DE69633494T2

DE69633494T2 - Verfahren zur verhinderung von transplantatabstossung

Info

Publication number: DE69633494T2
Application number: DE69633494T
Authority: DE
Inventors: Onuora Modestus OBOCHI; Julia Levy
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: British Columbia Vancouver British, University of
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-12
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2016-01-13
Also published as: AU4381896A; FI972953A; CA2210109A1; JP3702330B2; EP0804238B1; DE69633494D1; ATE277636T1; JP2001526623A; CZ214697A3; CN1192157A; KR19980701317A; ES2227578T3; NO973251D0; HUP9801123A3; MX9705268A; FI972953A0; SK93797A3; PL321246A1; TW426518B; CA2210109C

Description

Technisches Gebiet
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bereitstellung von Allotransplantaten in der Therapie und zur Verhinderung der Abstoßung von Allotransplantaten durch einen Empfänger. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Behandlung von Spendergewebe mit photodynamischen Therapieverfahren zur Depletion des Gewebes von Antigen-präsentierenden Zellen und zur Verminderung der Immunogenität von darin enthaltenen Zellen.
Hintergrund des Standes der Technik
Der Erfolg einer Transplantation eines Allotransplantats in einen Wirt hängt von solchen Faktoren ab, wie den Antigenen auf dem transplantierten Gewebe, die vom Empfänger als Fremdkörper erkannt werden und die Abstoßungsantwort auslösen können, den Zellen im Immunsystem des Empfängers, die die Abstoßung vermitteln, und den Reaktionen, die entweder die Präsentation des Fremdantigens oder die zelluläre Antwort modifizieren. Es ist bekannt, dass eine signifikante Komponente der Allotransplantatabstoßung auf die Anwesenheit von nicht parenchymalen Zellen (Passenger-Leukozyten) im Spendergewebe zurückzuführen ist.
Es ist auch bekannt, dass die Produkte des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) eine wichtige Rolle bei der Mediation eines Angriffs durch das Transplantatgewebe gegen den Empfänger spielen. Der MHC ist im Allgemeinen komplex, weil er viele verschiedene Loci einschließt, wobei jeder getrennte Zelloberflächenantigene kodiert und weil die Loci einen extensiven Polymorphismus aufweisen. Die Loci des MHC fallen in eine von zwei Klassen, Klasse I oder Klasse II, basierend auf ihrer Gewebeverteilung, der Struktur der exprimierten Antigene und ihren Funktionen. Klasse-I-Antigene, die auf allen nukleierten Zellen vorhanden sind, dienen als die primären Ziele für cytotoxische T-(CD8⁺)-Lymphozyten. Klasse-II-Antigene sind nicht so verbreitet im Gewebe verteilt und dienen als primäre Ziele für Helfer-T-(CD8⁺)-Lymphozyten.
Die polymorphen Formen der einzelnen Loci von humanem Leukozyten-Antigen (HLA), dem MHC bei Menschen, wurden durch Antikörper und durch verschiedene In-vitro-Verfahren, die die T-Lymphozyten-Erkennung messen, erkannt. Diese Antworten, vermittelt durch die Erkennung von Polymorphismus im Spender seitens des Empfängers korrelieren mit den starken Abstoßungsreaktionen, die in vivo stattfinden. Die Untersuchung zur zellulären Grundlage der Transplantatabstoßung unter Verwendung von In-vitro- wie auch In-vivo-Studien gab zu erkennen, dass sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-Lymphozyten an der Abstoßungsreaktion beteiligt sind.
Versuche, das Überleben von Allo- und Xenotransplantaten nach der Transplantation sowohl in experimentellen Modellen als auch in der medizinischen Praxis zu verlängern, haben sich hauptsächlich auf die Suppression des Immunsystems des Empfängers konzentriert. Die Zielsetzung dieser Behandlung besteht in der präventiven Immunsuppression und/oder Behandlung der Transplantatabstoßung.
Beispiele von zur Immunsuppression verwendeten Mitteln schließen cytotoxische Mittel, Antimetabolite, Corticosteroide und antilymphozytäres Serum ein. Nicht spezifische Immunsuppressiva, die bei der präventiven Immunsuppression als besonders wirksam befunden wurden (Azathioprin, Bromocryptin, Methylprednisolon, Prednison und Ciclosporin A), haben den klinischen Transplantationserfolg signifikant verbessert. Die Nephrotoxizität von Ciclosporin A nach der Nierentransplantation wurde durch die Coadministration von Steroiden, wie zum Beispiel Prednisolon oder Prednisolon in Kombination mit Azathioprin, reduziert. Nieren wurden überdies unter Verwendung von Antilymphozyten-Globulin, gefolgt von Ciclosporin A, erfolgreich transplantiert. Ein anderes Protokoll besteht aus der totalen lymphatischen Bestrahlung des Empfängers vor der Transplantation, gefolgt von minimaler Immunsuppression nach der Transplantation. Die Behandlung der Abstoßung hat die Verwendung von Steroiden, 2-Amino-6-aryl-5-substituierten Pyrimidinen, heterologem Antilymphozyten-Globulin und monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Leukozytenpopulationen beinhaltet.
Die Hauptkomplikation von Immunsuppressiva ist Infektionen. Die systemische Immunsuppression ist zusätzlich von unerwünschten toxischen Wirkungen, wie z. B. Nephrotoxizität, wenn Ciclosporin A nach der Nierentransplantation verwendet wird, und der Reduktion des Spiegels der hämopoietischen Stammzellen begleitet. Immunsuppressiva können auch zu Adipositas, schlechter Wundheilung, steroidbedingter Hypoglykämie, Steroidpsychose, Leukopenie, gastrointestinaler Blutung, Lymphomen und Hypertonie führen.
Angesichts dieser Komplikationen haben die Transplantations-Immunologen nach Verfahren zur Suppression der Immunantwort auf eine antigenspezifische Weise gesucht, so dass nur die Antwort auf das Spender-Alloantigen verloren gehen würde. Eine derartige spezifische Immunsuppression wurde im Allgemeinen durch Modifikation von entweder der Antigenität des zu transplantierenden Gewebes oder der spezifischen Zellen, die zur Mediation der Abstoßung fähig sind, erreicht. Ob in bestimmten Fällen Immunität oder Toleranz induziert werden, hängt von der Art und Weise ab, auf die das Antigen dem Immunsystem präsentiert wird. Andere Strategien gegen eine Abstoßung haben sich auf die Eliminierung oder Attenuierung der MHC-tragenden Passenger-Leukozyten, d. h. die Antigen-präsentierenden Zellen („APC") in Spendergeweben vor der Transplantation konzentriert.
Verfahren, über die für diesen Zweck berichtet wurde, schließen das Kultivieren des Spendergewebes über eine verlängerte Zeitdauer ein (Lafferty et al., „Thyroid Allograft Immunogenicity is Reduced alter a Period in Organ Culture", Science, 188: 259 (1975)). Es wurde festgestellt, dass die Vorbehandlung der Allotransplantatgewebe durch Züchten in der Gewebekultur vor der Transplantation in zwei murinen Modellsystemen zur permanenten Verträglichkeit über die MHC-Schranken hinweg führt (Lafferty et al., Transplantation, 22: 138–49 (1976); Bowen et al., Lancet, 2: 585–86 (1979)). Es wurde hypothetisiert, dass eine derartige Behandlung in der Depletion von Passenger-Lymphzellen und folglich der Abwesenheit einer zur Gewebeimmunogenität notwendigen Stimulatorzellpopulation führt. So wurde zum Beispiel etwas HLA-Matching zwischen Spender und Empfänger, z. B. bei Gefäß- und Nierentransplantationen und manchmal vor Bluttransfusionen, verwendet.
Das Spendergewebe wurde mit Wachstumsfaktor, wie zum Beispiel TGF-β, (Czarniecki et al., US-Patent Nr. 5,135,915, erteilt am 4. August 1992), manchmal in Kombination mit verlängerten Kulturzeiten (Orton, US-Patent Nr. 5,192,312, erteilt am 9. März 1993) behandelt.
Spendergewebe kann mit UV-Licht behandelt werden (Reemtsma et al., US-Patent Nr. 4,946,438, erteilt am 7. August 1990, und Lau et al., „Prolongation of Rat Islet Allograft Survival by Direct Ultraviolett Irradiation of the Graft, Science, 223: 607 (1984)), manchmal zusammen mit Mikroeinkapselung (Weber et al., US-Patent Nr. 5,227,298, erteilt am 13. Juli 1993). Andere Wissenschaftler haben Barrierenmembranen allein verwendet, wie zum Beispiel die Bilayer, die eine erste nicht cytotoxische Schicht und eine zweite Außenschicht aus einem biokompatiblen und semipermeablen Polymermaterial, gelehrt von Cochrum, US-Patent Nr. 4,696,286, erteilt am 29. September 1987, umfasst.
