まで、多くのヒト抗−腫瘍抗体が、癌患者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ s）(Irie et al，Br．J．Cancer,(1981),44:262)または腫瘍放出リンパ節リンパ 球(Schlom et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1980),77:6841-6845，Cote et al， Proc．Natl．Acad．Sci.(1983)，80:2026-2030）から生産された。しかしながら 、このような抗体はしばしば細胞間で反応し、従って治療的には効果のない抗原 （Ho et al，In Hybridoma Technology，Amsterdam(1988),37-57）、またはＩg Ｍの種類（McCabe et al，Cancer Research,(1988),48,4348-4353）、ＩgＧ類よ り固形癌の貫通能力の低い抗体の種類であった。これらのうちヒト抗体が臨床試 験まで移行したのがほとんどない（Drobyski et al，R.C．Transplantation(199 1),51,1190-1196）ことは、取り出された抗体が次善の品質をもっていたことを 示唆している。さらに、これらの方法は試験用ドナー初回抗原刺激Ｂ細胞を開発 したから、これらの細胞が有用なモノクローナル抗体の取得の最適資源ではない ことは明らかである。 最近、初回抗原刺激されたドナーからのヒト抗体の生産は、ヒトＢ細胞の増加 をもたらすＣＤ４０での刺激により（Banchereau et al，F．Science(1991),251 :70，Zhang et al，J．Immunol.(1990)，144,2955-2960，Tohma et al，J．Immu nol.(1991),146:2544-2552）または不死化への余分のインビトロの追加免疫段階 のプライマーにより（Chaudhuri et al，Cancer Supplement(1994),73,1098-110 4）、改善されてきた。この原理は、初回抗原刺激されたドナー（４２−４４） からの細胞を用いてサイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルスおよ びヘモフィラス・インフルエンザに対するヒトモノクローナル抗体の生産に利用 され、他の方法（３２）で得られたものより著しく高い収率を示した。 さらに、ドナー初回抗原刺激のために、健康なドナーからのリンパ球の免疫化 およびエクスビボ培養が報告された。初回抗原刺激されたドナーからのＰＢＬ細 胞のエクスホマイン追加免疫を用いたヒトモノクローナル抗体の生産のいくつか の成功が報告された（Maeda et al，Hybridoma(1986),5:33-41，Kozbor et al， J．Immunol.(1984),14:23，Duchosal et al，Nature(1992),355:258-262）。イ ンビトロの免疫化の実現可能性は、最初ネズミリンパ球を用いて１９６７年にミ シェルおよびダットンによって示された（Mishell et al，J．Exp．Med(1967),1 26:423-442）。１９７３年に、ホフマンはヒトリンパ球を成功裡に免疫化した（ Hoffman et al，Nature(1973),243:408-410）。また、初回抗原刺激の成功は、 末梢血液から（Luzzati et al，J．Exp．Med.(1975),144:573-585，Misiti et a l，J．Exp．Med.(1981),154:1069-1084，Komatsu et al，Int．Archs．Allergy Appl．Immunol.(1986),80:431-434，Ohlin et al，C.A.K．Immunology(1989),68 :325(1989)）、扁桃腺（Strike et al，J．Immunol.(1978),132:1789-1803）、 および脾臓、この脾臓は外傷から得られた脾臓（Ho et al，In Hybridoma Techn ology，Amsterdam(1988),37-57，Boerner et al，J．Immunol.(1991),147:86-95 ，Ho et al，J．Immunol.(1985),135:3831-3838，Wasserman et al，J．Immunol ．Meth.(1986),93:275-283，Wasserman et al，J．Immunol．Meth.(1986),93:27 5-283，Brams et al，Hum．Antibod．Hybridomas(1993),4,47-56，Brams et al ，Hum．Antibod．Hybridomas(1993),4,57-65）および原発性血小板減少症（ＩＴ Ｐ）患者からの脾臓（Boerner et al，J．Immunol.(1991),147:86-95，Brams et al，Hum．Antibod．Hybridomas(1993),4,47-56，Brams et al，Hum．Antibod． Hybridomas(1993),4,57-65，McRoberts et al，"In Vitro Immunization in Hyb ridoma Technology"，Elsevier，Amsterdam(1988),267-275，Lu et al，P．Hybr idoma(1993),12,381-389）からのリンパ球を用いて報告された。 インビトロ免疫化はかなりの利点、例えば、容易に再現可能な免疫化、適当な 培養および手技によって、それ自体抗体分類の手技を容易にする（Chaudhuri et al，Cancer Supplement(1994),73,1098-1104）。また、自己抗原に対するイン ビボ耐性がＩＶＩ間に広がらない（Boerner et al，J．Immunol.(1991),147:86- 95，Brams et al，J．Immunol．Methods(1987),98:11）との証拠がある。従っ て、この技術は自己抗原、例えば、癌マーカーおよび自己免疫に関与する受容体 に対する抗体の生産に適用し得る。 インビトロの、例えば、癌関連抗原（ＴＡＡs）(Boerner et al，J．Immunol. (1991),147:86-95，Borrebaeck et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1988),85:3995 )のみで免疫刺激した種々の抗体に対する応答の発生が報告されている。しかし ながら、得られた抗体は残念ながら、典型的なＩｇＭであり、ＩgＧサブクラス ではなかった(McCabe et al，Cancer Research,(1988),48,4348-4353，Koda et al，Hum．Antibod．Hybridomas,(1990))、１：１５および２次（ＩgＧ）応答は 免疫化ドナーからのリンパ球を用いたプロトコルでのみ報告された。従って、こ れらのプロトコルは１次免疫応答の誘発には成功するが、再応答の発生にはドナ ー免疫化細胞を必要とすると思われる。 本研究はまた、インビトロにおけるヒトモノクローナル抗体を効果的に誘導す るための一般的なプロトコルを開発するために培養および免疫変異体を分類学的 に分析するために行われた（Boerner，J．Immunol.(1991),147:86-95，Brams et al，Hum．Antibod．Hybridomas(1993),4,47-56，Lu et al，Hybridoma（1993） ,12,381-389）。これにより、被験歴のないヒト脾臓細胞のＩＶＩによって誘導 されたフェリチンに特異的なヒトモノクローナル抗体の分離が得られた（Boerne r et al，J．Immunol.(1991),147:86-95）。本研究によりまた、あらたな二次（ ＩgＧ）応答が完全にインビトロで誘導され得るプロトコルが得られた（Brams e t al，Hum．Antibod．Hybridomas(1993),4,57-65）。 しかしながら、ＩＶＩの非常に有利な利点にもかかわらず、このような方法の 効果は、免疫細胞が培養容器の単層で成長するという事実のため厳しく制限され る。反対に、三次元構造を有するインビボの胚中心は免疫応答の活性相中脾臓に 観察される。これらの三次元構造には、多くの免疫学者によりＢ細胞の抗原−特 異活性化の部位と同等であると信じられている抗原提示細胞によって取り囲まれ ている活性化Ｔ−およびＢ−細胞を含まれる。 天然の脾臓環境に代替するものは、「再現」すなわち、「重度の複合免疫不全 症（ＳＣＩＤ）」マウスなどの免疫易感染性動物宿主中の脾臓条件の模倣である 。 ヒトリンパ球は、ＳＣＩＤのマウス（hu−ＳＣＩＤ）により容易に養子免疫され 、高濃度の免疫グロブリンを産生する（Mosier et al，Nature(1988),335:256,M cCune et al，L．Science(1988),241,1632-1639）。さらに、再構築のために用 いられたドナー患者が特定の抗原に暴露されたならば、同じ抗原に対する強い二 次応答がこのようなマウス中に誘導され得る。例えば、Duchosal et al，Nature (1992)，355:258-262は、１７年前に破傷風トキソイドで予防接種されたドナー 患者のヒト抹消血Ｂ−細胞がＳＣＩＤ環境中に再刺激され、高濃度、すなわち約 １０⁴が産生され得たと報告した。さらに彼らは、ヒトの細胞から抽出されたラ ムダおよびＭ１３ファージの順列組合せライブラリー法（Huse et al，R.A．Sci ence(1989),246:1275）を用いて、２種のヒト抗−ＴＴ抗体遺伝子のクローニン グおよび発現を報告している。報告された抗体の抗原親和性は１０⁸−１０⁹／Ｍ の範囲であった。しかしながら、このプロトコルはドナー患者の初回抗原刺激細 胞が必要であり、収率が非常に低く、３７０,０００クローンのライブラリーか ら２クローンのみが得られた。 従って、かってはhu−ＳＰＬ−ＳＣＩＤのマウスは、抗原に対するひとモノク ローナル抗体を産生するためだけに利用され、ドナー患者は天然に効率よく初回 3)，92,26-36）されるかのいずれかであり、それは多くの場合、ウイルス性また は細菌性抗原の暴露を伴う。また、hu−ＳＣＩＤ動物モデルを用いて報告された 血清力価のレベルは、正常なマウスの免疫処置により典型的に行われたものより 著しく低い。 さらに、一次抗体応答の誘導の後に被験歴のないヒトリンパ球を用いたhu−Ｓ ＣＩＤのマウスに二次抗体応答の誘導が起こり得る２種のプロトコルが開示され た。しかしながら、これらのプロトコルの両方の使用は実質的に制限される。第 １のプロトコルでは、一次応答は、肝臓、胸腺およびリンパ節が外科的に移植さ れたヒト胎児性hu−ＳＣＩＤのマウス中に誘導される。しかしながら、この方法 は、入手が非常に制限される胎児組織、並びにプロトコルの複雑な外科的方法（ McCune et al，L．Science(1988),241,1632-1639）により厳しく制限される。 第２のプロトコルでは、致死量の放射線照射した正常なマウスが、Ｔ−およびＢ −細胞摘出ヒト骨髄細胞およびＳＣＩＤのマウス骨髄細胞を用いて再構築される （Lubin et al，Science,(1991),252-427）。しかしながら、この方法は、４カ 月のインキュベート期間が必要なので不利である。さらに、両方のプロトコルは 、非常に低い抗体力価レベル、すなわち１０⁴以下という結果である。 また、Carlsson et al，J．Immunol.(1992),148:1065-1071は、抗原（破傷風 トキソイド）初回抗原刺激ドナーからのＰＢＭＣｓを用いた方法を１９９２年に 報告している。その細胞は短時間のインビトロ培養およびＳＣＩＤマウスへの移 入前の初回抗原刺激期間にマクロファージおよびＮＫ細胞をまず激減させた。つ いで、hu−ＳＰＬ−ＳＣＩＤのマウスを抗原で追加免疫した。この方法では、Ｓ ＰＬ−ＳＣＩＤ血清中、５×１０⁵まで、平均ＴＴ特異ひとＩgＧ力価＝１０⁴と いう結果が報告された。 ヒトモノクローナル抗体の産生は、さらに一般的には、所望のヒトモノクロー ナル抗体の、一定の、理想的には、永久的な供給物を分泌する細胞を得るために 、不死化Ｂ細胞の産生を必要とする。Ｂ細胞の不死化は、一般に、次の４つの方 法のうちの１つにより行われ得る：(i)ＥＢＶでの形質転換、(ii)マウス−ヒト のヘテロ融合、(iii)ＥＢＶ形質転換後のヘテロ融合、および(iv)順列組合せ免 疫グロブリン遺伝子ライブラリー技術。 ＥＢＶ形質転換は、多数の報告において、主に、抗ＨＩＶ抗体の産生に上手く 使用されている（Gorny，et al，Proc．Natl．Acad．Sci.(1989),86:1624-1628, Posner，et al．J．Immunol.(1991),146:4325-32）。主な利点は、Ｂ細胞２００ 個あたり約１個が形質転換されるようになることである。しかし、ＥＢＶ形質転 換細胞は、一般的には、不安定であり、主に、少量のＩgＭ抗体を産生し、十分 にクローン化せず、また培養してから数カ月後には抗体を製造しなくなる。ヘテ ロ融合（Carrol，et al，J．Immunol．Meth.(1986),89:61-72）は、一般的には 、高レベルのＩgＧ抗体を分泌するハイブリドーマを産生するのに有利である。 ハイブリドーマはまた、希釈を制限することにより、容易にクローン化もする。 しかし、不利な点は、収率が低いこと、すなわち、２０,０００個のリンパ球あ た り１個以下のハイブリドーマにしかならないことである（Boerner et al，J．Im munol.(1991),147:86-95，Ohlin，et al，C.A.K．Immunology(1989),68:325,Xiu -mei et al，Hum．Antibod．Hybridomas(1990),1:42，Borrebaeck C.A.K.Abstra ct at the "Second International Conference" on "Human Antibodies and Hyb ridomas," April 26-28，1992，Cambridge，England）。ＥＢＶ形質転換後、ヘ テロ融合を組み合わせると、次の２つの利点が得られる：(i)ＥＢＶ形質転換後 、ヒトＢ細胞がより容易に融合パートナーと融合する、および(ii)より安定かつ より多くハイブリドーマを産生する（Ohlin，et al，Immunology(1989),68:325 ，Xiu-mei et al，Hum．Antibod．Hybridomas(1990),1:42，Borrebaeck C.A.K． Abstract at the "Second International Conference" on "Human Antibodies a nd Hybridomas," April 26-28，1992，Cambridge，England）。最後の技術、す なわち、順列組合せ疫グロブリン遺伝子ライブラリー技術の利点は、非常に大き なライブラリーがＭ１３ Ｆab 発現技術によってスクリーニングされ得（Huse， et al，Science(1989),246:1275，William Huse，Antibody Engineeromg: A Pra ctical Guide，Borrebaeck C.A.K.，ed．5:103-120）、またその遺伝子が容易に 産生細胞系へ伝達され得るという事実である。しかし、その収率は、一般的には 、３７０,０００クローンあたり約１個と極めて低いオーダーである（Duchosal ，et al，Nature(1992)，355:258-262）。 すなわち、上記によれば、より効果的なヒトモノクローナル抗体、特にＲＳＶ に特異的な抗体、の生産方法は非常に利益があることは明らかである。さらに、 現在入手し得るものより、優れた結合活性、特異性およびエフェクター機能を有 するＲＳＶ−Ｆ タンパク質に特異的なヒト抗体もまた強く待望されていること もまた明らかである。 本発明の目的 本発明の目的は所望の抗原に特異的な高力価のヒト抗体の改良された産生方法 を提供することである。 