JP2002104998A - 移植可能な組成物 - Google Patents

移植可能な組成物

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JP2002104998A JP2001222108A JP2001222108A JP2002104998A JP 2002104998 A JP2002104998 A JP 2002104998A JP 2001222108 A JP2001222108 A JP 2001222108A JP 2001222108 A JP2001222108 A JP 2001222108A JP 2002104998 A JP2002104998 A JP 2002104998A
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cell
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、移植組織を持つ動物による拒絶反
応を阻止する物質を提供する。 【解決手段】 レシピエントの動物による、移植された
組織の拒絶反応を阻害する物質であって、細胞を溶解す
ることなしに抗原による細胞と動物のＴリンパ球との相
互作用を防ぐために、動物内でＴリンパ球による応答を
惹き起こすことが可能な組織の細胞表面に抗原が存在す
るとき抗原の修飾排除又は隠蔽することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、組織の移植、例
えば、島細胞や筋肉細胞又は全臓器の、そのような組織
を必要としているホストである真性糖尿病の患者もしく
はその危険性のある患者や筋ジストロフィーの患者そし
て臓器移植を必要としている患者への移植、に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】真性糖尿病は、一般に多い先天性疾患で
あり、インスリン欠損によって特徴付けられる。これ
は、血糖値の正常な制御を妨げ、そして高血糖やケトア
シドーシスを導く。
【０００３】インスリンはペプチドホルモンであり、グ
ルコースの利用、タンパク合成、中性脂肪の形成や蓄
積、そして何種かの細胞の成長を促す。インスリンは膵
臓のランゲルハンス島内のβ細胞によって作られる。若
年性糖尿病（１０−２０％）は、自己免疫反応によるβ
細胞の完全な破壊によって引き起こされる。成人型糖尿
病はいくつかの原因がある。しかし、多くの場合、β細
胞のインスリン分泌に欠陥がある。一般にブタ又はウシ
のインスリンを用いたインスリン注射療法は、重度高血
糖やケトアシドーシスを妨げることができるが、しかし
完全に血糖値を正常にすることはできない。
【０００４】注射療法は大変成功している一方、糖尿病
の第一の罹患率を有する未成熟な血管の劣化は防ぐこと
ができない。毛細血管変性や、アテローム性動脈硬化病
の進行の両方を含む糖尿病性の血管劣化は、結局、腎臓
疾患や網膜芽腫劣化、狭心症、心筋硬塞、末梢神経症そ
して動脈硬化症を引き起こす。
【０００５】最近、ヒトインスリンをコードする遺伝子
のクローニングによって、ヒトインスリンの大量生産が
可能となった。ヒトインスリンは、より良い治療法とし
て、ウシインスリンやブタインスリンにとって代わり始
めている。ヒトインスリンの利用は、インスリンの他の
型や、インスリン耐性を媒介する抗体を含んでいること
及び非ヒトインスリンのわずかに異なる構造から生じる
アレルギー反応に関係したいくつかの問題を排除した。
こうした利点にも拘らず、ヒトインスリン治療は血管劣
化を妨げることができなかった。
【０００６】活動量日常の飲食物、時刻そして他の事前
にプログラムした因子に基づいて、異なるインスリン量
を与えることができるインスリン注入ポンプが開発され
た。このような装置は、血糖値制御を改善するが、それ
らもまた血管劣化を防ぐことはできない。
【０００７】膵臓の一部もしくは全ての外科的な移植
は、糖尿病にとって本質的に最も良い治療であると考え
られている。しかしながら、膵臓は繊細で複雑な臓器で
あり、そしてヒトのドナーにとってその一部のみを与え
ることは不可能であり、唯一使用できるのは死去したド
ナーであるため、好結果の移植は難しい。更に、膵臓の
わずかな部分であるランゲルハンス島のβ細胞のみがイ
ンスリンを生産し、その残りの膵臓は、移植の拒絶反応
の重要な標的となる。ランゲルハンス島は、膵臓から分
離しても、栄養シグナルに応答し適切な量のインスリン
を分泌することから、ランゲルハンス島のみの移植は理
想的なゴールである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】糖尿病の治療としての
移植療法に関する主な問題は、現在の方法では一生涯免
疫抑制剤の投与を必要とすることにある。これらの薬剤
は、感染に対し感受性を高めたり、腎臓疾患、高血圧そ
して腫瘍成長を導く可能性がある。
【０００９】これらの深刻な副作用にもかかわらず、小
島移植は実験動物によって幸運にも為し遂げられた。げ
