DE60116075T4

DE60116075T4 - Behandlung von tumoren mit photodynamischer therapie

Info

Publication number: DE60116075T4
Application number: DE60116075T
Authority: DE
Inventors: C. William FANSLOW; K. Elaine THOMAS
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: US20050129689A1; DE60116075D1; ES2254408T3; DE60116075T2; ATE313334T1; WO2001080888A2; AU2001255740B2; ES2254408T4; EP1276501B1; DK1276501T3; DK1276501T5; CA2407336A1; AU5574001A; US20020041864A1; EP1276501B9; PT1276501E; EP1276501A2; WO2001080888A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zur Behandlung von Tumoren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung von tumortragenden Individuen mit einer photodynamischen Therapie in Kombination mit zusätzlichen Reagenzien.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die photodynamische Therapie (PDT) ist eine Form der Krebsbehandlung, die mit der Verwendung eines Photosensibilisators und Licht einhergeht. Bei dieser Behandlungsmodalität wird einem Individuum, das an Krebs oder einem präkanzerösen Zustand leidet, ein photosensibilisierendes Agens verabreicht. Kanzeröse (und präkanzeröse) Zellen speichern den Photosensibilisator besser als normale Gewebe. Eine nachfolgende Bestrahlung der Zellen mit wellenlängenspezifischem Licht führt zu einer photochemischen Reaktion, die eine oxidative Schädigung zahlreicher Zellbestandteile und den Zelltod bewirkt (erörtert von Dougherty et al.: J. Natl. Cancer Institute 90: 889; 1998).
CD40 ist ein Transmembranprotein, das sowohl an verschiedenen normalen Zellen, darunter B-Lymphozyten, Monozyten, einige Basalzellen und dendritische Zellen, als auch an verschiedenen transformierten Karzinomzelllinien exprimiert wird (Clark Tissue Antigens, 36: 33 (1990)). Ein Ligand für CD40 wird an aktivierten T-Zellen exprimiert (Spriggs et al.: J. Exp. Med., 176: 1453 (1992); Armitage et al. Nature, 357: 80 (1992)). Eine Bindung von CD40 an CD40L bewirkt eine B-Zell-Proliferation in Abwesenheit jedes Co-Stimulus und eine Induktion einer Antikörper-Sekretion von B-Zellen in Gegenwart von Cytokinen.
Lösliche Formen von CD40L und agonistischen CD40-Antikörpern (d.h. jenen, die die biologischen Wirkungen von CD40L nachahmen) sind bei der Behandlung von Krankheiten verwendbar, die durch neoplastische Zellen die CD40 exprimieren, charakterisiert sind, wie etwa B-Lymphome, Melanome und Karzinome (US-Patent 5,674,492).
Lösliches CD40L ist außerdem verwendet worden, um die Proliferation und/oder Differenzierung von CD40-positiven Sarkomzellen zu fördern, als ein Mittel zur direkten Behandlung der Malignität oder als ein Zusatz zur Chemotherapie oder um die Immunantwort eines immunsuprimierten Individuums zu steigern, wie etwa einer Person, die an einer Malignität leidet (US-Patent 5,945,513). Außerdem ist lösliches CD40L benutzt worden, um eine über T-Effektorzellen vermittelte Immunantwort zu stimulieren (WO 96/26 735).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Satzes von Teilen, der ein CD40-Bindungsprotein und einen Photosensibilisator zur getrennten, gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verabreichung an ein Lebewesen für die Behandlung eines Tumors oder eines präkanzerösen Zustandes aufweist, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.
Eine weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines CD40-Bindungsproteins bei der Herstellung eines Medikaments für die photodynamische Behandlung eines Lebewesens, die an einem Tumor oder einem präkanzerösen Zustand leidet, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.
Diese und weitere Ziele der vorliegenden Erfindung, die aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung erkennbar sind, sind wie durch die beigefügten Ansprüche definiert, erfüllt worden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner die weiter oben identifizierten Verfahren zur Behandlung von tumortragenden Lebewesen und Verfahren zum Induzieren einer zytotoxischen Lymphozyten-Reaktion (CTL-Reaktion), die weiters ein Verabreichen von zusätzlichen therapeutischen oder aktiven Wirkstoffen einschließen. Solche Therapeutika oder Wirkstoffe schließen jene ein, die einen Tumorzelltod und/oder eine Apoptose herbeiführen, jene, die die Anzahl Antigen aufweisender Zellen erhöhen, jene, die eine Reifung dendritischer Zellen stimulieren, und jene, die zu einer Expansion von T-Effektorzellen und zur Immunaktivierung führen. Geeignete zusätzliche Therapeutika oder Wirkstoffe schließen FasL, TRAIL, TNF alpha und CD30L ein.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner in Kombination mit dem oben beschriebenen Satz von Teilen oder der Verwendung, in vivo- und/oder in vitro-Verfahrensweisen, die eine auf der Immunantwort basierende Tumortherapie und/oder die Expansion und Reifung dendritischer Zellen betreffende Techniken zur Optimierung der antitumoralen therapeutischen Wirkungen der PDT und von CD40L zum Gegenstand haben. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von tumortragenden Individuen, die mit einem Verabreichen von Flt3L an das tumortragende Individuum; einem Verabreichen einer photodynamischen Therapie an das Individuum und einem Verabreichen von CD40L an das Individuum einhergehen. Zusätzliche therapeutische oder aktive Wirkstoffe, die einen Tumorzelltod und/oder eine Apoptose induzieren, die Anzahl der Antigen aufweisenden Zellen erhöhen und die Reifung von dendritischen Zellen stimulieren, können ebenso verabreicht werden. Die vorlegende Erfindung beschreibt weiters in vitro-Verfahrensweisen, die mit einem Sammeln von dendritischen Zellen von dem Individuum, einer Expansion der dendritischen Zellen, indem sie Flt3-L ausgesetzt werden, einer Infusion der expandierten dendritischen Zellen in das Individuum, einer Behandlung des Individuums mit einer photodynamischen Therapie und einer Verabreichung von CD40-Bindungsprotein an das Individuum einhergehen. Ein Verabreichen von flt3-L an das Individuum, bevor die dendritischen Zellen gesammelt werden, wird die Mobilisierung der dendritischen Zellen unterstützen und die Anzahl der dendritischen Zellen, die für die Sammlung zur Verfügung stehen, erhöhen. Alternativ können in vitro-Verfahren das Sammeln von hämatopoietischen Stamm- oder Vorläuferzellen und das Kontaktieren der Zellen mit flt3-L, um dendritische Zellen zu erzeugen, einschließen, bevor dem tumortragenden Individuum die erzeugten dendritischen Zellen infundiert werden.
Bei der vorliegenden Erfindung können verschiedenste CD40-Bindungsproteine benutzt werden, einschließlich beispielsweise einen Antikörper, der CD40 bindet; membrangebundenes CD40L in voller Länge; eine lösliche extrazelluläre Region eines CD40L; ein Fusionsprotein, das eine CD40 bindende Region (oder Domäne) von einem CD40L oder einem Antikörper gegen CD40 aufweist, die mit einem zweiten Protein, beispielsweise einer Immunglobulin-Fc-Domäne oder einer Zipper-Domäne, fusioniert ist.
