FI104732B

FI104732B - Menetelmä transplantaatiossa käyttökelpoisen solun tai kudoksen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI104732B
Application number: FI930886A
Authority: FI
Inventors: Denise Faustman
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1993-02-26
Publication date: 2000-03-31
Also published as: CA2090009A1; EP1484063A2; FI930886A; FI930886A0; US5283058A; US5783216A; US6844011B1; EP0550482A4; EP0550482A1; JP2002104998A; EP1484063A3; CA2090009C; AU656150B2; WO1992004033A1; AU8510491A; JPH06503810A

Description

, 104732

Menetelmä transplantaatiossa käyttökelpoisen solun tai kudoksen valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 Keksintö koskee menetelmää transplantaatiossa käyt tökelpoisen solun tai kudoksen valmistamiseksi. Tässä kuvataan kudosten, esim. saarekesolujen, lihassolujen ja kokonaisten elinten, transplantaatiota tällaisia kudoksia tarvitseviin isäntiin, esim. potilaisiin, joilla on tai 10 joille uhkaa kehittyä sokeritauti, joilla on lihassurkas-tumatauti tai jotka tarvitsevat elinsiirrettä.

Sokeritauti on yleinen rappeuttava sairaus, jolle on tunnusomaista insuliinipuutos, joka estää veren glukoo-sitasojen normaalia säätelyä ja joka johtaa veren liian 15 suureen sokeripitoisuuteen ja veren liiallisesta ketoni-määrästä johtuvaan liikahappoisuuteen.

Insuliini, joka on peptidihormoni, edistää glukoosin käyttöä, proteiinisynteesiä, neutraalien lipidien muo- i dostusta ja varastointia ja joidenkin solutyyppien kasvua.

20 Insuliinia tuottavat β-solut haiman Langerhansin saarek- , keissa. Varhain puhkeavan sokeritaudin (10 - 20 % tapauk- ~ * · · sista) aiheuttaa autoimmuunireaktio, joka aiheuttaa β-so- • · « r lujen täydellistä tuhoutumista. Aikuisiällä puhkeavalla : '.V sokeritaudilla on monia syitä, mutta useimmissa tapauksis- I I t _ 25 sa β-saarekesolujen insuliinin eritys on puutteellista.

Insuliiniruiskehoito, yleensä käyttäen sian tai naudan :1·1; insuliinia, estää vakavaa veren liian suurta sokeripitoi- • ^ suutta ja veren liiallisesta ketonimäärästä johtuvaa lii- .···, kahappoisuutta, muttei kykene täysin normalisoimaan veren • · 30 glukoositasoja. Vaikka ruiskehoito on ollut melko tulokse- • · "1 kasta, se ei onnistu estämään ennenaikaista verisuonten *·’1· rappeutumista, joka on nykyään tärkein sairastamisen syy - : sokeritautipotilailla. Sokeritautiin liittyvä verisuonten ;·[ rappeutuminen, johon sisältyy sekä hiussuonten rappeutu- 35 mistä että vaitimonhaurauskovetustaudin kiihtymistä, voi 2 104732 lopulta aiheuttaa munuaisten vajaatoimintaa, verkkokalvon rappeutumista, sydänkouristusta, sydäninfarktin, ääreis-hermosairautta ja valtimonkovetustautia.

Hiljattain on ihmisen insuliinin koodaavan geenin 5 kloonaus tehnyt mahdolliseksi tuottaa suuressa mittakaavassa ihmisen insuliinia, joka on alkanut syrjäyttää naudan insuliinin ja sian insuliinin valittuna hoitona. Ihmisen insuliinin käyttö on poistanut joitakin ongelmista, jotka liittyvät muihin insuliinin muotoihin, mukaan lukien 10 vasta-aineiden välittämä insuliinin vastustus ja allergiset reaktiot, jotka johtuvat ei-ihmisinsuliinien hiukan erilaisista rakenteista. Näistä eduista huolimatta hoito ihmisen insuliinilla ei estä verisuonten rappeutumista.

On kehitetty insuliininantopumppuja, jotka antavat 15 vaihtelevia annoksia insuliinia aktiivisuuden, ruokavalion, kellonajan ja muiden ennalta ohjelmoitujen tekijöiden perusteella. Vaikka tällaiset laitteet parantavat veren sokeripitoisuuden kontrollointia, ne eivät myöskään estä verisuonten rappeutumista.

20 Osan haimasta tai koko haiman kirurgisen transplan- . taation ajatellaan olevan mahdollisesti paras sokeritaudin • · · , ; hoito. Onnistunut transplantaatio on kuitenkin vaikeaa, koska haima on hauras ja monimutkainen elin ja ihmisluo-vuttajan on mahdotonta antaa ainoastaan osaa siitä; ainoa

· I

’...· 25 mahdollinen lähde on kuollut luovuttaja. Lisäksi ainoas- i · · • taan pieni osa haimasta, Langerhansin saarekkeen β-solut, tuottavat insuliinia; muu osa haimasta edustaa mahdollista kohdetta siirteen hylkimiselle. Ainoastaan Langerhansin .···. saarekkeiden transplantaatio on tavoiteltu päämäärä, koska • · ,···, 30 ne jatkavat sopivien määrien insuliinia erittämistä vas- *!* tauksena ravitsemussignaaleihin silloinkin kun ne on eris- *·**· tetty muusta osasta haimaa.

Transplantaatiohoitoon sokeritaudin hoitona liittyvä tärkeä ongelma on se, että nykyiset hoito-ohjelmat vaa-35 tivat immuunivastetta heikentävien lääkkeiden elinikäistä i i 3 104732 antamista. Nämä lääkkeet voivat aiheuttaa lisääntynyttä alttiutta infektiolle, munuaisten vajaatoimintaa, korkeaa verenpainetta ja kasvaimen kasvua.

Näistä vakavista komplikaatioista huolimatta saa-5 rekkeiden transplantaatiota on suoritettu onnistuneesti koe-eläimillä. Jyrsijöillä on onnistuneen transplantaation osoitettu palauttavan normaalin veren glukoosin säätelyn ja estävän verisuonten lisärappeutumista. Allograftien ja ksenograftien (lajien välisiä siirteitä) laajempi käyttö 10 sokeritaudin hoitona riippuu siirteen hylkimisen estämisestä. On kauan tiedetty, että saarekkeiden viljely ennen transplantaatiota vähentää immunogeenisyyttä ja lisää siirteen eloon jäämistä (Lacy et ai., Science 204 (1979) 312; Lafferty et ai., Science 188 (1975) 259). Ajatellaan, 15 että pitkäaikainen viljely poistaa Ia:n omaavat matkusta-jaimusolut, jotka ovat tärkein kiihoke soluvälitteiselle immuniteetille ja siirteen hylkimiselle. Faustman et ai.

(J. Exp. Med. 151 (1980) 1673) ovat todenneet, että saare-kesoluilta puuttuvat Ia-antigeenideterminantit ja ne il- = 20 mentävät luokan I antigeeniä pinnallaan. Tämä teki Faust-manille et ai. (Proc. Natl. Acad. of Sei. USA 78 (1981)

I I I

5156) mahdolliseksi kehittää hoito-ohjelman, joka käytti »ti — luovuttajalle spesifistä anti-Ia-seerumia ja komplementtia Ia:n omaavien imusolujen tuhoamiseksi saarekkeissa ja mah- I < I — 25 dollisti transplantaation suuren kudostenyhteensopivuuses-

• V teen sokeritautisiin hiiriin, joiden immuunivastetta ei I

oltu heikennetty.

