FR2513882A1 - Lymphocytes luttant contre les cellules cancereuses, procede pour leur production et agents anticancereux contenant ces lymphocytes ou un antigene glyco-apparente - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES LYMPHOCYTES LUTTANT CONTRE LES CELLULES CANCEREUSES, UN PROCEDE POUR LEUR PRODUCTION ET DES AGENTS ANTICANCEREUX CONTENANT CES LYMPHOCYTES OU UN ANTIGENE GLYCO-APPARENTE; LES LYMPHOCYTES LUTTANT CONTRE LES CELLULES CANCEREUSES AGISSENT SPECIFIQUEMENT SUR LES CELLULES CANCEREUSES CONTENANT UN ANTIGENE GLYCO-APPARENTE DERIVANT DES CELLULES CANCEREUSES ET LES DETRUISENT.

Description

La présente invention concerne des lymphocytes luttant contre les cellules cancéreuses, un procédé pour leur production et des agents anticancéreux contenant ces lymphocytes ou un antigène glycoapparenté.

De façon générale, l'invention concerne des lymphocytes luttant contre les cellules cancéreuses (que l'on appelle ci-après "cellules tueuses") et un procédé pour leur production. Plus particulièrement elle concerne des cellules tueuses qui agissent de façon spécifique sur les cellules cancéreuses ayant un antigène glyco-apparenté dérivant des cellules cancéreuses (cet antigène est désigné ci-après par l'abréviation "GRA") et détruisent les cellules cancéreuses ainsi qu'un procédé pour produire ces cellules tueuses. De plus, l'inven- tion concerne un nouvel agent anticancéreux contenant les cellules tueuses ou un GRA comme ingrédient actif.

Les cellules provoquant la réponse immunitaire, en particulier les lymphocytes T qui jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire à médiation cellulaire, provoquent le rejet des greffons dû aux antigènes des cellules étrangères mais n'ont pas d'effet inhibiteur appréciable vis- -vis des cellules cancéreuses ou n'ont qu'un effet inhibiteur très limité. Donc, les cellules cancéreuses ne sont pas détruites et se multiplient in vivo pour finalement conduire a la mort l'hotte atteint d'un cancer.

Cependant, le mécanisme responsable de la reconnaissance des éléments "self" et "not-self" n'est pas totalement élucidé et diverses recherches ont été effectuées pour apporter des connaissances quant à la nature de la matière de base entrant en jeu dans ce système. Par exemple, des marqueurs de surface des cellules sur les cellules de leucémie de la souris ou des cellules de carcinome embryonnaire utilisant des lectines, telles que l'agglutinine de
Dolichos biflorus (DBA) et l'agglutinine d'arachide (PNA), comme décrit dans Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2), pages 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) pages 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 pages 473-481 (1981) et Cell 18 pages 183-191, septembre 1979.

Cependant, pour autant qu'on le sache actuellement, on n'a pas tenté d'obtenir de nouveaux lymphocytes qui puissent combattre spécifiquement les cellules cancéreuses et également des agents anticancéreux utilisant la réponse immunitaire des lymphocytes.

A la suite de recherches poussees concernant la réponse immunitaire de l'este aux cellules cancéreuses et son application au traitement du cancer, la demanderesse a découvert qu'un antigène spécifique des cellules cancéreuses qui n'est pas présent dans les cellules normales différenciées, qui est le GRA,agit comme un immunogène pour l'hôte et a une tres forte immunogénicité qui provoque une réponse immunitaire spécifique des cellules cancéreuses.De plus, la demanderesse a découvert que,lorsqu'on utilise le GRA pour sensibiliser des lymphocytes , on peut obtenir des cellules tueuses qui agissent de façon spécifique sur les cellules cancéreuses contenant du GRA et que > Si l'on administre les cellules tueuses a l'hte, elles reconnaissent le GRA et agissent sur les cellules cancéreuses contenant du GRA pour les détruire et présentent donc un excellent effet dans le traitement et la prévention du cancer.

Selon ses divers modes de réalisation, l'invention concerne
- des cellules tueuses ;
- un procédé pour produire des cellules tueuses ; et
- un agent anticancéreux contenant des cellules tueuses ou du
GRA comne ingrédient actif.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre et en se référant aux dessins annexés sur lesquels
- la figure I est une microphotographie de cellules cancéreuses
Daudi ;
- la figure 2 est une microphotographie illustrant la formation de plaques de lyse des cellules cancéreuses de la figure 1 par le GRA- ;
- la figure 3 est une microphotographie de cellules cancéreuses
KATO-III ;.

- la figure 4 est une microphotographie illustrant la formation de plaques de lyse des cellules cancéreuses de la figure 3 par le GRA-1-K-T
- la figure 5 est une microphotographie de cellules cancéreuses de BT-i ;
- la figure 6 est une microphotographie montrant la formation de plaques de lyse des cellules cancéreuses de la figure 5 par le GRA-I-K-T ;
- la figure 7 est une microphotographie de cellules cancéreases MKN-45;
- la figure 8 est une microphotographie montrant la formation de plaques de lyse des cellules cancéreuses de la figure 7 par le GRA-1-K-T;
- la figure 9 est une microphotographie de cellules cancéreuses MOLT;
- la figure 10 est une microphotographie montrant la formation de plaques de lyse des cellules cancéreuses de la figure 9
par le GRA-1-K-T;;
- la figure 11 est une microphotographie de BT-1 traité par un mélange de lymphocytes de sang périphérique humain non sensibilisés;
- les figures 12 et 13 sont des microphotographies d'un tissu cancéreux de souris cancéreuse à laquelle on a administré du GRA-M-1-K;
--la figure 14 est une microphotographie montrant l'état du cancer d'une souris cancéreuse d'un groupe auquel on a administré du GRA-H-l;
- la figure 15 est une microphotographie montrant l'état du cancer d'une souris cancéreuse d'un groupe auquel on n'a pas administré du GRA-M-1;
- la figure 16 est une microphotographie montrant le tissu cancéreux d'une souris cancéreuse d'un groupe auquel on n'a pas administré le GRA-M-1;
- la figure 17 est une microphotographie du tissu cancéreux du groupe auquel on a administré le GRA-M-1;;
- la figure 18 représente un diagramme d'électrophorèse du GRA sur gel de SDS utilisant la méthode CBB de coloration des protéines;
- les figures 19 à 21 représentent les diagrammes d'électrophorèse du GRA sur gel de SDS utilisant la méthode PAS de coloration du sucre;
- la figure 22 illustre schématiquement les résultats du diagramme d'électrophoràse du oeA sur gel de SDS utilisant la méthode GB de coloration des protéines. et
- la figure 23 représente un graphique montrant le taux de croissance de la tumeur chez des souris C3H/HE sur lesquelles on a transplanté des cellules de rate de souris immune X 5563 et des cellules X 5563.

L'invention va maintenant etre décrite de façon détaillée.

On peut préparer les cellules tueuses de l'invention par exemple selon un procédé dans lequel on utilise du oeA pour sensibiliser des lymphocytes.

Le GRA que l'on utilise dans le procédé ci-dessus peut etre obtenu à partir de cellules cancéreuses contenant du GRA d'hommes ou d'animaux, par exemple des cellules cancéreuses cultivées, des cellules cancéreuses transplantées, des cellules cancéreuses spontanées, des cellules cancéreuses induites par des substances chimiques ou des virus ou des cellules cancéreuses dérivant de tissus opérés, selon le mode opératoire suivant.

On sépare les composants. de la membrane-cellulaire des cellules cancéreuses indiquées ci-dessus et on les traite avec une lectine qui se combine de façon spécifique avec une terminaison galactose ou une terminaison N-acétylgalactosamine terminale, le GRA se combinant avec la lectine et pouvant être facilement séparé.

Des exemples appropriés de la lectine fixant le galactose comprennent la lectine d'arachide, la lectine de Ricins communis. et la lectine de soja (voir J.B.C., 250 8518-8523 (1975); Biochem.

Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975); Z Immunitaetsforch, 138, 423-433 (1969); Br J. Exp. Pathol, 27, 228-236 (1946); Proc.

Nath. Acad. Sci. USA, 75, n 5 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13 196-204 (1974); et Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976)).

Des exemples appropriés de lectines fixant la N-acdtylgalac- tosamine comprennent l'agglutinine de Dolichos biflorus, la lectine de "braid orange", la lectine de Helix pomatia, la lectine de Phaseolus limensis, la lectine de Bauhinia purpurea et la lectine de soja (Glycin max).

On peut effectuer la séparation des composants des membranes des cellules cancéreuses selon des techniques connues telles qu'une méthode d'homogénéisation et une méthode de solubilisation utilisant un agent dissolvant. Il est plus avantageux d'utiliser une méthode dans laquelle les cellules cancéreuses sont homogénéisées dans du soluté salé physiologique ou dans un tampon approprié, une portion précipitée est recueillie selon une technique telle que la séparation centrifuge e s t dissoute dans du soluté salé physiologique ou dans un tampon par emploi d'un agent dissolvant et la portion surnageante est séparée selon une technique telle que la séparation centrifuge.Les agents dissolvants que l'on peut utiliser comprennent les agents tensioactifs que l'on sait généralement capables de dissoudre les membranes cellulaires tels que les agents tensioactifs non ioniques, par exemple le TRITON X-100 (produit par Wako Pure Chemical
Industries Ltd.), le NP-40 (produit par Schell Co., Ltd), la digitonine, et l'urée, et les agents tensio-actifs anioniques, par exemple le dodécylsulfonate de sodium (SDS).

