DE69922090T2

DE69922090T2 - Austausch von T-Lymphozyten

Info

Publication number: DE69922090T2
Application number: DE69922090T
Authority: DE
Inventors: David Klatzmann; Jose Cohen; Olivier Boyer; Veronique Thomas-Vaslin; Jean-Loup Salzmann
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-07-09
Also published as: ES2234220T3; WO2000002520A3; ATE283057T1; EP0972518A2; EP0972518B1; EP0972518A3; DE69922090D1; JP2002520262A; WO2000002520A2; FR2780891A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der Immunologie und Medizin. Sie betrifft ganz besonders einen neuen immunologischen Versuchsansatz, der die Behandlung zahlreicher Krankheiten erlaubt. Die Erfindung beruht ganz besonders auf einem als „Austausch von T-Lymphocyten" bezeichneten Verfahren für therapeutische Zwecke, nach Depletion der T-Lymphocyten des Wirts. Die Erfindung kann ebenfalls zur Behandlung zahlreicher Krankheiten angewandt sein, an denen die T-Lymphocyten beteiligt sind, wie Autoimmunkrankheiten, Transplantationen, Viruskrankheiten, Allergien, etc.
Die T-Lymphocyten sind für die Entwicklung wirksamer Immunantworten wichtig, die einen Schutz des Organismus insbesondere gegen infektiöse Agenzien oder Tumorzellen erlauben. Denn wenn auch die Antwort der T-Lymphocyten meistens von Vorteil ist, kann sie in bestimmten Situationen im Gegenteil Ursache von Krankheiten (Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßung, etc.) sein. In diesen Situationen ist folglich besonders wichtig, die Antwort der T-Lymphocyten kontrollieren zu können, um die Immunkrankheit zu behandeln.
Es gibt gegenwärtig mehrere angewandte Therapien, deren Ziel die Kontrolle von T-Immunantworten ist, wenn dies erforderlich ist. Die Behandlung der Folgen einer Organtransplantation bietet ein gutes Beispiel für den Einsatz dieser verschiedenen Behandlungen. Auf Organtransplantationen folgen immer als herkömmlich bezeichnete Behandlungen mit Immunsuppressiva, wie zum Beispiel Endoxan, Corticosteroiden, Cyclosporin oder FK506, die zum Schutz des Transplantats vor der Immunantwort des Wirts, die zu einer Abstoßung führt, bestimmt sind. Wenn auch diese Behandlungen sich als relativ wirksam herausstellen, wie dies der erfolgte Fortschritt bei Organtransplantationen zeigt, können sie nicht immer die Abstoßung der Transplantate verhindern. Andererseits haben diese Behandlungen zwei Nachteile: (i) sie „frieren" nur die Immunantwort ein und müssen folglich ständig fortgesetzt werden (die vollständige Einstellung von Behandlungen mit Immun suppressiva führt im Allgemeinen zur Abstoßung des Organs selbst nach mehreren Jahren) und (ii) sie sind vollkommen unspezifisch und hemmen folglich daher auch die wünschenswerten Immunantworten während der gesamten Dauer dieser Behandlung. Sie führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit für Infektionen und bestimmten Krebsarten. Diese Situation beeinträchtigt die Lebenserwartung des Patienten.
Wenn nicht kontrollierte Abstoßungen durch diese Behandlungen mit Immunsuppressiva vorkommen, bestehen andere therapeutische Möglichkeiten außer einer einfachen Dosiserhöhung der eingesetzten Medikamente. Das ist zum Beispiel die Verwendung von die T-Lymphocyten zerstörenden Antikörpern: polyklonale Seren oder monoklonale Antikörper erkennen Oberflächenmoleküle, die auf der Oberfläche von T-Lymphocyten exprimiert sind (anti-CD3, anti-CD4). Diese Behandlungen bewirken die Zerstörung aller T-Lymphocyten, das sind die T-Lymphocyten, die für die Abstoßung des Transplantats verantwortlich sind, wie auch alle anderen T-Lymphocyten, und die Behandlungen weisen folglich ebenfalls eine mangelhafte Spezifität auf, die zu einem beträchtlichen immundepressiven Zustand bei den Personen führt.
Für bestimmte Autoimmunkrankheiten wird die autologe Transplantation von Knochenmark („GMO") als ein neuer therapeutischer Ansatz angesehen. Der Reiz dieser Behandlungen ist, der Transplantation des Knochenmarks eine Konditionierung vorangehen zu lassen, die zu einer Zerstörung seines Immunsystems führt, danach dem Kranken seine eigenen hämatopoietischen Zellen mit dem Ziel einer Rekonstitution mit Hilfe der naiven T-Lymphocyten zu transplantieren. Da diese Lymphocyten autolog sind, werden sie dennoch wiederum an immunpathologischen Vorgängen beteiligt sein können, die zur Durchführung dieser Behandlung geführt haben. Außerdem scheint die Rekonstituierung der T-Lymphocyten aus Knochenmarkzellen bei Erwachsenen ein wenig wirksamer Vorgang zu sein.
Die allogene GMO wird gegenwärtig für bestimmte Krankheiten vorgeschlagen, wie schwere Autoimmunkrankheiten, um dementsprechend den Patienten mit verschiedenen Lymphocyten zu rekonstituieren, die nicht an immunpathologischen Reaktionen beteiligt sein sollen. Dennoch ist die allogene Transplantation von Knochenmark aufgrund der GVH mit einer bedeutenden Morbidität verbunden, die ihre Anwendung begrenzt. Tatsächlich sind die T-Lymphocyten, die in dem hämatopoietischen Transplantat vorhanden sind und in einen als Folge der für die Transplantation erforderlichen Konditionierung immungeschwächten Patienten reinjiziert werden, für einen Angriff verantwortlich, der gegen die Wirtszellen gerichtet ist, was auch als Wirt-Transplantat-Reaktion bezeichnet wird. Diese Reaktion ist manchmal schwierig mit Hilfe herkömmlicher immunsupprimierender Behandlungen zu kontrollieren und verläuft selbst manchmal tödlich.
Es ist heute nicht legitim, einem Patienten mit chronischen Gelenksbeschwerden, die sich aber über mehrere Jahre sogar Jahrzehnte entwickeln können, eine Behandlung mit einer Mortalität von mehr als 10% vorzuschlagen.
Die Kontrolle der pathologischen Immunantworten beruht heute folglich im Wesentlichen auf nicht spezifischen immunsupprimierenden Behandlungen, die nur vorübergehend diese Antworten „einfrieren". Trotz aller Vorteile dieser Behandlungen, die weitgehend ihre Wirksamkeit in der Klinik gezeigt haben, ist es wichtig, heute andere Therapiearten zu entwickeln, deren Ziel eine spezifischere und möglicherweise permanente Immunsuppression wäre.
* Veröffentlichungen beschreiben die Verabreichung von T-Lymphocyten, die mit einem Selbstmordgen modifiziert sind, das für die Thymidin-Kinase vom Herpessimplex-Virus codiert (WO 97/45142; Contassot et al., 1998, Transplantation 65, 1365-70; Tiberghien, 1997, Hum. Gene Ther., 8, 615-624; Cohen et al., 1997, Blood, 89, 4636-4645; Tiberghien, 1997, Transfusion clinique et biologique, 4, 275-80; Helene et al., 1997, Journal of Immunology, 158, 5079-82; Bordignon et al., 1995 Human Gene Therapy, 6, 813-9.
WO 96/05287 beschreibt ein Verfahren zur Selektion von T-Lymphocyten mit einer Antigenspezifität.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen therapeutischen Ansatz zur Regulation der Immunantwort dar. Die vorliegende Erfindung betrifft ganz besonders ein neues Konzept der Modulation der Immunantwort von T-Lymphocyten, besonders der Antwort von immunpathologischen T-Lymphocyten. Die Erfindung weist zahlreiche Vorteile im Vergleich mit früher in der Technik beschriebenen Ansätzen auf, besonders hinsichtlich der Spezifität, der Stabilität (zeitliche Dauer) und des Komforts für die Personen.
Ein erster Aspekt der Erfindung beschreibt ganz besonders ein Verfahren zur Modifikation des Immunsystems einer Person, umfassend das Ersetzen der T-Lymphocyten dieser Person. Ganz besonders umfasst dieses Verfahren die Depletion der T-Lymphocyten (oder von Subpopulationen von T-Lymphocyten) der Person (ohne Depletion anderer hämatopoietischer Zellen, darunter die Stammzellen), anschließende Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend modifizierte autologe, syngene oder allogene T-Lymphocyten (oder Subpopulationen von T-Lymphocyten). Dieses Verfahren ist ganz besonders zur Kontrolle der von den T-Lymphocyten vermittelten immunpathologischen Antworten bestimmt.
Ein anderer besonderer Aspekt der Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Regulation der von den T-Lymphocyten induzierten immunpathologischen Antworten, umfassend das Ersetzen aller oder eines Teils der T-Lymphocyten einer Person durch eine Population modifizierter T-Lymphocyten.
Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die von T-Lymphocyten hervorgerufen sind, umfassend das Ersetzen aller oder eines Teils der T-Lymphocyten einer Person durch eine Zusammensetzung, umfassend modifizierte T-Lymphocyten.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer Population von T-Lymphocyten zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer von den T-Lymphocyten vermittelten Immunkrankheit bei einer Person, die einer spezifischen Depletion aller oder eines Teils ihrer T-Lymphocyten ohne Depletion ihrer anderen hämatopoietischen Zellen, darunter die Stammzellen, unterzogen wurde.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung einer Zusammensetzung von T-Lymphocyten, deren Repertoire modifiziert (angereichert mit oder im Gegenteil an bestimmten Antigenspezifitäten veramt) worden ist.
Die vorliegende Erfindung beschreibt folglich einen neuen medizinischen Ansatz, der auf dem Ersetzen der T-Lymphocyten einer Person beruht und häufig mit folgendem Ausdruck „Austausch von T-Lymphocyten" bezeichnet wird.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf dem neuen Konzept der Homöostase der T-Lymphocyten. Die Erfindung beruht besonders auf der Vorstellung, nach der bei Erwachsenen die Homöostase der T-Lymphocyten sich im Wesentlichen aus Veränderungen der Populationen der reifen T-Lymphocyten ausbildet und nicht wie man bis heute dachte, aus der Differenzierung von hämatopoietischen Stammzellen, die zu T-Lymphocyten über den Thymus differenzieren.
Die gesamten Daten (i) über die Rekonstitution der T-Immunopoiese nach der Transplantation von Knochenmark, die aus gereinigten unreifen hämatopoietischen Stammzellen erfolgt (an Lymphocyten verarmt und/oder auf CD34 gereinigt), (ii) über die Immunopoiese nach Transplantation von Knochenmark als Funktion des Alters, und schließlich (iii) über die Homöostase der T-Lymphocyten im Verlauf der Infektion mit HIV, stützen diese neue Auffassung.
Diese Daten stimmen ebenfalls mit allen aktuellen Daten überein, die sich auf die Homöostase der T-Lymphocyten bei der Maus beziehen. Insbesondere ist beschrieben worden, dass eine Maus, deren Thymus mehr als drei Tage nach der Geburt entfernt wird, mit einer normalen Anzahl an T-Lymphocyten normal lebt. Dagegen entwickelt eine Maus, deren Thymus vor Tag 3 entfernt wird, keine T-Lymphocyten, aber wenn man ihr reife T-Lymphocyten reinjiziert, entwickeln sich diese und die Maus lebt normal mit einer normalen Anzahl an T-Lymphocyten.
Das Prinzip der Erfindung ist folglich besonders neuartig, denn es wird vorgeschlagen, dass das Ersetzen der T-Lymphocyten eines Patienten nicht notwendigerweise durch eine Transplantation von Knochenmark oder hämatopoietischen Stammzellen erfolgt (eine medulläre Aplasie (Konditionierung) vorausgehend), sondern auch mit einem weniger invasiven Verfahren erfolgen kann, das Gegenstand dieser Erfindung ist, das «der Austausch von T-Lymphocyten» ist.
Die Erfindung bietet folglich einen ersten Vorteil im Vergleich zu älteren Techniken, der in der schnellen Rekonstitution des Immunität besteht. Daher erlauben gemäß der Erfindung die einem Patienten injizierten T-Lymphocyten eine viel schnellere Expansion als die Rekonstitution aus T-Lymphocyten, die aus der Differenzierung hämatopoietischer Zellen stammen, was zu einem vollständigen (oder nahezu vollständigen) Ersetzen der T-Lymphocyten des Patienten durch einen Pool von T-Lymphocyten führt, die von den injizierten Zellen abstammen.
Die Erfindung weist einen weiteren bedeutenden Vorteil im Vergleich zu älteren Techniken auf, der in ihrer Spezifität beruht. Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken, bei denen Immunsuppressiva eingesetzt werden, oder zu GMO, der vollständige Knochenmark-Aplasien vorausgehen, weist daher die vorliegende Erfindung:

– eine Spezifität gegenüber immunpathologischen T-Lymphocyten auf, und
– modifiziert nur lediglich einen Teil des Immunsystems einer Person. Schließlich beruht die Erfindung auch auf der Zerstörung von Klonen von immunpathologischen T-Lymphocyten und besitzt folglich ebenfalls einen stabilisierenden Charakter insoweit, als die Klone endgültig supprimiert sind.

