ES2343673T3 - Activacion de celulas t especificas de antigeno por celulas dendriticas tratadas con virus/antigeno. - Google Patents
Activacion de celulas t especificas de antigeno por celulas dendriticas tratadas con virus/antigeno. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la preparación de una composición que contiene células T activadas que puede realizar y estimular una respuesta inmunoespecífica en un paciente, que comprende las etapas de (i) preparar las células T del paciente o de un pariente del mismo; (ii) activar las células dendríticas por un método que comprende las etapas de (a) preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro, (b) preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo, (c) desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro, (d) coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro, en el que el virus puede mejorar la adhesión del antígeno a y la presentación del antígeno por las células dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células dendríticas; (iii) preparar un agente de activación de las células T que comprende las células dendríticas de la etapa (ii); y (iv) activar las células T de la etapa (i) mediante el tratamiento con el agente de activación de las células T de la etapa (iii) in vitro, en el que las etapas (i), (ii) (a) y (ii) (b) no implican ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser humano o un animal y en el que el pariente del paciente es una persona o un animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.
Description
Activación de células T específicas de antígeno
por células dendríticas tratadas con virus/antígeno.
La presente invención se refiere a un método
para la preparación de una composición que contiene un agente de
activación de células T que contiene células dendríticas (CD)
tratadas con antígeno tratado con virus que puede usarse como una
vacuna para estimular una respuesta inmune en un paciente.
El sistema inmunológico de pacientes con cáncer
y también de los pacientes que padecen enfermedades infecciosas
crónicas, enfermedades autoinmunes, fallo renal con necesidad de
diálisis o disfunciones inmunohereditarias funciona ineficazmente y
necesita ayuda externa. Las causas de esta inmunodeficiencia pueden
ser las propias enfermedades o los defectos externamente inducidos
que incluyen la inmunosupresión por las terapias convencionales
contra el cáncer. Adicionalmente, el reconocimiento de enfermedades
como el cáncer o infecciosas por el sistema inmunológico puede
enfrentarse a obstáculos tales como presentación débil o ineficaz
del antígeno específico para la enfermedad.
Por tanto, la reconstitución de la
inmunocompetencia para antígenos específicos es un objeto de
investigación intensa. La terapia celular por transferencia de
células T específicas de antígeno alogénicas o autólogas activadas
in vitro o la inducción in vivo de dichas células por
procedimientos de vacunación son estrategias actuales que se
dirigen a resolver los problemas de inmunodeficiencia mencionados
anteriormente.
Las células T son linfocitos que pueden
proporcionar ayuda inmunológica específica y no específica para
varios mecanismos inmunes y también puede atacar y erradicar
directamente antígenos celulares extraños o asociados a
enfermedades. Estas pueden desarrollar y/o transferir memoria
inmunológica durante meses y años contra dichos antígenos y por
tanto, son mediadores importantes de la protección inmulógica a
largo plazo.
Las primeras estrategias desarrolladas para
conferir una competencia mejorada a un paciente que padecía de
inmunodeficiencia fueron terapias de transferencia celular adoptiva.
Estas terapias se usaron principalmente para el tratamiento del
cáncer y emplearon en primera instancia los denominados linfocitos
citolíticos activados por linfocinas (LAK) y posteriormente
linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) activados por linfocinas para
la transferencia de autólogos. El término "autólogo" significa
que las células que se transfirieron las originó el mismo paciente.
Los linfocitos citolíticos se generaron a partir de sangre
periférica o de tejido tumoral obtenidos recientes por intervención
quirúrgica. Los linfocitos citolíticos obtenidos se cultivaron y se
activaron principalmente en medio que contenía
interleucina-2 (IL-2), un factor de
crecimiento de células T [refs. 1, 2]. Otros intentos de
transferencia celular autóloga y alogénica adoptiva incluyen la
estimulación de las células T con células tumorales y/o con
anticuerpos o citocinas in vitro o in vivo antes de
transferirse de manera adoptiva al receptor [refs. 3 a 10]. El
término "alogénico" significa que las células transferidas las
origina otro individuo.
El uso de células dendríticas (CD) para la
activación de células T específicas de antígeno (péptido) in
vivo o in vitro se ha establecido en años muy recientes
[refs. 8 a 13]. Las CD son células presentadoras de antígeno
"profesionales" que pueden ser activadores de células T
específicas de antígeno más potentes que las propias células
portadoras del antígeno. La CD puede impulsarse o cargarse con
antígenos tales como péptidos o lisados celulares, por ejemplo
antígenos derivados de células tumorales. Las CD procesan el
material antigénico e integran los productos en los complejos CMH
(Complejo Mayor de Histocompatibilidad) de clase I y/o clase II que
pueden presentarlos a las células T. Para una completa activación de
los linfocitos citolíticos T, se necesita una presentación del
material procesado en las dos clases I y II de los complejos CMH,
aunque los propios linfocitos citolíticos sólo pueden reconocer una
presentación mediante el CMH de clase I. El CMH de clase II es
necesario para la activación adicional de las células T auxiliares.
Este hallazgo ha conducido a la adición de sustitutos del tipo
hemocianina de lapa californiana (HLC) que representan antígenos
auxiliares que pueden integrarse en el CMH de clase II.
Adicionalmente, dicho sustituto podría representar un neoantígeno y
por tanto, puede servir como una molécula indicadora [ref. 8].
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es
un paramixovirus aviar que se ha usado durante mucho tiempo en la
terapia contra el cáncer. Este virus puede usarse directamente para
la infección y lisis de las células cancerígenas in vitro o
in vivo y puede usarse para la modificación de células
tumorales en vacunas para dar lugar a una adherencia mejorada de
las células estimuladoras para sus células diana. El NDV puede
inducir también una amplia variedad de señales coestimuladoras para
la activación de las células T cuando éste se usa para modificar
vacunas celulares [refs. 14 a 22].
Sin embargo, las estrategias mencionadas
anteriormente presentan diversos problemas y desventajas.
En el caso del uso de citocinas para la
activación y expansión de células inmunes in vitro, los
métodos que se han usado anteriormente no han mostrado una relación
clínica beneficio-riesgo aceptable. Esto se debe
principalmente a una activación inespecífica de todo el sistema
inmunitario y a una dependencia de las células transferidas sobre
la sustitución de citocinas in vivo después de la aplicación
al paciente. El tratamiento resultante de pacientes con dosis
elevadas de citocinas se acompaña por efectos secundarios
significativos que han conducido a abandonar esta estrategia. Los
métodos más sofisticados usan un componente específico de antígeno
o un desencadenante de los receptores de las células T para la
activación in vitro de las células T además de células
producidas por dosis bajas de citocinas que solo muestran una
actividad limitada. Habitualmente, la actividad de las células se
suprime fácilmente después de la transferencia al paciente, o las
células inmunes no encuentran (es decir no migran a) a las células
diana in vivo. Por lo tanto, la memoria inmunológica
generada de esta manera es únicamente efímera y, además, conduce a
la progresión de la enfermedad temprana después del éxito
terapéutico ocasional.
Hasta ahora, las CD se han usado clínicamente
para la inducción in vivo de respuestas inmunes específicas
de antígeno. Sin embargo, los obstáculos que impedían una terapia
exitosa usando las CD han sido la generación y/o el aislamiento de
una cantidad suficiente de CD funcionalmente activas para la
aplicación terapéutica. Las estrategias que se han desarrollado
hasta ahora, casi nunca han considerado la posibilidad de una
inducción de tolerancia por las CD insuficientemente impulsadas o
insuficientemente diferenciadas. Además, la generación in
vivo de las respuestas de las células T con las CD puede ser
difícil en pacientes con un sistema inmunodeficiente.
La oncolisis in vivo usando el NDV
resultó ser difícil debido a una inactivación eficaz del virus por
el sistema inmunitario del paciente y debido a las células tumorales
resistentes al virus en tumores heterogéneos. Las vacunas de
células tumorales modificadas con virus que se han usado hasta ahora
para la activación in vivo de células T específicas de
antígeno sólo muestran efectos limitados que sólo se observan en las
primeras etapas del cáncer. Las estrategias que usan el NDV se
enfrentan a otros obstáculos tales como pacientes inmunosuprimidos
o inmunodeficientes, células T insuficientemente activas debido a
una sobrecarga antigénica en el paciente vacunado o debido a
factores inhibidores que producen las células diana para las células
T. Adicionalmente, la presentación a antígeno subóptima en células
diana para diversos antígenos (es decir, en este caso, tumorales) y
en células preexistentes presentadoras de antígeno in vivo
pueden ser la razón del fallo de la activación de las células T.
Un problema adicional de las vacunas celulares
modificadas con virus que se han desarrollado hasta ahora es que
para alcanzar una suficiente eficacia necesitan un número
significativo de células viables portadoras de antígeno. Esto ha
limitado el uso de vacunas celulares modificadas con virus en
aplicaciones clínicas hasta ahora porque en situaciones clínicas se
dispone de una cantidad de materia prima comparablemente grande
(principalmente material tumoral quirúrgicamente resecable) que
contiene cantidades considerables de células muertas.
Además, la necesidad de células malignas viables
en vacunas modificadas con virus da como resultado la necesidad de
irradiar las células para su inactivación antes de su uso in
vivo. Este método de inactivación es eficaz, sin embargo, es
difícil de aplicar con respecto a los procesos de producción
farmacéuticos controlados [refs. 20, 23 a 25].
El documento WO 94/21798 describe entre otros el
uso médico de ADN que codifica la
hemaglutinina-neuramidasa (HN) de un paramixovirus
o su proteína, en cualquier caso sin su paramixovirus nativo, con
objeto de aumentar las respuestas de las células T específicas de
antígeno en seres humanos. Las células tumorales se inactivan, se
infectan con el ADN de la HN o se cargan con la proteína de HN y
después se vuelven a administrar al paciente. En una segunda
posibilidad, se aíslan macrófagos u otras células presentadoras de
antígenos de un paciente o se cultivan en un cultivo y se enfrentan
al CMH del paciente, se incuban con un péptido portador de epítopos
para las células T u otro antígeno adecuado y se infectan con el ADN
de la HN o se cargan con proteína de HN, por lo que en el paciente
aumenta la estimulación in vivo de las células T citotóxicas
de elevada especificidad para la citolisis de las células
enfermadas por el componente que proporciona la proteína HN.
Por lo tanto, el problema técnico subyacente de
la presente invención es mejorar la inducción in vivo e
in vitro de estimuladores inmunoespecíficos de antígeno muy
activos, cuyo efecto median especialmente las células T y las
células T de memoria durante el uso clínico terapéutico. Esta mejora
incluye la reducción de la posibilidad de inducción a tolerancia
por los esfuerzos de activación de las células T y, por tanto,
aumentando la seguridad del procedimiento.
La solución del problema técnico anterior se
consigue proporcionando las realizaciones como se caracteriza en
las reivindicaciones.
En particular, la presente invención se refiere
a un método para la preparación de una composición que contiene
células T activadas que puede realizar y estimular una respuesta
inmunoespecífica en un paciente, que comprende las etapas de
- (i)
- preparar las células T del paciente o de un pariente del mismo;
- (ii)
- activar las células dendríticas por un método que comprende las etapas de
- (a)
- preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,
- (b)
- preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,
- (c)
- desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,
- (d)
- coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,
en el que el virus puede mejorar la adhesión del
antígeno a y la presentación del antígeno por las células
dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y
coseñalización de las células dendríticas;
- (iii)
- preparar un agente de activación de células T que comprende las células dendríticas de la etapa (ii); y
- (iv)
- activar las células T de la etapa (i) mediante el tratamiento con el agente de activación de células T de la etapa (iii) in vitro,
en el que las etapas (i), (ii) (a) y (ii) (b) no
implican ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser humano
o un animal y en el que el pariente del paciente es una persona o un
animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el
paciente mediante el tipo HLA (antígeno leucocitario humano).