Geeignete CD40-Antikörper schließen CD40-Antikörper ein, die CD40 binden und vernetzen, wodurch ein Signal übertragen wird. Darunter sind der monoklonale Antikörper HuCD40-M2 (ATCC HB11459) und CD40 Bindungsproteine, die eine aus dem Antikörper HuCD40M2 stammende Antigenbindungsdomäne aufweisen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird die Meinung vertreten, dass bei der vorliegenden Erfindung ein tumorzerstörendes oder -auflösendes Verfahren, das als photodynamische Therapie (PDT) bekannt ist, den Zelltod hervorruft und zu einer Antigenaufnahme und -darreichung durch dendritischen Zellen (DZ) an Stellen, die den absterbenden Tumor dränieren, führt. Sobald diese tumorantigen-tragenden dendritischen Zellen (DZ) mit einem CD40-Bindungsprotein in Kontakt gebracht werden, lösen sie eine für den Tumor spezifische wirksame Gedächtnis-CTL-Reaktion aus. Die CTL-Reaktion führt zu einer Ausrottung oder zu einer signifikanten Verringerung der verbleibenden Tumorbelastung. Die hier beschriebenen Verfahren können benutzt werden, um eine breite Palette von Tumoren und präkanzerösen Zellen zu behandeln, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Basal- und Plattenepithelzellen, Hautkrebs, Brustkrebs, Hautmetastasen bildende Krebsarten, Gehirntumore, Hals- und Kopf, Magen und Malignität des weiblichen Genitaltrakts, Krebsarten sowie präkanzeröse Zustände der Speiseröhre, wie etwa Barrett-Ösophagus.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Kombinieren einer photodynamischen Therapie (PDT) mit der Verabreichung von CD40-Bindungsprotein an ein tumortragendes Lebewesen. In einer weiteren Ausführungsform schließen die durch die vorliegende Erfindung dargestellten Verfahren weiters Kombinationstherapien zur Verabreichung eines oder mehrerer Wirkstoffe zur Verbesserung der auf der Immunantwort basierenden Tumortherapie ein. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung, zusätzlich zur Verabreichung von CD40-Bindungsprotein in Kombination mit einer PDT ein oder mehrere Mobilisierungsagenzien zu verabreichen, um die Anzahl der dendritischen Zellen zu erhöhen, und/oder ein oder mehrere Agenzien zu verabreichen, um die Reifung der dendritischen Zellen zu induzieren, und/oder ein oder mehrere Agenzien zu verabreichen, die eine T-Zell-Proliferation stimulieren.
Dendritische Zellen können in vivo vermehrt werden, indem ein tumortragendes Lebewesen Flt3L und/oder GM-CSF verabreicht wird. Agenzien, die geeignet sind, die Reifung von dendritischen Zellen zu induzieren, schließen CD40L, TNF alpha, RANKL, LPS und konditionierte Monozytenmedien ein. Die Reifung von dendritischen Zellen anregende Agenzien können systemisch oder lokal, an den Ort oder in der Nähe des Tumors verabreicht werden. Agenzien, die geeignet sind, die T-Zell-Proliferation und -funktion zu stimulieren, schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, IL-2, IL-15, IL-7, IL-12 und IFN-gamma ein. Agenzien die die T-Zell- Proliferation stimulieren, können systemisch oder in die Nähe des Tumors oder der dränierenden Lymphknoten verabreicht werden.
Zusätzlich oder als eine Alternative zu den in vivo-Verfahren zur Erzeugung dendritischer Zellen können dendritische Zellen mit in vitro-Verfahren erzeugt werden, um nachfolgend den tumortragenden Lebewesen verabreicht zu werden. Beispielsweise können unter Anwendung bekannter Sammlungs- und Zelltrennungsverfahren nach einer in vivo-Mobilisierung mit Flt3L, G-CSF, GM-CSF, SCF oder Cyclophosphamid und/oder anderen Mobilisierungsagenzien CD34+-Zellen gesammelt werden. Dendritische Zellen von den gesammelten CD34+-Zellen können in vitro unter Verwendung von Stoffen, die eine Erzeugung von dendritischen Zellen bewirkenden, wie etwa FLt3L, GM-CSF, CD40L und IL-15 kultiviert werden. Alternativ können PBMCs zur in vitro-Erzeugung dendritischer Zellen gesammelt werden, gegebenenfalls unter Anwendung solcher Reagenzien wie etwa GM-CSF und IL-4, um die dendritischen Zellen zu erzeugen. Die in vitro erzeugten dendritischen Zellen können dem tumortragenden Lebewesen, die eine PDT erhalten soll, infundiert werden, um die Anzahl der dendritischen Zellen, für das Induzieren einer CTL-Reaktion, zu erhöhen.
Verfahren zur in vivo und in vitro-Mobilisierung und -Erzeugung von dendritischen Zellen sowie Verfahren zur Stimulierung der T-Zell-Proliferationen sind in WO 97/12 633 und den gleichzeitig anhängigen US-Anmeldungen Nr. 09/154,903, 09/444,027, 09/448,378 beschrieben.
Photodynamische Therapie (PDT)
Das tumorzerstörende oder -auflösende Verfahren, das bei der vorliegenden Erfindung genutzt wird, die PDT, ist eine Krebstherapie, die eine photochemische Reaktion nutzt, um neoplastische Zellen und Zellen, die präkanzerös oder Vorläufer zu neoplastischen Zellen sind, zu zerstören (erörtert von Dougherty et al.: J. Natl. Cancer Institute 90: 889, 1998). Die Anwendung der PDT ist gemäß den im Fach bekannten Verfahren, die im Allgemeinen mit der Verabreichung eines oder mehrerer Photosensibilisatoren an ein tumortragendes Lebewesen einhergehen, gefolgt von einem Lichtaktivierungsschritt, bei dem Licht einer spezifischen Wellenlänge auf den Tumor gerichtet wird, wo sich der Photosensibilisator abgelagert hat.
Die zytotoxische Wirkung der PDT ist im Wesentlichen durch die Bildung von Singulettsauerstoff vermittelt, der durch Energieübertragung von einem mittels Licht aktivierten, im Gewebe lokalisierten Photosensibilisator auf Sauerstoff im Grundzustand erzeugt wird. Singulettsauerstoff hat einen kleinen Wirkradius und kann eine oxidative Schädigung zahlreicher Zellbestandteile an oder nahe bei dem Ort seiner Erzeugung herbeiführen (Gollnick et al.: Cancer Res., 57: 3904–3909 (1997)).
Die durch die PDT vermittelte oxidative Schädigung hat verschiedenste Wirkungen auf Tumorzellen, das Mikrogefäßsystem innerhalb und in der Nähe des Tumors und auf Zellen des Immunsystems. Eine PDT induziert sowohl Veränderungen in der Plasmamembran und in den Membranen von Zellorganellen der betroffenen Zellen, eine Hinaufregulierung der Expression einiger Stressproteingene und eine Aktivierung bestimmter Gene, die an der Apoptose beteiligt sind, führt aber auch zu einer Freisetzung von starken Entzündungsmediatoren. Obwohl die Rolle der verschiedenen Effekte, die durch eine PDT induziert werden, nicht klar ist, wird die Meinung vertreten, dass die Kombination der Effekte für die Ausrottung der Krebszellen erforderlich ist (Dougherty et al.: supra).
Die Akutphasen-Immunreaktion auf eine PDT ist entzündlicher Natur, wobei jedoch die langfristige Kontrolle von Tumoren ein Ergebnis der spezifischen antitumoralen Immunität zu sein scheint. Die Wirksamkeit einer solchen langfristigen, tumorspezifischen Immunität ist unvorhersagbar, da die PDT bestimmte Immunfunktionen signifikant unterdrücken kann, insbesondere jene, an denen Effektor-T-Zellen beteiligt sind (Elmets et al.: Cancer Res., 46: 1608–1611 (1986); Simkin et al.: Proc. Int. Soc. Optical Eng., 2392: 2333 (1995); Gruner et al.: Scand. J. Immunol., 21: 267–273 (1985)). Es wird die Meinung vertreten, dass die Unterdrückungswirkungen mit einer Vermittlung von immunmodellierenden Cytokinen wie etwa IL-6 und IL-10 einhergehen (Gollnick et al.: supra).
Die PDT ist wirksam bei der Behandlung einer breiten Palette von humanen Tumoren und präkanzerösen Zuständen angewendet worden, einschließlich von Basal- und Plattenepithelzellen, von Hautkrebsarten, Brustkrebs, Hautmetastasen bildenden Krebsarten, Gehirntumoren, Kopf- und Hals-Krebs, von Magenkrebs und der Malignität des weiblichen Genitaltrakts, von Krebsarten und präkanzerösen Zuständen der Speiseröhre, wie etwa Barrett-Ösophagus (US-Patent 6,013,053; Marcus, in: Future Directions and Applications in Photodynamic Therapy, Gomer (Hg.), Bellingham, WA SPIE Optical Engineering Press (1990), S. 5–56; und Overholt et al.: Sem. Surg. Oncol., 11: 1–5 (1995)).
