NL8202638A - Cancer cell-fighting lymphocytes, process for their production and anti-cancer agents, containing these lymphocytes. - Google Patents
Cancer cell-fighting lymphocytes, process for their production and anti-cancer agents, containing these lymphocytes. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8202638A NL8202638A NL8202638A NL8202638A NL8202638A NL 8202638 A NL8202638 A NL 8202638A NL 8202638 A NL8202638 A NL 8202638A NL 8202638 A NL8202638 A NL 8202638A NL 8202638 A NL8202638 A NL 8202638A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- lectin
- antigen
- cancer
- gra
- combines
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 119
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 105
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 179
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 69
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 69
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 69
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 43
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 claims description 24
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical group CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 20
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 20
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 claims description 5
- 244000112675 Lablab purpureus Species 0.000 claims description 5
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000220487 Bauhinia Species 0.000 claims description 2
- 108010058611 Helix lectin Proteins 0.000 claims description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000018907 Tylosema fassoglense Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims 5
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 claims 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 claims 1
- 108010084962 lima bean lectin Proteins 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 49
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 40
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 17
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 17
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 17
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 14
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 14
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 108010046016 Peanut Agglutinin Proteins 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 11
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 11
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 108010039433 dolichos biflorus agglutinin Proteins 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 7
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 6
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 5
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010046569 Galectins Proteins 0.000 description 4
- 102000007563 Galectins Human genes 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- -1 bromoacetyl Chemical group 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100282787 Caenorhabditis elegans gba-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101000934342 Mus musculus T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 108010065337 fluorescein isothiocyanate-peanut agglutinin Proteins 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 2
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150117081 51 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 240000003521 Bauhinia purpurea Species 0.000 description 1
- 235000011462 Bauhinia purpurea Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101800004637 Communis Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- VLHUSFYMPUDOEL-WZTVWXICSA-N Iothalamate meglumine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CNC(=O)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I VLHUSFYMPUDOEL-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 241001507252 Japanese monkeys Species 0.000 description 1
- 241000219822 Macrotyloma axillare Species 0.000 description 1
- 235000001504 Macrotyloma uniflorum var. uniflorum Nutrition 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 235000005770 birds nest Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000853 cresyl group Chemical group C1(=CC=C(C=C1)C)* 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- HFZNPKDYLSOGBE-SCEMAYBHSA-N nrc-12 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(C)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 HFZNPKDYLSOGBE-SCEMAYBHSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010086652 phytohemagglutinin-P Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000005765 wild carrot Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
ν' 4 '5 4 -ν '4' 5 4 -
Kankercellenbestrijdende lymfocyten, werk-wijze voor de produktie daarvan en antikankermiddelen, die deze lymfocyten bevatten.Cancer cell-fighting lymphocytes, method of production thereof and anti-cancer agents containing these lymphocytes.
De uitvinding heeft betrekking op kankercellenbestrijdende lymfocyten (hiema aangeduid als "dodende cellen") en een werkwijze voor de produktie daarvan. Zij heeft in het bijzonder betrekking op dodende cellen, die spe-5 cifiek inwerken op kankercellen met een glycoverwant antigeen, dat van de kankercellen afkomstig is (dit antigeen wordt hiema aangeduid als "GRA") en de kankercellen vernietigen en op een werkwijze voor de produktie van deze dodende cellen.The invention relates to cancer cell-fighting lymphocytes (hereinafter referred to as "killing cells") and a method of production thereof. In particular, it relates to killing cells which specifically act on cancer cells with a glycopants antigen derived from the cancer cells (this antigen is hereinafter referred to as "GRA") and destroys the cancer cells and production of these killing cells.
Bovendien heeft de uitvinding betrekking op een nieuw anti-10 kankermiddel, dat met name de dodende cellen of GRA als aktief bestanddeel bevat.In addition, the invention relates to a new anti-cancer agent, particularly containing the killing cells or GRA as an active ingredient.
Immuunresponseffektorcellen, in het bijzonder T-lymfoeyten, die een voomame rol bij immuunrespons en cel-medium spelen, veroorzaken afstoting van enten, die aan vreem-15 de celantigenen zijn toe te schrijven, maar vertonen geen waameembare of zeer beperkte inhibitie tegen kankercellen.Immune response effect cells, especially T lymphocytes, which play a major role in immune response and cell medium, cause rejection of grafts attributable to foreign cell antigens, but show no perceptible or very limited inhibition against cancer cells.
Aldus worden de kankercellen niet vemietigd en vermenigvul-digen zich in vivo, hetgeen tenslotte leidt tot de dood van de aan kanker lijdende gastheer.Thus, the cancer cells are not destroyed and multiply in vivo, finally leading to the death of the cancerous host.
20 Het mechanisme, dat verantwoordelijk is voor de herkenning van eigen of niet eigen is echter niet geheel duidelijk en men heeft verschillende onderzoekingen gedaan voor het krijgen van inzicht in de aard van de bij een der-gelijk systeem betrokken materiele basis, bijvoorbeeld cel-25 oppervlakmerken aan muisleukemiecellen of embryonaal casi- noomcellen onder gebruikmaking van lectinen, zoals Dolichos biflorus agglutinine (DBA) en peanut pinda agglutinine (PNA) als beschreven in Biochem. Biophys. Res. Comm. 8£ (2) 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 30 473-481 (1981) en Cell 18 183-191 September 1979.However, the mechanism responsible for recognizing one's own or not one's own is not entirely clear and various studies have been conducted to gain insight into the nature of the material basis involved in such a system, for example cell-25. surface marks on mouse leukemia cells or embryonic casinoma cells using lectins, such as Dolichos biflorus agglutinin (DBA) and peanut peanut agglutinin (PNA) as described in Biochem. Biophys. Res. Comm. 8 (2) 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 30 473-481 (1981) and Cell 18 183-191 September 1979.
82026388202638
Ifc * * - 2 -Ifc * * - 2 -
Er zijn echter geen pogingen van betekenis gedaan tot het verschaffen van nieuwe lymfocyten, die kanker-cellen specifiek kunnen bestrijden en ook antikankermiddelen geven onder gebruikmaking van immuunrespons van lymfocyten.However, no significant attempts have been made to provide new lymphocytes, which can specifically fight cancer cells and also give anti-cancer agents using lymphocyte immune response.
5 Als resultaat van uitgebreide onderzoekingen aan de immuunrespons van de gastheer op kankercellen en zijn toepassing op de behandeling van kanker, werd gevonden, dat er in een kankercel specifiek antigeen, GRA, is, dat niet in gedifferentieerde normale cellen wordt aangetroffen, dat 10 als een immunogeen voor de gastheer werkt en een zeer hoge immunogeniciteit heeft, die een voor de kankercellen speci-fieke immuunrespons veroorzaakt. Bovendien werd gevoiiden, dat wanneer GRA voor het sensitiseren van lymfocyten wordt gebruikt, er dodende cellen kunnen worden verkregen, die 15 specifiek inwerken op kankercellen, die GRA bevatten en wan neer de dodende cellen aan de gastheer worden toegediend, herkennen zij GRA en werken vemietigend op de GRA bevattende kankercellen in en dus, dat zij een uitstekend effekt verto-nen bij de behandeling en voorkoming van kanker.As a result of extensive studies of the host's immune response to cancer cells and its application to cancer treatment, it has been found that in a cancer cell there is specific antigen, GRA, that is not found in differentiated normal cells, which an immunogen acts for the host and has a very high immunogenicity causing an immune response specific for the cancer cells. In addition, it has been argued that when GRA is used to sensitize lymphocytes, killing cells can be obtained, which act specifically on cancer cells containing GRA and when the killing cells are administered to the host, they recognize GRA and are destructive on the GRA-containing cancer cells and, therefore, that they show an excellent effect in the treatment and prevention of cancer.
20 Een uitvoeringsvorm van de uitvinding behelst dan ook dodende cellen.Therefore, an embodiment of the invention involves killing cells.
Een andere uitvoeringsvorm behelst een werk-wijze voor de produktie van dodende cellen.Another embodiment involves a method for the production of killing cells.
Nog een andere uitvoeringsvorm van de onder-25 havige uitvinding behelst een antikankermiddel, dat dodende cellen of GRA als aktief bestanddeel bevat.Yet another embodiment of the present invention involves an anti-cancer agent containing killer cells or GRA as an active ingredient.
Van bijgaande figuren is figuur 1 een mikrofoto van Daudi kankercellen, figuur 2 een mikrofoto, die de vorming laat 30 zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van fi guur 1, figuur 3 een mikrofoto van Kato-III kankercellen, figuur 4 een mikrofoto, die de vorming laat 35 zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van fi- 8202638 * 4 - 3 - guur 3, figuur 5 een mikrofoto van BT-I kankercellen, figuur 6 een mikrofot, die de vorming laat zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van f i-5 guur 5, figuur 7 een mikrofoto van MKN-45 kankercellen, figuur 8 een mikrofoto, die de vorming laat zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van fi-10 guur 7, figuur 9 een mikrofoto van MOLT kankercellen, figuur 10 een mikrofoto, die de vorming laat zien van plaatjes door GBA-1-K-T van de kankercellen van figuur 9, 15 figuur 11 een mikrofoto van BT-1, behandeld met een mengsel van ongesensitiseerde menselijke perifere bloedlymfocyten, figuren 12 en 13 telkens een mikrofoto van het kankercelweefsel van een aan kanker lijdende muis, waar-20 aan GBA-M-1-K-T is toegediend, figuur 14 een mikrofoto, die de toestand toont van kanker in een aan kanker lijdende groep muizen, waaraan GRA-M-1 is toegediend, figuur 15 een mikrofoto, die de kankertoe-25 stand toont in een aan kanker lijdende groep muizen, waaraan geen GRA-M-1 is toegediend, figuur 16 een mikrofoto, die het kankercelweefsel toont van een aan kanker lijdende groep muizen, waaraan geen GRA-M-1 is toegediend, 30 figuur 17 een mikrofoto van het kankercel weefsel van de groep, waaraan GRA-M-1 is toegediend, figuur 18 een SDS gel elektroforesediagram van GRA onder gebruikmaking van proteinevlekken volgens C.B.B. methode, 35 figuren 19 tot en met 21 telkens een SDS gel 8202638 -4- * * $ elektroforesediagram van GRA onder gebruikmaking van suiker-kleuring volgens de PAS methode, figuur 22 een schematische voorstelling van de resultaten van een SDS gel elektroforesediagram van GRA 5 onder gebruikmaking van proteinevlekken volgens de C.B.B.From the accompanying figures, Figure 1 is a micrograph of Daudi cancer cells, Figure 2 is a micrograph showing the formation of GRA-1-KT images of the cancer cells of Figure 1, Figure 3, a micrograph of Kato-III cancer cells, Figure 4 a micrograph showing the formation of platelets by GRA-1-KT of the cancer cells of FIG. 8202638 * 4 - 3 - figure 3, FIG. 5 a micrograph of BT-I cancer cells, FIG. 6 a micrograph showing the shows platelet formation by GRA-1-KT of the cancer cells of Figure 5, Figure 7 shows a micrograph of MKN-45 cancer cells, Figure 8 shows a micrograph showing platelet formation by GRA-1-KT of the cancer cells of Figure 7, Figure 9, a micrograph of MOLT cancer cells, Figure 10, a micrograph showing platelet formation by GBA-1-KT of the cancer cells of Figure 9, Figure 11, a micrograph of BT -1, treated with a mixture of unsensitized human peripheral blood lymphocytes, Figures 12 and 13 each e and a micrograph of the cancer cell tissue of a cancerous mouse administered GBA-M-1-KT, Figure 14 a micrograph showing the state of cancer in a group of cancerous mice to which GRA-M- has been administered. 1, Figure 15 is a micrograph showing the cancer state in a cancer group of mice not administered GRA-M-1, Figure 16 is a micrograph showing the cancer cell tissue of a group of cancer mice to which GRA-M-1 has not been administered, Figure 17, a micrograph of the cancer cell tissue of the group to which GRA-M-1 has been administered, Figure 18 an SDS gel electrophoresis diagram of GRA using protein stains according to CBB method, Figures 19 to 21 each show an SDS gel 8202638 -4- * * $ electrophoresis diagram of GRA using sugar staining according to the PAS method, figure 22 a schematic of the results of an SDS gel electrophoresis diagram of GRA 5 using protein stains according to the CBB
methode en figuur 23 een grafiek, die tumorgroei toont in C3H/HE muizen, getransplanteerd met X5563 immune muize-miltcellen en X5563 cellen.method and Figure 23 is a graph showing tumor growth in C3H / HE mice transplanted with X5563 immune mouse spleen cells and X5563 cells.
10 De doden§e/van de uitvinding kunnen bijvoor- beeld worden bereid volgens een methode, waarbij GRA voor het sensitiseren van lymfocyten wordt gebruikt.The kills / of the invention can be prepared, for example, according to a method using GRA to sensitize lymphocytes.
GRA als gebruikt bij bovenstaande methode kan uit GRA bevattende kankercellen van mensen of dieren, 15 bijvoorbeeld gekweekte kankercellen, getransplanteerde kanker cellen, spontaan optredende kankercellen, met chemische stof of virus opgewekte kankercellen en kankercellen, afkomstig uit geopereerde weefsels, op de volgende wijze worden verkre-gen.GRA as used in the above method can be obtained from human or animal cancer cells, for example cultured cancer cells, transplanted cancer cells, spontaneously occurring cancer cells, chemically or virus-generated cancer cells and cancer cells derived from operated tissues, from GRA containing cancer cells. -gene.
20 Celmembraankomponenten worden als boven beschreven van kankercellen afgescheiden en behandeld met een lectine, dat specifiek kombineerd met een eindstandige galactose of een eindstandig N-acetylgalactosamine, waardoor waardoor GRA met de lectine wordt gekombineerd en gemakkelijk 25 kan worden afgescheiden.Cell membrane components are separated from cancer cells as described above and treated with a lectin, which specifically combines with a terminal galactose or a terminal N-acetylgalactosamine, whereby GRA is combined with the lectin and can be easily separated.
Geschikte voorbeelden van galactosebindend lectine zijn pindalectine en ricinus communis lectine (zie J.B.C., 250, 8518-8523 (1975), Biochem, Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975), Z. Immunitaetsforch, 138, 423-433 (1969), 30 Br. J. Exp. Pathol, 27, 228-236 (1946), Proc. Nath. Acad.Suitable examples of galactose-binding lectin are pindalectin and castorin communis lectin (see JBC, 250, 8518-8523 (1975), Biochem, Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975), Z. Immunitaetsforch, 138, 423-433 ( 1969), 30 Bro J Exp Pathol, 27, 228-236 (1946), Proc Nath Acad.
Sci. USA, 75, No. 5, 2215-2219 (1978), Biochemistry, 13, 196-204 (1974) en Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976). Geschikte voorbeelden van N-acetylgalactosebindend lectine zijn Dolichos boon (Dolichos biflorus) agglutinine, vlecht-35 sinaasappel lectine,Helix pomatia lectine, lima-boon (Phaseolus 8202538Sci. USA, 75, no. 5, 2215-2219 (1978), Biochemistry, 13, 196-204 (1974) and Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976). Suitable examples of N-acetylgalactose binding lectin are Dolichos bean (Dolichos biflorus) agglutinin, braid orange lectin, Helix pomatia lectin, lima bean (Phaseolus 8202538
A KA K
* ' 4 - 5 - limensis) lectine, soja (Glycine max) lectine en Bauhinia boon (Bauhinia purpurea) lectine.* 4 - 5 - limensis) lectin, soy (Glycine max) lectin and Bauhinia bean (Bauhinia purpurea) lectin.
De afscheiding van kankercelmembraankompo-nenten kan op bekende wijzen geschieden, zoals door homoge-5 nisering en solubilisering onder gebruikmaking van een op- lossend middel. Het is voordeliger een methode te gebruiken, waarbij kankercellen in fysiologische zoutoplossing of in een geschikte buffer worden gehomogeniseerd, een geprecipi-teerd gedeelte bijvoorbeeld door centrifugering wordt ver-10 wijderd en opgelost in fysiologische zoutoplossing of een buffer met behulp van een oplossend middel en de bovenstaande vloeistof overbiijft. Te gebruiken oplossende middelen zijn bijvoorbeeld oppervlakteaktieve stoffen, waarvan algemeen bekend is, dat zij celmembraan oplossen, zoals nietionogene 15 oppervlakteaktieve stoffen, bijvoorbeeld Triton X-100 (gepro-duceerd door Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (geproduceerd door Shell Co, Ltd.), digitonine en ureum en anionogene oppervlakteaktieve stoffen, bijvoorbeeld natrium-dodecylsulfonaat (SDS).The secretion of cancer cell membrane components can be accomplished in known ways, such as by homogenization and solubilization using a solvent. It is more advantageous to use a method in which cancer cells are homogenized in physiological saline or in a suitable buffer, a precipitated portion is removed, for example, by centrifugation and dissolved in physiological saline or a buffer using a solvent and the supernatant liquid. Solvents to be used are, for example, surfactants, which are well known to dissolve cell membrane, such as nonionic surfactants, eg Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (produced by Shell Co., Ltd.), digitonin and urea and anionic surfactants, e.g. sodium dodecyl sulfonate (SDS).
20 Uit de aldus verkregen celmembraankomponen- ten kan GBA, dat met lectine kan kombineren, onder gebruikmaking van de eigenschappen van lectine op de gebruikelijke fysisch chemische en biochemische wijzen worden gewonnen.From the cell membrane components thus obtained, GBA, which can combine with lectin, can be recovered using the properties of lectin in the usual physicochemical and biochemical ways.
Voorbeelden van dergelijke werkwijzen zijn affniniteitschro-25 matografie onder gebruikmaking van een lectinebevattende dragerkolom, immuunprecipitatie onder gebruikmaking van GBA antilichaam of iets dergelijks, dialyse, gelfiltratie, elek-troforese, fysische precipitatie onder gebruikmaking van een suiker proteine-precipiteermiddel, bijvoorbeeld poly-30 ethyleenglycol en aceton en een kombinatie daarvan. De voor- keur verdient affiniteitschromatografie onder gebruikmaking van een lectinebevattende dragerkolom, waarbij de dragerkolom gemakkelijk kan worden vervaardigd door immobilisatie van lectine aan een onoplosbare drager. Een dergelijke immo-35 bilisatie van lectine aan een onoplosbare drager kan op be- 8202638 'i - 6 - kende wijzen voor de immobilisatie van biostoffen worden uit-gevoerd. Van deze methoden verdienen een aktivering van polysaccharide met cyaanbromide en een immobilisering van de gebruikmaking van N-hydroxysuccimideesters de voorkeur. De 5 aktivering van polysaccharide met cyaanbromide is een methode, waarbij een onoplosbare drager met cyaanbromide wordt behan-deld en het aldus verkregen geaktiveerde produkt ter immobilisering van lectine onder zachte omstandigheden wordt on-derworpen aan een koppelingsreaktie met lectine. Bij de 10 behandeling van de onoplosbare drager met eyaambromide ge-bruikt men bijvoorbeeld basische verbindingen als natrium-hydroxyde en natriurawaterstofcarbonaat voor het instellen van de pH op 7,5 tot 12 en behandelt de drager 1 tot 12 minu-ten bij kamertemperatuur in een oplosmiddel als water, azijn-15 zuumitril of een op pH 7,5 tot 12 gehouden buffer, bijvoorbeeld 0,1 M natriumwaterstofcarbonaatbuffer (pH ongeveer 8,7) en 0,01 M fosfaatbuffer (pH ongeveer 7,7). Gewoonlijk is de gebruikte hoeveelheid cyaanbromide bij voorkeur gelijk aan die van de onoplosbare drager, 20 Elke bekende onoplosbare drager met lage niet specifieke adsorptie voor alle biostoffen, grote poreus-heid, met een funktionele groep, die biostoffen onder zachte omstandigheden kan immobiliseren en chemisch en fysisch vol-doende stabiel is, kan bij de uitvinding worden gebruikt.Examples of such methods are affinity chromatography using a lectin-containing carrier column, immunoprecipitation using GBA antibody or the like, dialysis, gel filtration, electrophoresis, physical precipitation using a sugar protein precipitant, eg, polyethylene glycol and acetone and a combination thereof. Preferred is affinity chromatography using a lectin-containing support column, wherein the support column can be easily manufactured by immobilizing lectin on an insoluble support. Such immobilization of lectin to an insoluble carrier can be carried out in known ways for the immobilization of biofuels. Of these methods, activation of polysaccharide with cyanogen bromide and immobilization of the use of N-hydroxy succimide esters are preferred. The activation of polysaccharide with cyanogen bromide is a method in which an insoluble carrier is treated with cyanogen bromide and the thus obtained activated product for immobilizing lectin under soft conditions is subjected to a coupling reaction with lectin. In the treatment of the insoluble carrier with eyaam bromide, for example, basic compounds such as sodium hydroxide and sodium hydrogen carbonate are used to adjust the pH to 7.5 to 12 and the carrier is treated for 1 to 12 minutes at room temperature in a solvent as water, vinegar-15 vacuum nitrile or a buffer maintained at pH 7.5 to 12, for example, 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH about 8.7) and 0.01 M phosphate buffer (pH about 7.7). Usually, the amount of cyanogen bromide used is preferably equal to that of the insoluble carrier. Any known insoluble carrier with low nonspecific adsorption for all biosubstances, high porosity, with a functional group capable of immobilizing biosubstances under soft conditions and chemically and is physically sufficiently stable can be used in the invention.
25 Onoplosbare dragers, die men kan gebruiken, zijn bijvoorbeeld een drager, vervaardigd uit cellulose, bijvoorbeeld amino-ethylcellulose, carboxymethylcellulose, broomacetylcellulose en p-anilinocellulose, een drager van verknoopte dextran, bijvoorbeeld Sephadex en CM-Sephadex (vervaardigd door 30 Farmacia Corp.), en een drager van agarose, bijvoorbeeldInsoluble carriers which can be used are, for example, a carrier made of cellulose, for example aminoethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, bromoacetyl cellulose and p-anilino cellulose, a carrier of cross-linked dextran, for example Sephadex and CM-Sephadex (manufactured by Farmacia Corp. 25). ), and an agarose carrier, for example
Sepharose 2B, Sepharose 4B en Sepharose 6B (vervaardigd door Farmacia Corp.).Sepharose 2B, Sepharose 4B and Sepharose 6B (manufactured by Farmacia Corp.).
Bij de koppelingsreaktie van de met cyaanbromide geaktiveerde drager als boven beschreven met lectine, 35 gebruikt men de met cyaanbromide geaktiveerde drager in een 8202638In the coupling reaction of the cyanogen bromide-activated carrier described above with lectin, the cyanogen bromide-activated carrier is used in an 8202638
VV
i - 7 - hoeveelheid van 30 tot 80 maal de lectine en voert de reaktie 10 tot 20 uur bij een temperatuur van 0 tot 40°C, bij voor-keur van 2 tot 8°C uit in een geschikt oplosmiddel, zoals een 0,1 mol/1 natriumwaterstofcarbonaatoplossing in water 5 (die 0,5 mol/1 natriumchloride bevat, pH: 8,4). Op deze wijze kan een lectinebevattende drager voor affiniteitschromatogra-fie worden vervaardigd.i-7 - amount from 30 to 80 times the lectin and carry out the reaction for 10 to 20 hours at a temperature from 0 to 40 ° C, preferably from 2 to 8 ° C in a suitable solvent, such as a 0, 1 mol / l sodium hydrogen carbonate aqueous solution 5 (containing 0.5 mol / l sodium chloride, pH 8.4). In this way, a lectin-containing support for affinity chromatography can be prepared.
Door chromatografie onder gebruikmaking van de boven vervaardigde lectinebevattende drager, kombineert 10 het gewenste GRA met de in de drager aanwezige lectine en wordt in de kolom ingevangen. Vervolgens kan men stoffen, die met bijvoorbeeld lectine kunnen kombineren door de kolom leiden teneinde een uitwisselingsreaktie te bewerkstelligen, of eventueel kan men een adsorptiescheider (elueeroplossing), 15 bijvoorbeeld een hoog geconcentreerde zoutoplossing, een kaliumthiocyanaatoplossing in water of een hydraatbuffer, ter dissociatie door de kolom leiden en bet gewenste GBA ver-krijgen.By chromatography using the lectin-containing carrier prepared above, the desired GRA combines with the lectin contained in the carrier and is trapped in the column. Subsequently, substances which can combine with, for example, lectin, can be passed through the column in order to effect an exchange reaction, or, optionally, an adsorption separator (eluent solution), for instance a highly concentrated salt solution, a potassium thiocyanate solution in water or a hydrate buffer, can be dissociated by the column and obtain the desired GBA.
Voorbeelden van bij de uitwisseling te ge-20 bruiken stoffen, die met lectine kunnen kombineren, wanneer een galactosebindend lectinebevattende drager voor affiniteits-chromatografie is gebruikt, zijn diegene, die kunnen kombineren met een eindstandig galactosekombinerend lectine, bijvoorbeeld galactose, disacchariden met een eindstandige ga-25 lactose en oligosacchariden met een eindstandige galactose en voorbeelden van stoffen, die met lectine kunnen kombineren, wanneer een N-acetylgalactoseaminebindende lectine voor affi-niteitschromatografie is gebruikt, zijn die, die kunnen kombineren met een eindstandig N-acetylgalactosaminekombinerend 30 lectine, bijvoorbeeld N-acetylgalactosamine, disacchariden met een eindstandig N-acetylgalactosamine en oliesacchariden met een eindstandig N-acetylgalactosamine.Examples of substances to be used in the exchange which can combine with lectin when a galactose-binding lectin-containing carrier for affinity chromatography have been used are those which can combine with a terminal galactose-combining lectin, for example galactose, disaccharides with terminal ga -25 lactose and oligosaccharides with a terminal galactose and examples of substances which can combine with lectin, when an N-acetylgalactoseamine binding lectin has been used for affinity chromatography, are those which can combine with a terminal N-acetylgalactosamine combining lectin, for example N -acetylgalactosamine, disaccharides with an N-acetylgalactosamine terminal and oil saccharides with an N-acetylgalactosamine terminal.
Het aldus verkregen GRA bevat glycoproteine met een galactose en/of N-acetylgalactosamine in eindstand, 35 glycolipide en/of saccharide, 8202638 - 8 -The GRA thus obtained contains glycoprotein with a galactose and / or N-acetylgalactosamine in the final position, glycolipid and / or saccharide, 8202638 - 8 -
Het aldus bereide GRA kan desgewenst worden gevriesdroogd en verder worden gezuiverd onder gebruikmaking van de gewone scheidingsmethode. Zo kunnen bijvoorbeeld de GRA preparaten, die met een galactosebindend lectine zijn 5 gebonden worden onderworpen aan een scheidingsmethode onder gebruikmaking van een N-acetylgalactosaminekombinerend lectine en diegene, die met een N-acetylgalactosaminekombinerend lectine zijn gewonnen, kunnen worden onderworpen aan een scheidingsmethode onder gebruikmaking van een galactosebindend 10 lectine.The GRA thus prepared can, if desired, be lyophilized and further purified using the conventional separation method. For example, the GRA preparations bound with a galactose-binding lectin can be subjected to a separation method using an N-acetylgalactosamine-combining lectin and those recovered with an N-acetylgalactosamine-combining lectin can be subjected to a separation method using a galactose binding lectin.
De hier gebruikte lymfocyten zijn niet kritisch en men kan allerlei lymfocyten van normale of aan kanker lijdende mensen of dieren gebruiken. Voorbeelden zijn lymfocyten, afkomstig uit periferaal bloed, beendermerg, lym-15 feklieren, milt, tonsillen en thymus. Deze lymfocyten worden op fysische of chemische wijze of volgens een oppervlakte-membraanmethode, of lets dergelijks gewonnen.The lymphocytes used here are not critical and a variety of lymphocytes from normal or cancerous people or animals can be used. Examples are lymphocytes from peripheral blood, bone marrow, lymph nodes, spleen, tonsils and thymus. These lymphocytes are obtained physically or chemically or by a surface membrane method or the like.
De sensitisering van lymfocyten met GRA wordt uitgevoerd door de lymfocyten 1 tot 10 dagen, bij voorkeur 20 2 tot 7 dagen te kweken op een GRA bevattend kultuurmedium.Lymphocyte sensitization with GRA is performed by culturing the lymphocytes for 1 to 10 days, preferably 2 to 7 days, on a GRA-containing culture medium.
Als kultuurmedium voor de sensitisering van lymfocyten kan men verschillende gebruikelijke voedingsmedia voor een dergelijke celkweek gebruiken. Voorkeursvoorbeelden zijn een RPMI 1640 medium, een Eagle MEM kultuur, enzovoort, 25 waaraan menselijk serum, kalffoetusserum (KFS), kalfserum, paardeserum of iets dergelijks is toegevoegd. De aan de kultuur toe te voegen hoeveelheid GRA bedraagt gewoonlijk 1 tot 1000 ng/ml en bij voorkeur 1 tot 500 ng/ml, als berekend als g een hoeveelheid suiker per 1 x 10 /ml lymfocyt.As a culture medium for the sensitization of lymphocytes, one can use various conventional nutrient media for such a cell culture. Preferred examples are an RPMI 1640 medium, an Eagle MEM culture, etc., to which human serum, calf fetal serum (KFS), calf serum, horse serum or the like has been added. The amount of GRA to be added to the culture is usually 1 to 1000 ng / ml, and preferably 1 to 500 ng / ml, as calculated as g an amount of sugar per 1 x 10 / ml lymphocyte.
30 De kweek geschiedt op de gebruikelijke wijze, bijvoorbeeld bij een pH van ongeveer 7,2 en een temperatuur van ongeveer 37°C.The cultivation is carried out in the usual manner, for example at a pH of about 7.2 and a temperature of about 37 ° C.
De als boven bereide dodende cellen van de uitvinding zijn nagenoeg normale lymfocyten en hebben een 35 GRA-specifieke celbestrijdende werking. Zo heeft bijvoorbeeld 8202638 * V 4 - 9 - GRA-1-KT, dat een van de dodende cellen van de uitvinding is, eigenschappen, die voor menselijke periferaal bloed T-cellen gewoon zijn en vertonen een celbestrijdende werking, die specifiek is voor GRA bevattende kankercellen, hetgeen in 5 onderbeschreven voorbeeld wordt aangetoond.The killing cells of the invention prepared as above are substantially normal lymphocytes and have GRA-specific cell-fighting activity. For example, 8202638 * V 4 - 9 - GRA-1-KT, which is one of the killing cells of the invention, has properties common to human peripheral blood T cells and exhibits cell-fighting activity specific for GRA containing cancer cells, as shown in the example described below.
Goede voorbeelden van de nieuwe dodende cellen van de uitvinding zijn GRA-1-KT en GRA-M-1, die in onderstaande voorbeelden worden bereid. Alle dodende cellen van de uitvinding zijn bij aanvrager verkrijgbaar.Good examples of the novel killing cells of the invention are GRA-1-KT and GRA-M-1, which are prepared in the examples below. All killing cells of the invention are available from applicant.
10 De dodende cellen van de uitvinding kunnen onbeperkt worden vermenigvuldig op bovenbeschreven kultuur-medium, dat een T-celgroeifaktor (TCGF, IL-2) bevat. In dit geval kan selektieve kultuur van kloning van de dodende cellen volgens de gebruikelijke ultraverdunningsmethode worden 15 uitgevoerd. Deze dodende cellen kunnen lange tijd stabiel worden bewaard, bijvoorbeeld in vloeibare stikstof.The killing cells of the invention can be multiplied indefinitely on culture medium described above containing a T cell growth factor (TCGF, IL-2). In this case, selective culture of cloning of the killing cells can be performed according to the conventional ultra-dilution method. These killing cells can be stored stably for a long time, for example in liquid nitrogen.
Het GRA kan afzonderlijk als aktief bestand-deel worden gebruikt en kan bovendien in kombinatie met an-dere bakteriele en kankerinhibiterende middelen worden ge-20 bruikt. Kankerinhibiterende middelen, die het GRA van de uitvinding als aktief bestanddeel bevatten, kunnen in elke vorm verkeren, mits zij in zodanige toestand zijn, dat zij het GRA in doeltreffende hoeveelheden bevatten. Gewoonlijk wordt het middel intraveneus, subcutaan, intradermaal of 25 intramuskulair toegediend als een oplossing, een suspensie of een emulsie. Voorts kan het worden geleverd als een droog-produkt, dat vloeibaar kan worden gemaakt door voor het gebruik een geschikte drager toe te voegen. Dit vloeibare middel kan een suspendeermiddel bevatten, bijvoorbeeld methyl-30 cellulose, een emulgator, bijvoorbeeld lecithine, konserveer- middelen, bijvoorbeeld methyl-p-hydroxybenzoaat, een stabi-lisator die als zodanig geen nadelige invloed op de immunise-rende werking op mensen en dieren heeft, een buffer, enzo-voort.The GRA can be used separately as an active ingredient and can additionally be used in combination with other bacterial and cancer inhibiting agents. Cancer inhibitors containing the GRA of the invention as an active ingredient can be in any form, provided they are in such a state that they contain the GRA in effective amounts. Usually, the agent is administered intravenously, subcutaneously, intradermally or intramuscularly as a solution, a suspension or an emulsion. Furthermore, it can be supplied as a drying product, which can be liquefied by adding a suitable carrier before use. This liquid agent may contain a suspending agent, for example, methyl-cellulose, an emulsifying agent, for example, lecithin, preservatives, for example, methyl p-hydroxybenzoate, a stabilizer which as such does not adversely affect the immunizing action on humans and animals, a buffer, and so on.
35 Een te gebruiken waterige drager is bijvoor- 8202638 * - 10 - beeld fysiologische zoutoplossing en te gebruiken niet wateri-ge dragers zijn bijvoorbeeld plantaardige olie, bijvoorbeeld sesamolie, minerale olie, bijvoorbeeld paraffine, dierlijke olie, bijvoorbeeld squalleen en propyleenglycol. Bovendien 5 kan men ter verhoging van de immunologische werking geschikte toevoegsels opnemen. Te gebruiken toevoegsels zijn bijvoorbeeld volledige toevoegsels van Freund, saponine voor dieren en aluminiumhydroxyde voor mensen.An aqueous carrier to be used is, for example, physiological saline and non-aqueous carriers to be used are, for example, vegetable oil, for example sesame oil, mineral oil, for example paraffin, animal oil, for example squalene and propylene glycol. In addition, suitable additives can be included to enhance the immunological activity. Additives to be used are, for example, complete additives of Freund, saponin for animals and aluminum hydroxide for humans.
Het antikankermiddel van de uitvinding kan 10 een maal of herhaaldelijk gedurende een lange tijd ter behan- deling aan een kankerpatient worden toegediend of kan ter voorkoming van kanker worden toegediend aan iemand, die het gevaar loopt kanker te krijgen.The anti-cancer agent of the invention may be administered once or repeatedly for a long time to a cancer patient for treatment or may be administered to a person at risk of developing cancer for the prevention of cancer.
Aangezien de LD,_q (muis, intraperitoneaal) 15 van GRA tenminste 500 mg/kg bedraagt, berekend als een hoe- veelheid suiker, heeft het antikankermiddel van de uitvinding een geringe toxiciteit en kan dan ook in een groot doseer-trajekt worden toegediend. Hoewel de GRA-concentratie in het antikankermiddel van de uitvinding niet kritisch is, verdient 20 het gewoonlijk de voorkeur, dat deze 0,001 tot 100 ^ug/ml bedraagt als berekend als een hoeveelheid suiker. Ten aanzien van de dosis van het antikankermiddel verdient het gewoonlijk de voorkeur het middel toe te dienen in een hoeveelheid van 0,001 tot 1000 ^ug/kg/dag tegelijkertijd of in verschil-25 lende porties, hoewel deze dosis varieert met de omvang van de ziekte en de leeftijd en het geslacht van de patient.Since the LD, q (mouse, intraperitoneal) of GRA is at least 500 mg / kg, calculated as an amount of sugar, the anti-cancer agent of the invention has low toxicity and can therefore be administered in a wide dosage range. Although the GRA concentration in the anti-cancer agent of the invention is not critical, it is usually preferred that it be 0.001 to 100 µg / ml as calculated as an amount of sugar. Regarding the dose of the anti-cancer agent, it is usually preferred to administer the agent in an amount of 0.001 to 1000 µg / kg / day at a time or in varying portions, although this dose varies with the extent of the disease and the age and sex of the patient.
Het aldus bereide antikankermiddel, dat de dodende cellen als aktief bestanddeel bevat, wordt bij voorkeur gebruikt als een injekteerbare oplossing in kombinatie 30 met dragers, die bij de bereiding van dergelijke bloedmedi- cijnen worden gebruikt. De gebruikte dragers zijn niet kritisch,, maar dragers met een aan die van bloed gelijke tonus verdienen de voorkeur. Fysiologische zoutoplossing verdient de bijzonder voorkeur. Bij de bereiding van het middel ver-35 dient het de voorkeur, dat de dodende cellen voldoende worden 8202638 t % .The anti-cancer agent thus prepared, containing the killing cells as an active ingredient, is preferably used as an injectable solution in combination with carriers used in the preparation of such blood medications. The carriers used are not critical, but carriers with a tone similar to that of blood are preferred. Particular preference is given to physiological saline. In the preparation of the agent, it is preferred that the killing cells become sufficient 8202638%.
- 11 - gewassen met fysiologische zoutoplossing of iets dergelijks, opdat boven beschreven kultuurmedium wordt verwijderd en daama worden de cellen in een drager geflotteerd.- washed with physiological saline or the like, so that the culture medium described above is removed and the cells are then floated in a carrier.
De concentratie van de dodende cellen in het 5 middel is niet specifiek beperkt maar bedraagt bij voorkeur 5 9 10 tot 10 per milliliter. Als de dodende cellen intraperi- g toneaal worden toegediend in een dosis van 10 per muis, wordt geen toxiciteit waargenomen. Hoewel de dosis van het antikankermiddel van de uitvinding varieert met de ernst van 10 de ziekte en de leeftijd en het geslacht van de patient, verdient het gewoonlijk de voorkeur dat het middel wordt toe- 5 12 gediend in een dosis van 10 tot 10 /kg/dag, in een portie of in deelporties.The concentration of the killing cells in the agent is not specifically limited, but is preferably from 5 to 10 per milliliter. When the killing cells are administered intraperitoneally at a dose of 10 per mouse, no toxicity is observed. Although the dose of the anti-cancer agent of the invention varies with the severity of the disease and the age and sex of the patient, it is usually preferred that the agent be administered at a dose of 10 to 10 / kg / day, in a portion or in portions.
De volgende voorbeelden lichten de uitvinding 15 toe.The following examples illustrate the invention.
Referentievoorbeeld I Lokaliteit van GRA - 1A. Bereiding van met FITC gemerkt lectine (PNA-FITC).Reference Example I Location of GRA - 1A. Preparation of FITC labeled lectin (PNA-FITC).
20 Tien mg pindalectine (PNA, geproduceerd door EY Co.) werd opgelost in 2 ml 0,01 M fosfaatbuffer, die 0,85%Ten mg of pindalectin (PNA, produced by EY Co.) was dissolved in 2 ml of 0.01 M phosphate buffer, containing 0.85%
NaCl bevatte (pH 7,2). In 1 ml 0,5 M waterstofcarbonaatbuffer (pH 9,0) werd 2 mg FITC (geproduceerd door Sigma Laboratories Inc.) opgelost en 0,5 ml van de resulterende oplossing werd 25 toegevoegd aan boven bereide PNA buffer. Het mengsel werd daama 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens ge-scheiden over Sephadex G25 (10 mm x 300 mm, geproduceerd door Farmacia Corp.). De beginpiek werd opgevangen. FITC/PNA verhouding 1,0.NaCl (pH 7.2). 2 mg of FITC (manufactured by Sigma Laboratories Inc.) was dissolved in 1 ml of 0.5 M hydrogen carbonate buffer (pH 9.0) and 0.5 ml of the resulting solution was added to PNA buffer prepared above. The mixture was then stirred at room temperature for 2 hours and then separated over Sephadex G25 (10mm x 300mm, produced by Farmacia Corp.). The initial peak was absorbed. FITC / PNA ratio 1.0.
30 1B. Bereiding van met FITC gemerkt lectine (DBA-FITC).30 1B. Preparation of FITC labeled lectin (DBA-FITC).
Op dezelfde wijze als onder 1A boven werd DBA-FITC verkregen onder gebruikmaking van DBA geproduceerd door EY Co. FITC/DBA verhouding 0,9.In the same manner as under 1A above, DBA-FITC was obtained using DBA produced by EY Co. FITC / DBA ratio 0.9.
35 820263835 8202638
,. V,. V
« % · - 12 - 1C. Sojaagglutinine-FITC (FITC-SBA) is ver-krijgbaar van EY Co. FITC/SBA verhouding 1,4.«% · - 12 - 1C. Soy Glutinin-FITC (FITC-SBA) is available from EY Co. FITC / SBA ratio 1.4.
2. Lokaliteit van GRA in verschillende 5 kankercellen.2. Locality of GRA in different 5 cancer cells.
a. Gekweekte menselijke kankercellen (1 x g 10 ) werden drie maal met een 0,05 M triszoutzuurbuffer, die 0,85% NaCl (pH 7,2) bevatte, gewassen volgens een centri-fugaalmethode en daarna voegde men 100 yul PNA-FITC, DBA-FITC 10 of SBA-FITC (200 yUg/ml) als boven bereid onder 1. toegevoegd.a. Cultured human cancer cells (1 xg 10) were washed three times with a 0.05 M tris hydrochloric acid buffer containing 0.85% NaCl (pH 7.2) by a centrifugal method and then 100 µl PNA-FITC was added , DBA-FITC 10 or SBA-FITC (200 µg / ml) as prepared under 1. above.
Men liet het resulterende mengsel 30 minuten bij kamertempera-tuur staan teneinde het te laten reageren. Toen de reaktie voltooid was werd het reaktiemengsel drie maal gewassen met 0,01 M fosfaatbuffer, die 0,85% NaCl (pH 7,2) bevatte en 15 daarna werden de cellen op een glasplaat gebracht en onder een fluorescerende mikroskoop onderzocht.The resulting mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to react. When the reaction was complete, the reaction mixture was washed three times with 0.01 M phosphate buffer containing 0.85% NaCl (pH 7.2) and then the cells were placed on a glass plate and examined under a fluorescent microscope.
De resultaten zijn weergegeven in tabel A.The results are shown in Table A.
De gebruikte kankercellen zijn alien bekend en zijn verkregen van de First Pathology Laboratories, Medical Department of 20 Niigata University.The cancer cells used are alien known and obtained from the First Pathology Laboratories, Medical Department of 20 Niigata University.
TABEL ATABLE A
Kankercellen positieve verhouding -K-a.n5.erce.fien van GRA (%)Cancer cells positive ratio -K-a.n5.erce.fien of GRA (%)
PNA DBA SBAPNA DBA SBA
25 Raji (Burkitt lymfoom) 98,3 1,425 Raji (Burkitt's Lymphoma) 98.3 1.4
Dauji (Burkitt lymfoom) 93,1 5,2 BT-1 (Burkitt lymfoom) 50,1 0 P-12 (T-cel lymfoom) 44,3 6,7 MOLT (T-cel leukemie) 0,6 4,8 30 Fujimaki (B-cel lymfoom) 19,1 5,3Dauji (Burkitt lymphoma) 93.1 5.2 BT-1 (Burkitt lymphoma) 50.1 0 P-12 (T cell lymphoma) 44.3 6.7 MOLT (T cell leukemia) 0.6 4.8 Fujimaki (B-cell lymphoma) 19.1 5.3
Oda (IgD myeloom) 0,6 10,0 QG-56 (longkanker, geschubd) 70,4 2,0 PC-1 (longkanker, geschubd) 78,4 0,4 PC-3 (longkanker, adenocarcinoom) 77,1 0 35 QG-90 (longkanker, kleine cel) 68,0 0 8202638 * « - 13 - TABEL A (vervolg) ,, ,, positieve verhoudingOda (IgD myeloma) 0.6 10.0 QG-56 (lung cancer, scaly) 70.4 2.0 PC-1 (lung cancer, scaly) 78.4 0.4 PC-3 (lung cancer, adenocarcinoma) 77.1 0 35 QG-90 (lung cancer, small cell) 68.0 0 8202638 * «- 13 - TABLE A (continued) ,, ,, positive ratio
KaAercellen van GBA (%)_GBA cell cells (%) _
PNA DBA SBAPNA DBA SBA
PC-13 (longkanker, grote cel) 17,0 0 5 MK-2 (maagkanker, slechte 63,7 0,1 diff erentiatie) KATO-III (maagkanker, signet ringkanker 57,3 0 MKN-45 (maagkanker, slechte 1,0 40,3 differentiatie) 10 MKN-1 (maagkanker, adenocarcinoom 4,6 0,4 geschubd) MKN-28 (maagkanker) 0,4 0,1 MKN-74 (maagkanker) 0,5 0 MGH-U1 (urineblaaskanker) 37,4 0 15 KU-2 (urineblaaskanker) 4,5 21,4 T-24 (urineblaaskanker) 14,6 0 NBT-2 (urineblaaskanker) 13,1 1,0 NRC-12 (nierkanker) 23,9 0 KU-1 (nierkanker) 3,3 0,6 20 Kuramochi (ovariumkanker) 80,0 0 NB-1 (neuroblastoom) 50,9 1,7 YT-nu (neuroblastoom) 3,6 0,5 TGW-nu-1 (neuroblastoom) 4,1 0 TGW-nu-11 (neuroblastoom) 2,0 1,0 25 GOTO (neuroblastoom) 0,5 0 ITO (embryonaal carcinoom) 96,9 12,3 NEC-8 (embryonaal carcinoom) 44,6 0 SCH (choriocarcinoom, maag) 14,6 3,1 GCH (chriocarcinoom, uterus) 5,4 0 30 YN-1 (rhabdomyosarcoom) 5,7 1,7PC-13 (lung cancer, large cell) 17.0 0 5 MK-2 (gastric cancer, poor 63.7 0.1 differentiation) KATO-III (gastric cancer, signet ring cancer 57.3 0 EQS-45 (gastric cancer, poor 1 .0 40.3 differentiation) 10 EQS-1 (gastric cancer, adenocarcinoma 4.6 0.4 scaly) EQS-28 (gastric cancer) 0.4 0.1 EQS-74 (gastric cancer) 0.5 0 MGH-U1 (urinary bladder cancer ) 37.4 0 15 KU-2 (urinary bladder cancer) 4.5 21.4 T-24 (urinary bladder cancer) 14.6 0 NBT-2 (urinary bladder cancer) 13.1 1.0 NRC-12 (kidney cancer) 23.9 0 KU-1 (kidney cancer) 3.3 0.6 20 Kuramochi (ovarian cancer) 80.0 0 NB-1 (neuroblastoma) 50.9 1.7 YT-nu (neuroblastoma) 3.6 0.5 TGW-nu-1 (neuroblastoma) 4.1 0 TGW-nu-11 (neuroblastoma) 2.0 1.0 25 GOTO (neuroblastoma) 0.5 0 ITO (embryonic carcinoma) 96.9 12.3 NEC-8 (embryonic carcinoma) 44, 6 0 SCH (choriocarcinoma, stomach) 14.6 3.1 GCH (chriocarcinoma, uterus) 5.4 0 30 YN-1 (rhabdomyosarcoma) 5.7 1.7
Mouse X5563 (plasmacytoom) 92,0 0 90,6Mouse X5563 (plasmacytoma) 92.0 0 90.6
Mouse MH134 (hepatoom) 18,6 0 6,4 35 8202638Mouse MH134 (hepatoma) 18.6 0 6.4 35 8202638
VV
- 14 - b) De kwaadaardige weefsels van kankerpa-tienten werden door een roestvrij stalen zeef ($ 150) geleid teneinde een enkele cellensuspensie te verkrijgen. Na twee maal wassen met 0,01 M tris-HCl buffer (pH 7,4), die 2 mM 5 CaCI^, 2mM MgCl^ en 0,85% NaCl bevatte, werd 5x10^ cellen in 100 ^ul buffer hersuspendeerd.14) b) The malignant tissues of cancer patients were passed through a stainless steel screen ($ 150) to obtain a single cell suspension. After washing twice with 0.01 M tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 2 mM 5 CaCl 3, 2mM MgCl 2 and 0.85% NaCl, 5x10 4 cells were resuspended in 100 µl buffer.
Honderd ^ul FITC-PNA of FITC-DBA (100 ^ug/ml) werd aan de cellensuspensie toegevoerd en bet mengsel werd 20 minuten bij kamertemperatuur geinkubeerd. Na drie maal 10 wassen met koud PBS werden de cellen onderzocht onder een fluorescentie mikroskoop.One hundred µl FITC-PNA or FITC-DBA (100 µg / ml) was added to the cell suspension and the mixture incubated at room temperature for 20 minutes. After washing three times with cold PBS, the cells were examined under a fluorescent microscope.
De resultaten zijn weergegeven in tabel B.The results are shown in Table B.
De kwaadaardige weefsels van kankerpatienten zijn verkregen van de Kansai Medical University.Cancer patients' malignant tissues were obtained from Kansai Medical University.
1515
GSAGSA
No. Kankerpatientweefsel PNA DBA - 1 maagkanker + + 2 maagkanker + + 20 3 maagkanker 4 maagkanker + 5 maagkanker + + 6 maagkanker + 7 borstkanker + 25 8 borstkanker + 9 borstkanker + 10 borstkanker + + 11 darmkanker + + 12 darmkanker - + 30 13 Esofaguskanker + 14 hepatoom - +No. Cancer patient tissue PNA DBA - 1 gastric cancer + + 2 gastric cancer + + 20 3 gastric cancer 4 gastric cancer + 5 gastric cancer + + 6 gastric cancer + 7 breast cancer + 25 8 breast cancer + 9 breast cancer + 10 breast cancer + + 11 colon cancer + + 12 colon cancer - + 30 13 Esophageal cancer + 14 hepatoma - +
Noot: Symbool "+" betekent GEA is uitgedrukt op het celopper-vlak.Note: Symbol "+" means GEA is expressed on the cell surface.
Symbool betekent GRA is niet uitgedrukt op het cel-35 oppervlak.Symbol means GRA is not expressed on the cell-35 surface.
8202638 i + v · - 15 -8202638 i + v - - 15 -
Referentievoorbeeld IIReference example II
Bereiding van GRAPreparation of GRA
IA. Bereiding van geimmobiliseerd lectine (PNA-Sepharose).IA. Preparation of Immobilized Lectin (PNA-Sepharose).
5 Drie gram met CNBr geaktiveerd Sepharose 4B5 Three grams of CNBr-activated Sepharose 4B
(geproduceerd door Farmacia Corp.) werd grondig gewassen met 1 mM HC1 en gesuspendeerd in 200 ml 0,1 H natriumwaterstof-carbonaat (pH 8,5). Daama werd 5 ml 0,01 M fosfaatbuffer (pH 8,5), die 20 mg PNA bevatte, toegevoegd en men liet het 10 gebeel 2 uur bij 25°C reageren waarbij men af en toe roerde, teneinde PNA-Sepharose te bereiden.(produced by Farmacia Corp.) was washed thoroughly with 1 mM HCl and suspended in 200 ml 0.1 H sodium hydrogen carbonate (pH 8.5). Then, 5 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH 8.5) containing 20 mg of PNA was added and the picture was reacted for 2 hours at 25 ° C with occasional stirring to prepare PNA-Sepharose.