Adicionalmente, la presente invención también se
refiere a un método para la preparación de un agente de activación
de células T que contiene células dendríticas activadas para la
activación de células T que realizan y estimulan una respuesta
inmune específica en un paciente, en el que las células dendríticas
se activan mediante el método que comprende las etapas de
- (a)
- preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,
- (b)
- preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,
- (c)
- desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,
- (d)
- coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,
en el que el virus puede mejorar la adhesión del
antígeno a y la presentación del antígeno por las células
dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y
coseñalización de las células dendríticas, en el que las etapas (a)
y (b) no implican ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser
humano o un animal, y en el que el pariente del paciente es una
persona o animal que está relacionado consanguínea y/o
genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.
La expresión "agente de activación de células
T" como se usa en este documento significa una composición o
formulación que contiene células dendríticas activadas que pueden
estimular una respuesta inmune en un paciente contra antígenos. Las
células dendríticas activadas del agente de activación de células T
definido anteriormente pueden activar células T in vivo así
como in vitro.
Por lo tanto, la composición definida
anteriormente en la que el agente de activación de células T como se
caracteriza anteriormente puede usarse para la activación de
células T in vitro. El propio agente de activación de
células T puede usarse como una vacuna para la activación de células
T in vivo.
Por tanto, la presente invención proporciona
nuevos métodos para mejorar la inducción tanto in vivo como
in vitro de inmunoestimuladores muy activos, específicos de
antígeno, que pueden usarse en los siguientes regímenes
terapéuticos diferentes:
- (1)
- La composición obtenida por el método de la presente invención es particularmente útil en un método de terapia celular, en el que las células T activadas se administran al paciente. Dicho método también se denomina inmunoterapia adoptiva o pasiva (ADI).
- (2)
- El agente de activación de células T obtenido de acuerdo con la presente invención proporciona una vacuna, por ejemplo una vacuna contra tumor, para inmunizar a un paciente con un antígeno tal como un antígeno tumoral en una forma sumamente inmunogénica. Dicho régimen terapéutico también se denomina inmunoterapia específica activa (ASI).
Para la estimulación de las células T in
vivo, las células dendríticas activadas pueden administrarse al
paciente, por ejemplo, por vía intracutánea, subcutánea o
intralinfática, y las células T del paciente migran al locus de
administración donde se activan mediante las células dendríticas. El
agente de activación de células T usado para la activación de las
células T en la composición obtenida de acuerdo con la presente
invención también puede contener sustancias que se preparan usando
tecnología de ADN recombinante. Preferiblemente, el agente de
activación de células T usado para la activación de las células T en
la composición obtenida de acuerdo con la presente invención
contiene uno o más de otros agentes de activación de células T que
actúan de manera aditiva o sinérgica con las células
dendríticas.
El término "antígeno" comprende cualquier
estructura que puede inducir una respuesta inmune en un organismo
ya sea por sí mismo o cuando se acopla a una molécula o célula
transportadora adecuada. Por lo tanto, los antígenos de acuerdo con
la presente invención son células tumorales así como las partes de
las mismas tales como polipéptidos, oligopéptidos derivados de las
mismas, lípidos tales como glucolípidos, polisacáridos y ácidos
nucleicos. De acuerdo con una realización preferida de la
composición definida anteriormente, el antígeno se prepara del
paciente, sin embargo, como se define anteriormente, el antígeno
también puede prepararse de otros organismos o puede ser sintético
o biosintético.
Preferiblemente, el antígeno que es un virus
tratado en la etapa (ii) (a) tal como células tumorales vivas
tratadas con virus puede inactivarse sin usar radiación antes de la
coincubación con las células dendríticas en la etapa (d) del método
definido anteriormente. Los métodos preferidos para la inactivación
y lisis de las células vivas tales como células tumorales vivas
incluyen, por ejemplo, congelación-descongelación y
ultrasonido. El uso de métodos aparte de la radiación plantea menos
problemas en el proceso de producción de los productos
farmacéuticos.
El uso de médula ósea además o en lugar de
sangre como la fuente de células T que van a activarse conduce a un
aumento de la producción de células T específicas de antígeno muy
activas, por ejemplo, células T de memoria, para la estimulación
mediante coincubación con las CD modificadas con el NDV.
Preferiblemente, el antígeno tal como una
célula, por ejemplo, una célula tumoral, puede purificarse
adicionalmente durante la preparación del paciente, por ejemplo,
por técnicas de inmunoperla. Estas técnicas comprenden el uso de
pequeñas perlas metálicas magnéticas (por ejemplo, de Dynal o
Milteny) que están acopladas a anticuerpos dirigidos contra
componentes contaminantes tales como células u otros agentes.
Después de unirse a las perlas acopladas al anticuerpo durante una
etapa de incubación, los contaminantes se eliminan del agente de
activación de células de T, por ejemplo una suspensión de las
células dendríticas activadas, aplicando un campo magnético que
extrae las perlas fuera de la suspensión. Adicionalmente, las
células pueden crioconservarse después de su preparación, por
ejemplo, del paciente, en la etapa (a) anterior y pueden congelarse
antes o después del tratamiento con el virus en la etapa (a) y/o
coincubarse con las células dendríticas en la etapa (d)
anterior.
