DE19636328A1

DE19636328A1 - HLA-Moleküle zur Immunregulation

Info

Publication number: DE19636328A1
Application number: DE1996136328
Authority: DE
Inventors: Martin Prof Dr Kroenke; Nicholaus Dr Zavazava
Original assignee: Individual
Current assignee: Kroenke Martin Gerhard Ernst Prof Drmed 5096
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 1998-03-05

Description

Die Erfindung betrifft HLA-Moleküle (Humane Leukozyten Antigen) in löslicher Form, insbesondere als Aggregate, als Medikament zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen, welche das zuvor genannte Humane Leukozyten Antigen spezifisch erkennen. Darüber hinaus umfaßt die Erfindung eine Verwendung von insbesondere löslichen Aggregaten oder Antigeneinheiten von spezifischem Humanem Leukozyten Antigen (HLA-Moleküle) zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen, welche das zuvor genannte Humane Leukozyten Antigen spezifisch erkennen.

Stand der Technik

Nach Transplantationen werden die transplantierten Organe gewöhnlich von dem Immunsystem des Organempfängers abgestoßen. Dabei erkennen die zytotoxischen T-Zellen des Empfängers auf den Zellen des Organtransplantates die Strukturen des Humanen Leukozyten Antigens (HLA) als eine Fremdstruktur.

Um diese Abstoßungsreaktion zu vermindern, wird der Empfänger lebenslang mit Medikamenten wie Cyclosporin A und/oder Kortison behandelt. Weiterhin wird zusätzlich Anti-Lymphozytenserum oder OKT3 Antikörper eingesetzt.

Diese Form der Immunsuppression hat wesentliche Nachteile. Die Toleranzen sind unspezifisch. Nicht nur das Transplantat, sondern auch Bakterien, Viren und eukaryotische Keime werden vor dem Immunsystem nicht mehr erkannt und daher auch nicht mehr effektiv eliminiert. Sonst nicht lebensbedrohliche Infektionen können tödlich verlaufen (CMV, EBV, . . .). Es können bösartige Tumore auftreten (ca. 0-20%). Schocksyndrome können sich bei der OKT3 Therapie ereignen (sogenanntes Zytokinfreisetzungs-Syndrom).

HLA

HLA-Moleküle und deren Funktion sind seit langem bekannt. Vgl. Jan Klein, Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination, 1982, New York. So wurde schon im Jahr 1969 angenommen, daß HLA-Moleküle der Leber eine Toleranz hervorrufen könnten. Jedoch konnte aus dieser Mutmaßung keine technische Lehre gewonnen werden. Klarheit über die Mechanismen konnte nicht gewonnen werden. Der schützende Effekt der gleichzeitig transplantierten Leber gegen eine Immunabstoßung wurde in klinischen Studien bestätigt. Vgl. CLAYBERG et al. (1987) Nature 330: 763-765. Wurden andere Organe zusammen mit der Leber transplantiert, war ein längeres Überleben des Transplantats zu beobachten. So ist bekannt, daß HLA-Moleküle in zytotoxischen Test protektiv wirken. Zavazava et al. (1991) Transplantation 51: 838-812. Die unterschiedlichen HLA-Moleküle rufen unterschiedliche Reaktionen bei den zytotoxischen T-Zellen und den T-Helferzellen hervor. HLA-Moleküle der Klasse 1 verhindern eine zytotoxische Reaktion (Clayberger et al. (1987) Nature, 330: 763-765). Monomere HLA-Moleküle der Klasse 1 stimulieren T-Zellen nicht. Wogegen die Multimeren HLA-Moleküle die Interleukin-2-Produktion der T-Zellen anregen. Vgl. Abastado et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 439-447.

Die bisherigen Befunde über die Wirkung von HLA-Molekülen auf die Transplantat-Abstoßung sind widersprüchlich. Eine klare Lehre zum technischen Handeln fehlt. Ein klinischer Einsatz von HLA-Molekülen bei der Behandlung von Immunreaktionen war nicht möglich. Zuviel Umklarheiten herrschen bei der Interpretation der wissenschaftlichen Daten vor.

Aufgabe

Es ist Aufgabe der Erfindung eine spezifische Toleranz oder Immunsuppression zu induzieren, wobei die nicht-spezifische Suppression vermieden wird.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wird durch Aggregate oder Antigeneinheiten von spezifischem Humanem Leukozyten Antigen (HLA-Moleküle) zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen gelöst,

a) welche zur Toleranzinduktion bei einer Transplantation oder Transfusion das fremde, dem Spender entsprechende Humane Leukozyten Antigen spezifisch erkennen (allogen);
b) welche bei einer Autoimmunerkrankung das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen);
c) welche bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, bei denen das Immunsystem körpereigene Strukturen erkennt und zerstört, das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen); und
d) welche zur Toleranzinduktion oder Suppression bei Allergien das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen).