Beispiele für zweckmäßige Photosensibilisatoren, die bei der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, schließen Hämatoporphyrine (Kessel: Cancer Lett., 39: 193–198 (1988)), Uroporphyrine, Phthalocyanine (Kreimer-Birnbaum: Sem. Hematol., 26: 157–173 (1989)), Purpurine (Morgan et al.: Photochem. Photobiol, 51: 589–592 (1990) und Kessel: Photochem. Photobiol. 50: 169–174 (1989)), Acridinfarbstoffe, Bacteriochlorophylle (Beems et al.: Photochem. Photobiol., 46: 639–643 (1987) und Kessel et al.: Photochem. Photobiol., 49: 157–160 (1989)) und Bacteriochlorine (Gurinovich et al.: J. Photochem. Photobiol. B-Biol., 13: 51–57 (1992)) ein.
Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignete Photosensibilisatoren schließen jene ein, die zum Teil in der Tabelle 1 des US-Patents 5,942,534 zusammengestellt sind. Eine Alternative zur Verabreichung des Photosensibilisators an sich ist die Verabreichung eines Vorläufers dieser Verbindung. Beispielsweise, bewirkt 5-Aminolävulinsäure eine endogene Produktion des Photosensibilisators Protoporphyrin IX (Morgan et al.: J. Med Chem., 32: 904–908 (1989)).
CD40/CD40-Bindungsproteine
CD40 ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-(TNF)/Nervenwachstumsfaktor-(NGF)-Rezeptorfamilie, von der festgestellt worden ist, dass sie auf B-Lymphozyten, Monozyten, einigen Epithelzellen und dendritischen Zellen exprimiert wird (Clark: Tissue Antigens, 36: 33, 1990). Es ist gezeigt worden, dass dieses Zelloberflächenantigen eine wichtige Rolle in der B-Zellproliferation und -differenzierung sowie beim Wachstum der bösartigen Zellen, auf denen es exprimiert wird, spielt.
Der Ligand für CD40 (im Folgenden "CD40L") ist identifiziert und charakterisiert worden, und diesen Liganden codierende DNA ist aus peripheren Blut-T-Zellen kloniert worden (Spriggs et al.: J. Exp. Med., 176: 1453 (1992); Armitage et al.: Nature, 357: 80 (1992) und Armitage et al.: US-Patente Nr. 5,961,974, 5,962,406 und 5,981,724). Die biologische Aktivität von CD40L wird durch Binden dieses Cytokins an CD40 vermittelt und schließt die B-Zell-Proliferation in Abwesenheit eines Co-Stimulus und eine Induktion einer Antikörper-Sekretion von B-Zellen in Gegenwart von Cytokinen ein.
So, wie der Ausdruck "CD40-Bindungsprotein" hier gebraucht wird, bezieht sich auf Polypeptide, die spezifisch CD40 durch eine nichtkovalente Wechselwirkung binden, die auf der richtigen Konformation des CD40-Bindungsproteins und des CD40 selbst beruht. Vorzugsweise hat das CD40-Bindungsprotein eine agonistische Aktivität, d.h. es ahmt den natürlich vorkommenden Liganden für CD40 (CD40L) nach, der auf aktivierten T-Zellen vorhanden ist, indem es an eine CD40 exprimierende Zelle bindet und dieser ein Signal übermittelt. Tests für biologische Aktivitäten von CD40L sind zur Beurteilung der agonistischen Aktivität dienlich. Weitere Verfahren, um die agonistische Aktivität eines CD40-Bindungsproteins zu messen, schließen ein Untersuchen des CD40-Bindungsproteins auf die Fähigkeit, eine Bindung von CD40 an CD40L zu inhibieren, ein. CD40-Bindeproteine, die CD40 binden und ein Binden von CD40 an CD40L inhibieren, wie durch Beobachten einer zu mindest etwa 90% Inhibition der Bindung von löslichem CD40 an CD40L bestimmt wurde, werden eine agonistische Aktivität haben.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendbaren CD40-Bindungsproteine schließen Antikörper gegen CD40 (darunter humanisierte Antikörper oder Antikörper, die mit rekombinanten Mitteln bearbeitet worden sind, um sie für eine therapeutische Verwendung geeignet zu machen), CD40L, lösliches CD40L und Fusionsproteine, die ein lösliches CD40L oder einen Antikörper gegen CD40 und ein zweites Protein aufweisen, ein. Insbesondere schließen CD40-Bindungsproteine Antikörper gegen CD40, die CD40 vernetzen und ein Signal übermitteln; CD40L in voller Länge, oligomere lösliche Formen von CD40L oder Fragmenten davon, die CD40 binden (z.B. die extrazelluläre Domäne des CD40L und Fragmente davon); CD40L-Fusionsproteine, z.B. lösliche CD40L/Fc-Fusionen und lösliche CD40L/Leucin-Zipper-Fusionen, ein. Oligomere lösliche Formen von CD40L schließen die extrazelluläre Domäne von CD40L oder Fragmente der extrazellulären Domäne, die CD40 binden, die in oligomerer Form sind, ein. Ein solches Beispiel für ein lösliches oligomeres CD40L ist das Fragment der extrazellulären Domäne mit den Aminosäuren 113–261 der SEQ ID Nr: 2 und der Leucin-Zipper der SEQ ID Nr: 3. Wenn das Fragment und der Leucin-Zipper kombiniert werden, ergibt sich eine oligomere Form des CD40L.
CD40L in voller Länge enthält Polypeptide, die die Aminosäuren 1 bis 260 der SEQ ID Nr: 1 und die Aminosäuren 1 bis 261 der SEQ ID Nr: 2 aufweisen. Lösliche Formen von CD40L weisen die Aminosäuren 47 bis 260, 113 bis 260 und 120 bis 260 der SEQ ID Nr: 1 und die Aminosäuren 47 bis 261, 112 bis 261, 113 bis 261 und 120 bis 261 der SEQ ID Nr: 2 auf. Weiters weisen CD40-Bindungsproteine Fragmente der extrazellulären Domäne von CD40L (SEQ ID Nr: 1 und SEQ ID Nr: 2) auf, die CD40 binden. Eine solche Bindung reicht aus, um ein Binden von löslichem CD40 an CD40L zu inhibieren, wie durch Beobachtung einer zumindest etwa 90% Inhibition der Bindung von löslichem CD40 an CD40L bestimmt wurde.
Alternative Ausführungsformen des CD40L-Polypeptids, löslicher CD40L-Polypeptide und geeigneter Fragmente davon schließen solche Polypeptide ein, bei denen ein Cystein bei Aminosäure 194 der SEQ ID Nr: 2 durch Tryptophan ersetzt ist. Noch weitere Ausführungsformen schließen CD40L-Polypeptid und lösliche CD40L-Polypeptide ein, die durch das Komplement der DNA codiert sind, die mit einer DNA, die irgendeines der vorerwähnten Polypeptide codiert, unter strenger Stringenz hybridisiert (Hybridisierung in 6 × SSC bei 63°C über Nacht, Waschen in 3 × SSC bei 55°C), und welche lösliches CD40 binden. Eine solche Bindung reicht aus, um ein Binden von löslichem CD40 an CD40L zu inhibieren, wie durch Beobachtung einer zumindest etwa 90% Inhibition der Bindung von löslichem CD40 an CD40L bestimmt wurde.