っ歯動物における成功した移植は、正常な血糖値の制御
を回復し、そして更に血管の劣化を防ぐことが示され
た。糖尿病の治療として、同種間の組織移植、異種間の
組織移植が更に広く応用されるようになるかどうか、移
植の拒絶反応を防げるかどうかにかかっている。移植前
に小島を培養することによって免疫源が下げられ、移植
の生存者が増加することが以前から知られている。長期
培養によって、細胞性免疫や、移植の拒絶反応に対する
初期の刺激物質であるＩａ提示リンパ細胞が取りのぞか
れることことが知られている。ファーストマン（Ｆａｕ
ｓｔｍａｎ）らは、小島細胞がＩａ抗原提示基を欠き、
その表面にクラスＩ抗原を提示していることを見出した
（J. Exp. Med. 151:1673, 1980 ）。このことにより、
ファーストマンらがドナー特異性抗Ｉａ血清や、小島に
おけるＩａ提示リンパ細胞を完全に破壊する補体を用い
た方法を開発することが可能になった。そして移植は、
主要組織適合の障害を越えて非免疫抑制糖尿マウスの作
成を可能にした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、移植組織を持
つ動物による拒絶反応を阻止する物質を提供する。この
阻害物質は、組織細胞の表面に存在し、動物においてＴ
リンパ球が起因する反応を引き起こし得る抗原を修飾、
削除又は被覆することに関与するものである。抗原の修
飾、削除又は被覆は、細胞と動物のＴリンパ球間の抗原
に起因した相互作用を、細胞の溶解を伴わずに阻止す
る。移植に用いる組織（“ドナー”組織）細胞は、それ
らの表面にＨＬＡクラスＩ抗原（主要組織適合複合体抗
原のいくつかのクラスのうちの一つのメンバー）を持っ
ている。これらの抗原は、受容体において細胞毒性Ｔ細
胞を活性化し、いくつかの連続した活性化段階を経て、
最終的にドナー細胞の溶解を引き起こす。このカスケー
ドは、宿主の細胞特性Ｔ細胞上のＣＤ８リセプターを、
ドナーの細胞上のＨＬＡクラスＩ抗原間の非特異的な複
合体形成によって始められる。複合体形成は、Ｔ細胞に
よる溶解は、結果としてドナー細胞の死を招く。この溶
解の過程は、同種間の移植でさえ拒絶によって起こり得
る。この発明によると、この問題はドナー細胞上のＨＬ
ＡクラスＩ抗原の被覆、修飾又は削除によって解消さ
れ、従って細胞溶解カスケードを導くＣＤ８−ＨＬＡク
ラスＩ抗原相互作用は生ずることができなくなる。
【００１１】以下に、更に詳細について説明する。この
発明によると、ドナー細胞の表面上のＴ細胞リセプター
と相互作用をする抗原は、好都合に修飾削除又は被覆さ
れ得る。そのためこの発明は、同種間の組織や臓器の移
植だけでなく、異種間の組織移植も同様に可能にし、ヒ
ト患者に移植するためにヒト以外の動物での供与臓器や
組織の生産の可能性を広げる。
【００１２】被覆因子が供与細胞抗原に対する抗体のＦ
（ａｂ´）2 フラグメントである。これらのフラグメン
トは、抗原と免疫複合体を形成することが可能であり、
そのため、抗原−Ｔ細胞相互作用を妨げる一方、それら
は抗体のＦｃ部位を取り除かれているため、補体と結合
できず、従って細胞溶解も導かない。たとえこのような
Ｆ（ａｂ´）2 フラグメントが、供与細胞上の抗原部位
を永久に被覆するに十分なほど強固に結合するとは限ら
ないとしても、このような治療を受けた組織の長期の宿
主の需要性は得られるだろうということは予想される。
【００１３】以下に、更に詳細について説明する。ドナ
ー組織細胞上の拒絶反応を誘導する表面抗原は、被覆す
ることに加え、例えばキャッピングによる修飾や、ドナ
ー組織として用いられるトランスジェニック動物又は培
養の段階で遺伝的操作により全体的、部分的に削除する
ことはできる。
【００１４】この発明のその他の特性や有利性は、次の
実施形態の記述それから権利の主張より明らかになるで
あろう。
【００１５】
【発明の実施の形態】供与組織の調製 この発明の特別な例の詳細について述べる前にこの発明
のいくつかのパラメータについて短く論じる。
【００１６】供与組織 小島細胞の移植を可能にするのに加えこの発明は他の組
織や臓器例えば腎臓心臓肝臓肺脳そして筋肉組織の移植
をも容易にすることが可能である。
【００１７】抗原の被覆修飾又は削除 この発明はいかなるＴ細胞と相互作用を持ついかなる供
与組織の細胞上の抗原を覆い、修飾又は削除するのに用
いることが可能である。ＨＬＡクラスＩ抗原に加え抗原
というものは小島細胞を含む全ての実質細胞上でも見ら
れる。宿主のＴ細胞と相互作用して拒絶反応を導く他の
重要な供与細胞抗原はＬＦＡ−３やＩＣＡＭ−１であ
る。これらは宿主Ｔ細胞リセプターであるＣＤ２やＬＦ
Ａ−１と顕著に反応する。ＬＦＡ−３とＩＣＡＭ−１の
双方は心臓や腎臓のような移植臓器内の血管を構成して
いる内皮細胞上で見られる。これらの抗原を被覆、修飾
そして削除することはＣＤ２＋，ＬＦＡ−１＋宿主Ｔリ
ンパ球によるこれらの抗原の認識を妨げ、それによって
いかなる欠陥を含んだ組織の移植も容易にするであろ
う。更に特定のドナー細胞抗原の被覆、変性、そして削
除をすることは１つ以上のドナー細胞のタイプに対する