IB. Op dezelfde wijze als in 1A. boven, behalve dat men DBA gebruikt in plaats van PNA, werd DBA-Sepharose verkregen.IB. In the same way as in 1A. above, except using DBA instead of PNA, DBA-Sepharose was obtained.
15 2. Bereiding van GRA.15 2. Preparation of GRA.
a. BT-1 (Burkittlymfoom) cellen (1,3 x 10 ) werden drie maal gewassen met fysiologische zoutoplossing en men voegde 30 ml 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4) toe, die 20 2% "TRITON X-100" (geproduceerd door Wako Pure Chemical Indus tries Ltd.), 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2 bevatte.a. BT-1 (Burkitt's lymphoma) cells (1.3 x 10) were washed three times with physiological saline and 30 ml of 0.01 M tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was added, containing 20 2% "TRITON X-100 (produced by Wako Pure Chemical Indus tries Ltd.), contained 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2 and 2 mM MgCl2.
Het mengsel werd 15 rainuten bij 4°C geroerd en daama onder-worpen aan ultracentrifugescheiding bij 100.000 x g. Van 28 ml aldus verkregen bovenstaande vloeistof leidde men een por-25 tie van 14 ml door een kolom (middellijn 0,5, lengte 1 cm) voor affiniteitschromatografie, gevuld met PNA-agaroseparels (geproduceerd door Maruzen Co., Ltd.), die in evenwicht waren gebracht met een triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,1% TRITON X-100, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2 bevatte. Na te 30 zijn gewassen met dezelfde buffer als boven gebruikt, elueerde men de kolom met 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,1 M lactose, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en'0,1% TRITON X-100 bevatte. De aldus geelueerde portie werd 48 uur gedialy-seerd met 0,01 M triszoutzuurbuffer, die 0,85% NaCl, 2 mM 35 MgCl2 en 2 mM CaCl2 bevatte onder verkrijging van 17 ml GRA- 8202638 % - 16 - oplossing. Met deze GRA oplossing werden de hoeveelheid pro-teine en de hoeveelheid suiker respektievelijk gemeten volgens de Folin-Lowrymethode en de fenol-zwavelzuurmethode en zij bleken respektievelijk 644 ^ug en 120 jug te bedragen. Dit 5 wordt hiema aangeduid als "GRA-1".The mixture was stirred at 4 ° C for 15 minutes and then subjected to ultracentrifuge separation at 100,000 x g. Of 28 ml supernatant thus obtained, a 14 ml portion was passed through an affinity chromatography column (diameter 0.5, length 1 cm), filled with PNA agarose beads (produced by Maruzen Co., Ltd.), which equilibrated with a tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) containing 0.1% TRITON X-100, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2. After washing with the same buffer as used above, the column was eluted with 0.01 M tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) containing 0.1 M lactose, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 and 0.1% TRITON X-100. The portion thus eluted was dialyzed for 48 hours with 0.01 M tris hydrochloric acid buffer containing 0.85% NaCl, 2 mM 35 MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 to give 17 ml of GRA 8202638% solution. With this GRA solution, the amount of protein and the amount of sugar were measured by the Folin-Lowry method and the phenol-sulfuric acid method, respectively, and were found to be 644 µg and 120 µg, respectively. This is hereinafter referred to as "GRA-1".
b. C3H/He muismamma tumor (MMT) cellen (1 x 10^) werden drie maal gewassen met fysiologische zoutoplos-sing en men voegde 30 ml 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4) toe, die 2% TRITON X-100, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mMb. C3H / He mouse mammary tumor (MMT) cells (1 x 10 ^) were washed three times with physiological saline and 30 ml of 0.01 M tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4), containing 2% TRITON X-100, were added. 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 mM
10 MgCl2 bevatte. Het mengsel werd 30 minuten bij 4°C geroerd.10 MgCl2. The mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes.
Vervolgens werd het mengsel onderworpen aan ultracentrifuge-scheiding bij 100.000 x g gedurende 2 uur en de bovenstaande vloeistof werd een nacht gedialyseerd met 0,1 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl^ 15 bevatte. De aldus gedialyseerde vloeistof werd geconcentreerd tot 3 ml en een 1 ml portie werd daama geleid door een kolom (middellijn 0,5, lengte 2 cm) voor affiniteitschromatografie, gevuld met dezelfde PNA-Sepharose als boven gebruikt, dat in evenwicht was gebracht met een triszoutzuurbuffer (pH 7,4), 20 die 0,005% TRITON X-100, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2Then the mixture was ultracentrifuged at 100,000 xg for 2 hours and the supernatant was dialyzed overnight with 0.1 M tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) containing 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl ^ 15 contained. The thus dialyzed liquid was concentrated to 3 ml and a 1 ml portion was then passed through an affinity chromatography column (diameter 0.5, length 2 cm) filled with the same PNA-Sepharose used above, equilibrated with a tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4), 20 containing 0.005% TRITON X-100, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2 and 2 mM MgCl2
bevatte. Na volledig te zijn gewassen met dezelfde buffer als boven gebruikt, elueerde men de kolom met een 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,1 M lactose, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en 0,005% TRITON X-100 bevatte en de aldus 25 geelueerde portie werd 48 uur gedialyseerd met een 0,01 Mcontained. After being completely washed with the same buffer as used above, the column was eluted with a 0.01 M tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) containing 0.1 M lactose, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 0.005% TRITON X-100 and the thus-eluted portion was dialyzed with 0.01 M for 48 hours
triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2 bevatte onder verkrijging van 2 ml GRA oplossing. Met de aldus verkregen GRA-oplossing bedroeg de hoeveelheid proteine en de hoeveelheid suiker respektievelijk 156 j\xg en 30 94 j\ig. Dit wordt hiema aangeduid als "GRA-M-1".tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) containing 0.85% NaCl, 2 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 to give 2 ml GRA solution. With the GRA solution thus obtained, the amount of protein and the amount of sugar were 156 µg and 30 µg respectively. This is referred to as "GRA-M-1".
c. Ongeveer 120 g (nat gewicht) KATO-III werd met een Waring blender gehomogeniseerd in 100 ml PBS.c. About 120 g (wet weight) of KATO-III was homogenized in 100 ml PBS with a Waring blender.
Na 1 uur centrifugeren bij 100.000 g werd het persstukje opgelost in 100 ml 2% Triton X-100 in 0,01 M tris-HCl buffer 35 (pH 7,6), die 0,15 M NaCl bevatte. De bovenstaande vloeistof 8202638 % 4 - 17 - na t uur centrifugeren bij 100.000 g werd geleid over een kolom van PNA-Sepharose 4B (0,8 x 15 cm), die in evenwicht was gebracht met 0,015% Triton X-100 in 0,01M tris-HCI (pH 7,6), dat 0,15 M NaCl bevatte. Na wassen-met 50 ml van de 5 buffer werd het GRA geelueerd met de buffer, die 0,1 M lactose bevatte. Het geelueerde GRA werd gedialyseerd tegen 0,85%After centrifugation at 100,000 g for 1 hour, the pellet was dissolved in 100 ml of 2% Triton X-100 in 0.01 M tris-HCl buffer 35 (pH 7.6) containing 0.15 M NaCl. The supernatant 8202638% 4 - 17 - after centrifugation at 100,000 g for one hour was passed through a column of PNA-Sepharose 4B (0.8 x 15 cm) equilibrated with 0.015% Triton X-100 in 0, 01M tris-HCl (pH 7.6) containing 0.15 M NaCl. After washing with 50 ml of the buffer, the GRA was eluted with the buffer containing 0.1 M lactose. The eluted GRA was dialyzed at 0.85%
NaCl, geconcentreerd met Sephadex Pharmacia Co. en opgeslagen bij -20°C voor gebruik.NaCl, concentrated with Sephadex Pharmacia Co. and stored at -20 ° C for use.
De op dezelfde wijze als onder a. boven be-10 paalde hoeveelheden proteine en suiker bleken respektievelijk 2,0 mg en 0,8 te bedragen. Dit wordt hiema aangeduid als "GBA-2n.The amounts of protein and sugar determined in the same manner as under a. Above were found to be 2.0 mg and 0.8, respectively. This is referred to as "GBA-2n."
d. Op dezelfde wijze als onder c. boven wer-den de volgende GRA monsters verkregen.d. In the same way as under c. above, the following GRA samples were obtained.
1515
TABEL CTABLE C
PRAPRA
GRA Materiaal -r—^^- -- proteine- suiker- monster bron hoeveelheid (g) gehalte (mg) gehalte(mg) GRA-3 BT-1 33 0,5 0,09 20 GRA-4 Borstkan- 5 0,24 0,5 ker (uit-gesneden) GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38 GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54 GRA-7 Raji 29 0,78 0,45 25 GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4 GRA-M-3 LLC 14,4 0,06 0,07 GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35 GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 30 e. Op dezelfde wijze als onder c. boven, behalve dat MKN-45 (ongeveer 29 g) werd gebruikt in plaats van Kato-III en DBA-Sepharose verkregen onder 1B. boven werd gebruikt in plaats van PNA-Sepharose en eluering werd uitge-voerd met N-acetylgalactosamine, werd een GRA-preparaat met 35 een proteinegehalte van 0,03 mg en een suikergehalte van 0,01 8202638 - 18 - mg verkregen. Dit wordt hierna aangeduid als "GRA-8".GRA Material -r - ^^ - - protein- sugar- sample source amount (g) content (mg) content (mg) GRA-3 BT-1 33 0.5 0.09 20 GRA-4 Breast jug- 5 0, 24 0.5 ker (cut) GRA-5 QG-56 24 0.6 0.38 GRA-6 QG-90 26 1.0 0.54 GRA-7 Raji 29 0.78 0.45 25 GRA- M-2 MMT 200 11.3 28.4 GRA-M-3 LLC 14.4 0.06 0.07 GRA-M-4 MH-134 85 0.65 0.35 GRA-M-5 X-5563 25 0.56 0.23 30 e. In the same way as under c. above, except that MKN-45 (about 29 g) was used in place of Kato-III and DBA-Sepharose obtained under 1B. above was used in place of PNA-Sepharose and elution was performed with N-acetylgalactosamine, a GRA preparation having a protein content of 0.03 mg and a sugar content of 0.01 8202638-18 mg. This is hereinafter referred to as "GRA-8".
f. Vijf ml GRA-3, bereid onder d. boven werd gebracht in een DBA-Sepharosekolom en geelueerd met tris-HCl buffer (0,015% Triton X-100, 2 mM MgCl2 CaCl2, 0,85% 5 NaCl) onder verkrijging van 4 ml frakties nos. 1-12. Frakties 1-3 worden aangeduid als "GRA-3-A" en frakties 4-11 als "GRA-3-B". Daarna werd de kolom geelueerd met dezelfde buffer, die echter 0,1 M N-acetylgalactosamine bevatte onder verkrijging van frakties, aangeduid als "GKA-3-C".f. Five ml of GRA-3 prepared under d. was placed in a DBA Sepharose column above and eluted with tris-HCl buffer (0.015% Triton X-100, 2 mM MgCl 2 CaCl 2, 0.85% 5 NaCl) to give 4 ml fractions nos. 1-12. Fractions 1-3 are referred to as "GRA-3-A" and fractions 4-11 as "GRA-3-B". Then, the column was eluted with the same buffer, but containing 0.1 M N-acetylgalactosamine to yield fractions, designated "GKA-3-C".
10 g. SDS gel elektroforese.10 g. SDS gel electrophoresis.
Elk van de GRA-preparaten, die volgens bovenstaande werkwijzen waren verkregen, werd onderworpen aan elektroforese volgens de methode, beschreven in Fairbanks et al: Biochemistry 10, 2606, 1971.Each of the GRA preparations obtained by the above methods was subjected to electrophoresis by the method described in Fairbanks et al: Biochemistry 10, 2606, 1971.
15 De verkregen resultaten worden getoond in figuren 18 tot 22.The results obtained are shown in Figures 18 to 22.
In figuren 18-19 betekenen de cijfers 1 tot 5 het volgende: 1: standaard, 2: GRA-M-3, 3: GRA-7, 4: GRA-1 20 en 5: GRA-5.In Figures 18-19, numbers 1 to 5 mean the following: 1: Standard, 2: GRA-M-3, 3: GRA-7, 4: GRA-1 20, and 5: GRA-5.
In figuur 20 betekenen cijfers 1 tot 4 het volgende: 1: standaard, 2: GRA-M-2, 3: GRA-6 en 4: GRA-5.In Figure 20, numbers 1 to 4 mean the following: 1: Standard, 2: GRA-M-2, 3: GRA-6, and 4: GRA-5.
25 In figuur 21 betekenen cijfers 1 tot 3 het volgende: 1: GRA-M-4, 2: GRA-M-5 en 3: standaard.25 In figure 21, numbers 1 to 3 mean the following: 1: GRA-M-4, 2: GRA-M-5 and 3: standard.
In figuur 22 betekenen nummers 1 tot 4 het volgende: 30 1: GRA-3, 2: GRA-3-A, 3: GRA-3-B en 4: GRA- 3-C.In Figure 22, numbers 1 to 4 mean the following: 30 1: GRA-3, 2: GRA-3-A, 3: GRA-3-B and 4: GRA-3-C.
Figuur 18 toont de toestand van GRA, dat is onderworpen aan proteinevlekreaktie volgens de C.B.B. methode (Fairbanks et al: Biochemistry 10, biz. 2606, 1971).Figure 18 shows the state of GRA subjected to protein stain reaction according to the C.B.B. method (Fairbanks et al: Biochemistry 10, biz. 2606, 1971).
35 Figuren 19-21 tonen de toestand van GRA, dat 8202638 * · - 19 - onderworpen is aan suikerkleurreaktie volgens de PAS-methode (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. 30, biz. 148 (1962)).Figures 19-21 show the state of GRA, that 8202638 * - 19 - has been subjected to sugar color reaction by the PAS method (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. 30, biz. 148 (1962)).
Figuur 22 toont een schematische voorstelling van de resultaten van de vlekvorndng volgens de boven beschre- 5 ven C.B.B. methode.Figure 22 shows a schematic representation of the results of the stain formation according to the C.B.B. described above. method.
Van de onder opgesomde standaardstoffen werden de volgende gebruikt van Biorad Lab. Calif. U.S.A..Of the standard fabrics listed below, the following were used from Biorad Lab. Calif. U.S.A ..
200 K dalton; myosine 116 „ ; fy-galactosidase 10 92,5 π ; fosforylase200 K dalton; myosin 116 "; ph-galactosidase 10 92.5 π; phosphorylase
66,2 „ ; BSA66.2 "; BSA
45 „ ; eivalbumine 21,5 i, ; soja-trypsine inhibitor.45 "; egg albumin 21.5 i; soy trypsin inhibitor.
Referentievoorbeeld IIIReference example III
15 Bereiding van TCGF.15 Preparation of TCGF.
a. Vier kg milt van Japanse apen (verkregen van Japan Plymates Co., Ltd.) werd gesneden en twee maal ge- wassen met een RPMI-1640 kultuurmedium (geproduceerd doora. Four kg spleen of Japanese monkeys (obtained from Japan Plymates Co., Ltd.) was cut and washed twice with an RPMI-1640 culture medium (produced by
Flow Laboratory Co., Ltd.). De cellen werden gefiltreerd 20 met behulp van Mesh (geproduceerd door Millipore Inc., 150 mesh) en onderworpen aan een specifieke graviteitcentrifuge- methode (specifieke graviteit, 1,076) onder verkrijging van 9 2 liter 2 x 10 /ml lymfocyten. De aldus verkregen lymfocyten werden 3 maal gewassen met een RPMI-1640 kultuurmedium en 25 het lymfocytengetal werd ingesteld op 5 x 10^ per ml onder gebruikmaking van hetzelfde medium als boven, dat 10% FCS bevatte. Men liet het geheel daama 1 uur bij 37°C staan in een kooldioxydefermenteerinrichting. De lymfocyten uit de bovenstaande vloeistof werden gewonnen en het lymfocyten- g 30 getal werd ingesteld op 1 x 10 per ml door gebruik van het zelfde kultuurmedium als boven, dat 1% FCS bevatte. Vervolgens werd 1 ^ug/ml indomethacine (geproduceerd door Sigma Laboratories, Inc.) en 0,2% PHA-P (geproduceerd door Difco Co.) toegevoegd en onderwierp het geheel 48 uur bij 37°C aan 35 kultuur in een kooldioxydegasfermenteerinrichting. Men centri- 8202638 - 20 - fugeerde 10 minuten bij 3000 rpm af en won de resulterende bovenstaande vloeistof, die werd gesteriliseerd door filtratie door een Millipore filter (geproduceerd door Millipore Inc., 0,2 ^um) onder verkrijging van 2 liters TCGF.Flow Laboratory Co., Ltd.). The cells were filtered using Mesh (manufactured by Millipore Inc., 150 mesh) and subjected to a specific gravity centrifuge method (specific gravity, 1.076) to obtain 9 2 liters of 2 x 10 / ml lymphocytes. The lymphocytes thus obtained were washed 3 times with an RPMI-1640 culture medium and the lymphocyte number was adjusted to 5 x 10 µ per ml using the same medium as above containing 10% FCS. The whole was then allowed to stand at 37 ° C for 1 hour in a carbon dioxide fermenter. The lymphocytes from the supernatant were collected and the lymphocyte g number was adjusted to 1 x 10 per ml using the same culture medium as above containing 1% FCS. Then 1 µg / ml indomethacin (produced by Sigma Laboratories, Inc.) and 0.2% PHA-P (produced by Difco Co.) was added and subjected to culture in a carbon dioxide gas fermenter for 48 hours at 37 ° C. Centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes and the resulting supernatant recovered, which was sterilized by filtration through a Millipore filter (produced by Millipore Inc., 0.2 µm) to obtain 2 liters of TCGF.