Ein bevorzugtes CD40-Bindungsprotein ist ein oligomeres lösliches CD40L, wobei der lösliche Teil ein oligomerisiertes Fragment der extrazellulären Domäne der SEQ ID Nr: 2 ist, und wobei das Cystein bei Aminosäure 194 durch Tryptophan ersetzt ist. Vorzugsweise weist das oligomere lösliche CD40L eine oligomerisierende Zipper-Domäne (z.B. den Leucin-Zipper), wie etwa jene der SEQ ID Nr: 3, oder eine Peptidvariante, bei der konservative Aminosäuresubstitutionen vorgenommen worden sind, wobei das Peptid in der Lage ist, ein oligomeres lösliches CD40L-Fusionsprotein zu bilden, auf. Ein solches lösliches oligomeres CD40L/Leucin-Zipper-Fusionsprotein enthält ein Polypeptid, das die Aminosäuren 113 bis 261 der SEQ ID Nr: 2 und den Leucin-Zipper der SEQ ID Nr: 3 (CD40L/LZ) aufweist.
Verfahren zur Expression von rekombinanten CD40L-Polypeptiden sind auch in den Patenten an Armitage beschrieben. Ähnliche Verfahren können angewendet werden, um weitere CD40-Bindungsproteine zu exprimieren. Außerdem sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie zahlreiche Expressionssysteme bekannt, einschließlich prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme. Das Expressionssystem, das gewählt wird, kann die Beschaffenheit des rekombinanten CD40-Bindungsproteins, das exprimiert wird, beeinflussen. Beispielsweise kann in Säugetier-Expressionssystemen (z.B. COS7-Zellen) exprimiertes CD40L bezüglich der relativen Molekülmasse und des Glycosylierungsmusters einem natürlich vorkommenden CD40L ähnlich sein, während in Hefe exprimiertes CD40L stärker als natürlich vorkommendes CD40L glycosyliert sein kann. Eine Expression von CD40L in bakteriellen Expressionssystemen wie etwa E. coli liefert nichtglycosylierte Moleküle.
Die Antikörper gegen CD40, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können polyklonal oder monoklonal sein. Der besondere agonistische CD40-Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, ist diesbezüglich unkritisch. Beispiele für solche CD40-Antikörper schließen HuCD40-M2 (ATCC Nr. HB11459) und HuCD40-M3 sowie Antigenbindungsdomänen davon ein. Weitere monoklonale CD40-Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, lassen sich unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erzeugen (siehe US-Patente RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993). Verwendbare agonistische Antikörper können auch mittels rekombinanter DNA-Techniken, um einen Maus-Antikörper zu "humanisieren" oder um wie im US-Patent 5,801,227 beschrieben Einzelketten-Antikörper herzustellen, konstruiert werden.
Wenn erst einmal geeignete CD40-Bindungsproteine erhalten worden sind, können sie durch viele Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, isoliert oder gereinigt werden. Geeignete Verfahren schließen Peptid- oder Proteinaffinitätssäulen, HPLC oder RP-HPLC, eine Reinigung über Protein A- oder Protein G-Säulen oder Kombinationen dieser Verfahren ein. Rekombinante CD40-Bindungsproteine können gemäß den Standardverfahren erzeugt werden und unter Verwendung von im Fach bekannten Test, darunter beispielsweise sowohl ELISA, ABC- oder Dot-Blot-Tests, als auch Tests auf die biologische Aktivität, wie etwa jene, die für den monoklonalen CD40-Antikörper beschrieben worden sind, auf ihre Bindungsspezifität zu dem CD40 geprüft werden.
Verabreichung von CD40-Bindeprotein
Das CD40-Bindungsprotein kann einem Lebewesen, vorzugsweise einem Menschen, in einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger verabreicht werden. Folglich kann das CD40-Bindungsprotein beispielsweise durch Bolusinjektion, subkutan oder intraperitoneal, kontinuierliche Infusion, intermittierende intravenöse Infusion, nachhaltige Freisetzung aus Implantaten oder durch andere geeignete Verfahren gegeben werden.
Typisch wird ein CD40-Bindungsprotein in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die gereinigtes CD40-Bindungsprotein zusammen mit physiologisch akzeptablen Trägern, Excipienten oder Verdünnungsmitteln enthält. Solche Träger sind für die Lebewesen in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen, nichttoxisch. Gewöhnlich ist die Herstellung solcher Zusammensetzungen mit einem Kombinieren eines CD40-Bindungsproteins mit Puffern, Antioxidationsmitteln wie etwa Ascorbinsäure, Polypeptiden mit einem geringen relativen Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextranen, Chelatbildnern wie etwa EDTA, Glutathion oder anderen Stabilisatoren und Excipienten verbunden. Neutral gepufferte Salzlösung oder Kochsalzlösung, gemischt mit konspezifischem Serumalbumin, sind beispielhafte geeignete Verdünnungsmittel.
Die besondere therapeutisch wirksame Menge, die verwendet wird, ist für die vorliegenden Erfindung nicht kritisch, wobei sie in Abhängigkeit sowohl von dem besonderen CD40-Bindungsprotein, das gewählt wird, von der Art, der Häufigkeit und Intensität der PDT, als auch vom Alter, Gewicht und Geschlecht des Lebewesens variieren wird. Typisch werden therapeutisch wirksame Dosierungen (Dosen, die eine anti-neoplastische Aktivität liefern, oder Dosen, die ausreichen, um eine verstärkte CTL-Reaktion zu liefern) des CD40-Bindungsproteins im Bereich von ungefähr 0,01 bis ungefähr 1,0 mg/kg Körpergewicht sein. Typischer sind die Dosen im Bereich von 0,05 bis 0,2 mg/kg Körpergewicht. Wie weiter unten beschrieben ist, kann eine Verabreichung des CD40-Bindungsproteins einen oder mehrere Tag(e) vor der Anwendung der PDT erfolgen, wobei sie über einen Zeitraum fortgesetzt wird, in dem die verstärkte CTL-Reaktion und die verstärkte Immunreaktion und/oder die verbesserte Reifung von Antigen aufweisenden Zellen wirksam ist. Alternativ kann eine Verabreichung des CD40-Bindungsproteins am Tag der PDT oder Tage nach der PDT beginnen. Auf jeden Fall ist zu bevorzugen, dass das CD40-Bindungsprotein vorhanden ist, um eine gleichzeitig mit der PDT oder sofort nach der PDT ablaufende Immunantwort zu verbessern.
CD40-Bindunsproteine können auch in Konjugaten von Arzneimitteln oder in Kombinationen mit Toxinen oder radioaktiven Verbindungen verwendet werden. Die Herstellung solcher Konjugate für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten ist im Fach bekannt (siehe beispielsweise Waldmann: Science, 252: 1657 (1991)).
Verabreichung der PDT
Eine photodynamische Therapie oder PDT wird mittels Verfahren durchgeführt, die im Fach bekannt sind. Verfahren zur Verabreichung einer PDT sind von Dougherty et. in: J. Natl. Cancer Institute 90: 889, 1998, beschrieben. Solche Verfahren schließen das Verabreichen eines Photosensibilisators oder eines Gemischs von Photosensibilisatoren, gefolgt von einer Bestrahlung des Lebewesens (der betroffenen Körperregion) mit Licht, das von dem Photosensibilisator absorbiert wird, ein. Nach der Absorption des Lichts, wird der Photosensibilisator in einem angeregten Zustand versetzt und bewirkt die Erzeugung von Singulettsauerstoff. Singulettsauerstoff ist hochgiftig, hat aber nur einen kleinen Wirkradius. Im Fach sind verschiedene Weisen der Verabreichung eines Photosensibilisators bekannt und werden, in der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Beispielsweise kann der Photosensibilisator oral, topisch, parenteral oder lokal (d.h. direkt in den oder in die Nähe des Tumors oder präkanzerösen Bereich) verabreicht werden. Die Photosensibilisatoren können auch unter Verwendung von Vehikeln wie etwa Phospholipid-Vesikeln oder Öl-Emulsionen zugeführt werden. Die Verwendung einer auf Lipiden basierenden Vehikelzuführung kann eine verstärkte Akkumulation des Photosensibilisators in neoplastischen Zellen zur Folge haben. Alternative Zuführungsverfahren, die ebenfalls in diesen vorliegenden Erfindungen eingeschlossen sind, schließen die Verwendung von Mikrokügelchen oder monoklonalen Antikörpern oder anderen Proteinen, die spezifisch ein Protein (oder Proteine), das an der Oberfläche von neoplastischen Zellen binden lokalisiert ist, ein.