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön mukaiselle menetelmälle transplantaatios- .···. 30 sa käyttökelpoisen solun tai kudoksen valmistamiseksi on " • « — ’·* tunnusomaista, että naamioidaan antigeeni, joka on maini- = • « · · · ’ * tun solun pinnalla, saattamalla mainittu solu tai kudos :111: kosketukseen komplementtiin sitoutumattoman vasta-aineiso- ( tyypin tai komplementtiin sitoutumattoman vasta-ainefrag- 35 mentin kanssa, joka kykenee muodostamaan kompleksin maini- ^ i · 4 104732 tun solun tai kudoksen pinnalla olevan mainitun antigeenin kanssa siten, että kun solu viedään eläimeen ihminen mukaanlukien mainitun solun hajoaminen estyy.

Keksintö mahdollistaa saajaeläimen suorittaman 5 transplantoidun kudoksen hylkimisen estämisen. Menetelmäs sä naamioidaan antigeeni, joka ollessaan läsnä kudoksen solun pinnalla kykenee aiheuttamaan T-imusoluvälitteisen vasteen eläimessä; antigeenin naamioiminen estää antigeenin välittämää solun ja eläimen T-imusolun välistä vuoro-10 vaikutusta aiheuttamatta solun lyysiä.

Kun transplantoitavan kudoksen ("luovuttajan" kudoksen) soluilla on pinnallaan HLA-luokan I antigeenejä (suuren histokompatibiliteettikompleksin antigeenien yhden luokan jäseniä), nämä antigeenit aiheuttavat sytotoksisten 15 T-solujen aktivaatiota saajissa, mikä päättyy luovuttajan solujen lyysiin useiden peräkkäisten aktivaatiovaiheiden jälkeen. Kaskadin panee alulle epäspesifinen konjugaatin muodostuminen isännän sytotoksisten T-solujen pinnalla olevan CD8-reseptorin ja luovuttajan solun pinnalla ole-20 vien HLA-luokan I antigeenien kesken. Konjugaatin muodostumista seuraa T-solujen välittämä lyysi, mikä johtaa luovuttajan solun kuolemaan. Tämä lyysiä aiheuttava ta-

• I I

pahtumasarja voi johtaa hylkimiseen myös lajinsisäisessä transplantaatiossa. Keksinnön mukaan tähän ongelmaan käy- • « « 25 dään käsiksi naamioimalla luovuttajan solujen pinnalla

• \i olevat HLA-luokan I antigeenit, niin että CD8-HLA-luokan I

antigeeni -vuorovaikutusta, joka panee alulle liuottavan kaskadin, ei voi esiintyä.

.···. Kuten alla selitetään yksityiskohtaisemmin, mitä .··, 30 tahansa luovuttajan solujen pinnalla olevia T-solun resep- « o torin kanssa vuorovaikutukseen kykeneviä antigeenejä voi-*·’*· daan edullisesti muuntaa, poistaa tai naamioida. Keksintö 'iri: ei siten salli ainoastaan kudosten ja elinten lajinsisäis- tä transplantaatiota vaan myös ksenograftien transplantaa-35 tion luoden mahdollisuuden "kasvattaa" luovuttajan elimiä = 104732 ja kudoksia muissa eläimissä kuin ihmisissä ihmispotilail-le transplantaatiota varten.

Edullisia naamiointlaineita ovat luovuttajan solujen antigeenien vastaisten vasta-aineiden F(ab')2 -fragmen-5 tit; vaikka nämä fragmentit kykenevät muodostamaan immuu-nikomplekseja antigeenin kanssa ja siten estämään antigeeni -T-soluvuorovaikutusta, ne eivät, koska niistä on pois- * tettu vasta-aineen Fc-osa, sido komplementtia eivätkä aiheuta solun lyysiä. On havaittu, että vaikkei ehkä odotet-10 taisi tällaisten F(ab')2 -fragmenttien sitoutuvan tarpeeksi tiukasti naamioidakseen pysyvästi luovuttajan solujen pinnalla olevia antigeenikohtia, voidaan saavuttaa isännän _ pitkäaikainen täten käsiteltyjen kudosten hyväksyminen. Ϊ

Kuten alla selitetään yksityiskohtaisemmin, luovut- = 15 tajan kudosten solujen pinnalla olevia hylkimistä aiheuttavia pinta-antigeenejä voidaan naamioimisen lisäksi muun- 1 taa esim. käyttämällä "capping"-ilmiötä tai poistaa kokonaan tai osittain geenimanipulaation avulla, joko trans- 5 geenisissä eläimissä, joita käytetään luovuttajan kudoksen 20 lähteenä, tai viljelmässä.

Keksinnön muita piirteitä ja etuja selviää seuraa- = I vasta sen edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta ja pa tenttivaatimuksista.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus “ 25 Ensin kuvataan lyhyesti piirrokset.

( i i • V Piirrokset

Kuvio 1 on joukko graafisia esityksiä, jotka valai- = sevat HLA-luokka I:n (W6/32), CD29 (4B4), CD54 (ICAM-1) ja s CD58 (LFA-3) -ilmennystä juuri eristettyjen 99 - 97 % puh- • · · z 30 taiden kokonaisten ihmisen Langerhansin saarekkeiden pin- = i · = "* naila epäsuoran immunofluoresenssin ja virtaussytometrian “ • * avulla. A. Ihmisen saarekkeet olivat positiivisia määrä- ^ • · · ;— ...· nä 36 % W6/32-vasta-aineen avulla tutkittaessa (----) .

:\ B. Ihmisen saarekkeet olivat negatiivisia CD29:n suhteen z 35 osoittaen 9 % ilmennystä (----). C. Ihmisen saarekkeet =

II

• I I

6 104732 olivat tässä puhtaassa saarekepreparaatissa käytännöllisesti katsoen negatiivisia ICAM-l:n suhteen ilmennyksen ollessa 14 % (----) . D. Ihmisen saarekkeet olivat negatii visia LFA-3-ilmennyksen suhteen 10,2 % soluista ollessa 5 positiivisia. Taustan vuohen antihiiri-FITC-ilmennys oli 9 % (----) tässä kokeessa. Käytettiin avointa porttia sul kien pois kuolleet solut ja jätteet virtaussytometriässä. Kuten odotettua, saarekepreparaatit, joissa oli epäpuhtautena suuria määriä fibroblastiliikakasvua tai endoteeliso-10 luja (puhtaus 60 - 75 %) , olivat positiivisia alhaisten määrien LFA-3 ja ICAM suhteen.

Kuvio 2 on sarja valokuvia, jotka osoittavat Balb/c-saajien munuaiskapselin alle transplantoitujen ihmisen saarekkeiden histologisen analyysin. A. Mikrovaloku-15 va ihmisen saareke -ksenograftista 30 päivää transplantaation jälkeen, kun on suoritettu esitransplantaatiokäsitte-ly HLA-luokka I:n F (ab1) 2-fragmenteilla (W6/32) . Tämä al-dehydifuksiinivärjäys (X100) osoittaa hyvinjyväistyneitä saarekkeita munuaiskapselin alla. B. Mikrovalokuva ihmisen 20 saareke -ksenograftista 200 päivää transplantaation jäl-f*f keen, kun on suoritettu esitransplantaatiokäsittely HLA- luokka I .-n F (ab') 2-fragmenteilla (W6/32) . Tämä aldehydifuk-;; siinivärjäys (X100) osoittaa hyvin jyväistyneitä saareksi' keitä munuaiskapselin alla. C. Kontrolli-Balb/c-hiirelle 25 transplantoitiin käsittelemättömiä tuoreita ihmisen saa- « « · : *.· rekkeita ja ne tapettiin sitten päivänä 30. Tämä tunnus- ·»· '·/· · omainen mikrovalokuva osoittaa luovuttajan saarekkeiden puuttumisen ja kapselin alaisen sidekudostumisen läsnä- ;***; olon, joka osoittaa aikaisemman alueen, johon saarekkeet .···. 30 oli transplantoitu. D. Hiiren haimassa olevan hiiren saa- • < rekkeen aldehydifuksiinivärjäys, joka osoittaa terveiden ·· · · · beetasolujen tunnusomaisen purppuranpunaisen jyväistynei-'... * syyden.