5 b. De bron van TCGF was de bovenstaande vloeistof van aan mengkultuur onderworpen periferale bloedlymfocyten van tien gezonde donors. Niet adherente lymfocyten, bereid uit C.F. (Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co.)) afgescheiden lymfocyten door adsorptie aan plastik oppervlak 10 bij 37°C gedurende 1 uur werden gesuspendeerd in RPMI-1640 medium, dat 1% FCS bevatte (1,5 x 10 cellen/ml) en geinku- beerd met 0,2% PHA.-P, indomethacine (1 ,ug/ml) en menselijke 5 B-cellenlijn (BT-1) (1,5 x 10 cellen/ml) voorbehandeld met mitomycine C (50 ^ug/ml). Na 48 uur werd de bovenstaande 15 vloeistof van de kultuur gewonnen en gebruikt als TCGF-bron.5 b. The source of TCGF was the supernatant of mixed culture peripheral blood lymphocytes from ten healthy donors. Non-adherent lymphocytes prepared from C.F. (Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co.)) secreted lymphocytes by adsorption on plastic surface at 37 ° C for 1 hour were suspended in RPMI-1640 medium containing 1% FCS (1.5 x 10 cells / ml) and incubated with 0.2% PHA.-P, indomethacin (1 µg / ml) and human 5 B cell line (BT-1) (1.5 x 10 cells / ml) pretreated with mitomycin C (50 µg / ml). After 48 hours, the culture supernatant was collected and used as a TCGF source.
(H. Inoue et al, Scand. J. Immunol. 12, biz. 149-154 (1980)).(H. Inoue et al., Scand. J. Immunol. 12, biz. 149-154 (1980)).
Referentievoorbeeld IV.Reference example IV.
Bereiding van lymfocyten.Preparation of lymphocytes.
1. Menselijke periferaal bloedlymfocyten.1. Human peripheral blood lymphocytes.
20 Vijftig ml bloed, verkregen van een gezonde volwassene of verschillende kankerpatienten door beparinisatie, werd aan centrifugaalscheiding onderworpen door het gebruik van Ficol Pack (geproduceerd door Farmacia Japan Co., Ltd.) onder verkrijging van 5 x 10^ periferaal bloedlymfocyten.Fifty ml of blood, obtained from a healthy adult or various cancer patients by pararinization, was centrifuged using Ficol Pack (manufactured by Farmacia Japan Co., Ltd.) to obtain 5 x 10 4 peripheral blood lymphocytes.
25 2. Muismiltlymfocyten.25 2. Mouse spleen lymphocytes.
De milt van een C3H/He muis (manmetje, 6w) werd uitgesneden en twee maal gewassen met een RPMI-1640 kultuurmedium. De milt werd daama losgemaakt met een injek-tienaald en geleid door een roestvrijstalen zeef (100 mesh) 30 ter verwijdering van grote stukken. De aldus gefiltreerde cellen werden twee maal gewassen met hetzelfde kultuurmedium als boven en onderworpen aan centrifugaalscheiding bij 1200 rpm gedurende 10 minuten onder verkrijging van 4 x 10^ milt-lymfocyten.The spleen of a C3H / He mouse (male, 6w) was excised and washed twice with an RPMI-1640 culture medium. The spleen was then detached with an injection needle and passed through a stainless steel screen (100 mesh) to remove large pieces. The cells thus filtered were washed twice with the same culture medium as above and subjected to centrifugal separation at 1200 rpm for 10 minutes to obtain 4x10 1 spleen lymphocytes.
35 8202638 * - 21 -35 8202638 * - 21 -
Voorbeeld IExample I
GRA.-1 (hoeveelheid proteine: 40 ^ug/ml, hoeveelheid suiker: 7,5 ^ug/ml) als verkregen in referentie-voorbeeld II onder Ila. werd tot 1000 maal het oorspronkelijke 5 volume verdund met een KPMI-1640 kultuurmedium, dat 15% FCSGRA.-1 (amount of protein: 40 µg / ml, amount of sugar: 7.5 µg / ml) as obtained in reference example II under Ila. was diluted to 1000 times the original 5 volume with a KPMI-1640 culture medium containing 15% FCS
bevatte ter bereiding vein een sensitiseerkultuaxrmedium.contained a sensitizing culture medium for preparation.
Menselijke periferaal bloedlymfocyten (5 x g 10 /5 ml) als verkregen in referentievoorbeeld IV onder 1. werden toegevoegd aan 5 ml van het sensitiseerkultuurmedium, 10 bereid als boven, dat op een laboratoriumschaal werd gebracht en twee dagen bij 37°C werd gekweekt. Men kweekte nog 5 dagen verder op het KPMI-1640 kultuurmedium, dat 20% JTCGF en 15% FCS bevatte als verkregen in referentievoorbeeld III, onder g verkrijging van 20 ml dodende cellenoplossing, die 1 x 10 15 dodende cellen per ml bevatte. Dit wordt hierna aangeduid als "GBA-1-K-T".Human peripheral blood lymphocytes (5 x g 10/5 ml) as obtained in Reference Example IV under 1. were added to 5 ml of the sensitizing culture medium, prepared as above, which was placed on a laboratory dish and grown for two days at 37 ° C. Cultivation was continued for 5 days on the KPMI-1640 culture medium containing 20% JTCGF and 15% FCS as obtained in Reference Example III to obtain 20 ml of killing cell solution containing 1 x 10 killing cells per ml. This is hereinafter referred to as "GBA-1-K-T".
Voorbeeld IIExample II
De muismiltlymfocyten als verkregen in referentievoorbeeld IV onder 2. werden ingesteld op een getal g 20 van 5 x 10 /ml door gebruik van een KPMI-1640 kultuurmedium, dat 15% FCS bevatte. Daama werd GRA.-M-1 als verkregen in referentievoorbeeld II onder lib. toegevoegd, zodat de defini-tieve hoeveelheden proteine en suiker respektievelijk 1,5 ^ug/ ml en 0,9 yUg/ml bedroegen. Een 5 ml portie van het resulte-25 rende mengsel werd twee dagen bij 37°C gekweekt op een labora toriumschaal (6 ml x 15 ml, vervaardigd door Falcon Co.). De vorming van klonen werd geobserveerd. De portie werd nog vier dagen verder gekweekt op een KPMI-1640 kultuurmedium met 15% FCS, dat 25 vol% TCGF (geproduceerd door Japan Immuno 30 Research Laboratories Co., Ltd.) bevatte onder verkrijging g van 50 ml dodende cellenoplossing, die 1 x 10 dodende cellen per ml bevatte. Dit wordt hierna aangeduid als "GRA-M-1-KT".Mouse murine lymphocytes as obtained in Reference Example IV under 2. were adjusted to a number g of 5 x 10 / ml using a KPMI-1640 culture medium containing 15% FCS. Then GRA.-M-1 as obtained in Reference Example II under lib. so that the final amounts of protein and sugar were 1.5 µg / ml and 0.9 µg / ml, respectively. A 5 ml portion of the resulting mixture was grown on a laboratory dish (6 ml x 15 ml, manufactured by Falcon Co.) for two days at 37 ° C. Clone formation was observed. The aliquot was cultured for a further four days on a KPMI-1640 culture medium containing 15% FCS containing 25 vol% TCGF (produced by Japan Immuno 30 Research Laboratories Co., Ltd.) to obtain g of 50 ml of killing cell solution containing 1 x 10 killing cells per ml. This is hereinafter referred to as "GRA-M-1-KT".
Voorbeeld IIIExample III
Periferaal bloedlymfocyten (5 x 10 ) van een 35 gezonde donor werden bij 37°C geinkubeerd in RPMI-1640 medium, 8202638 ψ - 22 - dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-2 en 15% FCS bevatte.Peripheral blood lymphocytes (5 x 10) from a healthy donor were incubated at 37 ° C in RPMI-1640 medium, 8202638 ψ-22 - containing 50 ng / ml (protein content) GRA-2 and 15% FCS.
Op dag 2 werd het boven beschreven menselijk TCGF toegevoegd aan het medium totdat de concentratie 20% bereikte en de inkubatie werd nog 3 dagen voortgezet teneinde dodende cellen 5 te verkrijgen. Dit wordt hiema aangeduid als "GRA-2-K-T".On day 2, the human TCGF described above was added to the medium until the concentration reached 20% and incubation was continued for another 3 days to obtain killing cells. This is referred to as "GRA-2-K-T".
Voorbeeld IV.Example IV.
Dodende cellenpreparaten GRA.-8-K-T, GM-3-A-K-T en GRA-3-C-K-T werden op dezelfde wijze als in voorbeeld in bereid onder gebruikmaking van respektievelijk GRA-8, GEA-10 3-A en GSA-3-C (proteinegehalte: 50 ng/ml) en het in referen- tievoorbeeld Illb verkregen TCGF.Killing cell preparations GRA.-8-KT, GM-3-AKT and GRA-3-CKT were prepared in the same manner as in example using GRA-8, GEA-10 3-A and GSA-3-C, respectively ( protein content: 50 ng / ml) and the TCGF obtained in reference example Illb.
Voorbeeld V.Example V.
Bij C3H/He muizen (wijfjes, 8 weken) werden g intradermaal X5563 cellen (10 ) van dezelfde stam ingeplant 15 en na 7 dagen werd de tumor chirurgisch uitgesneden. Na nog 7 dagen werden X5563 cellen (10^) van dezelfde stam ingeent en de tegen inenting resistente -muizen werden immune muizen genoemd.C3H / He mice (females, 8 weeks) were implanted with intradermal X5563 cells (10) of the same strain and after 7 days the tumor was surgically excised. After a further 7 days, X5563 cells (10 ^) from the same strain were inoculated and the vaccination resistant mice were called immune mice.
De miltcellen van de immune muizen en normale 20 C3H/He muizen werden geprepareerd volgens de gebruikelijke methode.The spleen cells of the immune mice and normal C3H / He mice were prepared according to the usual method.
gg
Elke lading miltcellen (5 x 10 /bron) werd ter verkrijging van dodende cellen 5 dagen gesensitiseerd met 40 ng/ml (proteinegehalte) GRA-M-5 in RPMI-1640 medium, 25 dat 15% FCS bevatte.Each batch of spleen cells (5 x 10 / source) was sensitized for 5 days with 40 ng / ml (protein content) GRA-M-5 in RPMI-1640 medium containing 15% FCS.
Uit normale miltcellen verkregen dodende cellenpreparaat wordt hiema aangeduid met "GRA-M-5-K-T-1" en dat, verkregen van immune miltcellen wordt hiema aangeduid met "GRA-M-5-K-T-2".Killing cell preparation obtained from normal spleen cells is hereinafter designated "GRA-M-5-K-T-1" and that obtained from immune spleen cells is hereinafter designated "GRA-M-5-K-T-2".
30 Voorbeeld VI.Example VI.
Menselijke periferaal bloedlymfocyten (5 x 10^) werden twee dagen bij 37°C geinkubeerd RPMI-1640 medium, dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-1 bevatte. Op dag 3 werden de lymfocyten overgedragen aan RPMI-1640 medium, dat 10% 35 serum van de donor van de lymfocyten en 0 tot 100 ng/ml 8202638 - i - 23 - (proteinegehalte) GBA-1 bevatte en de inkubatie ward nog 5 dagen voortgezet ter verkrijging van dodende cellenprepara-ten als getoond in onderstaande tabel D.Human peripheral blood lymphocytes (5 x 10 ^) were incubated for two days at 37 ° C RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) GRA-1. On day 3, the lymphocytes were transferred to RPMI-1640 medium containing 10% lymphocyte donor serum and 0 to 100 ng / ml 8202638 - i - 23 - (protein content) GBA-1 and incubation 5 more days continued to obtain killing cell preparations as shown in Table D below.
5 TABE1 D5 TABE1 D
GRA concentratie (ng/ml)GRA concentration (ng / ml)
Begindag Dag 3 Dodende cellen.Day 3 Day 3 Killing cells.
50 0 GRA-1-K-T-1 50 1,6 GBA-1 -K-T-2 10 50 3,2 GBA-1-K-T-3 50 6 GBA-1-K-T-4 50 12,5 GBA-1-K-T-5 50 25 GRA-1-K-T-6 50 50 GBA-1-K-T-7 15 50 100 GBA-1-K-T-850 0 GRA-1-KT-1 50 1.6 GBA-1 -KT-2 10 50 3.2 GBA-1-KT-3 50 6 GBA-1-KT-4 50 12.5 GBA-1-KT -5 50 25 GRA-1-KT-6 50 50 GBA-1-KT-7 15 50 100 GBA-1-KT-8
Voorbeeld VIIExample VII
a. Periferaal bloedlymfocyten (PBL) van ver-schillende kankerpatienten na operatie werden gesensitiseerd 20 met GRA-3 ter verkrijging van dodende celpreparaten. PBLa. Peripheral blood lymphocytes (PBL) from various cancer patients after surgery were sensitized with GRA-3 to obtain killing cell preparations. PBL
g (5 x 10 ) van de patienten werd 2 dagen geinkubeerd in BPMI-1640 medium, dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-3 bevatte en daama nog 5 dagen in RPMI-1640 medium, dat 20% TCGF en 15% FCS bevatte, ter verkrijging van dodende cellen als ge-25 toond in tabel E.g (5 x 10) of the patients were incubated for 2 days in BPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) of GRA-3 and then 5 more days in RPMI-1640 medium containing 20% TCGF and 15% FCS containing killing cells as shown in Table E.
TABEL ETABLE E
Periferaal bloedlymfocyten. , ----- dagen naPeripheral blood lymphocytes. , ----- days after
Ranker P-GBA D-GRA operatie dodende cellen 30 maagkanker + + 14 GBA-3-K-T-1 maagkanker ++ 35 GRA-3-K-T-2 borstkanker + - 21 GRA-3-K-T-3 borstkanker +- 7 GRA-3-K-T-4 borstkanker +- 35 GBA-3-K-T-5 35 maagkanker + - 21 GRA-3-K-T-6 8202638 - 24 -Ranker P-GBA D-GRA surgery killing cells 30 stomach cancer + + 14 GBA-3-KT-1 stomach cancer ++ 35 GRA-3-KT-2 breast cancer + - 21 GRA-3-KT-3 breast cancer + - 7 GRA- 3-KT-4 breast cancer + - 35 GBA-3-KT-5 35 stomach cancer + - 21 GRA-3-KT-6 8202638 - 24 -
In de bovenstaande tabel geven P-GRA en D-GRA de GRA lokaliteit aan op het kwaadaardige weefsel (uit-gesneden door operatie) van de kankerpatienten, waaruit PBL werd verzameld als bepaald op dezelfde wijze als in referen-5 tievoorbeeld I onder 2b. P-GRA en D-GRA zijn resultaten, die zijn verkregen onder gebruikmaking van respektievelijk FITC-PNA en FITC-DBA. De dagen na opera.tie geven de tijd aan, waarin PBL na de operatie werd verzameld.In the table above, P-GRA and D-GRA indicate the GRA locality on the malignant tissue (excised by surgery) of the cancer patients, from which PBL was collected as determined in the same manner as in Reference Example I under 2b. P-GRA and D-GRA are results obtained using FITC-PNA and FITC-DBA, respectively. The days after surgery indicate the time in which PBL was collected after surgery.
g b. PBL (5 x 10 ) verzameld van borstkanker- 10 patienten 21 dagen na operatie werd 7 dagen geinkubeerd in RPMI-1640 medium, dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-3 eng b. PBL (5 x 10) collected from breast cancer patients 21 days after surgery was incubated for 7 days in RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) GRA-3 and
10% serum van de patient bevatte, ter sensitisering van PBLContained 10% patient's serum to sensitize PBL
en ter verkrijging van dodende cellenprepraat. Dit wordt hierna aangeduid als "GRA-S-K-T-y".and to obtain killing cellular formulation. This is hereinafter referred to as "GRA-S-K-T-y".
15 Voorbeeld VIIIExample VIII
8 GRA-1-K-T (10 ) als verkregen in voorbeeld I werd opgelost in 10 ml fysiologische zoutoplossing teneinde een injekteerbare oplossing te bereiden.8 GRA-1-K-T (10) as obtained in Example I was dissolved in 10 ml of physiological saline to prepare an injectable solution.