Como las células dendríticas pueden procesar
antígenos procedentes de material genético, también es posible usar
material genético, es decir, un ácido nucleico tal como ADN o ARN
(preferiblemente ARNm), que codifica las señales inmunológicas de
dicho antígeno tratado/modificado con virus que proporciona la
activación (impulso) de las células dendríticas en lugar de o
además del propio antígeno en la etapa (d) del método para la
activación de la CD como se define anteriormente. Por ejemplo, las
células dendríticas pueden tratarse con el ácido (o ácidos)
nucleico correspondiente por transfección (por ejemplo, usando los
métodos de fosfato-calcio, lipofección o
electroporación). Las fuentes preferidas del ácido (o ácidos)
nucleico son células presentadoras de antígeno infectadas con
virus. Estas células no sólo procesan productos génicos para la
expresión de antígenos sino también productos, por ejemplo un
cóctel de citocinas, proteínas de choque térmico, etc., que
inducidas por la infección del virus sirve como señales
inmunológicas. Por ejemplo, el ARNm que codifica dichos productos
puede transcribirse en ADN y por lo tanto este material genético
puede amplificarse mediante el uso de PCR. Por tanto, puede
proporcionarse una fuente constante de antígeno modificado/tratado
con virus para el tratamiento continuado de un gran número de
pacientes que desde el punto de vista farmacéutico sea fácil de
manipular.
Preferiblemente, las células dendríticas en
desarrollo también se coincuban con el virus durante la etapa de
incubación in vitro (c).
De acuerdo con realizaciones adicionales
preferidas del método para obtener la composición definida
anteriormente y el agente de activación de células T, el virus
usado se selecciona del grupo constituido por paramixovirus tales
como el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) o el virus de las
paperas, virus de la vacuna, mixovirus, herpesvirus, virus del
SIDA, papilomavirus humano (VPH) y el virus del tumor mamario de
ratón (MMTV).
El agente de activación de células T usado para
la activación de células T en la composición obtenida de acuerdo
con la presente invención comprende células dendríticas que se
activan con un virus y un antígeno que se prepara preferiblemente
de un paciente que tiene un sistema inmune significativamente
alterado. Preferiblemente, esta alteración del sistema inmune del
paciente puede producirse por trastornos crónicos tales como cáncer,
infecciones, fallo renal que tiene que tratarse mediante diálisis,
enfermedades autoinmunes y/o disfunciones inmunohereditarias.
El término "paciente" como se usa en este
documento comprende seres humanos así como animales. El paciente
preferido es un ser humano. El "pariente" del paciente es una
persona o un animal, respectivamente, que está relacionado
consanguínea y/o genéticamente mediante el tipo HLA con el paciente,
es decir el ser humano o el animal.
En la composición definida anteriormente las
células T se activan mediante el método que comprende las etapas
de
- (i)
- preparar células T del paciente o del pariente del mismo, y
- (ii)
- tratar las células T con el agente de activación de células T in vitro como se define anteriormente.
Preferiblemente, el tratamiento de las células T
con el agente de activación de células T de acuerdo con la presente
invención en la etapa (ii) anterior se lleva a cabo mediante
coincubación en un medio que contiene una dosis baja o media de
citocinas durante un corto tiempo. Mas preferiblemente, el medio de
cultivo no contiene más de 6000 U/ml de citocinas, por ejemplo
IL-2, y el cultivo en el medio que contiene una
dosis baja de citocinas no es superior a siete días.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la
presente invención al menos parte de los monocitos preparados en la
etapa (b) del agente de activación de células T definido
anteriormente y al menos parte de las células T preparadas en la
etapa (i) de la composición definida anteriormente pueden proceder
de la médula ósea o de la sangre del paciente o del pariente. Por
lo tanto, a diferencia de la técnica anterior las vacunas de
terapia celular, en el agente de activación de células T definido
anteriormente puede usarse médula ósea como una fuente muy eficaz
de monocitos a partir de los cuales se desarrollan las células
dendríticas y, adicionalmente, en la composición definida
anteriormente como una fuente muy eficaz de células T (memoria) que
se obtiene para la activación in vitro con las CD tratadas
con virus además de los monocitos o células T, respectivamente, de
sangre periférica.
Además de las ventajas mencionadas anteriormente
del agente de activación de células T y de la composición obtenida
de acuerdo con la presente invención, estos presentan diversas
ventajas adicionales debido a la nueva estrategia para la
activación de células T.
Cuando se usan como el antígeno se necesitan 1,5
x 10^{6} CD modificadas con NDV y un equivalente de 1,5 x
10^{6} células diana (por ejemplo células tumorales) para la
vacunación in vivo de un ser humano o para una estimulación in
vitro razonablemente eficaz de células T derivadas, por ejemplo,
de seres humanos. Teniendo en cuenta estas consideraciones el
método para la activación de las células T como se describe
anteriormente proporciona la posibilidad de usar células diana como
antígenos que pueden estar muertas o vivas, ya que la absorción y
el procesamiento del material mediante las CD conducen a una
presentación antigénica a las células diana CD vivas al final. Por
el contrario, en las vacunas de células tumorales modificadas con
virus convencionales para conducir una activación eficaz de las
células T al menos 1,5 x 10^{6} células diana deben estar vivas y
no más del 66% de células muertas deben contaminar las células diana
vivas [ref. 20, 24 a 26.]. Sin embargo, un promedio del 50% de
células diana están muertas, por ejemplo, en suspensiones recientes
de células de tumor después de la crioconservación que es
frecuentemente necesaria para el almacenamiento de la materia prima.
Por lo tanto, el uso de las CD modificadas con NDV en lugar de
células diana vivas portadoras del antígeno original reduce
aproximadamente al 50% la cantidad de materia prima necesaria, ya
que como antígeno pueden usarse células diana muertas así como
células diana vivas (las células diana vivas se disgregan
preferiblemente por congelación por choque o por infección con el
virus).
Además, el uso de un virus, por ejemplo el NDV,
para aumentar el número de CD y para potenciar su función facilita
y aumenta la generación de las CD eficaces que pueden usarse para la
activación de las células T (memoria) in vitro o in
vivo.