Spendergewebe wurden mit einer großen Reihe verschiedener Substanzen, wie zum Beispiel der topischen Applikation von Ciclosporin auf Hauttransplantate, behandelt, wie von Hewitt et al., US-Patent Nr. 4,996,193, erteilt am 26. Februar 1991, offenbart wurde, und die Perfusion einer Spenderniere mit lymphozytischem Chalon, wie von Jones et al., US-Patent Nr. 4,294,824, erteilt am 13. Oktober 1981, beschrieben. Die Überlebenszeit von Hauttransplantaten wurde durch die In-vitro-Behandlung mit Cortison, Thalidomid, oder Urethan vor der Implantation in ein Labortier verlängert. Die Menge des lokal applizierten Arzneimittels auf die Haut ist gewöhnlich kleiner als die Menge, die zum Erlangen einer ähnlichen Wirkung durch Injektion des Arzneimittels systemisch in den Empfänger erforderlich ist. Die Spenderhaut wurde in vitro mit Streptokinase/Streptodornase, RNA- und DNA-Präparaten vom Empfänger oder Lösungen aus Glutaraldehyd vor der Transplantation zur Reduktion der Antigenität der zu transplantierenden Haut behandelt.
Fortschrittlichere Ansätze haben die Behandlung von Spendergewebe mit einem monoklonalen Antikörper beinhaltet, der gegen das MHC-Produkt, zusammen mit Komplement gerichtet ist (Faustmann et al., „Prolongation of Murine Islet Allograft Survival by Pretreatment of Islets mit Antibody Directly to Ia Determinants", Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 78: 5156 (1981)) oder der Behandlung des Spendergewebes mit einem Immunkonjugat des Antikörpers, der gegen den MHC gerichtet ist (Shizuru, J. A., et al., „Inhibition of Rat Mixed Lymphocyte Pancreatic Islet Cultures with Anti-Ia-Immunotoxin", Transplantation, 42: 660 (1986)). Variable Ergebnisse wurden anhand dieser Verfahren erhalten. Es besteht folglich im Stand der Technik ein Bedarf an einem Verfahren zur Verlängerung des Transplantatüberlebens bei Transplantationsoperationen, die die Toxizität und andere unerwünschte Wirkungen, die sich aus der Verwendung großer Dosen von Immunsuppressiva ergeben, minimieren würden.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Verfahren zur selektiven Zerstörung dieser APC-Zellen beinhaltet das Kontaktieren des Spendergewebes mit einem Photosensibilisator, gefolgt von Lichtexposition und dann Transplantation. Ähnliche photodynamische Verfahren wurden zuvor primär zur Zerstörung von Geweben, wie zum Beispiel Tumorgeweben, atherosklerotischen Plaques, oberflächlichen Hauterkrankungen und unerwünschten Pathogenen im Blut, eingesetzt (Levy et al., US-Patente Nr. 5,283,255, erteilt am 1. Februar 1994, 4,883,790, erteilt am 28. November 1989; 4,920,143, erteilt am 24. April 1990; 5,095,030, erteilt am 10. März 1992; und 5,171,749, erteilt am 15. Dezember 1992. Siehe auch Dougherty et al., US-Patente Nr. 4,932,934, erteilt 12. Juni 1990; 4,889,129, erteilt 26. Dezember 1989; 5,028,621, erteilt 2. Juli 1991; 4,866,168, erteilt am 12. September 1989; 5,145,863, erteilt am 8. September 1992; und 4,649,151, erteilt am 10. März 1987.
Das US-Patent 4,866,168 an Dougherty et al. offenbart zum Beispiel eine Zusammensetzung, die unter dem Warenzeichen „Photofrin II" angeboten wird, die durch Rückgewinnung des Aggregatanteils des Hämatoporphyrin-Derivats mit hohem Molekulargewicht erhalten wird. Als ein anderes spezifisches Beispiel offenbart US-Patent 4,883,790 an Levy et al. die Verwendung einer Gruppe verwandter Verbindungen, die als „Monohydrobenzoporphyrine" für analoge Zwecke bestimmt sind.
Es wurde außerdem die Verwendung vieler verschiedener Photosensibilisatoren von ähnlicher Struktur beschrieben. Siehe zum Beispiel die Derivate von (1-Hydroxyethyl)deuteroporphyrin, hydrophoben Hämatoporphyrin-Ethern und Verbindungen, die aus Methylpheophorbid hergestellt werden (Pandey et al., US-Patent Nr. 5,002,962, erteilt am 26. März 1991), Pyropheophorbid-Konjugate (Pandey et al., US-Patent Nr. 5,314,905); Bacteriochlorophyll-a-Derivate (Dougherty, US-Patente Nr. 5,171,741 und 5,173,504); Monovinyl- und Divinylether-verknüpfte Dimere (Ward, US-Patent Nr. 4,961,920); Benzoporphyrin-Derivate (Allison et al., US-Patent Nr. 5,214,036); Dibenzoporphyrin-Verbindungen (Dolphin et al., US-Patente Nr. 5,308,608 und 5,149,708); die sogenannten „grünen" Porphyrine, wie zum Beispiel Monobenzoporphyrin-Derivate (Jamieson et al., US-Patent Nr. 5,087,636); Porphyrin-Verbindungen, die exocyclische Doppelbindungen enthalten (Chang et al., US-Patent Nr. 5,064,952) und Porfimer-Natrium-Zusammensetzungen (Clauss et al., US-Patent Nr. 5,244,914). Im Allgemeinen werden diese Arzneimittel, in einer ersten Annäherung, hinsichtlich ihrer Verwendbarkeit in Bezug auf die photodynamische Therapie als untereinander austauschbar angesehen.
Während die photodynamische Therapie primär die Behandlung von Tumorzellen betrifft, wurden zusätzliche Applikationen zuvor gezeigt. So können diese Photosensibilisatoren zum Beispiel in Protokollen zur Eliminierung atherosklerotischer Plaques und bei der Behandlung von Blut und anderer Körperflüssigkeiten zur Zerstörung infektiöser Organismen verwendet werden. Die photodynamische Therapie wurde jedoch anscheinend noch nicht zur Eradikation von Passenger-Leukozyten in Spender-Allotransplantatgewebe verwendet.
Es ist insbesodere ein erfindungsgemäßer Vorteil, dass im Gegensatz zu therapeutischen Regimen, die die Verabreichung eines Photosensibilisators an einen Organismus beinhalten, Spendergewebe am angemessensten in vitro vor einem eigentlichen Transplantationsverfahren behandelt werden können. Auf diese Weise werden mit der Gewährleistung des richtigen Lichtexpositionsniveaus einhergehende Probleme, von z. B. mit einem mit den Targetzellen in einem Organismus assoziierten Konjugat, weitgehend umgangen.
Das erfindungsgemäße Verfahren resultiert weiter in Transplantaten, die immunologisch in geeigneten Wirten stabil, biologisch funktionell und dazu fähig sind, vor der Transplantation gelagert zu werden. Folglich wird erfindungsgemäß die Etablierung einer Bank aus photodynamisch behandelten Transplantaten ermöglicht, die zur kurzfristigen Lagerung verwendet werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Minimierung der Abstoßung von Transplantaten in Tieren. Vor der Transplantation wird Spendergewebe, das Antigenpräsentierende Zellen (APC) enthält, mit einem Photosensibilisator in Kontakt gebracht und Licht mit einer Wellenlänge ausgesetzt, das vom Photosensibilisator für eine Zeitdauer absorbiert wird, die zur Depletion der APC ausreichend ist. Diese Behandlung tötet nicht die Keratinozyten, sie kann jedoch ihre Expression, sowohl von Klasse-I- als u/oder Klasse-II-Antigenen als auch die von ihnen sezernierten Cytokine, dergestalt verändern, dass die Immunogenität der Haut selbst vermindert wird.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung eines Photosensibilisators zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung der Immunogenität von Spendergewebe, enthaltend Antigen-präsentierende Zellen (APC), während der photodynamischen Therapie unter Bedingungen, die für die genannten APC unter Verwendung einer Photosensibilisator-Menge von 0,1 bis 2 μg/ml nicht cytotoxisch sind.