Voorbeeld IXExample IX
20 I. GRA-M-1 als verkregen in referentievoor- beeld II onder lib. werd met fysiologische zoutoplossing zodanig verdund, dat de hoeveelheden suiker en proteine respektievelijk 1,0 yUg/ml en 1,6 yug/ml bedroegen teneinde daardoor een antikankermiddel no 1 te bereiden.I. GRA-M-1 as obtained in Reference Example II under lib. was diluted with physiological saline so that the amounts of sugar and protein were 1.0 µg / ml and 1.6 µg / ml, respectively, to thereby prepare an anti-cancer agent no 1.
25 II. Een tumorlob van C3H/He spontaan optre- dende borstkanker werd steriel uitgesneden tot een kubus van 5 mm en getransplanteerd onder de rughuid van elk van tien C3H/He muizen van dezelfde stam als boven (7 weken oud, man-net jes). Zeven dagen na de transplantatie werden fixering en 30 multiplikatie van de tumor bevestigd. Aan 5 van de muizen werd elk subcutaan antikankermiddel no 1 als boven bereid onder I. toegediend in een dosis van 3 yul per dag bij tussen-pozen van twee dagen. De resterende 5 muizen werden als onbehandelde kontroledieren gebruikt. Tien dagen na de eerste 35 toediening werd de tumor uitgesneden door operatie en werd 8202638 - 25 - het gemiddelde gewicht gemeten. Tegelijkertijd werd patho-histologisch onderzoek uitgevoerd.25 II. A tumor lobe of C3H / He spontaneously occurring breast cancer was sterile excised into a 5 mm cube and transplanted under the back skin of each of ten C3H / He mice of the same strain as above (7 weeks old, male nets). Fixation and tumor multiplication were confirmed seven days after transplantation. 5 of the mice were administered each subcutaneous anti-cancer agent no 1 as prepared above under I. at a dose of 3 µl per day at two day intervals. The remaining 5 mice were used as untreated control animals. Ten days after the first administration, the tumor was excised by surgery and the average weight was measured. At the same time, patho-histological examination was performed.
Tumorvolume:Tumor volume:
Toegediende groep 22,3 mm3 (figuur 14) 5 Kontrole 162,7 mm3 (figuur 15).Infused group 22.3 mm3 (figure 14) 5 Control 162.7 mm3 (figure 15).
Dit betekent dat er een 86,3% vermindering in de tumor optrad.This means that there was an 86.3% reduction in the tumor.
Pathohistologisch onderzoek:Pathohistological examination:
In de kontrolegroep (figuur 16) waren vogel-10 nestlichamen van kanker gevormd, bet weefseltype was gelijk aan medullaire canaliculaire kanker en de multiplikatie van tumorcellen werd over bet gehele weefsel waargenomen. Ander-zijds veroorzaakten de kankercellen in de met het middel be-handelde groep (figuur 17) vervloeiingsnecrose op de plekken, 15 waar de kankercellen waren gevormd en er trad verkalking en firose op onder achterlating van slecbts een zeer beperkte boeveelheid kankercellen. Aldus werden de antitumoreigenschap-pen van het antikankermiddel van de uitvinding waargenomen.In the control group (Figure 16), bird-nest cancer bodies were formed, the tissue type was equal to medullary canalicular cancer, and the multiplication of tumor cells was observed over the entire tissue. On the other hand, the cancer cells in the drug-treated group (Figure 17) caused liquefaction necrosis at the sites where the cancer cells were formed and calcification and firosis occurred leaving only a very limited amount of cancer cells. Thus, the anti-tumor properties of the anti-cancer agent of the invention were observed.
Proefvoorbeeld I.Test example I.
20 GRA-1-K-T (1 yUl) als verkregen in voorbeeld I werd gebracht op een mikroplaat (geproduceerd door Falcon Corp.) en men liet bet geheel 15 minuten bij kamertemperatuur staan. Daarna werd 4 yul FCS (geproduceerd door Falcon Corp.) toegevoegd en men liet het mengsel 30 minuten bij kamertempe-25 ratuur staan. Men voegde met neuraminidase behandelde rode bloedcellen van schapen (SRBC^) ingesteld op een getal vanGRA-1-K-T (1 µL) as obtained in Example I was applied to a microplate (manufactured by Falcon Corp.) and left to stand at room temperature for 15 minutes. Then 4 µl FCS (produced by Falcon Corp.) was added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Sheep neuraminidase-treated red blood cells (SRBC4) were adjusted to a number of
1 x 10 per milliliter en 5 yul 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2), waaraan 0,85% NaCl was toegevoegd, toe en onderwierp de plaat aan een centrifugaalscheiding bij 600 rpm gedurende 5 minuten.Add 1 x 10 per milliliter and 5 µl of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.2), to which 0.85% NaCl was added, and centrifuged the plate at 600 rpm for 5 minutes.
30 De plaat werd daarna omgekeerd en niet gereageerd hebbendThe plate was then inverted and unresponsive
NN
SRBC werd verwijderd. Een verfoplossing (Brilliant Cresyl Blue, van Merck & Co.) werd ter kleuring van de lymfocyten toegevoegd en men zag een positief rosetteeffekt. Aldus werd gevonden, dat tenminste 98% rosettevorming positief is 35 (T-cellen).SRBC was removed. A dye solution (Brilliant Cresyl Blue, from Merck & Co.) was added to stain the lymphocytes and a positive rosette effect was observed. Thus, it was found that at least 98% rosette formation is positive (T cells).
8202638 - 26 -8202638 - 26 -
Proefvoorbeeld IITest example II
Specifieke kankercellen dodende werking. a. Van de in tabel A getoonde cellen werden de volgende vijf celstammen met verschillende GRA positief 5 verhoudingen gebruikt als menselijke doelwitkankercellen.Specific cancer cells killing effect. a. Of the cells shown in Table A, the following five cell strains with different GRA positive ratios were used as human target cancer cells.
Doelwitkankercellen:Target cancer cells:
No. 1 BT-1 (Burkittlymfoom)No. 1 BT-1 (Burkitt's lymphoma)
No. 2 Daudi (Burkittlymfoom)No. 2 Daudi (Burkitt's lymphoma)
No. 3 KATO-III (maagkanker) 10 No. 4 MKN-45 (maagkanker)No. 3 KATO-III (gastric cancer) 10 No. 4 EQS-45 (gastric cancer)
No. 5 MOLT (T-cel leukemie).No. 5 MOLT (T cell leukemia).
Op een mikroplaat (geproduceerd door FalconOn a micro plate (produced by Falcon
Corp.), werden 5 x 10^ per put doelwitkankercellen gelami- neerd volgens een centrifugaal procedure bij 800 rpm gedurende 3 15 5 minuten. Daama werd 4 x 10 per put GRA-1“K-T als verkregen in voorbeeld langzaam toegevoegd en 1 uur geinkubeerd.Corp.), 5 x 10 4 per well of target cancer cells were laminated according to a centrifugal procedure at 800 rpm for 3 minutes. Then 4 x 10 per well of GRA-1 "K-T as obtained in Example was slowly added and incubated for 1 hour.
De dodende werking werd bepaald volgens de mate van plaatjesvorming en werd als volgt beoordeeld: ++ dodende werking wordt duidelijk waargeno- 20 men.The killing activity was determined according to the degree of platelet formation and was evaluated as follows: ++ killing activity is clearly observed.
+ dodende werking waargenomen.+ killing effect observed.
± dodende werking enigszins waargenomen.± killing effect slightly observed.
- dodende werking niet waargenomen.- killing effect not observed.
In een kontrolegroep werden ongesensitiseerde 25 menselijke periferaal bloedlymfocyten gebruikt, die op dezelf- de wijze als in voorbeeld I waren verkregen, behalve dat er geen GRA was gebruikt. De resultaten zijn weergegeven in tabel F.Unsensitized human peripheral blood lymphocytes obtained in the same manner as in Example 1 were used in a control group, except that no GRA was used. The results are shown in Table F.
Uit tabel F blijkt, dat de dodende T-cellen, 30 die volgens de werkwijze van de uitvinding zijn geproduceerd een sterke GRA specifieke cytotoxische werking hebben.Table F shows that the killing T cells produced according to the method of the invention have a strong GRA specific cytotoxic activity.
35 8202638 - 27 -35 8202638 - 27 -
TABEL FTABLE F
Doelwitkanker- GRA-positief Bepaling plaat- eel______ verhouding (%) j esvorming_ GRA-1-K-T Daudi (fig. D 93,1 ++ (fig. 2) 5 §roep KATO-III (fig. 3) 57,3 + (fig. 4) BT-1 (fig. 5) 50,1 ++ (fig. 6) MKN-45 (fig. 7) 1,0 ± (fig. 8) MOLT (fig. 9) 0,6 - (fig.10)Target cancer- GRA positive Determination of platelet ratio ___ ratio (%) of formation _ GRA-1-KT Daudi (fig. D 93,1 ++ (fig. 2) 5 §group KATO-III (fig. 3) 57,3 + (Fig. 4) BT-1 (Fig. 5) 50.1 ++ (Fig. 6) MKN-45 (Fig. 7) 1.0 ± (Fig. 8) MOLT (Fig. 9) 0.6 - (fig. 10)
Kontrole- BT-1 50,1 - (fig.11)Control- BT-1 50.1 - (Fig. 11)
Ϊ o §roeP§ o §roeP
b. Dezelfde doelwitkankercellen als gebruikt 6 5 onder a. boven (3,2 x 10 ) werden vermengd met 8 x 10 GRA- 1-K-T (celverhouding: 5/1) en het resulterende cellenmengsel 6 (totaalgetal: 4 x 10 ) werd gekweekt op een RFMI-1640 medium, 15 dat 15% FCS bevatte. Na een uur werd het aantal overblijvende cellen geteld en het % cytotoxiciteit werd berekend met <ie volgende vergelijking: aantal cellen na % cytotoxiciteit = (1 - (---- 1 ........... ) x 100).b. The same target cancer cells as used 6 5 under a. Above (3.2 x 10) were mixed with 8 x 10 GRA-1-KT (cell ratio: 5/1) and the resulting cell mixture 6 (total number: 4 x 10) was grown at an RFMI-1640 medium, containing 15% FCS. After one hour, the number of remaining cells were counted and the% cytotoxicity was calculated by the following equation: number of cells after% cytotoxicity = (1 - (---- 1 ...........) x 100 ).
20 aantal cellen voor kweek (4 x 10^)20 cell count for culture (4 x 10 ^)
De resultaten worden gegeven in tabel G.The results are given in Table G.
TABEL GTABLE G
25 _Aantal cellen25 _Number of cells
Doelwit- Voor Na % Cytotoxi- cellen kweek kweek citeit_Target- Before Na% Cytotoxi cells culture culture city_
Daudi 4 x 106 2,9 x 106 91 r £ KATO-III 4 x 10 3,7 x 10 24 30 BT-1 - 4 x 106 3,2 x 106 65 MKN-45 4 x 106 3,9 x 106 7,2 MOLT 4 x 106 4,2 x 106 -3 c. De procedure van b. boven werd herhaald 35 met uitzondering, dat de mengverhouding van GRA-1-K-T tot 8202638 - 28 - doelwitkankercellen werd veranderd in 5/3. De resultaten wor-den gegeven in tabel H.Daudi 4 x 106 2.9 x 106 91 r £ KATO-III 4 x 10 3.7 x 10 24 30 BT-1 - 4 x 106 3.2 x 106 65 EQS-45 4 x 106 3.9 x 106 7 .2 MOLT 4 x 106 4.2 x 106 -3 c. The procedure of b. above was repeated except that the mixing ratio of GRA-1-K-T to 8202638-28 target cancer cells was changed to 5/3. The results are given in Table H.
TABEL HTABLE H
5 _Aantal cellen_5 _ Number of cells_
Doelwit- Voor Na % Cytotoxi- cellen kweek kweek citeit_Target- Before Na% Cytotoxi cells culture culture city_
Daudi 4 x 106 3,6 x 105 91 KATO-III 4 x 106 3,6 x 106 24 10 BT-1 4 x 106 1,4 x 106 65 MKN-45 4 x 106 3,7 x 106 7,2 MOLT 4 x 106 4,1 x 106 -3Daudi 4 x 106 3.6 x 105 91 KATO-III 4 x 106 3.6 x 106 24 10 BT-1 4 x 106 1.4 x 106 65 EQS-45 4 x 106 3.7 x 106 7.2 MOLT 4 x 106 4.1 x 106 -3
Bij bovenstaande proef werd waargenomen, 15 dat GBA-1-K-T een sterk bindende aktiviteit uitoefent opIn the above experiment it was observed that GBA-1-K-T exerts a strong binding activity on
Daudi, KATO-III en BT-1, maar slechts een geringe bindende werking op MKN-45 en MOLT.Daudi, KATO-III and BT-1, but only a minor binding effect on MKN-45 and MOLT.
Proefvoorbeeld IIITest Example III
C3H/He aan spontane borstkanker lijdende 20 muizen ontvingen subcutaan GRA-M-1-K-T als verkregen in voor- g beeld II in een dosis van 3 x 10 /0,3 ml/muis 3 maal per week, om de dag. Na 10 dagen werd de focus uitgenomen en on-derzocht.C3H / He 20 spontaneous breast cancer patients received GRA-M-1-K-T subcutaneously as obtained in Example II at a dose of 3 x 10 / 0.3 ml / mouse 3 times a week every other day. After 10 days, the focus was removed and examined.
Zoals in figuur 12 wordt getoond trad er 25 infiltratie van lymfocyten in kankercellen op en werd er breuk in het tumorgebied waargenomen. Ook blijkt uit figuur 13, dat werd waargenomen, dat er verkalking van het tumorgebied optrad en dat men dus kan zien, dat de dodende cellen van de uitvinding antitumorwerking hebben.As shown in Figure 12, lymphocyte infiltration into cancer cells occurred and fracture in the tumor region was observed. It is also apparent from Figure 13 that it was observed that calcification of the tumor area occurred and thus it can be seen that the killing cells of the invention have anti-tumor activity.
30 Vergelijkend voorbeeld IComparative Example I
In dit voorbeeld werden kankercellen als zodanig als specifieke antigenen bij de werkwijze van de uitvinding gebruikt in plaats van GRA.In this example, cancer cells as such were used as specific antigens in the method of the invention in place of GRA.
Er werden voor kankercellen gevoelig gemaakte 35 lymfocyten verkregen op dezelfde wijze als in voorbeeld I, 8202638 * t - 29 - behalve dat in plaats van GEA gebruik werd gemaakt van BT-1,Lymphocytes sensitized to cancer cells were obtained in the same manner as in Example 1, 8202638 * t - 29 - except that BT-1 was used instead of GEA,
Daudi, KATO-III of MKN-45 in een hoeveelheid van 1x10"* per laboratoriumschaal.Daudi, KATO-III or MKN-45 in an amount of 1x10 "* per laboratory scale.
Bij deze lymfocyten werd de cytotoxische 5 werking onderzocht op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld IIIn these lymphocytes, the cytotoxic activity was examined in the same manner as in test example II
onder a. De resultaten worden gegeven in tabel I.under a. The results are given in Table I.
Uit tabel I ziet men, dat de boven bereide lymfocyten geen enkele cytotoxische werking hebben.It can be seen from Table I that the lymphocytes prepared above do not have any cytotoxic activity.
10 TABEL I10 TABLE I
Celle voor gebruik bij sensitisering van lymfocyten.__Cell for use in lymphocyte sensitization .__
Doelwitcellen BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 BT-1 15 Daudi ---- KATO-III -- MKN-45 ----Target cells BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 BT-1 15 Daudi ---- KATO-III - MKN-45 ----
Proefvoorbeeld IVTest example IV
20 Op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld IIIn the same manner as in test example II
onder b. werd de kankercel dodende werking van GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T en GRA-3-C-K-T, verkregen in voorbeeld I bepaald.under b. the cancer cell killing activity of GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T and GRA-3-C-K-T obtained in Example 1 was determined.
De resultaten worden gegeven in tabel J.The results are shown in Table J.
25 TABEL J25 TABLE J
_Cytotoxiciteit__Cytotoxicity_
Doelwitcellen GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GKA-3-C-K-TTarget cells GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GKA-3-C-K-T
KATO-III 8,0 5,0 5,0 BT-1 4,3 5,0 4,0 30 MKN-45 20 5,0 20 MOLT 000KATO-III 8.0 5.0 5.0 BT-1 4.3 5.0 4.0 30 EQS-45 20 5.0 20 MOLT 000
Proefvoorbeeld VTest example V
a. De cytotoxiciteit van elk van de dodende 35 cellenpreparaten, verkregen in voorbeeld VI, werd bepaald 8202638 51 - 30 - met de Cr afgifteproef (J. Immunol. 122, 2527-2533 (1979).a. The cytotoxicity of each of the killing cell preparations obtained in Example VI was determined 8202638 51-30 by the Cr release assay (J. Immunol. 122, 2527-2533 (1979).