拒絶反応の感受性を低くするかもしれない。例えばＨＬ
ＡクラスＩ抗原を持つ小島細胞のような実質細胞を処理
するだけでなくこのような抗原を持つリンパ球をも同様
に行う。そしてもしもこのようなリンパ球がドナー組織
の調製内に存在する場合、ＨＬＡクラスＩ抗原の除去又
はＨＬＡクラスＩ抗原被覆因子で組織を処理することで
それらリンパ球の抗原性を低くする。
【００１８】ＨＬＡクラスＩ，ＬＦＡ−３そしてＩＣＡ
Ｍ−１抗原は十分特性が明らかにされている。そしてこ
れらの抗原に対する抗体は公的に手に入り、そして常法
によって作ることが可能である。例えば抗ＩＣＡＭ−１
はメイン州ＡＭＡＣ Ｉｎｃ．より購入することができ
る。抗ＬＦＡ−３を産生するハイブリドーマ細胞はメリ
ーランド州ロックビル、the American Type Culture Co
llectionより購入することができる。
【００１９】移植されるドナー組織は１つ以上のＴ細胞
と相互作用する抗原を持つことから、例えば２又はそれ
以上の被覆因子による処理が同時に使用されるだろう。
または、それに代わって、ドナー組織に対して作られた
ポリクローン抗血清がドナー組織の多数の細胞表面抗原
を被覆するのに使用されるであろう。
【００２０】非細胞溶解被覆因子 一般にこの発明は被覆因子の３つのカテゴリーを使用す
ることができる。（１）抗体又はフラグメント又は誘導
体、（２）可溶性のフラグメント又は抗原に特異的な宿
主Ｔ細胞リセプターの類似品、（３）Ｔ細胞リセプター
の抗原と結合する部位と類似の合成誘起性物質
【００２１】抗体、現在最も良い被覆因子は１つ又はそ
れ以上の抗原に特異的な調製品もしくは全ドナー臓器又
は組織抗血清調整品として使用することができる。どち
らの場合においても標品は補体と結合できず従ってドナ
ー細胞の溶解は導かない。補体との結合は抗体のＦｃ部
位の削除や補体に結合できないアイソタイプ抗体又はさ
ほど良くはないが補体結合を阻止する薬剤を連結した補
体結合抗体を用いることによって妨げることができる。
【００２２】個々の抗原特異的抗体は常法によって作る
ことができる。動物例えばマウスを被覆された抗原で免
疫し、次いでハイブリドーマの調製、常法に従った抗体
のスクリーニングと続くが、その代わりに全ドナー抗血
清もまた使用できるであろう。例えばドナー組織はブタ
由来であり全ブタ抗血清はブタのドナー組織又はブタリ
ンパ球でマウスを免疫し、次いでヒトＴリンパ球とブタ
ドナー細胞との癒着を阻止する抗体をスクリーニングす
ることによって作られる。
【００２３】抗体や抗体のフラグメントの代わりとし
て、被覆はドナー組織細胞抗原とＴ細胞との結合を競合
的に阻止する可能性のある宿主Ｔ細胞リセプターの使用
や、さもなければ宿主Ｔ細胞と相互作用する組織上の抗
原部位を埋めることによって成されるであろう。Ｔ細胞
分子はタンパク例えばＣＤ８，ＣＤ２そしてＬＦＡ−１
はよく特徴の判っているタンパクであり、一般的に細胞
外領域、膜貫通領域そして標的細胞リガンドと結合する
細胞質領域とに分けられる。可溶性Ｔ細胞リセプタータ
ンパクフラグメントは組換えＤＮＡの常法によって作る
ことができる。膜貫通領域そして細胞質領域をコードし
たＤＮＡを欠失させ細胞外領域ＤＮＡが組換え細胞内で
発現し可溶性の組換えタンパクを産生する。
【００２４】キャッピング キャッピングとは、抗体を用いて表面抗原の凝集や失活
を引き起こすことを表した言葉である。最初、組織は抗
原に対する特異的な抗体と接触することで抗原抗体免疫
複合体を形成する。次の段階は、２番目の抗体が組織と
接触し最初の抗体を持つ免疫複合体を形成すると、最初
の抗体は細胞表面上の１点に凝集しキャップを形成す
る。この技術は良く知られており、そしてテイラー（Ｔ
ａｙｌｏｒ）ら（１９７１）、Ｎａｔ． Ｎｅｗ Ｂｉ
ｏｌ．２３３：２２５−２２７、そしてＳａｎｉｓｏら
（１９８６），Ｂｌｏｏｄ，６７：３４３−３４９で述
べられている。例えば、ＨＬＡクラスＩ抗原を持つ小島
細胞の場合において最初の段階は細胞をＨＬＡクラスＩ
に対する抗体（例えばＷ６／３２抗体，以下に述べられ
ている）と培養し、それらドナーに対する抗体、例えば
ヒツジ抗マウス抗体と培養し凝集を起こさせる。
【００２５】ＨＬＡクラスＩ発現の減少したトランスジ
ェニック動物 移植前にドナー組織細胞上の表面抗原を被覆するのに代
わる、もしくは付加するものとして、遺伝学的に編成さ
せ表面抗原発現を抑えられたトランスジェニック動物に
おいて、このような組織は生育することが可能である。
このようなトランスジェニック動物は、標的抗原をコー
ドした遺伝子を欠失又は不活化するか、もしくは細胞表
面上の発現に必要な遺伝子の欠失又は不活化した遺伝子
を用い、相同組換えによるトランスジェニックの常法に
よって作ることができる。
【００２６】例えば、ＨＬＡクラスＩの発現の場合にお
いて相同組換えとはＨＬＡクラスＩ分子自身の欠失又は
不活化するか、もしくはその表面の発現に必要な分子を
不活化又は欠失する、どちらかを用いることができる。
ＨＬＡクラスＩ分子は３２Ｋｄと４５Ｋｄ鎖からなるタ
