FI77157C - FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV GLYKOBUNDEN ANTIGEN OCH FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV FOER KANCERCELLER TOXISKA LYMFOCYTER, SOM AER SPECIFIKA MOT DENNA Antigen. - Google Patents

FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV GLYKOBUNDEN ANTIGEN OCH FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV FOER KANCERCELLER TOXISKA LYMFOCYTER, SOM AER SPECIFIKA MOT DENNA Antigen. Download PDF

Info

Publication number
FI77157C
FI77157C FI822325A FI822325A FI77157C FI 77157 C FI77157 C FI 77157C FI 822325 A FI822325 A FI 822325A FI 822325 A FI822325 A FI 822325A FI 77157 C FI77157 C FI 77157C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gra
cells
lectin
cancer
antigen
Prior art date
Application number
FI822325A
Other languages
Finnish (fi)
Swedish (sv)
Other versions
FI77157B (en
FI822325L (en
FI822325A0 (en
Inventor
Masakazu Adachi
Original Assignee
Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP15641481A external-priority patent/JPS5857321A/en
Priority claimed from JP56156413A external-priority patent/JPS5857318A/en
Priority claimed from JP56158472A external-priority patent/JPS5859922A/en
Priority claimed from JP56158473A external-priority patent/JPS5859923A/en
Priority claimed from JP57111168A external-priority patent/JPS591420A/en
Application filed by Otsuka Pharma Co Ltd filed Critical Otsuka Pharma Co Ltd
Publication of FI822325A0 publication Critical patent/FI822325A0/en
Publication of FI822325L publication Critical patent/FI822325L/en
Publication of FI77157B publication Critical patent/FI77157B/en
Application granted granted Critical
Publication of FI77157C publication Critical patent/FI77157C/en

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515Animal cells
    • A61K2039/5158Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

1 771571 77157

Menetelmä glykosidonnaisen antigeenin valmistamiseksi ja menetelmä tälle antigeenille spesifisten syöpäsoluille myrkyllisten lymfosyyttien valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää glykosidonnaisen antigeenin valmistamiseksi, joka on eristetty ihmis- tai eläinsyöpäsolumembraanin aineosasta ja joka liittyy lek-tiiniin, joka sitoutuu pääteasemassa olevan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin.The present invention relates to a process for the preparation of a glycosidone antigen isolated from a component of the human or animal cancer cell membrane ascosylate, which binds to a galacto-terminal galactose component and binds to a lectin

10 Antigeenistä käytetään tästedes lyhennettä "GRA". Keksintö koskee lisäksi menetelmää syöpäsoluille myrkyllisten lymfosyyttien valmistamiseksi, jotka ovat spesifisiä glykosidonnaisten antigeeniä vastaan, joka on eristetty ihmis- tai eläinsyöpäsolumembraanin aineosasta ja joka 15 liittyy lektiiniin, joka sitoutuu pääteasemassa olevaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyligalaktoosiamiiniin.. Soluista käytetään tästedes lyhennettä "tappajasolut" ja ne toimivat syöpäsoluja vastaan, jotka sisältävät glykosidonnaista syöpäsoluista lähtöisin ole-20 vaa antigeeniä.10 The antigen is hereinafter referred to as "GRA". The invention further relates to a method for producing lymphocytes toxic to cancer cells, specific for a glycosidone antigen isolated from a human or animal cancer cell membrane component and associated with a lectin that binds to galactose at the terminal cell or to the N-acetyl lactone and they act against cancer cells that contain a glycosidone-derived antigen from the cancer cells.

j On tunnettua, että immuunivasteen aikaansaavat so lut, erityisesti solujen välityksellä tapahtuvassa immuunivasteessa pääosassa olevat T-lymfosyytit, aiheuttavat vieraiden solujen antigeenien takia siirrännäisen hylki-25 mistä, mutta estävät hyvin rajoitetusti tai mitättömässä määrin syöpäsoluja. Siten syöpäsolut eivät tuhoudu, vaan jakautuvat in vivo aiheuttaen lopulta syöpää sairastavan kuoleman.It is known that cells that elicit an immune response, especially T lymphocytes, which play a major role in the cell-mediated immune response, cause graft rejection due to foreign cell antigens, but inhibit cancer cells to a very limited or negligible extent. Thus, cancer cells are not destroyed, but divide in vivo, eventually causing cancer death.

Kuitenkaan mekanismi, joka saa aikaan omien solu-30 jen erottamisen vieraista, ei ole täysin selvä ja on tehty erilaisia tutkimuksia tällaisen systeemin materiaali-pohjan luonteen selvittämiseksi. Esimerkiksi hiiren leu-kemiasolujen tai sikiön syöpäsolujen pintamerkkiaineita, joissa käytetään lektiinejä, kuten Dolichos biflorus 35 -agglutiniinia (DBA) ja maapähkinäagglutiniinia (PNA), 2 77157 kuvataan julkaisuissa Biochem. Biophys. Res. Conan. 89(2) (1979) 448-455, ibid. 96(4) (1980) 1547-1553, J. Biochem. 89 (1981) 473-481 ja Cell 18 (syyskuu 1979) 183-191.However, the mechanism that causes the separation of own cells from foreign ones is not entirely clear and various studies have been performed to elucidate the nature of the material-base of such a system. For example, surface markers for mouse Leu chemistry cells or fetal cancer cells using lectins such as Dolichos biflorus 35 agglutinin (DBA) and peanut agglutinin (PNA), 2 77157 are described in Biochem. Biophys. Res. Conan. 89 (2) (1979) 448-455, ibid. 96 (4) (1980) 1547-1553, J. Biochem. 89 (1981) 473-481 and Cell 18 (September 1979) 183-191.

Tähänastisen tiedon mukaan ei kuitenkaan ole tehty 5 mitään huomattavia yrityksiä valmistaa uusia lymfosyyttejä, jotka pystyvät toimimaan spesifisesti syöpäsoluja vastaan ja myös syövän vastaisina aineina, jotka käyttävät hyväkseen lymfosyyttien immuunivastetta.However, to date, no significant attempts have been made 5 to produce new lymphocytes capable of acting specifically against cancer cells and also as anti-cancer agents that take advantage of the lymphocyte immune response.

Isännän immuunivastetta syöpäsoluille ja sen sovel-10 tamista syövän hoitoon koskevien laajojen tutkimustulosten tuloksena on nyt havaittu, että syöpäsoluille ominaisessa antigeenissä, jota ei esiinny erilaistuneissa normaa-lisoluissa, on GRA:a, joka toimii immunogeenina isännälle, ja jolla on hyvin voimakas immuniteettia aiheuttava 15 vaikutus, joka aiheutuu syöpäsoluja vastaan spesifisen immuunivasteen. Lisäksi on havaittu, että kun käytetään GRA:n lymfosyyttien herkistämiseen, voidaan saada tappajasoluja, jotka toimivat spesifisesti GRA:a sisältäviä syöpäsoluja vastaan tuhoten ne, ja joilla on siten erin-20 omainen vaikutus syövän hoidossa ja estämisessä.Extensive research into the host immune response to cancer cells and its application to cancer treatment has now shown that an antigen specific to cancer cells, which is not present in differentiated normal cells, contains a GRA that acts as an immunogen to the host and has a very potent immunogenic effect. effect caused by a specific immune response against cancer cells. In addition, it has been found that when GRA is used to sensitize lymphocytes, killer cells can be obtained that act specifically against GRA-containing cancer cells, destroying them and thus having an excellent effect in the treatment and prevention of cancer.

Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle GRA:n valmistamiseksi on tunnusomaista, että ihmis- tai eläinsyö-päsolujen solumembraanin aineosat saadaan homogenoimalla tai liuottamalla, solumembraanin aineosat käsitellään lektiinillä, joka spesifisesti sitoutuu pääteasemassa ole-25 vaan galaktoosiin tai pääteasemassa olevaan N-asetyyliga-laktoosiamiiniin muodostaen lektiini-solumembraaniaine-osakompleksin ja eristetään lektiiniin sitoutunut glyko-sidonnainen antigeeni ja siitä glykosidonnainen antigeeni.The method of the present invention for the preparation of GRA is characterized in that the cell membrane components of human or animal cancer cells are obtained by homogenization or dissolution, the cell membrane components are treated with lectin which specifically binds to terminal galactose or terminal N-acetyl-lactose-lactose lactose. cell membrane substance sub-complex and isolating the lectin-bound glycos-bound antigen and the glycos-bound antigen therefrom.

Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle tappaja-30 solujen valmistamiseksi on tunnusomaista, että ihmisen tai eläimen lymfosyyttejä herkistetään kasvattamalla niitä 1-10 vuorokautta tavanomaisessa ravintoalustassa, joka lisäksi sisältää 1-1000 ng/ml keksinnön mukaisesti valmistettua glykosidonnaista antigeeniä, laskettuna sokeri-35 määränä 1·10^ lymfosyyttiä kohti millilitrassa.The method of the present invention for producing killer-30 cells is characterized in that human or animal lymphocytes are sensitized by growing them for 1-10 days in a conventional medium further containing 1-1000 ng / ml of a glycosidic antigen prepared according to the invention, calculated as 1 ^ per lymphocyte per milliliter.

3 771573 77157

Lyhyt selitys kuvioistaBrief explanation of the figures

Kuvio 1 on mikrovalokuva Daudi-syöpäsoluista;Figure 1 is a photomicrograph of Daudi cancer cells;

Kuvio 2 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-1-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 1 syöpäsoluille; 5 Kuvio 3 on mikrovalokuva KATO-III-syöpäsoluista;Figure 2 is a photomicrograph showing GRA-1-K-T-induced spot formation on the cancer cells of Figure 1; Figure 3 is a photomicrograph of KATO-III cancer cells;

Kuvio 4 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 3 syöpäsoluille;Figure 4 is a photomicrograph showing GRA-1-K-T-induced spot formation on the cancer cells of Figure 3;

Kuvio 5 on mikrovalokuva BT-l-syöpäsoluista;Figure 5 is a photomicrograph of BT-1 cancer cells;

Kuvio 6 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n 10 aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 5 syöpäsoluille;Fig. 6 is a photomicrograph showing the formation of spots on the cancer cells of Fig. 5 caused by GRA-1-K-T 10;

Kuvio 7 on mikrovalokuva MKN-45-syöpäsoluista;Figure 7 is a photomicrograph of MKN-45 cancer cells;

Kuvio 8 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 7 syöpäsoluille;Figure 8 is a photomicrograph showing GRA-1-K-T-induced spot formation on cancer cells of Figure 7;

Kuvio 9 on mikrovalokuva MOLT-syöpäsoluista; 15 Kuvio 10 on mikrovalokuva, joka esittää GRA-l-K-T:n aiheuttamaa täplien muodostumista kuvion 9 syöpäsoluille;Figure 9 is a photomicrograph of MOLT cancer cells; Fig. 10 is a photomicrograph showing GRA-1-K-T-induced spot formation on the cancer cells of Fig. 9;

Kuvio 11 on mikrovalokuva BT-l:sta, joka on käsitelty ihmisen ääreisverenkierron herkistymättömien lymfosyyttien seoksella; 20 Kuviot 12 ja 13 ovat molemmat mikrovalokuvia, jot ka esittävät syöpää sairastavan hiiren, jolle on annettu GRA-M-l:K:a, syöpäsolukkoa;Figure 11 is a photomicrograph of BT-1 treated with a mixture of non-sensitized human peripheral blood lymphocytes; Figures 12 and 13 are both photomicrographs showing a cancer cell of a cancerous mouse given GRA-M-1: K;

Kuvio 14 on mikrovalokuva, joka esittää syövän tilaa syöpää sairastavassa hiiriryhmässä, jolle on an-25 nettu GRA-M-l:a;Figure 14 is a photomicrograph showing the cancer status in a group of cancer-treated mice given GRA-M-1;

Kuvio 15 on mikrovalokuva, joka esittää syövän tilaa syöpää sairastavassa hiiriryhmässä, jolle ei ole annettu GRA-M-l:a;Figure 15 is a photomicrograph showing the cancer status in a group of cancer-naïve mice not given GRA-M-1;

Kuvio 16 on mikrovalokuva, joka esittää syöpää 30 sairastavan hiiriryhmän, jolle ei ole annettu GRA-M-l:a, syöpäsolukkoa.Figure 16 is a photomicrograph showing a cancer cell of a group of 30 murine mice not administered GRA-M-1.

Kuvio 17 on mikrovalokuva ryhmän, jolle on annettu GRA-M-l:a, syöpäsolukosta;Figure 17 is a photomicrograph of a cancer cell from a group given GRA-M-1;

Kuvio 18 esittää GRA:ri SDS-geelielektroforeesidia-35 grammia, jossa on käytetty C.B.B-menetelmän mukaista pro-teiinivärjäystä; 4 77157Figure 18 shows 35 grams of GRA SDS gel electrophoresiside using protein staining according to the C.B.B method; 4 77157

Kuviot 19-21 esittävät GRA:n SDS-geelielektroforee-sidiagrammia, joka on värjätty PAS-menetelmän mukaisesti sokerivärjäyksellä;Figures 19-21 show an SDS gel electrophoresis diagram of GRA stained according to the PAS method with sugar staining;

Kuvio 22 on kaaviokuva, joka esittää tuloksia 5 GRA:n SDS-elektroforeesidiagrammista, jossa on käytetty C.B.B-menetelmän mukaista proteiinivärjäystä;Fig. 22 is a schematic diagram showing the results of an SDS electrophoresis diagram of 5 GRAs using protein staining according to the C.B.B method;

Kuvio 23 esittää käyrää, joka osoittaa kasvainten kasvunopeuden C3H/HE-hiirellä, jolle on siirrostettu X5563-immuunihiiren pernasoluja ja X5563-soluja.Figure 23 is a graph showing tumor growth rate in a C3H / HE mouse inoculated with X5563 immune mouse spleen cells and X5563 cells.

10 Lymfosyyttien valmistuksessa käytettävä GRA voi daan saada GRA:a sisältävistä ihmisen tai eläinten syöpäsoluista, esimerkiksi viljellyistä syöpäsoluista, siirretyistä syöpäsoluista, spontaanisti esiintyvistä syöpäsoluista, kemiallisella aineella tai viruksilla indu-15 soiduista syöpäsoluista ja leikatuista kudoksista saaduista syöpäsoluista, seuraavalla menetelmällä.10 The GRA used in the production of lymphocytes can be obtained from human or animal cancer cells containing the GRA, for example, cultured cancer cells, transplanted cancer cells, spontaneously occurring cancer cells, chemical or virus-induced cancer cells, and cut tissue derived cells.

Solumembraanin aineosat erotetaan syöpäsoluista, joita on kuvattu yllä ja käsitellään lektiinillä, joka liittyy spesifisesti pääteasemassa olevaan galaktoosiin 20 tai N-asetyyligalaktoosiamiiniin,jolloin GRA liittyy lek-tiiniin ja on helppo erottaa.The cell membrane components are separated from the cancer cells described above and treated with a lectin specifically associated with the terminal galactose 20 or N-acetylgalactosamine, whereby the GRA is associated with the lectin and is easily separated.

Soveltuvia esimerkkejä galaktoosiin sitoutuvista lektiineistä ovat maapähkinälektiini, Ricinus communis -lektiini ja soijapapu (Glycine max) -lektiini /les.Suitable examples of galactose-binding lectins are peanut lectin, Ricinus communis lectin and soybean (Glycine max) lectin / les.

25 J.B.C. 250 (1975) 8518-8523; Biochem. Biophys. Res. Comm. 62 (1975) 144; Z. Immuniteatsforch 138 (1969) 423-433;25 J.B.C. 250 (1975) 8518-8523; Biochem. Biophys. Res. Comm. 62 (1975) 144; Z. Immuniteatsforch 138 (1969) 423-433;

Br.J.Exp. Pathol. 27 (1946) 228-236; Proc. Nath. Acad.Br.J.Exp. Pathol. 27 (1946) 228-236; Proc. Nath. Acad.

Sei. USA 75(5) (1978) 2215-2219; Biochemistry 13 (1974) 196-204; ja Carbohydrate Research 51 (1976) 107-11S7.Sci. USA 75 (5) (1978) 2215-2219; Biochemistry 13 (1974) 196-204; and Carbohydrate Research 51 (1976) 107-11S7.

30 Soveltuvia esimerkkejä N-asetyyligalaktoosiamiineihin sitoutuvista lektiineistä ovat Dolichos-papu (Dolichos biflorus) -agglutiniini, braid-appelsiinilektiini. Helix pomatia -lektiini, limanpapu (Phaseolus limensis) -lektiini, soijapapu (Glycine max) -lektiini ja Bauhinia-papu 35 (Bauhinia purpurea) -lektiini.Suitable examples of lectins that bind to N-acetylgalactose amines are Dolichos bean (Dolichos biflorus) agglutinin, braid-orange lectin. Helix pomatia lectin, mucus bean (Phaseolus limensis) lectin, soybean (Glycine max) lectin and Bauhinia bean 35 (Bauhinia purpurea) lectin.

5 771 575,771 57

Syöpäsolumerabraanin aineosien erottaminen voidaan tehdä tunnetuilla menetelmillä, kuten homogenoimalla ja liuottamalla liuottavaa ainetta apuna käyttäen. On edullisempaa käyttää menetelmää, jossa syöpäsolut homogenoi-5 daan fysiologisessa suolaliuoksessa tai soveltuvassa puskurissa saostunut osa kerätään esimerkiksi erottamalla sentrifugoimalla ja liuotetaan fysiologiseen suolaliuokseen tai puskuriin liuottavaa ainetta apuna käyttäen ja supernatantti erotetaan esimerkiksi sentrifugoi-10 maila. Liuottaviin aineisiin, joita voidaan käyttää kuuluvat pinta-aktiiviset aineet, joiden tiedetään yleensä pystyvän liuottamaan solumembraania, kuten ei-ioniset pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi TRITON X-100 (valmistaja Wako Pure Chemical Industries Ltd., NP-40 (val-15 mistaja Shell Co., Ltd.), digitoniini ja urea ja anioni-set pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi natriumdodekyy-: lisulfonaatti (SDS).Separation of the components of the cancer cell membrane can be accomplished by known methods, such as homogenization and dissolution with the aid of a solubilizing agent. It is more preferred to use a method in which cancer cells are homogenized in physiological saline or a suitable buffer, the precipitated portion is collected, for example, by separation by centrifugation and dissolved in physiological saline or buffer with the aid of a solubilizing agent, and the supernatant is separated by centrifugation. Solvents that can be used include surfactants that are generally known to be capable of dissolving the cell membrane, such as nonionic surfactants, for example, TRITON X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries Ltd., NP-40). Shell Co., Ltd.), digitonin and urea and anionic surfactants, for example sodium dodecyl sulfonate (SDS).