- Luovuttajan kudospraparaatti ,··*. 35 Ennen kuin kuvataan yksityiskohtaisesti keksinnön • · erityisiä esimerkkejä, tarkastellaan lyhyesti joitakin keksinnön parametrejä.

ί i v 104732

Luovuttajan kudos

Sen lisäksi että keksintö sallii saarekesolujen transplantaation, se voi helpottaa minkä tahansa muun kudoksen tai elimen, esim. munuaisen, sydämen, maksan, keuh-5 kon, aivo- ja lihaskudoksen transplantaatiota.

Naamioitavia, muunnettavia tai poistettavia antigeenejä

Keksintöä voidaan käyttää minkä tahansa luovuttajan kudoksen soluista pinnalla olevan minkä tahansa isännän 10 T-solun kanssa vuorovaikutukseen kykenevän antigeenin naa mioimiseksi. HLA-luokan I antigeenien lisäksi, joita esiintyy kaikkien peruskudossolujen pinnalla mukaan lukien saarekesolut, muita tärkeitä luovuttajan solujen antigeenejä, joiden tiedetään kykenevän vuorovaikutukseen 15 isännän T-solujen kanssa hylkimisen aikaansaamiseksi, ovat LFA-3 ja ICAM-1; nämä reagoivat vastaavasti isännän T-so- ~ lujen reseptorien CD2 ja LFA-1 kanssa. Sekä LFA-3 että ICAM-1 esiintyvät sellaisten endoteelisolujen pinnalla, jotka muodostavat verisuonia transplantoiduissa elimissä 20 kuten munuaisessa ja sydämessä. Näiden antigeenien naamiointi, muuttaminen tai poistaminen helpottaa minkä tahansa • · · . ! verisuonitetun siirteen transplantaatiota estämällä isän- * · ; ; nän CD2+ ja LFA-1+ -T-imusoluja tunnistamasta noita anti- • ♦ · geenejä. Lisäksi määrätyn luovuttajan solun antigeenin '··’ 25 naamiointi, muuttaminen tai poistaminen voi tehdä useamman • t · : V kuin yhden luovuttajan solutyypin vähemmän alttiiksi hyi- “ • · · — · kimiselle. Esimerkiksi ei ainoastaan peruskudossoluilla kuten saarekesoluilla ole HLA-luokan I antigeenejä, vaan 1 matkustajaimusoluilla on myös sellaisia antigeenejä, ja • tl 30 jos tällaisia imusoluja on läsnä luovuttajan kudosprepa- • · · • . raatissa, HLA-luokan I antigeenin poistaminen tai kudos-

MMI

* preparaatin käsitteleminen HLA-luokan I antigeenin naami- I t ... — oivalla aineella tekee nuo imusolut vähemmän antigeenisik- · · « * • · __ 104732

O

Antigeenit HLA-luokka 1, LFA-3 ja ICAM-1 ovat hyvin karakterisoituja, ja näiden antigeenien vastaisia vasta-aineita on yleisesti saatavissa ja voidaan valmistaa yleisen tekniikan avulla. Esimerkiksi anti-ICAM-1 voidaan saa-5 da toiminimeltä AMAC, Inc., Maine; hybridoomasoluja, jotka tuottavat anti-LFA-3, voidaan saada kokoelmasta the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Kun transplantoitava luovuttajan kuodos omaa useamman kuin yhden T-solujen kanssa vuorovaikutukseen kykene-10 van antigeenin, voidaan kahta tai useampaa käsittelyä, esim. kahta tai useampaa naamiointlainetta, käyttää yhdessä. Vaihtoehtoisesti voidaan luovuttajan kudosta vastaan aikaansaatua polyklonaalista antiseerumia käyttää luovuttajan kudoksen monien solun pinta-antigeenien naamioi-15 miseksi.

Lyysiä aiheuttamattomia naamiointiaineita

Yleensä voidaan käyttää kolmea naamiointiaineiden luokkaa: 1) vasta-aineita tai niiden fragmentteja tai johdannaisia; 2) antigeenille spesifisten isännän T-solun 20 reseptorien liukoisia fragmentteja tai analogeja ja 3) . .·. synteettisiä orgaanisia molekyylejä, jotka jäljittelevät T-solun reseptorien antigeeniä sitovia ominaisuuksia.

i ; Vasta-aineita, joita nykyään pidetään edullisimpina naamiointiaineina, voidaan käyttää joko yhdelle tai useam- • · *·* 25 malle antigeenille spesifisinä valmisteina tai koko luo- • t | : .* vuttajan elimen tai kudoksen antiseerumivalmisteina. Kum-

• M

V · massakin tapauksessa on välttämätöntä, että valmisteet eivät kykene sitomaan komplementtia eivätkä aiheuttamaan ;***: luovuttajan solujen lyysiä. Komplementin sitominen voidaan • · · 30 estää poistamalla vasta-aineen Fc-osa, käyttämällä vasta- • · · • t aineisotyyppiä, joka ei kykene sitomaan komplementtia, tai • · · · · | * vähemmän edullisesti käyttämällä komplementin sitovaa vas- l r ta-ainetta yhdessä sellaisen lääkkeen kanssa, joka estää komplementin sitomista.

35 Yksittäiselle antigeenille spesifisiä vasta-aineita voidaan valmistaa yleisten menetelmien avulla, mukaan lu- i j 9 104732 kien eläimen, esim. hiiren, immunisointi naamioitavalla antigeenillä, mitä seuraa hybridoomien valmistus ja vasta-aineiden seulonta yleisten menetelmien mukaan. Vaihtoehtoisesti voidaan myös käyttää koko luovuttajan antiseeru-5 meja. Esimerkiksi kun luovuttajan kudos on peräisin sialta, koko sian antiseerumeja tuotetaan immunisoimalla hiiri sian luovutetulla kudoksella tai sian imusoluilla, mitä ' seuraa sellaisten vasta-aineiden esiinseulonta, jotka estävät ihmisen T-imusolujen tarttumisen sian luovutettuihin 10 soluihin.

Vaihtoehtona vasta-aineille tai vasta-ainefragmen- teille naamiointi voidaan toteuttaa käyttämällä liukoista

isännän T-solun reseptoria, joka kilpaillen estää noiden I

T-solujen sitoutumista luovuttajan kudoksen solujen anti- : 15 geeneihin valtaamalla kudoksen pinnalla olevan antigeeni- Ξ kohdan, joka muuten kykenisi vuorovaikutukseen isännän ' T-solujen kanssa. T-solun molekyylit tai proteiinit, esim. " CD8, CD2 ja LFA-1, ovat hyvin karakterisoituja proteiine- Ξ ja, joilla yleensä on solunulkopuolinen domeeni, kalvon : 20 läpi menevä alue ja soluiiman domeeni ja jotka sitoutuvat . .·. kohdesoluligandeihin. Liukoisia T-solun reseptorin pro- Ξ · · _ teiinifragmentteja voidaan valmistaa yleisten yhdistelmä- “ • · i DNA-menetelmien avulla, joissa kalvon läpi menevän ja so- ~ luliman domeenin koodaava DNA poistetaan ja solunulkopuo- ”

• I

'··' 25 lisen domeenin DNAzta ilmennetään rekombinanttisoluissa ~ i i ( — • · « I .· liukoisen rekombinanttiproteiinin tuottamiseksi.