5151
Dat wil zeggen 50 ,uCi radioaktief Cr (Japan Isotope Asso- ' 7 ciation) werd toegevoegd aan KATO-III (2x10) en de cellen werden 1 uur bij 37°C geinkubeerd in RPMI-1640 medium en voor 51 5 het verkrijgen van met Cr-gemerkte doelwitcellen voldoende gewassen door centrifugering. Dodende cellen (effektorcellen) 6 5 (2 x 10°) werden toegevoegd aan de doelwitcellen (1 x 10J) (aldus E/T = 20/1) en het mengsel werd 4 uur bij 37°C geinkubeerd in RPMI-1640 medium. De bovenstaande vloeistof werd 10 afgecentrifugeerd en haar radioaktiviteit werd bepaald door vloeistofskintillatietelling.That is, 50 µCi radioactive Cr (Japan Isotope Asso- 7 ciation) was added to KATO-III (2x10) and the cells were incubated in RPMI-1640 medium for 1 hour at 37 ° C and obtained with 51 Cr-labeled target cells washed sufficiently by centrifugation. Killing cells (effector cells) 6 (2 x 10 °) were added to the target cells (1 x 10J) (thus E / T = 20/1) and the mixture was incubated in RPMI-1640 medium at 37 ° C for 4 hours. The supernatant was centrifuged off and its radioactivity was determined by liquid quintillation counting.
5151
De specifieke Cr afgifte (%) die overeen-komt met de cytolitische werking van effektorcellen werd berekend volgens de volgende vergelijking.The specific Cr release (%) corresponding to the cytolytic activity of effector cells was calculated according to the following equation.
15 Specifieke ~^Cr afgifte (%) (afgifte bij proef) - (spontane afgifte) χ (maximum afgifte) - (spontane afgifte) (De maximum afgifte betekent de radioaktiviteit wanneer alle cellen gelyceerd worden).15 Specific ~ ^ Cr release (%) (trial release) - (spontaneous release) χ (maximum release) - (spontaneous release) (The maximum release means the radioactivity when all cells are lysed).
20 De verkregen resultaten worden gegeven in tabel K.The results obtained are given in Table K.
TABEL KTABLE K
5151
Dodende cellen Specifieke Cr afgifte (%) 25 GRA-1-K-T-1 13 GRA-1-K-T-2 25 GRA-1-K-T-3 22 GRA-1-K-T-4 20 GRA-1-K-T-5 22 30 GRA-1-K-T-6 25 GRA-1-K-T-7 27 GRA-1-K-T-8 32Killing cells Specific Cr release (%) 25 GRA-1-KT-1 13 GRA-1-KT-2 25 GRA-1-KT-3 22 GRA-1-KT-4 20 GRA-1-KT-5 22 30 GRA-1-KT-6 25 GRA-1-KT-7 27 GRA-1-KT-8 32
Uit de resultaten van tabel K blijkt, dat 35 TCGF en FCS geen verband houden met de opwekking van dodende 8202638 - 31 - * *> ψ cellen.The results of Table K show that 35 TCGF and FCS are not related to the generation of killing 8202638 - 31 * *> ψ cells.
b. De cytotoxiciteit van, GRA-2-K-T, verkre- .. 51 gen bij voorbeeld III werd bepaald volgens Cr afgifte- proef op dezelfde wijze als boven onder a. Een specifieke ^Cr . 51 5 afgifte van 14,3% werd waargenomen aan met Cr gemerkt KATO- III als doelwitcellen (E/T = 20/1).b. The cytotoxicity of GRA-2-K-T, 51 gene in Example III was determined by Cr release assay in the same manner as above under a. A specific Cr. Release of 14.3% was observed on Cr-labeled KATO-III as target cells (E / T = 20/1).
Proefvoorbeeld VITest example VI
a. Onder gebruikmaking van KATO-III (E/T = 20/1) als doelwitcellen werd de cytotoxiciteit van in voor- 10 beeld VII onder a. verkregen dodende cellen bepaald op de zelfde wijze als in proefvoorbeeld II onder b.a. Using KATO-III (E / T = 20/1) as target cells, the cytotoxicity of killing cells obtained in Example VII under a. was determined in the same manner as in Example 2 under b.
De resultaten worden gegeven in onderstaande tabel L.The results are given in Table L below.
15 TABEL L15 TABLE L
Dodende cellen % Cytotoxiciteit GRA-3-K-T-1 38,0 GRA-3-K-T-2 18,2 GRA-3-K-T-3 20,9 20 GRA-3-K-T-4 23,2 GRA-3-K-T-5 24,5 GRA-3-K-T-6 20,2Killing cells% Cytotoxicity GRA-3-KT-1 38.0 GRA-3-KT-2 18.2 GRA-3-KT-3 20.9 20 GRA-3-KT-4 23.2 GRA-3-KT -5 24.5 GRA-3-KT-6 20.2
b. De cytotoxiciteit van in voorbeeld VIIb. The cytotoxicity of Example VII
5151
25 onder b. verkregen GRA-3-K-T-7 werd bepaald met Cr-KATO-III25 under b. GRA-3-K-T-7 obtained was determined with Cr-KATO-III
(E/T = 20/1) als doelwitcellen op dezelfde wijze als in . 51 proefvoorbeeld V. De specifieke Cr afgifte van de dodende cellen bleek 25,5% te zijn.(E / T = 20/1) as target cells in the same manner as in. Test Example V. The specific Cr release of the killing cells was found to be 25.5%.
Proefvoorbeeld VIITest example VII
30 De cytotoxiciteit van de in voorbeeld VThe cytotoxicity of the Example V
51 verkregen dodende cellen werd bepaald met de Cr afgifte- proef op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld V. De gebraikte 51 doelwitcellen waren met Cr-gemerkte X5563 cellen. Als kon- trole werden lymfocyten gebruikt, verkregen op dezelfde wijze 35 als in voorbeeld V, behalve dat sensitisering van miltcellen 8202638 - 32 - werd uitgevoerd met 1 x 10^/put met mitocyne C-behandelde g X5563 cellen (5 x 10 /ml X5563 cellen werden 60 minuten be-handeld met 50 ^ug/ml mitomycine C) in plaats van GRA-M-5 te gebruiken.51 killing cells obtained were determined by the Cr release assay in the same manner as in Test Example V. The 51 target cells used were Cr-labeled X5563 cells. Lymphocytes obtained in the same manner as in Example V were used as control, except that sensitization of spleen cells 8202638 - 32 - was performed with 1 x 10 4 / well mitocyne C-treated g X5563 cells (5 x 10 / ml X5563 cells were treated with 50 µg / ml mitomycin C) for 60 minutes instead of using GRA-M-5.
5 De verkregen resultaten zijn weergegeven in onderstaande tabel M.The results obtained are shown in Table M below.
TABEL M 51TABLE M 51
Specrfieke Gr afgifte 10 E/T verhoudingSpecific Gr release 10 E / T ratio
Dodende cellen 40:1 20:1 10:1 GRA-M-5-K-T-1 12,7 6,3 5,7 GRA-M-5-K-T-2 18,4 20,6 13,7Killing cells 40: 1 20: 1 10: 1 GRA-M-5-K-T-1 12.7 6.3 5.7 GRA-M-5-K-T-2 18.4 20.6 13.7
Kontrole 0,0 0,0 0,0 15Control 0.0 0.0 0.0 15
Proefvoorbeeld VIII (H-2 proef) GRA-M-1, GRA-M-3 en GRA-M-4, verkregen in bovenstaand referentievoorbeeld II, werden in serie verdund met PBS (0,85% NaCl) teneinde monsters te bereiden.Test Example VIII (H-2 Test) GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 obtained in Reference Example 2 above were serially diluted with PBS (0.85% NaCl) to prepare samples.
20 Anti-H-2 serum van National Institute of20 Anti-H-2 serum from National Institute of
Genetic Research en bovenstaand monster werden vermengd en 2 uur bij 4°C geinkubeerd waama men doelwitcellen toevoegde overeenkomend met het gebruikte anti-H-2-serum. Miltcellen of lymfekliercellen, die op de gebruikelijke wijze van 25 B10 (H-2 ) en B10.Br (H-2^) muizen waren verkregen, werden als doelwitcellen gebruikt. Nadat de cellen met PBS waren gewassen werd komplement (konijn) aan de cellen toegevoegd en werden de cellen 1 uur bij 37°C geinkubeerd en gevlekt met 0,2% tryptaan blauw-PBS ter bepaling van % cytotoxiciteit.Genetic Research and the above sample were mixed and incubated for 2 hours at 4 ° C adding target cells corresponding to the anti-H-2 serum used. Spleen cells or lymph node cells obtained in the usual manner from B10 (H-2) and B10.Br (H-21) mice were used as target cells. After the cells were washed with PBS, complement (rabbit) was added to the cells and the cells were incubated at 37 ° C for 1 hour and stained with 0.2% tryptane blue-PBS to determine% cytotoxicity.
30 Het anti-H-2-serum werd in een zodanige maximum verdunning gebruikt, dat het tenminste 95% cytotoxiciteit vertoonde in afwezigheid van GRA.The anti-H-2 serum was used in such a maximum dilution that it showed at least 95% cytotoxicity in the absence of GRA.
Het blokkerend effekt door GRA werd bepaald voor in onderstaande tabel N getoonde systemen.The blocking effect by GRA was determined for systems shown in Table N below.
35 820263835 8202638
FF
% I% I
- 33 -- 33 -
TABEL NTABLE N
GRA Anti-H~2-serum, concentratie Doelwitcellen GRA-M-1 D-23 (anti-H-2Kk), X80 B10BR (H-2k) D-32 (anti-H-2Dk), X300 miltcellen 5 GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb), X600 B10 (H-2b) T. of D-" (anti-H-2D ), X80 miltcellen GRA-M-4 D-23 , X80 B10.BR (h-2k) of D-32 , X300 lymfekliercellen 10 De verkregen resultaten worden gegeven in tabel 0.GRA Anti-H ~ 2 serum, target cell concentration GRA-M-1 D-23 (anti-H-2Kk), X80 B10BR (H-2k) D-32 (anti-H-2Dk), X300 spleen cells 5 GRA- M-3 D-33 (anti-H-2Kb), X600 B10 (H-2b) T. or D- "(anti-H-2D), X80 spleen cells GRA-M-4 D-23, X80 B10.BR (h-2k) or D-32, X300 lymph node cells. The results obtained are given in Table 0.
TABEL 0 % Cytotoxiciteit 15 Anti-H-2 _Verdunning van monster _ GRA serum X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 0 * I - - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13 D-23 - 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14 D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 20 Π 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14 D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15 D“2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17 III D-23 100 100 100 100 --- - - 100 10 D32 99 99 99 99 -- - - - 99 10 25 Opmerkingen: GRA I : GRA-M-1 GRA II : GRA-M-3 GRA III: GRA-M-4 * betekent % cytotoxiciteit wannear alleen komplement werd gebruikt.TABLE 0% Cytotoxicity 15 Anti-H-2 _ Dilution of sample _ GRA serum X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 0 * I - - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13 D-23 - 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14 D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 20 Π 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14 D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15 D “2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17 III D-23 100 100 100 100 --- - - 100 10 D32 99 99 99 99 - - - - 99 10 25 Remarks: GRA I: GRA-M-1 GRA II: GRA -M-3 GRA III: GRA-M-4 * means% cytotoxicity when only complement was used.
3030
Uit de resultaten van bovenstaande tabel 0 kan men zien, dat GRA-M-1, GRA-M-3 en GRA-M-4 H-2 missen.From the results of Table 0 above, it can be seen that GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 lack H-2.
Proefvoorbeeld IXTest Example IX
35 C57BL/6 muizen ontvingen subcutane transplan- 8202638 - 34 - tatie van LLC (2 x 10 ) van dezelfde stam en na 6 dagen werd subcutaan 1 mg (proteine) GRA-M-3, verkregen in referentie-voorbeeld II onder d. toegediend. Daama werd de toediening gedurende 4 dagen 1 maal daags herhaald bij dezelfde dosis.C57BL / 6 mice received subcutaneous transplantation of LLC (2 x 10) from the same strain and after 6 days 1 mg (protein) GRA-M-3, obtained in Reference Example II under d. administered. Then the administration was repeated once a day at the same dose for 4 days.
5 De dag na de laatste toediening werden tumorcellen uitge- sneden en gewogen. Ter kontrole gebruikte men dieren, waar-aan fysiologisehe zoutoplossing was toegediend. Elke proef-groep omvatte 5 dieren.Tumor cells were excised and weighed the day after the last administration. Animals to which physiological saline had been administered were used as a control. Each test group included 5 animals.
Als resultaat vond men een gemiddeld tumor-10 gewicht van de kontrolegroep van ongeveer 500 mg. In de groep, waaraan GRA-M-3 was toegediend, vertoonden drie dieren ver-dwijning van tumor en twee hadden een gemiddeld tumorgewicht van 100 mg.As a result, an average tumor-10 weight of the control group was found to be approximately 500 mg. In the group administered GRA-M-3, three animals had tumor disappearance and two had an average tumor weight of 100 mg.
Proefvoorbeeld XTest example X
15 C57BL/6 muizen werden gedurende drie dagen 1 maal daags subcutaan geimmuniseerd met 1 ng (proteine) GRA-M-3, verkregen in referentievoorbeeld II onder d. en op dag 5 werden miltcellen van het dier gewonnen teneinde effektorcellen te verkrijgen. Er werd een mengsel bereid van 20 de effektorcellen en Lewis longcarcinoom (LLC) als doelwit- cellen in een verhouding van E/T = 50:1 en een portie 5 (1 x 10 ) daarvan werd getransplanteerd bij muizen van dezelfde stam en men voerde de proef van Winn uit (J. Immunol.C57BL / 6 mice were immunized subcutaneously with 1 ng (protein) GRA-M-3, obtained in Reference Example II under d, once daily for three days. and spleen cells were harvested from the animal on day 5 to obtain effector cells. A mixture of effector cells and Lewis lung carcinoma (LLC) as target cells at a ratio of E / T = 50: 1 was prepared and a 5 (1 x 10) portion thereof was transplanted into mice of the same strain and fed Winn's experiment (J. Immunol.
86, biz. 228-239 (1961)).86, biz. 228-239 (1961)).
25 De verkregen resultaten zijn weergegeven in onderstaande tabel P.The results obtained are shown in Table P below.
TABEL PTABLE P
Effektor- Tumorgroei (%) Dag 20 mor- taliteit/ 30 cel_ Dag 15 Dag 17 Dag 18 Dag 19 Dag 20 groep A 5,7 5,5 5,7 3,1 1,4 0/10 B 21,4 39,5 37,1 55,4 76,8 4/10 C 39,3 65,1 61,7 98,1 96,4 4/10Effector Tumor growth (%) Day 20 mortality / 30 cell_ Day 15 Day 17 Day 18 Day 19 Day 20 group A 5.7 5.5 5.7 3.1 1.4 0/10 B 21.4 39. 5 37.1 55.4 76.8 4/10 C 39.3 65.1 61.7 98.1 96.4 4/10
Opmerkingen: 35 Groep A zijn miltcellen van GRA-M-3 immune 8202638Comments: Group A are spleen cells of GRA-M-3 immune 8202638
• I• I
- 35 - muizen.- 35 - mice.
Groep B zijn miltcellen van normale muizen.Group B are spleen cells from normal mice.
Groep C zijn miltcellen van muizen 10 dagen g na transplantatie van LLC (1 x 10 ).Group C are mouse spleen cells 10 days g after transplantation of LLC (1 x 10).
5 De Tumorgroei werd berekend volgens de vol- gende vergelijking:Tumor growth was calculated according to the following equation:
T - TT - T
Tumorgroei (%) = —--— x 100Tumor growth (%) = ——— x 100
TT
NN
waarin T. de dikte voorstelt van de voetzool aan de kant waar Awhere T. represents the thickness of the sole of the foot on the side where A
10 de tumor getransplanteerd werd en T^. de dikte voorstelt van de normale voetzool.10 the tumor was transplanted and T ^. represents the thickness of the normal sole of the foot.
Proefvoorbeeld XITest example XI
C3H/He muizen werden geimmuniseerd met 4,5 ^ug (proteine) van GRA-M-4, verkregen in referentievoorbeeld 15 II onder d. en 0,1 ml kompleet toevoegsel van Freund bij het sacrococcygeale gedeelte. Na twee weken werden op de gebrui-kelijke wijze lymfekleircellen gewonnen en gebruikt als responsiecellen voor het bepalen van proliferatieve respons bij GRA-M-4.C3H / He mice were immunized with 4.5 µg (protein) of GRA-M-4 obtained in Reference Example 15 II under d. and 0.1 ml complete Freund's additive at the sacrococcygeal portion. After two weeks, lymph nodes were collected in the usual manner and used as response cells to determine proliferative response in GRA-M-4.
20 Voor dit doel werden responsiecellen (5 x 10^) 5 dagen in aanwezigheid van GRA-M-4 geinkubeerd in RPMI-1640 medium, dat 15% FCS bevatte. Tijdens de laatste 18 uur van 3 3 de inkubatieperiode werd 1^uCi H-thymidine ( H-TdR) aan het medium toegevoegd en de opneming daarvan in de cellen geteld.For this purpose, response cells (5 x 10 ^) were incubated in RPMI-1640 medium containing 15% FCS for 5 days in the presence of GRA-M-4. During the last 18 hours of the incubation period, 1 uCi H-thymidine (H-TdR) was added to the medium and its uptake counted in the cells.
25 De verkregen resultaten worden gegeven in onderstaande tabel Q.The results obtained are given in Table Q below.
TABEL QTABLE Q
Concentratie 3H-TdR. opneming GRA-M-4 (ng/ml) (gemiddeld cpm + S.E.) S.I.Concentration 3H-TdR. incorporation GRA-M-4 (ng / ml) (mean cpm + S.E.) S.I.