ンパクであり、もう一つのタンパクβ−２マイクログロ
ブリンと関連がある。このβ−２マイクログロブリンタ
ンパクとの高い保存性は原形質膜でのクラスＩの集合を
促すキャリア分子として機能していると考えられてい
る。
【００２７】そのため、例えば小島細胞の表面上のクラ
スＩ発現の阻止はＨＬＡクラスＩ鎖の一方を欠失又は不
活化するかもしくはキャリアβ−２マイクログロブリン
分子の欠失又は不活化によって成すことができる。トラ
ンスジェニック動物におけるβ−２マイクログロブリン
の発現の破壊が結果としてＨＬＡクラスＩの発現を減少
させたことはいくつかのグループによって成し遂げられ
ている（Koller and Smithies (1989), PNAS USA 86:89
32-8935; Zijlstra et al. (1990) Nature, 344:742-74
6; Doetschman et al. (1987) Nature, 51:503-512）。
【００２８】ＨＬＡクラスＩ発現を減少させる試験管内
方法 数種の腫瘍ウィルスは感染細胞においてＨＬＡクラスＩ
発現の減少が示された。Travers et. (1980) Int'l. Sy
mp. on Aging in Cancer, 175-180;Rees et al. (1980)
Br. J. Cancer, 57;374-377これに加えてＨＬＡクラス
Ｉ発現におけるこの影響はウィルス染色体のフラグメン
トを用いても可能であることが示された。アデノウィル
スのフラグメントを用いた培養腎臓細胞の感染は表面の
ＨＬＡクラスＩ抗原の発現を排除する（Whoshi et al.
(1988) J. Exp. Med. 168:2153-2164 ）。例えばドナー
細胞の表面上のＨＬＡクラスＩの発現を減少させる目的
としてウィルスフラグメント、これは非感染性であり、
併発症を引き起こすと考えられる完全なウィルスを用い
るよりも好ましい。他のウィルスやウィルスフラグメン
トは小島細胞のような実質細胞上のＨＬＡクラスＩ発現
を減少させたのと同様にドナー細胞の他のタイプの他の
表面抗原の発現の減少に使用できるであろう。
【００２９】分泌ドナー抗原を用いた受容体Ｔ細胞リセ
プターの部分的封鎖 以上述べられてきた移植阻止の方法は受容体のＴ細胞上
のリセプターによって外来因子として認識されるドナー
組織細胞上の表面抗原を削除、修飾又は被覆するという
ような全てドナー組織を編成させることに関するもので
あった。それに代わる方法は、異なる方法でドナー組織
を修飾することである。その方法はドナー組織から分泌
する抗原によって宿主Ｔ細胞リセプターを塞ぐことによ
って行う。例えば、ＨＬＡクラスＩ表面抗原を持つ実質
細胞を含んだドナー組織の場合、抗原を覆うことよりも
むしろ、それらの細胞は可溶性抗原をコードしているＤ
ＮＡを導入されることができる。可溶性抗原は分泌して
受容体のＴリンパ球上のＣＤ８リセプターと競合的に結
合するというよりはむしろ、ドナー組織細胞上の膜結合
性ＨＬＡクラスＩ抗原と結合するであろう。この方法の
技術はインスリン分泌と共に組換えタンパクを分泌させ
ると以下の研究者において用いられた方法とにているで
あろう（Lo et al. (1988) Cell, 53:159-168; Adams e
t al. (1987)Nature, 325:223-228）。Adams らは小島
細胞でのＳＶ４０ Ｔ抗原合成をインスリン産生と協調
して行った。ＨＬＡクラスＩ抗原の発現や分泌は、ＨＬ
ＡクラスＩ抗原の１つ又は療法のサブユニットに対する
遺伝子をインスリン遺伝子制御配列下に置くことによっ
てインスリン産生や分泌と連動するであろう。そのため
インスリン分泌は結果としてＨＬＡクラスＩ抗原の発現
と分泌と同時に行われるであろう。この方法は他のいか
なる細胞でもインスリン産生や分泌がみられないのと同
様に他のタイプの細胞が含まれているかもしれない組織
において小島細胞のみからＨＬＡクラスＩ抗原の分泌が
行われるという利点がある。加えてこのアプローチは、
可溶性ＨＬＡクラスＩ抗原を必要としている場所、例え
ば移植した小島細胞のすぐ周辺の領域に限定できる。
【００３０】
【実施例】次の特定の例は図解を目的としただけのもの
であり、この発明の範囲を限定しているものではない。
【００３１】実施例１ 本実施例は、ＨＬＡクラスＩ陽性のヒト島細胞を免疫抑
制されていないＢａｌｂ／ｃマウスに移植することに関
係する。ドナーの抗原を隠蔽する（マスク）ために、新
たに単離されたヒト島細胞を移植に先立って完全なモノ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体のＦ（ａｂ´）
2 フラグメントで処理する。Ｆ（ａｂ´）2 は抗体のＦ
ｃ領域を欠いており、こうして抗原が結合したときの複
合体によるキリングを避ける。完全なイムノグロブリン
をコントロールとして用いた。ヒト島細胞を対応するＨ
ＬＡクラス１モノクローナル抗体（Ｗ６／３２）（Amer
ican Tissue CULTURE Society ）（Barnstable et al.