A partir des composants de la membrane cellulaire ainsi obtenue, on peut séparer du GRA capable de se combiner avec une lectine selon des techniques physico-chimiques ou biochimiques habituelles utilisant les propriétés des lectines. Des exemples de telles techniques comprennent la chromatographie d'affinité utilisant une colonne de support contenant une lectine, une méthode d' immunoprécipitation utilisant un anticorps anti-GRA ou similaires, une méthode de dialyse, une méthode de filtration sur gel, une méthode d'électrophorèse, une méthode de précipitation physique utilisant un agent de précipitation des glycoprotéines, par exemple le polyéthylèneglycol et I'acétone, et une de leurs combinaisons.On préfère tout particulièrement la chromatographie d'affinité utilisant une colonne de support contenant une lectine et la colonne de support peut être facilement préparée par immobilisation d'une lectine sur un support insoluble. Cette immobilisation d'une lectine sur un support insoluble peut être effectuée selon des techniques connues classiquement utilisées dans l'immobilisation des substances biologiques. Parmi ces techniques on préfère utiliser une méthode d'activation d'un polysaccharide par le bromure de cyanogène et une méthode d'immobilisation utilisant des esters N-hydroxysuccimidiques.La méthode d'activation d'un polysaccharide par le bromure de cyanogène est une méthode dans laquelle on traite un support insoluble par le bromure de cyanogène et on soumet le produit activé ainsi obtenu à une réaction de couplage avec une lectine dans des conditions modérées pour immobiliser la lectine.Dans le traitement du support insoluble avec le bromure de cyanogène par exemple, on utilise des composés basiques tels que l'hydroxyde de sodium et l'hydrogénocarbonate de sodium pour ajuster le pH entre 7,5 et 12 et on traite le support dans un solvant tel que l'eau, l'acetonitrile ou un tampon maintenu a un pH de 7,5 à 12, par exemple un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH environ 8,7) et un tampon phosphate 0,01 M (pH environ 7,7), à la température ordinaire pendant environ 1 à 12 minutes. Généralement on préfère que la quantité de bromure de cyanogène utilisée soit égale à celle du support insoluble.

On peut utiliser dans l'invention un support insoluble connu quelconque qui a une faible adsorption non spécifique pour toutes les substances biologiques, a une porosité élevée, contient un groupe fonctionnel capable d'immobiliser les substances biologiques dans des conditions modérées et est chimiquement et physiquement suffisamment stable. Les supports insolubles que l'on. peut utiliser comprennent un support fait de cellulose, par exemple d'aminoéthylcellulose, de carboxysféthylcellulose, de bromoacétylcellulose, et de p-anilinocellulose, un support de dextran réticulé, par exemple de Sephadex et de CM-Sephadex (produits de Farmacia Corp.), et un support d'agarose par exemple le Sepharose 2B, le Sepharose 4B, et le Sepharose 6B (produits par Farmacia Corp.).

Dans la réaction de couplage du support activé par le bromure de cyanogène obtenu ci-dessus avec une lectine, on utilise le support activé par le bromure de cyanogène à raison de 30 à 80 fois la quantité de lectine et on les fait réagir dans un solvant approprié tel qu'une solution aqueuse à 0,1 mol/l d'hydrognocarbonate de sodium (contenant 0,5 mol/l de chlorure de sodium ; pH : 8,4) à une température de O à 400C et de préférence de 2 à 80C pendant une période d'environ 10 à 20 heures. On peut ainsi préparer un support contenant une lectine pour la chromatographie d'affinité.

Par chromatographie avec le support contenant une lectine préparée ci-dessus, le GRA désiré se combine avec la lectine contenue dans le support et est retenu dans la colonne. Ensuite on fait passer à travers la colonne > pour effectuer une réaction d'échange, des substances capables de se combiner avec la lectine ou, sinon, on fait passer à travers la colonne un séparateur d'adsorption (éluant), par exemple un sel très concentré, une solution aqueuse de thiocynanate de potassium ou un tampon nitrate pour provoquer une dissociation et obtenir le GRA désiré.

Dans la réaction d'échange des exemples des substances capables de se combiner avec la lectine lorsque l'on uti-lise un support pour la chromatographie d'affinité contenant une lectine fixant -le galactose comprennent celles qui se combinent avec une lectine se combinant avec une terminaison galactose, par exemple galactose, dissacharides contenant une terminaison galactose et oligosaccharides contenant une terminaison galactose, et des exemples des substances capables de se combiner avec la lectine lorsque l'on utilise pour la chromatographie d'affinité un support contenant une lectine fixant la
N-acétylgalactosamine comprennent celles qui peuvent se combiner avec une lectine se combinant avec une termLnaison N-acétylgalacto- samine, par exemple N-acétylgalactosamine, dissacharides contenant une terminaison N-acétylgalactosamine et oligosaccharides contenant une terminaison N-acétylgalactosamine.

Le GRA ainsi obtenu contient une glycoprotéine contenant une terminaison galactose et/ou N-acétylgalactosamine, un glycolipide et/ou un saccharide.

Le GRA ainsi préparé peut être lyophilisé si on le désire et purifié encore en utilisant des techniques de séparation ordinaires.

Par exemple, les préparations de GRA isolées avec une lectine fixant le galactose peuvent être soumises 8 une méthode de séparation utilisant une lectine se combinant avec la N-acétylgalactosamine et celles isolées avec une lectine se combinant avec la N-acétylgalactosamine peuvent être traitées par une méthode de séparation utilisant une lectine fixant le galactose.

Les lymphocytes que l'on utilise ici n'ont pas de limitations particulières et on peut utiliser tout lymphocyte de sujets humains ou d'animaux normaux ou cancéreux. Des exemples en comprennent les lymphocytes provenant du sang périphérique, de la moelle osseuse, des ganglions lymphatiques, de la rate, des amygdales et du thymus.

On isole ces lymphocytes selon des techniques physiques ou chimiques, une méthode utilisant une membrane superficielle, ou similaires.

On effectue la sensibilisation des lymphocytes avec le GRA par culture des lymphocytes dans un milieu de culture contenant du GRA pendant une période de 1 à 10 jours, de préférence de 2 à 7 jours.

Comme milieux de culture utiles pour la sensibilisation des lymphocytes, on peut utiliser divers milieux nutritifs courants classiquement utilisés pour de telles cultures cellulaires. Des exemples préférés comprennent le milieu RPMI 1640, le milieu MEM de Eagle etc., avec addition de sérum humain, de sérum foetal de veau (SFV), de sérum de veau, de sérum de cheval ou similaires. La quantité de GRA ajoutée au milieu de culture est généralement de I à 1000 ng/ml et de préférence de 1 à 500 ng/ml calculés en quantité de sucres par 1 x 106 lymphocytes/ml.

On effectue la culture selon une méthode courante par exemple à un pH d'environ 7,2 et à une température d'environ 370C.

Les cellules tueuses de ltinvention telles quelles préparées ci-dessus sont des lymphocytes essentiellement normaux et ont une activité de lutte contre les cellules, spécifique du GRA. Par exemple le GRA-1-KT, qui est une des cellules tueuses de l'invention, a des propriétés communes aux cellules T du sang périphérique humain et présente une activité de lutte contre les cellules, qui est spécifique des cellules cancéreuses contenant du GRA, comme le montre l'exemple décrit ci-après.

Des exemples typiques des nouvelles cellules tueuses de l'invention sont les cellules GRA-1-KT et GRA-M-1 qui sont préparées dans les exemples décrits ci-après. Toutes les cellules tueuses selon l'invention sont disponibles auprès de la Société demanderesse et leur dépat à 1'ATCC a été demandé.

On peut multiplier à l'infini les cellules tueuses de l'invention dans les milieux de culture précédemment décrits contenant un facteur de croissance des cellules T (TCGF, IL-2). Dans ce cas, la culture sélective d'un clone des cellules tueuses peut être effectuée selon la méthode classique d'ultra-dilution. Ces cellules tueuses peuvent être conservées de façon stable pendant des durées prolongées, par exemple dans l'azote liquide.

Le GRA peut etre utilisé isolément comme ingrédient actif et de
plus on peut l'utiliser en combinaison avec d'autres agents anti
bactériens et agents inhibiteurs du cancer. Les agents inhibiteurs du
cancer contenant le GRA de l'invention comme ingredient actif peuvent
être sous une forme quelconque tant que le GRA est contenu en quantité
fficace. Généralement, on administre l'agent par voie intraveineuse,sous-
cutanée,intradermique ou intramusculaire sous forme d'une solution, d'une sus
pension ou d'une émulsion. De plus, il peut être présenté sous forme
d'un produit sec que l'on peut transformer en un liquide par addition
d'un véhicule approprié avant l'emploi.Ces agents liquides peuvent
contenir un agent de mise en suspension, par exemple la méthylcellu
lose, un agent émulsifiant, par exemple la lécithine, des conserva
teurs par exemple le p-hydroxybenzoate de méthyle, un stabilisant qui
n'a pas d'effet indésirable sur la fonction d'immunisation de l'homme
ou des animaux, un tampon et similaires.

Les véhicules aqueux que l'on peut utiliser comprennent le solu
té salé physiologique, et les véhicules non aqueux que l'on peut
employer comprennent une huile végétale, par exemple l'huile de sésame,
une huile minérale, par exemple l'huile de paraffine, une huile ani male, par exemple le squalène, et le propylèneglycol. De plus, pour améliorer l'effet immunologique, on peut incorporer des adjuvants appropriés. Les adjuvants que l'on peut utiliser comprennent l'adju- vant complet de Freund, la saponine pour les animaux et l'hydroxyde d'aluminium pour l'homme.

L'agent anticancéreux de l'invention peut être administré une seule fois ou de façon répétée pendant une période de temps prolongée à un patient cancéreux pour le traitement du cancer ou peut être admi nistré à titre préventif à un sujet susceptible d'être atteint d'un cancer.

Comme la DL50 (souris, voie intrapéritonéale) du GRA est-d'au moins 500 mg/kg, calculé en quantité de sucre, l'agent anticancéreux de l'invention a une faible toxicité et peut donc être administré dans une gamme posologique étendue. Bien que la concentration du GRA dans l'agent anticancéreux de l'invention n'ait pas de limitations particulières, on préfère généralement quelle soit comprise entre 0,001 et 100 pglml calculée en quantité de sucre. En ce qui concerne la posologie de l'agent anticancéreux on préfère généralement administrer l'agent à raison de O, 001 à 1 000 pg/kg par jour en une seule prise ou en plusieurs portions, bien que la posologie varie selon l'importance de la maladie ainsi que l'age et le sexe du patient.

L'agent anticancéreux ainsi préparé contenant les cellules tuesses comme ingrédient actif est de préférence utilisé comme solutions injectables en combinaison avec des véhicules utilisés pour la préparation de tels médicaments injectés dans le sang. Les véhicules que l'on utilise ici n'ont pas de limitations particulières mais on préfère les vehicules dont la tonicité est égale à celle du sang. En particulier, on préfère le soluté salé physiologique. Pour préparer l'agent on préfère laver suffisamment les cellules tueuses avec du soluté salé physiologique ou similaires pour éliminer le milieu de culture précité puis les faire flotter dans un véhicule.

La concentration des cellules tueuses dans l'agent n'a pas de limitations particulières, mais elle est de préférence de 105 à 109 /ml. Lorsqu'on administre les cellules tueuses par voie intrapéri- 8 tonéale à la dose de 10 par souris, on n'observe pas de toxicité.

Bien que la posologie de l'agent anticancéreux de l'invention varie selon le degré de la maladie, ainsi que l'âge et le sexe du patient, on préfère généralement administrer l'agent à raison de 105 à 1012 cellules/kg par jour en une seule portion ou en prises divisées.

L'exemple, les exemples de référence, les exemples expérimentaux et les exemples comparatifs ci-après illustrent l'invention de façon plus détaillées sans la limiter.

EXEMPLE DE REFERENCE I
Localisation du GRA (1) - A. Préparation de lectine marquée à l'isothiocyanate de fluo
rescéine (FITC) (PNA-FITC).

On dissout 10 mg de lectine d'arachide (PNA, produit par Ey Co.) dans 2 ml de tampon phosphate 0,01 M contenant 0,85 % de chlorure de sodium (pH = 7,2). Dans I ml de tampon hydrogenocarbonate 0,5 M (pH 9,0) on dissout 2 mg de FITC (produit par Sigma Laboratories Inc.) et on ajoute 0,5 ml de la solution obtenue au tampon contenant la PNA préparée ci-dessus. On agite ensuite le mélange à la température ordinaire pendant deux heures puis on separe sur Sephadex G25 (10 mm x 300 mm, produit par Farmacia Corp.). On recueille le pic initial.

Rapport FITC/PNA = 1,0.

(1) - B.Préparation de lectine marquée par le FITC (DBA-FITC).

De la même manière qu'en (1)-A ci-dessus, on obtient le DBA-FITC en utilisant le DBA fabriqué par la Société EY Co., rapport
FITC/DBA = 0,9.

(1) - C.Agglutinine de soja-FITC (FITC-SBA). Fabriquée par la Société
EV Co. rapport FITC/SBA = 1,4.

(2) Localisation du GRA dans diverses cellules cancéreuses.

(a) On lave trois fois les cellules cancéreuses humaines cultivées (1 x 106) avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,05 M contenant 0,85 % de chlorure de sodium (pH 7,2), par centrifugation, puis on ajoute 100 l de PNA-FITC, de DBA-FITC ou de SBA-FITC (200Zg/ml) préparé en (1). On laisse le mélange obtenu reposer à la température ordinaire pendant 30 minutes pour provoquer la réaction. Après achèvement de la réaction, on lave trois fois le mélange réactionnel avec du tampon phosphate 0,01 M contenant 0,85 % de chlorure de sodium (pH = 7,2), puis on place les cellules sur une lame de verre et on les examine au microscope à fluorescence.

Les résultats figurent dans le tableau 1. Les cellules cancéreuses utilisées sont connues et ont été fournies par First Pathology
Laboratories, Medical Department of Niigata University.

TABLEAU 1
Taux de positivité
du GRA (%)
Cellules cancéreuses A DBA SBA
Raji (Lymphome de Burkitt) 98,3 1,4
Dauji (Lymphome de Burkitt) 93,1 5,2
BT-I (Lymphome de Burkitt) 50,1 0
P-12 (Lymphome à cellules T) 44,3 6,7
MOLT (Leucémie à cellules T) 0,6 4,8
Fujimaki (Lymphome à cellules B) 19,1 5,3
Oda (Myélome à IgD) 0,6 10,0
QG-56 (Cancer du poumon squameux) 70,4 2,0
PC-1 (Cancer du poumon, squameux) 78,4 0,4
PC-3 (Cancer du poumon, adénocarcinome) 77,1 1 0 0
QG-90 (Cancer du poumon, à petites cellules) 68,0 0
PC-13 (Cancer du poumon, à grandes cellules) 17,0 O MK-2 (Cancer de l'estomac, mauvaise différenciation) 63,7 0 > 1
KATO-III (Cancer de l'estomac, en chevalière) 57,3 0
MKN-45 (Cancer de l'estomac, mauvaise différentiation) 1,0 40,3
MKN-1 (Cancer de l'estomac, adénocarcinome squamaux) 4,6 0,4
MKN-28 (Cancer de l'estomac) 0,4 0,1
MKN-74 (Cancer de l'estomac) 0,5 0 MGH-U1 (Cancer de la vessie) 37,4 O
KU-2 (Cancer de la vessie) 4,5 21,4
T-24 (Cancer de la vessie) 14,6 0
NBT-2 (Cancer de la vessie) 13,1 1,0
NRC-12 (Cancer du rein) 23,9 0
KU-1 (Cancer du Rein) 3,3 0,6
Kuramochi (Cancer de l'ovaire) 80,0 O
NB-I (neuroblastome) 50,9 1,7
YT-nu (neurobalstome) 3,6 0,5
TGW-nu-l (neuroblastome) 4,1 0
TGW-nu-11 (neuroblastome) 2,0 1,0
GOTO (neuroblastome) 0,5 0
ITO (néphroblastome) 96,9 12,3
NEC-8 (néphroblastome) 44,6 0
SCH (choriocarcinome, estomac) 14,6 3,1
GCH (choriocarcinome, utérus) 5,4 0
YN-1 (rhabdomyosarcome) 5,7 1,7
Souris X5563 (plasmacytome) 92,0 0 90,6
Souris @@134 (hépatome) 18,6 0 6,4 (b) On fait passer des tissus malins de patients cancéreux à travers un tamis en acier inoxydable (Q 104 mm) pour obtenir une suspension de cellules simples. Après lavage deux fois avec le tampon tris, HCl 0,01H (pH 7,4) contenant CaC12 2mM, MgC12 2mM et Nage 2 0,85%, on remet en suspension 5.105 cellules dans 100 l du tampon.

On ajoute à la suspension de cellules 100 l de FITC-PNA ou de
FITC-DBA (200 g/ml) et on fait incuber le mélange à la température ambiante pendant 20 min. Après lavage trois fois par le BPS froid, on observe les cellules au microscope à fluorescence.

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 2 ci-après.

Les tissus malins de patients cancéreux ont été obtenus à la Kansai
Medical University.

TABLEAU 2 n0 Tissu de patient cancéreux GRA
PNA DBA 1 cancer de l'estomac + + 2 cancer de l'estomac + + 3 cancer de l'estomac 4 cancer de l'estomac + 5 cancer de l'estomac + + 6 cancer de l'estomac + 7 cancer du sein + 8 cancer du sein + 9 cancer du sein + - + 10 cancer du sein + + 11 cancer du colon + + 12 cancer du côlon - + 13 cancer de l'oesophage + 14 hépatome - +
Remarques : le symbole "+" signifie que le GRA est exprimé sur la sur
face de la cellule,
le symbole "-" indique que le GRA n'est pas exprimé sur la
surface de la cellule.

EXEMPLE DE REFERENCE 2
Préparation de GRA (I)-A. Préparation de lectine immobilisée (PNA-Sépharose)
On lave fond 3g de Sépharose 4B (produit par Farmacia Corp.) activé par le bromure de cyanogène avec de l'acide chlorhydrique lmM et on les met en suspension dans 200 ml d'hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH = 8,5). On ajoute ensuite 5 ml de tampon phosphate 0,01 M (pH = 8,5) contenant 20 mg de PNA et on fait réagir à 250C pendant deux heures en agitant de temps en temps pour préparer du PNA-Sépharose.

(1)-B On obtient le DBA-Sépharose de la même manière qu'en (1)-A ci-dessus > sauf qu'on utilise le DBA ou lieu du PNA.

(2) Préparation de GRA
(a) On lave trois fois avec du soluté salé physiologique des cellules (1,3 x 108) BT-I (lymphome de Burkitt) et on ajoute 30 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4) contenant 2X de
TRITON X-lOO (produit par Wako Pure Chemical Industries Ltd), 0,85% de chlorure de sodium 2 mM en chlorure de calcium et 2 mM en chlorure de magnésium. On agite le mélange à 40C pendant 15 minutes puis on le soumet à une séparation par ultra-centrifugation à 100 000 x g. Sur les 28 ml de liquide surnageant ainsi obtenus, on en fait passer 14 ml à travers une colonne (diamètre 0,5 cm, longueur 1 cm) pour chromatographie d'affinité, garnie de perles de PNAagarose (produit par Maruzen Co.Ltd) que l'on a équilibrée avec du tampon Tris-acide chlorhydrique (pH 7,4) contenant 0,1X de TRITON X100, 0,85% de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium et 2 mM en chlorure de magnésium. Après lavage avec le même tampon que ci-dessus, on élue avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4), 0,1 M en lactose, a 0,85 Z en chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium, 2 mM en chlorure de magnésium et à 0,1 Z de TRITON X-100.