Der besondere Photosensibilisator, der benutzt wird, ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Beispiele für Photosensibilisatoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen Hämatoporphyrine, Uroporphyrine, Phthalocyanine, Purpurine, Acridinfarbstoffe, Bacteriochlorophylle, Bacteriochlorine und weitere, die hierin offenbart sind, ein. Ein bevorzugt verwendeter Photosensibilisator ist Photofrin^® (QLT, Vancouver, Kanada); weitere Beispiele sind hierin offenbart und sowohl in Dougherty et al. als auch in verschiedenen anderen hierin offenbarten Quellen erörtert.
Die verabreichte Photosensibilisatormenge wird in Abhängigkeit sowohl von dem besonderen Photosensibilisator, der benutzt wird, vom Alter, Gewicht und Geschlecht des Lebewesens, von der Art und Weise der Verabreichung, als auch vom Typ, von der Größe und vom Ort des Tumors variieren. Beispielsweise kann Photofrin^® in Dosen von 2,0 oder 2,5 mg pro kg Körpergewicht verwendet werden. Die Dosierung für andere Photosensibilisatortypen kann im Bereich von 0,3 bis 7,2 mg pro kg Körpergewicht variieren. Dementsprechend ist der Fachmann in der Lage, bevorzugte Dosen verschiedener photosensibilisierender Agenzien nach einer Prüfung der relevanten Dosierungsinformationen vom Hersteller und/oder von anderen Fachkundigen festzulegen.
Die Wellenlänge des Lichts, der das Lebewesen ausgesetzt wird, wird in Abhängigkeit vom benutzten Photosensibilisator, vom Ort und von der Tiefe des Tumors oder der präkanzerösen Zellen variieren. Im Allgemeinen wird das Lebewesen Licht mit einer Wellenlänge von ungefähr 600 bis 900 nm, für Photofrin^® vorzugsweise ungefähr 600 bis ungefähr 640 nm, ausgesetzt. Verschiedene andere photosensibilisierende Agenzien haben ein stärkeres Absorptionsvermögen bei größeren Wellenlängen, im Bereich von ungefähr 650 bis 850 nm, was bei tiefer reichenden Tumoren vorteilhaft sein kann, da langwelligeres Licht tendenziell weiter in Gewebe eindringt. Umgekehrt kann eine Wellenlänge von ungefähr 410 nm zu besseren Ergebnissen führen, wenn eine geringe Eindringtiefe gewünscht ist; solche Dosierungen fallen ebenfalls in den Geltungsbereich dieser Erfindung.
Die Lichtdosis, der das Lebewesen ausgesetzt wird, wird je nach verwendetem Photosensibilisator unterschiedlich sein. Für Photofrin^® wird das Lebewesen im Allgemeinen einer Lichtdosis von ungefähr 50 bis 500 J/cm² rotem Licht ausgesetzt werden. Andere Sensibilisatoren können wirksamer sein und deshalb geringere Fluenzen, typisch von ungefähr 10 J/cm², erfordern. Bei höheren Fluenzen kann eine Hyperthermie auftreten, die die PDT verbessern kann; außerdem können Hyperthermie und PDT synergistisch wirken. Im Fach sind mehrere verschiedene Lichtquellen bekannt, wobei jede geeignete Lichtquelle, die im Stande ist, eine entsprechende Dosierung einer ausgewählten Wellenlänge zu liefern, bei den erfindungsgemäßen Verfahren benutzt werden kann.
Die Zeitvorgabe für die Lichtbestrahlung wird von dem benutzten Photosensibilisator, von der Art und dem Ort des Tumors oder der präkanzerösen Zellen sowie von den Verabreichungsverfahren abhängen. Typisch findet die Lichtbestrahlung ungefähr eine Stunde bis vier Tage nach der Verabreichung des Photosensibilisators statt. Außerdem können, wiederum in Abhängigkeit von dem Photosensibilisator, von der Art und dem Ort des Tumors kürzere Zeitspannen Anwendung finden. Beispielsweise kann eine Lichtbestrahlung nach einer topischen Verabreichung eines Photosensibilisators schon nach ungefähr zehn Minuten oder nach etwa drei Stunden nach der Verabreichung stattfinden (siehe US-Patent 6,011,563).
Verbessern der auf der Immunantwort basierenden Tumortherapie mit Kombinationstherapien
Der Satz von Teilen und die Verwendung der vorliegenden Erfindung schließen ferner einen oder mehrere Wirkstoffe ein, die zu verabreichen sind, um die auf der Immunantwort basierende Tumortherapie zu verbessern. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung, zusätzlich zur Verabreichung von CD40-Bindungsprotein in Kombination mit einer PDT ein oder mehrere Mobilisierungsagenzien, die die Anzahl der dendritischen Zellen erhöhen, zu verabreichen und/oder ein oder mehrere Agenzien, die eine Reifung von dendritischen Zellen herbeiführen, zu verabreichen und/oder ein oder mehrere Agenzien, die eine T-Zell-Proliferation, eine T-Effektorzell-Expansion und eine Immunaktivierung stimulieren, zu verabreichen.
Dendritische Zellen können in vivo vermehrt werden, indem dem tumortragenden Lebewesen Flt3L (beschrieben im US-Patent Nr. 5,554,512) und/oder GM-CSF verabreicht wird. Beispielsweise kann, bevor einem tumortragenden Lebewesen eine PDT verabreicht wird, über einen Zeitraum zwischen ungefähr 2 und 18 Tagen und vorzugsweise zwischen 10 und 14 Tagen FLt3-L in einer Dosis von 5 μg/kg bis 250 μg/kg und vorzugsweise von 25 μg/kg bis 150 μg/kg pro Tag verabreicht werden. Alternativ kann Flt3L alle 5 Tage mit Dosierungshöhen im Bereich von 50 μg/kg bis 450 μg/kg verabreicht werden.
Zusätzlich oder als eine Alternative zu in vivo-Verfahren zur Erzeugung von dendritischen Zellen können dendritische Zellen mittels in vitro-Verfahren erzeugt und anschließend dem tumortragenden Lebewesen verabreicht werden. Beispielsweise können vor einer Verabreichung einer PDT und nach einer Anwendung einer in vivo-Mobilisierung mit Flt3L, G-CSF, GM-CSF, Cyclophosphamid, SCF und/oder anderen Mobilisierungsagenzien CD34+-Zellen, Stamm- oder Vorläuferzellen unter Verwendung bekannter Gewinnungs- und Zelltrennungsverfahren gesammelt werden. Dendritische Zellen von den gesammelten CD34+-, Stamm- oder Vorläuferzellen können in vitro unter Verwendung von Stoffen, die eine Erzeugung von dendritischen Zellen bewirkenden wie etwa Flt3L, GM-CSF, CD40L oder einem anderen CD40-Bindungsprotein und IL-15, kultiviert werden. Alternativ können PBMCs für den Zweck der in vitro-Erzeugung dendritischer Zellen gesammelt werden. Die in vitro erzeugten dendritischen Zellen können in das eine PDT erhaltende tumortragendes Lebewesen infundiert werden, um die Anzahl der dendritischen Zellen, für eine Induktion einer CTL-Reaktion, zu erhöhen. Zellkulturmedien, die Flt3-L und/oder andere Agenzien für die in vitro-Erzeugung und -Mobilisierung von dendritischen Zellen enthalten, weisen diese Agenzien in Mengen auf, die genügen, um die Anzahl der dendritischen Zellen, die später dem Lebewesen mit einem Tumor oder einem präkanzerösen Zustand infundiert werden, zu maximieren. Solche Mengen können im Bereich von 0,1 μg/ml bis 5 μg/ml sein, wobei sie typisch ungefähr 2 μg/ml sind.
Verfahren für die in vivo und in vitro-Mobilisierung und -Erzeugung von dendritischen Zellen und Verfahren zur Stimulierung von T-Zell-Proliferationen sind in WO 97/12 633 und den gleichzeitig anhängigen US-Anmeldungen Nr. 09/154,903, 09/444,027, 09/448,378 beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können CD40-Bindungsproteine verabreicht werden, um eine Reifung von DZ zu stimulieren und ihre Fähigkeit, eine wirksame, spezifische, gegen den Tumor gerichtete zytotoxische Reaktion zu stimulieren, zu verbessern. CD40-Bindungsproteine können zusammen mit anderen DZ-Reifungsfaktoren wie etwa TNF-alpha, einem Liganden für den Rezeptoraktivator von NF-kappaB (RANKL), und Substanzen wie etwa Lipopolysaccharid verwendet werden. Außerdem können Agenzien, die eine CTL-Reaktion verbessern, zusammen mit einem CD40-Bindungsprotein verwendet werden. Solche Agenzien schließen die Interleukine 2, 15, 7 und 12, Interferon-gamma und Interferon-alpha ein. Die Reifung von dendritischen Zellen anregende Agenzien können systemisch oder lokal, an der oder in der Nähe der Tumorstelle appliziert werden. Dosen von CD40-Bindungsproteinen und im Besonderen von oligomeren löslichen Formen von CD40L können im Bereich von 0,01 mg/kg bis 1 mg/kg sein, wobei sie vorzugsweise im Bereich von 0,05 mg/kg bis 0,2 mg/kg sind. Die Dosierungshäufigkeit kann von täglich bis zu jedem zweiten Tag reichen und kann auf einmal pro Woche beschränkt sein, wenn die Art und Weise der Verabreichung einer solchen Häufigkeit bevorzugt (z.B. bei einer intravenösen Verabreichung).
Die Verwendung eines CD40-Bindungsproteins in Verbindung mit einer PDT, gemäß der vorliegenden Erfindung, bedeutet, dass das CD40-Bindungsprotein vor, während oder nach der PDT verabreicht werden kann. Vorzugsweise sollte ein CD40-Bindungsprotein nach der PDT verabreicht werden; insbesondere beginnt die Verabreichung des CD40-Bindungsproteins am Tag der PDT-Verabreichung oder ungefähr einen Tag oder zwei Tage danach. Außerdem kann die Kombination aus einem CD40-Bindungsprotein und einer PDT um die Anwendung zusätzlicher Wirkstoffe ergänzt sein, wie hierin beschrieben ist. Zusätzliche Wirkstoffe können, wie für den Wirkstoff und das angestrebte Ergebnis erforderlich ist, gleichzeitig zu der Verabreichung von CD40-Bindungsproteinen, davor oder danach verabreicht werden. Beispielsweise können FasL, TRAIL, CD30L and TNF alpha gleichzeitig zur Verabreichung des CD40-Bindungsproteins verabreicht werden. Die Anwesenheit dieser Wirkstoffe in Kombinationstherapien verbessert die tumorausrottenden Eigenschaften der Kombination aus CD40-Bindungsprotein und PDT. In einer Ausführungsform ist der Wirkstoff bzw. sind die Wirkstoffe in den Tumor oder in die Nähe des Tumors zu verabreichen.
Da die PDT ein von einer Radiotherapie (ionisierende Strahlung), Chemotherapie und Operation völlig verschiedenes Verfahren ist und folglich die Anwendung einer PDT nicht durch eine vorherige Radiotherapie, Chemotherapie oder Operation ausgeschlossen wird (Hsi et al.: Drugs, 57: 7250734 (1999); und McCaughan, Drugs & Aging, 15: 49068 (1999)), kann sie zusammen mit derartigen Verfahren angewendet werden (d.h. vor, während oder nach einem alternativen Verfahren wie etwa einer Strahlentherapie). Ihre verhältnismäßig geringe Toxizität macht die PDT außerdem als eine wiederholbare Form der Therapie geeignet. Außerdem können die hier beschriebenen Verbesserungen ermöglichen, Nebenwirkungen weiter zu verringern, indem die Photosensibilisatormenge oder die Dosierung des erforderlichen Lichts verringert wird.
Krankheitsvorbeugung oder -behandlung
Die hier präsentierten Ergebnisse deuten daraufhin, dass CD40-Bindungsproteine von erheblichem klinischem Nutzen bei der Behandlung von verschiedenen Tumoren sein können. Der Ausdruck Behandlung, wie er im Allgemeinen im Fach verstanden wird, verweist auf die Einleitung einer Therapie, nachdem klinische Symptome oder Krankheitsanzeichen festgestellt worden sind. In einer Ausführungsform kann der Tumor CD40 exprimieren, Beispiele hierfür sind B-Lymphome, Melanome oder Sarkome. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert der Tumor kein CD40. Beispiele für solche Tumore schließen T-Zell-Lymphome und Leukämien, viele Bindegewebetumore und Neuroblastome ein.
Außerdem wird die vorliegende Erfindung bei der Behandlung von präkanzerösen Zuständen (wie etwa dem Barrett-Osophagus) anwendbar sein, für welche eine PDT verwendet werden kann. Bei einer Anwendung in dieser Art und Weise können die hier beschriebenen Verfahren der Erfindung eher als vorbeugende Maßnahmen als eine genau definierte Behandlung eines erkrankten Individuums verstanden werden.
Die vorliegende Erfindung kann in Verbindung mit weiteren Therapien, die für erkrankte Lebewesen geeignet sind, einschließlich Chemotherapie, Strahlentherapie und Immuntherapie verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sind dafür bestimmt, besondere Ausführungsformen zu veranschaulichen, und nicht um Rahmen der Erfindung zu beschränken.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel zeigt, dass die schützende, antitumorale Reaktion, die durch eine PDT in vivo hervorgerufen wird, von der CD40:CD40L-Interaktion abhängig ist. Weibliche BALB/c-Mäuse (n = 45) wurden subkutan (SQ) mit 5,0 × 10⁴ BALB/c-Maus-Brustkrebs-EMT6-Zellen geimpft. Am Tag 6 nach der Tumor-Überimpfung wurde 30 tumortragenden Mäusen intraperitoneal (IP) Photofrin^® (ein Photosensibilisator, der von QLT, Vancouver, Kanada, bezogen wurde) in einer Dosis von 5,0 mg/kg injiziert. Den übrigen 15 tumortragenden Mäusen wurde kein Photofrin^® verabreicht (Negativkontrolle). Am folgenden Tag (Tag 7) wurden 15 der tumortragenden Mäuse, denen Photofrin^® injiziert worden war, mit 135 J/cm² rotem Licht mit einer Wellenlänge von 630 nm behandelt. Die Tumore der übrigen 15 tumortragenden Mäuse, denen Photofrin^® injiziert worden war und die nicht dem roten Licht ausgesetzt wurden, wurden operativ entfernt. Unmittelbar nach der Lichtbehandlung oder Operation erhielten 5 Mäuse jeder Behandlungsgruppe intraperitoneal 200 μg Ratten-IgG (Sigma), 200 μg monoklonales Ratten-anti-muCD40L M158 (Immunex Corporation, Seattle, WA) oder keine Antikörperinjektion. Diese Antikörperinjektionen wurden an den Tagen 8, 10 und 12 wiederholt. Den Mäusen der Negativkontrollgruppe wurden in gleicher Weise an den Tagen 7, 8, 10 und 12 Antikörper injiziert. Am Tag 13 wurden von allen Behandlungsgruppen Lymphknotenzellen isoliert und mit frischen EMT6-Tumorzellen in einem Verhältnis von 500 Lymphknotenzellen auf eine 1 Tumorzelle, d.h. 2,5 × 10⁶ Lymphknotenzellen und 5,0 × 10⁴ EMT6-Zellen, gemischt, und die resultierende Mischung wurde subkutan nicht tumortragenden BALB/c-Mäusen injiziert. Das Auftreten eines Tumors und das Tumorwachstum wurde vom Tag 18 bis zum Tag 90 überwacht. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Rolle der CD40/CD40L-Interaktion in der schützenden, antitumoralen Reaktion, die durch PDT ausgelöst wird