本発明のより具体的な目的は、(i)被験歴のないインビトロヒト脾臓細胞の初 回抗原刺激、(ii)初回抗原刺激された脾臓細胞を免疫易感染性ドナー、例えば ＳＣＩＤマウス、への伝達、および(iii)抗原での追加免疫を含む、高力価ヒト 抗体の新規産生方法を提供することである。 本発明の別の具体的な目的は、呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、およ び特にＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に特異的なヒトモノクローナル抗体の改良さ れた産生方法を提供することである。 本発明の別の目的は、主としてＩgＧを分泌するＥＢＶ不死化Ｂ−細胞の形成 に好都合であるＥＢＶ不死化Ｂ−細胞の改良された産生方法を提供することであ る。 本発明のより具体的な目的は、 (i)被験歴のないインビトロヒト脾臓細胞の初回抗原刺激； (ii)そのようなインビトロ初回抗原刺激された脾臓細胞を免疫易感染性ドナー 、例えばＳＣＩＤマウス、への伝達； (iii)抗原での免疫易感染性ドナーの追加免疫； (iv)抗原を追加免疫された免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、から ヒト抗体産生Ｂ細胞の分離； (v)上記分離されたヒト抗体産生Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換 を含む主としてＩgＧ類を分泌するＥＢＶ不死化Ｂ−細胞の改良された産生方法 を提供することである。 本発明の別の目的は、主としてヒトＩgＧ類を分泌する、ＳＣＩＤマウスから 得られるＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を含む新規組成物を提供することである。 本発明のより具体的な目的は、 (i)被験歴のないインビトロヒト脾臓細胞の初回抗原刺激； (ii)得られたインビトロ初回抗原刺激された被験歴のない脾臓細胞を免疫易感 染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、への伝達； (iii)抗原での免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウスの追加免疫； (iv)抗原を追加免疫された免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、から ヒト抗体産生Ｂ細胞の分離； (v)上記分離されたヒト抗体産生Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換 を含む方法によって産生される、主としてヒトＩgＧ類を分泌する、ＥＢＶ形質 転換ヒトＢ−細胞を含む新規組成物を提供することである。 本発明の別の具体的な目的は、２×１０^-9モル以下のＲＳＶ Ｆ−タンパク質 に対して親和性を有するＲＳＶ中和ヒトモノクローナル抗体を産生することであ る。 さらに、本発明の別の目的は、２×１０^-9モル以下のＲＳＶ Ｆ−抗原に対し て親和性を有する、ＲＳＶ中和ヒトＩgＧモノクローナル抗体を分泌するＥＢＶ 不死化細胞株を提供することである。 本発明のより具体的な目的は、それぞれ、ＲＦ−２およびＲＦ−１と称され、 インビボでＲＳＶを中和し、各々２×１０^-9以下のＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対 して親和性を有する、ヒトモノクローナル抗体を分泌する、２種のＥＢＶ不死化 細胞株、ＲＦ−２およびＲＦ−１を提供することである。 本発明の別の目的は、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変領域を含むヒト抗体を分 泌するトランスフェクタントを産生する、ＲＦ−１またはＲＦ−２の重鎖および 軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列で真核細胞をトランスフェクションするこ とである。 本発明のより具体的な目的は、ＲＦ−１またはＲＦ−２重鎖および軽鎖可変領 域を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を提供することである。 本発明の別の目的は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的であり、２×１０^-9モ ルのＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対してＫｄを示す、ＲＳＶ中和ヒトモノクローナ ル抗体の治療的または予防的有効量を投与してヒトのＲＳＶ感染を治療または予 防することである。 本発明のより具体的な目的は、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖 領域を含み発現するトランスフェクションされた真核細胞中に発現されるＲＦ− １またはＲＦ−２またはヒトモノクローナル抗体の治療的または予防的有効量を 投与してヒトのＲＳＶ感染を治療または予防することである。 本発明の別の目的は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と組み合わせて 、インビトロでＲＳＶを中和し、２×１０^-9モル以下のＲＳＶ Ｆ−タンパク質 に 対してＫｄを有するＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的なヒトモノクローナル抗体 の治療的または予防的有効量を含む、ＲＳＶ感染を治療または予防するワクチン を提供することである。 本発明のより具体的な目的は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と組み 合わせて、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖領域をコードするＤＮ Ａ配列を含み発現するトランスフェクションされた真核細胞から誘導される、Ｒ Ｆ−１またはＲＦ−２またはヒトモノクローナル抗体の治療的または予防的有効 量を含む、ヒトのＲＳＶ感染を治療または予防するワクチンを提供することであ る。 本発明の別の目的は、２×１０^-9モル以下のＲＳＶ融合（Ｆ）−タンパク質に 対して親和性を有するヒトモノクローナル抗体を用いて、試料、例えばたん、中 のＲＳＶの存在を検査することによりＲＳＶ感染の診断方法を提供することであ る。 さらに、本発明の別の目的は、２×１０^-9モル以下のＲＳＶ融合（Ｆ）−タン パク質に対して親和性を有する、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的なヒトモノク ローナル抗体を含み、その抗体が直接または間接的に適当なレポーター分子、例 えば酵素または放射性核種に結合する、ＲＳＶ感染の検出のための新規免疫プロ ーブおよび検査キットを提供することである。好ましい実施態様において、これ らのヒトモノクローナル抗体は、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖 領域でトランスフェクションされている真核性細胞、例えばＣＨＯ細胞、中に産 生されたＲＦ−１またはＲＦ−２または組換ヒトモノクローナル抗体を含む。 発明の簡単な説明 本発明は、その最も広い態様において、所望の抗原、好ましくはヒト疾患状態 の予防、治療または検出に関与する抗原に対するヒト抗体の新規製造方法に関す る。これら方法は、ナイーブな（naive）ヒト脾臓細胞をインビトロで初回抗原 刺激し、得られたインビトロで初回抗原刺激した脾臓細胞を免疫無防備状態にあ るドナー、たとえばＳＣＩＤマウスに移し、ついで該免疫無防備状態にあるドナ ーに抗原をブースター投与することを含む。 本発明はまた、ＩｇＧを分泌する細胞の産生に有利なエプスタイン−バーウイ ルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞の製造方法であって、ナイーブなヒト脾臓細胞をイ ンビトロで初回抗原刺激し、得られた初回抗原刺激した脾臓細胞を免疫無防備状 態にあるドナー、たとえばＳＣＩＤマウスに移し、該免疫無防備状態にあるドナ ーに抗原をブースター投与し、ヒト抗体を分泌する、好ましくはＩｇＧを分泌す るＢ細胞を該抗原ブースター投与したドナー、たとえばＳＣＩＤマウスから単離 し、ついで該単離したヒト抗体分泌細胞をＥＢＶでトランスフォーメーションす ることを含む方法にも関する。 本発明はさらに詳しくは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に対して高親和性を示 し、ＲＳＶ感染を中和もする、ＲＳＶ、とりわけＲＳＶ Ｆタンパク質に対する ヒト抗体の製造の改良法、並びにこれら方法の結果得られるヒトモノクローナル 抗体に関する。このことは、好ましくは、ナイーブなヒト脾臓細胞をインビトロ でＩ１−２および任意にＲＳＶ Ｆタンパク質で初回抗原刺激し、得られたイン ビトロで初回抗原刺激した脾臓細胞を免疫無防備状態にあるドナー、たとえばＳ ＣＩＤマウスに移し、ついでＲＳＶ Ｆタンパク質をブースター投与して、ＲＳ Ｖ Ｆタンパク質に対する高親和性、すなわち≦２×１０^-9モルを有する中和抗 ＲＳＶ Ｆタンパク質ヒト抗体を分泌するヒトＢ細胞を産生させることにより行 う。 得られたＢ細胞は、ヒト抗ＲＳＶ Ｆタンパク質モノクローナル抗体を定常的 かつ安定に提供できるように不死化するのが好ましい。好ましい態様において、 Ｂ細胞を抗原ブースター投与したＳＣＩＤマウスから単離し、ついでＥＢＶウイ ルスでトランスフォームして、ヒトＩｇＧを優勢的に分泌するＥＢＶトランスフ ォームしたヒトＢ細胞を産生させる。 ついで、これら細胞をクローニングして、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親 和性、すなわち≦１０^-7、好ましくは≦２×１０^-9モルを有するヒトモノクロー ナル抗体を分泌するＥＢＶトランスフォームした細胞株を選択する。 本発明はまた、かかる抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ヒトモノクローナル抗体の治療 剤および／または予防剤並びに診断剤としての使用にも関する。上記のように、 本発明の方法の結果、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親和性を示す、すなわち ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する≦２×１０^-9モルのＫｄを有し、インビトロでＲ ＳＶを中和もするヒトモノクローナル抗体が産生される。それゆえ、これら抗体 は、ＲＳＶ Ｆタンパク質が種々のＲＳＶ単離物において高度に保存されている 表面タンパク質であることが事実であるとしたなら、ＲＳＶ感染の予防または治 療のための予防剤および治療剤として理想的に適している。また、本発明のＲＳ Ｖ Ｆタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体の親和性および特異性が高い のであるなら、これら抗体はまたＲＳＶ感染を診断するのに用いることもできる 。 さらに詳しくは、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する２つの特別のヒト モノクローナル抗体、すなわち、ＲＦ−１およびＲＦ−２、並びにそれから得ら れる組換えヒト抗体（該抗体は、好ましくはＣＨＯ細胞（該細胞はＲＦ−１また はＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖ドメインをコードするＤＮＡ配列でトランスフ ェクションされている）中で産生される）を提供する。これら抗体は、ＲＳＶ感 染の治療または予防のための予防剤および／または治療剤として特に有用である 。さらに、これら抗体は診断剤として有用である。なぜなら、これら抗体はＲＳ Ｖ Ｆタンパク質に高親和性で結合する、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に対する ≦２×１０^-9の親和性を有するからである。これら抗体は治療剤として特に有用 である。なぜなら、これら抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質に対して高親和性および 特異性を有し、ＲＳＶ感染をインビトロで有効に中和する能力を有するからであ る。 図面の簡単な説明 図１は、抗Ｆタンパク質ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清を用いたＦタンパク質の イムノブロットを示す：（Ａ）および変性（Ｂ）Ｆタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅにかけ、ウエスタンブロッティングによりニトロセルロースに移したことに注 意。ニトロセルロースストリップを、陽性の対照であるマウス抗Ｆタンパク質Ｍ Ａｂ（レーン１Ａおよび１Ｂ）、陰性の対照であるｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清 抗ＴＴ（レーン２Ａおよび２Ｂ）およびマウス＃６（レーン３Ａおよび３Ｂ）、 マウス＃３（レーン４Ａおよび４Ｂ）およびマウス＃４（レーン５Ａおよび５Ｂ ）からのｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ抗Ｆタンパク質血清と反応させた。 図２は、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清抗Ｆタンパク質を用いたＨＥＰ−２細胞 の免疫蛍光を示す。非感染（左）およびＲＳＶ感染したＨＥｐ−２細胞を、ブー スター投与の１５日後に採取した１：５０希釈ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウス＃ ６からの血清と反応させた。 図３は、プラスチック結合したアフィニティー精製ＲＳＶ Ｆタンパク質への 精製ＲＦ−１およびＲＦ−２の反応性を示す。参照ヒト抗ＲＳＶ血清、ＬＮの反 応性をも記録してある。ＥＬＩＳＡプレートを５０ｎｇのＲＳＶ Ｆタンパク質 でコーティングした。 図４は、腫瘍細胞上澄み液から精製したＲＦ−１（レーン２）およびＲＦ−２ （レーン３）ヒトＭＡｂのＩＥＦを示す。ＩＥＦは３−１０のｐＨ勾配で行った 。レーン１はｐｉ標準を示す。 図５は、種々の量のＲＦ−１ついでＦＩＴＣ−標識ＧＡＨ ＩｇＧとともにイ ンキュベートしたＨＥｐ−２細胞およびＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞、１×１０⁶ の間接免疫蛍光フローサイトメトリーアッセイを示す。全集団の相対平均強度を 記録してある。 図６は、ヒト抗体の発現に使用するＮＥＯＳＰＬＡベクターを示す。ＣＭＶ＝ サイトメガロウイルスプロモーター。ＢＥＴＡ＝マウスβグロビン主要プロモー ター。ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル。ＳＶＯ＝ＳＶ４０複 製起点。Ｎ１＝ネオマイシンホスホトランフェラーゼエクソン１。Ｎ２＝ネオマ イシンホスホトランフェラーゼエクソン２。ＬＩＧＨＴ＝ヒト免疫グロブリンκ 定常領域。Ｈeavy＝ヒト免疫グロブリンγ１またはγ４ＰＥ定常領域。Ｌ＝リー ダー。ＳＶ＝ＳＶ４０ポリアデニル化領域。 図７ａは、ＲＦ−１の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図７ｂは、ＲＦ−１の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図８ａは、ＲＦ−２の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図８ｂは、ＲＦ−２の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図９ａは、ＲＦ−１軽鎖、リーダー配列、およびヒトκ定常ドメイン配列のア ミノ酸配列および核酸配列を示す。 図９ｂは、ＲＦ−１重鎖、リーダー配列、およびヒトγ／定常ドメイン配列の アミノ酸配列および核酸配列を示す。 