Das Arzneimittel kann in einem Verfahren verwendet werden, das Folgendes umfasst:

a. Kontaktieren des Spendergewebes mit einem Photosensibilisator zum Erhalt eines modifizierten Spendergewebes;
b. Exposition des genannten modifizierten Spendergewebes gegenüber Licht mit einer Wellenlänge, das von genanntem Photosensibilisator für eine Zeit absorbiert wird, die zur funktionellen Attenuierung der APC im Spendergewebe ausreicht; und
c. Transplantation des Spendergewebes enthaltend modulierte APC in das Gewebe eines Empfängers.

Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Behandlung eines Spendergewebes bereit, das Antigen-präsentierende Zellen (APC) enthält, welches Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Kontaktieren des Spendergewebes mit einem Photosensibilisator zum Erhalt eines modifizierten Spendergewebes und
(b) Exposition des genannten modifizierten Spendergewebes gegenüber Licht mit einer Wellenlänge, das von genanntem Photosensibilisator für eine Zeit absorbiert wird, die zur funktionellen Attenuierung der APC im Spendergewebe, unter Bedingungen, die für die genannten APC nicht cytotoxisch sind und unter Verwendung einer Photosensibilisator-Menge von 0,1 bis 2 μg/ml, ausreicht.

Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Zusammensetzung von Substanzen bereitgestellt, die ein Spendergewebe von einem Spender umfasst, wobei das Spendergewebe Antigen-präsentierende Zellen (APC) enthält und in Beimischung mit einem Arzneimittel vorliegt, das einen Photosensibilisator bei einer Konzentration von 0,1 bis 2 μg/ml umfasst.
In einer Ausführungsform liegt der Photosensibilisator in der Form eines Konjugats vor, umfassend eine targetspezifische Komponente zur Verstärkung der Interaktion zwischen dem Photosensibilisator und den Target-APC. Der Photosensibilisator vermittelt die Zerstörung der APC, wenn das Allotransplantat bei einer geeigneten Wellenlänge, die vom Photosensibilisator absorbiert wird, bestrahlt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Struktur von BPD-Verbindungen, die als erfindungsgemäße Photosensibilisatoren besonders nützlich sind.
Ausführungsformen der Erfindung
Erfindungsgemäß wird das Spendergewebe, wie nachstehend beschrieben, vor der Transplantation von Spendergewebe mit einem Photosensibilisator kontaktiert. Der Begriff „Spendergewebe" umfasst jedwede transplantierbaren oder implantierbaren Gewebetypen von einem Spender mit Ausnahme des Empfängers, die APC enthalten. Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Spendergewebe kann es sich um jedes aus einer großen Reihe verschiedener Gewebe, wie zum Beispiel Weichteilgewebe, wie zum Beispiel die Amnionmembran eines Neugeborenen, Knochenmark, hämatopoietische Vorläuferzellen, Kollagen und Knochenprotein zur Stimulation des Knorpelgewebewachstums; Organe, wie zum Beispiel Haut, Herz, Leber, Milz, Pankreas, Schilddrüsenlappen, Lungen, Nieren, tubuläre Organe (z. B. Darm, Blutgefäße oder Ösophagus); und Teile von Organen, wie zum Beispiel Herzklappen und isolierte Zellen oder Zellcluster, wie zum Beispiel die Inselzellen des Pankreas oder Leberzellen, handeln.
Tubuläre Organe können zum Ersatz geschädigter Anteile des Ösophagus, der Blutgefäße oder des Gallengangs verwendet werden. Hauttransplantate können nicht nur für Verbrennungen, sondern auch als ein Verband für den beschädigten Darm oder zum Schließen bestimmter Defekte, wie zum Beispiel einer Zwerchfellhernie, verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt das Spendergewebe Hautgewebe oder pankreatische Inselzellen dar.
Der Begriff „Transplantat", wie hierin verwendet, verweist auf biologisches Material, das sich von einem Spender zur Transplantation in einen Empfänger herleitet. Der Begriff „Transplantation" und Variationen davon verweisen auf die Insertion eines Transplantats in einen Empfänger, ob die Transplantation syngen (wenn der Spender und der Empfänger genetisch identisch sind), allogen (wenn der Spender und Empfänger von verschiedener genetischer Herkunft, aber von der gleichen Spezies sind) oder xenogen (wenn der Spender und der Empfänger von verschiedenen Spezies sind) ist. In einem typischen Szenario ist folglich der Wirt ein Mensch und das Transplantat ist ein Isotransplantat, das sich von einem Menschen gleicher oder verschiedener genetischer Herkunft herleitet. In einem anderen Szenario leitet sich das Transplantat von einer Spezies her, die sich von der unterscheidet, in die es transplantiert wird, einschließlich Tieren von phylogenetisch weitgehend getrennten Spezies, zum Beispiel ein Pavianherz, das in einen humanen Wirt transplantiert wird.
Das Spendergewebe kann aus jedweder Quelle entnommen werden, ob von Leichen oder lebenden Spendern. Beispiele geeigneter Spender schließen lebende Tiere, wie zum Beispiel Labortiere, wie zum Beispiel Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Wüstenspringmäuse, Meerschweinchen, Kühe, Primaten oder Menschen, ein. Spender sind bevorzugt Säuger, einschließlich Menschen.
Humane Spender sind bevorzugt freiwillige, blutsverwandte Spender, die bei einer körperlichen Untersuchung normal und von der gleichen wichtigen AB0-Blutgruppe sind, weil das Überqueren wichtiger Blutgruppenschranken das Überleben eines Allotransplantats gefährden kann. Es ist jedoch möglich, zum Beispiel eine Niere eines Spenders des 0-Typs in einen Empfänger des A-, B- oder AB-Typs zu transplantieren.
Der Begriff „Allotransplantat" verweist auf Zellen und Gewebe, die von einem Spender der gleichen Spezies wie der Empfänger herstammt oder sich von ihnen herleitet. Der Spender ist bevorzugt von der gleichen Spezies wie der Empfänger.
Der Begriff „Empfänger", wie hierin verwendet, verweist auf jedweden kompatiblen Transplantatwirt. Unter „kompatibel" versteht man einen Wirt, der das gespendete Transplantat annimmt. Beispiele potenziell nützlicher Empfänger schließen Tiere, bevorzugt Säuger, wie zum Beispiel landwirtschaftliche Nutztiere, zum Beispiel Pferde, Kühe oder Schafe; Haustiere, wie zum Beispiel Hunde oder Katzen; Labortiere, wie zum Beispiel Mäuse, Ratten, Wüstenspringmäuse oder Meerschweinchen; oder Primaten, wie zum Beispiel Affen oder Menschen, ein. Der Empfänger ist am bevorzugtesten ein Mensch. Wenn sowohl der Spender des Transplantats als auch der Wirt Menschen sind, wird bevorzugt ein Matching von Antigenen der Klasse-II-HLA durchgeführt, um auf diese Weise die Histokompatibiltät zu verbessern.
Photosensibilisatoren
Im Allgemeinen ist jedwede Verbindung eine unter einer großen Reihe verschiedener Verbindungen, die in der klassischen photodynamischen Therapie nützlich sind, zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Wie dem Durchschnittsfachmann bekannt sein wird, stellen die Porphyrin-verwandten Verbindungen eine wichtige Klasse bekannter Photosensibilisatoren dar. Wie vorstehend ausführlich beschrieben wurde, schließen diese Arzneimittel folgende ein: Hämatoporphyrin-Derivate, die Fraktion des Hämatoporphyrin-Derivats mit hohem Molekulargewicht, das als die Photosensibilisator-Zusammensetzung Photofrin II vertrieben wird und die aktiven Komponenten davon, verschiedene synthetische Derivate von Porphyrinen, wie zum Beispiel die Monohydrobenzoporphyrine, auf die auch als auf Benzoporphyrin-Derivate oder BPD verwiesen wird; grüne Porphyrine; und verschiedene andere polycyclische Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie bei Bestrahlung Singulett-Sauerstoff generieren, wobei sie folglich zur Zerstörung des Gewebes führen.
Verfahren zur Herstellung geeigneter Photosensibilisator-Verbindungen werden in den vorstehend beschriebenen Patenten und in den darin zitierten Veröffentlichungen, vollständig offenbart. Der Photosensibilisator ist bevorzugt BPD.
Im Prinzip handelt es sich bei dem kritischen Merkmal eines jeden Photosensibilisators um seine Neigung, wenn er Licht einer Wellenlänge ausgesetzt wird, die vom Photosensibilisator absorbiert werden kann, eine cytotoxische Wirkung auf Zellen, in denen er lokalisiert ist, auszuüben. Während angenommen wird, dass in vielen Fällen die cytotoxische Wirkung auf die Bildung von Singulett-Sauerstoff bei Exposition zurückzuführen ist, ist die genaue Funktionsform erfindungsgemäß nicht kritisch.
Wie in den vorstehenden Patenten von Dougherty et al. ausführlich besprochen wurde, sind in der Regel eine Anzahl zusätzlicher spezifischer Eigenschaften mit wirksamen Photosensibilisatoren assoziiert. Unter den Eigenschaften der Photosensibilisatoren im Allgemeinen, die von besonderer Signifikanz bei der erfindungsgemäßen praktischen Ausführung sind, befinden sich eine relative Abwesenheit von Toxizität auf Zellen bei Abwesenheit der photochemischen Wirkung und eine bereitwillige Clearance aus Geweben in Abwesenheit einer targetspezifischen Interaktion zwischen bestimmten Zellen und dem Photosensibilisator.
Die erfindungsgemäßen Photosensibilisatoren weisen bevorzugt ein Absorptionsspektrum auf, das im Wellenlängenbereich zwischen 350 nm und 1200 nm liegt, wobei das Absorptionsspektrum auf die gewünschte Penetration auf eine Weise spezifisch zugeschnitten werden kann, von der bekannt ist, dass sie per se bevorzugt zwischen ca. 400 und 900 und am bevorzugtesten zwischen 600 und 800 liegt.
Die erfindungsgemäßen Photosensibilisatoren werden auf eine Weise dosiert, die der guten medizinischen Praxis entspricht, wobei der Beschaffenheit der Transplantation und der zu behandelnden Erkrankung, der Spezies des Empfängers, der Erkrankung des individuellen Empfängers, dem Vorliegen von jedwedem anderem Arzneimittel im Spendergewebe oder im Körper des Empfängers und anderen den Fachleuten bekannten Faktoren Rechnung zu tragen ist. Eine therapeutisch wirksame Photosensibilisator-Menge, die zum Kontaktieren des Transplantats verwendet wird, ist eine Menge, die zur Reduktion der Immunogenität des Transplantats wirksam ist, so dass es mit dem Empfänger kompatibel ist und nicht abgestoßen wird. Die allgemein wirksame Menge für diesen Zweck liegt im Bereich von 0,1 bis 2,0 μg/ml und bevorzugt von ca. 0,25 bis ca. 1,0 μg/ml.
Der Photosensibilisator kann mit einem Immunsuppressivum oder mehr Immunsuppressiva zur Verstärkung der immunsuppressiven Wirkung auf das Transplantat kombiniert werden. Die wirksame Menge dieser anderen Mittel hängt von der Menge des in der Formulierung anwesenden Photosensibilisators, dem Transplantattyp, der Ursache der Transplantation, dem Ort der Abgabe, dem Verabreichungsverfahren, dem Verabreichungsplan, anderen vorstehend besprochenen Faktoren und anderen dem Fachmann bekannten Faktoren ab.
Der Photosensibilisator wird in der Regel durch sein Mischen bei Umgebungstemperaturen, geeignetem pH und dem gewünschten Reinheitsgrad, mit einem oder mehr physiologisch verträglichem/n Träger(n), d. h. Trägern, die für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind, formuliert. Der pH der Formulierung hängt hauptsächlich vom jeweiligen Gebrauch und der Konzentration des Photosensibilisators ab, liegt aber bevorzugt im Bereich irgendwo von ca. 3 bis ca. 8.
Der Photosensibilisator wird bevorzugt bei neutralem pH (z. B. bei ca. 6,5 bis ca. 7,5) aufrechterhalten, um sein Kleben an den Behältnissen, in die er gegeben wurde, zu verhindern, so wie es bei pH-Werten auftritt, die sich den physiologischen Spiegel annähern und um die Aktivierung des Photosensibilisators zu gewährleisten. Folglich stellt die Formulierung in einer Elektrolytlösung, die einen ausgeglichenen Salzpuffer bei pH 6,5, aber kein fetales Rinderserum („FBS") enthält, eine geeignete Ausführungsform dar. Der Grund, dass FBS ausgelassen wird, ist darauf zurückzuführen, dass es antigene Komponenten enthält, welche die Reaktion des Allotransplantats exazerbieren könnten. Wenn der Photosensibilisator an den Behältnissen klebt, in denen die Transplantate behandelt werden, wird ein geeigneter nicht antigener Bestandteil, wie zum Beispiel humanes Serumalbumin, gegebenenfalls in einer Menge zugefügt, die den Photosensibilisator nicht bei der Perfusion oder durch Anhaften des zu behandelnden Transplantats stört.
Wenn die Photosensibilisator-Formulierung topisch appliziert werden soll, wenn sie zum Beispiel vor der Transplantation auf das Hauttransplantat gestrichen werden soll, ist die Verwendung einer viskosen Lösung, wie zum Beispiel ein Gel, anstelle einer nicht viskosen Lösung, bevorzugt. Das Gel kann zum Beispiel durch Mischen der Lösung des Photosensibilisators mit einem Geliermittel, wie zum Beispiel einem Polysaccharid, bevorzugt einem wasserlöslichen Polysaccharid, wie zum Beispiel einer Hyaluronsäure, Stärken und Cellulose-Derivaten, wie z. B. Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Carboxymethylcellulose erlangt werden. Wenn ein Polysaccharid in einer Gelformulierung anwesend ist, liegt die Menge gewöhnlich im Bereich von ca. 1–90 Gew.-% des Gels, bevorzugter ca. 1–20% vor. Beispiele anderer geeigneter Polysaccharide für diesen Zweck und eine Bestimmung der Löslichkeit der Polysaccharide sind in EP 267,015 , veröffentlicht am 11. Mai 1988, zu finden, deren Offenbarung hierin unter Bezugnahme inkorporiert ist.
Wenn das zu behandelnde Transplantat für eine beliebige Zeitdauer gelagert werden soll, wird der Photosensibilisator bevorzugt hineinformuliert oder einer perfluorchemischen Emulsion (die als Blutsubstitut wirkt) zugefügt, um zu ermöglichen, dass hohe Sauerstoffkonzentrationen das Transplantat erreichen. Derartige Emulsionen umfassen eine Perfluorchemikalie, wie zum Beispiel Perfluordecalin und/oder Perfluortripropylamin, das mit einem Tensid in Wasser emulgiert ist. Es wird die Perfluorchemikalie gewählt, die für den Empfänger am wenigsten toxisch ist.
Beispiele geeigneter Tenside schließen die Poloxamer-Tenside ein, die eine Reihe von Molekülen darstellen, bei denen es sich um Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, entweder allein oder in Beimischung mit einem Phospholipid genommen, wie zum Beispiel Eilecithin, handelt. Ein anderes Beispiel einer Emulsion, die im Handel von Green Cross erhältlich ist, stellt Fluosol-DA 20% dar, das Perfluordecalin und Perfluortripropylamin enthält, das mit dem Poloxamer-Tensid, Pluronic F-68, emulgiert ist. Die Emulsionen von Perfluorchemikalien und ihre Wirkungen in Säugern werden ausführlicher in Bollands et al., J. Pharm. Pharmacol., 39: 1021–1024 (1987) beschrieben.
Die Photosensibilisator-Formulierung zur Verwendung bei der therapeutischen Verabreichung ist bevorzugt steril. Sterilität wird ohne weiteres durch sterile Filtration durch Membranen (0,2 Mikron) erreicht. Sobald der Photosensibilisator formuliert und sterilisiert wurde, könnte er gegenüber der oxidativen Denaturierung nicht stabil sein. Lyophilisierte Formulierungen zur Rekonstitution zum Beispiel, die BPD enthalten, sind jedoch zur Lagerung geeignet.
Targeting-Systeme
Die Verwendung dieser Photosensibilisatoren bei der Zerstörung der Fähigkeit des Spendergewebes, eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion zu initiieren, wird durch die Konjugation des Photosensibilisators an ein targetspezifisches Mittel verstärkt. Der Photosensibilisator kann insbesondere an (1) eine Komponente, die spezifisch die Antigen-präsentierenden Zellen (APC) im Spendergewebe direkt targetiert, (2) eine Komponente, die spezifisch ein Intermediärmaterial targetiert, welche die APC zum Targetieren durch das Konjugat markiert, oder (3) T-Zellen für eine Transplantat-gegen-Wirt-Situation, konjugiert werden. Sobald das Spendergewebe durch Interaktion mit dem Konjugat modifiziert wurde, wird es in beiden Fällen auf eine Weise exponiert, von der per se bekannt ist, dass sie eine weitgehende Depletion des APC-Pools im Spendergewebe bewirkt.
Es werden erfindungsgemäß spezifische Photosensibilisator-enthaltende Konjugate bereitgestellt, die zum Targetieren von APC in Allotransplantat-Spendergewebe wie auch als ein Verfahren zum Zerstören der APC in Spendergeweben durch die photodynamische Therapie („PDT") allgemein nützlich sind. Eine in diesem Verfahren nützliche Formulierung besteht im Wesentlichen aus einem Photosensibilisator und einem System zum Verknüpfen eines „Homing-Mittels" mit dem Photosensibilisator. Eine andere Formulierung umfasst die Kombination eines APC-Targeting-Systems und eines Photosensibilisators, der mit einem Homing-Mittel für das APC-Targeting-System konjugiert ist. Das letzendliche Ziel der Abgabe des Photosensibilisators ist mit beiden Formulierungen identisch.
Die targetierten APC können durch eine Reihe verschiedenster unterschiedlicher Typen targetspezifischer Mittel, einschließlich Komponenten, die für die MHC-Glycoprotein-Produkte und Lymphokin-Faktoren immunspezifisch sind, für die diese Zellen Rezeptoren tragen, zugänglich gemacht werden. Zur Reaktion mit den MHC-Glycoproteinen können gegen diese Glycoproteine gebildete Antikörper, entweder polyklonal oder monoklonal, verwendet werden.
Polyklonale Antiseren werden auf herkömmliche Weisen, wie zum Beispiel durch Injektion eines geeigneten Säugers mit Antigen, für das ein Antikörper erwünscht ist, wobei der Antikörper-Spiegel im Serum gegen das Antigen bestimmt und Antiseren hergestellt werden, wenn die Titer hoch sind. Präparationen aus monoklonalen Antikörpern können auch auf übliche Weise hergestellt werden, wie zum Beispiel nach dem Verfahren von Köhler und Milstein, Nature, Vol 226, S. 495–497 (1975). „Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity" und European Journal of Immunol., Vol. 6, S. 511–519 (1976), „Derivation of Specific Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cellfusion", unter Verwendung von z. B. Lymphozyten im peripheren Blut oder Milzzellen aus immunisierten Tieren und Immortalisierung dieser Zellen entweder durch Virusinfektion, durch Fusion mit Myelomen oder durch andere übliche Verfahren und Screening auf die Produktion der gewünschten Antikörper durch isolierte Kolonien.
Außer den Antikörpern können auch geeignete immunreaktive Fragmente, wie zum Beispiel the Fab-, Fab'- oder F(ab)₂-Fragmente, eingesetzt werden. Viele zum Gebrauch beim Bilden des Targeting-Mechanismus geeignete Antikörper sind bereits im Stand der Technik erhältlich. So wird zum Beispiel die Verwendung immunologisch reaktiver Fragmente als Substitute für ganze Antikörper von E. L. Morgan et al., Scand. J. Immunol., Vol 10, S. 395–402 (1979), „Comparison of the Bindung of Radiolabelled Human IgG and Fc-Fragments to Murine Spleen Cells" und Hans P. Kocher et al., The Journal of Immunol., Vol 122, Nr. 4, S. 1190–1195 (1979), „Tryptic Degradation of the CH1- und VL-Regionen von OgD und IgE1" beschrieben.
Zusätzlich zur Immunreaktivität kann unter Verwendung von Rezeptor-Liganden, die Rezeptoren an der APC-Zelloberfläche targetieren, zum Beispiel auf der Grundlage der Komplementarität von Konturen oder Ladungsmustern zwischen dem Rezeptor und Liganden, Targeting bewirkt werden. Wie hierin verwendet, verweist der Begriff „Rezeptor-Ligand" auf jedwede Substanz, natürlich oder synthetisch, die spezifisch an den APC-Zelloberflächen-Rezeptor bindet. Diese Rezeptor-Liganden schließen Lymphokin-Faktoren, wie zum Beispiel IL-2 ein.
Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Photosensibilisator mit einem targetspezifischen Mittel für ein Intermediärprodukt konjugiert, das wiederum für die APC spezifisch ist. Im Fall von Ia präsentierenden Rattenzellen könnte zum Beispiel der Maus-Antiratten-Ia-Antiköper als ein Intermediärprodukt verwendet werden. In diesem Fall würde ein Konjugat des Photosensibilisators, gekoppelt mit Antimausantikörper, Zellen, die mit dem murinen Antikörper markiert sind, auf genau die gleiche Weise wie dies ein Antiratten-Ia-Antikörper umfassendes Konjugat direkt tun würde, targetieren.
Konjugationsverfahren
Das Targeting-System kann unter Verwendung üblicher Verfahren und der Linker-Technologie, wie sie im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt sind und anhand des Beispiels in den vorstehenden Patenten von Levy et al. beschrieben sind, direkt an den Photosensibilisator konjugiert werden. Für Proteine, wie zum Beispiel Ig und andere Polypeptide, kann eine direkte kovalente Bindung zwischen dem Photosensibilisator und der targetspezifischen Komponente unter Verwendung von z. B. einem Dehydratisierungsmittel, wie zum Beispiel einem Carbodiimid, bewirkt werden. Aktive Komponenten des Konjugats können selbstverständlich auch durch die Verwendung von Linker-Verbindungen, die bifunktionell und dazu fähig sind, die beiden aktiven Komponenten kovalent miteinander zu verbinden, miteinander verbunden werden.
Jedes im Stand der Technik bekannte wirksame Verfahren, das zum Verbinden der beiden chemischen Komponenten geeignet ist, fällt in den erfindungsgemäßen Rahmen. Unter der Linker-Komponente versteht man im weiteren Sinne eine kovalente Bindung oder jedwede Linker-Komponente, die im Stand der Technik unter Verwendung von Standardverfahren erhältlich ist oder sich daraus herleiten lässt.
Als Alternative kann das Targeting durch zusätzliche spezifische Mittel vermittelt werden. Wie zum Beispiel nachstehend erläutert wird, kann ein auf den APC-spezifischen Antikörper gerichteter sekundärer Antikörper direkt mit dem Photosensibilisator verknüpft werden, und das MHC-Glycoprotein-targetierende Mittel kann als ein Brücke zwischen dem Immunkonjugat und der targetierten Zelle verwendet werden.
Behandlungsprotokoll
Die erfindungsgemäße Eliminierung oder funktionelle Attenuierung von APC oder die Modulation anderer Hautzellen, wie zum Beispiel Keratinozyten, wird auf eine relativ einfache Weise durch Kontaktieren des Spendergewebes direkt mit dem Photosensibilisator bewirkt, der in der Konjugatform vorliegen kann, unter Bedingungen, welche die Bildung einer starken Assoziation zwischen dem Photosensibilisator (oder der Target-spezifischen Komponente eines Photosensibilisator-enthaltenden Konjugats) und den Target-APC ermöglicht, während die Konzentration des Photosensibilisators im Spendergewebe minimiert wird.
Der Kontakt beinhaltet geeigneterweise die Applikation der Zusammensetzung auf eine oder mehr Oberfläche(n) des Transplantats oder Inkubieren oder Perfundieren eines Organtransplantats mit der erfindungsgemäßen Photosensibilisator-Formulierung. Die Behandlung findet im Allgemeinen mindestens eine Minute, bevorzugt von ca. 1 Minute bis ca. 72 Stunden und noch bevorzugter von ca. 2 Minuten bis ca. 24 Stunden statt. Die Kontaktzeit hängt von solchen Faktoren, wie der Konzentration des Photosensibilisators in der Formulierung, des zu behandelnden Transplantats und dem bestimmten Typ der Formulierung ab. Die Perfusion wird durch jedwedes geeignete Verfahren erreicht. So kann zum Beispiel ein Organ über eine Vorrichtung perfundiert werden, die einen konstanten Druck oder eine Perfusion bereitstellt, wobei sich ein Druckregler und eine Überlaufsituation zwischen einer Pumpe und dem Organ befinden. Als Alternative kann das Organ über eine abdichtbare Tür in eine Überdruckkammer gegeben werden und das Perfusat mittels einer Pumpe, welche die Flüssigkeit aus einem Reservoir zieht, an die Kammer abgegeben werden, während erschöpftes Perfusat gegebenenfalls über ein Ventil an das Reservoir zurückgeleitet wird.
Für Hauttransplantate kann die Formulierung auf die untere Oberfläche der zu transplantierenden Haut aufgestrichen oder gesprüht werden, so dass sich eine Schicht des Photosensibilisators zwischen der unteren Oberfläche des Spenders und dem Gewebe des Empfängers befindet. Das Ganzhauttransplantat wird jedoch bevorzugt in die Photosensibilisator-Zusammensetzung eingetaucht.
Der Kontaktierungsschritt kann über viele verschiedene Temperaturen stattfinden, wobei nur die Temperaturen, die zum Denaturieren hoch genug sind oder um eine anderweitig schädliche Wirkung auf das Transplantat auszuüben und die Temperaturen, die niedrig genug sind, um die zelluläre Aufnahme des Photosensibilisators zu minimieren, vermieden werden. Der Kontaktierungsschritt findet bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von ca. 50°C bis ca. 400°C, bevorzugt von ca. 150°C bis ca. 370°C und am bevorzugtesten bei Umgebungstemperatur statt.
Im Anschluss an eine geeignete Verteilung des Photosensibilisators zur Gewährleistung, dass er ordnungsgemäß mit den Target-APC assoziiert ist, wird das auf diese Weise behandelte Spendergewebe Licht mit einer Wellenlänge ausgesetzt, das vom Photosensibilisator absorbiert wird und zur Aktivierung der cytotoxischen Eigenschaften des Photosensibilisators führt. Eine derartige Exposition ist im Fach der photodynamischen Therapie selbstverständlich vollkommen konventionell. Beispielhafte Verfahren und Vorrichtungen für diesen Zweck werden zum Beispiel in den vorstehenden Patenten von Dougherty et al. beschrieben.
Nachdem das Transplantat mit dem Photosensibilisator kontaktiert und dem Licht ausgesetzt wurde, kann es so lange wie ca. 24–48 Stunden gelagert werden. Es wird jedoch in einem Transplantationsverfahren bevorzugt sofort verwendet. Die Lagerfähigkeit kann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung eines Blutsubstituts in der Formulierung (z. B. einer Emulsion von Perfluorchemikalien) oder durch Perfundieren des Transplantats mit einer Formulierung des Photosensibilisators, die ein gekühltes isotonisches Mittel und Antikoagulans enthält, gefolgt von Glycerol, um das Einfrieren der Transplantate mit wenig Zerstörung der Zellen zu ermöglichen, zu verbessern, wie in JP 60061501 , veröffentlicht am 9. April 1985, beschrieben wird. Das Transplantat kann außerdem mit verschiedenen Flüssigkeiten, welche die Formulierung einschließen, konserviert werden, während die Organe auf Gefriertemperaturen gekühlt werden, um das Organ semipermanent ohne Zellnekrocytose zu konservieren.
Vor der Transplantation wird das Transplantat zur Entfernung der Photosensibilisator-Zusammensetzung bevorzugt gewaschen, wie zum Beispiel durch ihr Eintauchen in eine physiologische Kochsalzlösung oder durch andere für diesen Zweck geeignete Mittel. Vor der Transplantation können dem Empfänger auch eine oder mehr spenderspezifische Bluttransfusionen mit mononukleären Zellen in mit PDT-behandeltem peripherem Blut zur Unterstützung des Überlebens des Transplantats gegeben werden. Ein alternatives Verfahren besteht darin, den Empfänger vor der Transplantationsoperation einer totalen lymphatischen Bestrahlung zu unterziehen. Es können vor der Transplantation jedwedes andere Verfahren, das für den jeweiligen Transplantatempfänger vorteilhaft wäre, als ein Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, die Oberfläche des Transplantats dergestalt zu modifizieren, um positiv oder negativ geladene Gruppen, wie zum Beispiel unter Verwendung einer geeigneten Aminosäure oder eines Polymers oder durch Anlagern einer physiologisch verträglichen Quelle geladener funktioneller Gruppen, bereitzustellen. Eine negativ geladene Oberfläche ist zum Beispiel für Blutgefäße geeignet, um die Blutgerinnung zu vermindern. Es ist unter bestimmten Umständen auch wünschenswert, die Oberfläche durch Kopplung, von zum Beispiel Phenylalanin, Serin oder Lysin an die Oberfläche, hydrophob oder hydrophil zu machen. Ein für diese Oberflächenmodifikationen besonders wirksames Immunsuppressivum stellt Glutaraldehyd dar.
Das Transplantationsverfahren selbst hängt von der jeweiligen zu behandelnden Erkrankung, dem Zustand des Patienten usw. ab. Der Arzt wird das geeignete Verfahren zur Anwendung in jedem gegebenen Fall erkennen. Die Transplantate werden optional systematisch während der kritischen postoperativen Periode (die ersten drei Monate) unter Verwendung von jedwedem geeigneten Verfahren, wie zum Beispiel Angiographie mit einem intravenösen Radionuklid, überwacht. Nach der Transplantation wird oft eine Immunsuppressionstherapie unter Verwendung eines geeigneten Immunsuppressivums als wichtige Maßnahme zur Gewährleistung des Überlebens des Transplantats eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ergänzt werden durch die oder in Kombination mit den gleichen oder reduzierten Dosierungen des Immunsuppressivums, das dem Spender systemisch, dem Spendergewebe in vitro oder dem Empfänger entweder lokal oder systemisch verabreicht wird, verwendet werden. Unter dem Begriff „Immunsuppressivum", wie hierin verwendet, versteht man die Substanzen, die auf die Suppression oder Maskierung des Immunsystems des Wirtes wirken, in den das Transplantat transplantiert wird. Dies würde Substanzen einschließen, welche die Cytokinproduktion unterdrücken, die Eigenantigenexpression downregulieren oder unterdrücken oder die MHC-Antigene maskieren.
Beispiele dieser Mittel schließen folgende ein: 2-Amino-6-aryl-5-substituierte Pyrimidine, Azathioprin oder Cyclophosphamid, Bromocryptin, Glutaraldehyd, antiidiotypische Antikörper für MHC-Antigene, Ciclosporin A, ein oder mehr Steroid(e), bevorzugt Corticosteroide und Glucocorticosteroide, wie zum Beispiel Prednison, Methylprednisolon und Dexamethason; Antikörper gegen Interferon-Gamma, Antikörper gegen den Tumornekrosefaktor-α, Antikörper gegen den Tumornekrosefaktor-β, Antikörper gegen Interleukin-2, Antikörper gegen den Cytokin-Rezeptor, wie zum Beispiel Antikörper gegen den IL-2-Rezeptor, heterologes Antilymphozytenglobulin; Pan-T-Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper OKT-3, Antikörper gegen CD4; Streptokinase, Streptodornase; oder RNA oder DNA vom Wirt.
Eine wirksame Menge, die durch diese Erwägungen ermittelt wird, stellt die Mindestmenge dar, die zur Verhinderung einer Immunantwort, die zur Abstoßung des Transplantats durch den Empfänger führen würde, notwendig ist, aber so viel wie erforderlich ist, um eine längere Überlebenszeit des Transplantats zu erreichen. Eine derartige Menge liegt bevorzugt unter der Menge, die für den Empfänger toxisch ist oder den Empfänger signifikant infektionsanfälliger macht. Die Menge des erfindungsgemäß erforderlichen Immunsuppressivums ist in der Regel niedriger als die, die normalerweise für transplantierte Transplantate, die nicht vorbehandelt wurden, erforderlich ist, und hängt von den individuellen Umständen ab, die das Transplantat und den Typ des verwendeten Immunsuppressivums umgeben.
Eine vollkommen pharmazeutisch wirksame Menge des Immunsuppressivums, Ciclosporin A, das parenteral verabreicht wird, liegt als ein spezifisches Beispiel pro Dosis im Bereich von ca. 0,1 bis 20 mg/kg des Körpergewichts des Patienten pro Tag im Vergleich zum typischen Bereich von ca. 5 bis ca. 15 mg/kg/Tag Ciclosporin A, das derzeit in der konventionellen immunsuppressiven Therapie verwendet wird. Für Nierentransplantate besteht die übliche Praxis darin, über kurze Perioden massive Glucocorticosteroid-Dosen, z. B. Methylprednisolon in Dosen von mehreren Gramm pro Tag über 3 bis 5 Tage, gefolgt von 20 bis 100 mg Prednison, ohne photodynamische Vorbehandlung des Transplantatgewebes zu verabreichen. Mit der erfindungsgemäßen Vorbehandlung wären signifikant niedrigere Dosen nützlich.
Wie vorstehend angemerkt wurde, unterliegen diese vorgeschlagenen Mengen des Immunsuppressivums sehr weitgehend dem therapeutischen Ermessen. Der Schlüsselfaktor bei der Auswahl einer angemessenen Dosis und eines Plans stellt das erhaltene Ergebnis dar, d. h. das Langzeitüberleben des Transplantats. So könnte zum Beispiel entweder initial zur Behandlung der hyperakuten Transplantatabstoßung, die der Antikörper-vermittelten Transplantatzerstörung zugeschrieben werden kann, oder in einem späteren Stadium, das durch eine plötzliche Abnahme der Transplantatfunktion gekennzeichnet ist, ein relativ hohe Dosis benötigt werden.
Wenn ein Immunsuppressivum verwendet wird, kann es durch jedwedes geeignete Mittel, einschließlich parenteral und gegebenenfalls zur lokalen immunsuppressiven Behandlung, als intraläsionale Gabe verabreicht werden. Parenterale Infusionen schließen die intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale oder subkutane Verabreichung ein. Wenn außerdem ein Immunsuppressivum verwendet wird, wird es zweckmäßigerweise durch gepulste Infusion, insbesondere in absteigenden Dosen oder durch Dauerinfusion verabreicht.
Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung, aber nicht zur Einschränkung der Erfindung beabsichtigt:
Beispiel 1
Herstellung eines BPD-Ra-MIg-Konjugats
Der in 1 gezeigte Photosensibilisator BPD-MA wird im Dunkeln von einer Konzentration von 1 mg/ml auf 200 pg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und mit einer bekannten Menge Ratten-Antimaus-Ig (RaMIg), das von den Cedar Lane Laboratories erhalten oder durch Immunisieren von Kaninchen mit Mausimmunglobulin und Reinigen der Antikörper über immunabsorbierenden Säulen erhalten wurde. Das Gemisch wird eine Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, und das resultierende Konjugat wird über Nacht durch eine Membran, die für Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 12–14 kD permeabel ist, gegen drei Liter PBS bei 4°C dialysiert. Modellstudien mit markierter BPD-MA zeigen, dass das zurückgehaltene Konjugat ein Verhältnis von BPD : Ak von 10–20 aufweist. Das Retentat von der Dialyse wird dann eingefroren und lyophilisiert und im Dunkeln gelagert.
Beispiel 2
Behandlung eines Allotransplantatgewebes mit dem Konjugat
Das Pankreasinselgewebe des Spenders wurde aus Ratten wie folgt isoliert: Männliche SD-Ratten (200–250 g) wurden mit intraperitoneal gegebenem Urethan (100 mg/kg) anästhesiert, und mittels einer Mittellinien-Laparotomie wurde Herz-Atem-Stillstand mit bilateralem Pneumothorax induziert. Der proximale Choledochus wurde kanüliert und distal an seinem Eintrittspunkt in das Duodenum okkludiert. Der Pankreas wurde dann auf eine retrograde Weise mit kalter (4°C) Kollagenase-Lösung (Typ XI, Sigma Chemicals) bei einer Konzentration von 0,42 mg (650 U) pro ml erweitert. Nach der Distension mit Kollagenase in situ, wurde eine Totalpankreatektomie durchgeführt.
Die Drüsen wurden 22 Minuten in einem Wasserbad von 37°C verdaut. Die verdauten Drüsen wurden durch Triturierung durch eine sterile silikonisierte Pipette dispergiert.
Der Rohgewebebrei wurde durch ein Siebfilter von 200 Mikron gegeben, um unverdaute Ducti, Blutgefäße und Lymphknoten zu entfernen und wurde dann durch einen diskontinuierlichen Dextrangradienten, bestehend aus zwei Monolayers mit einem spezifischen Gewicht von 1,065 bzw. 1,031, zentrifugiert. Das weniger dichte Inselgewebe wurde aus der Monolayer-Grenzfläche aspiriert, gewaschen und weiter durch Handauslese unter einem Präpariermikroskop gereinigt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden 300–400 funktionell und morphologisch intakte Inseln pro Pankreas geerntet.
Die Inseln wurden einen Tag in Ham's F-12-Medium, ergänzt mit 25% Kälberserum, 15 mM HEPES-Puffer und 1% Strepfungizon, in vitro kultiviert. Die kultivierten Inseln wurden mit im Handel erhältlichem Maus-Antiratten-Ia-monoklonalem Antikörper (bezeichnet als OX-6), erhältlich von SeraLab bei 0,2 mg/ml für Stunden bei °C initial inkubiert. OX-6 ist immunspezifisch gegen das Klasse-II-MHC-Produkt.
Portionen der mit OX-6 behandelten Inseln wurden mit (1) Ra-MIgG-BPD-Konjugat mit einem Verhältnis von 6,5 BPD : 1 Ak; (2) das gleiche Konjugat bei einem Verhältnis von 20 BPD : 1 Ak; (3) ein BPD-Konjugat mit dem irrelevanten Antikörper-GA-7sIgG bei 6,5 BPD : 1 Ak; (4) BPD allein und (5) Medium allein 2 Stunden bei 20°C im Dunkeln inkubiert. Die Inkubationsgemische wurden dann 10 Joule/cm² Lichtenergie bei einer Wellenlänge von 400–800 nm ausgesetzt. Die bestrahlten Kulturen wurden dann histologisch und auf APC-Depletion untersucht.
Beispiel 3
Charakterisierung des Spendergewebes
In den histologischen Studien wurden ca. 75–100 Inseln, die mit dem Konjugat von 6,5 BPD : 1 Ak behandelt wurden, unter die Nierenkapsel der syngenen Empfänger-SD-Ratten und allogenen WF-Ratten transplantiert. Sowohl bei den syngenen als auch allogenen Transplantationen wiesen alle Empfänger erfolgreiche Ergebnisse auf. Es wurde insbesondere, sowohl in syngenen als auch allogenen Transplantaten, ein vollständiger Ersatz des Transplantats durch Lymphozyteninfiltrat und keinem identifizierbaren endokrinen Gewebe beobachtet.
In den Studien zur APC-Depletion wurden die Inseln mit dem OX-6-Antikörper primär immungefärbt. Die so behandelten Zellen wurden einer sekundären Färbung mit FITC-markiertem Ziegen-Antimaus-Ig (Jackson Laboratories) markiert und der Fluoreszenzmikroskopie unterzogen. In Präparaten, die mit den Konjugaten behandelt wurden, wurden keine identifizierbaren Klasse-II-MHC-Zellen gesehen. In den Kontrollen (Konjugat mit irrelevantem Antikörper, BPD allein und Medium), wurde jedoch das Vorliegen dieser Zellen anhand der Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen, da die FITC-markierten sekundären Antikörper die APC markierten und eine grüne Fluoreszenz ausstrahlten.
Beispiel 4
Prävention der Abstoßung des Hautallotransplantats
Zur Festlegung einer Ausgangslinie, welche die minimale Abstoßung darstellt, wurden neun Syngrafts (bei dem Spender und Empfänger handelt es sich um das gleiche Tier) an BALB/c-Mäusen gemäß dem Standardverfahren (Billingham et al., „The Technique of Free Skin Grafting in Mammals", J. Exp. Biol., 28: 385–99 (1951)) wie folgt durchgeführt: Die zu transplantierende Trunkushaut der Maus wurde rasiert und enthaart. Die Maus wurde dann durch intraperitoneale Injektion eines Gemischs aus 20 Tl Ketamin-Hydrochlorid, 10 Tl Xylasin und 70 Tl PBS anästhesiert, worauf die Gewinnung einer Haut in voller Dicke (1 cm × 1 cm) durch sorgfältige Dissektion erfolgte, wobei ein geeignetes Transplantationsbett gelassen und darauf geachtet wurde, dass das Panniculus carnosus intakt blieb.
Die autologenen Hauttransplantate wurden dann wieder an der Transplantationsstelle appliziert und durch Applizieren einiger, ca. vier Topfen, Vetbond-Gewebekleber an der Grenzfläche zwischen Transplantat und Transplantatbett an Ort und Stelle befestigt. Das Transplanat wurde mit Petroleumgel-beschichteten Gazeschwämmen hinuntergedrückt, und das Transplantat und die Schwämme wurden mit Vetrap-Bandagestreifen, die zur Bildung eines „Körperstützverbandes" um den Körper gewickelt wurden, an Ort und Stelle gehalten.
Die Erfolgsrate für Langzeitsyngrafts, d. h. über 120 Tage, war höher als 90%. Die Transplantatabstoßung wurde als vollkommen erachtet, wenn mindestens eine 80%ige Nekrose des Transplantats auftrat. Das Überleben des Transplantats wurde als ein Mittelwert bezogen auf die Überlebenszeit in Tagen ± der Standardabweichung ausgedrückt.
Die allogenen Hauttransplantate zwischen C57BL/6-Mäusen (Spender, H-2^b) und BALB/C-Mäusen (Empfänger, H-2^d) wurden auch unter Verwendung der gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben, außer dass jedes Hauttransplantat aus einer Spendermaus entnommen und auf das Transplantatbett einer anderen Empfängermaus aufgelegt wurde, als Kontrollen durchgeführt. Die Trunkushaut der Spendermaus wurde, um es kurz zu fassen, rasiert und enthaart, dem anschließend die Gewinnung von Ganzhauttransplantaten (1 cm × 1 cm) folgte. Die Empfängermäuse wurden rasiert und dann durch intraperitoneale Injektion eines Gemischs von 20 Tl Ketamin-Hydrochlorid, 10 Tl Xylasin und 70 Tl PBS anästhesiert. Das Transplantatbett von jedem Empfänger wurde durch sorgfältige Dissektion der Trunkushaut (1 cm × 1 cm) vorbereitet, wobei darauf geachtet wurde, dass das Panniculus carnosus intakt blieb. Die Transplantate wurden am allogenen Transplantationsort aufgelegt und durch Applizieren von Vetbond-Gewebekleber, Petroleumgel-beschichteten Gazeschwämmen und Vetrap-Bandagestreifen zur Bildung eines „Körperstützverbandes" an Ort und Stelle gehalten. Die mittlere Überlebenszeit betrug 11,1 Tage (1,9 Standardabweichung).
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde die an einem Empfänger zu transplantierende Hautprobe zuerst eine Stunde mit einer Lösung von 1,0 Tg/ml des Photosensibilisators BPD in vitro kontaktiert. Die Haut wurde dann in einer Elektrolyt-Lösung, die kein fetales Rinderserum („FBS") enthielt, 30 Minuten suspendiert und Rotlicht von Lichtemitterdioden („LED") (10 J/cm² bei 690 nm ± 10 nm) ausgesetzt. Im Anschluss an diese Lichtbehandlung wurde die ausgesetzte Haut in eine Empfängermaus wie vorstehend beschrieben transplantiert. Das Tier wurde ab dem 8. Tag nach der Transplantation auf Abstoßung überwacht. Die mittlere Überlebenszeit für die Allotransplantate nahm auf 18,5 Tage (2,1 Standardabweichung) zu.
Diese Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I zum einfachen Vergleich in Tabellenform dargestellt.
TABELLE 1
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die immunmodulatorische Wirkung der photodynamischen Behandlung auf zu transplantierendes Gewebe in einer signifikant verlängerten Überlebenszeit des Engraftment resultieren könnte.
Das Experiment wurde wiederholt, um die durchgeführten erfindungsgemäßen Allotransplantationen wieder mit Standard-, Kontrollallotransplantaten zu vergleichen, wobei die Konzentration (von 0,25 auf 1,0 Tg/ml) des Photosensibilisators BPD variiert wurde. Die Ergebnisse dieser Tests sind nachstehend in Tabelle 2 zusammengefasst:
TABELLE 2
Da es den Anschein hatte, dass die zweifache Eskalierung des Photosensibilisators selbst nicht signifikant die Überlebenszeit des Engraftment verlängerte, wurde postuliert, dass die immunmodulatorischen Wirkungen der photodynamischen Behandlung von zu transplantierendem Gewebe von den selektiven Wirkungen auf Zellpopulationen in der Haut abhängen kann und nicht unbedingt auf die bekannte cytotoxische Wirkung der photodynamischen Therapie zurückzuführen sein könnte.
Beispiel 5
Histologische Untersuchung der zu transplantierenden Haut
Zur Untersuchung der Wirkungen der Behandlung von Hauttransplantaten mit photodynamischer Therapie unter Bedingungen, die in verlängerten Überlebenszeiten resultieren, wurden Hautproben gewonnen und wie vorstehend beschrieben, außer mit einem unterschiedlichen Bereich der Photosensibilisator-Konzentration, d. h. 0,25 oder 0,50 Tg/ml BPD, behandelt. Einige Gewebe wurden als Kontrollproben in einer Elektrolytlösung allein inkubiert, ohne dass irgendein Photosensibilisator anwesend ist. Alle Gewebeproben wurden über eine 24-Stunden-Periode inkubiert, wonach eine repräsentative Anzahl dem Licht ausgesetzt wurden. Wenn gegeben, erfolgte die Lichtexposition gegenüber Rotlicht bei einem Energieniveau von 10 J/cm².
Alle Proben wurden dann in Formalin gegeben und der histologischen Untersuchung unterzogen. Die in Elektrolytlösung allein inkubierten Gewebe (Kontrollproben) oder in einer Lösung von 0,50 Tg/ml BPD, ohne Lichtexposition, schienen normal zu sein. Die mit entweder 0,25 oder 0,50 Tg/ml BPD behandelten Proben, gefolgt von einer Behandlung mit Rotlicht, wiesen jedoch die folgenden Veränderungen auf: Nukleusvergrößerung, perinukleäre Vakuolisierung, Verminderung der Eosinophilie der Epithelzellen, Zunahme des cytoplasmatischen Volumens und vergrößerte Interzellularräume zwischen den Keratinozyten auf der Epitheloberfläche. Es wurde postuliert, dass – basierend auf diesen histologischen Befunden – die erfindungsgemäße photodynamische Behandlung eher in einem Grad der Zellschädigung als in Zelltod resultierte. Der Mechanismus für diese unerwartete, nicht cytotoxische Wirkung war nicht bekannt.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass Modifikationen und/oder Variationen an dem offenbarten erfindungsgemäßen Gegenstand vorgenommen werden können, ohne aus dem Rahmen der nachstehend beanspruchten Erfindung zu kommen.

Claims

Verwendung eines Photosensibilisators zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung der Immunogenität von Spendergewebe, enthaltend Antigenpräsentierende Zellen (APC) während der photodynamischen Therapie unter Bedingungen, die für die genannten APC unter Verwendung einer Photosensibilisator-Menge von 0,1 bis 2 μg/ml nicht cytotoxisch sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin genanntes Arzneimittel für ein Verfahren beabsichtigt ist, das Folgendes umfasst: a. Kontaktieren des Spendergewebes mit einem Photosensibilisator zum Erhalt eines modifizierten Spendergewebes; b. Exposition des genannten modifizieren Spendergewebes gegenüber Licht mit einer Wellenlänge, das von genanntem Photosensibilisator für eine Zeit absorbiert wird, die zur funktionellen Attenuierung der APC im Spendergewebe ausreicht; und c. Transplantation des Spendergewebes enthaltend modulierte APC in das Gewebe eines Empfängers.
Verfahren zur Behandlung eines Spendergewebes, enthaltend Antigenpräsentierende Zellen (APC), welches Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren des Spendergewebes mit einem Photosensibilisator zum Erhalt eines modifizierten Spendergewebes und (b) Exposition des genannten modifizierten Spendergewebes gegenüber Licht mit einer Wellenlänge, das von genanntem Photosensibilisator für eine Zeit absorbiert wird, die zur funktionellen Attenuierung der APC im Spendergewebe, unter Bedingungen, die für die genannten APC nicht cytotoxsich sind und unter Verwendung einer Photosensibilisator-Menge von 0,1 bis 2 μg/ml, ausreicht.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das genannte Spendergewebe humanes Gewebe ist.
Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin sich mindestens einige der Wellenlängen von genanntem Licht im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums befinden.
Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, worin während des genannten Expositionsschrittes b das genannte modifizierte Spendergewebe in einer Elektrolytlösung suspendiert ist.
Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin die Dosis von genanntem Licht während des genannten Expositionsschrittes b ca. 10 J/cm² beträgt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Spendergewebe Hautgewebe oder Pankreasinseln darstellt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannter Photosensibilisator BPD darstellt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannter Photosensibilisator in der Form einer Lösung in einem Konzentrationsbereich von 0,25 bis 1,0 μg/ml vorliegt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannter Photosensibilisator in der Form eines Konjugats, umfassend eine targetspezifische Komponente, vorliegt.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 11, worin genanntes targetspezifisches Mittel ein Mittel umfasst, das spezifisch mit den APC bindet.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 12, worin genanntes targetspezifisches Mittel einen Antikörper, ein Fragment davon oder einen Rezeptorliganden für einen Rezeptor auf der Oberfläche der APC darstellt.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 12, worin genanntes targetspezifisches Mittel ein Mittel umfasst, das an eine Markierung bindet, die wiederum spezifisch mit den APC bindet.
Spendergewebe mit einer reduzierten Empfindlichkeit gegen eine Allotransplantatabstoßung, das unter Verwendung eines Arzneimittels oder eines Verfahrens, wie nach einem der vorangehenden Ansprüche definiert, vorbereitet wurde.
Zusammensetzung eines Materials, das ein Spendergewebe von einem Spender umfasst, wobei genanntes Spendergewebe Antigen-präsentierende Zellen (APC) enthält und eine Beimischung mit einem Arzneimittel, umfassend einen Photosensibilisator in einer Konzentration von 0,1 bis 2 μg/ml, darstellt.