On dialyse la portion ainsi éluée avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M contenant 0,85X de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de magnésium et 2 mM en chlorure de calcium pendant 48 heures pour obtenir 17 ml de solution de GRA. On soumet cette solution de GRA à une détermination de la quantité de protéines et de la quantité de sucres respectivement selon la méthode de Folin-Lowry et la méthode au phénol-acide sulfurique pour obtenir respectivement les valeurs de 644 pg et de 120 ug. On appelle ci-après ce produit "GRA-1".

(b) On lave trois fois avec du soluté salé physiologique des cellules de tumeur mammaire de la souris C3H/He(MXT, 1.1010) et on ajoute 30 ml de tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4) contenant 2 Z de TRITON X-100, 0,85X de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium et 2 mM en chlorure de magnésium. On agite le mélange à 4 C pendant 30 minutes. Ensuite on soumet le mélange à une séparation par ultra--centrifugation à 100 000 x g pendant 2 heures et on dialyse le liquide surnageant pendant une nuit avec du tampon Tris HC1 0,1 M (pH 7,4) contenant 0,85% de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium et 2 mM en chlorure de magnésium.On concentre le liquide ainsi dialysé à 3 ml et on en fait passer une portion de 1 ml à travers une colonne (diamètre 0,5 cm, longueur 2 cm) de chromatographie d'affinité garnie du même PNA-Sépharose que celui utilisé ci-dessus que l'on a équilibré avec du tampon Tris-acide chlorhydrique (pH = 7,4) contenant 0,005 Z de TRITON X-lOO, 0,85% de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium et 2 mN en chlorure de magnésium.

Après après avoir lavé à fond avec le même tampon que celui utilisé cidessus, on élue avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4), 0,1 M en lactose, à 0,85 X de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium, 2 mM en chlorure de magnésium et à 0,005% de
TRITON X-100 et on dialyse la portion ainsi éluée pendant 48 heures avec du tampon Tris-acide chlorhydrique 0,01 M (pH 7,4) contenant 0,85 Z de chlorure de sodium, 2 mM en chlorure de calcium et 2 mM en chlorure de magnésium pour obtenir 2 ml d'une solution de GRA. On détermine la quantité de protéines et la quantité de sucre contenues dans cette solution de GRA et on obtient respectivement les valeurs de 156 Ug et de 94 g. On appelle ci-après ce composé "GRA-M-I".

(c) On homogénéise environ 120 g (poids humide) de KATO-III dans 100 ml de PBS au moyen d'un mélangeur Waring. Après centrifugation à 100 000 g pendant 1 h, on dissout la pastille dans 100 ml de
Triton X-100 9 2% dans le tampon Tris,HCl O,OlM (pH 7,6) contenant
NaCl 0,15M. On recueille le liquide surnageant par centrifugation à 100 000 g pendant 1 h et on l'applique sur une colonne de
PNA-Sépharose 4B (0,8 x 15 cm) équilibrée avec le Triton X-100 à 0,015% dans le tampon tris,HCl 0,OlM (pH 7,6) contenant NaCl 0,15 M.

Après lavage avec 50 ml du tampon, on élue le GRA avec le tampon contenant du lactose O,lM. Le GRA élué est dialysé contre NaCl à 0,85%, concentré par Sephadex de la Société Pharmacia Co. et conservé à -200C avant l'emploi.

On trouve que les quantités de protéine et de sucres déterminées de la même manière qu'en (a) ci-dessus sont de 2,0 mg et 0 > 8 mg respectivement. Ce produit est dénommé ci-après"GRA-2".

(d) On obtient les échantillons de GRA suivants de la même manière qu'en (c) ci-dessus.

TABLEAU 3
Echantillon Matière GRA
de GRA Source Quantité (g) Teneur en Teneur en protéines ~~~~~~ ~~~~~~~~~~~ protéines (mg) sucres(mg)
GRA-3 BT-1 33 0,5 0,09
GRA-4 Tumeur 5 0,24 0, 5
mammaire
(excisée)
GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38
GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54
GRA-7 Raji 29 0,78 0,45
GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4
GRA-M-3 LLC 14,4 0,06 0,07
GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35
GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 (e) En opérant de la même manière que dans (c) ci-dessus, sauf que l'on utilise du MKN-45 (environ 29 g) au lieu de Kato-III et du DBA-Sépharose obtenu en (1)-B ci-dessus au lieu de PNA-Sépharose 4B et qu'on effectue l'élution avec la N-acétylgalactosamine, on obtient une préparation de GRA ayant une teneur en protéines de 0,03 mg et une teneur en sucres de 0,01 mg. Cette préparation est appelée ci-après "GRA-8".

(f) On charge le GRA-3 préparé en (d) ci-dessus (5 ml) dans une colonne de DBA-Sépharose et on élue par le tampon tris-HCl (a 0,015% de Triton X-100, 2 mM en MgCl2 et CaCl2, à 0,85% de NaCl) pour obtenir des fractions n 1 à 15 de 4 ml. Les fractions n 1 à 3 sont dénommées "GRA-3-A" et les fractions n 4 à 12 "GRA-3-B". On élue ensuite la colonne avec le même tampon,mais contenant de la
N-acétylgalactosamine 0,1M pour obtenir des fractions dénommées "GRA-3-C".

(g) Electrophorèse sur gel de SDS
On soumet chacune des préparations de GRA obtenues par les modes opératoires ci-dessus à ltélectrophorèse, selon la méthode décrite par Fairbanks et coll dans Biochemistry, volume 10, page 2606, 1971.

Les résultats obtenus sont indiqués dans les figures 18 à 22.

Dans les figures 18 et 19, les chiffres 1 à 5 ont les significations suivantes
1--- étalon; 2--- GRA-M-3; 3--- GRA-7; 4--- GRA-1; et
5 --- GRA-2.

Dans la figure 20, les chiffres 1 à 4 ont les significations suivantes
1 --- étalon; 2 --- GRA-M-2; 3 --- GRA-6; 4 --- GRA-5.

Dans la figure 21, les chiffres 1 à 3 ont les significations suivantes
1 --- GRA-M-4; 2 --- GRA-M-5; 3 --- étalon.

Dans la figure 22, les chiffres 1 à 4 ont les significations suivantes :
1 --- GRA-3; 2 --- GRA-3-A; 3 --- GRA-3-B; 4 --- GRA-3-C.

La figure 18 représente l'état du GRA soumis à a réaction de coloration des protéines, selon la méthode C.B.B. (Fairbanks et coll. : Biochemistry, volume 10, page 2606, 1971).

Les figures 19 à 21 représentent l'état du GRA soumis à la réaction de coloration des sucres, selon la méthode PAS (R.M. Zacharius et col. Anal. 13iochem. volume 30, page 148 (1962)).

La figure 22 représente schématiquement les résultats de coloration selon la méthode C.B.B. décrite ci-dessus.

On utilise comme étalons les substances énumérées ci-dessous fournies par la Société Biorad Lab., Califormie, Etats-Unis d'Amdrique.

200 K dalton; myosine 116 K dalton; ss-galactosidase
92,5 K dalton; phosphorylase
66,2 K dalton; BSA
45 K dalton; ovalbumine
21,5 K dalton; inhibiteur de trypsine du soja.

EXEMPLE DE REFERENCE 3
Préparation du facteur de croissance des cellules T (TCGF) (a) On excise la rate (4 kg) d'un singe japonais (fourni par Japan
Plymates Co. Ltd) et on la lave deux fois avec du milieu de culture
RPMI-1640 (produit par Flow Laboratory Co. Ltd). On filtre les cellules avec du Mesch (produit par Millipoee Inc. 0,106 mm) et on soumet à une méthode de centrifugation par densité (densité : 1,076) pour obtenir deux litres d'un produit à 2 x 109 lymphocytes/ml. On lave trois fois les lymphocytes ainsi obtenus avec un milieu de culture RPMI-1640 et on ajuste le nombre des lymphocytes à 5 x 107/ml avec le même milieu que celui utilisé ci-dessus contenant 10% de SVF.

On laisse reposer dans un appareil de fermentation à atmosphère de dioxyde de carbone à 37 C pendant 1 h. On recueille les lymphocytes surnageants et on ajuste le nombre de lymphocytes à 1 x 106/ml en utilisant le même milieu de culture que ci-dessus contenant 1% de SVF. Ensuite, on ajoute 1 l/ml d'indométhacine (produit de
Sigma Laboratories Inc.) et 0,2% de PHA-P (produit de Difco Co.) et on cultive dans un appareil de fermentation à atmosphère de dioxyde de carbone à 370C pendant 48 heures. On effectue une séparation centrifuge (3 000 tr/min) pendant 10 min et on recueille le liquide surnageant puis on le stérilise par filtration avec un filtre
Millipore (produit par Millipore Inc. 0,2 m) pour obtenir 2 litres de TCGF.