f»« ~ V · "Capping" "Capping" on termi, joka viittaa vasta-aineiden ~ käyttämiseen aiheuttamaan pinta-antigeenien yhteenkertymi- - 30 sen ja inaktivaation. Ensiksi kudos saatetaan kosketuksiin ' . antigeenille spesifisen vasta-aineen kanssa, niin että • · · · · ί—

muodostuu antigeeni-vasta-aineimmuunikomplekseja. Seuraava I

• · vaihe on kudoksen saattaminen kosketuksiin toisen vasta-aineen kanssa, joka kykenee muodostamaan immuunikomplekse-35 ja ensimmäisen vasta-aineen kanssa, niin että ensimmäinen z vasta-aine kertyy yhteen muodostaen pipomuodostelman (cap) yhteen ainoaan kohtaan solun pinnalla. Tekniikka tunnetaan z 10 104732 hyvin ja on kuvattu esim. julkaisuissa Taylor et ai., Nat. New Biol. 233 (1971) 225 - 227 ja Santiso et ai., Blood 67 (1986) 343 - 349. Sellaisten solujen, esimerkiksi saareke-solujen, tapauksessa, joilla on HLA-luokan I antigeenejä, 5 ensimmäinen vaihe on inkuboida soluja HLA-luokan I vastaisen vasta-aineen (esim. W6/32-vasta-aine, kuvattu alla) kanssa ja sitten inkuboida luovuttajalajin vastaisen vasta-aineen, esim. vuohen antihiirivasta-aineen, kanssa yh-teenkertymisen aikaansaamiseksi.

10 Transgeenisiä eläimiä, joilla on vähentynyt HLA- luokka I:n ilmennys

Vaihtoehtona tai lisänä sille, että naamioidaan luovuttajan kudosten solujen pinnalla olevia pinta-antigeenejä ennen transplantaatiota, tällaisia kudoksia voi-15 daan kasvattaa transgeenisissä eläimissä, joita on muutettu geneettisesti niin että pinta-antigeenien ilmentyminen on vähentynyt. Tällaisia transgeenisiä eläimiä voidaan aikaansaada yleisten transgeenitekniikkojen avulla, käyttäen geenejä, jotka poistavat tai inaktivoivat kohdeanti-20 geenin koodaavan geenin tai poistavat tai inaktivoivat . ,·, geenin, joka on välttämätön sen ilmentymiselle solun pin- > · · . nalla, homologisen rekombinaation avulla.

* 4 \ ; Esimerkiksi HLA-luokka I.-n ilmentämisen tapauksessa • I < homologista rekombinaatiota voidaan käyttää joko poista-25 maan tai inaktivoimaan itse HLA-luokka I:n molekyyli tai » · · • inaktivoimaan tai poistamaan seuralaismolekyyli, joka on

• M

ί,ί ί välttämätön sen ilmentymiselle pinnassa. HLA-luokka I:n molekyyli on proteiini, joka koostuu 32 kilodaltonin ja 45 kilodaltonin ketjusta ja joka on liittynyt toiseen pro-

• M

30 teiiniin, β-2-mikroglobuliiniin. Erittäin hyvin säilytetyn #· • t p-2-mikroglobuliiniproteiinin uskotaan toimivan kanta]amo- | * lekyylinä, joka helpottaa luokka I:n kokoonpanoa solukal- voissa.

Luokka I:n ilmentymisen solujen, esim. saarekesolu- • 35 jen, pinnalla estäminen voidaan siten suorittaa joko pois- tantalla tai inaktivoimalla toinen HLA-luokka I:n ketjuista i · < 1X 104732 tai poistamalla tai inaktivoimalla kantaja β-2-mikroglo-buliinimolekyyli. β-2-mikroglobuliinin ilmentymisen kat kaisemisen transgeenisissä eläimissä, mikä johtaa vähentyneeseen HLA-luokka I:n ilmentymiseen, ovat suoritta-5 neet useat ryhmät (Koller ja Smithies, PNAS USA 86 (1989) 8932 - 8935; Zijlstra et ai., Nature 344 (1990) 742 - 746;

Doetschman et ai., Nature 51 (1987) 503 - 512).

In vitro -menetelmiä HLA-luokka I:n ilmentymisen vähentämiseksi 10 Monien kasvaimia aiheuttavien virusten on osoitettu vähentävän HLA-luokka I:n ilmentämistä infektoiduissa soluissa; Travers et ai., Int'1. Symp. on Aging in Cancer (1980) 175 - 180; Rees et ai., Br. J. Cancer 57 (1988) 374 - 377. Lisäksi on osoitettu, että tämä vaikutus HLA- - 15 luokka I:n ilmentämiseen voidaan aikaansaada ehyen viruksen lisäksi käyttämällä virusgenomien fragmentteja. Vil- : jeltyjen munuaissolujen transfektio adenoviruksen fragmen- : teillä aiheuttaa pinnan HLA-luokka I:n antigeenien ilmen- [ tymisen poistumisen; Whoshi et ai., J. Exp. Med. 168 “ 20 (1988) 2153 - 2164. HLA-luokka I:n ilmentämisen luovuttajan solujen, esim. saarekesolujen, pinnalla vähentämistä : t varten virus fragmentit, jotka eivät ole tarttuvia, ovat • I · _ edullisempia kuin kokonaiset virukset, jotka voisivat ai- • « heuttaa komplikaatioita. Muita viruksia ja virus fragment- = .···, 2 5 te ja voitaisiin käyttää vähentämään muun tyyppisten luo- .1*1 vuttajan solujen pinnalla olevien muiden pinta-antigeenien “ • · ~ ilmentämistä samoin kuin myös vähentämään HLA-luokka I:n

i · I

*·* * ilmentämistä peruskudossolujen kuten saarekesolujen pin- ^ nalla.

• · ♦ _ *...* 30 Saajan T-solujen reseptorien paikallinen sulkeminen II» — :...· eritettyjen luovuttajan antigeenien avulla i_

Yllä tarkasteltuihin transplantaation hylkimisen = * t . estämismenettelyihin liittyy kaikkiin luovuttajan kudoksen 3 1 ·

”* muuttaminen siten että luovuttajan kudoksen solujen pin- E

· r

: '*· 35 nalla olevat pinta-antigeenit, jotka saajan T-solujen pin- I

* * * • · i_ 12 104732 nalla olevat reseptorit tunnistavat vieraiksi, poistetaan, muunnetaan tai naamioidaan. Vaihtoehtoinen menettelytapa on muuntaa luovuttajan kudosta erilaisella tavalla, joka aikaansaa isännän T-solujen reseptorien tukkimisen luovut-5 tajän solujen erittämän antigeenin avulla. Esimerkiksi sellaisen luovuttajan kudoksen tapauksessa, joka sisältää pinnan HLA-luokka I:n antigeeniä omaavia peruskudossolu-ja, sen sijaan että naamioitaisiin antigeeni, nuo solut voidaan transfektoida liukoisen antigeenin koodaavalla 10 DNA:11a, joka antigeeni eritetään ja sitoutuu kilpailevasta saajan T-imusolujen pinnalla olevaan CD8-reseptoriin, joka muuten sitoutuisi luovuttajan kudoksen solujen pinnalla olevaan kalvoon sitoutuneeseen HLA-luokka I:n antigeeniin. Tämän menetelmän suorittamiseen käytettävät tek-15 niikat ovat vastaavia kuin menetelmät, joita muut työskenteli jät ovat käyttäneet aikaansaadakseen rekombinanttipro-teiinin erittymisen yhdessä insuliinin erittymisen kanssa; Lo et ai., Cell 53 (1988) 159 - 168; Adams et ai., Nature 325 (1987) 223 - 228. Adams et ai. aikaansaivat SV40 T 20 -antigeenin synteesin saarekesoluissa yhdessä insuliinin tuotannon kanssa. HLA-luokka I:n antigeenin ilmentyminen ja erittyminen voitiin kytkeä insuliinin tuotantoon ja erittymiseen sijoittamalla HLA-luokka I:n antigeenin toisen tai kummankin alayksikön geeni insuliinigeenin sääte-25 lysekvenssien kontrollin alaiseksi. Insuliinin erittäminen johtaa siten HLA-luokka I:n antigeenin samanaikaiseen il- • m mentymiseen ja erittymiseen. Tämän menettelytavan etuna • · · * on, että se aiheuttaa HLA-luokka I:n antigeenin erittymi sen ainoastaan saarekesoluista kudoksessa, joka voi sisäl- • · i ·...’ 30 tää myös muita solutyyppejä; mikään läsnä olevista muista • · · :,..ί soluista ei tuota eikä eritä insuliinia. Lisäksi tämä lä- hestymistapa rajoittaa liukoisen HLA-luokka I:n antigee- f r ... nin paikallistetulle alueelle, jossa sitä tarvitaan, s.o.