El uso de un virus, por ejemplo un paramixovirus
tal como NDV, que puede mejorar la adhesión del antígeno a las
células dendríticas y que puede estimular la activación de las
células dendríticas como se describe anteriormente además reduce la
probabilidad de una inducción de tolerancia por un número y/o
función ineficaz de las CD en el paciente. Esta ventaja y el hecho
de que el uso de un virus como se describe anteriormente para
aumentar el número de las CD así como su función mejora y aumenta la
generación de las DC eficaces representa propiedades adicionales
sorprendentes del agente de activación de células T de acuerdo con
la invención que no pueden predecirse de las nuevas propiedades de
virus tales como el NDV en la modificación de las células
tumorales. Generalmente, las CD en sí mismas deberían poder realizar
una función de presentación a antígeno óptima y una señalización
coestimuladora para la activación de las células T. Por lo tanto, en
teoría, no es una necesidad obvia para los efectos de un virus como
el NDV sobre las DC. Sin embargo, cuando un virus tal como el NDV
en realidad induce una secreción de citocinas coestimuladoras y
proporciona moléculas de adhesión para una mayor interacción célula
diana-células T para la preparación de vacunas
celulares tales como las vacunas celulares tumorales descritas
anteriormente, esto mejora la maduración y/o diferenciación y/o
presentación antigénica, respectivamente, de las DC. Además, el
virus tal como el NDV también puede modificar además o en lugar de
inducir una señalización coestimuladora en las DC para generar una
activación de las células T mejorada.
También, de acuerdo con realizaciones preferidas
de la composición y con el agente de activación de las células T
obtenido de acuerdo con la presente invención, el virus tal como el
NDV puede inducir al menos en parte fusiones entre el antígeno y
las células dendríticas en la etapa (d) de la activación de las
células dendríticas. La fusión puede mediarse a través de la
proteína de fusión del virus conduciendo a híbridos entre las
células dendríticas y el antígeno tratado con virus tal como una
célula. Dichos híbridos mejoran adicionalmente la capacidad de
presentación al antígeno y la actividad de la activación de las
células T de las células dendríticas. El antígeno es
preferiblemente una célula tal como una célula de tumor derivada de
un paciente o una célula derivada de una línea celular de tumor que
confiere al híbrido múltiples antígenos asociados a tumores.
De las propiedades conocidas de virus tales como
el NDV no se esperaban estos efectos en las CD en las células
tumorales y en las vacunas celulares tumorales. Por el contrario, de
los estudios de la técnica anterior, se habría esperado que los
virus supriman las CD. Por ejemplo, Jenne et al. [ref. 27.]
observaron una supresión de las propiedades de estimulación de las
células T por virus y Raftery et al. [ref. 28] observaron
cambios en la función de las CD que se creía que contribuían a la
inmunosupresión asociada al citomegalovirus humano después de
infectar las CD con citomegalovirus humano.
Además, las células T que están contenidas en la
composición obtenida de acuerdo con la presente invención y que se
activan mediante el método descrito anteriormente usando el agente
de activación de las células T in vitro, definido
anteriormente, muestran una elevada eficacia y dependencia reducida
sobre la aplicación de citocinas in vivo que reduce los
efectos secundarios potenciales de una terapia usando la composición
de acuerdo con la presente invención. Además, las células T
activadas por el método como se describe anteriormente muestran una
sensibilidad reducida a mecanismos de inactivación en un paciente,
ya que las células T activadas de acuerdo con la presente invención
están más diferenciadas y más eficazmente activadas.
Por ejemplo, los métodos de acuerdo con la
presente invención pueden usarse para obtener una composición
farmacéutica que contiene una cantidad farmacéuticamente eficaz del
agente de activación de células T y/o la composición obtenida de
acuerdo con la presente invención, opcionalmente en combinación con
un transportador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable,
preferiblemente para el tratamiento curativo o profiláctico del
cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes. Adicionalmente, la
composición farmacéutica que puede obtenerse usando la presente
invención puede contener uno o más agentes de activación de células
T que pueden actuar de manera aditiva o sinérgica con el agente de
activación de células T y/o la composición de acuerdo con la
presente invención. La composición farmacéutica que puede obtenerse
usando la presente invención puede aplicarse mediante cualquier vía
de aplicación convencional usada en la vacunación o terapia celular
tal como administración intravenosa, intramuscular, intracutánea,
subcutánea y/o intralinfática, por ejemplo, por infusión o
inyección.
La composición farmacéutica que puede obtenerse
usando la presente invención puede aplicarse en un método para el
tratamiento de un paciente que padece una alteración del sistema
inmunológico que puede estar causada por enfermedades tales como
por cáncer, infecciones, fallo renal, enfermedades autoinmunes y/o
inmunodisfunciones hereditarias que comprenden la etapa de
administrar la composición farmacéutica descrita anteriormente en
una cantidad suficiente para estimular y/o realizar una respuesta
inmune específica en un paciente.
Realizaciones adicionales de la presente
invención se refieren a métodos para la preparación de células
dendríticas activadas y células T activadas, respectivamente. El
método para la preparación de células dendríticas activadas de
acuerdo con la presente invención comprende las etapas de
- (a)
- preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,
- (b)
- preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,
- (c)
- desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,
- (d)
- coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,
en el que el virus puede mejorar la adhesión y
la presentación del antígeno a las células dendríticas y modular la
activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células
dendríticas;
en el que las etapas (a) y (b) no implican
ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser humano o un
animal, y en el que el pariente del paciente es una persona o animal
que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente
mediante el tipo HLA.
El método para la preparación de células T
activadas de acuerdo con la presente invención comprende las etapas
de
- (i)
- preparar células T de un paciente o pariente del mismo,
- (ii)
- tratar las células T con el agente de activación de células T obtenido in vitro, por el método de acuerdo con la presente invención,
en el que la etapa (i) no implica ningún
tratamiento quirúrgico del cuerpo del paciente o del pariente y en
el que el pariente del paciente es una persona o animal que está
relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante
el tipo HLA.
La presente invención se ilustrará
adicionalmente mediante los ejemplos siguientes no limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
La preparación de las células tumorales
modificadas con NDV comprende las siguientes etapas:
- (1)
- Aislamiento de material tumoral por intervención quirúrgica
- (2)
- Disociación del material celular tumoral en una suspensión de células únicas por medios mecánicos y enzimáticos: cuatro tiempos de incubación durante 30 minutos a 37ºC con colagenasa (5 U/ml) y DNasa (15 U/ml). Opcionalmente, purificación de las células tumorales por inmunoperlas que reduce las células no tumorales contaminantes
\global\parskip0.980000\baselineskip
- (3)
- Crioconservación de las células tumorales
- (4)
- Congelación de las células tumorales y modificación/infección con NDV: de 20 a 100 unidades hemaglutinantes de virus por 1 x 10^{7} células.
- (5)
- Inactivación de las células tumorales modificadas con NDV con 4 a 5 ciclos de congelación y descongelación por choque.
\vskip1.000000\baselineskip
- (1)
- Extracción de médula ósea y/o sangre del pariente,
- (2)
- Preparación de monocitos de la médula ósea y/o sangre e inducción de maduración y diferenciación en las CD por cultivo convencional con interleucina-4 (IL-4), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) y factor de necrosis tumoral (TNF) con y sin NDV
- (i)
- aislamiento de células de 150 ml de sangre
- (ii)
- cultivo de monocitos durante un día en RPMI 1640 mas glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y complementado con autólogos al 5%, plasma no inactivado, 1000 U/ml de IL-4 (de Promocell) y 1000 U/ml de GM-CSF
- (iii)
- cambio de medio y cultivo durante dos días en el medio anterior (día 1)
- (iv)
- cambio de medio, adición de TNF\alpha (de Promocell) a una concentración final de 10 ng/ml (día 4)
- (3)
- Carga/impulso de las CD con lisado celular tumoral modificado con virus añadiendo el lisado a las CD seguido de incubación en medio de cultivo celular
- (v)
- adición de las CD a las células tumorales a una relación de 1 parte de CD por 3 partes de células tumorales muertas en 1 ml de medio X vivo, centrifugación a baja velocidad [1000 revoluciones por hora (rph)], incubación a 37ºC durante 4 días (día 5)
- (vi)
- control de las CD cargadas con antígeno usando análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS)
- (vii)
- cultivo de las CD cargadas con antígeno en RPMI + plasma al 5% + IL-4 + GM-CSF + TNF\alpha durante tres días (hasta el día 8)
- (4)
- aislamiento de las TC de la médula ósea y/o sangre mediante un método que comprende una etapa de enriquecimiento por inmunoperlas (esto puede realizarse durante la fase de generación/carga de las TC)
- (viii)
- aislamiento de las TC de 150 ml de sangre (lisis de eritrocitos, adherencia, kit Pan de aislamiento de células T)
- (ix)
- control de las TC usando análisis FACS
- (5)
- expansión de las TC en cultivo celular
- (6)
- coincubación de las TC y las CD que se han impulsado con lisado tumoral modificado con NDV que comprende una corta incubación en presencia de citocinas a dosis baja o media para evitar la inducción de la dependencia de las TC sobre estas citocinas
- (x)
- adición de las TC a las CD cargadas con antígeno en una proporción de 1 parte de CD por 34 partes de TC e incubación en RPMI reciente complementado con plasma al 5% (pero sin citocinas) durante tres días (hasta el día 11)
- (xi)
- cambio de medio y adición de IL-2 (6000 U/ml) el día 11 y cultivo durante tres días
- (xii)
- recogida de las TC activadas, resuspensión de las TC en 10 ml de medio I, carga de la suspensión en una jeringa para inyección intravenosa, filtración; el filtrado se toma en 400 \mul de medio y se inyecta subcutáneamente.
- (7)
- Análisis de la actividad antitumoral de las TC activadas usando células ELISPOT. Las células T se coincuban (se exponen) con antígeno durante 20 horas. Posteriormente, se detecta la producción de \gamma-interferón (IFN-\gamma) para cada célula T única en una placa recubierta con anticuerpos anti-IFN-\gamma. La unión de IFN-\gamma se detecta en manchas que rodean a las células T por medio de tinción ELISA.
\global\parskip1.000000\baselineskip
(1) Día 1 a 14
Inmunosupresión del paciente con quimioterapia
de dosis media o dosis intensificada y/o radioterapia y/o
corticoesteroides y ciclosporina, que es necesario para evitar el
rechazo de las TC activadas con tumor NDV-CD
alogénicas del pariente del paciente.
El paciente se trata con 80 mg/m^{2} de taxol,
40 mg/m^{2} de epirubicina y 50 mg de hidrocortisol por día
durante dos semanas consecutivas. Además, se realizan radiaciones de
30 Gray de una metástasis ósea.
(2) Día 15
Infusión intravenosa de las TC alogénicas que se
activaron por tratamiento con NDV- CD.
Aproximadamente 5 x 10^{8} células T que se
han activado mediante el método descrito anteriormente se infunden
en un volumen de 250 ml de solución lactato de Ringer.
(3) Siguiente ciclo de tratamiento después de
un descanso de seis semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
IL-4cc humana recombinante (rHU)
disuelta en solución salina tamponada con fosfato (PBS)/albúmina de
suero humano (HSA) al 1% (solución madre: 1 x 10^{5} U/ml, que
corresponden a 1 x 10^{5} \mug/ml)
GM-CSF disuelto en PBS/albúmina
de suero bovino (BSA) al 1% (solución madre: 1 x 10^{5} U/ml)
TNF\alpha rHU disuelto en RPMI 1640/BSA al 1%
(solución madre: 1 \mug/ml) IL-2 disuelto en
medio vivo X (solución madre: 6 x 10^{5} U/ml, diluido 1:100),
proleucina (de Chiron).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células MCF-7 en
medio RPMI, complementado con suero de ternero fetal al 10% (FCS). 1
x 10^{7} células se lavaron para eliminar el FCS y se infectaron
con 60 unidades hemaglutinantes de la cepa Ulster del virus de la
enfermedad de Newcastle en medio RPMI añadiendo solución de virus
durante 60 minutos a 37ºC. Los virus no adsorbidos se retiraron por
lavado de nuevo antes de realizar una incubación durante 24 horas a
37ºC en RPMI/FCS al 2%.
Las células de control no se infectaron con
virus pero por otro lado se trataron del mismo modo que las células
infectadas (es decir, incubación durante 60 minutos en RPMI sin FCS
seguido por incubación durante 24 h en RPMI/FCS al 2%).
Después de completar la incubación, las células
infectadas (MCF-7-DNV) y las de
control se lisaron mediante tres ciclos de
congelación-congelación. En ambas preparaciones de
calculó el contenido de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
- (1)
- Extracción de médula ósea de un paciente con cáncer de mama
- (2)
- Preparación de células dendríticas de la médula ósea como se describe anteriormente en el punto (2) de "preparación de células T y células dendríticas de un pariente del paciente".
\vskip1.000000\baselineskip
Se coincubaron células dendríticas 1 x 10^{6}
con 200 \mug/ml de lisado de
MCF-7-NDV lisado o con 200
\mug/ml de lisado de células MCF-7 no infectadas.
Esto se realizó lavando las células dendríticas y añadiendo las
células lavadas a la solución de la proteína antigénica
correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon células T autólogas del paciente a
partir de médula ósea como se describe anteriormente en el punto
(4) de "preparación de células T y células dendríticas de un
pariente del paciente". Las células dendríticas impulsadas con
antígeno se añadieron a las células T en una proporción de una
célula dendrítica por cinco células T. La incubación se realizó
durante 48 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células T activadas se determinaron en una
base celular única mediante su producción de
\gamma-interferón usando el ensayo ELISPOT. El
interferón-\gamma unido se detecta en manchas que
rodean a las células T por medio de una tinción ELISA como se
describe anteriormente en el punto (7) de "preparación de células
T y células dendríticas de un pariente del paciente".
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectaron 415 células formando manchas en
2,5 x 10^{4} células T tras la estimulación con células
dendríticas impulsadas con
MCF-7-NDV. Únicamente se detectaron
190 células formando manchas en 2,5 x 10^{4} células T
estimuladas con células MCF-7 no infectadas. Se
detectaron 150 células formando manchas en 2,5 x 10^{4} células T
estimuladas con células dendríticas no impulsadas. Se observaron
menos de 12 manchas en 2,5 x 10^{4} células T sin estimular del
todo. Se contaron 165 manchas cuando las células dendríticas se
habían impulsado con una línea celular de cáncer no mamario.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados anteriores muestran que en el
paciente con cáncer de mama la capacidad estimuladora de las
células T de las células dendríticas que se han impulsado con
antígeno infectado con virus era más del doble en comparación con
las células dendríticas que se habían impulsado con antígeno no
infectado, con células dendríticas no impulsadas y con células
dendríticas que se habían impulsado con una línea celular de cáncer
no mamario.
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron células tumorales
MCF-7 irradiadas, usadas como antígeno, durante 30
con NDV y se almacenaron durante una noche a 4ºC sin incubación
adicional.
Como un control, se usaron células
MCF-7 no infectadas que por otro lado se trataron
del mismo modo que las células no infectadas con NDV. Como un
control adicional, se usaron leucocitos de sangre periférica.
Se generaron células dendríticas incubando
monocitos de sangre periférica de un paciente con cáncer de mama
con GM-CSF e interleucina-4
(IL-4) durante 5 días usando un protocolo
convencional (véase, por ejemplo, ref.
8.).
8.).
Las células dendríticas se impulsaron con
células MCF-7 infectadas, radiadas pero no lisadas o
células de control por co-incubación a 37ºC durante
6 horas en medio sin citocinas. Después de 6 horas se añadió a los
cultivos TNF-\alpha, IL-1,
IL-6 y prostaglandina E2 para ayudar a la
diferenciación final de las células dendríticas. Posteriormente, la
incubación continuó durante 40 horas.
Las células dendríticas impulsadas se lavaron
para eliminar las citocinas. Las células lavadas se almacenaron a
4ºC durante 6 horas, seguido de incubación durante 90 horas a 37ºC
en un medio que contenía suero de células antólogas pero sin
citocinas. Este procedimiento imita el almacenamiento de una vacuna
a 4ºC y por tanto la persistencia in vivo de las células
dendríticas impulsadas en el paciente autólogo después de la
inyección de la vacuna.
Después de 90 horas las células dendríticas
impulsadas con antígeno se usaron para la estimulación a corto
plazo (42 h) de células T autólogas purificadas de sangre periférica
del paciente. La proporción de células dendríticas con respecto a
células T era de 1 a 10 y de 1 a 100.
Después de 42 horas de estimulación a corto
plazo se determinó la producción de
\gamma-interferón (activación) en las células T
mediante el método ELISPOT descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células dendríticas, impulsadas con antígeno
infectado con virus (células tumorales MCF-7),
inducen sustancialmente más células T productoras de
\gamma-interferón (es decir, activa) que las
células dendríticas que se han impulsado con células de control.
Adicionalmente, las células dendríticas impulsadas con células
MCF-7 infectadas con virus estimulan células T más
eficazmente que solo las células MCF-7 infectadas
con virus, solo las células MCF-7 no infectadas,
células dendríticas impulsadas con virus o células dendríticas
impulsadas con leucocitos de sangre periférica. Por tanto, el
efecto de la potenciación del virus de las actividades estimuladoras
de las células dendríticas era estable incluso después de más de 90
horas de incubación sin citocinas. Por lo tanto, un agente de
activación de células T usado como una vacuna conteniendo estas
células puede mantener su actividad de estimulación de células T
(memoria) in vivo durante al menos este período de
tiempo.
Claims (30)
1. Un método para la preparación de una
composición que contiene células T activadas que puede realizar y
estimular una respuesta inmunoespecífica en un paciente, que
comprende las etapas de
- (i)
- preparar las células T del paciente o de un pariente del mismo;
- (ii)
- activar las células dendríticas por un método que comprende las etapas de
- (a)
- preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,
- (b)
- preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,
- (c)
- desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,
- (d)
- coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,
en el que el virus puede mejorar la adhesión del
antígeno a y la presentación del antígeno por las células
dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y
coseñalización de las células dendríticas;
- (iii)
- preparar un agente de activación de las células T que comprende las células dendríticas de la etapa (ii); y
- (iv)
- activar las células T de la etapa (i) mediante el tratamiento con el agente de activación de las células T de la etapa (iii) in vitro,
en el que las etapas (i), (ii) (a) y (ii) (b) no
implican ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser humano
o un animal y en el que el pariente del paciente es una persona o un
animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el
paciente mediante el tipo HLA.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el tratamiento de las células T comprende un tiempo de
incubación corto con las células dendríticas activadas no superior a
7 días.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que las células T activadas son al menos en parte
células T de memoria.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos parte de las células
T a activar y/o al menos parte de los monocitos se preparan a partir
de la médula ósea del paciente o del pariente.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el tratamiento de las células T
se realizan en un medio de cultivo que no contiene más de 6000 U/ml
de IL-2.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método comprende
adicionalmente la etapa de inactivar el antígeno obtenido en la
etapa (a) sin el uso de radiación.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que el antígeno se inactiva por
congelación-descongelación o ultrasonido.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células tumorales se
preparan del paciente.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula tumoral se
purificada adicionalmente mediante técnicas de inmunoperlas.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que el antígeno se crioconserva
después de su preparación y se congela antes de la coincubación con
las células dendríticas en la etapa (d).
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en el que en la etapa (c) el desarrollo
de las células dendríticas también se incuba con el virus.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en el que el virus induce al menos en
parte fusiones entre el antígeno y las células dendríticas en la
etapa (d).
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en el que el sistema inmunológico del
paciente está significativamente alterado.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que la alteración del sistema inmunitario del paciente
está causada por cáncer, infecciones, fallo renal, enfermedades
autoinmunes y/o inmunodisfunciones hereditarias.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14, en el que el paciente es un ser
humano.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 15, en el que el agente de activación de
células T contiene adicionalmente uno o más agentes de activación de
células T.
17. Un método para la preparación de un agente
de activación de células T que contiene células dendríticas
activadas para la activación de células T que realizan y estimulan
una respuesta inmunoespecífica en un paciente, en el que las
células dendríticas se activan mediante el método que comprende las
etapas de
- (a)
- preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,
- (b)
- preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,
- (c)
- desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,
- (d)
- coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,
en el que el virus puede mejorar la adhesión del
antígeno a y la presentación del antígeno por las células
dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y
coseñalización de las células dendríticas, en el que las etapas (a)
y (b) no implica ningún tratamiento quirúrgico en el cuerpo del ser
humano o del animal y en el que el pariente del paciente es una
persona o animal que está relacionado consanguínea y/o
genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
17, en el que el método comprende adicionalmente la etapa de
inactivar el antígeno obtenido en la etapa (a) sin el uso de
radiación.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
18, en el que el antígeno se inactiva por
congelación-descongelación o ultrasonido.
20. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 19, en el que la célula tumoral se
prepara del paciente.
21. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 20, en el que la célula tumoral se
purifica adicionalmente por técnicas de inmunoperlas.
22. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 21, en el que el antígeno se crioconserva
después de su preparación y se congela antes de la coincubación con
las células dendríticas en la etapa (d).
23. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en el que en la etapa (c) el
desarrollo de las células dendríticas también se coincuba con el
virus.
24. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 23, en el que el virus induce al menos en
parte fusiones entre el antígeno y las células dendríticas en la
etapa (d).
25. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 24, en el que el sistema inmunológico del
paciente está significativamente alterado.
26. El método de acuerdo con la reivindicación
25, en el que la alteración del sistema inmunológico está causada
por cáncer, infecciones, fallo renal, enfermedades autoinmunes y/o
inmunodisfunciones hereditarias.
27. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 26, en el que el paciente es un ser
humano.
28. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 27, en el que el agente de activación de
células T contiene adicionalmente uno o más agentes de activación de
células T.
29. Un método para la preparación de células
dendríticas activadas que comprende las etapas de
- (a)
- preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,
- (b)
- preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,
- (c)
- desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,
- (d)
- coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,
en el que el virus puede mejorar la adhesión y
la presentación del antígeno a las células dendríticas y modular la
activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células
dendríticas, en el que las etapas (a) y (b) no implica ningún
tratamiento quirúrgico en el cuerpo del ser humano o del animal y en
el que el pariente del paciente es una persona o animal que está
relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante
el tipo HLA.
30. Un método para la preparación de células T
activadas que comprende las etapas de
- (i)
- preparación de las células T de un paciente o pariente del mismo;
- (ii)
- tratamiento de las células T con el agente de activación de células T obtenido in vitro, mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 28,
en el que la etapa (i) no implica ningún
tratamiento quirúrgico del cuerpo del paciente o del pariente y en
el que el pariente del paciente es una persona o un animal que está
relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante
el tipo HLA.
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