(1978) Cell, 14:9-20）又は対応しないＣＤ２９モノク
ローナル抗体（Coulter Corporation, Hialeah, F1）で
処理する。正常なヒト島細胞調製物は生育し過ぎた内皮
細胞や繊維芽細胞を含まず、ＩＣＡＭ−１を発現せず、
ＣＤ２９を発現せず、ＬＦＡ−３を低レベルに発現し、
ＨＬＡクラスＩ抗原はポジティブである（図１）。それ
ゆえ他の細胞傷害性Ｔリンパ球と異なって重要な接着エ
ピトープであるＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１の顕著な発
現を欠き、そのためこれらの接着エピトープをＴ細胞の
結合から保護する必要がほとんどない。
【００３２】Ｆ（ａｂ´）2 フラグメントは、固定化し
たペプシンを用いて得られた。精製した抗体２０mg/ml
をｐＨ４．７の切断緩衝液中に加え、３７℃の振とう水
浴（Pierce Chemical, Rockford, IL ）の中でＣＤ２９
抗体は４．５時間、Ｗ６／３２抗体（ＨＬＡクラスＩ）
は４．０時間切断した。粗切断物をペプシンから除去し
直ちにｐＨ７．０の結合緩衝液中で中性化した。この抗
体混合物を固定化したプロテインＡカラムにかけ、Ｆ
（ａｂ´）2 フラグメントを含む溶出画分を集めた。切
断物から混入しているＦｃフラグメントを取り除くため
に分子量５０，０００用の切断したチューブを用い、Ｐ
ＢＳに対して２４時間透析した。透析バッグの中に１０
ｍＭになるようにＣＨＡＰＰＳを加えた。切断とＦ（ａ
ｂ´）2 フラグメントの精製とをモニタするために１５
％ＳＤＳゲルを銀染色した。フラグメントの最終精製は
セファロース１２カラム（Pharmacia, Upsala, Sweden
）を用いてＨＰＬＣを行った。
【００３３】Ｆ（ａｂ´）2 フラグメント又は完全な抗
体１μｇをヒト島細胞約１×１０6と室温で３０分間イ
ンキュベートした。インキュベートの後、処理済みの、
又は未処理の島細胞を２％ＦＣＳを含むハンクス緩衝液
で１回洗浄し、直ちに腎小体の下にシリンジで注入して
移植する。用いたヒト島細胞は単離後４日以内に移植す
る。１０週令から１２週令のメスのＢａｌｂ／ｃマウス
（The Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine ）に
２２００から４５００個のヒト島細胞を移植した。移植
後３０日又は２００日後にマウスを頸部脱臼により殺害
し、移植組織を含む腎臓を外科的に取り除き、直ちにＢ
ｏｕｓｉｎ´ｓ溶液中に固定した。
【００３４】移植の研究の結果を表１に示す。ドナーの
組織片である島細胞（ＨＬＡクラスＩ）をＷ６／３２Ｆ
（ａｂ´）2 で予め処理すると移植後３０日後５体の全
てのレシピエントの中で島細胞移植片が完全に生存して
いた（１群）。同様に、移植後２００日後でも５体の全
てのレシピエントの中で完全に生存していた。組織学的
には、１０体全てのマウスの中で腎小体下で高度に顆粒
化した島細胞が観察された（図１Ａ、１Ｂ）。未処理の
ヒト島細胞はこのマウスの中では７日間のうちに直ちに
拒絶された。移植片にはこれらのマウスの中で腎小体の
中に塊状のリンパ球の侵入が観察され、顆粒状の島細胞
は観察されなかった。ＨＬＡクラスＩＦ（ａｂ´）2 で
処理した島細胞移植片（Ｗ６／３２）は視覚的には移植
後２００日経っても隣接するリンパ球の塊に固定されて
いない（図１Ｂ）。
【００３５】完全なＨＬＡクラスＩ Ｗ６／３２抗体で
予め処理した島細胞移植片を導入したＢａｌｂ／ｃレシ
ピエントには移植後３０日又は２００日後生存している
島細胞移植片は観察されなかった（３群，４群）（表
１）。これは恐らく、完全で未切断の抗体の完全な結合
と溶解とを示している。これらの移植片は、移植部位で
嚢状の腎繊維を形成していた（図１Ｃ）。ドナーの島細
胞を対応しないＣＤ２９に対応するＦ（ａｂ´）2 フラ
グメントで処理した場合は２００日後（６群）の場合と
同様に３０日後（５群）までに島細胞移植片の拒絶が観
察された。完全なＣＤ２９抗体でも島細胞移植片の生存
を長引かせることはできなかった（７群，８群）。ドナ
ーのヒト島細胞を特異的なＨＬＡクラスＩ Ｆ（ａｂ
´）2 抗体フラグメント（Ｗ６／３２）及び対応しない
ＣＤ２９ Ｆ（ａｂ´）2 抗体フラグメント（ＣＤ２
９）で処理した場合はＨＬＡクラスＩ Ｆ（ａｂ´）2
フラグメント単独で観察された場合と同様に３０日後
（９群）及び２００日後（１０群）５体のレシピエント
全ての中で組織片が生存していた。予想された通りに未