Darüber hinaus umfaßt die Erfindung eine Verwendung von Aggregaten oder Antigeneinheiten von spezifischem Humanem Leukozyten Antigen (HLA-Moleküle) zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen,

HLA-Moleküle umfassen Aggregate und Antigeneinheiten. Aggregate sind Oligomere von HLA-Antigenen. Derartige Oligomere können aus 2 bis 100 Antigeneinheiten bestehen, bevorzugt sind 5 bis 20, mehr bevorzugt 10-15 Einheiten. Antigeneinheiten sind HLA-Moleküle in ihrer natürlichen Zusammensetzung aus unterschiedlichen Ketten, so setzt sich zum Beispiel bei dem HLA-D die Antigeneinheit aus der alpha und der beta Kette zusammen. Aggregate bedeutet, daß Ketten der HLA-Typen zu Komplexen verbunden sind, wobei die zusammenhaltenden Kräfte Van-der-Vaal′sche Kräfte, Wasserstoffbrücken, Ionen-Verbindungen (-NH₃⁺ ⁻OCC-) und kovalente Bindungen sein können oder ein Gemisch aus verschiedenen Bindungen, wobei wenigstens eine der Bindung die Bindefunktion übernimmt. Die HLA-Moleküle als Aggregate oder Antigeneinheiten umfassen ebenfalls bevorzugt körpereigene Strukturen oder fremde Strukturen, welche in der Bindungsdomäne vorliegen. Die Strukturen werden bei der Antigenpräsentation gegenüber T-Zellen gegen Antigen ausgetausche. Sie liegen in der Größenordnung von einem Peptid mit einer Kette aus 8 bis 13 Aminosäuren vor.

Bevorzugt sind Aggregate, mehr bevorzugt sind lösliche Aggregate. Auch lösliche Antigeneinheiten sind sinnvoll.

Bekannt sind vor allem die Humanen Leukozyten Antigene A, B, C, DQ und DR. Auch weitere Antigene werden in der Literatur beschrieben. Von den zytotoxischen T-Zellen werden die HLA-A, HLA-B und HLA-C (Klasse 1- Antigene) erkannt. Die HLA-DQ und HLA-DR (Klasse II-Antigene) werden von weiteren T-Zellen des Immunsystems erkannt, welche eine Immunantwort verstärken oder abschwächen können. Für die erfindungsgemäße HLA-Moleküle und deren Verwendung sind beide Typen an Antigenen zu einzusetzen. In Abbas et al. (1994, zweite Auflage) Gellular and Molecular Immunology Philadelphia werden die HLA-Typen ausführlich beschrieben. Quellen für die Oligomeren können Aufreinigungen von löslichen HLA-Molekülen von Spendern sein. Dieses ist nicht in allen Fällen möglich, da sich die Aggregate mit gleichbleibender Qualität nicht immer bilden lassen. Bevorzugt sind HLA-Oligomere, wobei wenigstens die einzelnen Ketten gentechnologisch hergestellt werden. Die Peptide zur Stabilisierung können synthetisch hergestellt werden. Die Verknüpfung kann durch Aggregation, Anlagerung (zum Beispiel Biotin/Streptavidin) oder auch kovalent erfolgen. Komplexe aus HLA-Molekülen umfassen auch zelluläre Strukturen, bevorzugt als Peptid, so zum Beispiel eine Sequenz aus 8 bis 13 Aminosäuren, welche bei der Antigenpräsentation gegen das spezifische Antigen ausgetauscht wird.

Die Aggregate sollen bei Transplantationen ein Zusammensetzung an Monomeren aufweisen, welche spenderspezifisch ist. Auch ist es möglich mehrere HLA-Typen zu vermischen, welche eine hohe Wahrscheinlichkeit besitzen, daß viele Spender wenigstens Unterkombinationen aufweisen.

Vorteilhaft sind Aggregate oder Antigeneinheiten, welche dominant oder ausschließlich aus den extrazellulären Domänen der HLA-Moleküle bestehen. Mehr bevorzugt sind Fragmente der extrazellulären Domänen, welche dominant an der spezifischen Antigenerkennung beteiligt sind. Solche Domänen sind in Parham et al. (1987) Nature 325: 625 und Santos et al. (1989) PNAS 86: 8936 beschrieben.