図１０は、図９ａ〜９ｃに示すＲＦ−１核酸配列およびヒトγ／定常ドメイン を含む、ＮＳＫＥ１と称するＮＥＯＳＰＬＡベクターの模式図を示す。 図１１ａは、ＲＦ−２軽鎖、リーダー配列、およびヒトκ定常ドメイン配列の アミノ酸配列および核酸配列を示す。 図１１ｂは、ＲＦ−２重鎖、リーダー配列、およびヒトγ／定常ドメイン配列 のアミノ酸配列および核酸配列を示す。 図１１ｃは、ヒトγ／定常ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す。 図１２は、図１１ａ〜１１ｃに示すＲＦ−２核酸配列およびヒトγ／定常ドメ イン配列を含む、ＮＳＫＧ１と称するＮＥＯＳＰＬＡベクターの模式図を示す。 発明の詳細な説明 上記のように、本発明は、所望の抗原、好ましくはヒト疾患状態に関与する抗 原に対するヒトモノクローナル抗体の新規な非常に効率的な製造方法を提供する 。ヒト疾患状態に関与する抗原は、一般に抗体の適当な治療標的を含む表面抗原 であろう。たとえば、これにはウイルスの表面タンパク質およびヒト癌細胞の表 面上で発現される抗原が含まれる。好ましい態様において、表面抗原はＲＳＶの 融合タンパク質（Ｆタンパク質）を含むであろう。 ヒト疾患状態には、例示として、ウイルス感染、たとえば、ＲＳＶ、パピロー マウイルス、肝炎、ＡＩＤＳなど、癌、細菌感染、酵母感染、寄生体感染、たと えばマラリアなどが含まれる。本質的に、ヒト疾患状態は、特定の抗原に特異的 なヒトモノクローナル抗体の投与によって潜在的に防御または治療が可能なあら ゆるヒト疾患状態を包含することを意図している。 本発明のヒトモノクローナル抗体の製造方法は、本質的に、ナイーブヒト脾臓 細胞のインビトロでの初回抗原刺激、これら脾臓細胞の免疫無防備状態のドナー へ、すなわちＳＣＩＤマウスの移行、ついで該脾臓細胞を投与したＳＣＩＤマウ スへの抗原ブースター投与の組み合わせを含む。驚くべきことに、ヒト抗体を製 造するためのこれら２つの公知方法の組み合わせが相乗的結果を生み出すことが わかった。とりわけ、免疫した抗原に対する非常に高められた抗原特異的応答、 およびＩｇＧイソ型のヒトモノクローナル抗体の非常に高い力価が得られる。さ らに詳しくは、この組み合わせにより、これまでにない高い二次応答が得られる ことがわかった：すなわち、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清でのヒトＩｇＧ応答は ＳＣＩＤでのナイーブ細胞の移行から得られる結果に比べて１０倍高く、特異的 抗体応答は１０００倍増加した。また、得られる抗体は活動昂進（hyperactive ）免疫動物で実験的に産生される抗体に匹敵する高い親和性および特異性を有す ることがわかっている。また、かかる予期しない結果を得るためにナイーブな脾 臓細胞を用いる場合には、インビトロと得られたｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウス 中に導入した後との両場合に抗原で攻撃する必要があることもわかった。また、 抗原のブースター投与の直前に、別の新たな初回抗原刺激していない脾臓細胞を ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤドナーに導入することも必須ではないが好ましい。この ことにより、抗体応答が一層さらに促進されることがわかった。 本発明は、ナイーブなヒト細胞から二次応答を生成するための最適のインビト ロ一次およびブースタープロトコールが以前に開示された［ブラムズ（Ｂrams） ら、Ｈum.Ａntibod.Ｈybridomas（１９９３）、４、５７−６５］後に開発され た。ブラムズら、Ｈum.Ａntibod.Ｈybridomas（１９９３）、４、５７−６５の プロトコールは、一つの抗原攻撃に供した培養液から得られるものに比べて約２ 倍から１０倍高い抗原特異的なＩｇＧ応答を与えることがわかった。このインビ トロ免疫（ＩＶＩ）プロトコールは、非常に異なる抗原、すなわち、ウマフェリ チン（ＨｏＦ）、カルモデュリン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、マウスＩｇＧ 、トランスフェリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｔ細胞依 存性タンパク質担体に結合したジニトロフェニル（ＤＮＰ）およびＲＳＶ融合（ Ｆ）タンパク質を用いて発展され、最適化された。 本質的に、このプロトコールは、培養を開始した後の１日目に脾臓細胞培養液 を１：１の比率の自己脾臓細胞とともに抗原で再刺激することを含む。このプロ トコールを用いて測定されたＩｇＧ応答は、繰り返し抗原暴露の結果であったが 、二次応答と等価なものであることが示された。 これら実験はさらに、外傷性脾臓およびＩＴＰ脾臓を含む完全な脾臓がリンパ 球の最適の採取源であることを示した。対照的に、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）お よび扁桃またはリンパ節からの細胞は抗原特異的な応答を誘発するうえで劣って いることがわかった。さらに、細胞成分の枯渇または中和はより悪い応答となっ た［ベーナー（Ｂoerner）ら、Ｊ.Ｉmmunol.（１９９１）、１４７：８６−９５ ］。また、これら実験は、所定の脾臓細胞調製物および抗原に対して独特の最適 抗原濃度が存在することを示した。 それゆえ、ナイーブなヒト脾臓細胞から二次応答を生成するための最適なイン ビトロ一次およびブースタープロトコールが確立されたら、このプロトコールを ヒトモノクローナル抗体を産生するための以前のインビボ法、すなわちＳＣＩＤ マウスと組み合わせることが考えられた。試験を行うまでは、初回抗原刺激した 脾臓細胞の投与がＳＣＩＤマウスによる所定抗原に対するヒトモノクローナル抗 体の産生に対して、または維持されるべきヒトリンパ球の能力に対して、いかな る影響を及ぼすか（もし、あるなら）については知られていなかった。しかしな がら、このことが抗原ブースト（boost）の促進およびインビトロ初回抗原刺激 したナイーブな脾臓細胞の発現の促進をもたらすと思われた。 この点に関し、リンパ球はＳＣＩＤ中でそれ自体を確立し数カ月生存しうるこ とが以前に報告されている［マッキューン（ＭcＣune）ら、Ｓcience（１９８８ ）、２４１、１６３２−１６３９、ルビン（Ｌubin）ら、Ｓcience（１９９１） 、 ２５２：４２７］。しかしながら、上記に記載したように、ＳＣＩＤまたは抗原 に対するヒトモノクローナル抗体を用いた従来法は、生まれつきまたはワクチン 接種により以前に抗原に暴露されたドナーからの細胞を用いており、一般に高ヒ ト抗体力価とはならなかった。 実に驚くべきことに、ｈｕ−ＳＣＩＤモデルにおいてヒトナイーブ脾臓細胞か らの二次応答を産生させるためのインビトロ一次およびブースタープロトコール ［ブラムズら、Ｈum.Ａntibod.Ｈybridomas（１９９３）、４、５７−６５］の 組み合わせが、免疫した抗原に対する非常に有意な抗原特異的ＩｇＧ応答によっ て示されるように、相乗的な結果となった。 さらに、これら方法の組み合わせから（ウマフェリチン（ＨｏＦ）をモデル抗 原として使用）以下のことがわかった： （i）ＳＣＩＤに移す前にインビトロ免疫段階を導入することが、有意の抗原 特異的応答を信頼性をもって誘発するのに必須である； （ii）ＳＣＩＤマウス中でヒト脾臓細胞の最適の維持を達成するためにヒト細 胞を腹腔内に移さなければならない； （iii）最適のインビトロ培養は約３日である； （iv）ＩＬ−２および任意にＩＬ−４またはＩＬ−６をインビトロで使用する と、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて抗原特異的応答の最高の抗体力価が 得られる； （v）マウスでのｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤは、アジュバント、たとえば、完全 フロイントアジュバント（ＦＣＡ）および／またはミョウバン中に懸濁した抗原 をブースター投与するのが好ましい； （vi）マウス由来であろうとヒト由来であろうとＮＫ細胞の死滅または中和は 、驚くべきことに抗体産生に対して何ら利益をもたらさない。しかしながら、低 ＮＫ株であるＳＣＩＤ−ベージュ（beige）マウスをインビトロ初回抗原刺激細 胞の宿主として用いると、アジュバントの組み合わせ、すなわちＦＣＡおよびミ ョウバンを用いてブースター投与を行ったときに優れた応答が得られることがわ かった； （vii）ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスの〜１／３の脾臓（リンパ節ではなく ）を通常のＳＣＩＤに比べて２５倍まで拡張した。さらに、これらのうち、かか る脾臓中の細胞の２／３までが通常のヒトリンパ球膜マーカーに対して陽性であ ると試験された。 さらに詳しくは、本発明の方法は、ナイーブなヒト脾臓細胞をインビトロにて 抗原で約１〜１０日間、好ましくは約３日間、初回抗原刺激し、該初回抗原刺激 した細胞をＳＣＩＤマウスに移し、ついで該マウスを約３〜１４日後、好ましく は約７日後に抗原をブースター投与することを含む。このことにより、約２４日 以降に、得られたｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスの血清中に高抗原特異的ＩｇＧ 応答が得られることが示された。一般に、血清の最終希釈力価は、ナイーブな抗 原としてウマフェリチンを用いて約１０⁶（約５０ｍｇ ＩｇＧ／ｍｌにおいて半 最大応答）およびウイルス抗原、すなわちＲＳＶの融合タンパク質で想起（reca ll）応答が誘発される場合には１０⁷（約５ｍｇ ＩｇＧ／ｍｌにおいて半最大応 答）である。これら結果に基づき、他の抗原を用いた場合にも同様の応答が得ら れるであろうことが予想される。 上記のように、所望の抗体応答の最適な誘発にはｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウ スにおいてインビトロとインビボの両方でのヒト細胞の抗原攻撃が必要である。 インビトロ初回抗原刺激の際にＩＬ−２が必要であること、およびＩＬ−２とと もにＩＬ−４およびＩＬ−６を同時投与するとｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスに おける応答がさらに促進されることもわかった。さらに、ＳＣＩＤ再構成は容易 になるが、放射線照射した（irradiated）同種リンパ球の同時腹腔内投与には依 存しなかった。 さらに、抗体応答は脾臓ごとに有意の変異が存在することがわかった。たとえ ば、ある種の脾臓では抗原特異的な抗体応答を生成するために１０日目に抗原と 自己の脾臓細胞とを同時に投与する必要があった。また、抗体応答レベルは、異 なるｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて若干異なることがわかった。しかし ながら、当業者であれば本明細書中の教示に基づいて、所定の抗原に対する最適 の抗原特異的抗体応答を生成するのに適した条件を容易に選択することができる 。 たとえば、幾つかの異なる脾臓調製物について、たとえばインビトロ免疫の１ ０日後に培養液中に特異的な抗体を産生する能力を試験することにより、最高の 応答を同定することができる。さらに、各脾臓から多数の細胞が調製され解凍さ れるので、選択した脾臓から３日間の新たなインビトロ免疫を行い、ついでこれ をＳＣＩＤマウスに移すことが可能である。対照的に、末梢血細胞は、かなり限 られた量のＰＢＬしか１回の移行で１ドナーから回復できないことから、かかる 最適化はできない。 上記で記載したように、従来の報告とは対照的に、本発明の方法では末梢血細 胞を用いたときにヒトＮＫ活性の中和は脾臓に対して何ら影響を及ぼさないこと がわかった。さらに、補体結合抗アシアロＧＭＩ抗体でＳＣＩＤ ＮＫ細胞を中 和すると抗原特異的なＩｇＧ応答は減少した。対照的に、ＮＫ細胞レベルの減少 した株であるＳＣＩＤ／ベージュマウスを用いると、通常のＳＣＩＤに比べて抗 原特異的なＩｇＧ応答が有意に増加した。 さらに、２つの免疫経路、静脈内（ＩＶ）および腹腔内（ＩＰ）を、ＳＣＩＤ マウスの再構成、すなわち該マウス中での脾臓細胞の維持およびヒト抗体の産生 をもたらす能力について比較した。腹腔が細胞移行および免疫の最適の部位であ ることがわかった。さらに、現在までのところ、細胞の静脈内移行は０.０１μ ｇ／ｍｌを越えるヒトＩｇＧがマウス血清中に検出されたときに決して再集団（ repopulation）となることは認められていない。 また、得られたＩｇＧ濃度は移行したヒト細胞の数と直接的な相関関係を有す ることもわかった。たとえば、ＳＣＩＤの再集団は、５×１０⁶のインビトロ初 回抗原刺激脾臓細胞を腹腔内注射した場合には９２％であり、５×１０⁷のイン ビトロ初回抗原刺激脾臓細胞を腹腔内注射した場合には実質的に１００％であっ た。当業者であれば本明細書中の教示に基づいて、注射したインビトロ初回抗原 刺激脾臓細胞の最適数を選択することができる。一般に、これは約１０⁴〜約１ ０⁸細胞、さらに好ましくは約１０⁶〜１０⁸細胞、最も好ましくは少なくとも約 １０⁷〜１０⁸細胞の範囲であろう。 抗体応答は特定のアジュバントの存在下で行えることもわかった。さらに詳し くは、最大ヒト抗体応答は、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスを完全フロイントア ジュバント（ＣＦＡ）中に懸濁した抗原またはＣＦＡとミョウバンとをいっしょ に用いてブースター投与したときに達成されることが観察された。フェリチンを ブースター投与したｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤにおける試験は、ＣＦＡの方がミョ ウバンよりも優れたアジュバントであり、それぞれ３３ｍｇ／ｍｌおよび１３ｍ ｇ／ｍｌヒトＩｇＧを誘起することを示した。ＣＦＡとミョウバンとの組み合わ せはＳＣＩＤにおける応答を改善しなかった。しかしながら、これらアジュバン トをＳＣＩＤ／ベージュ−ｈｕ（このマウスは減少したＮＫ細胞活性となる変異 を有している）に用いるとＣＦＡ単独の場合に比べてＩｇＧ産生が８〜１０倍増 加する。しかしながら、他のアジュバントまたはそれらの組み合わせもまた同様 のまたはより増大した結果をもたらすことが期待される。完全フロイントアジュ バントとミョウバンとをいっしょに用いた場合の全ヒトＩｇＧの最高濃度は約１ ０ｍｇ／ｍｌであり、特定のＩｇＧの最高濃度は約５００μｇ／ｍｌモノクロー ナル抗体当量であった。 この方法をフェリチンとともに使用すると、特異性、反応性、およびＩｇ鎖イ ソ型の点で高度免疫したヤギ、ウサギおよびブタで得られるものに匹敵するポリ クローナル抗体応答が得られた。ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清抗体は、ほとんど ＩｇＧであり、高フェリチンの組織からの細胞にのみ結合し、低フェリチンまた はフェリチン陰性の組織からの細胞には結合せず、天然のフェリチンおよびウエ スタンブロッティングにおける変性したフェリチンの両者を認識した。これら結 果は、得られたヒト抗体の抗体濃度という点でも抗原特異性という点でも極めて 予期しないものである。さらに、異なる抗原を用いて同様の結果が得られる。 注射後、ヒト細胞は２つの部位、すなわち腹腔およびマウス脾臓に蓄積する傾 向があることがわかった。血液中には約７％未満のヒト細胞が認められたが、リ ンパ節および肝臓はヒト抗原のものであり、肥大した脾臓および場合によりある 種の動物での腫瘍中では２５％〜３３％の細胞がヒト由来であった。これらヒト 細胞は肥大した脾臓ではほとんどＢ細胞とＴ細胞ばかりであり、あとは少量のＣ Ｄ１４⁺細胞（ほとんど単球）であった。 これら結果は、脾臓、リンパ節、肝臓および腹腔を調べるフローサイトメトリ ーにより決定した。ヒトの脾臓細胞が脾臓を再集団化（repopulated）した場合 には、それはしばしば天然のＳＣＩＤ脾臓に比べて２５倍までサイズが大きくな っていることがわかった。摘出後すぐに測定したとき、ヒト細胞は脾臓中の全細 胞数の約３０％までを構成し、残りは未知の起源のものであった。しかしながら 、３日間培養した後には生存細胞の大部分はヒト由来であることがわかった。と いうのは、これら細胞は抗体に結合し、マウスリンパ球とは交差反応を示さなか ったからである。 さらに、再構成したマウスは脾臓のサイズが通常のマウスと肥大した脾臓を有 するマウスとの２つのグループに分けることができることが観察された。肥大し た脾臓、すなわち通常より２５倍大きな脾臓を有するｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマ ウスは、通常の脾臓を有するマウスに比べて約１５０倍高いレベルのヒトＩｇＧ を有し、同様に処理した通常のサイズの脾臓を有するマウスより約１０,０００ 倍高いレベルの抗原特異的ヒトＩｇＧを有していた。抗原特異的な応答の相対的 な親和性が応答全体を通して増大したことがわかったが、これは全免疫グロブリ ンプールのうちのより高いパーセントのものが、より良好な結合特性を有する抗 体からなることを示していた。これら結果は、このシステムが抗原駆動されたも のであることを示している。 これら結果は非常に有意であり、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤからヒト細胞を回収 し、該細胞を組み合わせヒト抗体遺伝子ライブラリーを生成するために用いるこ とによって臨床的および／または診断的に使用可能な高親和性および特異性を有 するヒトモノクローナル抗体を得ることが可能であることを示している。 さらに詳しくは、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して高い親和性、すな わち≦２×１０^-9モルタンパク質を示す新規なヒトモノクローナル抗体を提供す るものであり、該ヒトモノクローナル抗体はＲＳＶをインビトロで中和すること ができる。本発明はさらに、かかるＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒトモノクロ ーナル抗体の製造方法を提供する。 一般に、かかるヒト抗体は、ナイーブなヒト脾臓細胞をＲＳＶ Ｆタンパク質 でインビトロ免疫し、該インビトロ免疫したヒト脾臓細胞を免疫無防備状態にあ る動物ドナー、すなわちＳＣＩＤマウスに移し、該動物にＲＳＶ Ｆタンパク質 をブースター投与し、ついで該動物から、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒトモ ノクローナル抗体を分泌するヒトＢ細胞を単離し、該ヒトＢ細胞を免疫し、つい で該免疫したＢ細胞をクローニングしてＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親和性 、好ましくは少なくとも１０^-7モル、さらに好ましくは≦２×１０^-9モルを有す るヒトモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。 上記のように、とりわけヒト脾臓細胞、すなわち以前にＲＳＶ Ｆ抗原に暴露 されたかまたは暴露されておらず免疫無防備状態にある動物ドナー、すなわちＳ ＣＩＤマウスに移されるヒト脾臓細胞のインビトロ免疫と該動物ドナーをついで ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原でブースター投与することの組み合わせは、ＳＣＩＤ マウスにおいてヒト抗体を製造する従来法に比べて有意な利点をもたらすことが わかった。すなわち、本発明の方法は、非常に高い抗体力価、すなわち最高の抗 Ｆタンパク質力価が約１０^-7である抗体力価、および高いＩｇＧ濃度、すなわち 最も高い応答で約３ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらす。さらに、この方法は、非常に 有利な特性の組み合わせ、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高い親和性を 示すことと実質的なインビトロ中和活性を示すこととの両者を有するヒト抗体の 製造を可能とする。 実施例において一層詳細に記載するように、本発明者らは２つのヒトモノクロ ーナル抗体、すなわちプラスモン共鳴（plasmon resonance）により決定したと きにＦタンパク質に対する親和性定数Ｋａ＝１０¹⁰Ｍを示すＲＦ−１、および滴 定微小熱量測定法（titration microcalorimetry）により決定したときにＫａ＝ １０８Ｍの親和性定数を示すＲＦ−２を単離した。また、ＲＦ−２の計算したＫ ｄは２×１０^-9Ｍであった。さらに、これら両抗体とも８〜１２０ｎｇ／ｍｌの 濃度でインビトロウイルス中和特性を示すとともに、以前にＲＳＶが感染した細 胞の融合を抑制する能力をも示す。重要なことに、このインビトロ中和活性は、 Ａ型およびＢ型の両ウイルス型の広範な範囲の種々の野生型および実験室ＲＳＶ 株に対して適用できる。 これら結果、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ感染細胞の表面上に発現 される表面タンパク質を含む）に対する本発明の抗体の高親和性並びに該ウイル スを有効に中和する能力およびウイルス感染した細胞の融合を抑制する能力から 、本発明のヒトモノクローナル抗体は治療剤および予防剤として、すなわちＲＳ Ｖに罹りやすいかまたはＲＳＶに感染した患者においてＲＳＶを治療または予防 するのに適しているに違いない。上記のように、ＲＳＶ感染は幼児において特に 広範にみられ、免疫無防備状態のヒトにおいてもみられる。それゆえ、本発明の モ ノクローナル抗体は、かかる対象者においてＲＳＶを予防または治療するのに特 に望ましいであろう。 さらに、本発明のモノクローナル抗体がヒト由来であることから、受動免疫療 法に特に適している。これは、本発明の抗体がマウスモノクローナル抗体の潜在 的な制約、すなわちＨＡＭＡ応答および正常なヒトエフェクター機能の不在、を 受けないであろうことによる。実際、本発明のヒトモノクローナル抗体の特徴付 け（以下の実施例に記載）に基づき、ＲＦ−１およびＲＦ−２の両者が、以前に 開示されたマウスまたはキメラ抗Ｆタンパク質抗体および組換えライブラリー由 来のヒトＦａｂフラグメントに比べて実質的に一層高いインビトロ中和活性およ び以前に感染したＲＳＶ細胞の融合を抑制する能力を示すことが明らかである。 また、本発明の抗体がヒト由来であることにより、かかる中和活性がインビボ投 与後も維持されるであろうことが期待される。 本発明のヒトモノクローナル抗体の他の利点は、正常組織との反応性を実質的 に有しないことである。以下に示すように、本発明のヒトモノクローナル抗体は ＲＳＶ感染細胞にのみ結合し、リンパ組織、肝臓、前立腺または喉頭表皮などの 細胞株には結合しない。それゆえ、これら抗体はインビボ投与したときにＲＳＶ 感染細胞には有効に結合するが正常組織には結合せず、かくしてＲＳＶ感染の中 和をもたらすことができる。さらに、開示した特性に基づき、ＲＳＶ Ｆタンパ ク質に対する本発明のヒトモノクローナル抗体はＲＳＶ感染に感受性の宿主を保 護するのに用いることが期待される。 さらに詳しくは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する本発明のヒトモノクローナル 抗体は、たとえば外傷性かまたはＩＴＰ源からヒト脾臓細胞を入手し、ついでこ れをインビトロで初回抗原刺激することにより製造する。このことには、本質的 に、該ナイーブなヒト脾臓細胞を充分な量の１１−２および任意にＲＳＶ Ｆタ ンパク質の存在下でインビトロにて培養して免疫（初回抗原刺激ともいう）を誘 発させることが含まれる。一般に、使用するＲＳＶ Ｆタンパク質の量は約１〜 ２０ｎｇ／ｍｌ ＲＳＶタンパク質、より好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、 最も好ましくは約４０ｎｇ／ｍｌのＲＳＶタンパク質である。 インビトロ培養の培地には、リンホカイン、とりわけＩＬ−２および任意にＩ Ｌ−４およびＩＬ−６も含まれるであろう。その量は、免疫および抗体産生細胞 の所望の産生をもたらす量であろう。たとえば、ＩＬ−２の場合、約５〜２００ ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは２５ＩＵ ／ｍｌの量が適している。 この培地にはまた、培養中のヒト脾臓細胞の生存力を維持するのに必要な他の 成分、たとえばアミノ酸や血清も含まれるであろう。実施例では２ｍＭグルタミ ン、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２５ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２ および２０％ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭを含有する培地を用いた。しかし ながら、当業者であれば本明細書中の教示に基づき、日常的な最適化を用いて培 地を変えることができる。 インビトロ免疫段階は免疫を誘発するのに充分な時間行われるであろう。一般 に、細胞をＲＳＶ Ｆタンパク質の存在下、約１〜１０日間、好ましくは約３日 間培養するであろう。しかしながら、これは、たとえば特定の脾臓細胞試料に依 存して変わるであろう。同様に、当業者であれば本明細書中の教示に基づき、ま た公知の方法を用いて、インビトロ免疫段階の適当な時間を決定できる。 インビトロ免疫に用いる抗原は、脾臓細胞がＦタンパク質に対して免疫され、 他の無用な（非表面）抗原に対して免疫されることのないことを確実にするため 、精製したＲＳＶ Ｆタンパク質が好ましいであろう。精製したＲＳＶ Ｆタンパ ク質を得る方法は当該技術分野で知られている。本発明では、とりわけウォルシ ュ（Ｗalsh）らの方法（ウォルシュら、Ｊ.Ｇen.Ｖirol.、７０、２９５３−２ ９６１、１９８９）を利用した。しかしながら、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する 特異性を有するヒトモノクローナル抗体を得るに充分な純度のＲＳＶ Ｆタンパ ク質が得られる限り、特定の方法は重要ではない。別法として、ＲＳＶ Ｆタン パク質は米国特許第５２８８６３０号（１９９４年２月２２日発行）に記載した 組換え法により製造することができる。 インビトロ免疫した後、ついでＲＳＶ Ｆタンパク質を免疫したまたは初回抗 原刺激したナイーブなヒト脾臓細胞を免疫無防備状態にあるドナー、すなわち ＳＣＩＤマウスに導入する。このことは、ＲＳＶ Ｆタンパク質で初回抗原刺激 したヒト脾臓細胞をＳＣＩＤマウスに腹腔内投与することにより行うのが好まし い。投与する該脾臓細胞の数は、一般に約１０⁴〜１０⁸脾臓細胞の範囲であり、 約１０⁷〜１０⁸脾臓細胞が好ましいであろう。かかる細胞の数は、所望の再構成 、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的なヒト抗体の回収可能な濃度を産生す るＳＣＩＤマウスとなるものである。好ましくは、かかる脾臓細胞は投与する前 に約８×１０⁸細胞／ｍｌの濃度にてＨＢＳＳ中に懸濁されるであろう。 脾臓細胞を腹腔内に移した後、ついでＳＣＩＤマウスにＲＳＶ Ｆタンパク質 をブースター投与する。このことは、ヒト抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の所望の 産生が実現されるように脾臓細胞の移行から充分近い時点にて行う。一般に、こ のことは、移行から３〜１４日後、最適には移行後約７日で行う。投与するＲＳ Ｖ Ｆタンパク質の量は、約１〜５０μｇ、好ましくは約１〜１０μｇの範囲で あろう。実施例では５μｇのタンパク質を投与した。しかしながら、投与の量お よび時点は特定のマウス、脾臓試料、およびＲＳＶ Ｆタンパク質の純度に依存 して変わってよい。 抗原のブースター投与は、好ましくはアジュバント、たとえば完全フロイント アジュバント、ミョウバン、サポニンなどの存在下で行い、完全フロイントアジ ュバント（ＣＦＡ）およびミョウバンが好ましいであろう。しかしながら、実質 的に等価または一層高い結果を得るために他の公知のアジュバントを代用するこ とができる。 ブースター投与後、ついでＳＣＩＤマウスをたとえば尾から採血し、そのヒト ＩｇＧ濃度および抗Ｆタンパク質抗体力価を試験する。ついで、最高の抗体力価 および濃度を示す動物を用いてヒトＩｇＧ分泌細胞を回収する。 最高の抗Ｆヒト抗体力価を有するＳＣＩＤマウスは、ヒト抗体分泌細胞の良好 な採取源となる大きな腹部腫瘍を生成することがわかった。好ましくは、これら 腫瘍を滅菌条件下で切り出すことにより回収し、単一細胞の懸濁液を調製し、つ いで細胞を洗浄および培養する。実施例では細胞を２％ウシ胎仔血清を含有する ＩＭＤＭで洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭを入れたＴ−２５フラスコ中、 １０⁶細胞／ｍｌの懸濁中で細胞を培養する。しかしながら、かかる培養条件は 当業者により変えることができる。 ついで、これら細胞を好ましくはＥＢＶを用いて不死化する。ついで、抗Ｆタ ンパク質抗体を分泌する不死化細胞を公知の方法、たとえばＥＬＩＳＡにより同 定する。上記のように、この方法は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合する ２つの別個のヒトモノクローナル抗体、すなわちＲＦ−１およびＲＦ−２が同定 される結果となることを示した。しかしながら、本明細書の教示、とりわけ実施 例に基づき、同様の特性を有するＲＳＶ Ｆタンパク質に対する他のヒトモノク ローナル抗体が不当な実験を行うことなく当業者により得ることができる。たい ていは２つの異なる実験において異なるＳＣＩＤマウスを用いて生成されたとい う事実から、これら２つの抗体は別個のものである。ＲＦ−１およびＲＦ−２を 発現する細胞株は、長期間、すなわち、それぞれ約１８カ月および１６カ月、培 養を維持でき、およそ約３６〜４８時間の倍加時間で分裂した。特定の抗体濃度 は、０.５×１０⁶細胞／ｍｌで播種し３日間増殖させた培養で平均約０.８〜１ μｇ／ｍｌである。 以下に一層詳細に記載するように、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともにＩｇＧ（ ｌ、ｋ）であり、ＥＬＩＳＡにおいてＦタンパク質への半最大結合がそれぞれ０ .６ｎｇ／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌで示され、それぞれ約８.８および８.９の等 電点を示す。 さらに、これら抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高い親和性を示す。詳し くは、ＲＦ−１の場合、ＩＡＳＹＳ機械上でのプラスモン共鳴により決定される ＲＦ−１の解離定数は約１０^-10Ｍである。ＲＦ−２のＫａ定数もまた、ワイズ マン（Ｗiseman）ら（１９８９）およびロバート（Ｒobert）ら（１９８９）に よる滴定微小熱量測定法による決定したとき、同様に高い。 さらに、これら抗体はＲＳＶ感染細胞には有効に結合するが、試験した正常な ヒト細胞、たとえば呼吸器内層（ＨＥｐ−２、喉頭表皮癌腫、ＣＣＬ２３）、肝 臓（ＨｅｐＧ２、ヒト肝臓細胞株、ＨＢ８０６８）、リンパ組織、ＳＢ、ヒトＢ リンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０およびＨＳＢ、Ｔリンパ芽球細胞 株、カタログ番号ＣＣＬ１２０.１、および前立腺（ＬＮＣａＰ.ＦＧＣ、ヒト前 立腺癌株、カタログ番号ＣＲＬ１７４０）には結合しないことが示された。 重要なことに、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともに実質的なインビトロＲＳＶウ イルス中和を示すことが示された。このことは、２つの異なるアッセイ（以下に 一層詳細に記載する）、すなわち、ウイルスを細胞に加える前に精製モノクロー ナル抗体と前以て反応させて行う感染中和アッセイ（抗体がウイルス感染性を抑 制する能力を測定する）およびウイルスの細胞内への侵入後にモノクローナル抗 体がウイルスの増殖および拡張を抑制する能力を測定する融合抑制アッセイにお いて示された。 さらに、以下に一層詳細に記載するように、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともに 、それぞれ約３０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度にて１２の異 なる単離物のウイルス感染を抑制した。それゆえ、ＲＦ−２はＲＦ−１よりも明 らかに優れており、ＲＦ−１に比べて約１.２５〜１０倍低い濃度で５０％ウイ ルス抑制（ＥＤ５０）をもたらす。 対照的に、前以て感染した細胞での融合およびウイルス抗原発現を抑制するに は一層高濃度のモノクローナル抗体が必要であり、ＲＦ−１はＲＦ−２よりも約 ５〜１０倍強力である。さらに、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともにＢ型ＲＳＶ、 Ｂ型ＲＳ６５５６、およびＡ型ＲＳＶ、Ａ型プロトタイプＲＳロング（Ｌong） に対しても有効であった。それゆえ、インビトロでの結果は、本発明のモノクロ ーナル抗体がＡ型およびＢ型の両プロトタイプの異なるＲＳＶ株により引き起こ されたＲＳＶ感染を治療または予防するのに用いることができることを示してい る。上記でも記載したように、ＲＳＶ Ｆタンパク質は異なるＲＳＶ単離物にお いてかなりよく保存されている。それゆえ、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する本発 明のモノクローナル抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質の保存されたエピトープに結合 すると思われる。 上記のように、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれから得られる（調 製法は以下に記載する）可変重鎖および軽鎖配列を含む組換えヒト抗体は、受動 抗体療法によりＲＳＶ感染を治療または予防するための治療剤または予防剤とし て用いられるであろう。とりわけ、これらＤＮＡ可変ドメインをコードするＤＮ Ａ配列は、図２に示すアイデック（ＩＤＥＣ）の特許に係る発現ベクター中に組 み込むことができる。このバージョンは実質的に本願と同じ出願人に係る米国特 許第０８／３７９,０７２号（１９９５年１月２５日出願）（参照のため本明細 書中に引用する）に記載されている。このベクターは、ヒト定常ドメイン、たと えば、ヒトガンマ１、ヒトガンマ４またはガンマ４ＰＥと称するその変異体を含 む（米国特許第０８／３７９,０７２号（参照のため本明細書中に引用する）を 参照）。一般に、このことには治療または予防に有効な量の本発明のヒトモノク ローナル抗体を感受性の患者またはＲＳＶ感染を示す患者に投与することを含む であろう。有効投与量は、好ましくは約５０〜２０,０００μｇ／Ｋｇ、さらに 好ましくは約１００〜５０００μｇ／Ｋｇの範囲であろう。しかしながら、適当 な投与量は、処置する宿主の状態、体重などの因子に依存して変わるであろう。 適当な有効投与量は当業者により決定することができる。 本発明のヒトモノクローナル抗体は、抗体を投与するのに適したあらゆる投与 法により投与することができる。典型的には、本発明の抗体は、注射、たとえば 静脈内、筋肉内もしくは腹腔内注射、またはさらに好ましくはエアロゾルにより 投与されるであろう。上記に記載したように、エアロゾル投与は処置する患者が 新生児である場合に特に好ましい。 薬理学的に許容しうる形態への抗体の製剤化は、公知の薬理学的担体および賦 形剤を用いて公知の方法により行うことができる。適当な担体および賦形剤の例 としては、緩衝食塩水、ウシ血清アルブミンなどが挙げられる。 さらに、本発明の抗体はＲＳＶ感染細胞への高い特異性および親和性を示すこ とから、ＲＳＶ感染の診断のための免疫プローブとしての有用性を有する。この ことは、一般に、ＲＳＶ感染していると思われる患者の試料、たとえば呼吸液（ respiratory fluid）を採取し、該試料を本発明のヒトモノクローナル抗体とと もにインキュベートしてＲＳＶ感染細胞の存在を検出することを含むであろう。 このことには、ヒトモノクローナル抗体−ＲＳＶ免疫複合体を検出するリポー ター分子で本発明のヒト抗体を直接または間接に標識することが含まれるであろ う。公知の標識の例としては、酵素、たとえば、β−ラクタマーゼ、ルシフェラ ーゼなど、および放射性標識が挙げられる。 モノクローナル抗体を用いて抗原の免疫検出を行う方法は当該技術分野でよく 知られている。また、本発明の抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体を診断に有効な量の 適当なリポーター分子と組み合わせてＲＳＶ感染の検出のための試験キットとす ることができる。 材料および方法 以下の材料および方法を実施例１〜６において用いた。Ｆタンパク質調製物および精製 ： Ｆタンパク質の調製は、本質的にウォルシュらの方法［ウォルシュら、Ｊ.Ｇe n.Ｖirol.、７０、２９５３−２９６１（１９８９）］に従って行った。簡単に 説明すると、７０％コンフルエンシーのＨＥｐ−２細胞にＲＳＶのロング株、Ａ 型のｌａｂ適合型を感染させた。Ｔ−１５０培養フラスコ中、５％ウシ胎仔血清 、２ｍＭグルタミンおよび２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＩＭＤＭ中に て４８時間培養した後、１％トリトンＸ−１００および１％デオキシコール酸を 含有するＰＢＳの溶解緩衝液で細胞を溶解した。Ｆタンパク質の精製を、マウス モノクローナル抗Ｆ抗体、Ｂ４（ヒロユキ・ツツミ（Ｈiroyki Ｔsutsumi）から の好意による）（ツツミら、１９８７）を結合させたセファデックスのアフィニ ティーカラム上にて粗製の細胞溶解液から行った。カラムを溶解緩衝液で充分に 洗浄し、精製Ｆタンパク質を０.１％デオキシコール酸を含有するｐＨ２.５の０ .１Ｍグリシン中で溶出した。溶出液を１Ｍトリス、ｐＨ８.５で直ちに中和し、 ＰＢＳに対して透析した。エクストラクティ（Ｅxtracti）−Ｄゲルカラム（ピ アス、ロックフォード、イリノイ、カタログ番号２０３４６）上で界面活性剤を 除去した後、ＥＩＡによりＦタンパク質の濃度を測定し、ガンマ放射線を照射し て溶液を滅菌した。リンパ球細胞調製物 ： 脾臓を、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者の臨床的に適用された脾摘 の後に得た。金属メッシュで篩にかけることにより単一細胞懸濁液を調製し、２ ％ ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭ培地中で洗浄した。塩化アンモニウム溶解緩衝 液で３７℃にて９０秒間処理することにより赤血球を取り除いた。ついで、この 白血球に富む懸濁液を血清含有培地で２回洗浄し、氷冷凍結培地（９５％ＦＣＳ と５％ＤＭＳＯ）中に１０⁸細胞／ｍｌにて再懸濁し、使用するまで液体窒素中 で凍結した。インビトロ免疫（ＩＶＩ） ： ２ｍＭグルタミン、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２５μｇ ／ｍｌのＩＬ−２および１０％ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭ中で培養を行っ た。２.５μｇ／ｍｌのアンホテリシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ ００μｇ／ｍｌのカナマイシン、５μｇ／ｍｌのクロルテトラサイクリン、５０ μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む抗体混 合物を加えた。上記細胞を４０ｎｇ／ｍｌのＦタンパク質とともに３×１０⁶細 胞／ｍｌにて６ウエルクラスター中で培養した。３日後、細胞を回収し、洗浄し 、ＳＣＩＤ再構成のためにＨＢＳＳ中に８×１０⁸細胞／ｍｌにて再懸濁した。ＳＣＩＤマウスの再構成 ： ５〜８週齢の雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスを、ＩＶＩに供した４×１０⁷のヒ ト脾臓細胞を含む２００μｌのＨＢＳＳを腹腔内注射することにより再構成した 。１週間後、ＣＦＡ中の５μｇのＦタンパク質を腹腔内にてブースター投与し、 さらに１５日後に尾から採血した。その血清をヒトＩｇＧ濃度および抗Ｆタンパ ク質抗体力価について試験した。ｈｕ／ＳＣＩＤマウスからのヒト細胞の回収 ： 高い抗Ｆタンパク質抗体力価を有する２匹のｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスは 大きな腹部腫瘍を生じた。屠殺したマウスから滅菌条件下で切り出すことにより 腫瘍を回収し、単一細胞の懸濁液を調製し、これら細胞を２％ウシ胎仔血清を含 むＩＭＤＭで洗浄し、Ｔ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中 で１０⁶細胞／ｍｌにて培養した。ヒトＩｇＧおよび抗Ｆタンパク質抗体の試験 ： ヒトＩｇＧおよび抗Ｆタンパク質抗体の試験をＥＬＩＳＡにより行った。この 目的のため、プレートをそれぞれ０.１Ｍ重炭酸緩衝液、ｐＨ９.５中のＧＡＨ− Ｉｇ（０.０５μｇ／ウエル）かまたはＦタンパク質（０.０５μｇ／ウエル）で 一夜コーティングし、１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳでブロックした。マウ ス血清、培養上澄み液または精製抗体の系列希釈をプレートと反応させた。結合 したヒトＩｇＧは、その後にＧＡＨ−ＩｇＧ−ＨＲＰおよびＯＰＤ基質（シグマ ）を加えることにより明らかにされた。選択した高力価のヒト血清を両アッセイ において陽性の対照として用い、精製ポリクローナルヒトＩｇＧまたは（γ、κ ）ミエローマタンパク質をそれぞれヒトＩｇＧおよびモノクローナル抗体の評価 に際しての標準として用いた。ヒト抗体のイソタイプ決定 ： イソタイプの決定を上記のようにＦタンパク質をコーティングしたプレート上 でＥＬＩＳＡにより行った。結合したヒトＩｇＧを、ヒトγ１、γ２、γ３、γ ４、μ、κおよびλ鎖に特異的なＨＲＰコンジュゲートマウスモノクローナル抗 体をその後に加えることにより明らかにした。陽性の対照は、（γ１、κ）、（ γ２、κ）、（γ３、κ）、（γ４、κ）または（λ、λ）イソタイプおよび遊 離のκ鎖およびλ鎖のミエローマタンパク質を用いて行った。プロテインＡ精製 ： タンパク質の精製をプロテインＡ−セファロース４Ｂカラム上の培養上澄み液 から行った。簡単に説明すると、上澄み液を回収し、０.２ｍｍのフィルターで 濾過し、０.０２％のアジ化ナトリウムを補充した。カラム（ゲル容量約０.５ｍ ｌ）を０.０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で平衡化し、ついで上澄 み液を低速で負荷した。充分に洗浄した後、結合したヒトモノクローナルＩｇＧ を０.１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３.５中で溶出し、セントリコン（Ｃ entricon）１０を濾紙（アミコン）を用いてＰＢＳ−アジドに対して透析し、さ らに使用するまでガンマ放射線を照射することにより滅菌した。カラムをクエン 酸、ｐＨ２.５で再生し、その後の使用のために０.０２％アジ化ナトリウムを含 むＰＢＳで再平衡した。等電点電気泳動 ： ヒト抗体の等電点電気泳動（ＩＥＦ）をポリアクリルアミド前形成ゲル（ファ ルマシア、ウプサラ、スウェーデン、カタログ番号８０−１１２４−８０）中、 ｐＨ３〜ｐＨ１０で行った。簡単に説明すると、２０μｌの試料を負荷し、１５ ００ボルトで９０分間行った。ｐｉ５.８〜１０.２５の標準をｐｉ標準のために 用いた。ゲルをクマシーブルー染色により染色し、２５％メタノール、６８％水 および８％酢酸を含有する脱染色緩衝液中で脱染色した。ウエスタンブロッティング ： 天然および沸騰により変性させた両Ｆタンパク質を１０％ポリアクリルアミド ゲル中で移動させた。ゲルを３０ボルトで２時間および６０ボルトで一夜、ニト ロセルロースシート上にブロッティングした。移動後、ニトロセルロースをＰＢ Ｓ中の１％ＢＳＡおよび０.１％トゥイーン２０で室温にて１時間ブロックした 。種々のストリップをＰＢＳ中で洗浄し、一次抗体、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ抗 Ｆタンパク質血清、またはｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ抗破傷風毒素陰性対照、また はマウス抗Ｆタンパク質陽性対照を１時間かけて加えた。血清はすべて１：５０ ０に希釈した。ＰＢＳで充分に洗浄した後、二次抗体、試料および陰性対照には ＧＡＨＩｇＧ−ＨＲＰ、または陽性対照にはＧＡＭ ＩｇＧを１時間かけて加え た。ブロットを４−クロロ−１−ナフトールで明示させた。免疫蛍光 ： ＲＳＶ感染したＨＥｐ−２細胞（４×１０⁴）を氷冷アセトンを用いてガラス スライド上に固定し、２０μｌの血清（１：１０に希釈）または精製ＭＡｂ（２ μｇ／ｍｌ）を３７℃にて１時間反応させた。スライドを洗浄し、結合した抗体 をＧＡＨＩｇＧ−ＦＩＴＣで３７℃にて３０分間明示させ、蛍光顕微鏡下で観察 した。ＦＡＣＳｃａｎ分析 ： ＲＳＶ感染したＨＥｐ−２細胞（１０⁶細胞／試料）を洗浄緩衝液（アジ化ナ トリウム０.１％を含有するＰＢＳ）で洗浄した。細胞ペレットを、２μｇ／ｍ ｌのＲＦ−１またはＲＦ−２を含有する５０μｌのインキュベーション緩衝液（ ＢＳＡ ０.１％を補充したアジ化ナトリウム０.１％含有ＰＢＳ）中に再懸濁 した。氷上で１５分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＧＡＨ ＩｇＧ− ＦＩＴＣを含有するインキュベーション緩衝液中に氷上にてさらに１５分間再懸 濁した。３回洗浄した後、細胞を１％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（１ｍ ｌ）中に固定し、ベクトン−ディッキンソンＦＡＣＳｃａｎ装置で分析した。親和性の決定 ： 可溶性のＦタンパク質に対するヒトＭＡｂの親和性を決定するために２つの方 法を用いた： プラスモン共鳴では、ＩＡＳＹＳ機械を用い、抗体を装置の湿潤側に共有結合 させ、これから該装置の乾燥側に照射した光の屈折の変化に基づいて質量の変化 を決定することができる。種々の濃度のＦタンパク質を加え、ついでＰＢＳの定 常流で溶出させた。該抗体からのＦタンパク質の遊離の結果としての質量の変化 を測定し、それから動力学Ｋ_offを決定した。Ｋａの計算は、種々の初期飽和レ ベルからの遊離速度を試験することにより行った。 別法として、親和定数の決定をワイズマンらおよびロバートらによる微小熱量 測定法により以下のようにして行った：ＲＦ−２とＦタンパク質とを既知濃度で 熱チャンバ中、４２℃にて同時にインキュベートし、溶液中の免疫複合体の生成 に伴うエンタルピー変化を測定した。この反応を５０℃で繰り返した。結合解離 定数Ｋをロバートらに従って温度およびエンタルピー変化の関数として下記式に て計算した： 式中、ＫｏｂｓおよびΔＨ^obsは、所定の絶対温度（Ｔｏｂｓ）で実験的に観察 された結合平衡定数およびエンタルピー変化であり、Ｒは普遍的な気体定数（１ .９８７）であり、ΔＣは実験的に決定された結合熱容量変化である。補体促進（Ｃomplement-enhanced）ウイルス中和アッセイ ： ２つの実験室株（ロング、Ａ型、および１８５３７、Ｂ型）および１０の野生 型ＲＳウイルス単離物（入院中の幼児から単離したもの）を用い、抗Ｆタンパク 質ヒトＭＡｂの中和能を評価した。系列希釈したヒトＭＡｂを、補体の存在下、 １００μｌ ＩＭＤＭ／マイクロタイタープレートウエル中、室温にて３０分間 、ウイルス（５０〜１００ｐｆｕ）とともにプレインキュベートした。ＨＥｐ− ２細胞（５×１０⁴／ウエル）を１００μｌ ＭＥＭ中にて加え、３７℃、５％Ｃ Ｏ₂にて３日間インキュベートした。プレートを洗浄し、アセトンで固定し、空 気乾燥し、ＲＳＶ抗原をマウスＭＡｂを用いたＥＬＩＳＡにより検出した。中和 の終 点を、抗体を加えない対照のウエルに比べて抗原産生を５０％減少させる希釈と して任意に決定した。ウイルス融合抑制アッセイ ： 融合抑制力価の決定を、１００ＴＣＩＤ₅₀のＲＳＶロング（プロトタイプＡウ イルス）またはＲＳ６５５６（Ｂ型臨床単離物）をＶＥＲＯ細胞（５×１０⁴／ ウエル）とともにマイクロタイタープレート中、３７℃、５％ＣＯ₂にて４時間 プレインキュベートすることにより行った。種々の濃度のヒトモノクローナル抗 体または対照を各ウエルに加え、各４の培養液を３７℃、５％ＣＯ₂にて６日間 インキュベートした。対照の培養液はウイルス非感染細胞（陰性）かまたは抗体 の不在下の感染細胞（陽性）を含んでいた。ウイルス増殖の検出を、ウサギポリ クローナル抗Ｆタンパク質抗血清およびＨＲＰ−標識抗ウサギＩｇＧを用いたＥ ＬＩＳＡにより行った。反応液をＴＭＢlue基質（ＫＰＩ、ゲイサーズバーグ、 メリーランド）で発色させた。力価（ＥＤ５０）は、ＭＡｂの用量応答の回帰分 析に基づき、ウイルス増殖を５０％抑制する抗体濃度として定義した。 実施例１ ＨＵ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ力価 ： １５匹のＳＣＩＤマウスに、ＩＴＰ状態の単一のドナーからのヒト脾臓細胞を 投与した。これら細胞は、ＩＬ−２および種々の濃度の可溶性Ｆタンパク質の存 在下で３日間、前以て培養した。すべての動物は首尾よく再構成し、Ｆタンパク 質をブースター投与した後に全ヒトＩｇＧ濃度は血清中で１２μｇ／ｍｌ〜１０ ｍｇ／ｍｌ、抗Ｆタンパク質力価は３×１０²〜１０⁶で様々であった（表Ｉ）。 インビトロでのＦタンパク質の暴露とインビボでの抗Ｆタンパク質力価との間に 何ら相関関係は観察されなかった。ウマフェリチン抗原系での本発明の方法にお いて、その後のインビボでの特異的な抗体力価を確実にするために脾臓細胞のイ ンビトロ培養の際に抗原暴露が必要であることが以前に観察された。これら２つ の系での不一致は、関与する抗原の違いによるのかもしれない。なぜなら、ヒト は生まれつきウマフェリチンには暴露されておらず、ＩＶＩ段階は脾臓細胞の初 回抗原刺激を含み、インビトロで一次応答を誘発するのに対して、一方、実質的 にすべてのヒトは生まれてから早い時期に天然感染によりＲＳＶに免疫になって おり、これがＦタンパク質に対する永久的な記憶となり、それゆえインビトロで ＩＬ−２単独で刺激した後にインビボでブースター投与しても二次応答を誘発す るに充分であるからである。 抗血清は、等電点電気泳動から判断されるように（データは示していない）ポ リクローナルであった。抗血清をＦタンパク質への反応性についてウエスタンブ ロッティングにより試験した。本発明者らの結果は、ポリクローナルヒトＡｂが 可溶性の天然のＦタンパク質をその二量体の形態（１４０ＫＤ）でも単量体の形 態（７０ＫＤ）でも認識することを示した。抗血清はまた変性したＦタンパク質 とも強く反応し、４８ＫＤと２３ＫＤとの２つのサブユニットに特異的に結合し た（代表的データを図１に示す）。このことは、Ｆタンパク質に対する体液性の 応答の少なくとも一部は該分子の直線状で非立体的なエピトープに対して向けら れたものであることを示唆している。免疫蛍光試験はさらに、ｈｕ−ＳＰＬ−Ｓ ＣＩＤ血清の特異性を示していた。なぜなら、天然のＳＣＩＤマウス血清ではな く免疫血清がＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞と強く反応したからである（図２）。陰 性対照として用いた非感染ＨＥｐ−２細胞に対しては反応性は観察されなかった 。それゆえ、可溶性のＦタンパク質が、天然に感染した細胞上に発現される膜ウ イルス抗原に特異的な抗体を産生するのに適した抗原であると結論された。 実施例２ 腫瘍細胞培養における抗体の同定 ： 高い抗Ｆタンパク質力価を有するすべてのマウスを屠殺し、腹膜灌流および脾 臓からヒト細胞を回収した。２匹のマウス（ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ＃６および ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ＃１５）が腹部に固形の腫瘍を自然に生じ、これを回収 し、単一細胞の懸濁液にして試験した。これら腫瘍細胞は、ＥＬＩＳＡにより決 定されるように特異的な抗Ｆタンパク質抗体を分泌した。これら腫瘍および抗体 をＲＦ−１（ＲＳＶ Ｆタンパク質）およびＲＦ−２と称する。ＲＦ−１および ＲＦ−２は、約２カ月離れて行った２つの実験において生成され、個々のｈｕ− ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスから単離されたので別個の抗体である。これら抗体は、 培養においてそれぞれ１８カ月および１６カ月以上確立され、約３６〜４８時間 の倍加時間で分裂した。特定の抗体濃度は、０.５×１０⁶細胞／ｍｌにて播種し て３日間増殖させた培養においては典型的に０.５〜１μｇ／ｍｌであった。 さらに特徴付けるため、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニテ ィークロマトグラフィーにより両ヒトＭＡｂを培養上澄み液から精製した。ＲＦ −１およびＲＦ−２の両抗体は、ＥＬＩＳＡにおいてＦタンパク質に対する半最 大結合をそれぞれ０.６ｎｇ／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌにて示すＩｇＧ（_l.k）で ある（図３）。ＩＥＦにおける移動パターンからＲＦ−１およびＲＦ−２の等電 点はそれぞれ８.８および８.９と決定された（図４）。ＲＦ−１およびＲＦ−２ はフローサイトメトリーにおいてＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞を特異的に認識した （図５）。ＲＦ−１の解離定数Ｋｄは、ＩＡＳＹＳ機械上でのプラスモン共鳴に より１０^-10Ｍ範囲であると決定された。ＲＦ−２のＫｄ定数は、ワイズマンら （１９８９）およびロバートら（１９８９）による滴定微小熱量測定により２× １０^-9Ｍと決定された。 実施例３ 抗Ｆタンパク質の組織特異性 ： ＡＴＣＣで入手可能な一連のヒト細胞株に対する反応性について、精製した抗 体をフローサイトメトリーにより測定する間接免疫蛍光アッセイによりスクリー ニングした（表II）。その結果は、これら抗体が呼吸器内層（ＨＥｐ−２、喉頭 表皮癌腫、ＣＣＬ２３）、肝臓（ＨｅｐＧ２、ヒト肝臓細胞株、ＨＢ８０６５） 、リンパ組織（ＳＢ、ヒトＢリンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０およ びＨＳＢ、Ｔリンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０.１）および前立腺 （ＬＮＣａＰ.ＦＧＣ、ヒト前立腺癌株、カタログ番号ＣＲＬ１７４０）などの 細胞株には結合しないことを示した。 実施例４ インビトロ機能的活性 ： これら抗体がインビトロでウイルス中和作用を有するかどうかを決定するため 、これら抗体を２つのタイプの機能的アッセイに供した。感染中和アッセイは、 ウ イルスを細胞に加える前に精製モノクローナル抗体と前以て反応させることによ って行い、それゆえＭＡｂがウイルス感染性を抑制する能力を反映する。融合抑 制は、ウイルスの細胞内への侵入後にＡｂがウイルスの増殖および拡張を抑制す る能力を反映する。両アッセイの結果は、ＥＩＡにおけるウイルス抗原滴定によ り決定されるように、所定のインキュベーション時間後に放出される培養液中の ウイルスの量として測定した。 両Ａｂは、試験した１２の単離物のすべてについて、ＲＦ−１およびＲＦ−２ それぞれ３０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌおよび８ｎｇ／ｍｌ〜１６５ｎｇ ／ｍｌの範囲の濃度にてウイルス感染を抑制することができた。ＲＦ−２はＲＦ −１よりもつねに優れており、ＲＦ−１に比べて１.２５〜１０倍低い濃度で５ ０％ウイルス抑制（ＥＤ５０）をもたらした。代表的なデータを表IIIに示す。 予想されるように、前以て感染した細胞での融合およびウイルス抗原発現を抑 制するには一層高濃度のＭＡｂが必要であった。このアッセイにおいてＲＦ−１ はＲＦ−２よりも５〜１０倍強力であった。両ＭＡｂは、Ａ型プロトタイプＲＳ ロングよりもＢ型プロトタイプＲＳ６５５６に対して一層有効であった。 表Ｉ：単一のドナーからの脾臓細胞をＦタンパク質とともにまたはＦタンパク質 なしでＩＬ−２の存在下で３日間培養した。ＳＣＩＤマウスを４×１０⁷細胞で 再構成し、ＣＦＡ中の１０μｇのＦタンパク質をブースター投与した。マウス＃ １、２、３、４および５では新鮮な同種細胞（２０×１０⁶）をブースターとと もに注射した。ヒトＩｇＧ濃度はポリクローナルＩｇＧの標準曲線との比較によ り決定し、抗Ｆタンパク質力価はＥＩＡにおける終点希釈により決定した。 表II：ＲＦ−２と種々の細胞株との反応性。種々の細胞株をＲＦ−２、２００ｎ ｇ／１０⁶細胞との間接免疫蛍光標識に供した。Ｆａｂヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩ ＴＣを第二段階に用いた。（−）はＲＦ−２の存在が平均蛍光のチャネルの変化 とならないことを示す。（＋）は平均標識の０.５ｌｏｇの増加を示す。 表III：ＥＤ₅₀は、モノクローナル抗体用量−応答の回帰分析に基づいてウイル ス増殖を５０％抑制する抗体の濃度として定義される。 実施例５（比較例） Ｆタンパク質に対するＩｇＧ想起応答のインビトロでの誘発 ： 人口の９５％以上が年齢の２歳以上にわたってＲＳＶに暴露されており、ＲＳ Ｖに首尾よく応答している［ヘンダーソン（Ｈenderson）ら、Ｊ.Ｍed.（１９７ ９）、３００、５３０−５３４］。それゆえ、脾臓細胞をインビトロにてＲＳＶ Ｆタンパク質で攻撃すると想起応答となるに違いなく、実際、主にＩｇＧの応 答がインビトロにて脾臓細胞で誘発された（図５）。最適抗原濃度である４０ｎ ｇ／ｍｌは、一次応答を誘発する抗原で観察されるもの、すなわちフェリチン、 Ｉｌｉｇ／ｍｌ［ベーナー（Ｂoener）ら、Ｊ.Ｉmmunol.、１９９１、１４７、 ８６−９５；ブラムス（Ｂrams）ら、Ｈum.Ａntibod.Ｈybridomas、１９９３、 ４、４７−５６］に比べて少なくとも１次数低い大きさであった。それゆえ、Ｆ タンパク質でインビトロにて初回抗原刺激すると二次様の応答が誘発されると考 えなければならない。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して有意のインビトロ応答を誘 発する幾つかの試みは、ＰＢＭＣおよび扁桃由来細胞で失敗に終わっている。 インビトロで初回抗原刺激した脾臓細胞からモノクローナル抗体を生成する限 られた努力からＲＳＶ Ｆタンパク質に対する幾つかのモノクローナルＩｇＧと して得られている。しかしながら、これらの殆どは幾つかの対照抗原の一つとＥ ＬＩＳＡにおいて交差反応した（結果は示していない）。 実施例６ ＲＦ−２をコードする遺伝子のクローニング： ＲＦ−１およびＲＦ−２クローンはいずれも有意な量の抗体を産生しない。ま た、これら細胞系はいずれも２０％ＦＣＳを含有する培地中で最もよく増殖した が、これは、精製抗体にウシＩｇＧが夾雑するので不都合である。したがって、 意味のある動物モデル試験を行うのに必要な量の抗体（これには、通常選択した 抗体につき１ｇが必要である）を製造および精製するのを可能にするには、ＲＦ −１およびＲＦ−２をコードする遺伝子を生産ベクターおよび細胞系に組み込む ことが好都合である。本願譲受人であるIDEC Pharmaceuticals，Inc.,はＣＨＯ 細胞中でヒトモノクローナル抗体を産生する非常に効率的な真核性生産系を開発 した。このベクター系は共願の米国特許第08/379,072号（1995年１月25日出願） 、および共願の米国特許第08/149,099号（1993年11月３日出願）に記載されてい る（この内容は本明細書の一部を構成する）。この系を常套的に使用することに より、抗体遺伝子をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞は、スピナー培養中で 無血清培地１Ｌにつき抗体約２００ｍｇを、またメトトレキセート中で増幅後に 発酵器中で５００ｍｇ／Ｌ以上を産生する。 約５ｘ１０⁶個のＲＦ−２細胞をクローンした細胞培養から（下記参照） ｍＲＮＡ単離キット、Fast Tract（In VitroGen，San Diego，California）を用 いてＲＮＡを抽出し、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴ−ｄＴプライマーおよび逆転写酵 素を用いて製造した。ｃＤＮＡの部分標本を出発物質に用い、可変領域遺伝子の ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行った。ＰＣＲは２組のプライマー を用いて行った（表ＩＶ参照）。 *表ＩＶの解説：ヒト免疫グロブリン重および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅に使用 した合成オリゴヌクレオチドプライマー。クローニング用の制限部位に太字下線 を付している。 第１組のプライマーは、重鎖可変領域を増幅するために設計された。この組は 、Ｊ領域に結合する１つの３プライマーと、後期リーダーおよびフレームワーク １領域に結合する５つのファミリー特異的５’プライマーからなる。第２組のプ ライマーはKapp可変領域を増幅させるために設計された。この組は、後期リーダ ーおよびフレームワーク１領域に結合する４つの５’プライマーおよび１つの３ ’ プライマーからなる。ＰＣＲ反応物をアガロースゲルで電気泳動し、正しいサイ ズの３５０塩基対のバンドを切り取った。ＤＮＡを電気溶出し、適切な制限酵素 で切断し、ＩＤＥＣのＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクター中にクローンした（図６参照 ）。ヒト抗体を発現させるのに用いたＮＥＯＳＰＬＡベクターには以下のものが 含まれる：ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター、ＢＥＴＡ＝マウスβグ ロビン主要プロモーター、ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、 ＳＶＯ＝ＳＶ４０複製起点。Ｎ１＝ネオマイシンホスホアムスフェラーゼエクソ ン１、Ｎ２＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン２。ＬＩＧＨＴ＝ ヒト免疫グロブリンκ鎖定常領域。Ｈｅａｖｙ＝ヒト免疫グロブリンγ１または γ４ＰＥ定常領域。Ｌ＝リーダー。ＳＶ＝ＳＶ４０ポリアデニル化領域。 ＩＤＥＣのＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクターは、免疫グロブリン遺伝子の大規模生 産用に設計された（Reffら、Blood,(1994)，83，435-445参照、この内容は本明 細書の一部を構成する）。これらベクターを用いて、マウス／ヒトキメラ、霊長 類動物／ヒトキメラおよびヒト抗体を高レベルで発現させることに成功した。Ｎ ＥＯＳＰＬＡは、プラスミドベクターＤＮＡが安定的に組み込まれたＣＨＯ細胞 を選択するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。さらに 、ＮＥＯＳＰＬＡは、メトトレキセート中で増幅させるためのジヒドロホーレー ト還元酵素遺伝子、ヒト定常軽鎖（κまたはγ）およびヒト定常重鎖領域（γ１ またはγ４（ＰＥ））を含む。γ４（ＰＥ）は、２つの突然変異（残るＦｃＲの 結合を排除するために導入されたＣＨ２領域中のグルタミン酸、および重鎖ジス ルフィド結合の相互作用の安定性を増すための、ヒンジ領域中のプロリン置換） を含むヒトγ４定常領域である（Algreら、J．Immunol.，148，3461-3468,(1992 );Angalら、Mol．Immunol.，30，105-108(1993)、これらの内容は本明細書の一 部を構成する）。所望の軽鎖可変領域の挿入を促進するため、ベクター中に独特 な制限部位が組み込まれた(Reffら、Blood,(1994),83,435-445)。 