処理のヒト島細胞は３０日後（１１群）及び２００日後
（１２群）とも存在しなかった。ただ、これらのレシピ
エント中には嚢状の腎繊維のみが３０日後（図１Ｃ）及
び２００日後に腎小体の下に存在していた。
【００３６】移植されたヒト島細胞の機能は移植後３０
日及び２００日に起こるインスリンＣ´ペプチドのレベ
ルを測定することによって調べた（表２）。Ｗ６／３２
Ｆ（ａｂ´）2 処理したヒト島細胞又はＷ６／３２
Ｆ（ａｂ´）2 及びＣＤ２９Ｆ（ａｂ´）2 で処理した
島細胞を導入した２０体全てのレシピエントには、３０
日後にバックグラウンドレベルより非常に高いレベルの
ヒトＣ´ペプチドが検出された（１，２，９，１０群）
（ｐ＝．００２）。Ｗ６／３２Ｆ（ａｂ´）2抗体で処
理した島細胞を導入した１０体全てのレシピエントにお
いても、２００日後にヒトＣ´ペプチドレベルは同程度
に検出された（２，１０群）（ｐ＝．００３）。これと
は対照的に、コントロールの移植群は全てヒトＣ´ペプ
チドレベルはバックグラウンドと同レベルであった
（３，４，５，６，７，８，１１，１２群）（ｐ＝．９
８）。
【００３７】実施例２ 本実施例は、ポリクローナルなＦ（ａｂ´）2 で予め処
理した移植組織の生育に関する移植片特異的な耐性の可
能性を調べるためにラットインスリノーマ腫瘍細胞（Ｒ
ＩＮ）を免疫抑制されていないＢａｌｂ／ｃマウスレシ
ピエントに移植することに関する。
【００３８】ＲＩＮ腫瘍細胞は樹立されたインスローマ
腫瘍細胞株（Ｐ１７．１）である。ポリクローナルなマ
ウス抗−ＲＩＮ血清を調製しＦ（ａｂ´）2 抗体フラグ
メントは実施例１に示した方法によって精製した。期待
通りに免疫抑制されていないＢＡＬＢ／ｃのマウス腎小
体の下に移植された異種移植片であり、ＲＩＮ細胞（レ
シピエントあたり５０００細胞）が一様に拒絶されるこ
とはアルデヒドフクシン染色による組織学的な観察によ
って明らかになった（ｎ＝４）（表３）。加えて、移植
に先立って完全に固定するＦｃ領域の除去をしていない
完全なポリクローナルのマウス抗−ＲＩＮ抗体で予め処
理したＲＩＮ細胞もレシピエントによる拒絶反応から移
植片を保護することはできなかった（ｎ＝４）。対照的
に、マウス抗ＲＩＮポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ´）2
フラグメントでＲＩＮ細胞を予め処理した場合はＲＩＮ
細胞が移植後１，２，３及び４カ月間生存することが可
能であった。それぞれのＢＡＬＢ／ｃのレシピエントは
移植時に同じ数の細胞を導入されたけれども、移植後異
なった月間隔で腎小体下の移植部位を通る一連の区画に
腫瘍組織の増加が顕著に認められ、これは腫瘍の増殖を
示唆している。加えて、移植に成功したＲＩＮ細胞は、
ヘマトキシリン及びエオシン染色により有系分裂をして
いることが示され、このことにより細胞分裂を行ってい
ることが、また恐らくは隠蔽されていない新しい外来抗
原の発現を確証するものである。異種組織片である腫瘍
細胞株が生存し続けること及び拡がることは移植片がレ
シピエントの耐性を誘導する可能性が存在することを示
唆する。Ｆ（ａｂ´）2 処理したＲＩＮ細胞を未処理の
ＲＩＮ細胞を左の腎臓に二次的に移植する３０日前に免
疫抑制されていないマウスの片側の右の腎臓に移植する
ことによって移植片の耐性に対する更なる証拠が得られ
た。６０日後この方法によって移植された４体のマウス
を殺害した。未処理の二次的なインスリノーマ細胞の移
植片は４つとも生存しており、このことは新たな腫瘍細
胞が生存するための十分な耐性のシステムが存在すると
いう推測を裏付ける。
【００３９】実施例３ 異種移植片中の非腫瘍性のヒト肝細胞の拒絶を防ぐため
のＦ（ａｂ´）2 ＨＬＡクラスＩ抗体処理の効果につい
ても調べた。肝実質組織から得た約５０００個の新鮮な
ヒト肝細胞を免疫抑制されていないマウスレシピエント
の腎小体の嚢状部分に注入した。嚢状部分のＰＡＳ染色
による組織学的な実験によりＦ（ａｂ´）2 処理した肝
細胞の５体全ての移植レシピエントにおいては、移植後
３０日後に生存している肝細胞が嚢状部分に存在してい
ることが容易に観察された。予想通りに未処理のヒト肝
細胞が５体全てのマウスにおいて移植後３０日までに一
様に拒絶されていた。
【００４０】
【発明の効果】実施例１及び３の結果から、外来性のＨ
ＬＡクラスＩ抗原決定基を隠蔽してレシピエントのＴ細
胞による認識を単純に阻害することによって、異種移植
片の生存が２００日まで延びることが明らかである。こ
の新しい戦略はレシピエントの処理を排除し、こうして
宿主の免疫応答を保ち、問題とされる病原体の認識が可
能なまま保持することができる。
【００４１】いずれは隠蔽抗体を失う可能性のある、あ
るいは新たな処理されていないＨＬＡクラスＩ抗原決定
基を新たに合成する可能性を示すかもしれない生存する
組織に対してレシピエントが反応性を示さない期間を延
長することによって、移植片特異的な耐性がこれらの移
植を安定化する可能性が示唆される。このことは移植が
成功した組織片においてリンパ球の侵入による大きなフ
ォーカスが欠如していることによって立証される。この
ことはＨＬＡクラスＩ抗体フラグメントで実質組織の島
細胞上のクラスＩ抗原ばかりでなく一時的なドナーとな
る樹状突起細胞上のクラスＩ抗原をコートするという移
植片の前処理についての推定と一致する。移植後の時間
の経過に伴って潜在的な移植片拒絶反応のイニシエータ
ーである抗原提示細胞が死ぬ、更に培養を続けることに
よってレシピエントを抗原を提示していない細胞上のＨ
ＬＡクラス抗原のレベルの低い細胞に徐々に晒すことが
できる。
【００４２】その他の具体例 その他の具体例は、続く特許請求の範囲中に示す。例え
ば、島細胞や肝細胞を処理する上に記述した方法は次に
示すように筋ジストロフィー患者に移植する筋肉細胞の
処理にも用いることができる。すなわち、筋肉細胞は島
細胞と同様に拒絶を促進するＨＬＡクラスＩ抗原を産生
し又クラスＩＩ抗原をも発現している。ヒトのドナーの
筋肉細胞は生きているドナーの、又は脳死したドナーの
１４−１６ゲージの切断トローカルを用いた１ないし２
インチ皮膚を切開する生検によって得られる。新鮮な筋
肉をコラーゲナーゼやトリプシンを用いて懸濁液になる
ように早く消化し３７℃で静置する。浮遊細胞片をピペ
ットで取り除きメディウム洗浄し１０００ｒｐｍ×１０
分間遠心した後、生細胞の数を数える。この細胞数測定
はＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ抗体フラグメントの加
えるべき量を見積もるのに用いられる。この処理は島細
胞に対する上に記述した方法に従う。同様に本発明は、
健康な固体又は遺伝学的な処理を施した細胞を特定の細
胞の構成要素が欠陥したレシピエントに導入することを
可能にする。例えば、血友病患者は第VIII因子を産生す
る健康なドナー由来の肝細胞又は第VIII因子を分泌する
ように遺伝学的な処置を施した細胞のレシピエントにな
り得る。
【００４３】本発明のもう一つの具体例は完全な内蔵
（例えば心臓、肺、肝臓、腎臓）の患者への移植にもあ
り得る。好ましい臓器の前処理の方法はドナーの臓器を
モノクローナルな抗原特異的抗体のＦ（ａｂ´）2 フラ
グメントで、又は臓器の組織に対して精製されたポリク
ローナルな抗血清で覆うことに関する。すなわち、これ
は他の液体でドナーの臓器を覆うという共通な技術によ
って達成される。
【００４４】
【表１】 ドナーのヒト移植片を移植に先立ってＨＬＡ
クラスＩ（Ｗ６／３２）又はＣＤ２９抗体又はＦ（ａｂ
´）2 で隠蔽したときの移植の結果 群 島細胞組織の処理° 移植後の日数＊ 成功例／総数＋ １ W6/32 F(ab')2 ３０日 ５／５ ２ W6/32 F(ab')2 ２００日 ５／５ ３ W6/32 抗体 ３０日 ０／５ ４ W6/32 抗体 ２００日 ０／５ ５ CD29 F(ab') 2 ３０日 ０／５ ６ CD29 F(ab') 2 ２００日 ０／５ ７ CD29 抗体 ３０日 ０／５ ８ CD29 抗体 ２００日 ０／５ ９ W6/32 F(ab')2 +CD29 F(ab')2 ３０日 ５／５ １０ W6/32 F(ab')2 +CD29 F(ab')2 ２００日 ５／５ １１ 未処理 ３０日 ０／５ １２ 未処理 ２００日 ０／５ ＊ＢＡＬＢ／ｃマウスにヒト島細胞を移植してから殺害
するまでの日数を示す。 °正常なヒト島細胞調製物はクラスＩ抗原を発現してい
るが、ＣＤ２９決定基を欠いている。 ＋この割合は移植を行った数に対して成功した数を表
す。島細胞移植片の生存率はヘマトキシリンにより又エ
オシン染色によりリンパ球の侵入を、及びアルデヒドフ
クシン染色によってベータ細胞を検出した。アルデヒド
フクシンは高度に顆粒化したベータ細胞を紫色に染色し
ヘマトキシリン及びエオシンはリンパ球を黒色に染め
る。本明細書中においては、腎小体の下でリンパ球のフ
ォーカスを欠く高度に顆粒化した島細胞が容易に判る。
本明細書中において、拒絶反応は大きなリンパ球の蓄積
及び／又は島細胞を欠く嚢状の繊維症を起した移植部位