30 Kontrole 0 5.302+1.761 - - 0,5 7.903 ± 1.290 1,5 1 10.076 ± 936 1,930 Control 0 5,302 + 1,761 - - 0.5 7,903 ± 1,290 1.5 1 10,076 ± 936 1.9
Experiment 5 10.686 ± 429 2,0 20 10.615 ± 1.270 2,0 35 40 8.565 + 1.419 1,6 8202638 « - 36 -Experiment 5 10,686 ± 429 2.0 20 10,615 ± 1,270 2.0 35 40 8,565 + 1,419 1.6 8202638 «- 36 -
Opmerking: "S.I." betekent stimulatieindex in termen van experiment/kontrole.Note: "S.I." means stimulation index in terms of experiment / control.
Proefvoorbeeld XIITest example XII
Men bepaalde hypersensitiviteitrespons / 5 van het vertraagde type (DTH) van normale C3H/He muizen, X5563 immune muizen en MH134 immune muizen, verkregen op dezelfde wijze als in voorbeeld V en GRA-M-4 immune muizen en GRA-M-5 immune muizen, verkregen op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld XI door voetzoolreaktie (FPR). Dat wil 10 zeggen met GRA of MMC behandelde tumorcellen werden geent op de voetzoolhuid van de achterpoot van het dier en de zwel- ling van de voetzool werd 24 uur na de enting bepaald. De DTH respons werd berekend door de zwelling voor de enting -2 af te trekken van die na enting (10 mm).Delayed type (DTH) hypersensitivity response (DTH) of normal C3H / He mice, X5563 immune mice and MH134 immune mice was obtained in the same manner as in Example V and GRA-M-4 immune mice and GRA-M-5 immune mice, obtained in the same manner as in Test Example XI by footpad reaction (FPR). That is, tumor cells treated with GRA or MMC were seeded on the footpad skin of the hind leg of the animal and the swelling of the footpad was determined 24 hours after inoculation. The DTH response was calculated by subtracting the swelling before the inoculation -2 from that after the inoculation (10 mm).
15 De verkregen resultaten zijn weergegeven in tabellen R-V.The results obtained are shown in Tables R-V.
TABEL RTABLE R
-2 _Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)-2 _ Average footpad swelling (10 mm)
Enting Normale muizen ME134 Immune muizen 20 1 2,8 13,6 2 12,4 32,0 3 3,6 3,6 4 3,2 22,0 5 6,8 27,0 25 Opmerkingen: gInoculation Normal mice ME134 Immune mice 20 1 2.8 13.6 2 12.4 32.0 3 3.6 3.6 4 3.2 22.0 5 6.8 27.0 25 Remarks: g
Groep 1: syngeneisch normale milt 1 x 10 / 20 ,ul medium (Hanks oplossing).Group 1: syngeneic normal spleen 1 x 10/20 ul medium (Hanks solution).
/ g/ g
Groep 2: MH134 cel 1 x 10 /20 ^ul medium. Groep 3: medium 20 ^ul.Group 2: MH134 cell 1 x 10/20 µl medium. Group 3: medium 20 µl.
30 Groep 4: GRA-M-4, 0,8 ^ug (proteine)/20 ^ul medium.Group 4: GRA-M-4, 0.8 µg (protein) / 20 µl medium.
Groep 5: „ 0,4 yUg „ !! · 35 8202638 - 37 -Group 5: „0.4 yUg„ !! 35 8202638 - 37 -
TABEL STABLE S
_2 _Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)__2 _ Average footpad swelling (10 mm) _
Eating Normale muizen X5563 immune muizen MH134 immune muizen I 5,4 4,3 1,1 5 2 0,9 - 24,3 3 2,0 16,9Eating Normal mice X5563 immune mice MH134 immune mice I 5.4 4.3 1.1 5 2 0.9 - 24.3 3 2.0 16.9
Opmerkingen:Comments:
Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yUl.Group 1: medium (Hanks solution) 20 yUl.
Groep 2: GRA-M-4, 4 yUg (proteine)20 yul 10 medium.Group 2: GRA-M-4, 4 yUg (protein) 20 yul 10 medium.
Groep 3: GRA-M-5, „ „ „Group 3: GRA-M-5, „„ „
IIII
TABEL TTABLE T
15 -215 -2
Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)Average footpad swelling (10 mm)
Enting Normale muizen GRA-M-4, immune muizen 1 1,7 -0,3 2 5,1 24,6Inoculation Normal mice GRA-M-4, immune mice 1 1.7 -0.3 2 5.1 24.6
Opmerkingen: 20Comments: 20
Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yul.Group 1: medium (Hanks solution) 20 yul.
Groep 2: GRA-M-4, 4 yUg (proteine)/20 yul medium.Group 2: GRA-M-4, 4 yUg (protein) / 20 yul medium.
TABEL UTABLE U
25 . .-225. .-2
Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)Average footpad swelling (10 mm)
Enting Normale muizen GRA-M-4, immune muizen 1 -1,8 0,6 2 6,3 20,0 3 6,8 6,3 30Inoculation Normal mice GRA-M-4, immune mice 1 -1.8 0.6 2 6.3 20.0 3 6.8 6.3 30
Opmerkingen:Comments:
Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yul.Group 1: medium (Hanks solution) 20 yul.
Groep 2: GRA-M-4, 4 yUg (proteine)/20 yul medium.Group 2: GRA-M-4, 4 yUg (protein) / 20 yul medium.
Groep 3: 4 ,ug (proteine/20 ,ul medium fraktie, 35 1 ' 8202638 ο - 38 - die door PNA-kolom was geleid ten tijde van GRA-M-4 (hierna "C.P.").Group 3: 4 µg (protein / 20 µl medium fraction, 35 '8202638 - - 38 - passed through PNA column at the time of GRA-M-4 (hereinafter "C.P.").
TABEL VTABLE V
-2 5 Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)_-2 5 Average footpad swelling (10 mm) _
Enting Normale muizen GRA-M-4, immune muizen 1 2,4 -1,0 2 2,6 17,7 3 2,4 1,8 10 4 5,5 18,9Inoculation Normal mice GRA-M-4, immune mice 1 2.4 -1.0 2 2.6 17.7 3 2.4 1.8 10 4 5.5 18.9
Opmerkingen:Comments:
Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yul. Groep 2: GRA-M-4, 3,8 yUg (proteine)/20 yul medium.Group 1: medium (Hanks solution) 20 yul. Group 2: GRA-M-4, 3.8 yUg (protein) / 20 yul medium.
15 Groep 3: 3,8 yUg (proteine)/20 yul medium "C.P." boven.Group 3: 3.8 yUg (protein) / 20 yul medium "C.P." upstairs.
Groep 4: 3,8 yUg (proteine) GRA-M-4 en 3,8 yUg (proteine)/20 yul medium "C.P.".Group 4: 3.8 yUg (protein) GRA-M-4 and 3.8 yUg (protein) / 20 yul medium "C.P.".
20 Referentieproef♦ X5563 Immune muizen werden op dezelfde ma-nier verkregen als in voorbeeld V. Miltcellen van deze immune muizen werden als effektorcellen gebruikt en de effektor-cellen (10^) en doelwitcellen (X5563, 10 ) werden samen ge-25 transplanteerd op muizen van dezelfde stam. De proef vanReference Test ♦ X5563 Immune mice were obtained in the same manner as in Example V. Spleen cells from these immune mice were used as effector cells and the effector cells (10 ^) and target cells (X5563, 10) were transplanted together on mice of the same strain. The test of
Winn werd op dezelfde wijze uitgevoerd als in proefvoorbeeld X.Winn was performed in the same manner as in Test Example X.
De verkregen resultaten worden getoond in figuur 23, waarin de X-as de dagen aangeeft en de Y-as de 30 gemiddelde tumorafmeting (cm2) ± S.E. en de verschillende tekens het volgende betekenen: # - -> : Groep, waarbij geen effektorcellen werden toegevoegd.The results obtained are shown in Figure 23, in which the X axis indicates the days and the Y axis the mean tumor size (cm2) ± S.E. and the different characters mean the following: # - ->: Group where no effector cells were added.
0-0 : Groep, waarbij niet behandelde 35 effektorcellen werden toegevoegd.0-0: Group, in which untreated effector cells were added.
8202638 ο - 39 - Δ-Δ: Groep, waarin effektorcellen, behandeld met konijnkomplement werden toegevoegd.8202638 ο - 39 - Δ-Δ: Group, in which effector cells treated with rabbit complement were added.
x-x: Groep, waarbij effektorcellen, behandeld met anti-Thy 1 (New England Nuclear Co., U.S.A.) en 5 konijnkomplement werden toegevoegd.x-x: Group, in which effector cells treated with anti-Thy 1 (New England Nuclear Co., U.S.A.) and rabbit complement were added.
0-□: Groep, waarbij effektorcellen, behandeld met anti-Lyt (New England Nuclear Co., II.S.A.) en konijnkomplement werden toegevoegd.0- □: Group, in which effector cells treated with anti-Lyt (New England Nuclear Co., II.S.A.) and rabbit complement were added.
-1: Groep, waarbij effektorcellen, 10 behandeld met anti-Lyt 2 (New England Nuclear Co., U.S.A.) en konijnkomplement werden toegevoegd.-1: Group, in which effector cells treated with anti-Lyt 2 (New England Nuclear Co., U.S.A.) and rabbit complement were added.
Uit de in figuur 23 getoonde resultaten kan men zien, dat Lyt 1 type T-cellen een belangrijke rol spelen bij het mechanisme van in vivo effektor bij tumorimmuniteit. 15 Voorts is het bekend, dat DTH respons wordt bemiddeld door Lyt-1 T-cellen, (J. Exp. Med. 143, biz. 1534-39 (1976)).From the results shown in Figure 23, it can be seen that Lyt 1 type T cells play an important role in the mechanism of in vivo effector in tumor immunity. Furthermore, it is known that DTH response is mediated by Lyt-1 T cells (J. Exp. Med. 143, biz. 1534-39 (1976)).
20 820263820 8202638
Claims (35)
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56156413A JPS5857318A (en) | 1981-10-01 | 1981-10-01 | Production of lymphocytes inhibiting cancer cells |
JP15641481A JPS5857321A (en) | 1981-10-01 | 1981-10-01 | Anticancer agent |
JP15641481 | 1981-10-01 | ||
JP15641381 | 1981-10-01 | ||
JP15847381 | 1981-10-05 | ||
JP56158473A JPS5859923A (en) | 1981-10-05 | 1981-10-05 | Carcinostatic agent |
JP15847281 | 1981-10-05 | ||
JP56158472A JPS5859922A (en) | 1981-10-05 | 1981-10-05 | Cancer cell-disturbing lymphocyte |
JP11116882 | 1982-06-28 | ||
JP57111168A JPS591420A (en) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | Sugar chain-relating antigen and its preparation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL8202638A true NL8202638A (en) | 1983-05-02 |
Family
ID=27526479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL8202638A NL8202638A (en) | 1981-10-01 | 1982-06-30 | Cancer cell-fighting lymphocytes, process for their production and anti-cancer agents, containing these lymphocytes. |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
AR (1) | AR230731A1 (en) |
AT (2) | AT382080B (en) |
AU (1) | AU554858B2 (en) |
BE (1) | BE893704A (en) |
CA (1) | CA1195269A (en) |
CH (2) | CH655660B (en) |
DD (2) | DD209577A5 (en) |
DE (2) | DE3249568A1 (en) |
DK (1) | DK292182A (en) |
FI (1) | FI77157C (en) |
FR (1) | FR2513882B1 (en) |
IL (1) | IL66270A (en) |
IT (1) | IT1189305B (en) |
MX (1) | MX7437E (en) |
NL (1) | NL8202638A (en) |
NO (1) | NO161601C (en) |
NZ (1) | NZ201112A (en) |
PT (1) | PT75148B (en) |
SE (1) | SE8204058L (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60214737A (en) * | 1984-04-06 | 1985-10-28 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Preparation of saccharide chain-related antigen (tca) |
EP0334300A1 (en) * | 1988-03-21 | 1989-09-27 | Neorx Corporation | The use of monoclonal antibodies and conjugates thereof as signals to direct sensitized effector cells to tumor sites |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1193378A (en) * | 1967-04-11 | 1970-05-28 | Rand Dev Corp | Cancer Antigen Complexes |
DE1943699A1 (en) * | 1969-08-28 | 1971-03-04 | Stiftung Onophrio | Medicinal product with an anti-proliferation effect and process for the manufacture of this medicinal product |
YU34005B (en) * | 1970-02-24 | 1978-10-31 | Podvinec Srecko | Process for obtaining bovine lymphatic gland extract |
US4371515A (en) * | 1978-12-26 | 1983-02-01 | E-Y Laboratories, Inc. | Method for forming an isolated lectin-immunological conjugate |
-
1982
- 1982-06-29 DK DK292182A patent/DK292182A/en not_active Application Discontinuation
- 1982-06-29 NZ NZ201112A patent/NZ201112A/en unknown
- 1982-06-29 PT PT75148A patent/PT75148B/en not_active IP Right Cessation
- 1982-06-29 NO NO822215A patent/NO161601C/en unknown
- 1982-06-29 FI FI822325A patent/FI77157C/en not_active IP Right Cessation
- 1982-06-30 AU AU85458/82A patent/AU554858B2/en not_active Ceased
- 1982-06-30 BE BE0/208493A patent/BE893704A/en not_active IP Right Cessation
- 1982-06-30 AR AR289864A patent/AR230731A1/en active
- 1982-06-30 MX MX8210163U patent/MX7437E/en unknown
- 1982-06-30 CH CH398882A patent/CH655660B/de unknown
- 1982-06-30 FR FR8211489A patent/FR2513882B1/en not_active Expired
- 1982-06-30 SE SE8204058A patent/SE8204058L/en not_active Application Discontinuation
- 1982-06-30 DD DD82241290A patent/DD209577A5/en not_active IP Right Cessation
- 1982-06-30 NL NL8202638A patent/NL8202638A/en not_active Application Discontinuation
- 1982-06-30 DD DD82261475A patent/DD221917A5/en not_active IP Right Cessation
- 1982-06-30 CH CH551284A patent/CH655661B/de unknown
- 1982-06-30 IT IT48724/82A patent/IT1189305B/en active
- 1982-07-08 IL IL66270A patent/IL66270A/en unknown
- 1982-09-30 DE DE19823249568 patent/DE3249568A1/en active Granted
- 1982-09-30 DE DE19823236298 patent/DE3236298A1/en active Granted
- 1982-10-01 AT AT0363782A patent/AT382080B/en not_active IP Right Cessation
- 1982-10-01 CA CA000412670A patent/CA1195269A/en not_active Expired
-
1985
- 1985-12-09 AT AT0354585A patent/AT390002B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PT668772E (en) | SPECIFIC MODULE OF THE IMMUNE SYSTEM | |
CN111407753A (en) | Novel compound having therapeutic effect on immune diseases and use thereof | |
JP2009102332A (en) | Immunotherapy for human | |
US10967017B2 (en) | Traditional Chinese medicine composition and use thereof | |
KR20080048536A (en) | Rabbit skin comprising biological active substance and its use | |
GB2106935A (en) | Cancer cell-combatting lymphocytes process, for the production thereof, and anticancer agents containing said lymphocytes | |
CN106729701B (en) | Application of pleurotus ferulae polysaccharide as adjuvant for preparing dendritic cell vaccine | |
NL8202638A (en) | Cancer cell-fighting lymphocytes, process for their production and anti-cancer agents, containing these lymphocytes. | |
US20190070246A1 (en) | Traditional chinese medicine composition and use thereof | |
US20190070236A1 (en) | Traditional chinese medicine composition and use thereof | |
CN110357881B (en) | Extraction process and application of beta-carbolinyl alkaloid in quassia tree | |
FI80711C (en) | Process for Preparing a Therapeutically Useful Thermally The Aturized, Glucoside Binding Antigen (GRA) Linked to Cancer Cells | |
CA1201988A (en) | Cancer cell-combatting lymphocytes, process for the production thereof and anticancer agents containing said lymphocytes | |
KR880001758B1 (en) | Process for preparing lymp cell against cancer | |
JPH0325408B2 (en) | ||
NZ214000A (en) | Method of sensitising lymphocytes to cancer associated antigens | |
JP2005247861A (en) | Mucin peptide having immuno-enhancing characteristic | |
JPWO2005011723A1 (en) | Preventive and / or therapeutic agent for hematopoietic tumor | |
JP3010258B2 (en) | Anti-HIV agent | |
Pasternak et al. | Immunogenicity of soluble extracts from a UV light-induced mouse sarcoma | |
US20040137095A1 (en) | Phytochemotherapy for cancer | |
SU1412596A3 (en) | Method of producing lymphocytes cyto-toxic to cancer cells, and method of producing glyco-bound substance | |
JP2837856B2 (en) | Lymphokine-activated killer cells and method for producing the same | |
WO2000032212A1 (en) | Lak activity potentiator orginating in shiitake mushroom hyphae extract and lak activity potentiating preparations containing the same | |
KR100492940B1 (en) | Composition for promoting anti-cancerous activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
BB | A search report has been drawn up | ||
BC | A request for examination has been filed | ||
BV | The patent application has lapsed |