ＲＦ−２の軽鎖は、デュプリケートでＮＥＯＳＰＬＡ中にクローンされ、Sang erらの方法にしたがって配列決定された（Sangerら、Proc．Natl． Acad．Sci.( 1997),74，5463-5467）。κ鎖はκ２サブグループのメンバーである。同様に、 ＲＦ− ２のヒト重鎖可変領域が単離され、ヒトγ１定常ドメインの前方にクローンされ た。 共通のＴａｃ逆転写酵素を用いることによりＲＦ−１およびＲＦ−２の軽鎖を コードする遺伝子は容易にクローンされたが、重鎖をコードする遺伝子のｃＤＮ Ａを得ることはできなかった。しかし、この問題は、高温（７０℃）に耐える逆 転写酵素に置き換えることにより未然に防がれた。これにより、Ｖ_H２ファミリ ーの遺伝子から最初に誘導されたプライマーを用いて完全なＰＣＲ生成物を得る ことができた。 ＲＦ−１軽および重可変ドメインのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ図 ７ａおよび７ｂに示す。ＲＦ−２軽および重可変ドメインのアミノ酸配列および 核酸配列をそれぞれ図８ａおよび８ｂに示す。図９ａ−９ｃは、標記ＮＥＯＳＰ ＬＡベクター中に発現したＲＦ−１の核酸およびアミノ酸配列を示す。図９ａお よび９ｂは、リーダー、可変軽および重、ならびにヒト定常ドメイン配列、すな わちヒトκドメインおよびヒトγ／定常ドメインを示す。図９ｃは、ヒトγ／定 常ドメインのアミノ酸および核酸配列を示す。図１０には、ＣＨＯ細胞中で図９ ａ−９ｃに示す配列を発現させることにより組換えＲＦ−１を得るための発現ベ クターを図解している。 同様に、図１１ａ−１１ａは、リーダー配列、ＲＦ−１可変軽、ヒトκ定常領 域、ＲＦ−２可変重、およびヒトγ／定常ドメインを示す。図１２は、ＣＨＯ細 胞中で組換えＲＦ−２を発現させるための発現ベクターを図解している。 実施例７ ＥＢＶ形質転換細胞をクローニングするためのプロトコールの開発： ＥＢＶ形質転換細胞からの抗体産生は連続的に低下し、最終的に停止する(Koz borら、J．Immunol．(1981)，127，1275-1280)。したがって、抗体産生を停止さ せずに続けさせる(immortalize)には、停止する前に細胞から免疫グロブリンを コードする遺伝子を抽出し、適切な発現系に組み込むことが不可欠である。 しかし、ＥＢＶ形質転換細胞は限界希釈や半固形寒天でクローンすることが非 常に難しい。我々の２つの抗−Ｆタンパク質抗体、ＲＦ−１およびＲＦ−２のプ ロテインＡ精製調製物の等電点フォーカシングゲル電気泳動により、ＲＦ−２調 製物に抗体の少なくとも２つのポピュレーションと、ＲＦ−１調製物中にオリゴ クローナリティ(oligoclonality)の可能性が示された。 マウスサイオーマ（thyoma）系ＥＬ−４ Ｂ５（Zhangら、J．Immunol．(1990) ,144,2955-2960）をフィーダー層として用いることにより、限界希釈による１個 の細胞から細胞を増殖させた(expand)。ヒトサイオーマ細胞系ＥＬ−４ Ｂ５は 、Ｂ細胞への成長を誘導するように膜レセプター中にｇｐ３９を発現する。ＥＬ −４ Ｂ５細胞を、１μＬプレートに５ｘ１０⁴個／ウェル接種し、該培養由来の 細胞を種々の濃度（０．３８個／ウェルおよびそれ以上）でＥＬ−４ Ｂ５層上 に接種した。適当な時間後に、接種濃度ごとに増殖がみられたウェル数を算定し た。 上清中にヒトＩｇＧおよび抗原特異的ＩｇＧが存在するかを試験した。このプ ロトコールを用いて、元のオリゴクローナル調製物からそれぞれＲＦ−１（表Ｖ 参照）およびＲＦ−２(表VI参照)を産生する細胞を単離およびクローンした。ク ローニング中に認められた非特異抗体についてはアイソタイプのみを分析し、特 異抗体のＩｇＧ１ｋと同じであることがわかった。特異抗体は、ＲＦ−１培養中 の種々の時点で作成した凍結物由来のＦ−タンパク質特異的クローンの収量およ び産生されたＩｇＧ量に基づいて、培養開始直後に総抗体量の約１／２０が生じ 、約８カ月培養後に消失すると見積もられた。ＲＦ−２は、あらゆる示した時間 で総ＩｇＧのかなりの大きな部分（約１０％も）を産生した。オリゴクローナル 調整物からの抗体を用いてＥＤ５０価の過大評価をもたらすin vitro中和データ を得た。しかし、我々のプラスモン(plasmon)共鳴を用いるアフィニティ試験で は純粋な抗体の使用を要しなかった。滴定微小熱量測定法(titration micro cal orimetry)を用いる該アフィニティ試験はクローン化物質を用いて実施された。 *表Ｖの説明：限界希釈によるＲＦ−１のクローニング。ＥＬ４−Ｂ５細胞を平 底９６ウェルプレートに５ｘ１０⁴個／ウェルで接種した。約２４時間後、対数 増殖期のＲＦ−１細胞を、示した濃度でフィーダー層上に接種した。２〜３週間 後、増殖および抗−Ｆ活性でウェルをスコアづけした。 ＊表XIVの説明：限界希釈によるＲＦ−２のクローニング。表VIIIに示すとおり 行った。 in vitro中和活性による２つのヒトモノクローナル抗体の臨床応用性を確認す るため、２つの異なる動物モデルにおいて、これら抗体のＳＲＶ感染を除去する 効果によりさらにこれらの抗体を特徴づけた。これらの前臨床成績評価は、適切 な発現ベクター中に挿入された該抗体をコードするクローン化遺伝子でトランス フェクトされたＣＨＯ細胞によって産生された物質を用いて行われる（図６参照 ）。２つの抗体モデル（１つは完全な相補およびＦｃレセプター結合ドメイン、 を含み（γ１）、もう１つはこれらのドメインを欠く(γ)）（ＰＥ突然変異体） （Alegreら、J．Immunol.，(1992),148，3461-3468; Angalら、Molecular Immunology，(1993)，30，105-108)が試験されるであろう。γ４変種の試験原理 は、２つの考えに基づいている：(i)抗−Ｆタンパク質Ｆａｂはin vitro(Barbas ら、Proc．Natl．Acad．Sci．(1992)，89，10164-10168)およびin vivo（Crowe ら、Proc．Natl．Acad．Sci.(1994),91,1386-1390、肺内に直接投与したにも関 わらず）で有意なウイルス中和効果を示していること、ならびに(ii)ウイルス感 染によってすでにストレスを受けている感受性組織においてエフェクター機能の 活性化をもたらす肺損傷を避けることは有利であろうこと。コントロールの非特 異抗体、１つはγ１で１つはγ４（ＰＥ）は、１つの集団内部の非特異ハイブリ ドーマＩｇＧ₁抗体から生じるであろう。 最初の動物モデルはマウスモデルである（Taylorら、J．Immunology(1984),52 ,137-142; Walsh,E.E.，J．Infectious Diseases(1994),170,345-350）。このモ デルは、１週間インキュベーション後の肺組織中の感染(load)ウイルスが２ｌｏ ｇ減少する最小用量で規定される有効用量を測定するのに使用する。このモデル は、どの抗体モデルを用いて進めるかを決めるのに用いられる。第２の動物モデ ルはアフリカミドリザルを用いる霊長類動物モデルである(Kakukら、J．Infecti ous Diseases(1993)，167，553-561)。ＲＳＶはアフリカミドリザルに肺損傷を 引き起こすが、このモデルの主目的は、抗体の、その損傷を抑制する特性を評価 することである。このモデルを用いる試験の数は１抗体を異なる５用量で試験す るものに限られよう。抗体、用量および感染日に対する注入日は、マウスモデル における知見に基づいて決定されよう。肺切片では、プラークアッセイを行った ウイルスについて、ＲＳＶによって生じた病変を検出するための光学顕微鏡検査 を行った。 ２種類の抗体を産生する細胞を刺激し、増殖させる過程で生じたあらゆるアミ ノ酸配列の変化が観察されよう。これは、ＲＦ−１およびＲＦ−２の重鎖のＣＤ Ｒ３領域に基づくＰＣＲプライマーのセットを用い、ＲＦ−１およびＲＦ−２を コードする遺伝子配列が２つの細胞系が生じた元の凍結細胞物質中に存在してい るかを試験することにより行われる。陽性コントロールはＲＦ−１およびＲＦ− ２が加わった(spiked)供給源細胞である。該分析はLevyら、1989、Levyら、J．E xp． Med.(1989),169:2007およびAlegreら、J．Immunol.(1992),148,3461-3468; Anga lら、Molecular Immunology(1993),30,105-108; Footeら、Nature(1991),352,53 0-532; Radaら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1991),88,5508-5512; Kocksら、Rev.Immu nol．(1989)，7,537-559; Wysockiら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1986),83,1847-185 1; Kippsら、J.Exp.Med.(1990),171,189-196; Uekiら、Exp.Med.(1990),171,19- 34によって確立された原理に従う。 実施例８ 大量（＞１００ｍｇ／Ｌ）のＲＦ−１およびＲＦ−２を生じるＣＨＯ細胞系の 作製： ａ．発現プラスミドのトランスフェクション、最高レベルのＲＦ−１およびＲ Ｆ−２を発現するＧ４１８耐性ＣＨＯクローンの単離および増殖。 ＲＦ−１およびＲＦ−２可変領域遺伝子をＮＥＯＳＰＬＡ中にクローンしたら 、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＧ４４）(Urlaubら、J.Somat ．Cell Mol.Genet.,(1986),16,,555)をプラスミドＤＮＡで形質転換する。ＣＨ Ｏ細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含ＳＳＦＭ Ｈ（ＧＩＢＣＯ）中で増 殖させる。ＢＴＸ ６００エレクトロポーレーション装置（ＢＴＸ、San Diego,C A）を用い、細胞４ｘ１０⁶個を０．４ｍＬディスポーザブルキュベット中でプラ スミドＤＮＡ２５μｇを用いてエレクトロポーレーションした。エレクトロポー レーション前に、哺乳動物細胞中で発現した遺伝子を細菌中で増殖させるために 使用したプラスミドの部分から分離するため、プラスミドＤＮＡをＰａｃＩで制 限する。エレクトロポーレーションの条件は、２３０Ｖ、４００マイクロファラ デー、１３ ｏｈｍｓである。エレクトロポーレーションしたものをそれぞれ９ ６ウェルプレート（約４０，０００細胞／ウェル）に接種した。プレートに、エ レクトロポーレーション後３日間およびその後定期的にコロニーが生じるまで、 ４００μg/mLのＧ４１８を含有する培地（Genetin,GIBCO）を加える。コロニー から得られる上清においてヒトＩｇＧの存在と抗−Ｆタンパク質活性をＥＬＩＳ Ａでアッセイする。 ｂ．メトトレキセート中での抗体発現の増幅 次に、最高量の免疫グロブリンを産生するＧ４１８耐性コロニーを大容器に移 し、増殖させる。最高量を分泌するＧ４１８クローンの発現は、９６ウェルプレ ート中、５ｎＭメトトレキセート（ＭＩＸ）中で選択することによる遺伝子増幅 により増加する。次に、最高量の抗体を産生する５ｎＭコロニーを増殖させ、次 いで９６ウェルプレート中で、再度５０ｎＭ ＭＩＸ中で選択することにより発 現を増幅させる。このプロトコールにより、我々は以前に７日間のスピナー培養 中で２００ｍｇ／Ｌ以上（発酵器中、６日間で０．５ｇ／Ｌ以上）を分泌するＣ ＨＯ細胞を誘導することができた。次に、ヒト抗体をプロテインＡアフィニティ クロマトグラフィーを用いて上清から精製する。 ｃ．抗体の産生と精製 各抗体１００ｍｇを得る。マウスモデル試験で決定した量の分泌抗体を産生す る。５０nMメトトレキセート含有ＣＨＯ−Ｓ ＳＦＭ II無血清培地(GIBCO Cat.N o.91-0456DK)中で選択したＣＨＯトランスフェクトーマ(transfectoma)を含むス ピナーフラスコを用い、必要量の抗体を生産する。上清を回収し、フィルターの セット（最終０．２nmフィルター）で濾過して特定の物質を除去する。上清を、 抗体の全量に基づいて予め決定したサイズのプロテインＡカラムにかける。洗浄 後、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を用いてカラムから中性緩衝液の １Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に溶出する。溶出／中性緩衝液を、Amicon CentriprepまたはCentricon30(Cat.no.4306および4209)を用いる限外濾過によ り１０００回以上滅菌ＰＢＳと交換する。抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整し、０ ．２ｎｍフィルターで濾過して滅菌する。抗体を精製し、動物に使用するまで２ ｍＬクライオチューブ中で氷冷貯蔵する。 実施例９ ＲＳＶ動物モデルでのパフォーマンスに関するＲＦ−１とＲＦ−２の特性 ＲＦ−１およびＲＦ−２のパフォーマンスを適当な動物モデルを使用して判定 する。この評価法は２段階に分かれ、第一は（ａ）抗体の力価を測定し、ならび にその抗体がウイルス感染を排除するために必須な支持（効果器）機能の型を決 定をするためのＢalb／cモデル［Ｔaylorほか、Ｊ．Ｉmmunology（１９８４年） 、５２巻：１３７〜１４２頁；Ｃroweほか、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．（１ ９９４年）、９１巻：１３９６〜１３９０頁；Ｃonnorsほか、Ｊ．Ｖirology（ １９９２年）、６６巻：７４４４〜７４５１頁］。マウスモデルで得たデータか ら霊長類モデルにおいてさらに研究するために候補１種を選択する。霊長類モデ ルはアフリカミドリザルモデルである［Ｋakukほか、Ｊ．Ｉnfectious・Ｄiseas es（１９９３年）、１６７巻：５５３〜５６１頁］。対象モノクローナル抗体が 肺障害に関連するウイルスの予防に使用できることを確認するためには霊長類モ デルは特に適当である。 ａ．マウスモデルにおけるテストパフォーマンス われわれが選択するゲッ歯類モデルはＢａｌｂ／ｃマウスである。このモデル は受動的療法の研究についてはよく研究されている［Ｃroweほか、Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．（１９９４年）、９１巻：１３８６〜１３９０頁；Ｃonnorsほ か、Ｊ．Ｖirology（１９９２年）、６６巻：７４４４〜７４５１頁］。Ｂalb／ cマウスは上部気道および下部気道におけるＲＳＶ増殖には全段階で高度に寛容 である［Ｔaylorほか、Ｊ．Immunology（１９８４年），５２巻：１３７〜１４ ２頁］。動物を５の群に分け、標準的マウスチャウおよび水を自由摂取させ、ロ チェスターゼネラル病院動物施設指針に沿って飼育する。これらの指針はニュー ヨーク州保健局、連邦動物福祉法およびＤＨＨＳ法令に適合している。注射、ウ イルス感染、眼窩採血、および頚部脱臼による屠殺を含めて全操作法はペントレ ン麻酔下に排気フード下に行った。 ｉ 抗体有効量の決定およびＲＦ−１とＲＦ−２およびγ１とγ ４（ＰＥ型）のパフォーマンスの比較。 第０日に１群５匹のマウスを１００μＬ容量中のＲＳＶの１０６ロング（サブ グループＡ）または１０⁵個の１８５３７（サブグループＢ）プラーク形成単位 （ＰＦＵ）の点鼻によって感染させる。ウイルス力価のピークである第４日目に 動物に４種の各Ｆ蛋白質特異的モノクローナル抗体標本または対照抗体を腹腔内 に注射すればよい。検査する用量は最初は試験管内研究から血清中和力価を与え るように算出した約１：３００またはそれ以上の参考用量の周辺に集中させる。 この力価は小動物でＲＳＶ感染に対する保護レベルに関連している。用量反応関 係は参考用量の２５、５、１、１／５、および１／２５倍での処理によって評価 する。さらに高用量または低用量を用いる実験も必要なら行う。対照マウスには 前記の通りにアイソタイプ適合モノクローナル抗体の対応する用量を注射する。 ２４時間後の第５日はウイルス放出の最盛期であるが、この日にマウスを屠殺す る。心臓穿孔によって血清を採取し、鼻甲介および肺臓を摘出し、秤量し、各々 １ｍＬおよび２ｍＬのＮＭＭ中でホモジナイズする。ＨＥｐ−２細胞でウイルス の力価についてホモジネートを検定し、ウイルス力価をＴＣＩＤ₅₀／ｇ組織で表 す。群間の平均力価を対照群とスチューデントのｔ−検定によって比較する。血 清は感染時と屠殺時に採取してヒトのモノクローナル抗体について酵素免疫検定 および中和検定によって定量する。上部呼吸樹ではＩｇＧアイソタイプは能動的 には分泌されない（ＩｇＡに比較して）ので、ウイルス力価の最大低下値は肺臓 ウイルス増殖にあると予測される。感染第４日の治療が肺ウイルスの減少に無効 であることが証明されたら、第２日および／または第３日の治療を評価する。 原液中および注射した動物から得られる血清中の各モノクローナル抗体力価は 前記の通りにＥＬＩＳＡを使用して測定する。確定している方法（８２）に従っ て親和性クロマトグラフィーによって精製したＲＳＶ融合蛋白質を固相で使用す る。実験的ＲＳＶ感染症に対するマウスＩｇＧの応答を評価するためにＲＳＶ・ Ｇ蛋白質に対する別の検定も案出するのがよい。ヒトのＩｇＧおよびマウスＩg Ｇに対して特異的なウサギ抗体（Ｖirion・Ｓystems社、ベセスダ、ＭＤから入 手できる）を用い、ヒトのモノクローナル抗体またはマウスの抗体をＥＬＩＳＡ によって検出する。 これらモノクローナル抗体の用量応答関係をウイルス力価を２ｌog₁₀倍以上ま たは＞９９％低下させる最低抗体力価として各抗体について測定する。保護の程 度は屠殺時に到達していた血清抗体レベルに関連する。これに加えて、ヒトのモ ノクローナル抗体の様々な組合せの相乗効果の可能性も検討する。前記に略述し た初期試験管内研究の結果を使用して生体内実験を誘導する。例えばＲＦ−１お よびＲＦ−２がＲＳＶ・Ｆ蛋白質上にある別個の抗原結合部位を有するなら、同 じアイソタイプ（γ１またはγ４）の組合せが相乗効果を示すこともある。 ｉｉ 肺組織の組織学的評価 肺炎の受動療法の効果を標準的な組織病理学的および組織免疫化学的な技術に よって評価する。細気管支周囲の浸潤および肺胞浸潤の双方が一次または二次感 染後のマウスについて記載されている［Ｃonnersほか、Ｊ．Ｖirology（１９９ ２年）、６６巻：７４４４〜７４５１頁］。実験動物をモノクローナル抗体で前 記の通り処理する。無感染無処置対照マウスを組織学的効果を評価するための比 較対照として使用する。感染後第５日および第８日に、肺臓を摘出し、定常的な 充填圧（３０cmＨ₂Ｏ）下に３０分間ホルマリンで膨張させる。切片にしてヘマ トキシリン−エオシンで染色した後、炎症性浸潤の程度を細気管支周囲および肺 胞部分について（ＰＭＮおよびリンパ球を別個に）標準的評点法を用いて測定す る。γ１およびγ４モノクローナル抗体が補体を別々に固定し、活性化すること も予測されるので、肺切片の炎症領域を購入可能なウサギの抗マウスＣ３抗体（ Ｖirion・Ｓystems社、ベセスダ、ＭＤ）およびペルオキシダーゼ結合ヤギおよ びウサギＩｇＧを用いてマウスＣ３沈着で染色する。 固定肺臓組織に見られる組織学的変化の評価に加え、肺臓の炎症を肺胞細胞学 も評価して査定する。前記の通り処置したマウス群を屠殺し、下部気道にＰＢＳ ３ｍＬを反復潅流することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行う。ＢＡＬの 細胞を計数し、細胞遠心分離標本の染色によって細胞型を確認する。 ｉｉｉ 感染症への自然免疫応答に及ぼす抗体療法の効果 コトンラットおよびヨザルのモデルでは、ＲＳＶ感染のポリクローナルＩgＧ 製品を用いる受動的療法は動物を攻撃から十分に保護するが、後続するウイルス に対する抗体の自然応答が減少する［Ｈｅｍｍｉｎｇほか、Ｊ．Ｉnfectious・ Ｄiseases（１９８５年）、１５２巻：１０８３〜１０８６頁；Ｐrinceほか、Ｖ irus・Ｒesearch（１９８５年）、３巻：１９３〜２０６頁］。これと対照的に 、Ｇrahamは処置したマウスが抗体への鈍感な応答およびウイルスの攻撃への罹 患性の双方を示すことを見出した［Ｇrahamほか、Ｐed．Ｒesearch（１９９３年 ）、３４巻：１６７〜１７２頁］。ヒトのモノクローナル抗体を用いてこの可能 性を評価するため、マウスをＲＳＶのロング株に感染させ、前記略述の通り第４ 日に保護用量の抗体で処置する。対照には感染無処置動物および無感染処置動物 を含める。抗体測定のため８週間は１週間置きに、続く８週間は４週間置きにマ ウスから採血する。ＲＳＶ・ＦおよびＧ蛋白質に対するヒトのモノクローナル抗 体およびマウスの抗体の双方をＥＬＩＳＡで測定する。これに加え、血清の中和 力価を各時点で測定する。残留するヒトのモノクローナル抗体および能動的に産 生されたマウス抗体による中和への寄与をＥＬＩＳＡの結果および無感染抗体処 理対照の中和活性の結果によって推定する。ヒトのモノクローナル抗体がＥＬＩ ＳＡによって検出されなければ、ＲＳＶの同一株を動物に再投与する。第４日に 動物を屠殺し、肺および鼻組織をウイルスについて力価検定して対照群と比較す る。 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導に及ぼすモノクローナル抗体療法の影響を評 価するために同様な実験を行うが、注射の６週間後にマウスを屠殺し、脾細胞培 養物を活性ＲＳＶで５日間刺激する［Ｗalsh，Ｅ．Ｅ．、Ｊ．Ｉnfectious・Ｄi seases（１９９４年）、１７０巻：３４５〜３５０頁］。ＣＴＬ活性を標準的ク ロム５１放出検定法によって持続的感染Ｂalb／c線維芽細胞細胞系統（ＢＣＨ４ 細胞）を用い、無感染Ｂａｌｂ／ｃ線維芽細胞細胞系統と比較して評価する。 主に樹立されたＲＳＶ感染症の受動的療法の有効用量に関する研究に基づき、 次にＲＳＶ感染症を予防し、または処置するためにはＲＦ−１またはＲＦ−２の どちらの抗体が最も有効であるかを決定する。γ１またはγ４（ＰＥ）態様間の 選択には肺組織学的研究、特に補体の補給がＣｌｑ結合抗体で明確に強化される と思われるかどうか、を考慮する必要がある。後続する強化された脈管化はウイ ルス−抗体の対立を増加するかも知れないが、補体の多量な活性化は有害な効果 を示す可能性がある。 ｃ．サルモデルにおけるテストパフォーマンス 選択する抗体に付いての決断的試験は霊長類で行う。われわれはＲＳＶに高度 な寛容性を示し、感染が肺臓病理を強化し、また検出可能な病巣を導く［Ｋakuk ほか、Ｊ．Infectious・Ｄiseases（１９９３年）、１６７巻：５５３〜５６１ 頁］アフリカミドリザル（Ｃercopithecus・aethiops）を選択する。アフリカミ ドリザルは容易に購入でき、危険がない。このサルの体重は５ｋｇおよび１０ｋ ｇの間である。抗体の予測的用量最大値は２０ｍｇ／ｋｇである。各１０ｋｇの 動物３匹を２０ｍｇ／ｋｇ、すなわち６００ｍｇの抗体で処置する。野生のアフ リカミドリザルはＲＳＶに対する自然の免疫を持っており、われわれの研究に導 入する要件は血清がＲＳＶについて陰性であることである。 マウスモデルで確立したベースライン、有効用量／ｋｇおよび療法開始前の感 染時点、に基づいて、ウイルスを減少させる有効用量を確立するため、ならびに これが肺臓病理の予防に関連するかどうかついて、特に実質組織の炎症への関与 について、確認するため、限定された一連の試験を行う。ウイルス株は１種、す なわちロング株（サブタイプＡ）を検査する。最初に参照用量の２５、５、１お よび１／２５倍を検査する。対照群２種、一方はウイルスに感染し、抗体処置し ないもの、他方はウイルスに感染し、アイソタイプ適合対照抗体の最大用量で処 置したものを分析する。本質的に実験は前記の通りに行う。１群３匹のサルを点 鼻法により１０⁶ＰＦＵのウイルスで感染させる。ウイルス感染の後、６日から ７日目にサルを屠殺し、肺臓および咽頭サンプルを採取し、前記の通りウイルス 検定および組織学的検査を行う。 組織学的検査は実質的に前記の通りに行う。略述すれば、肺を１０％中性緩衝 ホルマリンで定常充填圧下に潅流する。肺を少なくとも１週間ホルマリン中に保 持するのがよい。切片にしてヘマトキシリン−エオシンで染色後、スライドをＫ akukほか、Ｊ．Ｉnfectious・Ｄiseases（１９９３年）、１６７巻：５５３〜５ ６１頁に従って組織病理学的に評価する。血清サンプルも採取し、ＲＳＶに対 するヒトの抗体の力価をＥＬＩＳＡおよび感染中和検定で測定する。 実施例１０ １．ヒトの組織切片での試験管内検査による組織特異性の確認 次に抗体を二人の別人から得た異なる正常組織切片について免疫組織学的研究 によって正常な組織への潜在的な交差反応性についてさらに試験する。略述すれ ば、凍結組織のＣryostatミクロトーム切片に次の試験３種を行う：固定化分析 、ニトロ化分析および特異性／分布分析。精製ビオチン標識抗ＲＳＶ・Ｆ蛋白質 抗体を１％ＢＳＡ添加ＰＢＳに添加し、スライドを３０分間湿潤チャンバー中、 ２００Ｃでインキュベーションする。次にスライドを１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで洗 浄する。続いてこのスライドをアビジン−ＨＲＰとともに１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ 中で３０分間インキュベーションする。ＨＲＰを３，３−ジアミノベンジジン四 塩酸塩と反応させると、ＨＲＰでの酸化が介在する不溶性沈殿染色物を形成する 。これが対象ヒトモノクローナル抗体の潜在的な交差反応性を確認する。この試 験はＩmpath研究所、ＮＹ、ＮＹで行い、ＦＤＡによるヒトの治療を最終目的と する製品のＩＮＤ提出用として承認を受ける。この組織学的な手法は既存の組織 を使用し、放射能標識抗体でのＲＳＶ感染サルを標的とする別の研究より安価で ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/39 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 パン，リ−ゼン アメリカ合衆国92122カリフォルニア州 サンディエゴ、ジェネシー・アベニュー・ ナンバー114、8148番 (72)発明者 ウォルシュ，エドワード・イー アメリカ合衆国14534ニューヨーク州 ピ ッツフォード、オールド・フォージ・レイ ン25番 (72)発明者 ハード，シェリル・ジャン アメリカ合衆国92024カリフォルニア州 エンシニタス、ビア・モントロ1225番 (72)発明者 ニューマン，ローランド・アンソニー アメリカ合衆国92122カリフォルニア州 サンディエゴ、ロビンズ・ストリート4311 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＲＳＶ融合蛋白質を特異的に結合し、ＲＳＶ−Ｆ蛋白質に対して≦２× １０^-9モルの親和性を有するヒトのモノクローナル抗体。 ２．試験管内でＲＳＶを中和する請求項１のヒトのモノクローナル抗体。 ３．ＲＦ−１、ＲＦ−２、および、組換えヒトモノクローナル抗体であって ＲＦ−１またはＲＦ−２のいずれかの重鎖および軽鎖可変ドメインを含むもの、 から構成される群から選択されるＲＳＶ融合蛋白質を特異的に結合するヒトのモ ノクローナル抗体。 ４．その抗体がＲＦ−１である請求項３のヒトのモノクローナル抗体。 ５．その抗体がＲＦ−２である請求項３のヒトのモノクローナル抗体。 ６．その抗体がヒトのガンマ１、ヒトのガンマ４、またはヒトのガンマ４・ ＰＥ定常領域のいずれかを含む組換え抗体である請求項３のヒトのモノクローナ ル抗体。 ７．その抗体がＲＦ−１またはＲＦ−２のいずれかに４の重鎖および軽鎖可 変ドメインをコードするＤＮＡ配列を遺伝子移入されている真核生物細胞。 ８．その真核生物細胞がＣＨＯ細胞である請求項７の細胞。 ９．そのＤＮＡ配列が図７ａ、７ｂ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａまた は１０ｂのいずれか一つに示されたＤＮＡ配列から選択される請求項７の真核生 物細胞。 １０．ＲＳＶ融合蛋白質に対して≦２×１０^-9モルの親和性を有するヒトのモ ノクローナル抗体を分泌するエプスタイン−バー不死化Ｂ細胞系統。 １１．その抗体が試験管内でＲＳＶを中和する請求項１０の細胞系統。 １２．その細胞系統がＲＦ−１およびＲＦ−２から構成される群から選択され る請求項１０の細胞系統。 １３．（ｉ）ＩＬ−２存在下にヒトの脾細胞を試験管内でプライミングするこ と； （ｉｉ）このプライミングしたヒトの脾細胞をＳＣＩＤマウスに移入すること。 （ｉｉｉ）このＳＣＩＤマウスをＲＳＶ・Ｆ蛋白質で追加免疫すること；および （ｉｖ）そのＳＣＩＤマウスからＲＳＶ・Ｆ蛋白質に対して特異的なヒトのモノ クローナル抗体を分泌するヒトのＢ細胞を分離すること； を含むＲＳＶ融合（Ｆ）蛋白質に特異的なヒトの抗体を産生する方法。 １４．その分離したヒトのＢ細胞が不死化されている請求項１３の方法。 １５．エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を使用してその不死化を行う請 求項１４の方法。 １６．そのＥＢＶ不死化細胞をマウス胸腺腫細胞系統ＥＬ−４・Ｂ５を供給細 胞層に使用してクローニングする請求項１５の方法。 １７．そのプライミング段階をＩＬ−４またはＩＬ−６の存在下に行う請求項 １３の方法。 １８．その抗体がＲＦ−１またはＲＦ−２の重鎖および／または軽鎖可変ドメ インをコードするＤＮＡ配列。 １９．請求項１８のＤＮＡ配列の発現を提供する発現ベクター。 ２０．図７ａ、７ｂ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａおよび１０ｂに示すＤ ＮＡ配列から構成される群から選択した請求項１８のＤＮＡ配列。 ２１．ＲＳＶ・Ｆ蛋白質に対する≦２×１０^-9モルの親和性を有し、また、験 管内でＲＳＶを中和する、ヒトのモノクローナル抗体の１種またはそれ以上を予 防的有効量または治療的有効量で投与することを含む、ＲＳＶに罹病性のあるま たはＲＳＶに感染した個体においてＲＳＶ感染症を予防または処置する方法。 ２２．ＲＦ−１、ＲＦ−２、および組換えヒトのモノクローナル抗体であって ＲＦ−１またはＲＦ−２の重鎖および軽鎖可変ドメインを含むもの、から構成さ れる群からその抗体を選択する請求項２１の方法。 ２３．その抗体を注射によってまたはエアロゾルによって投与する請求項２１ の方法。 ２４．その抗体をアジュバントと組合せて投与する請求項２１の方法。 ２５．そのアジュバントが完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）、明礬また はその混合物である請求項２４の方法。 ２６．試験管内でＲＳＶを中和し、ＲＳＶ・Ｆ蛋白質に対して≦２×１０^-9モ ルの親和性を有する、ヒトのモノクローナル抗体の予防的または治療的な有効量 および医薬的に許容される担体を含む、ＲＳＶに罹病性のあるまたはＲＳＶ感染 した個体においてＲＳＶ感染症を予防または処置するために適当な医薬組成物。 ２７．ＲＦ−１、ＲＦ−２、および組換えヒトのモノクローナル抗体であって ＲＦ−１またはＲＦ−２のいずれかの重鎖および軽鎖可変ドメインを含むもの、 から構成される群からヒトのモノクローナル抗体を選択する請求項２６の医薬的 組成物。 ２８．ＲＳＶ・Ｆ蛋白質抗体の免疫複合体を形成する条件下にＲＳＶ・Ｆ蛋白 質に対して≦２×１０^-9モルの親和性を有するヒトのモノクローナル抗体ととも にその検体をインキュベーションすること；および ＲＳＶ・Ｆ蛋白質抗体免疫複合体の存在を検出して、ＲＳＶが検体中に存在す るかどうかを決定すること を含む、検体中のＲＳＶの存在を検出する方法。 ２９．その抗体がＲＦ−１またはＲＦ−２である請求項２８の方法。 ３０．その抗体が直接または間接にレポーター分子に結合している請求項２９ の方法。 ３１．そのレポーター分子が検出可能な酵素または放射性核種である請求項３ ０の方法。 ３２．その検体が呼吸器から得た体液である請求項２８の方法。 ３３．（ｉ）ＲＳＶ・Ｆ蛋白質に対して≦２×１０^-9モルの親和性を有するヒ トのモノクローナル抗体；および （ｉｉ）該ヒトのモノクローナル抗体に直接または間接に結合しているレポー ター分子 を含む、検体中のＲＳＶの存在を検定するための試験用キット。 ３４．該ヒトのモノクローナル抗体がＲＦ−１またはＲＦ−２である請求項３ ３の試験用キット。