Wie in der Tabelle 1 gezeigt ist, löste die Behandlung von tumortragenden Mäusen mit der PDT eine starke antitumorale Immunantwort aus, die auf naive Mäuse, die mit dem EMT6-Tumor herausgefordert worden waren, übertragen wurde; 9/10 oder 90% der Mäuse, die eine photodynamische Therapie erhielten, entwickelten eine schützende antitumorale Immunantwort. Jedoch verhinderte eine Verabreichung von M158, einem muCD40L-spezifischen Antikörper, der die biologische Aktivität des CD40L neutralisiert, an Mäuse nach der photodynamischen Therapie die Entwicklung einer schützenden antitumoralen Immunantwort bei 60% der Mäuse. Das Kontroll-Ratten-IgG-Protein veränderte die Entwicklung der durch die PDT induzierten antitumoralen Immunität nicht. Ein operatives Entfernen des Tumors löste ebenfalls keine schützende Immunantwort aus.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die CD40L-Funktion für die Entwicklung einer schützenden, antitumoralen Immunantwort erforderlich ist, die im Anschluss an eine PDT-Behandlung auftritt. Dass CD40L bei der Erzeugung einer PDT-induzierten, schützenden, antitumoralen Immunität in vivo biologisch wichtig ist, ist eine wesentliche und neue Feststellung. Da die PDT eine einzigartige Behandlung ist, kann sie eingesetzt werden, wenn Operation, Chemotherapie und/oder Bestrahlung den Krebs nicht eliminiert haben. Kombinieren der PDT mit der Verabreichung eines CD40-Bindungsproteins sollte die in vivo antitumorale Immunantwort auf eine breite Palette von Tumoren verbessern.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt, dass die Verabreichung eines CD40-Bindungsproteins (lösliches, trimeres CD40L, als CD40LT bezeichnet) an tumortragende Lebewesen in Verbindung mit einer PDT in vivo eine antitumorale Behandlung verbessert. Weibliche BALB/c-Mäuse wurden subkutan mit Tumorzellen geimpft, die von einem schwach immunogenen Tumor stammten. Den Tumorzellen wurde ermöglicht zu wachsen und zwar für eine Zeit, die ausreichend war, um einen Tumor zu bilden, der mit einer PDT nicht vollständig eliminiert werden kann; einem Teil der Mäuse wurde intraperitoneal Photofrin^® (ein Photosensibilisator, der von QLT, Vancouver, Kanada, bezogen wurde) mit einer Dosis von 5,0 mg/kg injiziert. Den übrigen tumortragenden Mäusen ist kein Photofrin^® gegeben worden (Negativkontrolle). Am Tag nach der Photofrin^®-Verabreichung wurde die Hälfte der tumortragenden Mäuse, denen Photofrin^® injiziert worden war, mit 135 J/cm² rotem Licht mit einer Wellenlänge von 630 nm behandelt. Die Tumore der übrigen tumortragenden Mäuse, denen Photofrin^® injiziert worden war und die nicht dem roten Licht ausgesetzt wurden, wurden operativ entfernt. Innerhalb von einem Tag oder von zwei Tagen nach der Lichtbehandlung oder Operation erhielt die Hälfte der Mäuse in jeder Behandlungsgruppe intraperitoneal 200 μg Ratten-IgG (Sigma) oder CD40LT. Die Tumorhäufigkeit und das Tumorwachstum wurden wie benötigt überwacht. Die nachstehende Tabelle stellt eine Behandlungsmatrix dar, die benutzt wurde, um jeder Gruppe eine angemessene Anzahl Mäuse zuzuordnen. Tabelle 2: Bewertung der CD40LT/PDT-Kombinationstherapie

Tumortherapie Antikörperbehandlung

keine Ratten-IgG

keine CD40LT

PDT Ratten-IgG

PDT CD40LT

operative Entfernung Ratten-IgG

operative Entfernung CD40LT
Sequenzliste

Claims

Satz von Teilen, der ein CD40-Bindeprotein und einen Fotosensibilisator zur getrennten, gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verabreichung an eine Person zur Behandlung eines Tumors oder eines präkanzerösen Zustandes aufweist.
Satz von Teilen nach Anspruch 1, wobei der Satz außerdem einen Wirkstoff enthält, der aus der Gruppe bestehend aus: a) FasL, b) CD30L, c) TRAIL und d) TNF-Alpha ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das genannte CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Antikörper gegen CD40, b) CD40L, c) löslichem CD40L und d) einem oligomeren löslichen CD40L-Fusionsprotein, das 1) ein lösliches CD40L oder einen Antikörper gegen CD40, und 2) ein zweites Protein umfasst, ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 3, wobei der genannte Antikörper gegen CD40 aus der Gruppe bestehend aus monoklonalem Antikörper HuCD40-M2 (ATCC HB11459) und Antikörpern, die eine Antigenbindungsdomäne von Antikörper HuCD40M2 besitzen, ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 260 von SEQ ID NO: 1, 47 bis 260 von SEQ ID NO: 1, 113 bis 260 von SEQ ID NO: 1 oder 120 bis 260 von SEQ ID NO: 1 aufweist, b) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 261 von SEQ ID NO: 2, 47 bis 261 von SEQ ID NO: 2, 112 bis 261 von SEQ ID NO: 2, 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 oder 120 bis 261 von SEQ ID NO: 2 aufweist, c) einem Polypeptid, das ein Fragment der Polypeptide von SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, d) einem Polypeptid, das ein Fragment der Polypeptide von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, e) einem Polypeptid gemäß b) oder d), wobei das Cystein bei Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 durch Tryptophan ersetzt ist, und f) einem Polypeptid, das durch das Komplement einer DNA codiert wird, die mit einer DNA hybridisiert, welche eines der Polypeptide von a)–c) unter strenger Stringenz (Hybridisierung über Nacht in 6 × SSC bei 63°C; Waschung in 3 × SSC bei 55°C) codiert, wobei das codierte Polypeptid CD40 bindet, ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 3, wobei das genannte zweite Protein aus der Gruppe bestehend aus einer Immunglobulin Fc-Domäne und einer oligomerisierenden Zipper-Domäne ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 6, wobei die oligomerisierende Zipper-Domäne aus der Gruppe bestehend aus a) einem Peptid, das eine durch SEQ ID NO: 3 repräsentierte Aminosäuresequenz besitzt, und b) einer Variante des Peptids von a), wobei die Variante im wesentlichen aus dem Peptid von a) mit einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen besteht, wobei die Variante in der Lage ist, ein oligomeres CD40L-Fusionsprotein zu bilden. ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 1, wobei das CD40-Bindeprotein die Aminosäuren 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 und das Peptid von SEQ ID NO: 3 aufweist.
Satz von Teilen nach Anspruch 3, wobei das oligomere lösliche CD40L die Aminosäuren 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 und das Peptid von SEQ ID NO: 3 aufweist, wobei das Cystein bei Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 durch Tryptophan ersetzt ist.
Satz von Teilen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der genannte Tumor aus der Gruppe bestehend aus einem B-Lymphom, einem Melanom und einem Karzinom ausgewählt ist.