transplantoituja saarekesoluja välittömästi ympäröivälle ί 35 alueelle.

• « I i · · 13 104732

Seuraavat erityiset esimerkit on tarkoitettu ainoastaan valaiseviksi, eikä niiden ole tarkoitus rajoittaa keksinnön piiriä.

Esimerkki 1 5 Tämä esimerkki sisältää HLA-luokka l:n suhteen po sitiivisten ihmisen saarekesolujen ksenogeenisen transplantaation Balb/c-hiirisaajiin, joiden immuunivastetta ei ole heikennetty. Juuri eristettyjä ihmisen saarekkeita esikäsiteltiin ennen transplantaatiota kokonaisella mono-10 klonaalisella vasta-aineella tai F(ab')2“ monoklonaalisen vasta-aineen fragmenteilla luovuttajan antigeenien kätkemiseksi ("naamioimiseksi"). F(ab' )2-fragmenteista puuttuu vasta-aineen Fc-alue, minkä johdosta vältetään komplementin välittämä tappaminen antigeeniin sitoutumisen jälkeen. " 15 Ehyttä immunoglobuliinia käytettiin kontrollina. Ihmisen saarekkeita käsiteltiin asianmukaisella HLA-luokka l:n monoklonaalisella vasta-aineella (W6/32) (American Tissue Culture Society) (Barnstable et ai., Cell 14 (1978) 9 - 20) tai asiaankuulumattomalla CD29- monoklonaalisella vas- Ξ 20 ta-aineella (Coulter Corporation, Hialeah, Fl). Puhtaat ihmisen saarekepreparaatit, joissa ei ole epäpuhtautena endoteeli- eikä fibroblastiliikakasvua, ovat negatiivisia ICAM-1-ilmennyksen suhteen, negatiivisia CD29-ilmennyksen suhteen, niillä on alhainen LFA-3-ilmennys ja ne ovat po- Ξ 25 sitiivisia HLA-luokka I:n antigeenien suhteen (kuvio 1).

* « ~ .1” Sen vuoksi saarekkeilta, toisin kuin muilta sytotoksisten *..1 T-imusolujen kohteilta, puuttuu kahden tärkeän tarttumis- i i r: ’·' 1 epitoopin LFA-3 ja ICAM-1 huomattava ilmentäminen, ja tar ve suojata näitä tarttumisepitooppeja T-solujen sitoutumi- • · · “ 30 seita on vähäinen.

• il l" F (ab' )2-fragmentteja aikaansaatiin käyttäen immobi-lisoitua pepsiiniä. Puhdistettua vasta-ainetta, jota oli . f··., lisätty pitoisuudeksi 20 mg/ml pH-arvon 4,7 omaavaan pilk- ^ • · — komispuskuriliuokseen, pilkottiin 4,5 tunnin ajan CD29- » I | ’1 35 vasta-aineen tapauksessa ja 4,0 tunnin ajan W6/32-vasta- • M -- « · ' - 14 104732 aineen (HLA-luokka I) tapauksessa 37 °C:ssa ravistinvesi-hauteessa (Pierce Chemical, Rockford, IL). Raaka pilkonta-tuoteseos poistettiin pepsiinistä ja neutraloitiin välittömästi pH-arvon 7,0 omaavalla sidontapuskuriliuoksella.

5 Tämä vasta-aineseos lisättiin immobilisoitu proteiini A -pylvääseen ja eluaattia koottiin F(ab' )2-fragmenttien saamiseksi. Sitten suoritettiin dialyysiä PBS:ta vastaan 24 tunnin ajan käyttäen rajamolekyylipainon 50 000 omaavaa putkea pilkontaseoksen vapauttamiseksi epäpuhtautena ole-10 vista Fc-fragmenteista. CHAPPS lisättiin dialyysipussiin pitoisuudeksi 10 mM. F(ab' )2-pilkontatuotteiden pilkonnan ja puhdistuksen täydellisyyttä tarkkailtiin 15 % SDS-gee-lien hopeavärjäyksen avulla. Fragmenttien lopullinen puhdistus suoritettiin HPLCrn avulla käyttäen Superose 12 15 -pylvästä (Pharmacia, Upsala, Ruotsi).

F( ab' )2-fragmentteja tai kokonaisia vasta-aineita inkuboitiin ihmisen saarekkeiden kanssa pitoisuutena 1 pg vasta-ainetta noin 1 x 106 saarekesolua kohti 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen käsitellyt 20 tai käsittelemättömät saarekkeet pestiin kerran Hanks-pus-kuriliuoksessa, joka sisälsi 2 % FCS, ja ne transplantoi-tiin sitten välittömästi munuaiskapselin allle injektio-.ruiskun avulla. Käytetyt ihmisen saarekkeet transplantoi-tiin 4 päivän kuluessa eristämisen jälkeen. Kymmenestä ,·<_ 25 kahteentoista viikon ikäisille Balb/c-naarashiirille (The ft · ,l'l Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) transplantoitiin * · · 2 200 - 4 500 ihmisen saareketta. 30 tai 200 päivää trans- • · · *·* * plantaation jälkeen hiiret tapettiin kaulan sijoiltaan- saattamisen avulla ja transplantoidun kudoksen sisältävä ·«« ·...· 30 munuainen poistettiin kirurgisesti ja kiinnitettiin välit- • · · » ’· tömästi Bouinin liuoksessa.

• · ·

Transplantaatiotutkimusten tuloksista on yhteenveto ♦ * ... taulukossa I. Luovuttajan ksenogeenisten saarekkeiden 'I' (HLA-luokka I) W6/32-F(ab' )2-esikäsittely johti täydelli- • · : '·· 35 seen saarekeksenograftin eloon jäämiseen kaikissa 5 saa- • · ] 15 104732 jassa, jotka arvioitiin 30 päivän kuluttua transplantaatiosta (ryhmä 1), sekä kaikissa 5 saajassa, jotka arvioitiin 200 päivän kuluttua transplantaatiosta (ryhmä 2). Histologia paljasti kaikissa 10 hiiressä hyvin jyväisty-5 neitä saarekkeita munuaiskapselin alla (kuvio IA, IB). Käsittelemättömät ihmisen saarekkeet hyljittiin viipymättä 7 päivän aikana tässä hiirimallissa; histologia osoitti näissä hiirissä massiivisia imusolujen tunkeutumisia munuaiskapselin alle eikä jyväistyneitä saarekesoluja. HLA-10 luokka I:n F(ab')2:l-la käsitellyt saarekesiirteet (W6/32) olivat käytännöllisesti katsoen vapaita vieressä olevista imusoluesiintymistä jopa 200 päivän kuluttua transplantaation jälkeen (kuvio IB). Imusolukertymät ovat viljelemällä jatkettujen ksenograftisiirteiden tunnettu ominaispiirre.

15 Balb/c-vastaanottajat, jotka saivat kokonaisella HLA-luok-ka l:n W6/32-vasta-aineella esikäsiteltyjä saarekesiirtei-tä, eivät osoittaneet eloonjäänyttä saarekekudosta 30 tai 200 päivän kuluttua transplantaatiosta (ryhmä 3, 4) (taulukko 1), mikä osoittaa todennäköistä komplementin sito-20 mistä ja lyysiä kokonaisen, katkaisemattoman vasta-aineen vaikutuksesta. Näille siirteille suoritettu histologia : paljasti kapselinalaista munuaisen sidekudostumista trans- “ • I a

plantaatiokohdassa (kuvio 1C). Luovuttajan saarekkeiden I

peittäminen asiaankuulumattomilla F(ab' )2-fragmenteilla, 7 i i 25 jotka oli suunnattu CD29:ää vastaan, johti saarekesiirteen " « t ."1^ hylkäämiseen päivään 30 mennessä samoin kuin myös päivään " *..* 200 mennessä (ryhmä 5, 6). Ehyt CD29-vasta-aine ei myös- ~ I I · ’·* * kään onnistunut pidentämään saarekeksenograftin eloonjäämistä (ryhmä 7, 8). Luovutettujen ihmisen saarekkeiden ” • · ♦ *...: 30 esikäsittely spesifisillä HLA-luokka I:n F(ab’ )2-vasta-ai- ·»» ΞΞ ·...· nefragmenteilla (W6/32) ja asiaankuulumattomilla CD29- • —

....: F(ab’ )2-vasta-ainefragmenteilla (CD29) johti siirteen elos- I

, saoloon kaikissa viidessä saajassa päivänä 30 (ryhmä 9) ja ~ kaikissa viidessä saajassa päivänä 200 (ryhmä 10), kuten : *·· 35 havaittiin pelkillä HLA-luokka I:n F(ab' )2-fragmenteilla.

< I

• · :- < « « 16 104732

Kuten odotettua, käsittelemättömät ihmisen saarekkeet olivat poissa sekä päivän 30 että päivän 200 arviointiajan-kohtina (ryhmä 11, 12). Ainoastaan kapselinalaista sideku-dostumista oli läsnä munuaiskapselin alla päivänä 30 (ku-5 vio 1C) ja päivänä 200 näissä saajissa.

Transplantoitujen ihmisen saarekkeiden toimintaa tarkkailtiin arvioimalla ihmisen insuliinin C'-peptidin tasoja 30 ja 200 päivän kuluttua transplantaatiosta (taulukko 2). Kaikilla 20 vastaanottajalla, jotka saivat 10 W6/32-F(ab' )2:11a päällystettyjä ihmisen saarekkeita tai W6/32-F(ab' )2:11a ja CD29-F(ab' )2; 11a päällystettyjä saarekkeita, oli päivänä 30 todettavissa oleva ihmisen C-peptidin taso selvästi taustatason yläpuolella (ryhmät 1, 2, 9, 10) (p = 0,002). Ihmisen C-peptidin taso todet-15 tiin samoin 200 päivän kuluttua kaikilla kymmenellä vastaanottajalla, jotka saivat W6/32-F(abr )2-vasta-aineella päällystettyjä saarekkeita (ryhmät 2, 10) (p = 0,003).

Sitä vastoin kaikilla yksilöillä kontrollitransplantaatio-ryhmissä oli ihmisen C-peptiditaso samanlainen kuin taus-20 tataso (ryhmä 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12) (p = 0,98). Esimerkki 2 . Tämä esimerkki sisältää rotan haimasaarekkeen

* « I

kasvaimen solujen (RIN) ksenogeenisen transplantaation • « f

Balb/c-hiirivastaanottajiin, joiden immuunivastetta ei ole !,! 25 heikennetty, tarkoituksena tutkia siirteen spesifisen sie- « « .*** don mahdollisuutta polyklonaalisella F(ab')2:lla esikäsi- • · « • ·* tellyn transplantoidun kudoksen kasvaessa.

• · · *·* * RIN-kasvainsolut ovat tunnettu rotan haimasaarek keen kasvainsolulinja (Meflasson et ai., J. Biol. Chem. O 30 258 (1983) 2094 - 2097). Polyklonaalista hiiren anti-RIN- : : seerumia tuotettiin ja F(ab' )2-vasta-ainefragmentteja ai- kaansaatiin kuten on kuvattu yllä esimerkissä 1. Kuten • · ... odotettua, Balb/c-hiirten, joiden immuunivastetta ei oltu • m heikennetty, munuaiskapselin alle transplantoidut kseno- • « • 35 geeniset RIN-solut (noin 5 000 solua saajaa kohti) oli yh- I · · » » # „ 104732 denmukaisesti hylätty arvioitaessa histologian avulla käyttäen aldehydifuksiinivärjäystä (n = 4) (taulukko 3).

Lisäksi RIN-solujen esikäsittely ehyellä polyklonaalisella hiiren anti-RIN-vasta-aineella, poistamatta komplementin 5 sitovaa Fc-aluetta, ennen transplantaatiota, ei myöskään onnistunut suojaamaan siirteitä vastaanottajan välittä-mältä hyljinnältä (n = 4). Sitä vastoin RIN-solujen esikäsittely hiiren anti-RIN-polyklonaalisten vasta-aineiden F(ab' )2-fragmenteilla mahdollisti RIN-solujen olemisen 10 elossa yhden, kahden, kolmen ja neljän kuukauden kuluttua transplantaatiosta. Vaikka kukin Balb/c-vastaanottaja sai yhtä suuren määrän soluja transplantaation hetkellä, sarja leikkeitä munuaiskapselien alla olevan transplantaatiokoh-dan yli kuukauden väliajoin transplantaation jälkeen pal- ;;

15 jasti kasvainkudoksen massan selvästi havaittavan lisäyksen, mikä viittasi kasvaimen kasvuun. Lisäksi onnistunees- I

ti transplantoidut RIN-solut osoittivat mitoosia hematok- 1 syliini ja eosiini -värjäyksessä, mikä varmisti solujen jakautumisen ja otaksuttavasti naamioimattomien vieraiden ~ 20 antigeenien uuden ilmentymisen. Ksenogeenisen kasvainsolu- Ϊ

linjan jatkunut eloonjääminen ja laajeneminen viittaa I

siirteen aiheuttaman sietokyvyn mahdolliseen läsnäoloon ^ vastaanottajissa. Lisäosoitus siirteen siedon tilasta saa- ^ I c e= ,v tiin transplantoimalla F(ab')2:11a päällystettyjä RIN-solu- I i

M 25 ja toispuolisesti hiirten, joiden immuunivastetta ei oltu I

* « heikennetty, oikeaan munuaiseen 30 päivän ajaksi ennen 1 » · » \ti·* sekundääristä transplantaatiota, jossa siirrettiin käsit- · · ** ' telemättömiä RIN-soluja vasempaan munuaiseen. Päivänä 60 neljä hiirtä, joille oli tällä tavalla suoritettu trans- “ * 4 * 30 plantaatiot, tapettiin. Neljä käsittelemätöntä haimasaare-

:ttt: kekasvainsolujen sekundaarista siirrettä osoittivat myös I

..I,· eloonjäämistä, mikä varmisti aavistetun sellaisen systee- ^ • · ... misen sietokykyisen tilan kehittymisen, joka oli riittävä ~ « · tuoreiden kasvainsolujen eloonjäämistä varten.

I · L.

« «

• · I

• -- « I « __ I I r « — « · · 18 104732

Esimerkki 3

Tutkittiin myös F(ab')2- HLA-luokka I:n vasta-aineella päällystämisen tehokkuutta kasvaimia aiheuttamattomien ihmisen maksasolujen ksenogeenisissä siirteissä hyl-5 kimisen estämisessä. Suunnilleen 5 000 tuoretta ihmisen maksasolua maksan peruskudoksesta injektoitiin hiirivas-taanottajien, joiden immuunivastetta ei oltu heikennetty, munuaiskapselien kapselinalaiseen tilaan. Histologlnen tutkimus käyttäen kapselinalaisten kohtien PAS-värjäystä 10 osoitti, että kaikki viisi F(ab')2:Ha käsiteltyjen maksa-solujen siirteen saajaa osoittivat helposti paikannettuja elinkykyisiä maksasoluja kapselinalaisessa munuaisen kohdassa 30 päivää transplantaation jälkeen. Kuten odotettua, käsittelemättömät ihmisen maksasolut oli kauttaaltaan hyl-15 jitty kaikissa viidessä hiiressä 30 päivän kuluttua transplantaatiosta .

Esimerkkien 1 ja 3 tulosten perusteella on selvää, että saajan T-solujen suorittaman tunnistamisen yksinkertainen häirintä vieraiden HLA-luokka I:n determinanttien 20 naamioinnin avulla mahdollistaa ksenograftin pitkittyneen eloonjäämisen 200 päivään saakka. Tämä uusi menettely poistaa vastaanottajan käsittelemisen säilyttäen siten isännän immuunivasteen, niin että se pysyy käytettävissä olevana relevanttien taudin aiheuttajien tunnistamista 25 varten.

..*]* Saajan pitkään kestävä reagoimattomuus sellaista • · *„· elinkykyistä kudosta vastaan, joka lopulta saattaa menet- • · · *·* * tää naamioivan vasta-aineen tai osoittaa kykyä uudelleen- syntetisoida uusia päällystämättömiä HLA-luokka I:n deter- • · · ·.„· 30 minantteja, viittaa siihen, että siirteen spesifinen sie- • · · ί.,.ί tokyky voi stabiloida näitä siirteitä. Tämän vahvistaa tunkeutuneiden imusolujen suurten pesäkkeiden puuttuminen • f onnistuneissa ksenografteissäni. Tämä on sen olettamukseni • « kanssa yhdenmukaista, että luovuttajan siirteen esikäsit- • * : 35 tely HLA-luokka I:n vasta-aineen fragmenteilla päällystää • f i 9 f

• I

• « · i 19 104732 lyhytaikaisten luovuttajan haaraisten solujen pinnalla olevia luokka I:n antigeenejä yhtä hyvin kuin peruskudos-saarekesolujen pinnalla olevan luokka l:n antigeenin. Ajan kuluessa transplantaation jälkeen nämä antigeenin tarjoa-5 vat solut, jotka ovat tehokkaita siirteen hyljinnän alullepanijoita, voivat kuolla toinen toisensa jälkeen, kuten tapahtuu pitkitetyssä viljelmässä, saattaen siten vähitellen saajan alttiiksi pienille määrille HLA-luokka I:n antigeenejä, jotka ovat ei-antigeenintarjoavien solujen pin-10 nalla.

Muita suoritusmuotoja

Muut suoritusmuodot sisältyvät seuraaviin patenttivaatimuksiin.

Esimerkiksi yllä kuvattuja menetelmiä saarekesolu-15 jen ja maksasolujen käsittelemiseksi voidaan käyttää li hassolujen käsittelemiseen lihassurkastumataudin omaaviin potilaisiin transplantaatiota varten seuraavasti; lihassoluilla kuten saarekesoluillakin on hylkimistä stimuloivia HLA-luokka I:n antigeenejä, ja ne ilmentävät myös luokka ; 20 II:n antigeenejä. Ihmisluovuttajan lihassoluja saadaan ottamalla näyte elävien sukulaisluovuttajien tai aivokuol- " ; leiden luovuttajien elävästä kudoksesta käyttäen vakiomi- i I i

• '>'i tan 14 - 16 putkipistintä 2,5 - 5,0 cm:n ihon viiltohaa- I

vaan. Tuoretta lihastappia pilkotaan sitten lievästi tuot-

I I I

25 taen yksisolususpensio käyttäen kollagenaasia, trypsiiniä ” i « ja dispaasia 37 °C:ssa. Kelluvat jätteet poistetaan pipe- • · *..* tin ja väliainepesujen avulla ja elinkykyisten solujen • · ·

·* * pelletille suoritetaan laskeminen sen jälkeen kun on sent- I

rifugoitu nopeudella 1 000 kierrosta minuutissa 10 minuu- « « « ·...* 30 tin ajan. Tätä solujen laskua käytetään sitten lisättävän

• M

. ·...· HLA-luokka I:n ja -luokka II:n vasta-aineiden fragmenttien määrän laskemiseen; käsittely on yllä saarekesoluja varten ,··. kuvatun mukainen. Samoin keksintö mahdollistaa terveeltä ^ • · . . — henkilöltä peräisin olevien solujen tai sellaisten, joille i '*· 35 on suoritettu geenimanipulaatiota, transplantaation vas- w t · taanottajiin, joilla on määrätyn solun komponentin puutos.

20 1Γ47??

Esimerkiksi verenvuototaudin omaavat henkilöt voisivat olla normaaleilta luovuttajilta peräisin olevien faktoria VIII tuottavien maksasolujen tai sellaisten solujen, jotka on geenimanipulaation avulla saatu erittämään faktoria 5 VIII, saajia.

Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto olisi kokonaisten elinten (esim. sydän, keuhko, maksa, munuainen) transplantaatio potilaisiin. Edullinen elimen naamiointiesikä-sittelymenetelmä käsittäisi luovuttajan elimen perfuusion 10 monoklonaalisten antigeenille spesifisten vasta-aineiden F( ab' )2-fragmenteilla tai elinkudosta vastaan tuotetulla polyklonaalisella antiseerumilla; perfuusio suoritetaan käyttäen tavanomaisia tekniikkoja luovutettujen elinten perfusoimiseksi muilla nesteillä.

15 Taulukko 1: Transplantaation lopputulos, kun on naamioitu luovutettuja ihmisen ksenografteja HLA-luokka I:n (W6/32) tai CD29:n vasta-aineilla tai F (ab' )2-fragmenteilla ennen kudoksen siirtämistä 20 Ryhmät Saarekekudoksen S/P-transplan- Hyväksytty- käsittely0 taatio-päiviä* jä/koko naismäärä* 1 W6/32-F(ab')2 30 päivää 5/5 2 W6/32-F(ab')2 200 päivää 5/5 25 3 W6/32-vasta-aine 30 päivää 0/5 4 W6/32-vasta-aine 200 päivää 0/5 5 CD29-F( ab' )? 30 päivää 0/5 • t · ^ *·“ ’ 6 CD29-F( ab' )2 200 päivää 0/5 7 CD29-vasta-aine 30 päivää 0/5 « · · 30 8 CD29-vasta-aine 200 päivää 0/5 9 W6/32-F(ab' )2 + CD29-F( ab' )2 30 päivää 5/5 ,··. 10 W6/32-F( ab' )2 + CD29-F(ab' )2 200 päivää 5/5 : *·· 35 11 ei mitään 30 päivää 0/5 • I · 12 ei mitään 200 päivää 0/5 ! 104732 21 S/P-transplantaatio-päiviä edustaa transplantaation jälkeisten päivien lukumäärää kunnes luovutettujen ihmisen saarekkeiden Balb/c-saajat tapettiin.

° Puhtaat ihmisensaarekepreparaatit ilmentävät luokka I:n 5 antigeenejä, mutta niiltä puuttuvat CD29-determinantit.

Tämä suhde edustaa onnistuneiden transplantaatioiden lukumäärän suhdetta suoritettujen transplantaatioiden lukumäärään, saarekeksenograftin eloonjääminen arvioitiin käyttäen hematoksyliini ja eosiini -värjäystä kudokseen 10 tunkeutuneiden imusolujen arvioimiseksi ja aldehydifuksii-nivärjäystä beetasolujen osoittamiseksi. Aldehydifuksiini värjää hyvin jyväistyneet beetasolut purppuranpunaisiksi; hematoksyliini ja eosiini värjää imusolut mustiksi. Hyväksytty edustaa tässä käsikirjoituksessa helposti paikannet-15 tuja hyvin jyväistyneitä saarekkeita munuaiskapselin alla, jossa ei ole imusolupesäkkeitä. Hylkääminen edustaa tässä käsikirjoituksessa transplantaatiokohtaa, jossa on suuria imusolukasaumia ja/tai kapselinalaista sidekudostumista ilman saarekkeita.

lii _ il· t | • <

I i l i I

• I

I t |

« I

·«« • ♦ » • · • · ··« - - • i · l_ • ♦ 9 --- " »· · » • · »·· ··· • · • · • · · ··1·· · , (M ...............—

• I

« f 1'

«M

• • a

« I

• «f « « • « * I · 22 104732

Taulukko 2: Ihmisensaarekeksenograftien toiminta arvioituna ihmisen C’-peptidin tasojen avulla • 1 & m > $

Ui I

15 C-pepti- \ Vlxh \ —

dintasot \ ^ iT

\ L\ \ \ ^ v> ^ ^ 'ϊ; \\ ” ^ ^ ^ - |il m :V ^ ^ ^ VV 25 ^ ^ ^ $ ^ \ V \> \> \

V \ V V V V

N v v \\ N o

ΓΛ ^ V \ V V V

___ • · » 30 ryhmät 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 _____ ^ • · « • m • m .·’·. ryhmä 1 W6/32 F (ab') 2, päivä 30 ryhmä 2 W6/32 F(ab')2, päivä 200 ryhmä 3 W6/32-vasta-aine, päivä 30 3^ ryhmä 4 W6/32-vasta-aine, päivä 200 ryhmä 5 CD29 F(ab')2, päivä 30 !··. ryhmä 6 CD29 F(ab‘)2, päivä 200 • · « ! 23 104732 ryhmä 7 CD29-vasta-aine, päivä 30 ryhmä 8 CD29-vasta-aine, päivä 200 ryhmä 9 W6/32+CD29 F(ab')2, päivä 30 ryhmä 10 W6/32+CD29 F(ab')2, päivä 200 ryhmä 11 ei käsittelyä, päivä 30 5 ryhmä 12 ei käsittelyä, päivä 200

Taulukko 3: RIN-haimasaarekekasvainsolujen transplantaatio BALB/c-saajiin, joiden immuunivastetta ei ole heikennetty

Luovuttajan RIN- Ruumiinavauksessa saadut 10 solujen käsittely histologiset tulokset

Ei mitään Kaikilta 4 hiireltä puuttuvat RIN-solut 1, 2, 3 ja 4 kuukauden kuluttua, ja transplantaatio-kohta osoittaa kapselinalaista 15 sidekudostumista.

Anti-RIN-vasta-aine Kaikilta 4 hiireltä puuttuvat RIN- solut 1, 2, 3 ja 4 kuukauden kuluttua, ja transplantaatiokohta osoittaa kapselinalaista side-20 kudostumista.

Anti-RIN-F(ab' )2- Kaikki 4 hiirtä osoittavat RIN- fragmentit solujen eloonjäämistä sarjassa

ruumiinavausten ajankohtia 1, I

2, 3 ja 4 kuukautta transplan- 25 taation jälkeen. Vähäisiä mutta _ *.1.· yhdenmukaisia imusolujen tunkeu- • · ·

·...· tumisia on nähtävissä transplan- I

·· · : 1 : taatiokohdassa.

• · • · · • · · • · ..... — • · · _ • · • · • # · • · · • · • · « _ • · _ • · » · · _ • ·

Claims

104732

1. Menetelmä transplantaatiossa käyttökelpoisen solun tai kudoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, 5 että naamioidaan antigeeni, joka on mainitun solun pinnalla, saattamalla mainittu solu tai kudos kosketukseen komplementtiin sitoutumattoman vasta-aineisotyypin tai komplementtiin sitoutumattoman vasta-ainefragmentin kanssa, joka kykenee muodostamaan kompleksin mainitun solun tai kulo doksen pinnalla olevan mainitun antigeenin kanssa siten, että kun solu viedään eläimeen ihminen mukaanlukien mainitun solun hajoaminen estyy.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitelty solu on tarkoitettu vietä- 15 väksi ihmiseen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni, kun se on mainitun solun tai kudoksen pinnalla, kykenee saamaan aikaan T-lymfosyyttivälitteisen vasteen eläimessä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu solu tai kudos on saareke-solu.

. ,·. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni naamioidaan ! ! 25 vasta-aineen F (ab1)2-fragmentilla. • · · lii

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • · **··* n e t t u mainittu antigeeni on ·· · ί .* a) HLA-luokka I -antigeeni, ja mainitun eläimen sy- • · · : totoksista CD8+-lymfosyyttiä estetään naamioimalla olemasta 30 vuorovaikutuksessa mainitun solun pinnalla olevan mainitun :***: HLA luokka I -antigeenin kanssa; ··· b) LFA-3-molekyyli, ja mainitun eläimen sytotoksis-', ta CD2+-lymfosyyttiä estetään naamioimalla olemasta vuoro- [ / vaikutuksessa mainitun solun pinnalla olevan mainitun LFA- '«·' 35 3-molekyylin kanssa; tai « · • I i ·« « f M « * I I • > · 104732 c) ICAM-1 -molekyyli, ja mainitun eläimen sytotok-sista LFA-l+-lymfosyyttiä estetään naamioimalla olemasta vuorovaikutuksessa mainitun solun pinnalla olevan mainitun ICAM-1-molekyylin kanssa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu vasta-aine saadaan polyklo-naalisesta vasta-aineesta, joka on nostatettu mainittua antigeeniä vastaan.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-10 n e t t u siitä, että mainittu vasta-aine on monoklonaali- nen vasta-aine.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu tai kudos on peräisin haimasta.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu antigeeni on HLA luokka I -antigeeni, LFA-3-antigeeni tai ICAM-1-antigeeni.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu tai kudos on ih- 20 missolu tai -kudos tai sian solu tai kudos.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu on peräisin ai- , ,·, voista, lihaksesta, sydämestä, maksasta, munuaisesta, keuh- kosta tai suonesta. ; ; 25

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, • · · tunnettu siitä, että mainittu antigeeni, kun se on • · *·.·’ peräisin munuaisesta, on HLA luokka I -antigeeni, joka on • · t : V naamioitu anti-HLA luokka -vasta-ainefragmentilla. ~ * * f V*

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine, kun mai- ' nittu antigeeni on peräisin munuaisesta, on anti-HLA luokka • · · I -vasta-ainefragmentti.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu tai kudos lisäk-35 si saatetaan kosketukseen toisen komplementtiin sitoutumat-toman vasta-aineisotyypin tai toisen vasta-aineen komple-.. menttiin sitoutumattoman fragmentin kanssa.