Siten saaduista solukalvokomponenteista voidaan erottaa lektiiniin sitoutumaan kykenevä GRA tavanomaisin 20 fysikaalisin, kemiallisin tai biokemiallisin menetelmin, - ; joissa käytetään hyväksi lektiinin ominaisuuksia. Esi merkkejä tällaisista menetelmistä ovat affiniteettikro-matografia, jossa käytetään hyväksi lektiiniä sisältävää kantajaa pylväässä, immuunisaostus, jossa käytetään 25 GRA-vasta-ainetta tai vastaavaa, dialyysi, geelisuodatus, elektroforeesi, fysikaalinen saostus käyttäen saostimena sokereita ja proteiineja saostavaa ainetta, esimerkiksi ' polyetyleeniglykolia ja asetonia sekä niiden yhdistelmät.The GRA capable of binding to lectin can be separated from the cell membrane components thus obtained by conventional physical, chemical or biochemical methods, -; utilizing the properties of lectin. Examples of such methods include affinity chromatography utilizing a lectin-containing support on a column, immunoprecipitation using 25 GRA antibodies or the like, dialysis, gel filtration, electrophoresis, physical precipitation using sugars and proteins as precipitant, e.g. acetone and combinations thereof.

Edullisempi on affiniteettikromatografia, jossa 1/. 30 käytetään lektiinipitoista kantajaa pylväässä, joka kan- taja on helppo valmistaa sitomalla lektiiniä liukenemat-.| tomaan alustaan. Tällainen lektiinin kiinnittäminen voi- daan tehdä tunnetuin menetelmin, joita tavanomaisesti käytetään biologisten aineiden sitomiseen. Näistä mene-35 telmistä on edullista käyttää syaanibromidipolysakkaridi- 6 77157 menetelmää ja kiinnitysmenetelmää, jossa käytetään N-hydroksimeripihkahappoimidiestereitä. Syaanibromidiak-tivointi-polysakkaridimenetelmä on menetelmä, jossa liukenematon alusta käsitellään syaanibromidilla ja siten 5 saadulle aktivoidulle tuotteelle tehdään liittämisreak-tio lektiinin kanssa miedoissa olosuhteissa lektiinin kiinnittämiseksi. Käsiteltäessä liukenematonta alustaa syaanibromidilla, käytetään esimerkiksi emäksisiä yhdisteitä, kuten natriumhydroksidia ja natriumbikarbonaat-10 tia, pH:n säätämiseksi arvoon 7,5-12 ja alusta käsitellään liuottimessa, kuten vedessä, asetonitriilissä tai pH-arvoon 7,5-12 säädetyssä puskurissa, 0,1 M natrium-bikarbonaattipuskurissa (pH noin 8,7) ja 0,01 M fosfaattipuskurissa (pH noin 7,7), huoneen lämpötilassa 15 noin 1-12 minuuttia. Syaanibromidin määrän on tavallisesti edullista olla yhtä suuri kuin liukenemattoman alustan määrä.More preferred is affinity chromatography in which 1 /. 30 uses a lectin-containing support in a column which is easy to prepare by binding the lectin to the soluble. to the ground. Such attachment of lectin can be done by known methods conventionally used for binding biological agents. Of these methods, it is preferable to use the cyanogen bromide polysaccharide method and the attachment method using N-hydroxysuccinimide esters. The cyanogen bromide activation polysaccharide method is a method in which an insoluble support is treated with cyanogen bromide and the activated product thus obtained is subjected to a coupling reaction with lectin under mild conditions to fix the lectin. When treating an insoluble medium with cyanogen bromide, for example, basic compounds such as sodium hydroxide and sodium bicarbonate are used to adjust the pH to 7.5-12 and the medium is treated in a solvent such as water, acetonitrile or a buffer adjusted to pH 7.5-12. In 1 M sodium bicarbonate buffer (pH about 8.7) and 0.01 M phosphate buffer (pH about 7.7) at room temperature for about 1-12 minutes. The amount of cyanogen bromide is usually preferably equal to the amount of insoluble support.

Keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua liukenematonta alustaa, jolla on alhainen ei-spesi-20 finen adsorptiokyky kaikkien biologisten aineiden suhteen, korkea huokoisuusaste ja joka sisältää funktionaalisen ryhmän, joka pystyy sitomaan biologisia aineita lievissä olosuhteissa ja on kemiallisesti ja fysikaalisesti kyllin pysyvää. Käyttökelpoisiin liukenemattomiin 25 alustoihin kuuluvat selluloosasta, esimerkiksi amino- etyyliselluloosasta, karboksimetyyliselluloosasta, bromi-asetyyliselluloosasta ja p-aniliiniselluloosasta, valmistetut alustat, ristisidoksia sisältävästä dekstraa-nista, esimerkiksi Sephadexista ja CM-sephadexista (val-30 mistaja Farmacia Corp.), valmistetut alustat ja agaroo-sista, esimerkiksi Sepharose 2B:sta, Sepharose 4B:sta ja Sepharose 6B:sta (valmistaja Farmacia Corp.), valmistetut alustat.Any known insoluble support having a low non-specific adsorption capacity for all biological agents, a high degree of porosity and containing a functional group capable of binding biological agents under mild conditions and sufficiently chemically and physically stable can be used in the invention. Useful insoluble media include media made from cellulose, for example aminoethylcellulose, carboxymethylcellulose, bromoacetylcellulose and p-aniline cellulose, cross-linked dextran from Farm, for example, from Sephadex and CM-sephadex. media made from agarose, for example Sepharose 2B, Sepharose 4B and Sepharose 6B (manufactured by Farmacia Corp.).

Tehtäessä liittämisreaktio yllä mainitulla ta-35 valla saadun syaanibromidilla aktivoidun alustan ja lek- 7 77157 tiinin välillä syaanibromidilla aktivoitua alustaa käytetään 30-80-kertainen määrä lektiiniin nähden ja niiden annetaan reagoida soveltuvassa liuottimessa, kuten 0,1 M natriumbikarbonaatin vesiliuoksessa (joka sisältää 5 0,5 mol/1 natriumkloridia: pH 8,4) lämpötilassa 0-40°C, edullisesti 2-8°C, noin 10-20 tunnin ajan. Tällä tavalla voidaan valmistaa affiniteettikromatografiässä käytettävä lektiiniä sisältävä kantaja.In the coupling reaction between the cyanogen bromide-activated medium obtained in the above-mentioned manner and the lectin, the cyanogen bromide-activated medium is used in an amount of 30 to 80 times that of lectin and reacted in a suitable solvent such as 0.1 M aqueous sodium bicarbonate solution (containing , 5 mol / l sodium chloride: pH 8.4) at a temperature of 0-40 ° C, preferably 2-8 ° C, for about 10-20 hours. In this way, a lectin-containing support for affinity chromatography can be prepared.

Kromatografiässä, jossa käytetään yllä mainitulla 10 tavalla valmistettua lektiinipitoista kantajaa, haluttu GRA liittyy kantajassa olevaan lektiiniin ja jää pylvääseen. Sen jälkeen pylvään läpi voidaan johtaa aineita, jotka pystyvät liittymään esimerkiksi lektiiniin, vaihtoreaktion aikaansaamiseksi tai vaihtoehtoisesti ko-15 lonnin läpi johdetaan desorboivaa ainetta (eluointiliuos-ta), esimerkiksi väkevöityä suolaliuosta, kaliumtiosya- naatin vesiliuosta tai nitraattipuskuria, jolloin ha- " luttu GRA irtoaa ja saadaan talteen.In chromatography using a lectin-containing support prepared as described above, the desired GRA binds to the lectin in the support and remains on the column. Substances capable of binding to, for example, lectin may then be passed through the column to effect an exchange reaction, or alternatively a desorbent (eluting solution), for example concentrated brine, aqueous potassium thiocyanate or nitrate buffer, may be passed through the column to give the desired GRA. and recovered.

Vaihtoreaktiossa, esimerkkejä aineista, jotka V” 20 pystyvät liittymään lektiiniin silloin, kun käytetään affiniteettikromatografiässä kantajaa, joka sisältää galaktoosia sitovaa lektiiniä, ovat aineet, jotka voivat liittyä pääteasemassa olevaan galaktoosiin sitoutuneeseen lektiiniin, esimerkiksi galaktoosi ja di- ja 25 oligosakkaridit, jotka sisältävät pääteasemassa olevan . . galaktoosiryhmän; esimerkkejä aineista, jotka pystyvät liittymään lektiiniin silloin, kun affiniteettikromato-grafiassa käytetään kantajaa, joka sisältää N-asetyyli-: galaktoosiamiinia sitovaa lektiiniä, ovat aineet, jotka : 30 pystyvät liittymään pääteasemassa olevaan N-asetyyli- galaktoosiamiiniin sitoutuneeseen lektiiniin, esimerkiksi N-asetyyligalaktoosiamiini ja di- ja oligosakkaridit, jotka sisältävät pääteasemassa olevan N-asetyyligalak-toosiamiinin.In the exchange reaction, examples of substances which V "20 are capable of binding to lectin when a carrier containing galactose-binding lectin is used in affinity chromatography are substances which may bind to a galactose-bound lectin at the terminal position, for example galactose and di- and oligosaccharides. . . galaktoosiryhmän; Examples of substances that can bind to lectin when a carrier containing N-acetyl-galactosamine-binding lectin is used in affinity chromatography are substances that are able to: bind to a terminal N-acetyl-galactosamine-bound lectin, e.g. N-acetyl di- and oligosaccharides containing the terminal N-acetylgalactosamine.

35 Siten saatu GRA sisältää glykoproteiinia, joka 8 77157 sisältää pääteasemassa olevaa galaktoosia ja/tai N-asetyy-ligalaktoosiamiinia sekä glykolipidiä ja/tai sakkaridia.The GRA thus obtained contains a glycoprotein which contains 8 77157 galactose and / or N-acetyl ligactose amine as well as a glycolipid and / or saccharide.

Siten valmistettu GRA voidaan haluttaessa kylmä-kuivata sekä puhdistaa edelleen tavanomaisia erotusmene-5 telmiä käyttäen. GRA-valmisteet, jotka on eristetty galaktoosia sitovan lektiinin avulla voidaan esimerkiksi erottaa menetelmällä, jossa käytetään N-asetyyligalak-toosiamiinia sitovaa lektiiniä ja ne jotka on eristetty N-galaktoosiamiinia sitovan lektiinin avulla, voidaan 10 käsitellä erotusmenetelmällä, jossa käytetään galaktoosia sitovaa lektiiniä.The GRA thus prepared can, if desired, be freeze-dried and further purified using conventional separation methods. For example, GRA preparations isolated by galactose-binding lectin can be separated by a method using N-acetylgalactosamine-binding lectin and those isolated by N-galactose amine-binding lectin can be treated by a separation method using galactose-binding lectin.

Tässä yhteydessä käytettävät lymfosyytit eivät ole ratkaisevia ja voidaan käyttää mitä tahansa imusoluja, jotka saadaan syöpää sairastavista ihmisistä tai 15 eläimistä. Esimerkkejä ovat ääreisverenkierrosta, luu-ytimestä, imusolmukkeista, pernasta, risoista ja kateen-korvasta saatavat lymfosyytit. Nämä lymfosyytit eristetään fysikaalisin tai kemiallisin menetelmin, pintakal-vomenetelmällä tai vastaavalla.The lymphocytes used in this context are not critical and any lymphocytes obtained from cancerous humans or animals can be used. Examples are lymphocytes from the peripheral bloodstream, bone marrow, lymph nodes, spleen, tonsils, and thymus. These lymphocytes are isolated by physical or chemical methods, surface membrane method or the like.

20 Lymfosyyttien herkistäminen GRA:11a tehdään kas vattamalla lymfosyyttejä viljelyalustassa, joka sisältää GRA:a, 1-10 vrk, edullisesti 2-7 vrk.Sensitization of lymphocytes to GRA is performed by growing lymphocytes in a culture medium containing GRA for 1-10 days, preferably 2-7 days.

Lymfosyyttien herkistykseen käytettävänä viljely-alustana voidaan käyttää erilaisia tavallisia ravin-25 toalustoja, joita tavanomaisesti käytetään tällaisessa solujen viljelyyn. Edullisia esimerkkejä ovat RPMI-1640-alusta, Eagle MEM -kasvualusta jne., joihin on lisätty ihmisen seerumia, lehmän sikiön seerumia (FCS), vasikan seerumia, hevosen seerumia tai vastaavaa. Viljelmään li-30 sättävän GRA:n määrä on tavallisesti 1-1000 ng/ml ja edullisesti 1-500 ng/ml, laskettuna sokerin määränä ja lymfosyyttien määrän ollessa 1 x 10^/ml.A variety of common nutrient media conventionally used in such cell culture can be used as the culture medium for lymphocyte sensitization. Preferred examples are RPMI-1640 medium, Eagle MEM medium, etc. supplemented with human serum, fetal bovine serum (FCS), calf serum, horse serum or the like. The amount of GRA to be added to the culture is usually 1 to 1000 ng / ml and preferably 1 to 500 ng / ml, calculated as the amount of sugar and the number of lymphocytes is 1 x 10 6 / ml.

Kasvatus tehdään tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi pH 7,2:ssa ja noin 37°C:n lämpötilassa.The culture is carried out by a conventional method, for example at pH 7.2 and a temperature of about 37 ° C.

35 Keksinnön mukaisesti valmistetut tappasolut ovat 9 77157 suurinpiirtein normaaleja lymfosyyttejä ja niillä on GRA-spesifinen solujen vastainen vaikutus. Esimerkiksi GRA-l-KT:11a, joka on yksi keksinnön mukaisesti valmistetuista tappajasoluista, on ominaisuudet, jotka ovat ta-5 vallisia ihmisen ääreisverenkierron T-soluille ja sillä on solujen vastainen vaikutus, joka on spesifinen GRA:a sisältäville syöpäsoluille, mikä on osoitettu jäljempänä kuvattavassa esimerkissä.The killer cells prepared according to the invention are approximately 77,7157 normal lymphocytes and have a GRA-specific anti-cellular activity. For example, GRA-1-KT, one of the killer cells of the invention, has properties common to human peripheral blood T cells and has an anti-cellular activity specific for GRA-containing cancer cells, as shown in in the example described below.

Tyypillisiä esimerkkejä keksinnön mukaisesti valio mistetuista uusista tappajasoluista ovat GRA-l-KT ja GRA-M-l, jotka valmistetaan jäljempänä kuvattavissa esimerkeissä. Kaikkia keksinnön mukaisesti valmistettuja tappajasoluja on saatavana patentin hakijalta.Typical examples of novel killer cells selected according to the invention are GRA-1-KT and GRA-M-1, which are prepared in the examples described below. All killer cells prepared according to the invention are available from the patent applicant.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja tappajasoluja 15 voidaan monistaa rajattomasti yllä kuvatulla kasvualustalla, joka sisältää T-solujen kasvutekijää (TCGF, IL-2). Tässä tapauksessa tappajasolukloonin selektiivinen kasvatus voidaan tehdä tavanomaisella ultralaimennusmene-telmällä. Näitä tappajasoluja voidaan säilyttää pitkiä 20 aikoja esimerkiksi nestetypessä.The killer cells 15 prepared according to the invention can be amplified indefinitely on the medium described above containing T cell growth factor (TCGF, IL-2). In this case, selective growth of the killer cell clone can be performed by a conventional ultra-dilution method. These killer cells can be stored for long periods of time, for example in liquid nitrogen.

GRA:a voidaan käyttää yksinään aktiivisena aineosana ja lisäksi yhdistettynä muihin antibakteerisiin ja syöpää estäviin aineisiin. GRA:a atkiivisena aineosanaan sisältävät, syöpää estävät aineet voivat olla missä ta-25 hansa muodossa, kunhan ne ovat sellaisina valmisteina, V- että GRA:a on vaikuttava määrä. Aine annetaan tavalli- sesti laskimon sisäisesti, ihon alle, ihon sisään tai - lihakseen liuoksena, suspensiona tai emulsiona. Se voi olla lisäksi kuivana tuotteena, joka voidaan tehdä nes-30 temäiseksi lisäämällä siihen soveltuvaa kantajaa ennen käyttöä. Nämä nestemäiset aineet voivat sisältää suspen-doivaa ainetta, esimerkiksi metyyliselluloosaa, emulgaat-toria, esimerkiksi lesitiiniä, säilytysaineita, esimerkiksi metyyli-p-hydroksibentsoaattia, stabilisaattoria, 35 jolla ei ole sellaisenaan haitallisia vaikutuksia ihmisten 10 771 57 ja eläimien immuunijärjestelmään, puskuria ja vastaavia lisäaineita.GRA can be used alone as the active ingredient and in addition in combination with other antibacterial and anti-cancer agents. Anti-cancer agents containing GRA as an active ingredient may be in any form, as long as they are in such preparations that there is an effective amount of V- and GRA. The substance is usually administered intravenously, subcutaneously, intradermally or intramuscularly as a solution, suspension or emulsion. In addition, it may be in the form of a dry product which can be made into a liquid-30 by the addition of a suitable carrier before use. These liquid substances may contain a suspending agent, for example methylcellulose, an emulsifier, for example lecithin, preservatives, for example methyl p-hydroxybenzoate, a stabilizer which as such does not have adverse effects on the human and animal immune buffer, .

Käyttökelpoisiin vesipitoisiin kantajiin kuuluu fysiologinen suolaliuos ja käyttökelpoisia vedettömiä 5 kantajia ovat kasviöljyt, esimerkiksi seesamöljy, mineraaliöljyt, esimerkiksi parafiiniöljy, eläinöljyt, esimerkiksi skvaleeni sekä propyleeniglykoli. Lisäksi voidaan lisätä immunologisen tehostamisen aikaansaamiseksi soveltuvia apuaineita. Apuaineita, joita voidaan käyt-10 tää ovat mm. Freund's complete adjuvants, saponiini eläimille ja alumiinihydroksidi ihmiselle.Useful aqueous carriers include physiological saline and useful anhydrous carriers include vegetable oils, for example sesame oil, mineral oils, for example paraffin oil, animal oils, for example squalene and propylene glycol. In addition, suitable excipients may be added to provide immunological enhancement. Excipients that can be used include e.g. Freund's complete adjuvants, saponin for animals and aluminum hydroxide for humans.

Syövän vastaista ainetta voidaan antaa kerran tai toistuvasti pitkän ajan kuluessa syöpäpotilaalle taudin hoitamiseksi tai henkilölle, joka on vaarassa sairas-15 tua syöpään, syövän estämiseksi.The anti-cancer agent can be administered once or repeatedly over a long period of time to a cancer patient to treat the disease or to prevent cancer in a person at risk for cancer.

Koska GRA:n LD^^-arvo (hiiri, vatsakalvon sisäisesti) on vähintään 500 mg/kg sokerin määränä laskettuna on, syövän vastaisen aineen myrkyllisyys pieni ja annostus voi siksi vaihdella suuresti. Vaikka GRA-pitoisuus 20 syövän vastaisessa aineessa ei ole ratkaiseva, on tavallisesti edullista käyttää pitoisuutta 0,001-100 pg/ml sokerin määränä laskettuna. Mitä tulee syövän vastaisen aineen annostukseen, on tavallisesti edullista antaa ainetta 0,001-100 pg/kg/vrk, yhdellä kertaa tai useana 25 annoksena, vaikkakin annostus vaihtelee riippuen sairauden laajuudesta ja potilaan iästä ja sukupuolesta.Since the LD50 value of the GRA (mouse, intraperitoneal) is at least 500 mg / kg in terms of sugar, the toxicity of the anticancer agent is low and the dosage can therefore vary widely. Although the GRA concentration in the anti-cancer agent is not critical, it is usually preferable to use a concentration of 0.001 to 100 pg / ml calculated as the amount of sugar. With respect to the dosage of the anti-cancer agent, it is usually preferable to administer the agent from 0.001 to 100 pg / kg / day, in a single dose or in several doses, although the dosage will vary depending on the extent of the disease and the age and sex of the patient.

Syövän vastainen aine, joka on valmistettu siten, että se sisältää tappajasoluja aktiivisena aineosanaan, käytetään edullisesti injektioliuoksena yhdessä täl-30 laisten lääkkeiden valmistukseen käytettävien kantajien kanssa. Tässä yhteydessä käytettävät kantajat eivät ole ratkaisevia, mutta isotoniset kantajat ovat edullisia. Fysiologinen suolaliuos on erityisen edullinen. Valmistettaessa ainetta on edullista pestä tappajasoluja 35 riittävästi fysiologisella suolaliuoksella tai vastaaval- 11 77157 la yllä kuvatun viljelyalustan poistamiseksi ja liettää ne sitten kantajaan.An anti-cancer agent prepared by containing killer cells as an active ingredient is preferably used as a solution for injection together with carriers for the manufacture of such drugs. The carriers used in this connection are not critical, but isotonic carriers are preferred. Physiological saline is particularly preferred. In preparing the agent, it is preferable to wash the killer cells 35 sufficiently with physiological saline or the like to remove the culture medium described above and then slurry them in the carrier.

Tappajasolujen pitoisuus aineessa ei ole tarkoin 5 9 rajoitettu, mutta se on edullisesti 10 -10 millilit-5 rassa. Kun tappajasoluja annetaan vatsakalvon sisäi- g sesti annoksena 10 /hiiri, ei havaita minkäänlaista myrkkyvaikutusta. Vaikka keksinnön mukaisesti valmistetetun syövän vastaisen aineen annostus vaihtelee taudin asteesta ja potilaan iästä ja sukupuolesta riippuen, on taval- 5 12 10 lisesti edullista antaa ainetta annoksena 10 -10 /kg/vrk joko yhtenä tai useampana annoksena.The concentration of killer cells in the substance is not strictly limited, but is preferably in the range of 10 to 10 milliliters. When the killer cells are administered intraperitoneally at a dose of 10 / mouse, no toxic effect is observed. Although the dosage of the anti-cancer agent according to the invention varies depending on the degree of the disease and the age and sex of the patient, it is usually preferable to administer the agent at a dose of 10-10 / kg / day in one or more doses.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä yksityiskohtaisemmin.The following examples illustrate the invention in more detail.

Referenssiesimerkki 1 15 GRA:n sijainti (1)-A FITC:lla merkityn lektiinin (PNA-FITC) valmistus 10 mg maapähkinälektiiniä (PNA, valmistaja EY Co.) liuotettiin 0,01 M fosfaattipuskuriin (2 ml), joka si-20 sälsi 0,85 % NaCl (pH = 7,2). 0,5 M vetykarbonaattipus-kuriin (1 ml) (pH = 9,0) liuotettiin 2 mg FITCsa (valmistaja Sigma Laboratories Inc.) ja tuloksena olevasta liuoksesta lisättiin 0,5 ml yllä valmistettuun PNA-pus-.. kuriin. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa kaksi ;; 25 tuntia ja erotettiin sitten Sephadex G25 -pylväässä ·'*' (10 x 300 mm, geelin valmistaja Farmacia Corp.). Kerät- tiin alkupiikki. FITC/PNA-suhde = 1,0.Reference Example 1 Location of GRA (1) -A Preparation of FITC-labeled lectin (PNA-FITC) 10 mg of peanut lectin (PNA, manufactured by EC Co.) was dissolved in 0.01 M phosphate buffer (2 ml) containing 0.85% NaCl (pH = 7.2). 0.5 mg of FITC (manufactured by Sigma Laboratories Inc.) was dissolved in 0.5 M bicarbonate buffer (1 ml) (pH = 9.0), and 0.5 ml of the resulting solution was added to the PNA buffer prepared above. The mixture was stirred at room temperature for two ;; 25 hours and then separated on a Sephadex G25 column · '*' (10 x 300 mm, gel manufactured by Farmacia Corp.). The initial peak was collected. FITC / PNA ratio = 1.0.

(1)-B FITCrlla merkityn lektiinin (DBA-FITC) valmistus 30 Valmistettiin (1)-A:ssa kuvatulla tavalla DBA- FITC käyttäen EY Corp.rn valmistamaa DBA:a. FITC/DBA-suhde = 0,9.(1) -B Preparation of FITC-labeled lectin (DBA-FITC) DBA-FITC was prepared as described in (1) -A using DBA manufactured by EC Corp. FITC / DBA ratio = 0.9.

(1)-C Soijapapuagglutiniinia FITC (FITC-SBA) myy EY Co. FITC/SBA-suhde = 1,4.(1) -C Soybean agglutinin FITC (FITC-SBA) is sold by EY Co. FITC / SBA ratio = 1.4.

12 771 57 (2) GRA:n sijainti erilaisissa syöpäsoluissa g (a) Ihraisen viljeltyjä syöpäsoluja (1 x 10 ) pestiin kolmesti 0,05 M tris-suolahappopuskurilla, joka sisälsi 0,85 % NaCl (pH = 7,2), sentrifugointimenetelmällä ja sitten 5 niihin lisättiin 100 yul (1):n mukaisesti valmistettuja PNA-FITC, DBA-FITC tai SBA-FITC (200 ^uq/ml). Tuloksena olevan seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, jotta aineet reagoisivat. Kun reaktio oli lopussa, reaktioseosta pestiin kolmesti 0,01 M fosfaattipuskurilla, 10 joka sisälsi 0,85 % NaCl (pH =7,2) ja sen jälkeen solut laitettiin lasilevylle ja tutkittiin fluoresenssimikroskoo-pilla.12 771 57 (2) Location of GRA in different cancer cells g (a) Human cultured cancer cells (1 x 10) were washed three times with 0.05 M Tris-hydrochloric acid buffer containing 0.85% NaCl (pH = 7.2) by centrifugation method and then 100 μl of PNA-FITC, DBA-FITC or SBA-FITC (200 μg / ml) prepared according to (1) were added. The resulting mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to react. When the reaction was complete, the reaction mixture was washed three times with 0.01 M phosphate buffer containing 0.85% NaCl (pH = 7.2), and then the cells were plated and examined by fluorescence microscopy.

Hiiret X5563 ja MH134 käsiteltiin ja tutkittiin samalla tavalla kuin yllä.Mice X5563 and MH134 were treated and examined in the same manner as above.

15 Tulokset ovat taulukossa 1. Käytetyt syöpäsolut ovat kaikki tunnettuja ja ne on saatu First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University:sta.15 The results are shown in Table 1. The cancer cells used are all known and were obtained from First Pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University.

Taulukko 1table 1

Syöpäsolut GRA-positiivisia 20 (%)Cancer cells GRA-positive 20 (%)

PNA DBA SBAPNA DBA SBA

Raji (Burkitt'in imukudoskasvain) 98,3 1,4Raji (Burkitt's lymphoma) 98.3 1.4

Dauji -"- 93,1 5,2 BT-1 - " - 50,1 0 25 P-12 (T-solu-imukudoskasvain) 44,3 6,7 MOLT (T-solu-leukemia) 0,6 4,8Dauji - "- 93.1 5.2 BT-1 -" - 50.1 0 25 P-12 (T-cell lymphoma) 44.3 6.7 MOLT (T-cell leukemia) 0.6 4, 8

Fujimaki (B-solu-imukudoskasvain) 19,1 5,3Fujimaki (B-cell lymphoid tumor) 19.1 5.3

Oda (IgD-luuydinkasvain) 0,6 10,0 QG-56 (keuhkosyöpä, suomuinen) 70,4 2,0 30 PC-1 - " - 78,4 0,4 PC-3 (keuhkosyöpä, rauhassyöpä) 77,1 0 QG-90 (keuhkosyöpä, pienisolu-) 68,0 0 PC-13 (keuhkosyöpä, suurisolu-) 17,0 0 MK-2 (vatsasyöpä, heikko erilaistu- 35 minen) 63,7 0,1 KATO-III (vatsasyöpä, signet ring -syöpä) 57,3 0 13 771 57Oda (IgD bone marrow tumor) 0.6 10.0 QG-56 (lung cancer, squamous) 70.4 2.0 30 PC-1 - "- 78.4 0.4 PC-3 (lung cancer, glandular cancer) 77.1 0 QG-90 (lung cancer, small cell) 68.0 0 PC-13 (lung cancer, large cell) 17.0 0 MK-2 (stomach cancer, poor differentiation) 63.7 0.1 KATO-III (stomach cancer) , Signet ring cancer) 57.3 0 13 771 57

Taulukko 1 (jatkoa)Table 1 (continued)

Syöpäsolut GRA-positiivisia (%)Cancer cells GRA-positive (%)

PNA DBA SBAPNA DBA SBA

5 MKN-45 (vatsasyöpä, heikko erilaistuminen ) 1,040,3 MKN-1 (vatsasyöpä, suomuinen rauhas- syöpä) 4,6 0,4 MKN-28 (vatsasyöpä) 0,4 0,1 10 MKN-74 " 0,5 0 MGH-Ul (virtsarakkosyöpä) 37,4 0 KU-2 " 4,5 21,4 T-24 " 14,6 0 NBT-2 " 13,1 1,0 15 NRC-12 (munuaissyöpä) 23,9 0 KU-1 " 3,3 0,65 MKN-45 (abdominal cancer, poor differentiation) 1,040.3 MKN-1 (abdominal cancer, squamous cell carcinoma) 4.6 0.4 MKN-28 (abdominal cancer) 0.4 0.1 10 MKN-74 "0.5 0 MGH-Ul (bladder cancer) 37.4 0 KU-2 "4.5 21.4 T-24" 14.6 0 NBT-2 "13.1 1.0 15 NRC-12 (kidney cancer) 23.9 0 KU-1 "3.3 0.6

Kuramochi (munasarjasyöpä) 80,0 0 NB-1 (varhaishermosolukasvain) 50,9 1,7 *: YT-nu " 3,6 0,5 " 20 TGW-nu-l " 4,10 TGW-nu-ll " 2,0 1,0 GOTO " 0,5 0 ITO (sikiön syöpä) 96,9 12,3 NEC-8 - " - 44,6 0 25 SCH (suonikalvosyöpä, vatsa) 14,6 3,1 GCH (suonikalvosyöpä, kohtu) 5,4 0 YN-1 (poikkijuovaislihaskasvain) 5,7 1,7Kuramochi (ovarian cancer) 80.0 0 NB-1 (early nerve cell tumor) 50.9 1.7 *: YT-nu "3.6 0.5" 20 TGW-nu-l "4.10 TGW-nu-ll" 2 .0 1.0 GOTO "0.5 0 ITO (fetal cancer) 96.9 12.3 NEC-8 -" - 44.6 0 25 SCH (choroidal cancer, abdomen) 14.6 3.1 GCH (choroidal cancer, uterus ) 5.4 0 YN-1 (striated muscle tumor) 5.7 1.7

Hiiri X5563 (plasmasolukasvain plasmacytoma) 92,0 0 90,6 : 30 Hiiri MH134 (maksakasvain, hepatoma) 18,6 0 6,4 .... (b) Syöpäpotilaiden pahanlaatuisia kudoksia johdet tiin ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan (# 150) läpi yksisolususpension aikaansaamiseksi. Kun solut oli pesty kahdesti 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka oli 5 35 2 mM CaCl2:n suhteen ja sisälsi 0,85 % NaCl, 5 x 10 solua suspendoitiin puskuriin (100 ^ul) . 100 jil FOTC-PNA tai FITC-DBA (200 jig/ml) lisättiin solususpensioon ja 14 771 5 7 seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Kun solut oli pesty kolmesti kylmällä PBS:lla, ne tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla.Mouse X5563 (plasma cell tumor plasmacytoma) 92.0 0 90.6: 30 Mouse MH134 (liver tumor, hepatoma) 18.6 0 6.4 .... (b) Malignant tissues from cancer patients were passed through a stainless steel screen (# 150) to provide a single cell suspension. After washing the cells twice with 0.01 M Tris-HCl buffer (pH = 7.4) in 5 mM CaCl 2 containing 0.85% NaCl, 5 x 10 cells were suspended in buffer (100 μl). ). 100 μl of FOTC-PNA or FITC-DBA (200 μg / ml) was added to the cell suspension and 14,771 5 7 mixtures were incubated at room temperature for 20 minutes. After washing the cells three times with cold PBS, they were examined under a fluorescence microscope.

Tulokset ovat taulukossa 2. Syöpäpotilaiden pahan-5 laatuiset kudokset on saatu Kansai Medical University:stä. Taulukko 2The results are shown in Table 2. Malignant-5 grade tissues from cancer patients were obtained from Kansai Medical University. Table 2

Nro Syöpäpotilaan kudos GRANo. Cancer patient tissue GRA

PNA DBAPNA DBA

1 Vatsasyöpä + + 10 2 + + 3 - 4 " + 5 " + + 6 + 15 7 Rintasyöpä + 8 " + - 9 " + 10 + + 11 Paksusuolisyöpä + + 20 12 " + 13 Ruokatorvisyöpä + 14 Maksakasvain - +1 Stomach cancer + + 10 2 + + 3 - 4 "+ 5" + + 6 + 15 7 Breast cancer + 8 "+ - 9" + 10 + + 11 Colon cancer + + 20 12 "+ 13 Esophageal cancer + 14 Liver tumor - +

Huomaa: Merkki"+” osoittaa, että GRA:a esiintyy solun pinnalla .Note: A “+” indicates that GRA is present on the cell surface.

25 Merkki osoittaa, että GRA:a ei esiinny solun pinnalla.25 The mark indicates that GRA is not present on the cell surface.

Referenssiesimerkki 2 GRA:n valmistus (1)-A Kiinnitetyn lektiinin valmistus (PNA-Sepharose) 30 Kolme g CNBr-aktivoitua Sepharose 4B:a (valmistajaReference Example 2 Preparation of GRA (1) -A Preparation of Attached Lectin (PNA-Sepharose) 30 Three g of CNBr-activated Sepharose 4B (manufactured by

Farmacia Corp.) pestiin hyvin 1 mM HCl:lla ja suspendoitiin 0,1 M natriumbikarbonaattiin (pH = 8,5, 200 ml). Sitten lisättiin 5 ml 0,01 M fosfaattipuskuria (pH = 8,5), joka sisälsi 20 mg PNA:a ja annettiin reagoida 25°C:ssa kaksi tun-35 tia välillä sekoittaen PNA-Sepharosen valmistamiseksi.Farmacia Corp.) was washed well with 1 mM HCl and suspended in 0.1 M sodium bicarbonate (pH 8.5, 200 mL). Then, 5 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH = 8.5) containing 20 mg of PNA was added and allowed to react at 25 ° C for two hours with stirring to prepare PNA-Sepharose.

(1)-B Samalla tavalla kuin (1)-A:ssa, mutta käyttäen PNA:n sijasta DBA:a, valmistettiin DBA-Sepharose.(1) -B In the same manner as in (1) -A, but using DBA instead of PNA, DBA-Sepharose was prepared.