Die vorliegende Erfindung bietet folglich zahlreiche Vorteile im Vergleich zu älteren Verfahren und weist vielfache Anwendungsmöglichkeiten auf.
Die oben beschriebenen Ergebnisse, die auf die Existenz eines autonomen und homöostatischen die T-Lymphocyten enthaltenden Kompartiments hinweisen, sind die Basis eines allgemeinen Behandlungsprinzips mit reifen T-Lymphocyten, wobei besagte Behandlung wenigstens 3 Eingriffe umfasst, die, falls erforderlich, zeitlich getrennt sein können:

1) – eine Entnahme autologer, syngener oder allogener T-Lymphocyten, wobei der Spender T-Lymphocyten besitzt, die Immunitäts-, Antigenitäts-, Altersmerkmale oder andere Merkmale aufweisen, die man dem Empfänger übertragen möchte, – gegebenenfalls die genetische Transformation der entnommenen Lymphocyten, um ihnen eine besondere Eigenschaft zu verleihen, – gegebenenfalls die Modifikation (Anreicherung, Depletion, Verarmung...) dieser Lymphocytenpopulation zu einer besonderen antigenen Unterklasse mittels Depletion, Anreicherung oder Verarmung in vitro oder ex vivo, zum Beispiel mittels Immunoaffinität,
2) – die Zerstörung aller oder eines Teils der T-Lymphocyten des empfangenden Patienten,
3) – die Injektion dem Empfänger der besagten angereicherten, depletierten, transformierten oder nicht transformierten Lymphocyten nach Zerstörung aller oder eines Teils seiner eigenen Lymphocyten.

Die Lymphocytenpopulation des Spenders, gegebenenfalls genetisch transformiert oder mittels Depletion einer oder mehrerer nicht untersuchten Unterklassen, kann dem Empfänger verbreicht werden.
Gleichwohl ist die Zerstörung aller oder eines Teils der T-Lymphocyten des Patienten bei allen Anwendungen des Verfahrens nicht unbedingt erforderlich.
Die Anwendungen dieser Behandlungsart sind zahlreich und decken alle Krankheiten oder physiologische Störungen ab, die am Immunsystem impliziert sind. Insbesondere kann man diese Art der Behandlung auf Autoimmunkrankheiten, Allergien, Alterung der Immunfunktionen wie Anergien etc. anwenden.
Diese Erfindung weist wenigstens zwei Spezifitäten auf:

– das vollständige oder partielle Ersetzen von T-Zellen eines Patienten,
– die vollständige oder partielle Zerstörung von pathologischen Klonen, die für die GVH und/oder eine bereits bestehenden Krankheit wie die Autoimmunitätkrankheit verantwortlich sind, und/oder allgemeiner eine Fehlregulation der Immunantwort aufweisen. Diese Zerstörung erfolgt mit Hilfe eines Systems, das spezifisch zum gewählten Zeitpunkt die aktivierten Klone der reinjizierten Zellen zerstört. Diese Zerstörung kann mit jedem vom Fachmann gewählten Mittel erfolgen, wie es später detailliert beschrieben wird.