によって示される。
【００４５】
【表２】 ヒトＣ´ペプチドレベルによって評価される
ヒト島細胞異種移植片の機能
【００４６】
【表３】 ＲＩＮインスリノーマ細胞の免疫抑制されて
いないＢＡＬＢ／ｃレシピエントへの移植ドナーＲＩＮの処理 解剖による組織学的な結果 未処理 ＲＩＮ細胞を欠く４匹全てのマウスは１，２，３，４ か月後に移植部位に嚢状繊維症が見付かった。 抗ＲＩＮ−抗体 ＲＩＮ細胞を欠く４匹全てのマウスは１，２，３，４ か月後に移植部位に嚢状繊維症が見付かった。 抗ＲＩＮ 移植後一連の解剖時期である１，２，３，４か月後に F(ab')2 フラグメント ４匹のマウス全てにＲＩＮ細胞の生存が確認された。 移植部位に僅かではあるが固定したリンパ球の侵入が 認められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、新たに分離した９９〜９７％精製総
ヒトランゲルハンス島のＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）
ＣＤ２９（４Ｂ４），ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）そして
ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）の提示を、間接免疫蛍光法やフ
ローサイトメトリーにより示しているグラフである。
Ａ．ヒト小島は、Ｗ６／３２抗体と３６％反応し陽性で
あった。Ｂ．ヒト小島は、ＣＤ２９に対し９％を示し陰
性であった。Ｃ．この高い精製度の標品において、小島
はＩＣＡＭ−１に対し１４％、実質的に陰性であった。
Ｄ．ヒト小島は、ＬＦＡ−３に対し実在の細胞の１０．
２％において示し、陰性であった。この実験において、
ヒツジ抗マウスＦＩＴＣのバックグラウンドは９％であ
った。死細胞や、破壊物の残骸を排除するための開かれ
た門は、フローサイトメトリーを用いることであった。
予想したように、多くの発育などの繊維芽細胞や、卵子
細胞を含んだ小島標品（精製度６０〜７５％）では、Ｌ
ＦＡ−３やＩＣＡＭに低い程度において陽性であった。
【図２】 図２はＢａｌｂ／ｃ受容体Ａの腎被嚢に移植
されたヒト小島の組織学的分析を示す一連の写真であ
る。Ａ．ＨＬＡクラスＩ Ｆ（ａｂ´）2 フラグメント
（Ｗ６／３２）で移植前処理を行った移植後３０日目の
ヒト小島移植組織の顕微鏡写真である。このアルデヒド
フクシン染色（Ｘ１００）は腎被嚢下の健全な粒状の小
島を示している。Ｂ．ＨＬＡクラスＩ Ｆ（ａｂ´）2
フラグメント（Ｗ６／３２）で移植前処理を行った移植
後２００日目のヒト小島移植組織の顕微鏡写真である。
このアルデヒドフクシン染色（Ｘ１００）は腎被嚢下の
健全な粒状の小島を示している。Ｃ．コントロールＢａ
ｌｂ／ｃマウスは未処理の新鮮なヒト小島を移植されそ
して３０日目で死んだ。この特徴的な顕微鏡写真は小島
の移植されたところに供与された小島が存在していない
ことと被嚢下に繊維芽細胞が存在していることを示して
いる。Ｄ．マウス膵臓におけるマウス小島のアルデヒド
フクシン染色は健全なβ細胞の特徴的な紫色の顆粒球の
産生を示している。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B065 AA91X AA93X AB01 AB10 BA01 BA08 BD13 BD50 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA942 ZC352 4C085 AA14 BB43 CC04 DD23 DD62 4C087 AA02 BB63 CA04 NA14 ZA36 ZA45 ZA81 ZC35

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 レシピエント動物のＴリンパ球が受容体
    分子を介してＴリンパ球による免疫反応を惹起し得る表
    面抗原を保持する移植細胞又は組織に対する前記動物の
    拒絶反応を阻害するための阻害物質であって、 前記物質が細胞又は組織を含み、 前記細胞又は組織において、レシピエント動物のＴリン
    パ球の受容体に結合し得る分泌性タンパク又はペプチド
    をコードするＤＮＡを発現させ、前記受容体を介する前
    記細胞又は組織へのＴリンパ球の結合を競合的に阻害す
    る、阻害物質。
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