Verwendung eines CD40-Bindeproteins bei der Herstellung eines Medikamentes zur fotodynamischen Behandlung einer Person, die an einem Tumor oder einem präkanzerösen Zustand leidet.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Medikament weiters einen Wirkstoff aufweist, der aus der Gruppe bestehend aus: a) FasL, b) CD30L, c) TRAIL und d) TNF-Alpha ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das genannte CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus a) einem Antikörper gegen CD40, b) CD40L, c) löslichem CD40L und d) einem oligomeren löslichen CD40L-Fusionsprotein, das 1) ein lösliches CD40L oder einen Antikörper gegen CD40, und 2) ein zweites Protein aufweist, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der genannte Antikörper gegen CD40 aus der Gruppe bestehend aus monoklonalem Antikörper HuCD40-M2 (ATCC HB11459) und Antikörpern, die eine Antigenbindungsdomäne von Antikörper HuCD40M2 besitzen, ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das genannte CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 260 von SEQ ID NO: 1, 47 bis 260 von SEQ ID NO: 1, 113 bis 260 von SEQ ID NO: 1 oder 120 bis 260 von SEQ ID NO: 1 aufweist, b) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 261 von SEQ ID NO: 2, 47 bis 261 von SEQ ID NO: 2, 112 bis 261 von SEQ ID NO: 2, 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 oder 120 bis 261 von SEQ ID NO: 2 aufweist, c) einem Polypeptid, das ein Fragment der Polypeptide von SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, d) einem Polypeptid, das ein Fragment der Polypeptide von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, e) einem Polypeptid gemäß b) oder d), wobei das Cystein bei Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 durch Tryptophan ersetzt wird, und f) einem Polypeptid, das durch das Komplement einer DNA codiert wird, die mit einer DNA hybridisiert, welche eines der Polypeptide von a)–c) unter strenger Stringenz (Hybridisierung über Nacht in 6 × SSC bei 63°C; Waschung in 3 × SSC bei 55°C) codiert, wobei das codierte Polypeptid CD40 bindet, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das genannte zweite Protein aus der Gruppe bestehend aus einer Immunglobulin Fc-Domäne und einer oligomerisierenden Zipper-Domäne ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die oligomerisierende Zipper-Domäne aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 repräsentiert wird, und b) einer Variante des Peptids von a), wobei die Variante im wesentlichen aus dem Peptid von a) mit einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen besteht, wobei die Variante in der Lage ist, ein oligomeres CD40L-Fusionsprotein zu bilden, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das CD40-Bindeprotein die Aminosäuren 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 und das Peptid von SEQ ID NO: 3 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das oligomere lösliche CD40L die Aminosäuren 113–261 von SEQ ID NO: 2 und das Peptid von SEQ ID NO: 3 aufweist, wobei das Cystein bei Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 durch Tryptophan ersetzt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei der genannte Tumor aus der Gruppe bestehend aus einem B-Lymphom, einem Melanom und einem Karzinom ausgewählt ist.
Satz von Teilen, das ein CD40-Bindeprotein und einen Fotosensibilisator zur getrennten, gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verabreichung an eine Person zur Induzierung einer CTL-Immunreaktion in einer tumortragenden Person aufweist, wobei die CTL-Immunreaktion spezifisch für den Tumor ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 21, wobei das genannte CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Antikörper gegen CD40, b) CD40L, c) löslichem CD40L und d) einem oligomeren löslichen CD40L-Fusionsprotein, das 1) ein lösliches CD40L oder einen Antikörper gegen CD40, und 2) ein zweites Protein aufweist, ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 22, wobei das CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 260 von SEQ ID NO: 1, die Aminosäuren 47 bis 260 von SEQ ID NO: 1, die Aminosäuren 113 bis 260 von SEQ ID NO: 1 oder die Aminosäuren 120 bis 260 von SEQ ID NO: 1 aufweist, b) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 261 von SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 47 bis 261 von SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 112 bis 261 von SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren 120 bis 261 von SEQ ID NO: 2 aufweist, c) einem Polypeptid, das ein Fragment der Aminosäuren 47–260 von SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, d) einem Polypeptid, das ein Fragment der Aminosäuren 47–261 von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, e) einem Polypeptid gemäß b) oder d), wobei das Cystein bei Aminosäure 194 durch Tryptophan ersetzt ist, und f) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch das Komplement einer DNA codiert wird, welche mit einer DNA hybridisiert, die eines der Polypeptide von a)–e) unter strenger Stringenz (Hybridisierung über Nacht in 6 × SSC bei 63°C; Waschung in 3 × SSC bei 55°C) codiert, wobei das codierte Polypeptid lösliches CD40 bindet, ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 22, wobei das genannte zweite Protein aus der Gruppe bestehend aus einer Immunglobulin Fc-Domäne und einer oligomerisierenden Zipper-Domäne ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 24, wobei die oligomerisierende Zipper-Domäne aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 aufweist, und b) einer Variante des Peptids von a), wobei die Variante im wesentlichen aus dem Peptid von a) mit einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen besteht, wobei die Variante in der Lage ist, ein oligomeres CD40L-Fusionsprotein zu bilden, ausgewählt ist.
Satz von Teilen nach Anspruch 22, wobei das oligomere lösliche CD40L die Aminosäuren 113–261 von SEQ ID NO: 2 und das Peptid von SEQ ID NO: 3 aufweist, wobei das Cystein bei Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 durch Tryptophan ersetzt ist.
Satz von Teilen nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Satz außerdem Flt3L umfasst.
Satz von Teilen nach Anspruch 1 oder Anspruch 27, das weiters Flt3L zur Behandlung von hämatopoietischen Stamm- oder Vorläuferzellen enthält, die der Person entnommen wurden, um dendritische Zellen zu gewinnen.
Satz von Teilen nach Anspruch 1, Ansprüchen 2 bis 10 oder Anspruch 27 in Kombination mit dendritischen Zellen.
Verwendung eines CD40-Bindeproteins bei der Herstellung eines Medikamentes zur Induzierung einer CTL-Immunreaktion in einer tumortragenden Person in Verbindung mit fotodynamischer Therapie, wobei die CTL-Immunreaktion spezifisch für den Tumor ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das genannte CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Antikörper gegen CD40, b) CD40L, c) löslichem CD40L und d) einem oligomeren löslichen CD40L-Fusionsprotein, das 1) ein lösliches CD40L oder einen Antikörper gegen CD40, und 2) ein zweites Protein enthält, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das CD40-Bindeprotein aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 260 von SEQ ID NO: 1, die Aminosäuren 47 bis 260 von SEQ ID NO: 1, die Aminosäuren 113 bis 260 von SEQ ID NO: 1 oder die Aminosäuren 120 bis 260 von SEQ ID NO: 1 aufweist, b) einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 261 von SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 47 bis 261 von SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 112 bis 261 von SEQ ID NO: 2, die Aminosäuren 113 bis 261 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren 120 bis 261 von SEQ ID NO: 2 aufweist, c) einem Polypeptid, das ein Fragment der Aminosäuren 47–260 von SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, d) einem Polypeptid, das ein Fragment der Aminosäuren 47–261 von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Fragment CD40 bindet, e) einem Polypeptid gemäß b) oder d), wobei das Cystein bei Aminosäure 194 durch Tryptophan ersetzt ist, und f) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch das Komplement einer DNA codiert wird, welche mit einer DNA hybridisiert, die eines der Polypeptide von a)–e) unter strenger Stringenz (Hybridisierung über Nacht in 6 × SSC bei 63°C; Waschung in 3 × SSC bei 55°C) codiert, wobei das codierte Polypeptid lösliches CD40 bindet, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das genannte zweite Protein aus der Gruppe bestehend aus einer Immunglobulin Fc-Domäne und einer oligomerisierenden Zipper-Domäne ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die oligomerisierende Zipper-Domäne aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 aufweist, und b) einer Variante des Peptids von a), wobei die Variante im wesentlichen aus dem Peptid von a) mit einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen besteht, wobei die Variante in der Lage ist, ein oligomeres CD40L-Fusionsprotein zu bilden, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das oligomere lösliche CD40L die Aminosäuren 113–261 von SEQ ID NO: 2 und das Peptid von SEQ ID NO: 3 aufweist, wobei das Cystein bei Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 durch Tryptophan ersetzt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 20, wobei der Satz oder das Medikament weiters Flt3L enthält.
Verwendung nach Anspruch 11 oder Anspruch 36, die weiters Flt3L zur Behandlung von hämatopoietischen Stamm- oder Vorläuferzellen aus einer Person enthält, um dendritische Zellen zu gewinnen.