Spezifischer, ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Population von T-Lymphocyten zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung an eine Person, die einer Depletion ihrer T-Lymphocyten ohne Depletion ihrer anderen hämatopoietischen Zellen, darunter die Stammzellen, unterzogen worden ist.
Die vorliegende Erfindung beruht folglich einerseits auf der Depletion der T-Lymphocyten des Empfängers und andererseits auf der Verabreichung einer Zusammensetzung von T-Lymphocyten. Ein allgemeines Schema dieses "Austauschs von T-Lymphocyten" ist in 1 dargestellt.
Wie aus dieser Figur hervorgeht, kann die T-Lymphocytenpopulation für diese Person autologe, syngene oder allogene T-Lymphocyten umfassen.
Der Ausdruck „autolog" bezeichnet eine Population von Zellen, die von der Person stammen, der die Zellen verabreicht werden. In dieser Anwendungsform werden folglich die T-Zellen der Person vor Durchführung der Depletion entnommen.
Der Ausdruck „syngen" bezeichnet eine Population von Zellen, die vom einem mit der Person identischen Zwilling stammen, der die Zellen verabreicht werden.
Der Ausdruck „allogen" bezeichnet eine Population von Zellen, die von einer anderen Person derselben Spezies (verwandt oder nicht verwandt) stammen, nämlich von einem anderen Menschen im Falle der Behandlung eines Humanpatienten.
Die Population von T-Lymphocyten kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik erhalten oder hergestellt sein. Folglich können die Lymphocyten entweder aus Blut, Lymphorganen oder anderen Organen bei einer Person mit Hilfe herkömmlicher Techniken (Cytophorese, Dichtegradienten, Zellsortierung, etc.) isoliert sein oder von Vorratsbanken erhalten sein. Für eine Entnahme bei einer Person sind die Lymphocyten bevorzugt aus mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) oder des Bluts der Nabelschnur erhalten. Das Blut der Nabelschnur ist eine wichtige Quelle. Denn die T-Lymphocyten der Nabelschnur besitzen den Vorteil, dass sie ein sehr vielfältiges Repertoire aufweisen und zahlreiche Teilungen durchlaufen können.
Handelt es sich um eine Population von autologen T-Lymphocyten können die Lymphocyten folglich in einer besonderen Anwendungsform der Erfindung vom derselben Person (oder von seinem Zwilling, falls vorhanden) mittels Cytophorese aus PBMC oder dem Blut der Nabelschnur entnommen sein.
Handelt es sich um eine Population von allogenen T-Lymphocyten, können sie in einer besonderen Anwendungsform der Erfindung jedem allogenen Spender entnommen sein, der vorzugsweise so ausgewählt ist, dass er mit dem Empfänger HLA-kompatibel ist, so dass es dabei zwischen den Antigen präsentierenden Zellen des Empfängers und den T-Lymphocyten des Spenders zu einer Kooperation kommen kann. In manchen besonderen Situationen können die T-Lymphocyten von einem Spender entnommen werden, der aufgrund eines besonderen Merkmals ausgewählt ist (zum Beispiel seiner erwiesenen Fähigkeit, auf ein infektiöses Agens zu reagieren).
Für die Durchführung des T-Lymphocytenaustauschs gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, dass die eingesetzte T-Lymphocytenpopulation T-Lymphocyten umfasst, die ein vielvältiges Repertoire aufweisen. Dies erlaubt nämlich die Förderung einer schnellen Rekonstitution der Immunität der Person und folglich die Vermeidung einer andauernden beträchtlichen Immundepression bei der Person. In dieser Hinsicht schätzt man, dass das periphere Blut ungefähr 2% der gesamten reifen T-Lymphocyten einer Person enthält. Zudem ist zu bedenken, dass für ein bestimmtes spezifisches Antigen die Häufigkeit der Klone der spezifischen T-Lymphocyten ungefähr eine Zelle auf 10⁵ ist. Folglich hat man aus ungefähr 10⁸ T-Lymphocyten des peripheren Bluts eine Population von T-Lymphocyten, bei der jede Antigenspezifität von ungefähr 1000 Zellen repräsentiert ist. Eine Population dieser Größe erlaubt folglich eine vollkommen zufriedenstellende Repräsentation des Repertoires der T-Lymphocyten. Vorzugsweise ist es bei der Entnahme erwünscht, dass die Menge an erhaltenen T-Lymphocyten in der Größenordnung von 10⁶ bis 10⁹ liegt, vorzugsweise ungefähr zwischen 10⁷ bis 10⁸ Zellen, um ein immunologisch hinreichendes Repertoire abzudecken. Danach können die Zellen, falls erforderlich, in vitro (ex vivo) kultiviert und entwickelt werden. Vorzugsweise umfasst die zur Verabreichung eingesetzte Population von T-Lymphocyten ungefähr 10⁷ bis 10¹² T-Zellen, noch bevorzugter zwischen 10⁸ und 10¹¹, vorteilhafterweise zwischen 10⁹ und 10¹⁰ T-Zellen. Es ist zu verstehen, dass diese Mengen vom Fachmann angepasst sein können.
Zudem kann die verwendete Population von T-Lymphocyten (T-Ly) bestimmte Zellen anderer Natur (nicht T-Ly) umfassen. Folglich enthält vorteilhafterweise die Population von T-Lymphocyten wenigstens 60% T-Ly, vorzugsweise wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 95% T-Ly. Die anderen vorhandenen Zelltypen können zum Beispiel B-Lymphocyten oder andere Blutzellen, allgemein hämatopoietische Zellen, sein. Die Qualität der T-Lymphocytenpopulation kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik bestimmt werden, und besonders durch Markierung mit verschiedenen spezifischen Antikörpern und Analyse mittels Durchflusscytometrie. Zudem kann die Qualität der Lymphocyten ebenfalls mittels Analyse ihres Repertoires mittels Durchflusscytometrie oder mittels immunoscoper Technik überprüft werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die verwendete Population von T-Lymphocyten im Allgemeinen eine Population, die zur Verbesserung der Immuneigenschaften der Person modifiziert ist. Die bei den T-Zellen vorgenommenen Modifikationen) können unterschiedlicher Natur sein.
Folglich kann es sich zum Beispiel um Modifikationen genetischer oder immunologischer Art handeln.
In einer ersten besonderen Variante der Erfindung umfasst die verwendete T-Lymphocytenpopulation genetisch modifizierte T-Lymphocyten.
Der Ausdruck „genetisch modifiziert" bedeutet, dass die Lymphocyten eine Nucleinsäure, die in Lymphocyten in nicht modifiziertem Zustand nicht natürlicherweise vorhanden ist, oder eine Nucleinsäure umfassen, die in einem nicht natürlichen Zustand in den Lymphocyten vorhanden ist (zum Beispiel eine künstlich amplifizierte Sequenz). Nachfolgend wird diese Nucleinsäure als heterologe Nucleinsäure bezeichnet.
Bevorzugter umfassen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten genetisch modifizierten Lymphocyten eine heterologe Nucleinsäure, die ein Selbstmordgen umfasst. Ganz besonders im Sinne der Erfindung versteht man unter dem Ausdruck „Selbstmordgen" jede Nucleinsäure, die für ein toxisches Produkt codiert, nämlich für ein Produkt (RNA, Protein, etc.) das in der Lage ist, die Zerstörung der Zelle, die das Produkt enthält, mit Hilfe verschiedener Mechanismen zu induzieren. Vorzugsweise handelt es sich um eine Nucleinsäure, die für ein Produkt (zum Beispiel ein Protein) mit einer bedingten Toxizität codiert, nämlich das in der Lage ist, einen normalerweise inaktiven Wirkstoff in einen für die Zelle hoch toxischen Metaboliten zu verwandeln. Mit dieser Art von Toxizität ist die Zelltoxizität durch die Verabreichung des Wirkstoffes streng kontrolliert, obwohl alle genetisch modifizierten Zellen das Selbstmordgen exprimieren.
In einer besonders bevorzugten Anwendungsform ist die verwendete Nucleinsäure (d.h. das Selbstmordgen) eine Nucleinsäure, deren toxische Wirkung spezifisch teilende Zellen schädigt. Beispiel für diese Art von Nucleinsäuren ist besonders die Thymidin-Kinase.
Das am häufigsten verwendete Selbstmordgen und mit den interessantesten biologischen Eigenschaften für die Kontrolle zellulärer Immunantworten codiert für die Thymidin-Kinase des Herpes-simplex-Virus des Typs 1 (HSV1-TK). Dieses Enzym ist im Gegensatz zu zellulären Thymidin-Kinasen in der Lage, verschiedene Nucleosid-Analoga, wie Aciclovir (ACV) oder Ganciclovir (GCV), zu Monophosphat-Derivaten zu phosphorylieren, die anschließend in Di- und Triphosphatverbindungen von den Zellenzymen umgewandelt werden. Diese Triphosphatverbindungen können danach von den zellulären Polymerasen in die DNA im Verlauf der Elongation eingebaut werden. Dieser Einbau führt zu einem Abbruch der Elongation und löst die Zellapoptose aus [11-18]. Folglich sind die toxischen GCV-Dosen, die für die Zerstörung der HSV1-TK exprimierenden Zellen erforderlich sind, wenigstens 100-mal niedriger als es für die Zerstörung der elterlichen Zellen erforderlich ist (ungefähr 10-mal für ACV). Wobei GCV in diesem System viel wirksamer ist als ACV, was der gebräuchlichste Wirkstoff ist, obwohl dieser eine Verabreichung mittels zweimal täglicher Infusion erfordert. Die Auslösung des Zelltodes durch Blockierung der DNA-Elongation bedeutet, dass nur teilende Zellen von GCV beeinträchtigt werden, was experimentell bestätigt worden ist. Folglich ist das HSV-1 TK Gen für die Gentherapie von Krebs verwendet worden [5, 6], und erst später für die Zerstörung der T-Ly gleich zu Beginn der pathologischen Immunantworten [1, 2, 7-9].
Dieses System besitzt folglich drei besonders interessante Eigenschaften für die vorliegende Erfindung: (i) eine bedingte Toxizität in Abhängigkeit der Verabreichung eines Wirkstoffes (ein Nukleosid-Analogon), der die Kontrolle des Zeitpunkts der Zerstörung der T-Ly erlaubt; (ii) eine Toxizität, die auf teilende Zellen beschränkt ist, eine Eigenschaft der aktivierten T-Ly; und (iii) eine hohe Flexibilität bei der Anwendung, die verschiedene Verabreichungsschemata des Wirkstoffes erlauben.
Der Prototyp des Selbstmordgens ist das HSV1-TK Gen, das mit Ganciclovir funktioniert.
Andere Thymidin-Kinasen können ebenfalls verwendet sein, wie die vom equinen Herpesvirus des Typs IV abstammende Thymidin-Kinase. Dies können ebenfalls verkürzte TK-Gene sein, wie das delta TK-Gen oder ein Enzym humanen Ursprungs, das so mutiert worden ist, dass es Eigenschaften dieser Virusenzyme erworben hat.
In dieser Hinsicht haben mehrere Arbeitsgruppen therapeutische Versuche begonnen, die auf der Übertragung eines HSV1-TK Gens auf reife T-Ly beruhen, die anschließend im Verlauf der Leukämie-Therapie mit allogenem GMO reinjiziert werden [27, 28]. Die ersten Ergebnisse, die von diesen Untersuchungen bekannt sind, deuten darauf, dass es möglich ist, die Reaktivität dieser T-Ly mit Hilfe einer Behandlung mit Ganciclovir (GCV) in vivo zu kontrollieren [7]. Die beim Menschen und Tier durchgeführten Versuche zeigen folglich, dass es möglich ist, GVH nach der Transplantation von allogenem Knochenmark zu kontrollieren, wenn die injizierten T-Ly das HSV1-TK Gen tragen. Dennoch bleibt das vorgeschlagene Verfahren sehr schwer, denn es umfasst das Ersetzen der gesamten hämatopoietischen Linien des Empfängers.
Die Verwendung einer Nucleinsäure, die für ein bedingtes Toxin codiert, bildet eine besonders bevorzugte Anwendungsform der Erfindung. Denn das Vorliegen dieses Konstruktionstyps in den für die Verabreichung verwendeten Lymphocyten erlaubt die Kontrolle der immunpathologischen T-Antworten auf spezifische Weise. Daher wird im Falle autologer T-Lymphocyten das Vorhandensein des Selbstmordgens für die Zerstörung der T-Lymphocyten genutzt, die an den pathologischen Immunantworten beteiligt sind, und folglich sind die Lymphocytenklone dauerhaft supprimiert, die für diese Krankheiten verantwortlich sind. Im Falle allogener T-Lymphocyten, die im Rahmen einer Knochenmarktransplantation Verwendung finden, wird das Vorhandensein des Selbstmordgens für eine Zerstörung der T-Lymphocyten genutzt, die an der Reaktion des Transplantats gegen den Wirt beteiligt sind, und folglich wird die Entwicklung dieser Art von Krankheiten vermieden.
Folglich wird in einem Anwendungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ein Patient, der an einer Krankheit leidet, die von einer immunpathologischen T-Antwort vermittelt ist, einer wirksamen Depletion von T-Lymphocyten unterzogen (wie es später beschrieben wird) und dann mit T-Lymphocyten rekonstituiert. Diese T-Lymphocyten können entweder T-Lymphocyten desselben Patienten (autologe) sein, nachdem sie mit einem Selbstmordgen transduziert worden waren (nämlich genetisch modifiziert), oder allogene T-Lymphocyten sein, die ebenfalls modifiziert sind. Die reifen T-Lymphocyten, die folglich der Person mit einer Depletion ihrer eigenen reifen T-Lymphocyten injiziert werden, werden sehr schnell proliferieren und expandieren, um den Pool reifer T-Lymphocyten zu rekonstituieren, entsprechend der Homöostase-Eigenschaft der reifen T-Lymphocyten und eine Expansion in vivo durchlaufen, so dass ihre Anzahl die Werte vor der Depletion wieder erlangt. In dieser Hinsicht werden die wenigen bei einer Person verbliebenen T-Ly sich um so weniger vermehren können, als das den T-Lys vorbehaltene Kompartiment von den injizierten Zellen „aufgefüllt" werden wird. Danach wird bei pathologischen Phasen die Person mit dem Wirkstoff behandelt, der in der Lage ist, zu einem toxischen Metaboliten von dem eingesetzten Selbstmordgen verwandelt zu werden, was zu einer bevorzugten Elimination nur der sich teilenden T-Lymphocyten führt, nämlich nur aktivierten und folglich für die Krankheit verantwortlichen T-Lymphocyten. Dieser Austausch von T-Lymphocyten und nachfolgende Behandlung in Gegenwart des Wirkstoffes erlaubt folglich in vivo und dauerhaft (sogar andauernd) das Repertoire der Lymphocyten bei der Person zu modifizieren.
Die Erfindung weist außerdem den Vorteil auf, selbst ohne Kenntnis a priori der an der Entwicklung der betrachteten Krankheit beteiligten Antigene angewandt werden zu können.
Gemäß einer anderen Variante der Erfindung umfasst die Population verwendeter T-Lymphocyten immunologisch modifizierte T-Lymphocyten. Ganz besonders umfasst diese immunologische Modifikation die Modifikation in vitro (oder ex vivo) des Repertoires der T-Lymphocyten besagter Population. Bevorzugter umfasst diese immunologische Modifikation die in vitro oder ex vivo Suppression von Klonen von Lymphocyten, die an den immunpathologischen Antworten beteiligt sind, und/oder von Subpopulationen von T-Lymphocyten mit besonderen immunologischen Eigenschaften (CD4+ oder CD8+, TH1 oder TH2...).
Vorteilhafterweise umfasst die verwendete T-Lymphocytenpopulation folglich eine „Lücke" im immunologischen Repertoire.
Diese Anwendungsform ist besonders für Situationen geeignet, in denen das oder die von den immunpathologischen Klonen erkannten Antigene bekannt sind. Folglich ist es in diesem Fall möglich, eine Depletion in vitro oder ex vivo der T-Lymphocytenpopulation mittels Immunoaffinität mit Hilfe zum Beispiel besagter Antigene oder Fragmente oder Homologe von diesen durchzuführen. Eine derartige Depletion kann zum Beispiel durch eine Passage der T-Lymphocytenpopulation in Kontakt mit einem Träger, auf dem besagte Antigene oder Fragmente oder Homologe immobilisiert sind, durchgeführt werden. Die Depletion von Klonen, die an der Immunkrankheit beteiligte spezifische Antigene erkennen, kann ebenfalls nach einer Übertragung der Selbstmordgene auf die T-Lymphocyten durchgeführt werden, wenn diese anschließend in Gegenwart des Antigens und einer Behandlung mit dem bedingten Toxin (GCV) in vitro stimuliert werden. Bei Fehlen einer genetischen Modifikation können diese vom Antigen in vitro aktivierten Lymphocyten-Klone ebenfalls von mit dem Toxin gekoppelten Antikörpern zerstört werden, die von den aktivierten T-Lymphocyten exprimierten Moleküle spezifisch erkennen (IL2-Rezeptoren).
Diese Anwendungsform kann zum Beispiel im Falle von Krankheiten angewandt sein wie Organtransplantationen, wo die Alloantigene des Organspenders beteiligt sind.
Diese immunologische Modifikation der T-Lymphocyten kann ebenfalls sowohl mit einer autologen oder syngenen Population als auch allogenen Population verwendet sein. Außerdem kann sie auch mit einer genetischen Modifikation kombiniert sein, wie es oben beschrieben ist.
Folglich umfassen in einer besonderen Anwendungsform die verwendete T-Lymphocytenpopulation modifizierte T-Lymphocyten:

– die immunologisch, durch Depletion von spezifischen Klonen und/oder Subpopulationen von T-Lymphocyten mit besonderen immunologischen Eigenschaften (CD4+ oder CD8+, TH1 oder TH2...) modifiziert sind, und
– die genetisch durch Einführen einer Nucleinsäure, die für ein toxisches Produkt codiert, modifiziert sind.

Gemäß einer anderen Variante der Erfindung umfasst die verwendete T-Lymphocytenpopulation allogene T-Lymphocyten, die eine erhöhte Immunität verleihen. Insbesondere ist es möglich T-Lymphocyten zu verwenden, die von einer Person stammen, die eine entsprechende (ausgeprägte oder gesteigerte) Antwort auf infektiöse Agenzien zeigt. So ist bekannt, dass die T-Immunantwort zum Teil von sehr verschiedenen genetischen Faktoren kontrolliert wird. Aus diesem Grund sind, bezogen auf ein bestimmtes Antigen, manche Personen in der Lage, geeignete (vorteilhafte) Antworten zu zeigen, während andere dies nicht können. Gemäß der Erfindung ist es folglich möglich, die T-Lymphocyten von einer Person, die für eine bestimmte Krankheit empfindlich ist, durch diejenigen T-Lymphocyten einer Person zu ersetzen, die umempfindlich ist.
In dieser Anwendungsform ist es nicht erforderlich, dass die T-Lymphocyten immunologisch modifiziert sind. Trotzdem ist es vorzuziehen, dass diese T-Lymphocyten genetisch modifiziert sind, wie es oben beschrieben ist, um jede Reaktion des Transplantats gegen den Wirt kontrollieren zu können.
Zudem ist es in einer bestimmten Anwendungsform der Erfindung möglich, eine Population von T-Lymphocyten zu verwenden, wie sie oben beschrieben ist, die genetisch und/oder immunologisch modifiziert ist und/oder eine erhöhte Immunität verleiht, umfassend außerdem eine Nucleinsäure, die für ein therapeutisches Produkt codiert. Denn gemäß der vorliegenden Erfindung ist es ebenfalls möglich, den verwendeten T-Lymphocyten eine neue Eigenschaft zu verleihen. Wenn die T-Lymphocyten Zellen sind, die einfach zu entnehmen, zu isolieren und zu kultivieren sind, können sie folglich gleichzeitig als Quelle zur Einführung (oder Wiedereinführung) von Proteinen oder von fehlenden oder anomalen Funktionen bei einer Person verwendet sein.
Für die genetische Modifikation der T-Lymphocyten können mehrere Ansätze entsprechend den Techniken des Fachmanns eingesetzt sein.
In einer besonderen Anwendungsform der Erfindung sind die Lymphocyten mit Hilfe eines viralen Vektors genetisch modifiziert. In dieser Anwendungsform wird die heterologe Nucleinsäure zum Beispiel in einen viralen Vektor eingeführt, der anschließend zur Infektion einer wie zuvor beschriebenen T-Lymphocytenpopulation verwendet wird.
Verschiedene Typen viraler Vektoren, besonders retrovirale Vektoren oder AAV, können verwendet sein. In einer bevorzugten Anwendungsform sind die Lymphocyten mit Hilfe eines retroviralen Vektors modifiziert.
Die Retroviren sind als Vektoren zur Übertragung von Genen auf T-Lymphocyten ausgewählt, denn die retrovirale Infektion führt zu einer stabilen Integration des Genoms in den Zellen. Dies ist eine sehr wichtige Eigenschaft unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Lymphocyten-Vermehrung entweder in vitro oder in vivo nach Injektion in die Person voraussetzt, dass das Transgen sehr stabil im Verlauf der Segregation ist, um bei jeder Zellteilung weitergegeben zu werden. Was die Retrovirustypen betrifft, die verwendet sein können, kann man zum Beispiel die Retroviren nennen, die zu der Familie der Oncoviren, der Lentiviren oder der Spumaviren gehören. Aus der Familie der Oncoviren kann man besonders die langsamen Oncoviren nennen, die kein Oncogen tragen wie zum Beispiel MoMLV, ALV, BLV oder MMTV und die schnellen Oncoviren wie zum Beispiel RSV. Aus der Familie der Lentiviren kann man zum Beispiel HIV, SIV, FIV oder CAEV nennen.
Techniken zur Konstruktion defekter rekombinanter Retroviren sind ausführlich in der Literatur (WO89/07150, WO90/02806, WO94/19478, etc.) beschrieben.
In einer besonderen Anwendungsform der Erfindung verwendet man vorteilhaft ein rekombinantes Retrovirus, umfassend eine Hülle vom GALV-Virus (Retrovirus pseudotypisiert mit GALV). Denn es ist gezeigt worden, dass die Infektion von hämatopoietischen Zellen mit einem rekombinanten Retrovirus wirksamer erfolgt, wenn die retrovirale Hülle von einem als Gibbon Affenleukämievirus (GALV) bezeichneten Retrovirus abstammt (Movassagh et al., Hum. Gene Ther. 9 (1998) 225). Mit Hilfe dieser retroviralen Hülle haben wir zudem gezeigt, dass es möglich war, Transduktionsraten von mehr als 95% bei reifen T-Lymphocyten vor jeder Selektion transduzierter Zellen zu erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Andererseits kann das verwendete rekombinante Retrovirus regulatorische Sequenzen der Expression (Promotoren) umfassen, die für bestimmte Subpopulationen von T-Lymphocyten spezifisch sind. Folglich kann es in bestimmten Situationen erwünscht sein, die Nucleinsäure nur in bestimmten Populationen von T-Zellen zu exprimieren, zum Beispiel in den CD4+ oder CD8+ oder noch in den als Th1 oder Th2 bezeichneten Zellen, für die spezifische Marker daher bei der Maus beschrieben sind, die ihre Trennung erlauben. Wenn diese Zellen durch den Cytokin-Typ, den sie produzieren (zum Beispiel IL2 oder gIFN für die Th1 und IL4 für die Th2), gekennzeichnet sind, ist es möglich, die regulatorischen Sequenzen dieser verschiedenen Gene zu verwenden, um die Expression der heterologen Nucleinsäure (insbesondere des Selbstmordgens) zu kontrollieren. Es ist ebenfalls möglich, Promotoren zu verwenden, die eine spezifische Expression in einer beliebigen T-Lymphocytenpopulation kontrollieren, wie zum Beispiel den für das CD4-Molekül codierenden Promotor.
Zudem sind in einer anderen besonderen Anwendungsform der Erfindung die Lymphocyten mit Hilfe eines Retrovirus genetisch modifiziert, das in einer Verpackungslinie gebildet ist und ein verkürztes pol Gen umfasst.
Ein Risiko, das mit der Verwendung viraler Vektoren für die Übertragung von Genen verbunden ist, ist die mögliche Generierung replizierender Viren. Die Verwendung von Linien, die als separates Genom bezeichnet werden, hat die Einschränkung dieses Phänomens erlaubt. Es ist möglich, dieses Phänomen durch Verwendung spezifischer Konstrukte noch zu verringern, die so gestaltet sind, dass sie möglichst viele Rekombinationsereignisse einschränken. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass die Verkürzung des 3'-Endes des pol Gens bis zur Smal Schnittstelle auf dem Genom des ecotropen Moloney Retrovirus (PNCA) erlaubt, die Polymerasefunktion bei Suppression aller Sequenzen, die sich zwischen dem pol Gen und dem für die Hülle des Moloney Virus codierenden Gen überlappen, vollständig zu erhalten. Die Verwendung dieses Konstruktionstyps zur Herstellung der rekombinanten Retroviren, die in der Lage sind, die T-Lymphocyten zu transduzieren, erlaubt folglich eine Verbesserung bezüglich der Sicherheit.
Die Infektion der T-Lymphocyten mit den retroviralen Vektoren kann gemäß jeder dem Fachmann bekannten Technik durchgeführt sein (Inkubation mit Retrovirus-Überstand, Co-Kultur von T-Lymphocyten mit Verpackungszellen vom Retrovirus, Transwell-Techniken, etc.). Ein besonders wirksames Verfahren ist von Movassagh et al. (siehe oben) beschrieben worden und umfasst einen eventuell zu wiederholenden Zentrifugationsschritt. Dieses Verfahren kann für die genetische Modifikation der T-Lymphocyten gemäß der Erfindung vorteilhaft angwandt sein.
Für eine bessere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist der Erhalt eines möglichst effizienten Gentransfers bei den T-Lymphocyten erwünscht. Folglich bevorzugt man die Verwendung einer Population von T-Lymphocyten, umfassend wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 65%, bevorzugter wenigstens 80% genetisch modifizierter T-Lymphocyten. In einer idealen Anwendungsform verwendet man eine Population von T-Lymphocyten, deren Modifikationsrate möglichst nahe 100% liegt.
Wie oben erwähnt, können derartige Niveaus in vitro oder ex vivo durch Verwendung zum Beispiel einer GALV-Hülle und gegebenenfalls unter bestimmten Infektionsbedingungen erhalten werden (Movassagh et al., oben). Zudem ist es in dem Maße, wie die genetische Modifikation in vitro durchgeführt ist, ebenfalls möglich, das Transduktionsniveau durch die Selektion wirksam infizierter Zellen zu verbessern. Hierfür stehen dem Fachmann bekannte Selektionsverfahren zur Verfügung, besonders die Verwendung von Antikörpern, die spezifische Marker auf der Oberfläche infizierter Zellen erkennen oder die Verwendung von Resistenzgenen (wie zum Beispiel das Resistenzgen für Neomycin und für den Wirkstoff G418), oder wie auch von toxischen Verbindungen für Zellen, die das Transgen nicht exprimieren (d.h. die Thymidin-Kinase). In dieser Hinsicht könnte es möglich sein, ein nur für die das HSV1-TK Gen tragende Zellen nicht toxisches Molekül zu verwenden. Dieses Molekül ist mit einem Verfahren zu finden, bei dem eine Durchmusterung einer Bibliothek von Molekülen durchgeführt wird, deren Toxizität bekannt ist und diejenigen Verbindungen zu testen, die 1) von dem HSV1-TK Enzym modifiziert werden und 2) deren Metaboliten nicht mehr toxisch sind. Der Vorteil eines derartigen Verfahrens besteht darin, dass es keiner Übertragung eines zweiten Gens bedarf und dass die Selektion nur unerwünschte Zellen betrifft.
Vorzugsweise ist die Selektion mit Hilfe eines Markergens durchgeführt, das in den retroviralen Vektor eingeführt ist und ein Membranprotein exprimiert. Das Vorhandensein dieses Proteins erlaubt folglich eine Selektion mit Hilfe herkömmlicher Trennungstechniken, wie Trennung mit magnetischen Kügelchen, Säulen oder Sortieren mittels Durchflusscytometrie. Aus dieser Sicht ist ein Gen von Vorteil, das für das humane Thy1-Molekül codiert. Man kann ebenfalls in Erwägung ziehen, ein Molekül wie das CD34-Molekül zu verwenden, das reifen T-Ly fehlt, denn es bestehen bereits Selektionssysteme für Zellen, die dieses Oberflächenmolekül tragen, wobei diese Systeme schon für die Sortierung von Zellen validiert und die klinisch eingesetzt worden sind. Außerdem können diese Marker ebenfalls „tag"-Sequenzen umfassen, wie zum Beispiel c-myc.
Die Verwendung eines Markergens der Membranexpression weist zudem zwei zusätzliche Vorteile im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf: (i) es erlaubt, die genetisch modifizierten T-Lymphocyten leicht zu verfolgen, wenn sie injiziert sind, und vor allem (ii) sie zu zerstören (selbst bei ausbleibender Teilung) aufgrund der Wirkung von Antikörpern, die spezifisch gegen dieses Molekül gerichtet sind (falls sich dies als erforderlich herausstellte).
Für die Durchführung der Expression des Markergens (wie Thy-1) ist es von Vorteil, als bicistronisch bezeichnete Vektoren bevorzugt zu verwenden, für die die toxischen Gene (z.B. HSV1-TK) und Marker (z.B. Thy1) durch eine IRES-Sequenz getrennt sind.
Die erhaltene T-Lymphocytenpopulation, gegebenenfalls genetisch und/oder immunologisch modifiziert und/oder mit einer erhöhten Immunität, kann in jedem Medium und jeder geeigneten Vorrichtung konditioniert werden. Daher sind die verwendbaren Medien alle Kulturmedien für Säugerzellen (RPMI, DMEM, etc.) oder jede andere angepasste Lösung zur Konservierung oder Lagerung von Säugerzellen (Salzlösungen, Puffer, etc.). Die verwendete Vorrichtung kann zum Beispiel ein Röhrchen, Kolben, Flasche, Ampulle, Spritze, Beutel, etc. sein, vorzugsweise unter für einen pharmazeutischen Gebrauch geeigneten Sterilbedingungen. Die Zellzusammensetzung kann anwendungsfertig oder gelagert (zum Beispiel gekühlt, gefroren oder lyophilisiert sein) im Hinblick auf die spätere Verwendung sein. Zudem können, wie es noch später angegeben wird, die Banken derartiger Zellen vorteilhafterweise unter den oben beschriebenen Präparations- und Lagerbedingungen hergestellt sein.
Wie oben angegeben, besteht die Erfindung aus einem Austausch von T-Lymphocyten einer Person und umfasst folglich die Verabreichung von reifen T-Lymphocyten an eine Person, die einer Depletion ihrer eigenen T-Lymphocyten unterzogen wurde.
Vor der Verabreichung wird folglich die Person einem Schritt der Depletion ihrer vorhanden eigenen T-Lymphocyten unterzogen. Es ist zu verstehen, dass wenn die verwendete T-Lymphocytenpopulation eine Population von autologen T-Lymphocyten ist, diese Population vor der Depletion hergestellt wird.
Die Depletion kann auf verschiedene Arten bewerkstelligt werden. Wenn eine begleitende Knochenmarktransplantation erfolgt, kann die Depletion folglich durch die Konditionierung wie die Radiotherapie erfolgen.
Dennoch wird die Depletion am bevorzugtesten durch Behandlung der Person in Gegenwart eines oder mehrerer Immunsuppressiva durchgeführt, insbesondere in Gegenwart eines für T-Lymphocyten spezifischen Immunsuppressivums. Aus diesem Grund wird die Person keiner totalen Aplasie des Knochenmarks unterzogen und behält eine gewisse Immunität, trotz der Immunsuppression der T-Lymphocyten.
Vorzugsweise ist das verwendete Immunsuppressivum ein „antilymphocytäres Serum" oder ein oder mehrere monoklonale Antikörper, die für Oberflächenmoleküle der T-Lymphocyten spezifisch sind. Insbesondere ist eine Verwendung eines Serums oder von anti-CD3, CD4 und/oder CD8 Antikörpern möglich. Diese Art von Immunsuppressiva (depletierendes Serum oder Antikörper) ist schon therapeutisch eingesetzt worden. Folglich zeigen bei Maus und Mensch durchgeführte Versuche, dass es möglich ist, ein Tier oder einen Kranken an reifen T-Lymphocyten durch diese Behandlungen sehr wirksam zu verarmen (Muller et al., Transplantation 64 (1997) 1432; Caillat-Zucman et al., Transplantation 49 (1990) 156).
Es ist nicht erforderlich, dass die Depletion von reifen T-Lymphocyten vollständig ist, damit der Austausch von T-Lymphocyten gemäß der Erfindung wirksam ist. Selbst wenn ein gewisser Prozentsatz von T-Lymphocyten weiter vorhanden, ist es folglich wenig wahrscheinlich, dass diese für einen Wiederausbruch der Immunkrankheit ausreichen werden. Im Allgemeinen führen die oben beschriebenen immunsuppressiven Behandlungen zu einer Depletion von mehr als 90%, oftmals 95%, was für die vorliegende Erfindung vollkommen geeignet ist.
Die Zusammensetzung von T-Lymphocyten kann auf verschiedene Arten und gemäß verschiedenen Protokollen verabreicht sein. Es ist erwünscht, die T-Lymphocyten zu einem Zeitpunkt zu verabreichen, wo die erfolgten Behandlungen von Patienten mit dem Ziel der Zerstörung ihrer eigenen T-Lymphocyten beendet worden sind, so dass sie ihrerseits nicht die T-Lymphocyten angreifen können, die injiziert werden.
Vorzugsweise wird die Zusammensetzung kurze Zeit (zum Beispiel weniger als 48 h nach) nach der Depletion verabreicht, um die Expansion der injizierten reifen T-Lymphocyten zu fördern, die normalerweise die Neigung besitzen, die «Lücke» der reifen Lymphocyten aufzufüllen. Zudem können die Behandlungen, falls erforderlich, mit den gleichen Zellen wiederholt werden, sogar mit Zellen verschiedener Spender aber entsprechend demselben therapeutischen Prinzip. Die Verabreichung kann vorteilhafterweise durch intravenöse oder intraarterielle Injektion erfolgen.
Wie oben angegeben, können die verabreichten Dosen allgemein zwischen 10⁸ und 10¹¹ T-Lymphocyten pro Person umfassen.
Zudem ist es im Verlauf der oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung der T-Lymphocytenpopulationen möglich, Zellen des Patienten (normale und/oder mit dem Selbstmordgen transduzierte) zu konservieren, die für den Bedarfsfall dienen können (Vorrat 1 und 2 in 1). Zum Beispiel wäre es immer möglich, falls unerwünschte Effekte auftreten, reinjizierte Zellen (zum Beispiel allogene) zu depletieren, um nun die (normalen) Zellen des Patienten zu reinjizieren.
Ebenso können im Falle eines allogenen Austausches die transduzierten oder normalen Zellen des Spenders ebenfalls für eine weitere Verwendung, falls erforderlich, konserviert werden (Vorrat 3 und 4 in 1). Es ist zudem möglich, dass bei einem Patienten, der transduzierte allogene T-Lymphocyten erhalten hat, bei dem man die GVH kontrolliert, es nun möglich ist, normale Lymphocyten desselben Spenders zu injizieren, ohne dass eine GVH auftritt (aktive Toleranz). Das hätte den Vorteil, Zellen zu reinjizieren, die nicht kultiviert worden wären. Aus diesem Grund umfasst vorteilhafterweise das Verfahren der Erfindung ebenfalls einen Schritt der Bildung von Banken von transduzierten oder nicht transduzierten T-Zellen, die vom Spender und vom Empfänger stammen.
Nach Verabreichung der oben beschriebenen Zusammensetzungen erlaubt die Erfindung das Auftreten oder die Entwicklung von Immunkrankheiten zu kontrollieren, entweder durch Verabreichung des zu einem toxischen Produkt metabolisierten Wirkstoffes (im Falle von T-Lymphocyten, die mit einem toxischen Gen genetisch modifiziert sind) oder einfach durch die Ausbildung einer erhöhten Immunität bei der Person.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung beruht ebenfalls in einem Produkt, umfassend:

– ein oder mehrere Immunsuppressiva, und
– eine Zusammensetzung, umfassend eine wie oben definierte Population von T-Lymphocyten,

Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung T-Lymphocyten mit einem vielfältigen Repertoire.
Vorteilhafterweise umfasst die Zusammensetzung eine Population von T-Lymphocyten, umfassend ein Selbstmordgen, und das Produkt der Erfindung umfasst außerdem einen Wirkstoff, der geeignet ist, in einen toxischen Metaboliten von dem Selbstmordgen umgewandelt zu werden.
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung von modifizierten T-Lymphocyten, umfassend:

– die Entnahme von T-Lymphocyten bei einer Person, und
– die Bildung einer Lücke im Repertoire dieser Lymphocyten oder allgemeiner die selektive Modifikation des Repertoires.

Ganz besonders wird die Lücke des Repertoires durch Depletion der T-Lymphocyten gebildet, die für an Krankheiten beteiligte Antigene spezifisch sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls jede Population von T-Lymphocyten, die von einer Person entnommen und an T-Lymphocyten-Klonen veramt ist, die für ein oder mehrere an Krankheiten beteiligte Antigene spezifisch sind.
Zudem kann die Erfindung ebenfalls mit jedem anderen Zelltyp zum Teil angewandt sein, nämlich mit jedem Zelltyp im Kompartiment, der folgenden Kriterien entspricht:

– man kann sie entnehmen, man kann die gesamte Population zerstören und man kann sie (mit Modifikationen) (re)injizieren und sie treten an die Stelle derjenigen, die man zerstört hat.
– man kann zum Beispiel eine Subpopulation von T-Ly oder von anderen zirkulierenden Zellen (Muskelzellen im Kreislauf) in Betracht zu ziehen.

Es gibt zahlreiche Anwendungen der Erfindung. Sie betreffen besonders sowohl die modifizierten autologen als auch die allogenen T-Lymphocyten, die gemäß der Erfindung modifiziert sind, alle Autoimmunkrankheiten und im weitesten Sinne chronische Entzündungskrankheiten (rheumatoide Polyarthritis, Arteriosklerose, etc.), Virusinfektionen (Hepatitis A, B, C, HIV etc.) oder genetische Krankheiten. Der Ersatz von T-Lymphocyten betrifft ebenfalls Organtransplantationen oder Zelltransplantationen (allogene, sogar xenogene), wie auch alle Krankheiten, für die man eine Reinjektion modifizierter Lymphocyten wünscht, zum Beispiel für die Sekretion eines therapeutischen Proteins. Dieses System kann ebenfalls für eine mögliche Kontrolle der Immunantwort auf ein therapeutisches Protein dienen, das zum Beispiel zur Korrektur eines genetischen Mangels dieses Proteins verabreicht wird. Ein Nachteil in dieser Situation ist, dass als Folge des genetischen Mangels, der Patient dieses Protein als fremd erkennt und es durch eine Immunantwort abstößt. Gemäß den Prinzipien der Erfindung, wenn die T-Lymphocyten ein Selbstmordgen exprimieren, ist es nun möglich, diese verhängnisvolle Immunantwort zu kontrollieren.
Folglich sind die Autoimmunkrankheiten, die als systemische Krankheiten bezeichnet werden (beispielsweise Lupus erythematodes disseminatus, rheumatoide Polyarthritis, Polymyositis), Leiden mit einer eindeutig immunologischen Komponente, die bei den Patienten durchgeführte biologische und histologische Forschungen rechtfertigen. Für viele dieser Krankheiten ist das „primum movens" nicht bekannt und es scheint, dass die Krankheitsursache multifaktorell ist. Dennoch bleibt als das zentrale Element eine nicht angepasste Immunantwort. Zudem ist es bei diesen Krankheiten im Allgemeinen möglich, den Zeitraum abzugrenzen, wo die für die Krankheit verantwortlichen T-Ly aktiviert sind und folglich sich teilen. Aus diesem Grund erlaubt die während dieser Phase andauernde Verabreichung der Prodrug gemäß der Erfindung prinzipiell ein Einwirken auf diese Zellen. Zudem führt diese Strategie zur Depletion der für die Krankheit verantwortlichen Zellklone und folglich im Prinzip zu einer dauerhaften Immunsuppression, sogar dauerhaft bei zentraler Produktion von T-Ly.
Zum Beispiel in einer besonderen Anwendungsform der Erfindung erhält ein Patient, der an rheumatoider Polyarthritis leidet, nach Depletion seiner eigenen T-Lymphocyten eine Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend seine eigenen T-Lymphocyten, die zur Expression eines Selbstmordgens genetisch modifiziert sind (autologe Zusammensetzung), oder modifizierte oder nicht modifizierte allogene T-Lymphocyten. Danach erlaubt, bei nach der Verabreichung unerwartet auftretenden möglichen Schüben von rheumatoider Polyarthritis, eine Behandlung mit einem Wirkstoff, der von dem Selbstmordgen in einen toxischen Metaboliten umgewandelt wird, die Zerstörung reaktiver Klone und folglich die Suppression der immunpathologischen Antwort.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls für die Behandlung von Virus-induzierten Immunkrankheiten anwendbar. Die Immunantwort auf die infektiösen Agenzien kann häufig immunpathologische Folgen besitzen, die manchmal zum Tod führen. Das geradezu klassische Beispiel hierfür ist die Antwort auf bestimmte Viren, die Hepatitis auslösen. Diese Viren replizieren in den Hepatocyten, was die Zerstörung der infizierten Hepatocyten durch das Immunsystem bedeutet, was zu einer manchmal tödlichen Hepatitis führt. In anderen Situationen scheint die Immunantwort des Wirts nicht in der Lage zu sein, das Virus zu eliminieren, und trägt im Gegenteil dazu bei, eine chronische Hepatitis aufrechtzuerhalten. Dies wird durch die Entwicklung der nach dem Virus C bezeichneten Hepatitis gut veranschaulicht. Während etwa zwei Drittel der Patienten in der Lage sind, sich des Virus zu entledigen, entwickelt ein Drittel eine chronische Hepatitis. Die Entwicklung dieser chronischen Hepatitis ist unabhängig von der viralen Replikationsrate und ist im Gegenteil von biologischen Zeichen begleitet, die von der fehlerhaften Immunantwort zeugen (zum Beispiel häufiges Vorhandensein von anti-DNA Antikörpern oder einer Kryoglobulinämie). Die vorliegende Erfindung erlaubt den/die Klon(e) von aktiven T-Lymphocyten zu eliminieren, die für die Immunkrankheit verantwortlich sind, und daher die Folgen der Infektion für den Wirt zu verringern.
Andererseits steht die Synthese der IgE, die an bestimmten Allergien beteiligt sind, ebenfalls unter der Kontrolle der T-Lymphocyten. Zudem erfolgt die Produktion der B-Lymphocyten aus Immunzellen des Knochenmarks und diese Zelle haben eine viel kürzere Halblebenszeit als die T-Lymphocyten. Aus diesem Grund ist es ebenfalls durch Anwendung der Technik des Austauschs von T-Lymphocyten gemäß der Erfindung möglich, allergische Antworten zu kontrollieren und allgemeiner die Antikörper-Antworten bei der Kontrolle der T-Antworten.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls für die Behandlung oder Prävention der Abstoßung von Organtransplantaten anwendbar.
Die herkömmliche Behandlung für eine manche Organkrankheiten ist, wenn dies erforderlich wird, der Austausch dieses Organs durch ein gesundes Organ, das von einem verstorbenen Spender (oder in bestimmten Fällen von einem lebenden Spender, sogar einer anderen Spezies) stammt. Obwohl eine strenge Sorgfalt für die Auswahl der Organspender aufzubringen ist, die die maximale Kompatibilität hinsichtlich der Histokompatibilitätsantigene aufweisen, ausgenommen Situationen bei Transplantationen bei eineiigen Zwillingen, führt die Organtransplantation immer zu einer Entwicklung einer Immunantwort, die sich gegen Antigene richtet, die von diesem Organ spezifisch exprimiert sind. Trotz der einmal in Gang gesetzten immunsupprimierenden Behandlung, führt diese Reaktion oftmals zu einer Abstoßung des transplantierten Organs (die Hauptursache für das Misslingen allogener Transplantationen). Abgesehen von nachträglichen oder akuten Abstoßungen, die im Wesentlichen humorale Antworten implizieren, ist die Abstoßung von Organtransplantaten meistens von T-Lymphocyten vermittelt.
Zahlreiche Arbeitsgruppen haben Projekte mit Transplantationen von modifizierten oder nicht modifizierten allogenen oder xenogenen Zellen entwickelt, damit sie einen Faktor für therapeutische Zwecke produzieren (zum Beispiel β-Inselzellen des Pankreas, Fibroblasten...). Insbesondere ist dieses auch bei sehr verschiedenartigen Krankheiten vorgeschlagen worden, wie Diabetes, Parkinson Krankheit, sogar selbst bei der Gentherapie bei den Organoiden. Das Haupthindernis für derartige Transplantationen bleibt die Abstoßung der allogenen oder xenogenen Zellen. Um diesen Nachteil zu umgehen, sind sehr viele Systeme vorgeschlagen worden, um die transplantierten Zellen vom Immunsystem zu trennen. Bei diesen Systemen kann es sich um eine Mikroverpackung für die Insertion von Zellen in porösen oder semipermeablen Materialien etc. handeln. Unglücklicherweise hat keines dieser Systeme eine hinreichende Wirksamkeit gezeigt, um es für die klinische Anwendung vorschlagen zu können.
Wenn diese Kranken sich zudem in einem gesunden immunologischen Zustand befinden, ist es absolut statthaft, einen Standard-Austausch von T-Lymphocyten in Erwägung zu ziehen, und dabei einen Vorrat an Lymphocyten der Kranken für den Fall anzulegen, wo möglicherweise ein Problem auftreten könnte.
Die vorliegende Erfindung bietet künftig einen neuen medizinischen Ansatz, um den Erfolg von Organ- oder Zelltransplantationen zu fördern. Insbesondere wird ein Austausch von T-Lymphocyten bei einem Empfänger durchgeführt, was erlaubt, falls erforderlich, jegliche Entwicklung einer möglichen Immunantwort auf das Transplantat durch eine selektive Zerstörung von alloreaktiven T-Lymphocyten zu kontrollieren. Im Rahmen von Organ- oder Zelltransplantationen ist eine Anwendung dieser Therapien entweder bei der Reimplantation beim Empfänger eines Organs oder Zellen und allogener T-Lymphocyten, die vom selben Spender stammen (und die folglich das transplantierte Organ und die transplantierten Zellen tolerieren), oder ein Organ oder Zellen eines allogenen Spenders zu transplantieren und dem Patienten seine eigenen gentechnisch modifizierten T-Lymphocyten zu reimplantieren, um die Antwort auf dieses Organ oder Zellen zu kontrollieren. Schließlich ist es möglich daran zu denken, ein Organ oder Zellen und allogene T-Lymphocyten, die von zwei verschiedenen Spendern stammen, zu transplantieren.
Eine besonders vorteilhafte Anwendungsform der vorliegenden Erfindung beruht in der Behandlung von Immunkrankheiten im Rahmen von Organ- oder Zelltransplantationen. Ganz besonders die Behandlung, die für die totale oder partielle Prävention oder die Reduktion oder Suppression von T-Lymphocyten vermittelten Immunkrankheiten bestimmt ist, die für ein Misslingen der Transplantationen verantwortlich sind.
In ähnlicher Weise kann die Erfindung ebenfalls zur Behandlung (zum Beispiel Prävention, Reduktion oder totalen Suppression) der Transplantat-Wirt-Reaktion (GVH) angewandt sein. Die Knochenmarktransplantation ist eine klassische Behandlung in sehr vielen klinischen Situationen, besonders bei vielen Leukämien. Die herkömmliche Behandlung beruht nun auf der Konditionierung des Spenders, deren Ziel es ist, das Maximum an Tumorzellen zu eliminieren, was eine medulläre Aplasie zur Folge hat, die eine Knochenmarktransplantation erfordert. Diese Knochenmarktransplantation wird vorzugsweise mit allogenen Zellen durchgeführt, denn diese haben gezeigt, dass sie für eine Wirkung verantwortlich sein können, die als «Transplantat gegen die Leukämie» bezeichnet sind, die in beträchtlicher Weise die Rückfallraten der so behandelten Leukämien begrenzt. Unglücklicherweise sind die allogenen T-Zellen auch für die immer ernstzunehmende und manchmal tödliche Krankheit von Transplantat gegen den Wirt (GVH) verantwortlich. Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erlaubt die Zerstörung der für die GVH verantwortlichen T-Lymphocyten und folglich die Behandlung dieser Immunkrankheit.
Andere Beispiele für Krankheiten, die durch das Ersetzen von T-Lymphocyten behandelt werden können, sind besonders Infektionen mit HIV oder bestimmte genetische Krankheiten.
Folglich sind die T-Lymphocyten ein wichtiges Ziel der Infektion mit HIV, deren klinische Entwicklung zum großen Teil vom Verhältnis dieser Lymphocyten beim infizierten Patienten abhängt. Einige therapeutische Strategien der Infektion mit HIV beruhen auf der Übertragung von genetisch modifizierten T-Lymphocyten, um dem Virus zu widerstehen. Denn es gibt auch Patienten, deren T-Lymphocyten weniger empfindlich für eine Infektion mit HIV sind, aufgrund von spontanen Mutationen in Genen, die für Proteine codieren, die am Replikationszyklus des Virus beteiligt sind. Folglich gibt es wie bei der Antwort auf das Hepatitis Virus genetische Unterschiede, die von den T-Lymphocyten exprimiert sind und diese mehr oder weniger für eine Infektion mit HIV empfindlich machen. Die vorliegende Erfindung erlaubt diese sehr verschiedenartigen genetischen Faktoren zu nutzen, besonders durch das Ersetzen der T-Lymphocyten einer Person, die für eine bestimmte Krankheit empfindlich sind, durch Lymphocyten einer unempfindlichen Person.
Es gibt andererseits sehr viele genetische Krankheiten, die mit der Unfähigkeit ein Protein zu synthetisieren verbunden sind, das, falls es von bestimmten spezifischen Zelltypen synthetisiert wird (nicht notwendigerweise T-Lymphocyten), dennoch eine allgemeine Wirkung besitzt. Folglich können diese Krankheiten oftmals durch eine Knochenmarktransplantation behandelt werden, wenn ein kompatibler Spender gefunden werden kann. Dieselben Krankheiten könnten durch eine Übertragung von T-Lymphocyten behandelt werden (Mucopolysaccharidose..).
Es gibt ebenfalls genetische Krankheiten, die auf Lymphocyten spezifisch einwirken (Adenosindesaminase-Mangel,..), die auch mit dem Standard-Austausch von T-Lymphocyten gemäß der Erfindung behandelt werden können. Schließlich können auch mögliche Strahlenunfälle oder jede andere akuta medulläre Insuffizienz (zum Beispiel toxische, medikamentöse...) durch einen Austausch der T-Lymphocyten gemäß der Erfindung behandelt werden. Man kann folglich Banken von hämatopoietischen Stammzellen und Banken von T-Lymphocyten anlegen, die von den gleichen Spendern stammen, wo nur die T-Lymphocyten einer genetischen Modifikation unterzogen worden wären, was die Kontrolle von immunpathologischen Krankheiten erlauben würde. Folglich kann man „universelle Banken" anlegen, die Marktransplantationen mit reifen T-Lymphocyten für Situationen erlauben, die das erfordern.
Gemäß einer anderen Variante der Erfindung kann die Population von T-Lymphocyten des Spenders für die Prävention oder Behandlung der Alterung von Immunfunktionen wie Anergien verwendet sein.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Hilfe der nachfolgenden Beispiele detaillierter beschrieben, die als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung betrachtet werden sollen.
LEGENDE DER FIGUREN
1: Schematische Darstellung des Prinzips des standardmäßigen Austauschs von T-Lymphocyten.
2: GCV-Empfindlichkeit von T-Zellen, die eine Thymidin-Kinasae exprimieren. Die Milzzellen sind 2 Tage in Gegenwart von ConA und steigenden Konzentrationen von GCV kultiviert, dann über Nacht mit Tritium-TdR beladen worden (eine Aufnahme von 100% ist ohne GCV zu beobachten). Die Dreiecke, Quadrate und Punkte entsprechen verschiedenen TK-Formen. Die obere Kurve entspricht nicht transduzierten T-Lymphocyten.
3: Schützende Wirkung vor der GVH mit einer Behandlung von 7 Tagen mit GCV. Die Kontrollgruppe der Bestrahlung wird von bestrahlten, nicht transplantierten Mäusen gebildet (n=15). Eine tödliche GVH an Tag 35 für 100% der Mäuse wird durch die Co-Injektion von Knochenmarkzellen und allogenen T-Lys induziert (n=25). Das Überleben der behandelten Mäuse (n=13) wird mit den Mäusen verglichen, die nur Mark erhielten und folglich keine GVH entwickelten (n=15).
4: Pharmakogenetische Kontrolle der lymphocytären Choriomeningitis bei Mäusen, die das Selbstmordgen in Populationen von CD4 und CD8 Lymphocyten exprimieren. FVB oder C57BL/6 Mäuse sind bestrahlt und mit syngenem Knochenmark, das von FVB Mäusen oder von transgenen EPDTKL20 Mäusen stammt, oder mit allogenem Mark rekonstituiert worden. Nach Rekonstitution des Immunsystems sind die Empfänger mit dem Virus der lymphocytären Choriomeningitis (10⁴ PFU LCMV Stamm Arm/53b) intracerebral infiziert und mit GCV über 7 Tage (zweimal tägliche intraperitoneale Injektionen mit 100 mg/kg) behandelt worden. Die Mäuse, die das TK-Gen in ihren Lymphocyten exprimieren, sind geschützt, überleben, haben LCMV eliminiert und besitzen einen hohen anti-LCMV Antikörper-Titer.
BEISPIELE
1. Untersuchung der Regulation der immunpathologischen Antwort
Um die Möglichkeit der Kontrolle der pathologischen Immunantworten mit Hilfe von Selbstmordgenen zu untersuchen, haben wir transgene Mäuse entwickelt, die das HSV1-TK-Gen in den T-Lys exprimieren. Diese Expression wird mit Hilfe regulatorischer Sequenzen erhalten, die von dem für das CD4-Molekül codierenden Gen stammen, von denen wir bereits gezeigt hatten, dass sie zu einer spezifischen Expression eines Transgens in den reifen CD4+ und CD8+ T-Lymphocyten unter Ausschluss der unreifen CD4^– CD8^– oder CD4⁺CD8⁺ Thymocyten führen [26]. Die T-Ly dieser transgenen Mäuse werden in vitro von GCV wirksam zerstört. (2).
In allen nachfolgenden Beispielen stammen die T-Lymphocyten von transgenen Mäusen einzig wegen der Vereinfachung des experimentellen Verfahrens. Dieselben Versuche können unter Verwendung von murinen oder humanen T-Lymphocyten reproduziert werden, in denen das gleiche Selbstmordgen mit einem retroviralen Vektor entsprechend den Regeln der Technik transferiert werden kann.
1.1 Kontrolle der GVH bei der Maus
Unter Verwendung transgener Mäuse, die das HSV1-TK-Gen in den T-Lymphocyten exprimieren, haben wir gezeigt, dass es vollkommen möglich war, die für die Reaktion des Transplantats gegen den Wirt verantwortliche allogene Antwort bei diesen Tieren zu kontrollieren. Wir haben also folglich den Beweis erbracht, dass wir prinzipiell in der Lage sind, die für die GVH verantwortlichen T-Lymphocyten zu kontrollieren. Man muss übrigens erwähnen, dass diese therapeutische Wirkung durch extrem kurze Behandlungen mit Ganciclovir erhalten werden kann und dass wir gezeigt haben, dass am Ende dieser Behandlungen nicht nur die Krankheit überwunden war, sondern dass die Mäuse eine normale Immunantwort zeigten.
Wir haben diese transgenen Mäuse als Spenderinnen von T-Lys HSV1-TK⁺ für die Entwicklung eines Modells der Transplantat gegen den Wirt Krankheit (GVH) nach einer Transplantation allogenen Knochenmarks (GMO) [8] verwendet. Folglich führt bei letal bestrahlten Mäusen ein allogenes GMO, das an T-Lys veramt ist, zu einem Überleben aller Tiere und zu einer vollständigen hämatopoietischen Rekonstitution durch die Spenderzellen. Dagegen führt das mit T-Lys supplementierte Transplantat zu einer 100% Mortalität der Tiere, die klinische und histologische Anzeichen einer GVH aufweisen. In diesem Modell haben wir gezeigt, dass wenn die T-Lys das HSV1-TK Selbstmordgen exprimieren, eine Behandlung mit GCV, beginnend am Tag der Transplantation und über 7 Tage ausgedehnt, die klinische GVH-Prävention erlaubt (3). Wenn diese Tiere getötet werden, zeigt die histologische Untersuchung das Fehlen jeglicher histologischer Anzeichen einer GVH bei diesen Tieren. Die Behandlung ist ebenfalls bei einer manifestierten GVH wirksam.
Die bei diesen Tieren vorhandenen Zellen hämatopoietischen Ursprungs stammen vom Spender. Interessanterweise haben wir beobachtet, dass die T-Lys, die die Behandlung mit GCV überlebt haben, immer noch in der Lage sind, auf Stimulationen durch ein Mitogen oder ein drittes Alloantigen, aber nicht durch die Zellen, die vom Spender oder vom Empfänger stammen, in vitro zu antworten. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass eine Behandlung mit GCV die Elimination alloreaktiver Klone von T-Lys erlaubt, und dabei ein Kompartiment von T-Lys konserviert, die in der Lage sind, auf andere antigene Stimulationen zu antworten.
1.2 Behandlung der autoimmunen Diabetes bei der diabetischen (NOD) Maus durch Austausch von T-Lymphocyten: Beweis der Wirkung
Dieses Experiment hat das Ziel, die Wirksamkeit des Austauschs von genetisch modifizierten T-Lymphocyten auf die Kontrolle einer spontanen Autoimmunkrankheit (MAI) zu zeigen, die hier mit dem Modell der autoimmunen diabetischen NOD Maus dargestellt ist. Der Austausch der T-Lymphocyten erfolgt unter Bedingungen, die den klinischen Bedingungen sehr nahe kommen. Der Austausch von T-Lymphocyten erfolgt mit für den Empfänger allogenen T-Lymphocyten, was die Zerstörung von eventuell verbleibenden autoimmunen Zellen erlaubt. Der Austausch von T-Lymphocyten erfolgt mit genetisch modifizierten T-Lymphocyten, die das TK-Selbstmordgen exprimieren. In diesem Modell beruht die Kontrolle der GVH auf der Verwendung von genetisch modifizierten T-Lymphocyten, die das TK-Gen exprimieren, verbunden mit einer Behandlung mit Ganciclovir (GCV). Dieses System erlaubt die Zerstörung der teilenden TK-T-Lymphocyten, die folglich die GVH kontrollieren. Der Austausch von T-Lymphocyten erfolgt nach einer nicht myelo-ablativen Konditionierung der NOD Mäuse durch eine Bestrahlung mit 8-9 Gy, die zu einem 100% Überleben an Tag 120 bei derartigen Mäusen führte. Der Austausch von T-Lymphocyten erfolgt durch Injektion in den retro-orbitalen Sinus der bestrahlten Mäuse mit 10⁷ Zellen, verbunden mit einer 7 tägigen präventiven Behandlung mit Ganciclovir, die zum Zeitpunkt der Transplantation beginnt. Eine erste Kontrollgruppe ist aus Mäusen gebildet, die 10⁷ Zellen vom allogenen Knochenmark aber keine T-Lymphocyten erhielten. Bei diesen Mäusen kann das Transplantat partiell oder vollständig abgestoßen werden und die MAI wieder auftreten. Eine zweite Kontrollgruppe ist mit Mäusen gebildet worden, die 10⁷ Knochenmarkzellen, die von NOD-Mäusen stammten, aber keine T-Lymphocyten erhielten.
Die Wirksamkeit dieser Strategie wird bewertet durch:

– die Analyse des Vorhandenseins von genetisch modifizierten T-Lymphocyten, die durch die Expression von Molekülen des MHC, die vom Spender stammen, gekennzeichnet sind;
– die Bestimmung von klinischen Anzeichen der autoimmunen Diabetes (Blutzucker höher als 2 g/l);
– durch das Vorhandensein von lymphocytären Infiltraten auf den Langerhans Inseln.

ERGEBNISSE • Ursprung der CSMNSP Tabelle 1: Untersuchung der Chimärisierung 180 Tage nach der Transplantation
180 Tage nach der Transplantation wird die hämatopoietische Rekonstitution nach Markierung der CSMNSP mit monoklonalen Antikörpern und mittels Durchflusscytometrie bewertet. Die vom Spender stammenden B und T-Zellen werden durch die Expression von Molekülen des MHC Klasse I (H-2^q) bestimmt. Die B und T-Zellen des Empfängers werden durch die Expression von Molekülen des MHC Klasse II (j-A^k) bestimmt.
Bei den NOD Mäusen, bei denen ein Austausch von T-Lymphocyten durchgeführt worden ist, sind nur vom Spender stammende Zellen vorhanden.
• Vorliegen von lymphocytären Infiltraten nach Austausch von T-Lymphocyten Tabelle 2: Preriinsulitis und Insulitis bei der NOD Maus nach Austausch von T-Lymphocyten.
180 Tage nach der Transplantation wird der Pankreas den Mäuse entnommen, in Bouin-Lösung fixiert, dann in Paraffin verbracht. Das Vorhandensein von lymphocytären Infiltraten wird mit 4 Micron dicken Schnitten nach Markierung mit Hämatoxoilin und Eosin bewertet.
Auf keinem Pankreas der Mäuse, die einem Austausch von T-Lymphocyten unterzogen wurden, ist ein lymphocytäres Infiltrat beobachtet worden.
Zudem sind die Mäuse normal glycämisch geblieben, was folglich das Ausbleiben eines Diabetes beweist.
Als Schlussfolgerung sind die Empfänger-Mäuse mit den allogenen T-Lymphocyten rekonstituiert und entwickeln keine Autoimmunkrankheit mehr.
1.3 Kontrolle einer Virus-induzierten Immunkrankheit
Wir wollten nun dasselbe System zur Kontrolle einer von einem Virus induzierten immunpathologischen Reaktion anwenden. Das klassische Versuchssystem ist das System zur Kontrolle der Encephalopathie, die von dem CML-Virus bei der Maus induziert wird.
Die Immunantwort auf das CML-Virus ist sehr gut bekannt. So sterben die mit diesem Virus intracerebral inokulierten Tiere sehr schnell an einem rasch verhängnisvollen Cerebralleiden, das von cytotoxischen T-Lymphocyten vermittelt ist. Bei den Tieren, die eine vorhergehende Immunisierung erhielten, ist die Reaktionskinetik der sensibilisierten T-Lymphocyten beschleunigt, was zu einem Schutz und zum Überleben der Mäuse führt. Bei den Tieren, die Ganciclovir zum Zeitpunkt der intracerebralen Injektion erhielten, führte die Zerstörung der cytotoxischen T-Lymphocyten, die von der viralen Replikation aktiviert waren, zu einer Kontrolle des Cerebralleidens.
1.4 Kontrolle einer Transplantatabstoßung
Wir haben dann unsere Mäuse zum Testen der Kontrolle der für die Organtransplantatabstoßung verantwortlichen Immunantworten verwendet. Das angewandte Modell kann als ein vollständig physiologisches Modell betrachtet werden. Es handelt sich um ein in heterotoper Position vaskularisiertes Herztransplantat bei der Maus. Wenn diese allogene Transplantation bei nicht behandelten Mäusen durchgeführt wird, erfolgt die Abstoßung in regelmäßiger Weise innerhalb einiger Tage nach der Transplantation. Wenn die Mäuse mit Ganciclovir innerhalb eines sehr kurzen Zeitraums (7 Tage ab der Transplantation) behandelt werden, wird das Herz dauerhaft toleriert und bewahrt seine Vitalfunktionen, wie es seine Schläge beweisen.
2. Therapieprotokoll des Austauschs von T-Lymphocyten, angewandt bei Autoimmunkrankheiten.
Die Behandlung beginnt mit einer Ablation der T-Lymphocyten. Diese Ablation kann zum Beispiel durch eine kombinierte Verabreichung von „antilymphocytärem Serum" (Immunglobuline, die in der Lage sind, T-Lymphocyten zu erkennen und diese in Gegenwart des Komplements des Patienten zu zerstören, und werden üblicherweise von Kaninchen gebildet, zum Beispiel von den Merieux Laboratorien). Die verabreichte Menge an Serum und die Verabreichungsdauer sind von den klinischen Daten der pharmazeutischen Menge und von der Herstellerempfehlungen abhängig. Diese Behandlung kann zur gleichen Zeit wie die Verabreichung anderer Immunsuppressiva wie Cyclophosamid und Cyclosporin erfolgen. Um die T-Lymphocyten im Gewebe zu erreichen, die diesen Behandlungen sehr wohl widerstehen könnten, ist es nun möglich, eine freisetzendeBestrahlung anzuhängen und dabei das Knochenmark des Patienten zu schützen.
Am Ende dieser Behandlung kann die Depletion der T-Lymphocyten bei peripherem Blut mittels ihrer herkömmlichen Zählung untersucht werden. Eine Depletion von mehr als 90% der Lymphocyten des peripheren Bluts ist vorzuziehen.
Am Ende dieser Behandlung erfolgt eine i.v. Injektion von T-Lymphocyten bei den Patienten, die pro Dosis bevorzugt zwischen 10⁹ und 10¹¹ Zellen enthält. Die T-Lymphocyten sind in diesem Fall von einem allogenen Spender erhalten worden, der die maximale Kompatibilität der Haupthistokompatibilitätsantigene aufweist. Dies kann zum Beispiel ein übereinstimmendes engverwandtes HLA für die Situationen sein, in denen das familiäre genetische Risiko, die selben Krankheiten innerhalb der Familien wiederzufinden, nicht zu erhöht ist. Die reinjizierten Zellen sind zuvor mit einem Selbstmordgen wie das HSV1-TK-Gen transduziert worden und die reinjizierten Zellen umfassen wenigstens 90% transduzierte Zellen. Zudem durchlaufen die Zellen die ganzen Qualtitätskontrollen (Phänotyp, Analyse des Repertoires).
Einige Tage nach der Injektion, vorzugsweise in der den Injektionen darauffolgenden Woche, 48 Stunden nach der Injektion, erhält der Patient eine Behandlung mit Ganciclovir mit 10 mg/kg zweimal täglich. Wenn die GVH-Anzeichen früher auftreten sollten, kann eine noch frühere Behandlung in Erwägung gezogen werden. Die Behandlung dauert wenigstens eine Woche. Am Ende dieser Behandlung wird der Patient weiter behandelt, besonders um die Rekonstitution der T-Lymphocyten zu kontrollieren.
Die Anzeichen einer Reaktion des Transplantats gegen den Wirt sind zum Beispiel mit Hautschädigungen verbunden. Wenn derartige Manifestationen auftreten, wird eine heilende Behandlung mit Ganciclovier unternommen.
Die Behandlung wird wiederholt und beendet, wenn die Lymphocytenzahl wieder Werte von wenigstens 200 T-Lymphocyten pro mm³ einnimmt.
Im Falle ernster Sekundäreffekte während der Behandlung, wie zum Beispiel eine GVH, die nicht mit Ganciclovier kontrolliert werden könnte, ist es nun möglich, den Patienten mit Medikamenten wieder zu behandeln, die die Zerstörung der T-Lymphocyten erlauben, um danach seine eigenen Zellen wieder zu injizieren, die zuvor kryokonserviert worden sind. Zudem hilft eine Injektion des anti-Marker Antikörpers bei der Elimination der T-Lymphocyten, wenn die T-Lymphocyten zur Konstruktion einen Membranmarker besitzen.
Für andere Arten von Autoimmunkrankheiten können die reinjizierten Lymphocyten ähnlicherweise mit dem HSV1-TK-Gen transduzierte Lymphocyten des Patienten sein. Unter diesen Umständen erfolgt am Schluss der Reinjektion keine Behandlung mit Ganciclovir. Nach Feststellung der Rekonstitution des Pools an Lymphocyten des Patienten, wenn Phasen akuter Krankheitsschübe auftreten werden, wird eine Ganciclovir-Behandlung so früh wie möglich nach Feststellung dieser Schübe erfolgen, die zum Beispiel Schübe einer entzündlichen Arthritis bei der Behandlung einer rheumatoiden Arthritis oder eines neurologischen oder muskulären Leidens im Falle der Arteriosklerose sein können.
3. Therapieprotokoll des Austauschs von T-Lymphocyten, angewandt für die Behandlung der Organtransplantation.
Bei dieser therapeutischen Indikation ist der Patient, wie zu vor beschrieben, vorbehandelt. Er wird danach zum Beispiel mit seinen eigenen das Selbstmordgen exprimierenden Zellen und ohne Behandlung mit Ganciclovir rekonstituiert. Wenn der Patient sein Immunsystem rekonstituiert hat, kann die eigentliche Organtransplantation vorgenommen werden. Unmittelbar der Transplantation folgend, kann eine ungefähr einwöchige prophylaktische Behandlung mit Ganciclovir unternommen werden. Der Patient wird dann auf die Entwicklung klinischer Anzeichen kontrolliert, die ein Beginn einer Transplantatabstoßung anzeigen könnten. In diesem Fall würde eine erneute Behandlung mit Ganciclovier unternommen werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die herkömmlichen immunsupprimierenden Behandlungen wie zum Beispiel Cyclosporin in dieser Situation eingesetzt werden können.
In einer anderen Therapieform können die Lymphocyten vom Organspender stammen. In diesem Fall tolerieren sie das Transplantat und die Vorgehensweise ist folglich eine GCV-Behandlung unmittelbar nach der Verabreichung der genetisch modifizierten T-Lymphocyten mit dem Ziel der GVH-Suppression.
4. Therapieprotokoll für die Prävention der immunologischen Alterung
Das Immunsystem unterliegt auch der Alterung, die durch eine schlechte Regulation der Immunantwort gekennzeichnet ist, wie beispielsweise das Auftreten von Autoimmunkrankheiten oder die Unfähigkeit, eine wirksame Immunantwort auf ein neues Antigen zu entwickeln.
In dieser Anwendung ist die Behandlung präventiver Art. Wenn der Patient noch jung ist, werden ihm T-Lymphocyten entnommen. Es ist einfach und gefahrlos, 10⁸ Lymphocyten im Verlauf einer Cytopherese zu entnehmen.
Dieser Eingriff kann ausreichend häufig in Zeiträumen von einigen Monaten wiederholt werden.
Es ist gegenwärtig bekannt, dass die Subpopulationen von T-Lymphocyten, als „Gedächtniszellen" bezeichnet, zirkulieren. Wenn dies nicht der Fall wäre, müssten sie chirurgisch oder nach einer Mobilisierung mit einem Wachstumsfaktor oder anderweitig entnommen werden.
In der bevorzugten Anwendungsform sind die T-Lymphocyten kultiviert und amplifiziert, um 10¹⁰ – 10¹¹ T-Lymphocyten zu erreichen.
Die Zellen werden nun aufgeteilt und mehrere Jahre eingefroren. Wenn ein Bedarf dafür besteht, wie Auftreten eines immunologischen Problems oder Schwierigkeiten, eine Immunantwort zu zeigen, werden die T-Lymphocyten aufgetaut und der Person wieder injiziert.
Diese Reinjektion kann alle oder einen Teil der eingefrorenen T-Lymphocyten betreffen und es kann eine totale oder partielle Ablation der zirkulierenden T-Lymphocyten vorangehen.
Man kann ganz vorausschauend zum Beispiel nur eine Unterklasse von T-Lymphocyten durch eine andere Unterklasse von T-Lymphocyten ersetzen. Zum Beispiel ist es vollkommen möglich, nur die CD8-Lymphocyten (oder jene, die ein bestimmtes TCR tragen) selektiv zu zerstören und die zuvor eingefrorenen T-Lymphocyten zu sortieren, um nur die erwünschte Unterkisse von T-Lymphocyten zu injizieren, sogar das Transplantat an dieser oder jener Unterklasse von T-Lymphocyten zu verarmen.
Man erhält nun den Austausch der T-Lymphocyten des Patienten durch jüngere und die besser genau ihre Funktionen garantieren. Im Falle von Autoimmunkrankheiten werden die alloreaktiven T-Lymphocyten zerstört und durch ungefährliche T-Lymphocyten ersetzt. Im Falle einer mit der Alterung der T-Lymphocytenpopulation verbundenen Krankheit handelt es sich um Präventionstherapie. Denn es handelt sich wirklich um eine „Verjüngung" der T-Lymphocyten und folglich des Immunsystems.
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Claims

Verwendung einer Population von T-Lymphocyten zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Behandlung einer von den T-Lymphocyten vermittelten Immunkrankheit bei einer Person bestimmt ist, die einer spezifischen Depletion ihrer T-Lymphocyten oder Subpopulationen von T-Lymphocyten ohne Depletion ihrer anderen hämatopoietischen Zellen, darunter die Stammzellen, unterzogen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von T-Lymphocyten bezogen auf die Person autologe oder syngene T-Lymphocyten umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von T-Lymphocyten bezogen auf die Person allogene T-Lymphocyten umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von T-Lymphocyten genetisch modifizierte T-Lymphocyten umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die T-Lymphocyten eine für ein toxisches Produkt codierende Nucleinsäure umfassen.
Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure für ein Protein codiert, das eine bedingte Toxizität besitzt, wie zum Beispiel die Thymidin-Kinase.
Verwendung gemäß Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lymphocyten eine für ein therapeutisches Produkt codierende Nucleinsäure umfassen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lymphocyten mit Hilfe eines viralen Vektors genetisch modifiziert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der virale Vektor ein retroviraler oder AAV vorzugsweise ein retroviraler Vektor ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von T-Lymphocyten immunologisch modifizierte T-Lymphocyten umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die immunologische Modifikation die Modifikation des Repertoires der T-Lymphocyten der Zusammensetzung umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 3 bis 4 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von T-Lymphocyten eine erhöhte Immunität bereitstellende T-Lymphocyten umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Depletion der T-Lymphocyten durch Behandlung der Person in Gegenwart eines oder mehrerer Immunsuppressiva durchgeführt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Depletion der T-Lymphocyten durch Behandlung der Person in Gegenwart eines für T-Lymphocyten spezifischen Immunsuppressivums durchgeführt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunsuppressivum ein anti-CD3, CD4 und/oder CD8 Serum oder Antikörper ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, außerdem umfassend die Verabreichung eines Medikaments an die Person, das geeignet ist, von dem Protein in einen toxischen Metaboliten umgewandelt zu werden.
Produkt, umfassend: – ein oder mehrere Immunsuppressiva, und – eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von T-Lymphocyten, die durch die in vitro oder ex vivo Suppression von Lymphocyten-Klonen, die an immunpathologischen Antworten beteiligt sind, und/oder von Subpopulationen von T-Lymphocyten mit besonderen immunpathologischen Eigenschaften, immunologisch modifiziert sind, im Hinblick auf eine separate oder in zeitlichen Abständen erfolgende Verwendung.
Produkt gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass – die Zusammensetzung eine Population von T-Lymphocyten umfasst, die ein Selbstmordgen umfassen, und dass das Produkt außerdem umfasst – ein Medikament, das geeignet ist, von dem Selbstmordgen in einen toxischen Metaboliten umgewandelt zu werden.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung von modifizierten T-Lymphocyten, umfassend: – die Entnahme von T-Lymphocyten bei einer Person, und – die Modifikation des Repertoires dieser Lymphocyten durch in vivo oder ex vivo Suppression von Lymphocyten-Klonen, die an immunpathologischen Antworten beteiligt sind, und/oder von Subpopulationen von T-Lymphocyten mit besonderen immunpathologischen Eigenschaften.
Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Lücke im Repertoire durch Depletion der T-Lymphocyten, die für bei Krankheiten beteiligte Antigene spezifisch sind, geschaffen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Prävention oder zur Behandlung von Immunkrankheiten, besonders im Rahmen von Organ- oder Zelltransplantationen, bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Prävention oder zur Behandlung der Alterung des zellulären Immunsystems bestimmt ist.