(b) La source de TCGF est le liquide surnageant de lymphocytes mixtes de sang périphérique de 10 donneurs en bonne santé. On met en suspens ion dans un milieu RPMI 1640 contenant 1% de FCS des lymphocytes (1,5.106 cellules/ml) n'adhérant pas préparés à partir de Lymphocytes C.F. (Conray. Ficol, Société Japan Immunoresearch Co.) séparés par adsorption sur une surface de matière plastique à 370C pendant 1 h, et on fait incuber avec du PHA-P à 0,2%, de l'indométhacine (1 g/ml) et une ligne de cellules B 5 humaines (BT-1) (1,5.10 cellules/ml) prétraitées par la mitomycine C (50)1g/mî). Après 48 h, on récolte le liquide surnageant de la culture et on l'utilise comme source de TCGF. < H. Inoue et col.,
Scand. J. Immunol. 12, pages 149-154 (1980)).

EXEMPLE DE REFERENCE 4
Préparation de lymphocytes (1) Lymphocytes du sang périphérique humain.

On soumet à une séparation centrifuge avec du Ficol-Pack (produit par Farmacia Japan Co Ltd.) 50 ml de sang hépariné provenant d'un adulte sain ou de divers patients cancéreux, pour obtenir
5.107 lymphocytes de sang périphérique.

(2) Lymphocytes de rate de souris
On excise la rate d'une souris C3H/He (mâle 6 semaines) et on la lave deux fois avec du milieu de culture RPMI-1640. On fragmente la rate avec une aiguille à injection et on la fait passer à travers un tamis d'acier inxoydable (0,150 mm d'ouverture de maille) pour éliminer les gros morceaux. On lave deux fois les cellules ainsi filtrées avec le même milieu de culture que celui utilisé ci-dessus et on effectue une séparation centrifuge à 1200 tr/min pendant 10 minutes pour obtenir 4 x 107 lymphocytes de rate.

EXEMPLE 1
On dilue à 1 000 fois le volume d'origine du GRA-1 (protéines : 40Pg/ml ; sucres : 7,5 pg/ml) obtenu dans l'exemple de référence 2 ((2)(a)) avec du milieu de culture RPMI-1640 contenant 15 % de SFV pour préparer un milieu de culture de sensibilisation.

On ajoute des lymphocytes de sang périphérique humain (5 x 106/5 ml) obtenus dans l'exemple de référence 4 (1) à 5 ml du milieu de culture de sensibilisation préparé ci-dessus, on place dans une bote de laboratoire et on cultive à 370C pendant deux jours. On cultive de plus avec du milieu de culture RPMI-1640 contenant 20 Z de TCGF et 15% de SFV, comme obtenu dans l'exemple de référence 3, pendant encore 5 jours pour obtenir 20 ml d'une solution de cellules tueuses contenant 1 x 106 cellules tueuses/ml. On appelle ces cellules "GRA-1-K-T".

EXEMPLE 2
On ajuste à la concentration de 5 x 106/ml avec du milieu de
culture RPMI-1640 contenant 15% de SFV, les lymphocytes de rate de
souris obtenus dans l'exemple de référence 4(2). On ajoute ensuite
du GRA-M-1 obtenu dans l'exemple de référence 2 ((2)(b)) pour que les
teneurs finales de protéines et de sucres soient respectivement de
1,5 pg/ml et 0,9 pg/ml. On cultive une portion de S ml du mélange obtenu dans une boîte de laboratoire (60 mm x 15 mm, produite par
Falcon Co.) à 370C pendant deux jours. On observe la formation de clones. On cultive encore cette portion avec du milieu de culture
RPMI-1640 contenant 15 Z de SFV et 20 % en volume de TCGF (produit par Japan Immuno Research Laboratories Co.Ltd) pendant encore 4 jours pour obtenir 50 ml d'une solution de cellules tueuses contenant 1 x 106 cellules tueuses/ml. On appelle ci-après ces cellules "GRA-M-1-K-T".

EXEMPLE 3
On fait incuber des lymphocytes (5.106) de sang périphérique d'un donneur sain dans le milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml (teneur en protéine) de GRA-2 et 15% de FCS à 37 C. Au deuxième jour, on ajoute le TCGF humain décrit ci-dessus au milieu jusqu'à ce que la concentration atteigne 20% et on continue l'incubation pendant encore 3 jours pour obtenir des cellules tueuses. On appelle ci-après ces cellules "GRA-2-K-T".

EXEMPLE 4
On prépare des préparation de cellules tueuses GRA-8-K-T,
GRA-3-A-K-T et GRA-3-C-K-T de la même manière qu'à exemple 1 en utilisant du GRA-8, du GRA-3-A et du GRA-3-C, respectivement (teneur en protéine : 50 ng/ml) et le TCGF obtenu à l'exemple de référence 3-(b).

EXEMPLE 5
On implante des cellules X5563 (106) de la même souche sur des souris C3H/HE (femelle de 8 semaines) par voie intradermique et, après 7 jours, on excise la tumeur par voie chirurgicale. Après encore 7 jours, on inocule des cellules X5563 (105) de la même souche et on appelle souris immunes les souris résistantes à l'inoculation.

On prépare, selon la méthode courante, les cellules de rate des souris immunes et de souris C3H/He normales.

On sensibilise chaque lot de cellules de rate (5.10 6/godet) avec 40 ng/ml (teneur en protéines) de GRA-M-5 dans le milieu RP!D:-l640 contenant 15% de FCS pendant 5 jours pour obtenir des cellules tueuses.

La préparation de cellules tueuses obtenues à partir de cellules normales de rate est dénommée ci-après"GRA-M-5-K-T-1" et celle obtenue à partir de cellules immunes de rate est dénommée ci-après "GRA-M-5-K-T-2".

EXEMPLE 6
On fait incuber pendant 2 jours à 370C des lymphocytes de sang périphérique humain (5.106) dans 5 ml de milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml (teneur en protéine) de GRA-1. Au troisième jour, on tranfère les lymphocytes sur du milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum du donneur des lymphocytes et O à 100 ng/ml (teneur en protéine) de GRA-1 et on continue l'incubation pendant encore 5 jouispour obtenir des préparations de cellules tueuses représentées dans le tableau 4 ci-après.

TABLEAU 4
Concentration en GRA (ng/ml) ler jour 3 e jour Cellules tueuses
50 0 GRA-1-K-T-1
50 1,6 GRA-1-K-T-2
50 3,2 GRA-1-K-T-3
50 6 GRA-1-K-T-4
50 12,5 GRA-1-K-T-5
50 25 GRA-1-K-T-6
50 50 GRA-1-K-T-7
50 100 GRA-1-X-T-8
EXEMPLE 7 (a) On sensibilise des lymphocytes de sang périphérique (PBL) de divers patients cancéreux après opération avec du GRA-3, pour obtenir ces préparations de cellules tueuses. On fait incuber les
PBL (5.106) des patients dans le milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml (teneur en protéine) de GRA-3 pendant 2 jours- et ensuite dans le milieu RPMI-1640 contenant 20% de TCGF et 15% de FCS pendant encore 5 jours pour obtenir les cellules tueuses indiquées dans le tableau 5 ci-après.

TABLEAU 5
Lymphocytes de sang périphérique.

Cancer P-GRA D-GRA Jours Cellules tueuses
après ltope- ration
Cancer de l'estomac + + 14 GRA-3-K-T-1
XI + + 35 GRA-3-K-T-2
Cancer du sein + - 21 GRA-3-K-T-3
+ + - 7 GRA-3-K-T-4
+ - 35 GRA-3-K-T-5
Cancer de l'estomac + - 21 GRA-3-K-T-6
Dans le tableau 5, P-GRA et D-GRA indiquent la localisation du
GRA exprimée sur le tissu malin (excisé apres l'opération) des patients cancéreux dont on a recueilli les PBL > détermine de La même manière que dans l'exemple de référence 1, 2-(b). P-GRA et D-GRA sont les résultats obtenus en utilisant du FITC-PNA et du FITC-DBA respectivement. Les jours après l'opération indiquent le temps après l'opé- ration au bout duquel on recteille les PBL.

(b) On fait incuber des PBL (5.106) recueillis sur des patientes atteintes de cancer du sein après 21 jours à partir de l'opération sur du milieu RPMI-1640 contenant 50 ng/ml (teneur -en protéine) de
GRA-3 et 10% de sérum du patient pendant 7 jour pour sensibiliser les
PBL et obtenir une préparation de cellules tueuses. On appelle ciaprès ces cellules "GRA-3-K-T-7".

EXEMPLE 8
On dissout du GRA-1-K-T (108) obtenu dans exemple 1 dans 10 ml de soluté salé physiologique pour préparer une solution injectable.

EXEMPLE 9 (1) On dilue le GRA-M-1 obtenu dans l'exemple de référence 2((2-)(b)) avec du solute salé physiologique pour que les teneurs en sucres et en protéines soient respectivement de 1,0 Xuglml et 1,6 lug/ml pour préparer un agent anticancéreux numéro 1. (2) On prélève stérilement des cubes de 5 mm d'un bloc tumoral de cancer spontane de la mamelle de souris C3H/He et on les transplante chacun dans la peau du dos de 10 souris C3H/He de la meme souche (7 semaines, malles). Sept jours après la transplantation, on confirme la fixation et la multiplication de la tumeur.A cinq des souris on administre par voie sous-cutanée l'agent anticancéreux numéro 1 prépare en (L) ci-dessus a raison de 300 tu 1 par jour à des intervalles de deux jours. On utilise les cinq souris restantes comme témoins non traite.

Dix jours après la première administration, on excise la tumeur par operation et on mesure le poids moyen. On effectue en même temps un examen histopathologique.

Volume des tumeurs :
Groupe administré 22,3 mm (figure 14)
Temoins 162,7 mm (figure 15)
Ceci indique une réduction de 83,3 % de la tumeur.

Examen histopathologique
Dans le groupe témoin (figure 16) des corps cancéreux en nid d'oiseaux se sont formes, la nature du tissu est semblable a celle du cancer medullaire-canaliculaire et la multiplication des cellules tumorales est observée dans tout le tissu. D'autre part, dans le groupe ayant reçu l'agent anticancéreux (figure 17), les cellules cancéreuses ont provoque une nécrose avec liquéfaction au niveau des sites de formation des cellules cancéreuses et il s'est produit une calcification et une fibrose ne laissant qu'une quantité très limitée de cellules cancéreuses. On a donc observé les propriétés antitumorales de l'agent anticancéreux de l'invention.

EXEMPLE D'ESSAI 1
On a placé sur une microbolte (produite par Falcon Corp) Ijilde GRA-I-K-T obtenu dans l'exemple I et on a laisse reposer à la température du laboratoire pendant 15 minutes. Ensuite on a ajouté 4 p1 de SFV (produit par Falcon Corp.) et on a laissé le mélange reposer à la température du laboratoire pendant 30 minutes. On a ajouté des globules rouges de mouton traités par la Neuraminidase (GRMN) ajustés à 1 x 109/ml et 5 l de tampon phosphate 0,01 M (pH 7,2) à 0,85 Z de chlorure de sodium et on a soumis la boite a une séparation par centrifugation à la vitesse de 600 tr/min pendant 5 minutes. La boîte a été ensuite retournée et on a éliminé les GRM n'ayant pas réagi.On a ajouté une solution colorante (Brillant Cresyl
Blue, produit par Merck et Co.) pour colorer les lymphocytes et on a examiné le pourcentage de lymphocytes formant des rosettes. On a constaté qu'au moins 98 Z des lymphocytes formaient des rosettes (cellules T).

EXEMPLE D'ESSAI 2
Activité spécifique des cellules tueuses de cellules cancéreuses (a) Parmi les cellules indiquées dans le tableau 1 on a utilisé les cinq souches cellulaires suivantes ayant des taux différents de posivité du GRA comme cellules cancéreuses humaines cibles.

Cellules cancéreuses cibles :
NO 1 BT-I Lymphome de Burkitt
NO 2 Daudi Lymphome de Burkitt
N 3 KATO-III Cancer de l'estomac
N 4 MKN-45 Cancer de l'estomac
N 5 MOLT Leucémie à cellules T
Sur une microplaque (produite par Falcon Corp.) on a appliqué 5 x 104 cellules cancéreuses cibles par godet par centrifugation à la vitesse de 800 tr/min pendant 5 minutes. On a ensuite ajouté avec précaution 4 x 103 cellules GRA-I-K-T obtenues dans l'exemple I par godet et on a incubé pendant une heure.

L'activité des cellules tueuses a été déterminée selon le degré de formation des plaques et notée comme suit
++ activité importante
+ activité
t légère activité
- pas d'activité
Dans un groupe témoin on a utilisé des lymphocytes de sang périphérique humain non sensibilisés que llon a préparés comme indiqué dans exemple 1 si ce n'est que lton n'a pas employé de GRA. Les résultats figurent dans le tableau 6.

I1 ressort de l'examen du tableau 6 que les cellules T tueuses produites selon le procédé de l'invention ont une forte activité cytotoxique spécifique du GRA.

TABLEAU 6
Cellules Taux de posi- Détermination de la
cancéreuses tivité du GRA formatio de plaques
cibles (%)
Groupe
GRA-1-K-T Daudi (Fig. 1) 93,1 ++ (Fig.2)
KATO-III (Fig.3) 57,3 + (Fig.4)
BT-I (Fig.5) 50,1 ++ (Fig.6)
MKN-45 (Fig.7) l,O + (Fig.8)
MOLT (Fig.9) 0,6 - (Fig.10)
Groupe BT-I 50,1 - (Fig témoin (b) On mélange les mêmes cellules cancéreuses cibles qu'utilisées en (a) ci-dessus (3,2 x 106) avec 8 x 105 cellules GRA-1-K-T (rapport des cellules 5/1) et on cultive le mélange cellulaire obtenu (nombre total des cellules ; 4 x 106) avec du milieu RPMI-1640 contenant 15% de SFV.Après une heure, on compte le nombre des cellules restantes et on calcule la cytotoxicité à partir de l'équation suivante
Nombre des cellules Cytotoxicité (%) = (1 - (#################) x 100)
avant culture (4 x 10 )
Les résultats figurent dans le tableau 7.

TABLEAU 7
Nombre de cellules
Cellules Avant culture Apres-culture Cytotoxicité cibles (%)
6 6
Daudi 4 x 10 2,9 x 10 28
KATO-III 4 x 106 3,7 x 106 7,5
BT-1 4 x 106 3,2 x 106 20
MKN-45 4 x 106 3,9 x 106 . 2,5
MOLT 4 x 10 4,2 x 106 - 5 (c) On répète le mode opératoire de (b) ci-dessus si ce n1 est que le rapport de mélange des cellules GRA-I-K-T aux cellules cancéreuses cibles est de 5/3. Les resultats figurent dans le tableau 8.

TABLEAU 8
Nombre de cellules
Cellules Cytotoxicité cibles Avant culture Après culture (%)
Daudi 4 x 106 3,6 x 105 91
KATO-III 4 x 10 3,6 x 106 24
BT-I 4 x 10 1,4 x 10 65
MKN-45 4 x 106 3,7 x 106 7,2
MOLT 4 x 106 4,1 x 106 -3
Dans l'essai ci-dessus, on observe que le GRA-l-K-T présente une forte activité de fixation sur les cellules cibles Deudi, KATO-III et BT-1, mais une faible activité de fixation seulement sur les cellules cibles MKN-45 et MOLT.

EXEMPLE D'ESSAI 3
A des souris CH3/He atteintes de cancer mammaire spontané, on administre par voie sous-cutanée les cellules GRA-M-1-K-T obtenues dam l'exemple 2 à la dose de 3 x 106/0,3 ml par souris trois fois par semaine, tous les deux jours. Après dix jours, on prélève le foyer et on l'examine.

Comme le montre la figure 12, il est produit une infiltration de lymphocytes dans les cellules cancéreuses et on observe une rupture de la zone tumorale. Egalement comme le montre la figure 13 on observe une calcification de la zone tumorale ce qui montre que les cellules tueuses de l'invention ont une activité antitumorale.

EXEMPLE COMPARATIF I
Dans cet exemple on utilise des cellules cancéreuses elles-mêmes comme antigène spécifique au lieu de GRA dans le procédé de llinven- tion.

On obtient des lymphocytes sensibilisés par des cellules cancéreuses comme dans l'exemple 1 si ce n'est qu'au lieu de GRA on utilise des cellules de BT-I, de Daudi, de KATO-III ou de MKN-45 à raison de 1 x 105 par boîte de laboratoire.

Avec ces lymphocytes, on détermine l'activité cytotoxique conne dans l'exemple d'essai 2 (a). Les résultats figurent dans le tableau 9.

Comme le montre le tableau 9 les lymphocytes préparés ci-dessus n'ont aucune activité cytotoxique.

TABLEAU g
Cellules Cellules utilisées pour la sensibilisation des cibles lymphocytes
BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 BT-I - - -
Daudi - -
KATO-III - -
MKN-45 - - -
EXEMPLE D'ESSAI 4
De la même manière qut l'exemple d'essai 2-(b), on détermine l'activité de cellules tueuses du GRA-8-K-T, du GRA-3-A-K-T et du
GRA-3-C-K-T obtenues à l'exemple 4. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 10 ci-après.

TABLEAU 10
Cellules Cytotoxicité % cibles GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GRA-3 -C-K-T
KATO-III 8,0 5,0 5,0
BT-1 4,3 5,0 4,0 MKN-45 20 5,0 20
MOLT O O O
EXEMPLE D'ESSAI 5 (a) On détermine la cytotoxicité de chacune des préparations de cellules tueuses obtenues à l'exemple 6 par l'essal de libération de Cr (J, Immunol. 122, pages 2527-2533 (1979). On ajoute 50 Ci de 51Cr radioactif (Japan Isotope Association) à des cellules
KATO-III (2.107) et on fait incuber les cellules à 37 C pendant 1 h dans le milieu RPMI-1640 et on lave suffisamment par centrifu 51 gation pour obtenir des cellules cibles marquées par Cr.On ajoute des cellules tueuses (cellules effecteurs) (2.106) aux cellules cibles (1.105) (rapport E/T = 20/1) et on fait incuber le mélange à 37 C pendant 4 h dans le milieu RPMI-1640. On recueille le liquide surnageant par centrifugation et on détermine sa radioactivité au moyen d'un compteur à scintillation à liquide.

Le taux de libération spécifique de 51Cr (%) qui correspond à l'activité cytolytique des cellules effecteurs est calculé selon l'équation suivante.

Taux de libération spécifique de 51Cr (%) = (libération dans l'essai) - (libération spontanée) (La libération maximale indique la radioactivité déterminée lorsque toutes les cellules sont lysées).

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 11 ci-après.

TABLEAU 11
Cellules tueuses Libération spéci
figue figue de 51Cr (%)
GRA-l-K-T-l 13
GRA-1-K-T-2 25
GRA-1-K-T-3 22
GRA-1-K-T-4 20
GRA-1-K-T-5 22
GRA-1-K-T-6 25
GRA-1-K-T-7 27
GRA-1-K-T-8 32
On peut voir, d'après les résultats indiqués dans le tableau 11 ci-dessus > que le TCGF et le FCS ntont pas de- relation avec l'induc- des cellules tueuses.

(b) On détermine la cytotoxicité du GRA-2-K-T obtenu à l'exemple 3 par l'essai de libération de 51Cr, de la même manière qu'en (a) cidessus. On obsarve une libération spécifique de 51Cr de 53% sur les cellules KATO-III marquées par Cr comme cellules cibles (E/T = 20/1).

EXEMPLE D'ESSAI 6 (a) En utilisant des cellules KATO-III (E/T = 20/1) comme cellules cibles, on détermine la cytotoxicité des cellules tueuses obtenues à l'exemple 7-(a) de la meme manière que dans l'exemple d'essai 2-(b).

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 12 ci-dessous.

TABLEAU 12
Cellules tueuses Cytotoxicité, %
GRA-3 -K-T-l 38,0
GRA-3-K-T-2 18,2
GRA-3-K-T-3 20,9
GRA-3-K-T-4 23,2
GRA-3-K-T-5 24,5
GRA-3-K-T-6 20,2 (b) On détermine la cytotoxicité du GRA-3-K-T-7 obtenu à l'exemple 7-(b) en utilisant des cellules KATO-III marquées par 51Cr (E/T = 20/1), comme cellules cibles, de la même manière qu'à l'exemple d'essai 5. On trouve une libération spécifique de 51Cr des cellules tueuses de 25,5%.

EXEMPLE D'ESSAI 7
On détermine la cytotoxicité des cellules tueuses obtenues à l'exemple 5 par l'essai de libération de 51Cr, de la même manière qu'à l'exemple d'essai 5. Les cellules cibles utilisées sont des cellules X5563 marquées par 51Cr. On utilise comme témoins des lymphocytes obtenus de la même manière qu'à l'exemple 5, sauf que la sensibilisation des cellules de rate est effectuée avec 1.105 cellules X5563 traitées par la mitomycine C par godet (5.106 cellules X5563 par ml traitées par 50Zg/ml de mitomycine C pendant 60 min) au lieu de GRA-M-5.

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau XIII cidessous.

TABLEAU 13
Libération spécifique de 51Cr (x)
Rapport E/T
Cellules tueuses 40:1 20:1 10:1
GRA-M-5-K-T-1 12,7 6,3 5,7
GRA-M-5 -K-T-2 18,4 20,6 13,7
Témoin 0,0 0,0 0,0
EXEMPLE D'ESSAI 8 (essai H-2)
On dilue en série du GRA-M-1, du GRA-M-3 et du GRA-M-4 obtenus dans l'exemple de référence 2 ci-dessus par le PBS (NaCl à 0,85%) pour préparer des échantillons.

On mélange du sérum anti-H-2 fabriqué par le National Institute of Genetic Research du Japon et li échantillon ci-dessus et on fait incuber à 4 C pendant 2 h et on ajoute une cellule cible correspondant au sérum anti-H-2 utilisé. On utilise canine cellules cibles des cellules de rate ou des cellules de ganglion lymphatique obtenues à partir de souris B10 (H-2b) et B10.BR (H-2k) par une technique classique. Après lavage des cellules par le PBS, on ajoute du complément (lapin) aux cellules et on fait incuber les cellules à 370C pendant 1 h et on colore par le PBS à 0,2% de Bleu trypan (Bleu
Direct 14 du Color Index) pour déterminer la cytotoxicité en %.On utilise le sérum anti-H-2 à une dilution maximale pour qu'il présente une toxicité d'au moins 95% en lu absence de GRA.

On détermine l'effet bloquant par le GRA pour les systemes indiqués dans le tableau 14 ci-dessous.

TABLEAU 14
GRA Sérum anti-H-2, concentration Cellules cibles
GRA-M-1 D-23 (anti-H-2Kk), X80 Cellules de rate
ou D-32 (anti-H-2Dk), X300 B10BR (H-2k)
GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb), X600 Cellules de rate
ou D-2 (anti-H-2Db), X80 B10 (H-2b)
GRA-M-4 D-23 , X80 Cellules de gan
ou D-32 , X300 glion lymphatique
B10.BR (h-2k)
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 15 ciaprès.

TABLEAU 15
Cytocoxicité, %
Sérum Dilution de l'échantillon
GRA anti-H-2 X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 0 * I- - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13
D-23 . 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14
D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 II - - 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14
D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15
D-2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17
III D-23 100 100 100 100 - - - - - 100 10
D-32 99 99 99 99 - - - - . 99 10
Remarques : GRA I : GRA-M-1
CRA II : GRA-M-3
GRA III: GRA-M-4
* indique la cytotoxicité lorsqu'on utilise le
complément seul.

On peut voir, d'après les résultats du tableau 15 ci-dessus que le GRA-M-11 le-GRA-M-3 et le GRA-M-4 n'ont pas de H-2.

EXEMPLE D'ESSAI 9
On transplante par voie sous-cutanée, sur des souris C57BL/6, des LLC (2.106) de la même souche et, après 6 jours, on administre par voie sous-cutanée 1 ng (protéine) de GRA-M-3 obtenu à l'exemple de référence 2-(d). On répète ensuite l'administration pendant 4 jours une fois par jour à la même dose. Le lendemain de la dernière administration, on excise et on pèse les cellules tumorales.

On utilise comme témoin des animaux auxquels on a administré du
sérum physiologique. Chaque groupe d'essai comprend 5 animaux.

On trouve que le poids moyen de la tumeur dans le groupe témoin
est d'environ 500 mg. Dans le groupe auquel on a administré le
GRA-M-31 trois animaux présentent la disparition de la tumeur et
deux ont un poids moyen de tumeur d'environ 100 mg.

EXEMPLE D'ESSAI 10
On immunise par voie sous-cutanée des souris C57BL/6 avec 1 Flg (protéine) de GRA-M-3 obtenu à l'exemple de référence 2-(d), une fois par jour pendant 3 jours et, au 5e jour, on recueille des cellules de rate chez les animaux pour obtenir les cellules effecteurs. On prépare comme cellules cible un mélange de cellules effecteurs et de carcinome pulmonaire de Lewis (LLC) dans un rapport
E/T = 50:1 et on transplante une portion de ces cellules (1.105) sur des souris de la même souche et on effectue l'essai de Winn (J. Immunol. 86. pages 228-239 (1961).

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 16 cidessous.

TABLEAU 16
Cellules Taux de croissance de la tumeur (%) Mortalité effecteurs 15 jours 17 jours 18 jours 19 jours 20 jours à 20 jours/ groupe
A 5 > 7 5,5 5,7 3,1 1,4 0/10
B 21,4 39,5 37,1 55,4 76,8 4/10
C 39,3 65,1 61,7 98,1 96,4 4j10
Remarques : Le groupe A représente les cellules de rate de souris
immunes GRA-M-3.

Le groupe B représente'les cellules de rate de souris
normales.

Le groupe C représente les cellules- de rate de souris
10 jours après la transplantation de LLC (1.106).

Le taux de croissance de la tumeur est calculé d'après l'équation suivante TA T:
Taux de croissance de la tumeur (%) = # T # x 100
N dans laquelle T représente l'épaisseur du coussinet de la patte du côté où la tumeur a été transplantée et TN l'épaisseur du coussinet de la patte normale.

EXEMPLE D'ESSAI 11
On immunise des souris C3H/He avec 4,5Zg (protéine) de GRA-M-4 obtenu à l'exemple de référence 2 (d) et 0X1 ml d'adjuvant complet de Freund dans la région sacrococcygienne. Après deux semaines on recueille des cellules de ganglions lymphatiques par une méthode classique et on les utilise comme cellules répondeurs pour déterminer la réponse de prolifération par le GRA-M-4.

A cet effet, on fait incuber les cellules répondeurs (4.105) dans le milieu RPMI-1640 contenant 15% de FCS en présence de
GRA-M-4, pendant 5 jours. Pendant les dernières 18 h de la période d'incubation, on ajoute au milieu lZCi de 3H-thymidine (3H-TdR) et on compte son incorporation dans les cellules.

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 17 cidessous.

TABLEAU 17
Concentration Incorporation de 3H-TdR *
GRA-M-4 (ng/ml) (coups'min, moyenne +) I.S,
Témoin 0 5 302 + 1 761
0,5 7 903 + 1 290 1,5
1 10 076 + 936 1,9
Expérience 5 10 686 + 429 2,0
20 10 615 + 1 270 2,0
40 8 565 + 1 419 1,6 t Indice de stimulation exprimé par le rapport experience/témoin.

EXEMPLE D'ESSAI 12
On détermine par la réaction du coussinet de la patte (FPR) la réponse d'hypersensibilité de type retardée (DTH) d'une souris normale C3H/He, d'unesouris immune X5563 et d'une souris immune
MH134 obtenues de la même manière qu'à l'exemple 5 et d'une souris immune GRA-M-4 et d'une souris immune GRA-M-5 obtenues de la même manière qu'à l'exemple d'essai 11. On essaye des cellules tumorales traitées par le GRA ou le MMC sur la peau du coussinet de la patte de derrière de 11 animal et on détermine le gonflement du coussinet 24 h après l'inoculation. Le degré de réponse DTH est calculé par soustraction du gonflement avant l'essai du gonflement après l'essai (10 2 mm).

Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 18 à 22 ci-dessous.

TABLEAU 18
Essai Augmentacion moyenne du coussinet (10-2 mm)
Souris normale Souris immune MH134
1 2,8 13,6
2 12,4 32,0
3 3,6 3,6
4 3,2 22,0
5 6,8 27,6
Remarques : Groupe 1; cellules de rate normale syngénétique
1.106/20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; cellules MH134 1.106/20)51 de milieu
Groupe 3; 20 l de milieu
Groupe 4; GRA-M-4, 0,8 g (protéine)/20 l de milieu)
Groupe 5; GRA-M-4, 0,4 g (protéine)/20 l de milieu)
TABLEAU 19
Essai Augmentation moyenne du coussiner (10-2 mm)
Souris Souris normale Souris immune X5563 Souris immune MH134
1 5,4 4,3 1,1
2 0,9 - 24,3
3 2,0 16,9
Remarques : Groupe 1; 20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; 4Zg de GRA-M-4 (protéine)/20 l de milieu
Groupe 3; 4 f de GRA-M-5 (protéine)/20 l de milieu.

TABLEAU 20
Essai Augmentation moyenne du coussinet (10-2 mm)
Souris normale Souris immune GRA-M-4
1 1,7 -0,3
2 5,1 24,6
Remarques : Groupe 1; 20 l de milieu (solution Hanks)
Groupe 2; 4Zg de GRA-M-4 (protéine)/20 l de milieu.

TABLEAU 21
Essai Augmentation moyenne du coussinet (10-2) mm)
Souris Souris normale Souris immune GRA-M-4
1 -1,8 0,6
2 6,3 20,0
3 6,8 6,3
Remarques : Groupe 1; 20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; 4Zg de GRA-M-4 (protéine)/20 l de milieu
Groupe 3; 4ug (protéine)/20 l de milieu de la fraction
qui passe à travers la colonne de PNA au moment
de GRA-M-4 (ci-après "C.P.")
TABLEAU 22
Essai Augmentation moyenne du coussinet (10 -t)
Souris normale Souris immune GRA-M-4
1 2,4 -1,0
2 2,6 17,7
3 2,4 1,8
4 5,5 18,9
Remarques :Groupe 1; 20 l de milieu (solution de Hanks)
Groupe 2; 3,8g de GRA-M-4 (protéine)/20 l de milieu
Groupe 3; 3,8Zg (protéine)/20 l milieu de "C.P." ci
dessus
Groupe 4; 3,8Zg(protéine) de GRA-M-4 et 3,8 g
(protéine)/20u1 de milieu de "C.P."
ESSAI DE REFERENCE
On obtient une souris immune X5563 de la même manière qu'à l'exemple 5. On utilise des cellules de rate de cette souris immune comme cellules effecteurs et on transplante simultanément les cellules effecteur (107) et les cellules cibles (X5563, 105) sur des souris de la même souche. On effectue l'essai de Winn de la même manière qu'à l'exemple d'essai 10.

Les résultats obtenus sont indiqués dans la figure 23 ci-après, dans laquelle les abscisses indiquent le temps en jours, et les ordonnées la dimension moyenne de la tumeur (cm2) + écart-type () et les différents signes ont la signification suivante

Groupe dans lequel on n'ajoute pas de cellules effecteurs.

Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs non traitées.

Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs traitées avec le complément de lapin.

Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs traitées avec l'anti-Thy 1 (Société New England Nuclear Co., E.U.A.), et le complément de lapin.

Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs traitées avec l'anti-Lyt 1 (Société New England Nuclear Co., E.U.A.), et le complément de lapin.

Groupe dans lequel on ajoute les cellules effecteurs trai
tées par l'anti-Lyt 2 (Société New England Nuclear Co.,
E.U.A.) et le complément de lapin.

On peut voir, d'après les résultats indiqués dans la figure 23 que les cellules T du type Lyt-l jouent un rôle important dans le mécanisme d'effecteurs in vivo dans l'immunité tumorale.
En outre, on sait que la réponse de DTH est à médiation par les cellules T de type Lyt-l (J. Exp. Med. 143, pages 1534-1539 (1976)).

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.

Claims (35)

REVENDICATIONS

1. Lymphocytes, cytotoxiques vis- -vis des cellules cancer reuses, spécifiques d'un antigène glyco-apparenté dérivant de cellules cancereuses, caractérisés en ce qu'on les prépare par sensibilisation des lymphocytes avec un antigène glyco-apparenté derivé de cellules cancéreuses.

2. Lymphocytes selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant de manière spécifique avec un groupe terminal galactose ou N-acétylgalactosamine.

3. Lymphocytes selon la revendication 2, caractérisés en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant specifiquement avec un groupe terminal galactose.

4. Lymphocytes selon la revendication 2, caractérisés en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant de manière spécifique avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.

5. Procédé pour la production de lymphocytes cytotoxiques vis-à-vis des cellules cancereuses,caracterisé en ce qu'il consiste à sensibiliser des lymphocytes avec un antigène glyco-apparenté dérive de cellules cancéreuses.

6. Procedé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'antigène glyco-apparente est un compoeantdemembrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant spécifiquement avec un groupe terminal galactose ou N-acétylgalactosamine.

7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant specifique- ment avec un groupe terminal galactose.

8. Procedé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'antigène glyco-apparente est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant specifique- ment avec un groupe terminal N-acétylgalactosamine.

9. Nouveaux médicaments utiles notamment comme agents anticancereux, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme produit actif des lymphocytes, cytotoxiques vis-à-vis des cellules cancéreuses, spécifiques d'un antigène glyco-apparenté dérivant de cellules cancereuses.

10. Médicaments selon la revendication 9, caractérisés en ce que les lymphocytes cytotoxiques vis-a-vis des cellules cancéreuses sont préparés par sensibilisation des lymphocytes avec un antigène glyco-apparente derivant de cellules cancéreuses.

11. Médicaments selon la revendication 9 ou 10, caractérisés en ce que l'antigène glyco-apparente est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant spécifiquement avec un groupe terminal galactose ou N-acetylgalactosamine.

12. Médicaments selon la revendication 11, caractérisés en ce que antigène glyco-apparente est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant spécifiquement avec un groupe terminal galactose.

13. Medicaments selon la revendication 11, caracterises en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant specifiquement avec un groupe terminal N-acétylgalactosamine.

14. Médicaments anticancéreux, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme produit actif un antigène glyco-apparenté dérivant de cellules cancéreuses

15. Medicaments selon la revendication 14, caractérisés en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant specifiquement avec un groupe terminal galactose ou N-acetylgalactosa- mine.

16. Médicaments selon la revendication 15, caractérises en ce que l'antigène glyco-apparente est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant spécifiquement avec nn groupe terminal galactose.

17. Médicaments selon la revendication 15, caractérisés en ce que l'antigène glyco-apparenté est un composant de membrane de cellules cancéreuses qui se combine avec une lectine se combinant spécifiquement avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.

18. Nouvel antigène glyco-apparenté, caractérisé en ce qu'on l'isole d'un composant de membrane de cellules cancéreuses humaines et en ce qu'ilpeut se combiner avec une lectine qui peut se combiner avec un groupe terminal galactose ou N-acétylgalactosamine.

19. Antigène glyco-apparenté selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est préparé par isolement d'un antigène glyco-apparente d'un composant de membrane de cellules cancéreuses humaines avec une lectine qui peut se combiner specifiquement avec un groupe terminal galactose ou N-acétylgalactosamine.

20. Antigène glyco-apparente selon la revendication 19, caractérisé en ce que la lectine est du type qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal galactose.

21. Antigène glyco-apparenté selon la revendication 20, caractérisé en ce que la lectine est la lectine d'arachide, la lectine de Ricinus communis ou la lectine de soja.

22. Antigène glyco-apparenté selon la revendication 21, caractérisé en ce que la lectine est la lectine d'arachide.

23. Antigène glyco-apparenté selon la revendication 19, caractérise en ce que la lectine est du type qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.

24. Antigène glyco-apparente selon la revendication 23, caractérisé en ce que la lectine est choisie parmi l'agglutinine de Dolichos, la lectine de "braid orange", la lectine de Helix pomatia, la lectine de haricot de Lima, la lectine de soja et la lectine de Bauhinia.

25. Antigène glyco-apparente selon la revendication 24, caractérisé en ce que la lectine est l'agglutinine de Dolichos.

26. Antigène glyco-apparente,caracterise en ce qu'on le prépare en isolant un antigène glyco-apparenté dgun composant de membrane de cellules cancéreuses humaines d'abord avec unepremière lectine qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal galactose et ensuite avec une seconde lectine qui se combine specifiquement avec un groupe terminal N-acetylgalactosamine.

27. Antigène glyco-apparenté selon la revendication 26, caractérise en ce que la première lectine est la lectine d'arachide et la seconde lectine est ltagglutinine Dolichos.

28. Procédé pour la préparation d'un antigène glyco-apparenté > caractérisé en ce qu'on isole un antigène glyco-apparente qui peut se combiner avec une lectine se combinant spécifiquement avec un groupe terminal galactose ou un acétylgalactosamine.

29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que l'on isole un antigène glyco-apparente d'un composant de membrane de cellules cancéreuses humaines avec une lectine qui se combine spécifiquement avec un grbupe terminal galactose ou N-acétylgalactosanine.

30. Procedé selon la revendication 29, caractérisé en ce que la lectine est du type qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal galactose.

31. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que la lectine est du type qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal N-galactosamine.

32. Procéde pour la préparation d'un antigène glyco-apparenté, caractérisé en ce qu'on isole un antigène glyco-apparenté d'un composant de membrane de cellules cancéreuses humaines d'abord par une première lectine qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal galactose et ensuite avec une seconde lectine qui se combine spécifiquement avec un groupe terminal N-acétylgalactosamine.

33. Procédé selon la revendication 32, caractérise en ce que la première lectine est le lectine de soja et la seconde lectine est l'agglutinine de Dolichos.

34. Médicaments selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisés en ce qu'ils sont conditionns à des concentrations de 105 à 10 lymphocytes par ml.

35. Médicaments selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caracterises en ce qu'ils sont conditionnés à la concentration de 0,001 à 100 / g de produit actif (en sucres)/ml.