15 771 57 (2) GRA:n valmistus (a) BT-1 (Burkittin imukudoskasvain) -solut (1,3 x g 10 ) pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella ja niihin lisättiin 30 ml 0,01 M tris-HCl-puskuria (pH = 7,4), 5 joka sisälsi 2 % "TRITON X-100":a (valmistaja Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0,85 % NaCl ja 2 mM CaCl2 ja 2 mM MgCl2. Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 15 minuuttia ja sitten sille tehtiin ultrasentrifugointierotus (100 000 x g). Siten saadusta supernatantista (28 ml) laskettiin 10 14 ml:n annos affiniteettikromatografiakolonnin läpi (hal kaisija 0,5 cm pituus 1 cm), joka oli täytetty PNA-aga-roosihelmillä (valmistaja Maruzen Co., Ltd.), jotka oli tasapainotettu tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,1 % TRITON X-lOOsa, 0,85 % NaCl 2 mM CaCl2 ja 2 mM 15 MgCl2· Kun helmet oli pesty samalla puskurilla kuin mitä edellä käytettiin, eluoitiin 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl ja oli 0,1 M laktoosin, 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen sekä sisälsi 0,1 % TRITON X-100:a. Siten eluoitunut osa dialysoitiin 20 0,01 M tris-HCl-puskurilla, joka sisälsi 0,85 % NaCl ja 011 2 mM MgCl2:n ja 2 mM CaCl2:n suhteen, 48 tuntia, jolloin saatiin 17 ml GRA-liuosta. GRA-liuoksesta mitattiin proteiinin ja sokerin määrät Folin-Lowry-menetelmällä ja fenolirikkihappo-menetelmällä vastaavasti ja niiden havait- 25 tiin olevan 644 jig ja 120 pg vastaavasti. Tästä liuokses- V. ta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-1".15 771 57 (2) Preparation of GRA (a) BT-1 (Burkitt's lymphoma) cells (1.3 xg 10) were washed three times with physiological saline and 30 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer (pH = 7.4), containing 2% TRITON X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 0.85% NaCl and 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2. The mixture was stirred at 4 ° C for 15 minutes and then subjected to ultracentrifugation (100,000 x g). A 14 ml aliquot of the supernatant thus obtained (28 ml) was passed through an affinity chromatography column (diameter 0.5 cm length 1 cm) packed with PNA-agarose beads (manufactured by Maruzen Co., Ltd.) equilibrated with tris. -HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1% TRITON X-100, 0.85% NaCl 2 mM CaCl 2 and 2 mM 15 MgCl 2 · After washing the beads with the same buffer as used above, 0 With 01 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.85% NaCl and 0.1 M lactose, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 and 0.1% TRITON X-100. The portion thus eluted was dialyzed against 0.01 M Tris-HCl buffer containing 0.85% NaCl and 011 2 mM MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 for 48 hours to give 17 ml of GRA solution. The amounts of protein and sugar in the GRA solution were measured by the Folin-Lowry method and the phenolic sulfuric acid method, respectively, and were found to be 644 μg and 120 pg, respectively. This solution is hereinafter abbreviated as "GRA-1".

(b) C3H/He-hiiren rintasyöpä (MMT) -soluja (1x10^) pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella ja niihin lisättiin 30 ml 0,01 M tris-HCl-puskuria (pH = 7,4), joka 30 sisälsi 2 % TRITON X-100:a, 0,85 % NaCl ja oli 2 mM CACl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen. Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 30 minuuttia. Sen jälkeen seos erotettiin ultrasentrifugoimal-la (100 000 x g) kaksi tuntia ja supernatanttia dialysoitiin yön yli 0,1 M tris-HCl-puskurilla, joka sisälsi 0,85 % 35 NaCl ja oli 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen. Siten dialysoitu liuos väkevöitiin 3 ml:ksi ja 1 ml:n annos 16 771 57 johdettiin läpi affiniteettikromatografiakolonnin (halkaisija 0,5 cm, pituus 2 cm), joka oli täytetty PNA-Sepharosel-la (samaa kuin edellä), joka oli tasapainotettu tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,005 % TRITON X-100:a, 5 0,85 % NaCl ja oli 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen.(b) C3H / He mouse breast cancer (MMT) cells (1x10 4) were washed three times with physiological saline and 30 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 2% TRITON was added. X-100, 0.85% NaCl and was 2 mM for CACl2 and 2 mM MgCl2. The mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes. The mixture was then separated by ultracentrifugation (100,000 xg) for two hours and the supernatant was dialyzed overnight in 0.1 M Tris-HCl buffer containing 0.85% NaCl and 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2. regarding. The dialyzed solution was thus concentrated to 3 ml and a 1 ml portion of 16,771,5 was passed through an affinity chromatography column (0.5 cm diameter, 2 cm length) packed with PNA-Sepharose (same as above) equilibrated with tris. -HCl buffer (pH = 7.4) containing 0.005% TRITON X-100, 0.85% NaCl and 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2.

Kun kolonni oli pesty kunnolla edellä mainitulla puskurilla, se eluoitiin 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl ja 0,005 % TRITON X-100:a ja oli 0,1 M laktoosin, 2 mM CaCl2:n ja 2 mM MgCl2:n suhteen ja siten 10 saatua eluoitunutta osaa dialysoitiin 48 tuntia 0,01 M tris-HCl-puskurilla (pH = 7,4), joka sisälsi 0,85 % NaCl ja oli 2 mM CaCljin ja 2 mM MgCl2:n suhteen, jolloin saatiin 2 ml GRA-liuosta.After washing the column thoroughly with the above buffer, it was eluted with 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.85% NaCl and 0.005% TRITON X-100 and was 0.1 M lactose, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 and the 10 eluted parts thus obtained were dialyzed for 48 hours in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.85% NaCl and 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 to give 2 ml of GRA solution.

Siten saadussa GRA-liuoksessa proteiinin määrä oli 15 156 ^,ug ja sokerin määrä 94 ^ug. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-M-l".In the GRA solution thus obtained, the amount of protein was 15,156 and the amount of sugar was 94. This solution is hereinafter referred to as "GRA-M-1".

(c) Noin 120 g (märkäpaino) KATO-III:a homogenoitiin 100 ml:ssa PBS:a Waring-sekoittimella. Kun oli sentrifugoi-tu yksi tunti (100 000 g), pelletti liuotettiin 0,01 M tris-20 HCl-puskuriin (100 ml), joka sisälsi 2 % TRITON X-100:a ja oli 0,15 M NaCl:n suhteen (pH = 7,6). Supernatantti erotettiin sentrifugoimalla (100 000 g) yksi tunti ja laitettiin kolonniin, joka oli täytetty PNA-Sepharose 4B:lla (0,8 x 15 cm), joka oli tasapainotettu 0,01 M tris-HCl-puskurilla 25 8pH = 7,6), joka sisälsi 0,015 % TRITON X-100:a ja oli 0,15 M NaCl:n suhteen. Kun kolonni oli pesty 50 mltlla puskuria, GRA eluoitiin puskurilla, joka oli 0,1 M laktoosin suhteen. Eluoitua GRA:a dialysoitiin 0,85-%:illa NaCl-liuoksella, väkevöitiin Sephadex:lla (Pharmacia Co.) ja 30 säilytettiin -20°C:ssa ennen käyttöä.(c) Approximately 120 g (wet weight) of KATO-III was homogenized in 100 ml of PBS with a Waring mixer. After centrifugation for one hour (100,000 g), the pellet was dissolved in 0.01 M Tris-20 HCl buffer (100 mL) containing 2% TRITON X-100 and 0.15 M NaCl. (pH = 7.6). The supernatant was separated by centrifugation (100,000 g) for one hour and applied to a column packed with PNA-Sepharose 4B (0.8 x 15 cm) equilibrated with 0.01 M Tris-HCl buffer. ) containing 0.015% TRITON X-100 and 0.15 M NaCl. After washing the column with 50 ml of buffer, the GRA was eluted with a buffer of 0.1 M lactose. The eluted GRA was dialyzed against 0.85% NaCl solution, concentrated with Sephadex (Pharmacia Co.) and stored at -20 ° C before use.

Proteiinin ja sokerin määrät määritettiin, kuten (a):ssa ja niiden havaittiin olevan 2,0 mg ja 0,8 mg vastaavasti. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-2".The amounts of protein and sugar were determined as in (a) and were found to be 2.0 mg and 0.8 mg, respectively. This solution is hereinafter referred to as "GRA-2".

35 (d) Samalla tavalla kuin (c):ssa valmistettiin seu- raavat GRA-näytteet.35 (d) In the same manner as in (c), the following GRA samples were prepared.

17 771 5717,771 57

Taulukko 3Table 3

GRA-näyte Materiaali GRAGRA sample Material GRA

Lähde Määrä (g) Proteiini- Sokeripi- pitoisuus toisuus (mg) (mg) 5 GRA-3 BT-1 33 0,5 0,09 GRA-4 Rintasyöpä 5 0,24 0,5 (leikattu) GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38 GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54 10 GRA-7 Raji 29 0,78 0,45 GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4 GRA-M-3 LLC 14,4 0,06 0,07 GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35 GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 : 15 (e) Samalla tavalla kuin yllä (c) :ssa, mutta käyttäen KATO-III:n sijasta MKN-45:a (noin 29 g) ja PNA-Sepharose 4B:n sijasta (1)-B:ssa valmistettua DBA-Sepharosea, ja eluoiden N-asetyyligalaktoosiamiinilla, saatiin GRA-valmis-te, jonka proteiinipitoisuus oli 0,03 mg ja sokeripitoisuus 20 0,01 mg. Tästä näytteestä käytetään tästedes lyhennettä "GRA-8".Source Quantity (g) Protein Sugar content content (mg) (mg) 5 GRA-3 BT-1 33 0.5 0.09 GRA-4 Breast cancer 5 0.24 0.5 (cut) GRA-5 QG- 56 24 0.6 0.38 GRA-6 QG-90 26 1.0 0.54 10 GRA-7 Raji 29 0.78 0.45 GRA-M-2 MMT 200 11.3 28.4 GRA-M- 3 LLC 14.4 0.06 0.07 GRA-M-4 MH-134 85 0.65 0.35 GRA-M-5 X-5563 25 0.56 0.23: 15 (e) In the same manner as above (c) but using MKN-45 (about 29 g) instead of KATO-III and DBA-Sepharose prepared in (1) -B instead of PNA-Sepharose 4B, and eluting with N-acetylgalactosamine, a GRA preparation with a protein content of 0.03 mg and a sugar content of 0.01 mg was obtained. This sample is hereinafter referred to as "GRA-8".

(f) Edellä valmistettu (d) GRA-3 (5 ml) laitettiin DBA-Sepharose-kolonniin ja eluoitiin tris-HCl-puskurilla (0,015 % TRITON X-100, 2 mM MgCl2, CaCl2, 0,85 % NaCl), 25 jolloin saatiin 4 ml fraktioita 1-12. Fraktioita 1-3 mer-kitään lyhenteellä "GRA-3-A" ja fraktioita 4-12 lyhenteel-: : : lä "GRA-3-B". Sitten kolonnia eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi kuitenkin N-asetyyligalaktoosiamiinia (0,1 M), jolloin saatiin fraktiot, joita merkitään lyhenteellä 30 "GRA-3-C".(f) GRA-3 (5 ml) prepared above (5 ml) was applied to a DBA-Sepharose column and eluted with Tris-HCl buffer (0.015% TRITON X-100, 2 mM MgCl 2, CaCl 2, 0.85% NaCl). to give 4 ml of fractions 1-12. Fractions 1-3 are abbreviated "GRA-3-A" and fractions 4-12 are abbreviated "GRA-3-B". The column was then eluted with the same buffer but containing N-acetylgalactosamine (0.1 M) to give fractions denoted by the abbreviation "GRA-3-C".

(g) SDS-geelielektroforeesi(g) SDS gel electrophoresis

Kullekin yllä mainituista GRA-valmisteista tehtiin elektroforeesi menetelmällä, jota kuvataan julkaisussa Fairbanks et ai., Biochemistry 10 (1971) 2606.Each of the above GRA preparations was electrophoresed by the method described in Fairbanks et al., Biochemistry 10 (1971) 2606.

35 Saadut tulokset ovat kuvioissa 18-22.35 The results obtained are shown in Figures 18-22.

18 771 5718 771 57

Kuvioissa 18-19 numerot 1-5 merkitsevät seuraavaa.In Figures 18-19, the numbers 1-5 mean the following.

1 = standardi; 2 = GRA-M-3; 3 = GRA-7; 4 = GRA-1; ja 5 = GRA-2.1 = standard; 2 = GRA-M-3; 3 = GRA-7; 4 = GRA-1; and 5 = GRA-2.

Kuviossa 20 numerot 1-4 merkitsevät seuraavaa. 1 = 5 standardi; 2 = GRA-M-2; 3 = GRA-6; 4 = GRA-5.In Figure 20, the numbers 1-4 mean the following. 1 = 5 standards; 2 = GRA-M-2; 3 = GRA-6; 4 = GRA-5.

Kuviossa 21 numerot 1-3 merkitsevät seuraavaa. 1 = GRA-M-4; 2 = GRA-M-5; 3 = standardi.In Figure 21, the numbers 1-3 mean the following. 1 = GRA-M-4; 2 = GRA-M-5; 3 = standard.

Kuviossa 22 numerot 1-4 merkitsevät seuraavaa. 1 = GRA-3; 2 = GRA-3-A; 3 = GRA-3-B; 4 = GRA-3-C.In Fig. 22, the numbers 1-4 mean the following. 1 = GRA-3; 2 = GRA-3-A; 3 = GRA-3-B; 4 = GRA-3-C.

10 Kuvio 18 esittää GRA:a, jolle on tehty proteiini- värjäys C.B.B.-menetelmällä /Fairbanks et ai., Biochemistry 10 (1971) 2606/.Figure 18 shows a GRA stained for protein staining by the C.B.B. method (Fairbanks et al., Biochemistry 10 (1971) 2606).

Kuviot 19-21 esittävät GRA:a, jolle on tehty sokeri-värjäys PAS-menetelmällä /R.M. Zacharius et ai., Anal.Figures 19-21 show a GRA subjected to sugar staining by the PAS method /R.M. Zacharius et al., Anal.

15 Biochem. 30 (1962) 148/.15 Biochem. 30 (1962) 148 /.

Kuviossa 22 on kaaviokuva C.B.B.-menetelmällä tehdyn värjäyksen tuloksista.Figure 22 is a schematic diagram of the results of staining by the C.B.B. method.

Standardeina käytettiin alla lueteltuja aineita, jotka saatiin Biorad. Lab. Calif. USA:sta.The substances listed below, obtained from Biorad, were used as standards. Lab. Calif. USA.

20 200 K dalton; myosiini 116 " /J-galaktosidaasi 92,5 " fosforylaasi20,200 K Dalton; myosin 116 "/ J-galactosidase 92.5" phosphorylase

66,2 " BSA66.2 "BSA

45 " ovalbumiini 25 21,5 " soijapaputrypsiini-inhibiittori45 "ovalbumin 25 21.5" soybean trypsin inhibitor

Referenssiesimerkki 3 TCGF:n valmistus (a) Japaninapinan (saatu Japan Plymates Co., Ltd.:sta) perna (4 kg) leikattiin irti ja pestiin kahdesti RPMI-1640- 30 kasvatusalustalla (valmistaja Flow Laboratory Co., Ltd.).Reference Example 3 Preparation of TCGF (a) The spleen (4 kg) of a Japanese monkey (obtained from Japan Plymates Co., Ltd.) was excised and washed twice with RPMI-1640-30 medium (manufactured by Flow Laboratory Co., Ltd.).

Solut suodatettiin Mesh-seulalla (valmistaja Milipore Inc., 150 mesh) ja niille tehtiin ominaispainosentrifugointi (ominaispaino 1,076), jolloin saatiin 2 1 lymfosyyttejä (2 x g 10 /ml). Siten saadut lymfosyytit pestiin kolmesti RPMI-35 1640-kasvatusalustalla ja lymfosyyttien lukumäärä säädettiin 7 5 x 10 :ksi millilitrassa käyttäen samaa alustaa kuin edellä, joka sisälsi 10 % FCS. Sen annettiin sitten seistä 19 771 57 hiilidioksidifermentaattorissa 37°C:ssa yksi tunti. Super-natanttina olevat lymfosyytit kerättiin ja lymfosyyttien lukumäärä säädettiin 1 x 10 :ksi millilitrassa käyttäen samaa kasvatusalustaa kuin edellä, joka sisälsi 1 % FCS.Cells were filtered through a Mesh screen (manufactured by Milipore Inc., 150 mesh) and subjected to specific gravity centrifugation (specific gravity 1.076) to obtain 2 L of lymphocytes (2 x g 10 / ml). The lymphocytes thus obtained were washed three times with RPMI-35 1640 medium and the number of lymphocytes was adjusted to 7 x 10 10 per milliliter using the same medium as above containing 10% FCS. It was then allowed to stand in a 19,771 57 carbon dioxide fermenter at 37 ° C for one hour. The supernatant lymphocytes were collected and the number of lymphocytes was adjusted to 1 x 10 per milliliter using the same medium as above containing 1% FCS.

5 Sen jälkeen lisättiin 1 ^ug/ml indometasiinia (valmistaja Sigma Laboratories, Inc.) ja 0,2 % PHA-P (valmistaja Difco Co.) ja soluja viljeltiin hiilidioksidifermentaattorissa 37°C:ssa 48 tuntia. Sentrifugoitiin (3 000 rpm) 10 minuuttia, supernatantti kerättiin ja steriloitiin suodattamalla 10 Millipore-suodattimella (valmistaja Millipore Inc., 0,2 ^um), jolloin saatiin 2 litraa TCGF:a.Then, 1 μg / ml indomethacin (manufactured by Sigma Laboratories, Inc.) and 0.2% PHA-P (manufactured by Difco Co.) were added, and the cells were cultured in a carbon dioxide fermenter at 37 ° C for 48 hours. Centrifuged (3,000 rpm) for 10 minutes, the supernatant was collected and sterilized by filtration through a 10 Millipore filter (manufactured by Millipore Inc., 0.2) to give 2 liters of TCGF.

(b) TCGF-lähteenä olivat sekakasvatetut ääreisverenkierron lymfosyytit, jotka olivat peräisin 10 terveeltä luovuttajalta.(b) The source of TCGF was mixed cultured peripheral circulating lymphocytes from 10 healthy donors.

15 Adsorboitumattomat lymfosyytit, jotka valmistettiin j C.F. /Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co,)J -erotetuis ta lymfosyyteistä adsorboimalla muovipinnalle 37°C:ssa yksi tunti, suspendoitiin RPMI-kasvatusalustaan, joka * * g sisälsi 1 % FCS:a (1,5 x 10 solua/ml) ja inkuboitiin 20 PHA-P:n (0,2 %), indometasiinin (1 ^ug/ml) ja mitomysiini C:llä (50 /Ug/ml) esikäsitellyn ihmisen B-soluvalmisteen / 5 (BT-1) (1,5 x 10 solua/ml) läsnäollessa. Viljelmän super na tantti kerättiin 48 tunnin kuluttua ja sitä käytettiin TCGF-lähteenä /H.Inoue et ai., Scand. J. Immunol. 12 (1980) 25 149-154/.15 Unadsorbed lymphocytes prepared from C.F. / Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co.,) from J-separated lymphocytes by adsorption on a plastic surface at 37 ° C for one hour was suspended in RPMI medium containing * * g containing 1% FCS (1.5 x 10 cells / ml) and incubated for 20 hours. PHA-P (0.2%), indomethacin (1 μg / ml) and human B cell preparation / 5 (BT-1) pretreated with mitomycin C (50 μg / ml) (1.5 x 10 cells / ml) in the presence of. The culture supernatant was collected after 48 hours and used as a source of TCGF (H.Inoue et al., Scand. J. Immunol. 12 (1980) 25 149-154 /.

Referenssiesimerkki 4 Lymfosyyttien valmistus (1) Ihmisen ääreisverenkierron lymfosyytit Verinäytteille (50 ml), jotka oli saatu terveeltä 30 aikuiselta tai useilta syöpäpotilailta heparinisoimalla, tehtiin erotus sentrifugoimalla käyttäen Ficol Pack:ia (valmistaja Farmacia Japan Co., Ltd.), jolloin saatiin 7 5 x 10 ääreisverenkierron lymfosyytteja.Reference Example 4 Preparation of Lymphocytes (1) Human Peripheral Circulatory Lymphocytes Blood samples (50 ml) obtained from healthy 30 adults or several cancer patients by heparinization were separated by centrifugation using a Ficol Pack (manufactured by Farmacia Japan Co., Ltd.). x 10 peripheral circulating lymphocytes.

(2) Hiiren pernan lymfosyytit 35 C3H/He-hiiren (uros, kuusi viikkoa) perna leikattiin irti ja pestiin kahdesti RPMI-1640-viljelyalustalla.(2) Mouse spleen lymphocytes The spleen of 35 C3H / He mice (male, six weeks) was dissected and washed twice with RPMI-1640 medium.

Pernaa pehmennettiin sitten ruiskutusneulalla ja puristettiin 20 „ 771 57 ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan (100 mesh) läpi suurten palojen poistamiseksi. Siten suodatetut solut pestiin kahdesti samalla kasvatusväliaineella ja erotettiin sentrifugoimalla (1 200 rpm) 10 minuuttia, jolloin 7 5 saatiin 4 x 10 pernan lymfosyyttejä.The spleen was then softened with a spray needle and pressed through a 20-771 57 stainless steel screen (100 mesh) to remove large pieces. The cells thus filtered were washed twice with the same culture medium and separated by centrifugation (1,200 rpm) for 10 minutes to obtain 4 x 10 6 splenic lymphocytes.

Esimerkki 1Example 1

Referenssiesimerkissä 2 ((2)-(a)) valmistettu GRA-1 (proteiinin määrä 40 ^ug/ml; sokerin määrä 7,5 ^ug/ml) laimennettiin 1 000-kertaiseksi alkutilavuuteen nähden RPMI- 10 1640-viljelyalustalla, joka sisälsi 15 % FCSsa, herkis- tyskasvatusalustan valmistamiseksi.The GRA-1 prepared in Reference Example 2 ((2) to (a)) (protein amount 40 μg / ml; sugar amount 7.5 μg / ml) was diluted 1000-fold relative to the initial volume in RPMI-1640 medium containing 15% in FCS, to prepare a sensitization medium.

Ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyttejä (5 x 10*V 5 ml), jotka oli saatu referenssiesimerkin 4 ((D) mukaisesti, lisättiin herkityskasvatusalustaan (5 ml), joka 15 oli valmistettu yllä kuvatulla tavalla ja joka oli laitettu laboratoriomaljalle ja kasvatettiin 37°C:ssa 2 vrk. Niitä kasvatettiin edelleen RPMI-1640-viljelyalustalla, joka sisälsi 20 % TCGF ja 15 % FCS ja joka oli valmistettu referenssiesimerkin 3 mukaisesti, vielä viisi vrk, jolloin saa-20 tiin 20 ml tappajasoluliuosta, joka sisälsi 1 x 10^ tappajasolua millilitrassa. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-1-K-T".Human peripheral circulating lymphocytes (5 x 10 * V 5 ml) obtained according to Reference Example 4 ((D)) were added to a sensitization medium (5 ml) prepared as described above and placed in a laboratory dish and grown at 37 ° C. 2 days, they were further grown in RPMI-1640 medium containing 20% TCGF and 15% FCS prepared according to Reference Example 3 for another five days to give 20 ml of a killer cell solution containing 1 x 10 4 killer cells per ml. This solution is hereinafter referred to as "GRA-1-KT".

Esimerkki 2Example 2

Referenssiesimerkin 4 ((2)) mukaisesti valmistetut g 25 hiiren pernan lymfosyytit laimennettiin solulukuun 5 x 10 /ml käyttäen RPMI-1640-viljelyalustaa, joka sisälsi 15 % FCS. Sitten lisättiin referenssiesimerkin 2 ((2)-(b)) mukaisesti valmistettua GRA-M-1:a siten, että proteiinin ja sokerin lopulliset määrät olivat 1,5 yug/ml ja 0,9 ^,ug/ml 30 vastaavasti. 5 ml:n erää saadusta seoksesta kasvatettiin laboratoriomaljalla (60 x 15 mm, valmistaja Falcon Co.) 37°C:ssa kaksi vrk. Havaittiin kloonautumista. Erää kasvatettiin edelleen RPMI-1640-kasvatusalustalla, jossa oli 15 % FCS:a, joka sisälsi 20 tilavuus-% TCGF:a (valmistaja 35 Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.) neljä vrk, jolloin saatiin 50 ml tappajasoluliuosta, joka sisälsi 1 x 21 77157 10^ tappajasolua millilitrassa. Tästä liuoksesta käytetään tästedes lyhennettä "GRA-M,L-K-T".G 25 spleen lymphocytes prepared according to Reference Example 4 ((2)) were diluted to a cell number of 5 x 10 / ml using RPMI-1640 medium containing 15% FCS. GRA-M-1 prepared according to Reference Example 2 ((2) to (b)) was then added so that the final amounts of protein and sugar were 1.5 μg / ml and 0.9 μg / ml, respectively. A 5 ml aliquot of the resulting mixture was grown in a laboratory dish (60 x 15 mm, manufactured by Falcon Co.) at 37 ° C for two days. Cloning was observed. The batch was further grown in RPMI-1640 medium containing 15% FCS containing 20% v / v TCGF (manufactured by 35 Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.) for four days to give 50 ml of a killer cell solution containing 1 x 21 77157 10 ^ killer cells per milliliter. This solution is hereinafter abbreviated as "GRA-M, L-K-T".

Esimerkki 3 Ääreisverenkierron lymfosyyttejä (5 x 106), jotka 5 oli saatu terveeltä luovuttajalta, inkuboitiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 50 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-2:a ja 15 % FCS:a 37uC:ssa. Toisena päivänä lisättiin yllä kuvattua ihmisen TCGF:a alustaan siten, että pitoisuudeksi tuli 20 % ja inkubointia jatkettiin vielä kol-10 me vrk tappajasolujen aikaansaamiseksi. Tätä tuotetta merkitään tästedes lyhenteellä "GRA-2-K-T".Example 3 Peripheral circulating lymphocytes (5 x 10 6) obtained from a healthy donor were incubated in RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) GRA-2 and 15% FCS at 37 ° C. On the second day, the human TCGF described above was added to the medium to a concentration of 20% and the incubation was continued for another three to 10 days to obtain killer cells. This product is hereinafter referred to as "GRA-2-K-T".

Esimerkki 4Example 4

Tappajasoluvalmisteet GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T ja GRA-C-K-T valmistettiin esimerkin 1 mukaisesti käyttäen 15 GRA-8:a, GRA-3-A:a ja GRA-3-C:a vastaavasti (proteiinipi-[ f [ toisuus 50 ng/ml) ja referenssiesimerkin 3-(b) mukaisesti valmistettua TCGF:a.The killer cell preparations GRA-8-KT, GRA-3-AKT and GRA-CKT were prepared according to Example 1 using 15 GRA-8, GRA-3-A and GRA-3-C, respectively (protein concentration of 50 ng / ml) and TCGF prepared according to Reference Example 3- (b).

Esimerkki 5 C3H/He-hiiriin (naaraita, kahdeksan viikkoa) istutet-20 tiin ihon sisäisesti X5563-soluja (10), jotka oli saatu samasta kannasta ja seitsemän päivän kuluttua kasvaimet poistettiin leikkaamalla. Tästä seitsemän päivän kuluttua inokuloitiin saman kannan X5563-soluja (10^) ja hiiret, jotka olivat resistenssejä inokulaatiolle, nimettiin immuu-25 nihiiriksi.Example 5 C3H / He mice (females, eight weeks) were implanted intradermally with X5563 cells (10) obtained from the same strain and after seven days the tumors were removed by excision. Seven days later, X5563 cells (10 ^) of the same strain were inoculated, and mice resistant to inoculation were designated immune nihouse.

Immuunihiirien ja C3H/He-normaalihiirien pernasolut preparoitiin tavanomaisesti.Spleen cells from immune mice and normal C3H / He mice were prepared conventionally.

Kukin pernasoluerä (5 x 10^/annos) herkistettiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 15 % FCS:a, olevalla 30 GRA-M-5:lla (proteiinipitoisuus 40 mg/ml) viisi vrk, jolloin saatiin tappajasoluja.Each batch of spleen cells (5 x 10 6 / dose) was sensitized with 30 GRA-M-5 (protein concentration 40 mg / ml) in RPMI-1640 medium containing 15% FCS for five days to obtain killer cells.

Normaaleista pernasoluista saatua tappajasoluvaImis-tetta kutsutaan tästedes lyhenteellä "GRA-M-5-K-T-1" ja im-muunipernasoluista saatua lyhenteellä "GRA-M-5-K-T-2".The killer cell preparation obtained from normal spleen cells is hereinafter referred to as "GRA-M-5-K-T-1" and from immune spleen cells as "GRA-M-5-K-T-2".

35 Esimerkki 635 Example 6

Ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyttejä (5 x 10^) inkuboitiin RPMI-1640-alustassa (5 ml), joka sisälsi 22 771 57 50 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-1:a 37°C:ssa kaksi vrk. Kolmantena päivänä lymfosyytit siirrostettiin RPMI-1640-alustaan, joka sisälsi lymfosyyttien luovuttajan seerumia (10 %) ja 0-100 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-1:a ja 5 inkubointia jatkettiin vielä viisi vrk, jolloin saatiin taulukon 4 mukaiset tappajasoluvalmisteet.Human peripheral circulating lymphocytes (5 x 10 6) were incubated in RPMI-1640 medium (5 ml) containing 22,771,550 ng / ml (protein content) of GRA-1 at 37 ° C for two days. On the third day, lymphocytes were seeded in RPMI-1640 medium containing lymphocyte donor serum (10%) and 0-100 ng / ml (protein concentration) GRA-1, and incubation was continued for another five days to obtain the killer cell preparations of Table 4.

Taulukko 4 GRA-pitoisuus (ng/ml)Table 4 GRA concentration (ng / ml)

Aloituspäivä Päivä 3 Tappajasolu 10 50 0 GRA-l-K-T-1 50 1,6 GRA-l-K-T-2 50 3,2 GRA-l-K-T-3 50 6 GRA-l-K-T-4 50 12,5 GRA-l-K-T-5 15 50 25 GRA-l-K-T-6 50 50 GRA-l-K-T-7 50 100 GRA-1-K-T-8Start date Day 3 Killer cell 10 50 0 GRA-lKT-1 50 1.6 GRA-lKT-2 50 3.2 GRA-lKT-3 50 6 GRA-lKT-4 50 12.5 GRA-lKT-5 15 50 25 GRA -lKT-6 50 50 GRA-lKT-7 50 100 GRA-1-KT-8

Esimerkki 7 (a) Ääreisverenkierron lymfosyyttejä (PBL), jotka 20 oli saatu useilta syöpäpotilailta leikkauksen jälkeen, herkistettiin GRA-3:lla tappajasolujen valmistamiseksi. Potilailta saatua PBL:a (5 x 10**) inkuboitiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 50 ng/ml (proteiinipitoisuus) GRA-3:a kaksi vrk ja sitten vielä viisi vrk RPMI-1640-vä-25 liaineessa, joka sisälsi 20 % TCGF:a ja 15 % FCS:a, jolloin saatiin taulukon 5 mukaisia tappajasoluja.Example 7 (a) Peripheral circulating lymphocytes (PBL) obtained from several cancer patients after surgery were sensitized with GRA-3 to prepare killer cells. Patient-derived PBL (5 x 10 **) was incubated in RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) GRA-3 for two days and then for another five days in RPMI-1640 medium containing contained 20% TCGF and 15% FCS to obtain the killer cells of Table 5.

Taulukko 5 Ääreisverenkierron lymfosyytit Syöpä P-GRA D-GRA Päivää leik- Tappajasolu 30 kauksestaTable 5 Peripheral circulating lymphocytes Cancer P-GRA D-GRA Days of surgery- Killer cell from 30 seasons

Mahasyöpä + + 14 GRA-3-K-T-1 " + + 35 GRA-3-K-T-2Gastric cancer + + 14 GRA-3-K-T-1 "+ + 35 GRA-3-K-T-2

Rintasyöpä + - 21 GRA-3-K-T-3 " + 7 GRA-3-K-T-4 35 + - 35 GRA-3-K-T-5Breast cancer + - 21 GRA-3-K-T-3 "+ 7 GRA-3-K-T-4 35 + - 35 GRA-3-K-T-5

Mahasyöpä + 21 GRA-3-K-T-6 23 7 7 1 57Gastric cancer + 21 GRA-3-K-T-6 23 7 7 1 57

Yllä olevassa taulukossa P-GRA ja D-GRA ilmoittavat GRA:n sijainnin pahanlaatuisessa solukossa (kasvaimet irrotettu leikkaamalla), joka on saatu potilailta, joista kerättiin PBL referenssiesimerkin 1, 2-(b) mukaisesti. P-GRA 5 ja D-GRA ovat tuloksia, jotka saatiin käyttäen FITC-PNA:a ja FlTC-DBA:a vastaavasti. Leikkauksen jälkeiset päivät ilmoittavat aikaa, jona PBL kerättiin leikkauksen jälkeen.In the table above, P-GRA and D-GRA indicate the location of GRA in a malignant cell (tumors removed by dissection) obtained from patients collected from PBL according to Reference Example 1, 2- (b). P-GRA 5 and D-GRA are results obtained using FITC-PNA and FlTC-DBA, respectively. Postoperative days indicate the time at which PBL was collected after surgery.

(b) PBL:a (5 x 106), joka oli kerätty rintasyöpäpotilailta 21 vrk:n kuluttua leikkauksesta, inkuboitiin RPMI- 10 1640-alustässä, joka sisälsi 50 ng/ml (proteiinipitoi suus) GRA-3:a ja potilaan seerumia (10 %), seitsemän vrk, jolloin saatiin tappajasoluvalmiste. Tätä kutsutaan tästedes lyhenteellä "GRA-3-K-T-7".(b) PBL (5 x 10 6) collected from breast cancer patients 21 days after surgery was incubated in RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein concentration) GRA-3 and patient serum ( 10%), seven days to obtain a killer cell preparation. This is hereinafter referred to as "GRA-3-K-T-7".

Esimerkki 8Example 8

OO

15 Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu GRA-l-K-T (10 ) :: laimennettiin fysiologisella suolaliuoksella (10 ml) ruis- :- kutettavan liuoksen aikaansaamiseksi.GRA-1-K-T (10) :: prepared according to Example 1 was diluted with physiological saline (10 ml) to obtain an injectable solution.

: : Esimerkki 9 (i) Referenssiesimerkin 2 ((2)—(b)) mukaisesti val- : 20 mistettu GRA-M-1 laimennettiin fysiologisella suolaliuok sella siten, että sokeri- ja proteiinipitoisuuksiksi saatiin 1,0 ^,ug/ml ja 1,6 ^ug/ml vastaavasti, jolloin saatiin syövän vastainen aine nro 1.Example 9 (i) GRA-M-1 prepared according to Reference Example 2 ((2) to (b)) was diluted with physiological saline to give sugar and protein concentrations of 1.0 μg / ml and 1.6 ug / ml, respectively, to give the anticancer agent No. 1.

(ii) C3H/He-hiirillä spontaanisti esiintyvästä rin-25 tasyöpäkasvaimesta leikattiin steriilisti 5 mm:n kuutio- maisia paloja ja ne siirrettiin selkänähän alle kymmenelle C3H/He-hiirelle, jotka olivat samaa kantaa kuin yllä ole-vat (seitsemän viikon ikäisiä uroksia) . Seitsemän päivän kuluttua istutuksesta varmistettiin kasvaimen kiinnittymi-30 nen ja jakautuminen. Viidelle hiiristä annettiin kullekin ihon alle syövän vastaista ainetta nro 1, joka oli valmis-tettu (i) :n mukaisesti, 300 ^ul/päivä kahden päivän väliajoin. Toista viiden hiiren joukkoa käytettiin käsittelemättömänä vertailuryhmänä. 10 päivän kuluttua ensimmäisestä 35 aineen antokerrasta kasvaimet poistettiin leikkaamalla ja niiden keskimääräinen paino mitattiin. Samanaikaisesti tehtiin patohistologinen tutkimus.(ii) 5 mm cubic pieces of spontaneously occurring rin-25 flatulence tumor in C3H / He mice were sterile cut and transferred to the dorsal fin of less than ten C3H / He mice of the same strain as the above seven-week-old males ). Seven days after implantation, tumor attachment and division were confirmed. Five mice were each given subcutaneous anti-cancer agent No. 1 prepared according to (i) at 300 μl / day at two-day intervals. Another set of five mice was used as an untreated control group. Ten days after the first 35 administrations, tumors were removed by excision and their average weight was measured. At the same time, a pathohistological study was performed.

24 7 7 1 5724 7 7 1 57

Kasvaimen tilavuus: 3 Lääkettä saanut ryhmä 22,3 mm (kuvio 14) 3Tumor volume: 3 Drug group 22.3 mm (Figure 14) 3

Kontrolliryhmä 162,7 mm (kuvio 15) Tämä merkitsee sitä, että kasvaimen koossa oli 86,3 %:n 5 pieneneminen.Control group 162.7 mm (Figure 15) This means that there was an 86.3% reduction in tumor size.

Patohistologinen tutkimus:Pathohistological examination:

Vertailuryhmässä (kuvio 16) muodostui linnunpesämäi-siä syöpäkasvaimia, kudostyyppi oli ydinkanavasyövän kaltainen ja kasvainsolujen jakautumista oli havaittavissa 10 kaikkialla kudoksessa. Toisaalta lääkettä saaneessa ryhmässä (kuvio 17) syöpäsolut aiheuttivat muodostumiskohdilleen nestemäisen kuolion ja esiintyi kovettumista ja sidekudoksen muodostumista ja jäljelle jäi vain hyvin rajoittunut määrä syöpäsoluja. Siten oli havaittavissa, että keksinnön 15 mukaisesti valmistetun syövän vastaisella aineella on kasvainten vastaisia ominaisuuksia.In the control group (Fig. 16), nested cancerous tumors developed, the tissue type was similar to nuclear canal cancer, and tumor cell distribution was observed throughout the tissue. On the other hand, in the drug-treated group (Fig. 17), the cancer cells caused liquid necrosis at their sites of formation and hardening and connective tissue formation occurred, leaving only a very limited number of cancer cells. Thus, it was found that the anti-cancer agent prepared according to the invention has anti-tumor properties.

Koe-esimerkki 1Experimental Example 1

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu GRA-l-K-T (1 ^ul) laitettiin mikrolevylle (valmistaja Falcon Corp.) ja annet-20 tiin seistä huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Sitten lisättiin 4 |il FCS:a (valmistaja Falcon Corp.) ja seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Lisättiin neuraminidaasilla käsiteltyjä lampaan punasoluja N 9 (SRBC ), joiden määrä oli säädetty 1x10 :ksi millilitras- 25 sa ja 5 jal 0,01 M fosfaattipuskuria (pH = 7,2), johon oli lisätty 0,85 % NaCl ja levylle tehtiin erotus sentri- fugoimalla nopeudella 600 rpm viisi minuuttia. Sitten levyGRA-1-K-T (1) prepared according to Example 1 was placed on a microplate (manufactured by Falcon Corp.) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. 4 FCS (manufactured by Falcon Corp.) was then added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Neuraminidase-treated sheep erythrocytes N 9 (SRBC) were added in an amount of 1x10 per milliliter and 5 μl of 0.01 M phosphate buffer (pH = 7.2) supplemented with 0.85% NaCl and separated on a plate. centrifugation at 600 rpm for five minutes. Then the record

NOF

käännettiin ja reagoimaton SRBC poistettiin. Lisättiin värjäysliuosta (Brilliant Cresyl Blue, valmistaja Merck & 30 Co.) lymfosyyttien värjäämiseksi ja tutkittiin rusetin muodostusta. Tuloksena havaittiin, että vähintään 98 % soluista on rusetin muodostuspositiivisia (T-soluja).was inverted and unreacted SRBC was removed. Staining solution (Brilliant Cresyl Blue, manufactured by Merck & 30 Co.) was added to stain lymphocytes and a bow formation was examined. As a result, it was found that at least 98% of the cells are bow-forming positive (T cells).

Koe-esimerkki 2Experimental Example 2

Spesifinen syöpäsolujen tappamisaktiivisuus 35 (a) Taulukon 1 mukaisista soluista kohteina toimi vina ihmisen syöpäsoluina käytettiin seuraavaa viittä solu-kantaa, joilla on erilainen GRA-positiivisuus.Specific Cancer Cell Killing Activity 35 (a) From the cells of Table 1, the following five cell strains with different GRA positivity were used as target human cancer cells.

25 7715725 77157

Kohteena olevat syöpäsolut: nro 1 BT-1 (Burkittin imukudoskasvain) nro 2 Daudi (Burkittin imukudoskasvain) nro 3 Kato-III (vatsasyöpä) 5 nro 4 MKN-45 (vatsasyöpä) nro 5 MOLT (T-solu-leukemia)Target cancer cells: No. 1 BT-1 (Burkitt's lymphoma) No. 2 Daudi (Burkitt's lymphoma) No. 3 Kato-III (stomach cancer) No. 5 MKN-45 (stomach cancer) No. 5 MOLT (T-cell leukemia)

Mikrolevylle (valmistaja Falcon Corp.) laminoitiin 4 kohteena olevia syöpäsoluja 5 x 10 syvennystä kohden sentri-fugoimalla nopeudella 800 rpm viisi minuuttia. Sitten li- 3 10 sättiin syvennystä kohden 4 x 10 esimerkin 1 mukaista GRA- 1-K-T:a varovasti ja inkuboitiin yksi tunti.4 target cancer cells were laminated to a microplate (manufactured by Falcon Corp.) at 5 x 10 wells by centrifugation at 800 rpm for five minutes. 4 x 10 GRA-1-K-T of Example 1 per well was then carefully added and incubated for one hour.

Tappamisaktiivisuus määritettiin täplien muodostu-misasteen perusteella seuraavaa asteikkoa käyttäen: ++ Selvästi havaittava tappamisaktiivisuus 15 + Havaittavissa oleva tappamisaktiivisuus ± Heikosti havaittava tappamisaktiivisuus - Tappamisaktiivisuutta ei havaittavissa Vertailuryhmänä käytettiin herkistämättömiä ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyttejä, jotka oli preparoitu esi-* 20 merkin 1 mukaisesti, mutta käyttämättä GRA:a. Tulokset ovat taulukossa 6.Killing activity was determined by the degree of spot formation using the following scale: ++ Clearly detectable killing activity 15 + Observable killing activity ± Low detectable killing activity - No detectable killing activity Unsensitized human peripheral circulating lymphocytes were used as a control group, : a. The results are shown in Table 6.

Taulukossa 6 ilmenee, että keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla tappaja-T-soluilla on voimakas GRA-spesifinen sytotoksinen vaikutus.Table 6 shows that the killer T cells prepared by the method of the invention have a potent GRA-specific cytotoxic effect.

25 Taulukko 625 Table 6

Kohde-syöpäsolu GRA-positii- Täplien muodostus ... visuus (%) .-X GRA-l-K- DAUDI (kuv. 1) 93,1 ++ (kuv. 2) T-ryhmä KATO-III (kuv. 3) 57,3 + (kuv. 4) 30 BT-1 (kuv. 5) 50,1 ++ (kuv. 6) MKN-45 (kuv. 7) 1,0 ± (kuv. 8) MOLT (kuv. 9) 0,6 - (kuv. 10)Target cancer cell GRA-positive- Spot formation ... visibility (%).-X GRA-1K-DAUDI (Fig. 1) 93.1 ++ (Fig. 2) T-group KATO-III (Fig. 3) 57.3 + (Fig. 4) 30 BT-1 (Fig. 5) 50.1 ++ (Fig. 6) MKN-45 (Fig. 7) 1.0 ± (Fig. 8) MOLT (Fig. 9) ) 0.6 - (Fig. 10)

Vertailu- BT-1 50,1 - (kuv. 11) ryhmä 35 (b) Samoja kohde-syöpäsoluja kuin käytettiin (a):ssa, (3,2 - 10^) sekoitettiin GRA-1-K-T:een (8 x 10^) (solusuh-de: 5/1) ja saatua soluseosta (kokonaislukumäärä: 4 x 10^) 26 7 7 1 57 kasvatettiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 15 % FCS:a. Tunnin kuluttua laskettiin jäljellä olevien solujen lukumäärä ja prosentuaalinen sytotoksisuus seuraavalla kaavalla.Comparative BT-1 50.1 - (Fig. 11) group 35 (b) The same target cancer cells as used in (a) were (3.2-10) mixed with GRA-1-KT (8 x 10 ^) (cell ratio: 5/1) and the resulting cell mixture (total number: 4 x 10 ^) 26 7 7 1 57 were grown in RPMI-1640 medium containing 15% FCS. After one hour, the number of remaining cells and the percentage of cytotoxicity were calculated by the following formula.

solujen lukumäärä c . . . . kasvatuksen jälkeen v lnn.number of cells c. . . . after rearing v lnn.

5 sytotoksisuus (%) = (1 - soiujen lukumäärä x 100) ennen kasvatusta (4 x 106)5 cytotoxicity (%) = (1 - number of strands x 100) before growth (4 x 106)

Tulokset ovat taulukossa 7.The results are shown in Table 7.

Taulukko 7 10 Solujen lukumääräTable 7 10 Number of cells

Kohdesolu Ennen Viljelyn Sytotoksisuus (%) viljelyä jälkeenTarget cell Before Culture Cytotoxicity (%) after culture

Daudi 4 x 10® 2,0x10® 28 KATO-III 4 x 106 3,7 x 106 7,5 15 BT-1 4 x 106 3,2 x 106 20 MKN-45 4 x 106 3,9 x 106 2,5 MOLT 4 x 10® 4,2 x 10® -5 (c) Meneteltiin kuten (b):ssa, mutta sekoitussuhde GRA-l-K-T/kohde-syöpäsolut muutettiin 5/3:ksi. Tulokset 20 ovat taulukossa 8.Daudi 4 x 10® 2.0x10® 28 KATO-III 4 x 106 3.7 x 106 7.5 15 BT-1 4 x 106 3.2 x 106 20 MKN-45 4 x 106 3.9 x 106 2, 5 MOLT 4 x 10® 4.2 x 10® -5 (c) The procedure was as in (b), but the mixing ratio of GRA-1KT / target cancer cells was changed to 5/3. The results 20 are in Table 8.

Taulukko 8Table 8

Solujen lukumääräNumber of cells

Kohdesolu Ennen Viljelyn Sytotoksisuus (%) viljelyä jälkeen 25 Daudi 4 x 10® 3,6 x 105 91 KATO-III 4 x 10® 3,6 x 10® 24 BT-1 4 x 10® 1,4 x 10® 65 MKN-45 4 x 10® 3,7 x 10® 7,2 MOLT 4 x 10® 4,1 x 10® -3Target cell Before Culture Cytotoxicity (%) after culture 25 Daudi 4 x 10® 3.6 x 105 91 KATO-III 4 x 10® 3.6 x 10® 24 BT-1 4 x 10® 1.4 x 10® 65 MKN -45 4 x 10® 3.7 x 10® 7.2 MOLT 4 x 10® 4.1 x 10® -3

30 Yllä olevassa kokeessa havaitaan, että GRA-l-K-T30 In the above experiment, it is found that GRA-1-K-T

sitoutuu hyvin aktiivisesti Daudi'in, KATO-IIIreen ja BT-1reen, mutta vain heikosti MKN-45reen ja MOLTreen. Koe-esimerkki 3binds very actively to Daudi, KATO-IIIre and BT-1re, but only weakly to MKN-45re and MOLTre. Experimental Example 3

Spontaanisti esiintyvää rintasyöpää sairastaville 35 C3H/He-hiirille annettiin ihon alle esimerkin 2 mukaista GRA-M-l-K-T:a annoksena 3 x 10®/0,3 ml/hiiri kolmesti vii- 27 7 7 1 57 kossa joka toinen päivä. Kymmenen päivän kuluttua pesäke irrotettiin ja tutkittiin.35 C3H / He mice with spontaneous breast cancer were subcutaneously administered the GRA-M-1-K-T of Example 2 at a dose of 3 x 10® / 0.3 ml / mouse three times a week every other day. After ten days, the colony was detached and examined.

Kuten kuviosta 12 ilmenee, tapahtui lymfosyyttien imeytymistä syöpäsoluihin ja oli havaittavissa kasvaimen 5 pinta-alan pienenemistä. Kuviosta 13 havaitaan, että kasvaimen alueella tapahtui kovettumista ja siten on havaittavissa, että keksinnön mukaisilla tappajasoluilla on kasvainten vastainen vaikutus.As shown in Figure 12, there was an absorption of lymphocytes into the cancer cells and a decrease in the surface area of the tumor 5 was observed. It can be seen from Figure 13 that hardening occurred in the tumor area and thus it can be seen that the killer cells according to the invention have an antitumor effect.

Vertailuesimerkki 1 10 Tässä esimerkissä käytettiin syöpäsoluja per se spesifisinä antigeeneinä GRA:n sijasta keksinnön mukaisessa menetelmässä.Comparative Example 1 In this example, cancer cells per se were used as specific antigens instead of GRA in the method of the invention.

Syöpäsoluherkistettyjä lymfosyyttejä saatiin esimerkin 1 mukaisesti, paitsi että käytettiin GRA:n sijasta 15 BT-l:a, Daudi'a, KAT0-II:a tai MKN-45:a määrinä 1 x 10^/ ; laboratoriomalja.Cancer cell-sensitized lymphocytes were obtained according to Example 1, except that 15 BT-1, Daudi, KAT0-II or MKN-45 were used instead of GRA in amounts of 1 x 10 6; Laboratory chalice.

: ·; Näiden lymfosyyttien sytotoksinen aktiivisuus tut- kittiin koe-esimerkin 2 ((a)) mukaisesti. Tulokset ovat taulukossa 9.: ·; The cytotoxic activity of these lymphocytes was examined according to Experimental Example 2 ((a)). The results are shown in Table 9.

20 Taulukossa 9 on havaittavissa, että yllä mainitulla tavalla valmistetuilla lymfosyyteillä ei ole minkäänlaista sytotoksista vaikutusta.20 It can be seen from Table 9 that lymphocytes prepared as mentioned above do not have any cytotoxic effect.

Taulukko 9Table 9

Lymfosyyttien herkistämisessä 25 käytettävät solutCells used for lymphocyte sensitization

Kohdesolu BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 . BT-1 -Target cell BT-1 Daudi KATO-III MKN-45. BT-1 -

Daudi - KATO-III - 30 MKN-45 -Daudi - KATO-III - 30 MKN-45 -

Koe-esimerkki 4Experimental Example 4

Koe-esimerkin 2-(b) mukaisesti määritettiin esimerkin 4 mukaisesti valmistettujen GRA-8-K-T:n, GRA-3-A-K-T:n ja GRA-3-C-K-T:n syöpäsoluja tappava vaikutus. Tulokset 35 ovat taulukossa 10.According to Experimental Example 2- (b), the cancer cell killing effect of GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T and GRA-3-C-K-T prepared according to Example 4 was determined. The results 35 are in Table 10.

Taulukko 10 28 771 57Table 10 28 771 57

Sytotoksisuus (%)Cytotoxicity (%)

Kohdesolu GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GRA-3-C-K-TTarget cell GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GRA-3-C-K-T

KATO-III 8,0 5,0 5,0 5 BT-1 4,3 5,0 4,0 MKN-45 20 5,0 20 MOLT 000 (a) Kunkin esimerkin 6 mukaisesti saadun tappajasi 10 soiuvalmisteen sytotoksisuus määritettiin Cr-vapautus-kokeella /J. Immunol. 122 (1979) 2527-2533/. S.O. 50 ,uCi radioaktiivista Cr:a (Japan Isotope Association) lisättiin KATO-III:een (2 x 10^) ja soluja inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti RPMI-1640-alustassa ja pestiin sen jälkeenKATO-III 8.0 5.0 5.0 5 BT-1 4.3 5.0 4.0 MKN-45 20 5.0 20 MOLT 000 (a) The cytotoxicity of each of the killer preparations of your killer 10 obtained according to Example 6 was determined by Cr- release test / J. Immunol. 122 (1979) 2527-2533 /. S.O. 50 μCi of radioactive Cr (Japan Isotope Association) was added to KATO-III (2 x 10 4) and the cells were incubated at 37 ° C for one hour in RPMI-1640 medium and then washed

e -Ie -I

15 sentrifugoimalla, jolloin saatiin Cr-merkittyjä kohde- g soluja. Tappajasolut (vaikuttajasolut) (2 x 10 ) lisättiin c kohdesoluihin (1 x 10 ) (siten vaikuttajasolu/kohdesolu-suhde = 20/1) ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa neljä tuntia RPMI-1640-alustassa. Supernatantti kerättiin sentrifu-ZU goimalla ja sen radioaktiivisuus määritettiin nestetuike-laskimella.By centrifugation to obtain Cr-labeled target g cells. Killer cells (effector cells) (2 x 10) were added to c target cells (1 x 10) (thus effector cell / target cell ratio = 20/1) and the mixture was incubated at 37 ° C for four hours in RPMI-1640 medium. The supernatant was collected by centrifugation and its radioactivity was determined with a liquid scintillation counter.

Ominais-^Cr-vapautus (%) , joka vastaa vaikuttaja-solujen sytotoksista aktiivisuutta, laskettiin seuraavalla yhtälöllä.The specific β-Cr release (%) corresponding to the cytotoxic activity of the effector cells was calculated by the following equation.

51 25 Ominais- Cr-vapautus (%) (vapautus kokeessa) - (spontaani vapautus) χ (maksimivapautus) - (spontaani vapautus) (Maksimivapautus on radioaktiivisuus silloin, kun kaikki so-30 lut hajoavat.)51 25 Specific Cr release (%) (release in experiment) - (spontaneous release) χ (maximum release) - (spontaneous release) (Maximum release is radioactivity when all 30 cells are degraded.)

Tulokset ovat taulukossa 11.The results are shown in Table 11.

5151

Taulukko 11 77157 29Table 11 77157 29

Tappajasolu Ominais- Cr- vapautus (%) GRA-l-K-T-1 13 5 GRA-l-K-T-2 25 GRA-l-K-T-3 22 GRA-l-K-T-4 20 GRA-l-K-T-5 22 GRA-l-K-T-6 25 10 GRA-l-K-T-7 27 GRA-l-K-T-8 32Killer cell Specific Cr release (%) GRA-lKT-1 13 5 GRA-lKT-2 25 GRA-lKT-3 22 GRA-lKT-4 20 GRA-lKT-5 22 GRA-lKT-6 25 10 GRA-lKT -7 27 GRA-1KT-8 32

Taulukon 11 antamista tuloksista on havaittavissa, että TCGF:lla ja FCS:lla ei ole vaikutusta tappajasolujen induktioon.From the results given in Table 11, it can be seen that TCGF and FCS have no effect on the induction of killer cells.

15 (b) Esimerkin 3 mukaisesti saadun GRA-2-K-T:n sytotok- - 51 : sisuus määritettiin Cr-vapautuskokeella samalla tavalla kuin (a) :ssa yllä. Havaittiin ominais-^Cr-vapautus 14,3 % • · 51 käytettäessä kohdesoluina Cr-merkittyjä KATO-III:a (vai kutta jasolu/kohdesolusuhde = 20/1).(B) The cytotoxicity of GRA-2-K-T obtained according to Example 3 was determined by a Cr release assay in the same manner as in (a) above. A specific Cr release of 14.3% • · 51 was observed using Cr-labeled KATO-III as target cells (or cell / target cell ratio = 20/1).

20 Koe-eslmerkki 6 (a) Käyttäen KATO-III (vaikuttajasolu/kohdesolu-suh-de = 20/1) kohdesoluna määritettiin esimerkin 7-(a) mukaisesti saatujen tappajasolujen sytotoksisuus samalla tavalla kuin koe-esimerkissä 2-(b).Experimental Example 6 (a) Using KATO-III (effector cell / target cell ratio = 20/1) as the target cell, the cytotoxicity of the killer cells obtained according to Example 7- (a) was determined in the same manner as in Experimental Example 2- (b).

25 Tulokset ovat taulukossa 12.25 The results are shown in Table 12.

Taulukko 12Table 12

Tappajasoluja Sytotoksisuus (%) GRA-3-K-T-1 38,0 GRA-3-K-T-2 18,2 30 GRA-3-K-T-3 20,9 GRA-3-K-T-4 23,2 GRA-3-K-T-5 24,5 GRA-3-K-T-6 20,2 (b) Esimerkin 7-(b) mukaisesti saadun GRA-3-K-T-7:n 35 sytotoksisuus määritettiin käyttäen ^Cr-KATO-III :a (vaikutta jasolu/kohdesolu-suhde = 20/1) kohdesoluna samalla ta- 51 valla kuin koe-esimerkissä 5. Tappajasolun ominais- Cr-vapautus oli 25,5 %.Killer cells Cytotoxicity (%) GRA-3-KT-1 38.0 GRA-3-KT-2 18.2 30 GRA-3-KT-3 20.9 GRA-3-KT-4 23.2 GRA-3- KT-5 24.5 GRA-3-KT-6 20.2 (b) The cytotoxicity of GRA-3-KT-7 obtained according to Example 7- (b) was determined using ^ Cr-KATO-III (effect and cell / target cell ratio = 20/1) as the target cell in the same manner as in Experimental Example 5. The specific Cr release of the killer cell was 25.5%.

77157 3077157 30

Koe-esimerkki 7Experimental Example 7

Esimerkin 5 mukaisesti saatujen tappajasolujen syto- toksisuus määritettiin ~^Cr-vapautuskokeella samalla ta- 51 valla kuin koe-esimerkissä 5. Kohdesoluna käytettiin -Cr-5 merkittyä X5563-solua. GRA-M-5:n sijasta käytettiin ver- tailunäytteenä lymfosyyttejä, jotka oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 5, mutta tekemällä pernasolujen herkis-tys mitomysiini C-käsitellyillä X5563-soluilla (1 x 10^/ syvennys) /5 x 10^/ml X5563-soluja käsiteltiin mitomysiini 10 C:lla (50 ^ug/ml) 60 minuuttia/.The cytotoxicity of the killer cells obtained according to Example 5 was determined by a ^1 Cr release assay in the same manner as in Experimental Example 5. A Xr63-labeled X5563 cell was used as a target cell. Instead of GRA-M-5, lymphocytes obtained in the same manner as in Example 5 but using sensitization of spleen cells with mitomycin C-treated X5563 cells (1 x 10 6 / well) / 5 x 10 6 / L were used as a control. ml of X5563 cells were treated with mitomycin at 10 ° C (50 μg / ml) for 60 minutes.

Saadut tulokset ovat taulukossa 13.The results obtained are shown in Table 13.

Taulukko 13 51Table 13 51

Ominais- Cr-vapautus (%)Specific Cr release (%)

Tappajasolu E/T ratio 15 40:1 20:1 10:1 GRA-M-5-K-T-1 12,7 6,3 5,7 GRA-M-5-K-T-2 18,4 20,6 13,7Killer cell E / T ratio 15 40: 1 20: 1 10: 1 GRA-M-5-KT-1 12.7 6.3 5.7 GRA-M-5-KT-2 18.4 20.6 13, 7

Vertailu 0,0 0,0 0,0Comparison 0.0 0.0 0.0

Koe-esimerkki 8 (H-2-tutkimus) 20 Referenssiesimerkin 2 mukaisesti saaduista GRA-M-1, GRA-M-3 ja GRA-M-4 tehtiin laimennussarja PBS:ään (0,85 % NaCl) näytteiden valmistamiseksi.Experimental Example 8 (H-2 Study) 20 GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 obtained according to Reference Example 2 were serially diluted in PBS (0.85% NaCl) to prepare samples.

Anti-H-2-seerumi (National Institute of Geneteic Reserach) ja yllä mainittu näyte sekoitettiin ja inkuboi-25 tiin 4°C:ssa kaksi tuntia ja lisättiin käytettyä anti-H-2-seerumia vastaava kohdesolu. Kohdesoluna käytettiin perna-solua tai immusolmukesolua, jotka oli saatu BIO (H-2°) ja ]rThe anti-H-2 serum (National Institute of Genetic Reserach) and the above sample were mixed and incubated at 4 ° C for two hours and the target cell corresponding to the anti-H-2 serum used was added. A spleen cell or a lymph node cell obtained from BIO (H-2 °) and] r was used as a target cell.

Bl0*Br (h-2 ) -hiiristä tavanomaisella menetelmällä. Kun solut oli pesty PBS:llä, lisättiin täydennysainetta (ka-30 niini) soluihin ja niitä inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti ja värjättiin 0,2 % trypaanisininen-PBS:llä prosentuaalisen sytotoksisuuden määrittämiseksi GRA:n poissaollessa.Bl0 * Br (h-2) mice by a conventional method. After washing the cells with PBS, supplement (ka-30in) was added to the cells and incubated at 37 ° C for one hour and stained with 0.2% trypan blue-PBS to determine the percentage of cytotoxicity in the absence of GRA.

GRA:n aiheuttama estovaikutus määritettiin taulukon 14 mukaisille systeemeille.The GRA-induced inhibitory effect was determined for the systems in Table 14.

31 7715731 77157

Taulukko 14 GRA Anti-H-2-seerumi, pitoisuus Kohdesolut GRA-M-l D-23 (anti-H-2Kk), X80 B10BR (H-2k)-pernaso- tai lut 5 D-23 (anti-H-2Dk), X300 GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb)f X600 BIO (H-2b)-pernasolut tai D-2 (anti-H-2Db), X80 GRA-M-4 D-23 X80 B10‘BR (h-2k)-imusol- 10 tai mukesolut D-32 X300Table 14 GRA Anti-H-2 serum, concentration Target cells GRA-M1 D-23 (anti-H-2Kk), X80 B10BR (H-2k) spleen or lut 5 D-23 (anti-H-2Dk) , X300 GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb) f X600 BIO (H-2b) spleen cells or D-2 (anti-H-2Db), X80 GRA-M-4 D-23 X80 B10 BR (h-2k) lymph node 10 or mu cells D-32 X300

Tulokset ovat taulukossa 15.The results are shown in Table 15.

Taulukko 15Table 15

Sytotoksisuus (%) 15 GRA Anti-H-2- Näytteen laimennus seerumi X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 O x I - - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13 D-23 - 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14 D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 20 li - - 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14 D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15 D-2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17 III D-23 100 100 100 100 - - - - - 100 10 D-32 99 99 99 99 - - - - - 99 10 :.V 25 Huom: GRA I: GRA-M-l GRA II: GRA-M-3 GRA III: GRA-M-4 "x": sytotoksisuus (%) pelkällä komplementilla 30 Taulukon 15 esittämistä tuloksista on havaittavissa, että GRA-M-l:lta, GRA-M-3:lta ja GRA-M-4:lta puuttuu H-2. Koe-eslmerkki 9 C57BL/6-hiirille siirrettiin ihon alle LLC:a (2 x 10^), joka oli peräisin samasta kannasta ja kuuden päivän 35 kuluttua annettiin ihon alle referenssiesimerkin 2-(d) mukaista GRA-M-3:a 1 ng (proteiini). Sen jälkeen annettiin samanlainen annos neljänä päivänä kerran päivässä. Viimeistä 32 771 5 7 antokertaa seuraavana päivänä kasvainsolut irrotettiin ja punnittiin. Vertailuryhmänä käytettiin hiiriä, joille annettiin fysiologista suolaliuosta. Kummassakin koeryhmässä oli viisi eläintä.Cytotoxicity (%) 15 GRA Anti-H-2- Sample dilution serum X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 O x I - - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13 D-23 - 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14 D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 20 li - - 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14 D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15 D-2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17 III D-23 100 100 100 100 - - - - - 100 10 D-32 99 99 99 99 - - - - - 99 10: .V 25 Note: GRA I: GRA-Ml GRA II: GRA-M-3 GRA III: GRA-M-4 "x": cytotoxicity (%) with complement alone 30 From the results shown in Table 15, it can be seen that GRA-M1, GRA-M-3 and GRA -M-4 lacks H-2. Experimental Example 9 C57BL / 6 mice were subcutaneously inoculated with LLC (2 x 10 6) from the same strain, and after six days, GRA-M-3 according to Reference Example 2- (d) was administered subcutaneously. ng (protein). A similar dose was then given once daily for four days. The day after the last 32,771 5 7 administrations, the tumor cells were detached and weighed. Mice given physiological saline were used as a control group. There were five animals in each experimental group.

5 Tuloksena havaittiin kasvaimen keskimääräisen koon olevan vertailuryhmässä noin 500 mg. Ryhmässä, jolle annettiin GRA-M-3:a, kolmella eläimellä kasvain oli kadonnut ja kahdella kasvaimen keskipaino oli noin 100 mg.5 As a result, the mean tumor size in the control group was found to be about 500 mg. In the group given GRA-M-3, three animals had lost their tumors and two had an average tumor weight of about 100 mg.

Koe-esimerkki 10 10 C57BL/6-hiiret immunisoitiin antamalla ihon alle 1 ng (proteiini) referenssiesimerkin 2-(d) mukaisesti saatua GRA-M-3:a kerran päivässä kolmen päivän ajan ja viidentenä päivänä eläimistä kerättiin pernasolut vaikuttaja-solujen saamiseksi. Valmistettiin seos vaikuttajasoluista 15 ja kohdesoluina toimivista Lewis'in keuhkosyöpäsoluista (LLC) vaikuttajasolu/kohdesolu-suhteen ollessa 50:1 ja osa 5 siitä (1 x 10 ) siirrettiin saman kannan hiireen ja tehtiin Winn-koe . Immunol. 86 (1961) 228-2397·Experimental Example 10 10 C57BL / 6 mice were immunized by subcutaneous administration of 1 ng (protein) of GRA-M-3 obtained according to Reference Example 2- (d) once a day for three days, and on the fifth day, spleen cells were collected from the animals to obtain influenza cells. A mixture of 15 effector cells and Lewis lung cancer cells (LLC) as target cells was prepared at a 50: 1 effector / target cell ratio, and a portion of 5 (1 x 10) was transferred to a mouse of the same strain and subjected to a Winn test. Immunol. 86 (1961) 228-2397 ·

Saadut tulokset ovat taulukossa 16.The results obtained are shown in Table 16.

20 Taulukko 1620 Table 16

Vaikutta- Kasvaimen kasvunopeus (%) Kuolleita/ jasolut Päivä Päivä Päivä Päivä Päivä ryhmä 20.Effect- Tumor growth rate (%) Deaths / cells Day Day Day Day Day group 20.

15 17 18 19 20 päivänä A 5,7 5,5 5,7 3,1 1,4 0/10 25 B 21,4 39,5 37,1 55,4 76,8 4/10 C 39,3 65,1 61,7 98,1 96,4 4/1015 17 18 19 20 A 5.7 5.5 5.7 3.1 1.4 0/10 25 B 21.4 39.5 37.1 55.4 76.8 4/10 C 39.3 65 , 1 61.7 98.1 96.4 4/10

Huom: Ryhmä A on GRA-M-3-immuunihiiren pernasoluja.Note: Group A is GRA-M-3 immune mouse spleen cells.

Ryhmä B on normaalin hiiren pernasoluja.Group B is normal mouse spleen cells.

Ryhmä C on pernasoluja, jotka on saatu hiirestä, joi- g 30 le on siirretty LLC:a (1 x 10), 10 päivää siirron jälkeen.Group C are spleen cells obtained from mice transfected with 30 (10 x 10) mice 10 days after transplantation.

Kasvainten kasvunopeus laskettiin seuraavalla kaavalla .Tumor growth rate was calculated by the following formula.

TA - TNTA - TN

Kasvainten kasvunopeus (%) = -^- x 100Tumor growth rate (%) = - ^ - x 100

35 N35 N

jossa TA on polkuanturan paksuus sivusta mitattuna silloin, kun kasvain on siirretty ja TN on normaalin polkuanturan paksuus.where TA is the thickness of the footpad as measured from the side when the tumor has been transferred and TN is the thickness of the normal footprint.

33 771 5 733 771 5 7

Koe-esimerkki 11 C3H/He-hiiri immunisoitiin antamalla 4,5 g (proteiini) GRA-M-4:a (referenssiesimerkki 2-(d)) ja 0,1 ml Freund's Complete Adjuvant'ia risti-häntäluun alueelle. Kahden vii-5 kon kuluttua imusolmukesolut kerättiin tavanomaisesti ja niitä käytettiin vastesoluina määritettäessä GRA-M-4:n aiheuttamaa nopeaa vastetta.Experimental Example 11 C3H / He mice were immunized by administering 4.5 g (protein) of GRA-M-4 (Reference Example 2- (d)) and 0.1 ml of Freund's Complete Adjuvant to the sacrum region. After two vii-5 weeks, lymph node cells were harvested conventionally and used as response cells to determine the rapid response elicited by GRA-M-4.

Tätä tarkoitusta varten vastesoluja (4 x 10^) inku-boitiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 15 % FCS:a 10 GRA-M-4:n läsnäollessa viisi vrk. Inkubointijakson 18 vii- 3 3 meisen tunnin aikana lisättiin 1 Ci H-tymidiiniä ( H-TdR) alustaan ja sen imeytyminen soluihin laskettiin.For this purpose, response cells (4 x 10 6) were incubated in RPMI-1640 medium containing 15% FCS in the presence of 10 GRA-M-4 for five days. During the last 3 hours of the incubation period, 1 Ci of H-thymidine (H-TdR) was added to the medium and its uptake into cells was calculated.

Tulokset ovat taulukossa 17.The results are shown in Table 17.

Taulukko 17 • 15 GRA-M-4 Pitoisuus 3H-TdR-imeytyminen S.I.Table 17 • 15 GRA-M-4 Concentration 3H-TdR Absorption S.I.

(ng/ml) (keski-cpm + S.E.)(ng / ml) (mean cpm + S.E.)

Vertailu 0 5,302 ί 1,761 0,5 7,903 + 1,290 1,5 : 1 10,076 ± 936 1,9 20 Koe 5 10,686 ± 429 2,0 20 10,615 ± 1,270 2,0 40 8,565 ± 1,419 1,6Comparison 0 5,302 ί 1,761 0,5 7,903 + 1,290 1,5: 1 10,076 ± 936 1,9 20 Experiment 5 10,686 ± 429 2,0 20 10,615 ± 1,270 2,0 40 8,565 ± 1,419 1,6

Huom: "S.I." on stimulointikerroin koe/vertailu. Koe-esimerkki 12 25 C3H/He-normaalihiiren, esimerkin 5 mukaisesti saatu jen X5563-immuunihiiren ja MH134-immuunihiiren sekä koe-esimerkin 11 mukaisesti saatujen GRA-M-4-immuunihiiren ja GRA-M-5-immuunihiiren viivästynyt hypersensitiivisyys (DTH)-vaste määritettiin polkuanturakokeella (FPR). S.o. GRA-30 tai MMC-käsiteltyjä kasvainsoluja laitettiin takajalan pol-kuanturan ihoon ja polkuanturan paisuminen määritettiin 24 tunnin käsittelyn jälkeen. DTH-vasteen aste laskettiin vähentämällä ennen käsittelyä esiintynyt paisuminen käsit- _2 telyn jälkeisestä (lo mm).Note: "S.I." is the stimulation factor test / comparison. Experimental Example 12 Delayed hypersensitivity (D) of hypersensitivity (C3H / He normal mouse, X5563 immune mouse and MH134 immune mouse obtained according to Example 5 and GRA-M-4 immune mouse and GRA-M-5 immune mouse obtained according to Experimental Example 11) response was determined by a footprint test (FPR). That is, GRA-30 or MMC-treated tumor cells were placed in the skin of the hind paw foot and the foot swelling was determined after 24 hours of treatment. The degree of DTH response was calculated by subtracting the pre-treatment swelling from the post-treatment (10 mm).

35 Saadut tulokset ovat taulukoissa 18-22.35 The results obtained are shown in Tables 18-22.

Taulukko 18 34 771 57 -2Table 18 34 771 57 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm)Trajectory average thickening (10 mm)

Ryhmä Normaalihiiri MH134-immuunihiiri 1 2,8 13,6 5 2 12,4 32,0 3 3,6 3,6 4 3,2 22,0 5 6,8 27,6Group Normal mouse MH134 immune mouse 1 2.8 13.6 5 2 12.4 32.0 3 3.6 3.6 4 3.2 22.0 5 6.8 27.6

Huom: Ryhmä 1; normaaleja pernasoluja 1 x 10^/20 ^,ul alus-10 taa (Hank'in liuos)Note: Group 1; normal spleen cells 1 x 10 ^ / 20 ^ ul ul-10 aa (Hank's solution)

Ryhmä 2; MH134-soluja 1 x 10^/20 ^ul alustaa Ryhmä 3; 20 ^ul alustaaGroup 2; MH134 cells in 1 x 10 4/20 μl medium Group 3; 20 ul of medium

Ryhmä 4; GRA-M-4, 0,8 g (proteiini)/20^,ul alustaa Ryhmä 5; GRA-M-4, 0,4 g (proteiini)/20^,ul alustaa 15 Taulukko 19 -2Group 4; GRA-M-4, 0.8 g (protein) / 20 μl of medium Group 5; GRA-M-4, 0.4 g (protein) / 20 μl medium 15 Table 19 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm)Trajectory average thickening (10 mm)

Ryhmä Normaalihiiri X5563-immuunihiiri MH132-immuunihiiri 1 5,4 4,3 1,1 2 0,9 - 24,3 20 3 2,0 16,9Group Normal mouse X5563 immune mouse MH132 immune mouse 1 5.4 4.3 1.1 2 0.9 to 24.3 20 3 2.0 16.9

Huom: Ryhmä 1; 20 ^ul alustaa (Hanki1in liuos)Note: Group 1; 20 μl of medium (Get the solution)

Ryhmä 2; GRA-M-4, 4 ^ug (proteiini)/20 ^ul alustaaGroup 2; GRA-M-4, 4 μg (protein) / 20 μl medium

Ryhmä 3; GRA-M-5, 4 ^,ug (proteiini)/20 ^ul alustaaGroup 3; GRA-M-5, 4 μg (protein) / 20 μl medium

Taulukko 20 _2 25 Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm)Table 20 _2 25 Path footprint av. thickening (10 mm)

Ryhmä Normaalihiiri GRA-M-4, Immuunihiiri 1 1,7 -0,3 2 5,1 24,6Group Normal mouse GRA-M-4, Immune mouse 1 1.7 -0.3 2 5.1 24.6

Huom: Ryhmä 1; 20 ^ul alustaa (Hank1in liuos) 30 Ryhmä 2; GRA-M-4, 4 ^,ug (proteiini)/20 ^ul väliainettaNote: Group 1; 20 μl of medium (Hank's solution) 30 Group 2; GRA-M-4, 4 μg (protein) / 20 μl medium

Taulukko 21 -2Table 21 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm) Ryhmä Normaalihiiri GRA-M-4, Immuunihiiri 1 -1,8 0,6 35 2 6,3 20,0 3 6,8 6,3 35 771 57Trajectory average thickening (10 mm) Group Normal mouse GRA-M-4, Immune mouse 1 -1.8 0.6 35 2 6.3 20.0 3 6.8 6.3 35 771 57

Huom: Ryhmä 1; 20 jil alustaa (Hank'in liuosta)Note: Group 1; 20 jil medium (Hank's solution)

Ryhmä 2; GRA-M-4, 4 ^uq (proteiini)/20 ^ul alustaa Ryhmä 3; fraktiota, joka kulki PNA-kolonnin läpi samanaikaisesti GRA-M-4:n kanssa (tästedes 5 "C.P."), 4 ^,ug (proteiini)/20 ^ul alustaaGroup 2; GRA-M-4, 4 μg (protein) / 20 μl medium Group 3; fraction passing through the PNA column simultaneously with GRA-M-4 (hereinafter 5 "C.P."), 4 μg (protein) / 20 μl medium

Taulukko 22 -2Table 22 -2

Polkuanturan keskim. paksuuntuminen (10 mm) Ryhmä Normaalihiiri GRA-M-4, Immuunihiiri 1 2,4 -1,0 10 2 2,6 17,7 3 2,4 1,8 4 5,5 18,9Trajectory average thickening (10 mm) Group Normal mouse GRA-M-4, Immune mouse 1 2.4 -1.0 10 2 2.6 17.7 3 2.4 1.8 4 5.5 18.9

Huom: Ryhmä 1; 20 jil alustaa (Hank* in liuosta)Note: Group 1; 20 jil medium (Hank * solution)

Ryhmä 2; GRA-M-4, 3,8 ^,ug (proteiini)/20 ^ul alustaa 15 Ryhmä 3; mainittua "C.P.":a, 3,8 yug (proteiini)/20 ^ul : alustaaGroup 2; GRA-M-4, 3.8 μg (protein) / 20 μl medium 15 Group 3; said "C.P.", 3.8 μg (protein) / 20 μl of medium

Ryhmä 4; 3,8 ^ug (proteiini) GRA-M-4 ja 3,8 ^ug (proteiini) "C.P.":a/20 ^ul alustaa Referenssikoe 20 X5563-hiiret saatiin samalla tavalla kuin esimerkis sä 5 . Tämän immuunihiiren pernasoluja käytettiin vaikutta- 7 jasoluina ja vaikuttajasolut (10 ) ja kohdesolut (X5563, 10^) siirrettiin yhdessä saman kannan hiireen. Tehtiin Winn-koe koe-esimerkin 10 mukaisesti.Group 4; 3.8 μg (protein) of GRA-M-4 and 3.8 μg (protein) of "C.P." / 20 μl of medium Reference Experiment 20 X5563 mice were obtained in the same manner as in Example 5. Spleen cells from this immune mouse were used as effector cells, and the effector cells (10) and target cells (X5563, 10 ^) were co-transferred to a mouse of the same strain. A Winn experiment was performed according to Experimental Example 10.

25 Tulokset ovat kuviossa 23, jossa abskissa on päiviä ja oordinaatta kasvaimen keskim. koko (cm ) ί S.E. ja jossa merkinnät tarkoittavat seuraavaa: •-·: Ryhmä, johon ei lisätty vaikuttajasoluja.25 The results are shown in Figure 23, where the abscissa shows the days and the coordinate of the tumor mean. size (cm) ί S.E. and wherein the entries mean the following: • - ·: A group to which no influencer cells were added.

o-o: Ryhmä, johon lisättiin käsittelemättömiä vaikuttaja- 30 soluja.o-o: Group to which untreated effector cells were added.

Δ-Δ: Ryhmä, johon lisättiin kanin komplementilla käsiteltyjä vaikuttajasoluja.Δ-Δ: Group to which rabbit complement-treated effector cells were added.

x-x: Ryhmä, johon lisättiin anti-Thy 1:11a (New Englandx-x: Group to which anti-Thy 1 was added (New England

Nuclear Co., USA) ja kanin komplementilla käsi-35 teltyjä vaikuttajasoluja.Nuclear Co., USA) and rabbit complement-treated effector cells.

O-O: Ryhmä, johon lisättiin anti-Lyt 1:11a (New EnglandO-O: Group to which anti-Lyt 1 was added (New England

Nuclear Co., USA) ja kanin komplementilla käsiteltyjä vaikuttajasoluja.Nuclear Co., USA) and rabbit complement-treated effector cells.

36 7 7 1 57 -: Ryhmä, johon lisättiin anti-Lyt 2:11a (New England36 7 7 1 57 -: Group to which anti-Lyt 2 was added (New England

Nuclear Co., USA) ja kanin komplementilla käsiteltyjä vaikuttajasoluja.Nuclear Co., USA) and rabbit complement-treated effector cells.

Kuvion 23 esittämistä tuloksista ilmenee, että Lyt-1-5 tyypin T-solut ovat tärkeässä asemassa in vivo vaikuttaja- solujen toimintamekanismissa kasvainten suhteen immunisoitaessa.The results shown in Figure 23 show that Lyt-1-5 type T cells play an important role in the mechanism of action of influencer cells in vivo upon tumor immunization.

Lisäksi on tunnettua, että DTH-vaste välittyy Lyt-1-solujen kautta /J.Exp. Med. 143 (1976) 1534-39/.In addition, it is known that the DTH response is mediated through Lyt-1 cells by /J.Exp. Med. 143 (1976) 1534-39 /.

Claims (7)

1. Förfarande för framställning av glykobunden antigen, somhar avskiljs ur en human- eller djurkancer- 5 cellmembrankomponent och som förenar sig med lektin, som binds vid terminal galaktos eller terminal N-acetylgalak-tosamin, kännetecknat därav, att human- eller djurkancercellernas cellmembrankomponenter erhälls genom att homogenisera eller upplösa, cellmembrankomponenterna 10 behandlas med lektin, som binds specifikt vid terminal galaktos eller terminal N-acetylgalaktosamin under bildan-de av ett lektin-cellmembrankomponentkomplex och den vid lektinbundna glykobundna antigenen avskiljs och därav den glukobundna antigenen. : 15A process for producing glycobonded antigen which is separated from a human or animal cancer cell membrane component and which associates with lectin which binds to terminal galactose or terminal N-acetyl galactosamine, characterized in that the cell membrane components of human or animal cancer cells are obtained. by homogenizing or dissolving, the cell membrane components are treated with lectin which binds specifically to terminal galactose or terminal N-acetylgalactosamine to form a lectin cell membrane component complex and the lectin-bound glycobonded antigen is separated and hence the glucobond. : 15 2. Förfarande enligt patentkravet 1, känne tecknat därav, att kancercellmembrankomponenten är en human kancercellmembrankomponent.2. A method according to claim 1, characterized in that the cancer cell membrane component is a human cancer cell membrane component. 3. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att lektinet är jordnötslektin. 20Method according to Claim 1, characterized in that the lectin is the peanut lectin. 20 4. Förfarande enligt patentkravet 1, känne tecknat därav, att lektinet är Dolichos-bönaggluti-nin.4. A process according to claim 1, characterized in that the lectin is Dolichos bean glutin. 5. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att den glykobundna antigenen av- 25 skiljs ur en human kancercellmembrankomponent först med ett första lektin, vilket specifikt binds vid en terminal galaktos och sedan med ett andra lektin, vilket specifikt binds vid en terminal N-acetylgalaktosamin.5. A method according to claim 1, characterized in that the glycobonded antigen is separated from a human cancer cell membrane component first with a first lectin, which specifically binds to a terminal galactose and then to a second lectin, which specifically binds to a terminal N. acetylgalactosamine. 6. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e - 30 tecknat därav, att det första lektinet är jordnötslektin och det andra lektinet är Dolichosbönagglutinin.6. A process according to claim 5, characterized in that the first lectin is peanut lectin and the second lectin is Dolichos bean agglutinin. 7. Förfarande för framställning av för kancerceller toxiska lymfocyter, som är specifikä mot en glykobunden antigen, som har avskilts ur en human- eller djurkancer- 35 cellmembrankomponent och som förenar sig med lektin, somA process for the preparation of lymphocyte-toxic lymphocytes specific to a glycobonded antigen which has been secreted from a human or animal cancer cell membrane component and associates with lectin, which
FI822325A 1981-10-01 1982-06-29 FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV GLYKOBUNDEN ANTIGEN OCH FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV FOER KANCERCELLER TOXISKA LYMFOCYTER, SOM AER SPECIFIKA MOT DENNA Antigen. FI77157C (en)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15641381 1981-10-01
JP15641481 1981-10-01
JP15641481A JPS5857321A (en) 1981-10-01 1981-10-01 Anticancer agent
JP56156413A JPS5857318A (en) 1981-10-01 1981-10-01 Production of lymphocytes inhibiting cancer cells
JP15847381 1981-10-05
JP15847281 1981-10-05
JP56158472A JPS5859922A (en) 1981-10-05 1981-10-05 Cancer cell-disturbing lymphocyte
JP56158473A JPS5859923A (en) 1981-10-05 1981-10-05 Carcinostatic agent
JP11116882 1982-06-28
JP57111168A JPS591420A (en) 1982-06-28 1982-06-28 Sugar chain-relating antigen and its preparation

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI822325A0 FI822325A0 (en) 1982-06-29
FI822325L FI822325L (en) 1983-04-02
FI77157B FI77157B (en) 1988-10-31
FI77157C true FI77157C (en) 1989-02-10

Family

ID=27526479

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI822325A FI77157C (en) 1981-10-01 1982-06-29 FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV GLYKOBUNDEN ANTIGEN OCH FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV FOER KANCERCELLER TOXISKA LYMFOCYTER, SOM AER SPECIFIKA MOT DENNA Antigen.

Country Status (19)

Country Link
AR (1) AR230731A1 (en)
AT (2) AT382080B (en)
AU (1) AU554858B2 (en)
BE (1) BE893704A (en)
CA (1) CA1195269A (en)
CH (2) CH655660B (en)
DD (2) DD209577A5 (en)
DE (2) DE3249568A1 (en)
DK (1) DK292182A (en)
FI (1) FI77157C (en)
FR (1) FR2513882B1 (en)
IL (1) IL66270A (en)
IT (1) IT1189305B (en)
MX (1) MX7437E (en)
NL (1) NL8202638A (en)
NO (1) NO161601C (en)
NZ (1) NZ201112A (en)
PT (1) PT75148B (en)
SE (1) SE8204058L (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60214737A (en) * 1984-04-06 1985-10-28 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk Preparation of saccharide chain-related antigen (tca)
EP0334300A1 (en) * 1988-03-21 1989-09-27 Neorx Corporation The use of monoclonal antibodies and conjugates thereof as signals to direct sensitized effector cells to tumor sites

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1193378A (en) * 1967-04-11 1970-05-28 Rand Dev Corp Cancer Antigen Complexes
DE1943699A1 (en) * 1969-08-28 1971-03-04 Stiftung Onophrio Medicinal product with an anti-proliferation effect and process for the manufacture of this medicinal product
YU34005B (en) * 1970-02-24 1978-10-31 Podvinec Srecko Process for obtaining bovine lymphatic gland extract
US4371515A (en) * 1978-12-26 1983-02-01 E-Y Laboratories, Inc. Method for forming an isolated lectin-immunological conjugate

Also Published As

Publication number Publication date
IT8248724A0 (en) 1982-06-30
AR230731A1 (en) 1984-06-29
FR2513882A1 (en) 1983-04-08
NO161601C (en) 1989-09-06
NO161601B (en) 1989-05-29
FI77157B (en) 1988-10-31
MX7437E (en) 1988-11-14
IL66270A (en) 1986-03-31
ATA363782A (en) 1986-06-15
NL8202638A (en) 1983-05-02
CH655660B (en) 1986-05-15
CA1195269A (en) 1985-10-15
NZ201112A (en) 1986-10-08
AU554858B2 (en) 1986-09-04
NO822215L (en) 1983-04-05
CH655661B (en) 1986-05-15
DE3249568C2 (en) 1987-10-01
AT382080B (en) 1987-01-12
DE3249568A1 (en) 1985-02-07
DD221917A5 (en) 1985-05-08
IT1189305B (en) 1988-02-04
FR2513882B1 (en) 1986-04-04
DE3236298A1 (en) 1984-03-15
SE8204058L (en) 1983-04-02
DK292182A (en) 1983-04-02
AU8545882A (en) 1983-04-14
BE893704A (en) 1982-10-18
IL66270A0 (en) 1982-11-30
SE8204058D0 (en) 1982-06-30
PT75148B (en) 1986-08-14
PT75148A (en) 1982-07-01
FI822325L (en) 1983-04-02
FI822325A0 (en) 1982-06-29
DE3236298C2 (en) 1987-09-24
AT390002B (en) 1990-03-12
ATA354585A (en) 1989-08-15
DD209577A5 (en) 1984-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2806634B2 (en) Pharmaceutical formulations for controlling tumors associated with prostate, gastric and breast cancer
FR2522267A1 (en) GLYCOPROTEINS WITH ANTITUMOR ACTIVITY, PROCESS FOR PREPARING THEM AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATION
GB2106935A (en) Cancer cell-combatting lymphocytes process, for the production thereof, and anticancer agents containing said lymphocytes
GB2086392A (en) Preparation controlling t-system of immunity and method for producing same
KR950008767B1 (en) Novel pharmacentical use of ebselen
KR920002935B1 (en) Angiogenesis inhibitor
FI77157C (en) FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV GLYKOBUNDEN ANTIGEN OCH FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV FOER KANCERCELLER TOXISKA LYMFOCYTER, SOM AER SPECIFIKA MOT DENNA Antigen.
EP0129173A2 (en) Malaria associated antigen and preparing process thereof
AU758856C (en) Compositions containing muscle-derived active agents
FI80711B (en) FREQUENCY REQUIREMENTS FOR THE ENTRY OF THERAPEUTIC THERAPEUTIC CONTAINERS, WHICH ARE A GLYCOSID BINDING ANTIGEN ANTIGEN (GRA), SOM HAERROER SIG FRAON CANCERCELLER.
RU2205010C2 (en) Natural antitumor or antiviral substances and their application
Fisher et al. Further observations concerning effects of antilymphocyte serum on tumor growth: with special reference to allogeneic inhibition
CN103992394B (en) The cationic peptide of a kind of Prof. Du Yucang and the purposes in preparing antineoplastic thereof
CA1201988A (en) Cancer cell-combatting lymphocytes, process for the production thereof and anticancer agents containing said lymphocytes
KR100673565B1 (en) - - Medicament improving the anti-tumour action of interferon-gamma and anti-cancer composition comprising interferon-gamma and the medicament
Garcia-Giralt et al. Extraction From Bovine Spleen of Immunosuppressant With No Activity on Hematopoietic Spleen Colony Formation ¹
JPH0325408B2 (en)
SU1412596A3 (en) Method of producing lymphocytes cyto-toxic to cancer cells, and method of producing glyco-bound substance
JPS63164895A (en) Lectin-like protein originated from cultured cell, its production and antitumor agent composed mainly of said substance
NZ214000A (en) Method of sensitising lymphocytes to cancer associated antigens
Kedar et al. Suppression by tumor growth of T cell growth factor production in mouse lymphoid cell cultures
EP0134247A1 (en) Protein with oncostatic effect, process for its preparation, and oncostatic drug containing it
KR900002671B1 (en) Protein-polysaccharides having immunopotentiating activitiies against tumor gells
NO850152L (en) PROCEDURE FOR MANUFACTURING HUMAN, EVEN CANCER REGULATORY FACTOR.
Tibell et al. Cyclosporine A in fat emulsion carrier: immunosuppressive effect in vitro

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: OTSUKA PHARMACEUTICAL CO,_. LTD.