Die erfindungsgemäßen, aggregierten, bevorzugt löslichen HLA-Moleküle besitzen pharmakologische Eigenschaften und sind deshalb als pharmazeutische Wirkstoffe verwendbar. Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Arzneimittel, das ein erfindungsgemäßes Aggregat und/oder Antigeneinheit enthält. Weiterhin gehört zur Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der erfindungsgemäßen Aggregate oder Antigeneinheiten enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Hilfsstoffen und/oder Trägerstoffen. Derartige Beimengungen sind in Remington′s Pharmaceutical Science, 15 th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) beschrieben. Ebenfalls umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die erfindungsgemäße Aggregate und/oder Antigeneinheiten und ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe und Trägerstoffe enthält.

Die erfindungsgemäße Aggregate und/oder Antigeneinheiten zeigen eine Inhibierung im zytotoxischen Test, welcher nach 20 Tage nach der einmaligen HLA-Appliaktion von 0,4 µg/ml bis 1 µg/ml 50% bei einem Zusammensetzungsverhältnis von Zytotoxischen T Zellen zu Zielzellen von 5 zu 1 besitzt. Höhere Konzentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit sind die erfindungsgemäßen Aggregate und/oder Antigeneinheiten in Konzentrationen von 0,04 µg/ml bis 10 µg/ml einsetzbar.

Die Versuchsergebnisse der in vitro Tests zeigen, daß die erfindungsgemäßen Aggregate und/oder Antigeneinheiten als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden können. Diese Versuchsergebnisse lassen sich von dem in vitro Testsystem auf ein in vivo System problemlos übertragen, da es sich bei dem Zytotoxizitätstest um einen etablierte Versuchsanordnung handelt, die zum Nachweis der alloreaktiven zytotoxischen T-Zellen dient. (Brunner et al. (1968) Immunology 14: 181-196).

Die Aggregate und/oder Antigeneinheiten der HLA-Moleküle können deshalb als Inhibitor bei Säugern, insbesondere bei Menschen, zur Behandlung der zuvor genannten Zustände verwendet werden. Auch zur Verwendung bei anderen Säugern, wie unseren Nutztieren, wie Hund, Katze, Rind, Schwein, Pferd, Schaf und Nagern sind die Aggregate und/oder Antigeneinheiten einsetzbar. Dort wird der HLA-Komplex MHC (major histokompatibility complex) genannt.

Die Erfindung liefert weiterhin

(i) die Verwendung von erfindungsgemäßen Aggregaten und/oder Antigeneinheiten (HLA-Molekülen) (zur Herstellung eines Medikaments) zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen,
- a) welche zur Toleranzinduktion bei einer Transplantation oder Transfusion das fremde, dem Spender entsprechende Humane Leukozyten Antigen spezifisch erkennen (allogen);
- b) welche bei einer Autoimmunerkrankung das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen);
- c) welche bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, bei denen das Immunsystem körpereigene Strukturen erkennt und zerstört, das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen); und
- d) welche zur Toleranzinduktion oder Suppression bei Allergien das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen).
(ii) ein Verfahren zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen,
- a) welche zur Toleranzinduktion bei einer Transplantation oder Transfusion das fremde, dem Spender entsprechende Humane Leukozyten Antigen spezifisch erkennen (allogen);
- b) welche bei einer Autoimmunerkrankung das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen);
- c) welche bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, bei denen das Immunsystem körpereigene Strukturen erkennt und zerstört, das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst"erkennen (syngen); und
- d) welche zur Toleranzinduktion oder Suppression bei Allergien das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen)
welches Verfahren eine Verabreichung einer Aggregat-Menge oder Antigeneinheiten-Menge (HLA-Molekülen) umfaßt, wobei die Menge die Krankheit oder Immunantwort unterdrückt, und wobei die HLA-Molekül-Menge einem Patienten gegeben wird, der ein solches Medikament benötigt;
(iii) eine pharmakologische Zusammensetzung zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen,
- a) welche zur Toleranzinduktion bei einer Transplantation oder Transfusion das fremde, dem Spender entsprechende Humane Leukozyten Antigen spezifisch erkennen (allogen);
- b) welche bei einer Autoimmunerkrankung das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen);
- c) welche bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, bei denen das Immunsystem körpereigene Strukturen erkennt und zerstört, das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen); und
- d) welche zur Toleranzinduktion oder Suppression bei Allergien das Humane Leukozyten Antigen vom Typ "selbst" erkennen (syngen)
welche Behandlung erfindungsgemäße Aggregate und/oder Antigeneinheiten (HLA-Molekülen) und wenigstens einen pharmazeutischen Hilfs- und/oder Trägerstoff umfaßt.

Für die therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet. Sie hängen beispielsweise von den verwendeten Salzen, vom Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zu stände ab.

Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwar ten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 1 bis 500 mg pro kg Körper gewicht umfassen. Bei größeren Säugetiere, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlene tägliche Dosis im Bereich von 1 bis 200 mg pro kg Kör pergewicht. Bevorzugt ist eine Dosis von 1 bis 50 mg pro kg Körpergewicht, am meisten bevorzugt ist eine Dosis von 5 bis 30 mg pro kg Körpergewicht. Zum Beispiel wird diese Dosis zweckmäßigerweise in Teildosen bis viermal täglich verabreicht. Zufriedenstellende Resultate sind zu erwarten, wenn die erfindungsgemäßen Substanzen subkutan oder intravenös verabreicht werden.

Beispiele

HLA-A2 und HLA-B7-spezifische zytotoxische T-Zellen werden gemäß Brunner et al. (1968) Immunology 14: 181-196 hergestellt, aufgearbeitet und gemessen.

Die [³H]-Thymidin-Inkoporation wird nach Bach und Hirschhorn (1964) Science 143: 813-814 gemessen.

In einem Thymidininkorporationstest unterdrückt die Zugabe von demselben HLA-Typ (syngen) wie die Proliferationszellen die Proliferation auf etwa 25% der Kontrolle bei einer Konzentration der HLA-Moleküle von 2 µg/ml. Sind Zellen und HLA-Typ allogen, führt dieses zu einer Proliferation von etwa 95% der Kontrolle ohne hinzugegebene HLA-Moleküle.

Wird der syngene HLA-Typ zu einer Kultur von allogen stimulierten T-Zellen hinzugegeben, so ist eine Apoptoses (Zelltod) zu beobachten (40 bis 60% Zytolyse). Werden anit-HLA-Antikörper zu der Kultur gegeben, wird der Zelltod inhibiert. Die HLA-Moleküle werden in ihrer Funktion eliminiert.

Überraschend hat sich gezeigt, daß gerade die Aggregate und dort insbesondere die löslichen besonders guten protektiven Effekt zeigen. So ist die Schutzwirkung der löslichen Aggregate gegenüber dem zytosolischen Ansatz um 250% erhöht. Beim Ansatz mit löslichen Aggregaten im Vergleich zu membranständigen Molekülen ist die Schutzwirkung um mindestens 800% erhöht. (Höhere Meßwerte waren in dem Testsystem nicht sicher nachweisbar.)
Die oben dargestellten Methoden sind ausführlich in L. HUDSON and F.C. HAY (1980) Practical Immunology, second edition, Oxford beschrieben.

Claims

1. Aggregate und/oder Antigeneinheiten von spezifischem Humanem Leukozyten Antigen (Humanene Leukozyten Antigen, HLA-Moleküle) zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen,

2. Aggregate von spezifischem Humanem Leukozyten Antigen nach Anspruch 1, wobei die Aggregate Oligomeren mit 2 bis 100 Antigeneinheiten umfassen.

3. Aggregate von spezifischem Humanem Leukozyten Antigen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aggregate Oligomere sind, welche zu Komplexen verbunden sind, wobei die zusammenhaltenden Kräfte Van-der-Vaal′sche Kräfte, Wasserstoffbrücken, Ionen-Verbindungen (-NH₃⁺ ⁻OCC-) und kovalente Bindungen sind oder ein Gemisch aus verschiedenen Bindungen, wobei wenigstens eine der Bindung die Bindefunktion übernimmt.

4. Aggregate und/oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die HLA-Moleküle ebenfalls körpereigene Strukturen oder fremde Strukturen umfassen, welche in der Bindungsdomäne vorliegen, und welche bei der Antigenpräsentation gegenüber T-Zellen gegen Antigen ausgetausche werden.

5. Aggregate oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aggregate oder Antigeneinheiten löslich sind.

6. Aggregate oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aggregate oder Antigeneinheit gentechnologisch oder synthetisch hergestellt sind.

7. Aggregate und/oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aggregate und/oder Antigeneinheiten aus den extrazellulären Domänen der HLA-Moleküle bestehen.

8. Aggregate und/oder Antigeneinheiten Anspruch 7, wobei die Aggregate und/oder Antigeneinheiten Fragmente von den extrazellulären Domänen von HLA-Molekülen sind.

9. Aggregate und/oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüche als pharmazeutischer Wirkstoff oder als Arzneimittel.

10. Aggregate und/oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüche als pharmazeutische Zusammensetzung, die Aggregate und/oder Antigeneinheiten enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Hilfsstoffen und/oder Trägerstoffen.

11. Verwendung von Aggregaten und/oder Antigeneinheiten nach einem der vorherigen Ansprüchen zur Eliminierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen,