JP2002520262A - Tリンパ球交換 - Google Patents

Tリンパ球交換

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クラッツマン,ダビッド
コーアン,ジョゼ
ボイエ,オリヴィエ
トマ−ヴァスラン,ヴェロニク
サルツマン,ジャン−ルー
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ユニヴエルシテ・ピエール・エ・マリー・キユリー・パリ・シス
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Tリンパ球交換手順に関する。この手順は、例えば、Tリンパ球の減少を経た対象への投与のための組成物を調製するために、Tリンパ球の集団を用いることを含む。本発明はこの手順を実施するための組成物および手段にも関する。本発明は数多くの障害、特に免疫病理を制御するためにも用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は免疫および医薬の分野に関する。さらに特定すると、それは数多くの疾
病を治療することを可能にする新規な免疫学的アプローチに関する。さらに特定
すると、本発明は、ホストのTリンパ球を減少させた後の、「Tリンパ球交換」
療法に関する。本発明は、Tリンパ球が含まれる数多くの障害の治療に適用する
ことができる。
【0002】 Tリンパ球は、特に伝染性の媒介動物または腫瘍細胞に対して、組織を守る効
果的な免疫反応の発達には不可欠な細胞である。しかしながら、Tリンパ球反応
は通常は有益である一方において、それは障害(自己免疫疾患、移植拒絶反応等
)の原因になり得る場合もあるのである。そのような場合、免疫病理を治療する
ためにTリンパ球の反応を制御する能力は非常に重要である。
【0003】 必要に応じて、T免疫応答を制御するために数多くの治療法が広く用いられて
いる。組織移植に引き続く治療はそのような異なる治療法の使用のよい例を提供
している。組織移植は通常、例えばエンドキサン、コルチコステロイド、サイク
ロスポリンまたはFK506のような、従来の免疫抑制剤として知られている免
疫抑制剤(拒絶反応に到るホストの免疫応答から移植物を保護することを目的と
する)による治療の後に引き続くものである。組織移植の中でなされた進歩によ
って証明されるように、そのような治療は比較的効果的であることが示されてい
るが、それらは常に移植拒絶反応を防げるわけではない。
【0004】 さらに、そのような治療は2つの欠点を有する: (i)それらはただ免疫応答を「凍結」するだけであり、それゆえ永久的に続け
なければならない(免疫抑制剤の治療を完全にやめることは、数年後でさえも組
織の拒絶反応という結果に終わる)、および (ii)それらは完全に非特異的であり、それゆえ治療の全期間の間、好ましい免
疫応答をも阻害してしまうのである。 これは、感染およびある種の癌に対する感受性を高めることとなる。この状況は
患者の生気ある予後を弱めている。
【0005】 このような免疫抑制剤の治療によって制御されていない拒絶が起こったときは
用いられる薬の用量を単に増やすという治療上の選択がある。例としては、Tリ
ンパ球を破壊する抗体(Tリンパ球の表面にあらわされた表面分子を認識するポ
リクローナル血清またはモノクローナル抗体(抗CD3、抗CD4))の使用が
ある。このような治療はすべてのTリンパ球、つまり移植の拒絶反応に対して反
応できるものと、他のすべてのTリンパ球の両方、を破壊し、それゆえ、特異性
も欠いており、対象(患者)における根本的な免疫抑制を誘発するように作用す
る。
【0006】 ある種の自己免疫型障害に対しては、自己骨髄移植(「BMT」)が新規な治
療上のアプローチとして現れている。そのような治療で重要なのは、骨髄移植の
前に、免疫系の破壊に導く状態にすることであり、そして、投薬を受けていない
Tリンパ球を用いて再構成する目的で、患者自身の造血細胞を使って、患者に移
植することである。しかしながら、それらのリンパ球は自家であるため、それら
は、その治療をするに到らせた免疫病理的過程に再び組み込まれるであろう。さ
らに、骨髄細胞からのTリンパ球の再構成は、大人においては低い効率の過程で
あるかもしれない。
【0007】 免疫病理的反応に加わらない、異なるリンパ球で患者を再構成することを目指
して、同種異系のBMTが、現在激しい自己免疫疾患のようなそれらの障害に対
して提案されている。しかしながら、同種骨髄移植は、その使用を制限する、G
VHによる高い死亡率で汚染されている。移植片対宿主反応(GVH)としても
知られるように、移植に必要な状態が、宿主の細胞に対する攻撃に対して反応で
きるものになるため、この造血細胞移植および免疫抑制された患者への再注入に
おいてTリンパ球が現れる。この反応は従来の免疫抑制剤の治療では制御が困難
なことがあり、致命的になることもありうる。
【0008】 慢性関節炎の患者に死亡率が10%以上の治療を提案することは、数年あるい
は数十年以上かかって明らかになるものであるにしても、正当ではない。
【0009】 病理的免疫反応の制御はこのように、今のところ、本質的にはそのような反応
を一時的に「凍結」するに過ぎない、非特異的免疫抑制剤の治療にとどまってい
る。その効果が臨床経験により広く証明されている、これらの治療法の重要性に
もかかわらず、より特異的な、そしてできれば永久的な免疫抑制を得ることを目
的とした他の治療上のモダリティーを開発することは重要なことである。
【0010】 本発明は、免疫反応を制御するための新規な治療学的アプローチを提供する。
さらに特定するなら、本発明はTリンパ球の免疫反応、なお特定するなら免疫病
理的なTリンパ球反応を調節するための新規な概念を提供する。本発明は、特に
特異性、安定性(持続性)および対象にとって安楽であることに関して、先行技
術に記述されているアプローチより数多くの利点を有する。
【0011】 さらに特定すると、第一の面において、本発明は、対象の免疫系を改変するた
めの、その対象のTリンパ球を置換することからなる方法を提供する。さらに特
定すると、この方法は、自家の、同系または同種異系の改変されたTリンパ球か
らなる組成物の投与に続いて、対象のTリンパ球(またはTリンパ球の副次集団
)を減少させる(幹細胞を含む、造血細胞を減少させることなしに)ことからな
る。
【0012】 さらに特定すると、この方法はTリンパ球により媒介される免疫病理的反応を
制御することを目的としている。
【0013】 さらに特異な面においては、本発明は、改変されたTリンパ球の集団によって
対象の全てまたは一部のTリンパ球を置換することを含む、Tリンパ球により誘
導される免疫病理的反応を制御するための方法をも提供する。
【0014】 本発明はまた、改変されたTリンパ球を含む組成物により対象の全てまたは一
部のTリンパ球を置換することを含む、Tリンパ球により引き起こされる障害の
治療法をも提供する。
【0015】 本発明はまた、そのTリンパ球の全てまたは一部を減少された対象に投与する
ための組成物を製造するためのTリンパ球の集団の使用にも関する。
【0016】 本発明はまた、そのレパートリー(repertoire)が改変されているTリンパ球
構成物(一定の抗原性特性が増強または減少された)の調製にも関する。
【0017】 本発明は、それゆえ、対象のTリンパ球を置換することに基づく、そして通常
、以下に「Tリンパ球交換」という表現で称される、新規な医療アプローチに関
するのである。
【0018】 本発明はTリンパ球ホメオスタシスの新規な概念に部分的に基づくものである
。特に、本発明は、大人では、Tリンパ球ホメオスタシスは本質的に成熟したT
リンパ球の集団の動きによって構成され、以前考えられていたように、胸腺を介
してのTリンパ球へ分化する、造血幹細胞の分化によるものではない、という考
えに基づいている。
【0019】 i)精製した未熟造血幹細胞(リンパ球中では減少し、CD34で精製される)
から産生される、骨髄移植後のT免疫新生(immunopoiesis)の再構築 ii)老化の機能としての骨髄移植後の免疫新生、そして最後に iii)HIV感染の進行中のTリンパ球のホメオスタシス のデータ収集が、この新規な概念を支持している。
【0020】 これらのデータはまた、マウスにおけるTリンパ球のホメオスタシスに関する
最新のデータにも結びつくものでもある。特に、生後3日より後に胸腺摘除され
たマウスは通常のTリンパ球数で普通に生きると記載されている。対照的に、生
後3日以前に胸腺摘除されたマウスはTリンパ球を発達させないが、もし、成熟
Tリンパ球を注射すると、これらは発達し、マウスは通常のTリンパ球数で普通
に生きる。
【0021】 本発明の原理は、このように、患者のTリンパ球の置換が、骨髄移植または造
血幹細胞(髄不全(条件付け)に先行される)を介して必ずしも起こるものでは
ないが、より侵襲のない方法、すなわち本願の主題である「Tリンパ球交換」に
より達成できる、ということを提示する点で特に独創的である。
【0022】 このように、先行技術に対する本願の最初の利点は免疫性の急速な再構築とい
うことにある。こうして本発明によれば、患者に注射されたTリンパ球は、造血
細胞の分化からのTリンパ球からの再構成よりもより急速な発達を可能にするも
のであり、注射されたものから生じるTリンパ球のプールによる、患者のTリン
パ球の完全な(あるいはほとんど完全な)置換で終結する。
【0023】 本発明は、特異性というその特徴において、先行技術に対しさらに重要な利点
を示す。すなわち、完全骨髄不全症に先行される、免疫抑制剤またはBMTを用
いた従来の技術に比較して、本願発明は: ・免疫病理的Tリンパ球に関して特異性を有する ・対象の免疫系の割合を改変するだけである。
【0024】 最後に、本発明は免疫病理的Tリンパ球のクローンを破壊することにも基づき
、すなわちクローンが積極的に除去されることについて安定性を有する。
【0025】 それゆえ、本発明は先行技術に対して数多くの利点を提供し、そして多くの用
途がある。
【0026】 下記の結果は成熟Tリンパ球による治療についての一般的原理の基礎を形作る
自立的なそして恒常的な、Tリンパ球を含む部分の存在を示唆し、該治療は、必
要であればちょうどよい時に相互に分離可能である、少なくとも3つの操作を含
む: 1)−自家移植の、同系または同種異系のTリンパ球の除去、免疫性を特徴とす
るTリンパ球を有するドナー、抗原性、年齢、またはそのような、レシピエント
に与えられるのが望ましいもの; −必要であれば、特別な性質とともに与えるための除去されたリンパ球の遺伝的
形質転換; −必要であれば、in vitroまたはex vivoにおける減少、増殖または変性、例え
ばイムノアフィニティ−による、特定の抗原性サブクラスにおけるこのリンパ球
の集団の改変(増殖、減少、変性……); 2)受け手側患者のTリンパ球の全てまたは一部の破壊; 3)患者自身の全てまたは一部のリンパ球を破壊した後の、該増殖、減少、形質
転換または非形質転換リンパ球の注射。
【0027】 おそらく遺伝的に形質転換されているか、1つ以上の望ましくないサブクラス
の減少により増加されている、提供者のリンパ球はすぐにでもレシピエントに投
与することができ、また、例えば特許出願PCT/FR9700385に記載さ
れた技術を用いて、凍結することもできる。
【0028】 凍結により、時を経ても完全に均一性を保っている生産物を用いることによる
長期治療ができるのである。
【0029】 全てまたは一部の患者のTリンパ球の破壊はこの方法の全ての適用において必
ずしも必要とされるものではない。
【0030】 このタイプの治療に対する応用は数多くあり、全ての障害または免疫系を含む
病理学的変化をまかなう。特に、このタイプの治療は自己免疫疾患、アレルギー
、アネルギー等のような免疫機能の老化に応用することができる。
【0031】 本発明は少なくとも2つの特異的特長を有する: ・患者のT細胞の全てまたは一部の置換; ・GVHおよび/または自己免疫疾患のような、以前から存在する障害および/
またはより一般的にみられる免疫反応の制御不全に対して反応性の病理学的クロ
ーンの全てまたは一部の破壊。この破壊は、望まれたときに、再注入された細胞
の活性化されたクローンを特異的に破壊する系により達成される。この破壊は、
以下に詳説する、当業者により選択されるいかなる方法を用いても達成すること
ができる。
【0032】 さらに特定すると、本発明の第一の側面は、Tリンパ球が減少した対象に投与
するための組成物を調製するための、Tリンパ球の集団の使用に関する。
【0033】 すなわち、本発明は最初にレシピエントのTリンパ球を減少させ、次にTリン
パ球の組成物を投与することに帰する。この「Tリンパ球交換」の概要的体系を
図1に示す。
【0034】 この図は用いられたTリンパ球集団が対象に関して自家の、同系または同種異
系のTリンパ球を含むものでありうることを示している。
【0035】 「自家」の用語は、それらが投与される対象に起源する細胞集団を意味する。
この意味において、減少が起こされる前にT細胞は対象から除去される。
【0036】 「同系」の用語は、投与される対象と全く同一の双子に起源する細胞集団を意
味する。
【0037】 「同種異系」の用語は、例えば人間の患者を治療する場合において他の人間の
ような、同じ種の(血族であるか否かを問わず)他の対象に起源する細胞集団を
意味する。
【0038】 Tリンパ球集団は当業者に既知の技術によって手に入れそして調製することが
できる。すなわち、リンパ球は対象の血液、リンパ組織等から従来の方法(血球
アフェレーシス、密度勾配、細胞選別等)を用いて単離することができ、または
保管バンクから手に入れることができる。対象から抜き取る際には、リンパ球は
好ましくは末梢単核性細胞(PBMC)または臍帯血から得る。臍帯血は興味深
いソースである。臍帯血からのTリンパ球は、高度に拡張された範囲を含むとい
う利点を有し、数多くの器官(division)を支持することができる。
【0039】 自家のTリンパ球集団の場合は、本発明の1つの特別に提供するところでは、
それらは対象自身(または、もし存在するのであればその真性の双子)からPB
MCまたは臍帯血からの血球アフェレーシスによって、抜き取ることができる。
【0040】 同種異系Tリンパ球集団については、本発明の1つの特別に提供するところで
は、いかなる異系のドナーからでも抜き取ることができ、好ましくは、レシピエ
ントの抗原を提示している細胞とドナーのTリンパ球の共同作用があるような、
レシピエントとのHLA相同性を示すものから抜き取ることができる。一定の特
別な状況では、Tリンパ球は、ある特別な特徴(例えば、感染物に対する証明さ
れた反応能力)により選択されたドナーから抜き取ることもできる。
【0041】 本発明のTリンパ球交換を実施するために、用いられるTリンパ球集団は、多
様化されたレパートリーのTリンパ球を含むことが好ましい。このことが、対象
における免疫性の急速な再構築を促進する。この点に関して、末梢血は、対象の
全成熟Tリンパ球の約2%を含んでいる。さらに、与えられた特異的な抗原に対
して、特異的なTリンパ球クローンの頻度はおよそ105個分の1細胞である。
すなわち、約108個の末梢血Tリンパ球には、約1000個の細胞からなる、
各々の抗原特異性を現すTリンパ球集団があることになる。
【0042】 十分な免疫的レパートリーを網羅するために、除去に当たり、106〜109
のオーダーで、好ましくはおよそ107〜109個の細胞で、Tリンパ球の量が得
られることが好ましい。そして、必要であれば、これらの細胞をin vitro(ex v
ivo)で培養し分化させることができる。好ましくは、投与に用いるTリンパ球
集団は107〜1012個のTリンパ球、さらに好ましくは、108〜1011個、有
利には109〜1010個のTリンパ球を含む。これらの量は、当業者によって適
用され得ると理解される。
【0043】 さらに、用いられるTリンパ球集団(T−Ly)は、一定の異なる性質(非T
−Ly)の細胞を含んでいてもよい。すなわち、有利には、Tリンパ球の集団は
少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも
95%のT−Lyを含んでいる。存在し得る他の細胞型は、例えばBリンパ球、
または他の血液細胞、一般的な造血細胞である。Tリンパ球集団の品質は当業者
に知られるいかなる技術を用いても、特には、異なる特異的抗原でラベルして、
そしてフローサイトメトリーまたは免疫検査(immunoscopy)を用いた解析によ
って、決定することができる。
【0044】 本発明において、用いられるリンパ球集団は、一般に対象の免疫特性を改善す
るように改変された集団である。T細胞に対する改変(単数または複数)は、様
々な性質のものでありうる。
【0045】 すなわち、例えば遺伝的または免疫的改変である。
【0046】 本発明の第一の特別な種類において、用いられるTリンパ球は遺伝的に改変され
たTリンパ球である。
【0047】 「遺伝的に改変された」という用語は、リンパ球が、自然状態では非改変リン
パ球には存在しない核酸、または非自然状態のリンパ球に存在する核酸(例えば
、人工的に増幅された配列)を含むことを意味する。この核酸は後に非相同核酸
と呼ばれる。
【0048】 さらに好適には、本発明で用いられる、遺伝的に改変されたリンパ球は、自殺
遺伝子を含む核酸を含む異種核酸を含む。より特定すると、本発明で用いる「自
殺遺伝子」の語は、毒性の産物、すなわち、いかなるメカニズムであれ、それを
含む細胞の破壊を誘発することができる産物(RNA、タンパク質等)をコード
するあらゆる核酸を意味する。好適には、条件付き毒性、すなわち、通常は不活
性な薬物を、その細胞にとって毒性の高い代謝産物に形質転換する能力のある産
物(例えばタンパク質)をコードする核酸である。このタイプの毒性においては
、遺伝的に改変された全ての細胞が自殺遺伝子を発現するが、細胞毒性は薬物の
投与によって厳しく制御される。
【0049】 特に好ましい手法においては、用いられる核酸(すなわち自殺遺伝子)は、分
裂細胞を特異的に標的とする毒性作用の核酸である。このタイプの核酸の例とし
てはチミジンキナーゼ(TK)がある。
【0050】 細胞の免疫反応を制御するために最も興味深い生物学的特性を有することがわ
かった、最も頻繁に用いられる自殺遺伝子は、1型Herpes simplex virus(HS
V1−TK)のチミジンキナーゼをコードする。細胞性チミジンキナーゼと対照
的に、この酵素はアシクロビル(ACV)またはガンシクロビル(GCV)のよ
うな異なったヌクレオシド類似物をリン酸化して、細胞性酵素によってジおよび
トリリン酸化合物に形質転換される単リン酸化誘導体能力を有する。これらのト
リリン酸化合物は、伸長反応の間に細胞性ポリメラーゼによってDNAに組み込
まれる。この組み込みは、それらの細胞の伸長の終結を誘導し、そしてアポトー
シスを開始する〔11−18〕。
【0051】 すなわち、HSV1−TKを発現している細胞を破壊するために要求されるG
CVの毒性用量は、その親細胞を破壊するために要求される量の少なくとも10
0分の1以下である(ACVではこの10倍)。この系ではGCVはACVより
もずっと効果的であるので、1日2回の潅流による投与を必要とするものの、こ
れは最も頻繁に用いられる薬である。DNA伸長をブロックすることによる細胞
死の導入は、分裂している細胞のみがGCVの作用を受けることを意味する;こ
れは実験的に確認されている。このように、HSV−1 TK遺伝子はガン〔5
,6〕および最近では病理的免疫反応の発生工程でのT−Lyの破壊〔1,2,
7−9〕に用いられている。
【0052】 すなわち、この系は、本発明について特に興味深い3つの特性を有している:
(i)T−Ly破壊の制御を中止し得る薬物(またはヌクレオシド類似物)の投
与に依存している条件付き毒性(ii)活性化されたT−Ly細胞の特性である、
分裂している細胞に限定された毒性、(iii)薬物の種々の投与計画を可能とす
る、使用の幅広い柔軟性。
【0053】 自殺遺伝子の原始型は、ガンシクロビルとともに機能するHSV1−TK遺伝
子である。IV型ヘルペスエキネ(equine)ウイルス由来のチミジンキナーゼのよ
うな他のチミジンキナーゼもまた用いることができる。それらは、ΔTK遺伝子
のような切形TK遺伝子、またはこれらのウイルス性酵素の特性を獲得するよう
に成熟したヒト起源の酵素であってもよい。
【0054】 この点に関して、多数のチームがHSV1−TK遺伝子の同種異系のBMTに
よる、白血病の間に再注入された成熟T−Ly細胞へのHSV1−TK遺伝子の
転移に基づく治療学的追跡を始めている〔27、28〕。これらの研究で知られ
るようになった最初の結果は、ガンシクロビル(GCV)での処理によってin v
ivoでこれらのT−Lyの活性を制御できるということを示している〔7〕。動物
およびヒトで行われた実験は、もし、注入されたT−LyがHSV1−TK遺伝
子を運び込んだ場合は、同種異系の骨髄移植後にGVHを制御することが可能で
あることを示している。しかしながら、提示された手術方法はレシピエントのす
べての造血細胞系を交換することを含むため、非常に厳しいものである。
【0055】 条件付き毒性物質をコードする核酸の使用が、本発明の特に好ましい施行であ
る。実際に、投与に用いられるリンパ球中におけるこのタイプの構造体の存在に
より、病理学的Tリンパ球を特異的な方法で制御することができるのである。す
なわち、自家Tリンパ球の場合は、自殺遺伝子の存在は病理学的免疫応答に組み
込まれたTリンパ球を破壊するため、すなわちこれらの障害に対して永続的方法
で反応し得るリンパ球クローンを排除するために用いられる。骨髄移植の場面で
用いられる同種異系のTリンパ球の場合は、自殺遺伝子の存在は移植片対宿主反
応に組み込まれるTリンパ球を破壊するため、すなわちこのタイプの障害が発達
するのを避けるために用いられる。
【0056】 すなわち、本発明のひとつの応用において、Tリンパ球の効果的な減少を経る
免疫病理的T反応に媒介される障害を有する患者(以下で説明する)は、Tリン
パ球で再構成される。これらのTリンパ球は、自殺遺伝子で変換された(すなわ
ち遺伝的に改変された)患者自身のTリンパ球であり得、改変された同種異系の
Tリンパ球でもあり得る。自身の成熟Tリンパ球が減少された対象に注入したT
リンパ球は急速に増殖し、in vivo増加を経ている成熟Tリンパ球のホメオスタ
シスの特性に従って、減少の以前の値を達成するその数になるように成熟Tリン
パ球のプールを再構築するまでに増加する。これに関して、対象中に残った希少
のT−Lyは、注入された細胞によって満たされているであろうT−Lyのため
のコンパートメントより少なく増殖することができる。
【0057】 病理的工程の間、対象は、用いられている自殺遺伝子によって毒物代謝系に導
入される薬物を用いて治療され、これが分裂しているTリンパ球、すなわち障害
に対して反応し得る、活性化Tリンパ球のみの好ましい排除へと導く。すなわち
、このTリンパ球交換およびそれに引き続く薬物存在下での治療は、対象のリン
パ球レパートリーの、in vivoでの、そして長期の(または永続的な)改変を可
能にするのである。
【0058】 本発明は、関連する障害の発達に含まれる抗原の事前の知識がない状態におい
ても行うことができるという利点を有する。
【0059】 本発明の、更なる応用例においては、用いられるTリンパ球集団は免疫学的に
改変されたTリンパ球を含む。さらに特定すると、この免疫学的改変は、該集団
のTリンパ球のレパートリーのin vivo(またはex vivo)での改変を含む。より
好ましくは、この免疫学的改変は病理的反応に含まれるリンパ球クローンおよび
/または特別な免疫学的特性のTリンパ球の副次的集団(sub-populations)(
CD4+またはCD8+、TH1またはTH2……)に含まれるTリンパ球クロ
ーンのin vitroまたはex vivoでの抑制を含む。
【0060】 好都合には、用いられるTリンパ球集団はすなわち、免疫学的レパートリー中
に「穴」を含んでいる。
【0061】 この手法は、免疫病理的クローンによって認識される抗原(単数または複数の
)が知られている状況に、特に適合する。この場合において、例えば該抗原また
はフラグメントまたはその類似物を用いたイムノアフィニティ-によってin vitr
oまたはex vivoにおけるTリンパ球集団の減少をさせることができる。そのよう
な減少は、例えば、Tリンパ球集団を、運搬して該抗原またはフラグメントまた
はその類似物が固定化された支持物に接触させることにより達成される。
【0062】 免疫病理に含まれる特異的抗原を認識するクローンもまた、自殺遺伝子がTリ
ンパ球に移送された後に、もしそれらが次にin vitroで抗原および定常的毒性(
GCV)による処理の存在下において刺激されるならば、減少されうる。遺伝子
改変がない場合は、これらの、in vitroで抗原によって活性化されるリンパ球の
クローンもまた、活性化Tリンパ球(II2受容体)により発現された分子を特
異的に認識する毒物に結合した抗体によって破壊されうる。
【0063】 この方法は、例えば、組織提供者(ドナー)の同種異系の抗原が含まれる、組
織移植のような障害の場合に適用することができる。
【0064】 このTリンパ球の免疫学的改変は自家または同系集団および同種異系の集団と
共に行うことができる。さらに、上記の遺伝的改変を伴うこともできる。
【0065】 すなわち、特別な方法においては、用いられるTリンパ球集団は改変された集
団を含む: ・免疫学的に、特別な免疫学的特性を有するTリンパ球(CD4+またはCD8
+、TH1またはTH2……)の特異的クローンおよび/または副次的集団によ
る、および、 ・遺伝的に、毒性産物をコードする核酸の導入による。
【0066】 本発明の更なる種類において、用いられるTリンパ球集団は、増幅された免疫
性を起こさせる同種異系のTリンパ球を含む。特に、感染性の物質に対して好ま
しい反応(発生されるか(pronounced)または増殖される)を示す、対象由来の
Tリンパ球を用いることができる。すなわち、T免疫反応は、遺伝的要素の幅広
い多様性によって部分的に制御されていることが知られている。この理由で、他
の対象がそうではないのに対し、ある抗原に対し適切な反応(有利な)を備える
ことができる対象がいる。本発明のとおり、すなわち障害に対して感受性の対象
のTリンパ球を、非感受性の対象のTリンパ球と交換することが可能なのである
【0067】 この方法においては、Tリンパ球は免疫学的に改変されていなくてもよい。と
はいえ、いかなる移植片対宿主反応の制御を可能にするにも、上述したようにT
リンパ球は遺伝的に改変されていることが望ましい。
【0068】 さらに、本発明の特別な方法においては、遺伝的に改変されたおよび/または
免疫学的に改変されたおよび/または改善された免疫性を獲得した、さらに、治
療学的産物をコードする核酸を含んだ、上記のTリンパ球の集団を用いることが
できる。本発明のとおり、用いられるTリンパ球に新規な特性を与えることもで
きる。Tリンパ球は容易に排除でき、単離できそして培養できる細胞であるので
、対象において欠損しているまたは異常なタンパク質または機能を導入(再導入
)するためのソースとして簡単に用いることができる。
【0069】 当業者が利用できる技術を用いて、数多くの手法を、Tリンパ球を遺伝的に改
変するために用いることができる。
【0070】 本発明の特別な方法の1つにおいては、リンパ球はウイルスベクターを用いて
遺伝的に改変される。この方法においては、例えば非相同核酸がウイルスベクタ
ーに導入され、続いて上述したとおり、Tリンパ球の集団を感染させるために用
いられる。
【0071】 異なる種々のウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターまたはAAVを
用いることができる。好ましい方法においては、リンパ球はレトロウイルスベク
ターを用いて遺伝的に改変される。
【0072】 レトロウイルスは、レトロウイルス感染が、細胞へのゲノムの安定して組み込
める結果となることから、Tリンパ球における遺伝子転移のために精選されたベ
クターである。これは非常に重要な特性である、なぜなら対象中への注入の後、
in vitroまたはin vivoでのリンパ球の展開(expansion)は、各々の細胞分裂に
転移されるために、導入遺伝子が分離の間非常に安定であることを必要とするか
らである。示すことができるレトロウイルスの型の例は、オンコウイルスファミ
リー、レンチウイルスまたはスプーマウイルスファミリーからのレトロウイルス
である。オンコウイルスファミリーの例としては、特に、遅発性(slow)オンコ
ウイルス、MoMLV、ALV、BLVまたはMMTVのような非ガン遺伝子担
体、そしてRSVのような急性(fast)オンコウイルスがある。レンチウイルス
ファミリーの例としては、HIV、SIV、FIV、またはCAEVがある。
【0073】 不完全組換えレトロウイルスを構築する技術は広く文献に記載されている(W
O89/07150、WO90/02806、WO94/19478)。
【0074】 本発明の特別な方法においては、有利にはGALVウイルスエンベロープを有
する組換えレトロウイルス(GALVでpseudo型にされたレトロウイルス)が用
いられる。レトロウイルスのエンベロープがGibbon Ape Leukemia Virus(GALV
)として知られるレトロウイルスに由来する場合に、組換えレトロウイルスによ
る造血細胞の感染が、より効果的であることが示されている(Movassagh et al.
,Hum. Gene Ther.9 (1998) 225)。このレトロウイルスエンベロープを用いて、
我々は形質導入細胞のいかなる選択もしていない成熟Tリンパ球において、95
%以上の形質導入率を得ることが可能であることを示した(未公開結果)。
【0075】 さらに、用いられた組換えウイルスは一定のTリンパ球副次的集団に特異的な
発現制御配列(プロモーター)を含むことができる。すなわち、一定の状況にお
いて、それらの分離を可能にするため、CD4+もしくはCD8+のような一定
のTリンパ球集団の核酸または、マウスにおいて最近記述された、細胞における
Th1もしくはTh2特異的マーカーのみを発現することが望ましい。これらの
細胞は、それらが産生するサイトカインの型によって特徴付けられるため(例え
ばTh1に対するIL2またはIFNg、Th2に対するIL4)、これらの異
なる遺伝子の制御配列を非相同核酸(特に自殺遺伝子)の発現制御に用いること
ができる。CD4分子をコードするプロモーターのように、ひとつの、またはほ
かのTリンパ球集団において特異的発現を制御しているプロモーターを用いるこ
ともできる。
【0076】 本発明のさらに特別な方法においては、リンパ球が切形のPol遺伝子を含む
パッケージング系統で産生されるレトロウイルスを用いて遺伝的に改変されてい
る。
【0077】 遺伝子転移にウイルスベクターを用いることに関連する危険性のひとつは、複
製ウイルスの生産の可能性である。分離されたゲノム系統として知られる系統を
用いることでこの現象を限定することができる。組換えという事象を最小限にな
るように特異的に設計した構築物を用いることで、さらにそれを少なくすること
ができる。例えば、我々は、Moloney ecotropeレトロウイルスゲノム(PNCA
)のゲノム上のSmaI酵素切断部位に対するPol遺伝子の3’末端の切形は
、Pol遺伝子とMoloneyウイルスエンベロープをコードする遺伝子にまたがる
配列全てが抑制されている間にもポリメラーゼ機能を完全に保持することができ
る。すなわち、Tリンパ球形質導入のための組換えレトロウイルスを産生するた
めの、このタイプの構築物の使用は安全性に関しての改善である。
【0078】 当業者に既知のいかなる技術(レトロウイルスの上澄と一緒にインキュベート
すること、Tリンパ球−レトロウイルスパッケージ細胞同時培養、トランスウエ
ル技術等)を用いても、レトロウイルスベクターを用いてTリンパ球を感染させ
ることができる。おそらく繰り返される遠心分離工程を含む、ひとつの特に効果
的な方法がMovassagh et al.(上記参照)により記述されている。この方法は本
発明のTリンパ球の遺伝的改変を有利に行うことができる。
【0079】 本発明の最も優れた方法は、Tリンパ球への遺伝子転移ができるだけ効果的で
ある方法である。すなわち、少なくとも50%、好ましくは少なくとも65%、
さらに好ましくは少なくとも80%の遺伝的に改変されたTリンパ球を含むTリ
ンパ球集団を用いることが好ましい。理想的な方法では、できる限り遺伝的な改
変の程度が100%近くになるようなTリンパ球集団が用いられる。
【0080】 上述したとおり、そのようなレベルはin vivoまたはin vitroで、例えばGA
LVエンベロープを用いて、そして必要であれば一定の感染状況下において得る
ことができる(Movassagh et al.,上記)。さらに、遺伝的改変がin vitroで行
われる場合は、効果的に感染した細胞を選択することにより、形質導入レベルを
改善することもまた可能である。最後に、当業者において異なった選択技術が利
用可能であり、すなわち抵抗性遺伝子(ネオマイシンおよび薬物G418に対し
て抵抗性の遺伝子のような)または導入遺伝子(すなわちチミジンキナーゼ)を
発現していない細胞には毒性である化合物、の利用である。これに関して、HS
V1−TK遺伝子を有する細胞に対しては、唯一の毒性のない分子を用いること
ができる。
【0081】 この分子を見つける方法は、毒性の知られている分子のライブラリで標的を生
産し、1)HSV1−TK酵素により改変されたものであるかおよび2)その代
謝産物が、もはや毒性ではないかを試験することである。このような方法の利点
は、もはや第2の遺伝子を転移する必要がなく、選択は、望ましくない細胞のみ
に働くことである。
【0082】 好ましくは、選択は、レトロウイルスに導入されて、膜タンパク質を発現する
マーカー遺伝子を用いて行われる。このタンパク質の存在はマグネチックビーズ
による分離、カラム、またはフラックス(flux)サイトメトリーのような、従来
の分離技術を用いる選択を許すものである。ここで、ヒトThy1分子をコード
するような遺伝子が好都合である。成熟T−LyはCD34分子のような分子の
使用もまた、すでに存在する、この分子をその表面に有する細胞を選択する系と
して考えられ、そのような系はセルソーティングのためにすでに有効であり、臨
床的研究で用いられている。さらに、そのようなマーカーにはc−mycタグの
ようなタグをも含めることができる。
【0083】 膜発現マーカー遺伝子の使用は、本発明の構成において、2つの付加的な有利
性を有する:(i)遺伝的に改変されたTリンパ球細胞を、それらが注入された
場合に、容易にモニターできる、そしてとりわけ、(ii)(分裂がない場合にお
いても)その分子に対する特異的な抗体の働きによって、それらを破壊すること
を可能にする(必要であれば)。
【0084】 有利には、(Thy−1のような)マーカー遺伝子の発現をするために、毒性
の遺伝子(例えばHSV1−TK)およびマーカー遺伝子(例えばThy1)が
IRES配列によって分離されている場合には、好ましくは2シストロン性のベ
クターが用いられる。
【0085】 必要であれば遺伝的に改変され、および/または免疫的に改変されおよび/ま
たは免疫性を改善した、得られたTリンパ球集団はいかなる好ましい媒体または
器具に梱包することも可能である。すなわち、好ましい媒体は全ての哺乳類の細
胞培養培地(RPMI、DMEM等)または哺乳類細胞の他の保存および/また
は保管用に好ましい溶液(塩溶液、緩衝液等)である。用いる器具は例えばチュ
ーブ、フラスコ、皿、アンプル、シリンジ、袋等であり、滅菌状態が治療用途に
は好ましい。即時的には、引き続きの使用の観点で、細胞組織を用いまたは保存
(例えば冷蔵保存、冷凍、冷凍乾燥)することができる。さらに、下記に示すと
おり、上述した調製および保管状態下での、そのような細胞のバンクがつくられ
ることが好ましい。
【0086】 上述したように、本発明は、対象のTリンパ球の交換からなり、すなわち、成
熟Tリンパ球を自身のTリンパ球を減少した状態の対象に投与することを含む。
【0087】 投与に先立ち、対象はすなわち、存在している対象のTリンパ球が減少される
工程を経る。もちろん、用いられるTリンパ球の集団が自家Tリンパ球集団であ
る場合には、この集団は減少に先立って調製される。
【0088】 減少は、種々の方法で行うことができる。すなわち、骨髄移植を伴う場合には
減少は放射線療法を含む条件付けにより影響されうる。
【0089】 しかしながら、減少はより好ましくは一種類以上の免疫抑制剤、特に特異的T
リンパ球免疫抑制剤の存在下において対象を治療することによって行われる。そ
の理由は、Tリンパ球免疫抑制にもかかわらず、対象は骨髄の全体的不全を経る
わけではなく、一定の免疫性を保持しているからである。
【0090】 好ましくは、用いられる免疫抑制剤は「抗リンパ球血清」か、または、Tリン
パ球膜表面分子に特異的な、さらなるモノクローナル抗体である。特に、抗CD
3、CD4、および/またはCD8抗体を用いることができる。このタイプの免
疫抑制剤(血清または減少抗体)は治療学的にすでに用いられている。すなわち
、マウスおよびヒトで行われた実験は、これらの処理によって、動物または患者
の成熟Tリンパ球を非常に効果的に減少することができることを示している(Mu
ler et al., Transplantation 64 (1997) 1432; Caillat-Zucman wt al., Trans
plantation 49 (1990) 156)。
【0091】 成熟Tリンパ球の減少は、本発明のTリンパ球交換を効果的なものとするため
には完全でなくてもよい。すなわち、たとえ一定の割合でTリンパ球が存在して
いたとしても、それらが免疫病理を再誘発するのに十分であるとは考えられない
。一般的に、上記の免疫抑制剤による処理が、本発明の目的に非常に好ましいと
ころの、90%以上、通常は95%以上の減少に導くのである。
【0092】 Tリンパ球の構成物は種々の手法および種々のプロトコルにより投与すること
ができる。注入されるTリンパ球の自己攻撃(turn attack)にあわないように
、患者自身のTリンパ球を破壊する目的で施された治療が排除されたのと同じ日
にTリンパ球を投与するのが好ましい。
【0093】 好ましくは、成熟注入Tリンパ球(通常、成熟Tリンパ球の〔穴〕を埋める傾
向がある)の展開を促進するように、構成物は減少から短時間(例えば48時間
以内)のうちに投与される。さらに、必要であれば、同じ細胞で、または異なる
ドナーからの細胞で同じ治療学的系統に従って、治療を繰り返すこともできる。
【0094】 上記で示したように、普通、投与量は通常1対象あたり108個から1011
のTリンパ球である。
【0095】 さらに、Tリンパ球集団を調製するための上記手順において、患者の細胞(普
通の、または自殺遺伝子を形質導入した)を保存しておくこともでき、それは必
要であれば使うことができる(図1におけるストック1および2)。例として、
望ましくない影響が現れたら、再注入した細胞(例えば同種異系の細胞)を減少
させ、次に(普通の)患者の細胞を再注入することも可能である。
【0096】 同じように、同種異系の交換の場合には、ドナー細胞(形質導入されたまたは
普通の)もまた必要であれば引き続きの使用のために保存することができる(図
1においてストック3および4)受け取った形質導入された同種異系のTリンパ
球を有する、GVHが制御されている患者であるならば、同じドナーからGVH
が起こることなく、普通のリンパ球を注入することができる(耐性活性)。この
理由で、本発明の方法は、形質導入されたか、またはされていない、ドナーおよ
びレシピエントのT細胞のバンクの設立への工程を含む。
【0097】 上記の構成物の投与に続いて、毒性の産物へと代謝される薬物の投与によって
か(毒性遺伝子により遺伝的に改変されたTリンパ球の場合)、または単純に対
象中に改善された免疫性を構成することにより、本発明は制御される免疫病理の
出現または発達を可能にする。
【0098】 本発明は 特に免疫病理的反応を制御するために分離した使用のためか、あるいは時間を置
いた使用のための、 ・1つ以上の免疫抑制剤;および ・上記定義されたTリンパ球集団を含む構成物; を含む産物にもまた帰するものである。
【0099】 好ましくは、構成物はTリンパ球の多様なレパートリーを含む。
【0100】 好都合には、構成物は自殺遺伝子を含むTリンパ球の集団を含み、本発明の産
物はさらに、自殺遺伝子によって毒性代謝物に変化させられる薬物を含む。
【0101】 本発明はまた、 ・Tリンパ球を対象から除去;および ・それらのリンパ球のレパートリーに穴を設けること、より一般的には、レパー
トリーの選択的改変 を含む、改変されたTリンパ球の構成物の調製法にも関する。
【0102】 さらに特定すると、レパートリー中の穴は、障害に含まれる抗原中の特異的T
リンパ球を減少することにより設けられる。
【0103】 本発明は、対象から除去され、1つ以上の障害に含まれる1つ以上の抗原の特
異的リンパ球クローン中において減少された、いかなるTリンパ球集団にも関す
る。
【0104】 さらに、本発明は他のいかなるタイプのコンパートメント細胞、すなわち以下
の特徴を有する細胞: ・除去され得るものであり、集団の全体が破壊され得る、そして(改変を伴って
)(再)注入され得るものであり、破壊されている細胞と交換される; ・Tリンパ球の副次的集団または予想されうる他の、例えば循環細胞サテライト
(satellite)筋肉細胞。
【0105】 本発明は、多くの応用を有する。特にそれらは、本発明の自家または同種異系
の改変されたTリンパ球、全ての自己免疫疾患および広い意味における慢性炎症
障害(リューマチ性関節炎、多重性硬化症等)、ウイルス感染(A型、B型、C
型肝炎、HIV等)に関する。Tリンパ球置換もまた、組織移植または細胞移植
(同種異系または外因性の)ならびに例えば治療力のあるタンパク質を分泌させ
るために、改変したTリンパ球の再注入が望ましいであろう全ての障害に関する
【0106】 このシステムはまた、有利には、例えば、タンパク質の遺伝的欠陥を修正する
ための、投与された治療力のあるタンパク質に対する免疫反応を制御することが
できるように用いられる。この状況の欠点の1つは、遺伝的相違により、患者は
このタンパク質を非自己と認識し、免疫応答によって拒絶することである。本発
明の原理によれば、もしTリンパ球が自殺遺伝子を発現するなら、この有害な免
疫応答を制御することができる。
【0107】 すなわち、全身性障害(例:狼瘡、紅斑、リューマチ性関節炎、多発性筋炎等
)として知られる自己免疫疾患は、患者で行われた生物学的および組織学的研究
によって示されたような免疫的構成物を明らかに有する。これらの障害の多くに
ついて、その原動力は知られておらず、障害の起源は多因性であることがわかっ
た。しかしながら、主要な要素は好ましくない免疫応答にある。
【0108】 さらに、これらの障害において、障害に反応可能なTリンパ球が活性化され、
そして分割する期間を決定することは一般的に可能である。この理由で、この時
期に薬物前駆体の投与は、本発明によれば、原理的にこれらの細胞に作用する。
さらに、この戦略は障害に対して反応する細胞クローンの減少という結果となり
、すなわち、中心的なTリンパ球産生を欠いて、原理的に長時間続くまたは永久
的な免疫抑制という結果になる。
【0109】 例として、本発明の特別な手法においては、患者自身のTリンパ球を減少した
後、リューマチ性関節炎に悩む患者が、自殺遺伝子を発現するように遺伝的に改
変された患者自身のTリンパ球(自家組成物)、同種異系の、改変されたまたは
非改変のTリンパ球を含む組成物の投与を受ける。その後、投与後にリューマチ
性関節炎が起こる期間に、自殺遺伝子によって毒性の代謝物に形質転換される薬
物で処理することにより、反応性クローンを破壊し、すなわち免疫病理的反応を
抑制することができる。
【0110】 本発明はウイルス誘発性免疫病理の治療にも用いることができる。感染物質に
対する免疫応答はしばしば、死にも導き得ることにもなる免疫病理的結果を有す
る。最も共通の例は、肝炎に反応し得るある種のウイルスに対する応答である。
これらのウイルスは、肝細胞で増幅し、免疫系の働きによる感染した肝細胞の破
壊が肝炎となり、時には死を招く。他の状況においては、宿主の免疫応答はウイ
ルスを根絶することができなくなり、対照的にクローン化した肝細胞の維持に参
加する。
【0111】 このことは、C型肝炎の進化によって良く説明される。約3分の2の患者は自
身からウイルスを取り除くことができるが、残りの3分の1はクローン化した肝
炎を発展させる。このクローン化した肝炎の進化は、ウイルスの増幅率から独立
しており、対照的に、異常免疫応答を示す生物学的信号(例えば抗DNA抗体ま
たはクリオグロブリン血症の頻発)にともなって起こる。本発明は、免疫病理に
反応し得る活性Tリンパ球クローンを排除することができ、すなわち、宿主への
注入に引き続く結果を減少させることができる。
【0112】 さらに、所定のアレルギーに含まれるIgE生合成もまた、Tリンパ球の制御
下にある。Bリンパ球は未成熟骨髄細胞から産生され、これらの細胞の半減期は
Tリンパ球よりも短い。このため、本発明のTリンパ球交換技術を用いてアレル
ギー反応を制御することができ、より一般的には、T応答を制御することで抗体
反応を制御することができる。
【0113】 本発明は組織移植拒絶反応を治療しまたは防ぐことに用いることもできる。
【0114】 組織障害の所定の数に対する従来の治療は、それが必要となった場合は、死亡
したドナー(所定の場合は生きているドナーからの、または他の種からの)から
得られた健康な組織とその組織の交換である。組織提供者を選ぶに際しては組織
適合性抗体との一対一の最大適合性により厳格な注意が払われているが、組織移
植は、通常その組織によって特異的に発現された抗原に対する免疫応答の発展へ
に至らしめる。
【0115】 免疫抑制治療が行われるにもかかわらず、この応答はしばしば移植された組織の
拒絶反応に終わる(これが同種異系の移植の失敗の基本原理である)。本質的に
体液の反応を含む、ある種の非常に激しいまたは激しい拒絶反応を別として、大
部分の場合は組織移植拒絶反応は本質的にTリンパ球に媒介される。
【0116】 数多くのチームが同種異系のまたは外因性の、改変されたまたは非改変の細胞
移植に対する構想を開発してきたが、その中でそれらは治療学的目的と共に一つ
の要素を作る(膵臓のβ島からの細胞、線維症等)。とりわけ、糖尿病、パーキ
ンソン病、または組織における遺伝子治療と同じくらい基本的な障害において提
唱されてきた。そのような移植で根本的な障害は、それらの同種異系または異種
の細胞に対する拒絶反応にある。
【0117】 この欠点を克服するため、移植された細胞を免疫系から分離するために非常に
多くの装置が提案されてきた。それらのシステムはマイクロカプセル化から、多
孔性材料または半透過性材料等への細胞の注入まで、多岐に渡る。残念ながら、
それらのシステムで臨床的に用いることができるほど十分に効果的であることが
証明されたものはない。
【0118】 別の患者が免疫的健康状態がよいので、いかなる問題が起こった場合でも患者
のリンパ球のストックを保存する一方で標準的なTリンパ球交換を計画すること
は非常に有効である。
【0119】 本発明はさらに、、組織または細胞移植の成功を促進する新しい医療アプロー
チを提供する。特に、Tリンパ球交換は、同種反応性Tリンパ球の選択的破壊に
よって、必要であれば、制御されることになる、移植に対するいかなる免疫応答
のいかなる発達も可能とするような受け入れ対象において実施されている。組織
または細胞移植の状況において、組織または細胞と、同じドナーに由来する同種
異系のTリンパ球(移植された組織または細胞を受け付ける)をレシピエントに
再移植するか、同種異系のドナーからの組織または細胞を移植して、その組織ま
たは細胞に対する反応を制御するため、患者に、患者自身の遺伝的に改変された
Tリンパ球を再移植することにより、これらの治療法を応用することができる。
最後に、二人の異なるドナーに由来する組織または細胞および同種異系のTリン
パ球の移植を計画することもできる。
【0120】 本発明の特に有利な方法は、組織または細胞の移植の状況における免疫病理の
治療にある。さらに特定すると、治療は、移植不全に反応し得るTリンパ球に媒
介される免疫病理の全体または部分的な予防、縮小または抑制を意味する。
【0121】 同じように、本発明は、移植片対宿主病(GVHD)の治療(例えば予防、縮
小または完全な抑制)に用いることができる。骨髄移植は大多数の臨床現場、特
に多くの白血病のおける従来の治療である。すなわち、従来の治療は腫瘍細胞の
最大数を排除するとの目的で、ドナーを調整することにあり、骨髄移植を必要と
する髄形成不全を作り出す結果となる。この骨髄移植は、治療した白血病の再発
の回数を有意に制限する、「移植片対白血病」として知られる影響に反応し得る
ことが示されている、同種異系細胞を用いて行われる。残念ながら、同種異系の
Tリンパ球は、通常危険であり、時には死に到る移植対宿主病にもまた反応し得
る。本発明の使用により、GVHに反応し得るTリンパ球を破壊することができ
るようになり、すなわち、この免疫病理が治療できるものとなる。
【0122】 Tリンパ球の置換により治療されるであろう障害の他の特別な例は、HIV感
染または所定の遺伝的疾病である。
【0123】 すなわち、Tリンパ球はHIV感染の原始的な標的であるので、その臨床的展
開は、感染した患者におけるそれらのリンパ球数の大幅な増加に依存している。
HIV感染の治療学的戦略は、ウイルスに抵抗するように遺伝的に改変されたT
リンパ球を転移することに見出された。しかしながら、ウイルスの複製サイクル
に含まれるタンパク質をコードする遺伝子の自然発生的な突然変異のため、その
Tリンパ球がHIVの感染に対して感受性が低い患者が存在する。
【0124】 すなわち、肝炎ウイルスに対する応答については、HIVの感染に多かれ少な
かれ感受性にさせるようなTリンパ球によって発現される、遺伝的差異がある。
本発明は、遺伝的要素の幅広い多様性を利用できるようにする、特に、与えられ
た障害に対して感受性の対象のTリンパ球を、非感受性の対象からのTリンパ球
と交換することによる。
【0125】 タンパク質を生合成する能力のないことと結びつけられ、もしそれが所定の特
異的な細胞型(Tリンパ球でなくてもよい)により合成されるにしても、一般的
な反応を有する、多数の遺伝的疾病が存在する。すなわちこれらの障害はしばし
ば、適合性のドナーを見つけることができる場合は、骨髄移植で治療され得る。
これらの同じ障害はTリンパ球転移(ムコポリ多糖類等)で治療することができ
る。
【0126】 リンパ球に特異的に影響する遺伝病(アデノシンデアミナーゼ欠損症等)もま
た存在し、それもまた、本発明の標準的なTリンパ球交換によって治療され得る
。最後に、考えられるX線照射事故または他のいかなる激烈な髄機能不全(例え
ば、毒性、薬物誘発等)もまた、本発明のTリンパ球交換で治療することができ
る。すなわち、Tリンパ球のみ免疫病理反応を制御され得るように遺伝的改変を
受ける、同じドナーに由来する造血幹細胞バンクおよびTリンパ球バンクも設立
できる。すなわち、要求されたときに、成熟Tリンパ球をともなう骨髄移植の実
施を可能にする「ユニバーサルバンク」も利用可能となろう。
【0127】 本発明の更なる態様においては、ドナーのTリンパ球集団もまた、アネルギー
のような免疫機能の老化の予防または治療に用いることができる。
【0128】 ここで、以下の、説明的であり、非限定的であると考えられなければならない
実施例によって本発明をさらに詳細に記載する。
【0129】 実施例 1.免疫病理的応答の調節の研究 自殺遺伝子を用いた病理的免疫応答の制御の可能性を研究するため、T−Ly
でHSV1−TKを発現するトランスジェニックマウスを開発した。この発現は
、未成熟CD4−、CD8−またはCD4+CD8+胸腺細胞の排除のために、
CD4+およびCD8+の成熟T細胞において、我々が以前に導入遺伝子の特異
的な発現に導くことを示したCD4分子をコードする遺伝子に由来する調節配列
を用いて得られる〔26〕。In vitroでは、これらのトランスジェニックマウス
のT−LyはGCVによって効果的に破壊される(図2)
【0130】 2.以降の全ての実施例において、トランスジェニックマウスから得られるT
リンパ球は、実験手順の簡略化によって、唯一のものである。同一の実験を、同
じ自殺遺伝子が本発明の手法に従ってレトロウイルスベクターによって転移され
得る、マウスまたはヒトのTリンパ球を用いて再現することができる。
【0131】 1.1 マウスにおけるGVHの制御 HSV1−TK遺伝子をTリンパ球において発現するトランスジェニックマウ
スを用いて、我々は、これらの動物における移植片対宿主反応に反応し得る同種
異系の反応を完全に制御することができることを示した。すなわち、我々はGV
Hに反応し得るTリンパ球を制御するための性能の原理を証明した。この治療学
的有効性はガンシクロビルによる非常に短時間の治療により得ることができるこ
とと、これらの治療の最後に障害が予防されていただけでなく、そのマウスが通
常の免疫応答を有していたことに触れておくべきであろう。
【0132】 我々は、これらのT−Ly HSV1−TKドナーとしてのトランスジェニッ
クマウスを、同種異系骨髄移植(BMT)後の移植片対宿主病(GVH)のモデ
ルを構築するために用いた。すなわち、致死量のX線照射マウスにおいて、成熟
T−Ly中で減少した同種異系のBMTは全ての動物の個体における生存および
ドナー細胞による完全な造血細胞の再構築という結果になった。対照的に、T−
Lyによって補足された移植は、臨床的にも組織学的にもGVHの兆候を見せた
動物の死亡率が100%であるという結果になった。このモデルにおいて、もし
、T−LyがHSV1−TK自殺遺伝子を発現するなら、移植の日から実施され
、7日間続けられたGCVによる治療は、臨床的なGVHを防いだことを示した
(図3)。これらの動物が犠牲になったとき、組織学的解析により、これらの動
物にはGVHの組織学的兆候が見られないことが明らかになった。この治療は明
らかにされたGVHにおいても有効であった。
【0133】 これらの動物に存在する造血細胞由来の細胞は、ドナーに由来する。おもしろ
いことに、GCVによる治療を生き抜いたT−Lyは、常にマイトジェンまたは
第3の同種抗原による刺激にin vitroで反応する能力があるが、ドナーおよびレ
シピエント由来の細胞によるものには反応しないことを我々は観察した。これら
の結果は、GCVによる治療が同種反応性T−Lyクローンを排除するが、他の
抗原刺激に対して反応する能力のあるT−Lyコンパートメントを保存すること
ができることを示している。
【0134】 1.2.Tリンパ球交換による、糖尿病マウス(NOD)における自己免疫糖尿
病の治療 本実験の目的は、糖尿病的自己免疫NODマウスのモデルによって現される自
然発生的自己免疫疾患(AID)の制御での、遺伝的に改変されたTリンパ球の
交換の効果を証明することである。Tリンパ球交換は臨床的に予想される状態下
で行われた。Tリンパ球交換は、いかなる残りの自己免疫細胞も破壊しうるレシ
ピエントに対して同種異系のTリンパ球を用いて行われた。Tリンパ球交換は、
遺伝的に改変された、TK自殺遺伝子を発現しているTリンパ球によって行われ
た。このモデルにおいて、GVH制御は、ガンシクロビル(GCV)での治療と
共同した、遺伝的に改変された、TK遺伝子を発現しているTリンパ球の使用に
存在する。このシステムはTK Tリンパ球が破壊されるのを可能として、GV
Hを制御する。
【0135】 Tリンパ球交換は、マウスを、そのようなマウスにおいてD120で100%
生存する結果となる8−9GyのX線照射によって非腫瘍性除去調整した後に行
われた。Tリンパ球交換は、107個の細胞を、ガンシクロビルによる7日間の
予防治療をして、移植と同時に初期化されたマウスのレトロ−オービタルな副鼻
腔洞に注射して行った。最初のコントロールグループは、同種異系の骨髄の細胞
107個を受けたが、Tリンパ球は受けていないマウスによって構成される。こ
れらのマウスにおいては、移植物は部分的にまたは完全に拒絶され、そしてAI
Dが再発し得る。2番目のコントロールグループはNODマウスに由来する10 7 個の骨髄細胞を受けたが、Tリンパ球は受けていないマウスによって構成され
る。
【0136】 この手法の有効性は、以下により評価される: ・ドナー由来のMHC分子を発現することを特徴とする、遺伝的に改変されたT
リンパ球の存在の解析; ・自己免疫糖尿病の臨床的兆候の決定(2g/lより多いグリセミア); ・ランゲルハンス島上のリンパ球浸潤物の存在。
【0137】 ・CSMNSP起源
【0138】
【表1】
【0139】 移植180日後、造血細胞再構築を、CSMNSPをモノクローナルAcで標
識した後、フローサイトメトリーで評価した。ドナー起源のBおよびT細胞は、
クラスIのMHC分子(H−2q)の発現によって決定した。レシピエントのB
およびT細胞はクラスIIのMHC分子(J−Ak)の発現によって決定した。
【0140】 Tリンパ球交換が行われたNODマウスにおいては、ドナー起源の細胞のみが
存在した。 ・Tリンパ球交換後のリンパ球浸潤物の存在
【0141】
【表2】
【0142】 移植後180日後に膵臓を取り出し、Bouinの溶液で固定し、パラフィン中に
静置した。リンパ球浸潤物の存在はヘマトキシリンおよびエオシンによる標識後
4ミクロンスライスで評価した。
【0143】 Tリンパ球交換を施したマウスからのいかなる膵臓にもリンパ球浸潤物は観察
されなかった。
【0144】 さらに、マウスは血糖正常を保ち、すなわち糖尿病の不存在を証明した。
【0145】 結論として、レシピエントマウスは同種異系のTリンパ球によって再構築され
、もはや自己免疫疾患を発現することはなかった。
【0146】 1.3.ウイルス誘発疾患の制御 我々は同じシステムをウイルスにより誘発される免疫病理反応を制御するため
に適用することを望んだ。最も型にはまった実験系はCMLウイルスによってマ
ウスに誘発される脳障害の制御であった。
【0147】 CMLウイルスに対する免疫応答は非常に良く知られている。すなわち、この
ウイルスに脳内感染した動物は、すばやく致命的に細胞障害性Tリンパ球により
媒介される、脳への攻撃から非常に急速に死亡する。先行免疫を受けた動物にお
いては、感作化されたTリンパ球の反応動作が早められ、マウスの保護および生
存へと導く。脳内注射と同時にガンシクロビルを受けた動物においては、細胞障
害性Tリンパ球はウイルス複製によって活性化され、脳攻撃の制御という結果に
なる(図4)。
【0148】 我々は次に、マウスを使って組織移植拒絶反応に反応可能な免疫応答の制御を
試みた。使用したモデルは最も生理的であると考えられるものである。マウスに
おいて異所の位置への血管化心臓移植である。この同種移植は未処理のマウスに
施され、移植から数日のうちに必然的に拒絶反応が起こった。マウスがガンシク
ロビルで非常に短期間(移植から7日間)処理された場合は、心臓は永続的に受
け入れられ、その必須の機能を保持していたことがその鼓動により証明された。
【0149】 2.自己免疫疾患に適用されたTリンパ球交換の治療的プロトコル 本治療は、Tリンパ球の除去に始まる。この除去は例えば、「抗リンパ球血清
」(患者のウサギで通常産生される補体、例えばMerieux研究所による、の存在
下においてTリンパ球を認識して破壊する免疫グロブリン)の投与と結合して行
うことができる。投与されたALSの量および投与期間は治療学的バッチの臨床
データおよび製造者の推奨に依存した。この治療はシクロフォスファミドやシク
ロスポリンのような他の免疫抑制剤の投与と同時に行うことができる。最後に、
これらの治療に対して、より抵抗性の組織Tリンパ球を攻撃するために、患者の
骨髄を保護する一方で、X線照射を加えることができる。
【0150】 この治療の最後に、Tリンパ球欠失は、抹消血を従来のカウンティングによっ
て解析することができる。好ましくは抹消血の90%以上のリンパ球が欠失して
いる。
【0151】 この治療の最後に、Tリンパ球の静脈注射が、好ましくは109〜1011個の
細胞の範囲の投与量で患者になされる。この場合において、Tリンパ球は主要組
織適合性抗原適合性が最大の同種異系ドナーから得られた。これは例えば、同じ
障害が家族に発見される遺伝的ファミリーの危険性がそれほど高くない状況にお
いて同一HLA血族でありうる。再注入される細胞は、HSV1−TKのような
自殺遺伝子を導入され、再注入された細胞は90%以上が遺伝子導入された細胞
である。さらに、品質管理の全体の幅はこれらの細胞によってなされる(表現型
、レパートリー解析)。
【0152】 注入から数日以内に、好ましくは注入から一週間以内に、さらには48時間以
内に、10mg/kg量のガンシクロビル処理が1日に2回患者に投与された。もし
、GVHの兆候がより早く現れるならば、処理がまだ早かったと考えられる。処
理は少なくとも一週間続けられる。この処理の終わりに、患者は、とりわけTリ
ンパ球の再構築を確認するために、まだモニターされている。
【0153】 移植片対宿主反応を示す兆候もまたモニターされている、例えば、皮膚の攻撃
である。もしこのような兆候が起こるなら、ガンシクロビルによる治療上の処理
が始められる。
【0154】 治療は、繰り返され、リンパ球のカウントが少なくとも1mm3当りTリンパ球
200個の値に回復したときに終了する。
【0155】 ガンシクロビルに制御されないGVHのような、治療中の厳しい二次的影響が
起こる中で、次に、始めるときまで凍結された、患者自身の細胞を再注入するた
めに、患者を再びTリンパ球を破壊する薬物で処理することができる。さらに、
これらのTリンパ球はその構築において膜表面マーカーを有するので、必要であ
れば、抗マーカー抗体がTリンパ球の除去を助ける。
【0156】 他のタイプの自己免疫疾患には、再注入されるリンパ球は、同じくHSV1−
TK遺伝子で遺伝子導入された患者のTリンパ球でありうる。これらの状態下に
おいては、細胞再注入の終わりに、ガンシクロビル処理は実施されない。患者の
Tリンパ球プールの再構築が確認された後、障害の激烈期が起こったときは、こ
れらの、例えばリューマチ性関節炎の治療に対する炎症性関節炎の工程や、多発
性硬化症の場合の神経工程および筋肉工程でありうるような、激烈期の同定の後
できるだけ早くガンシクロビル処理を施す。
【0157】 3.組織移植の治療に適用されるTリンパ球交換の治療的プロトコル この治療学的提示において、患者は上記のとおりの状態である。患者は例えば
患者自身の自殺遺伝子を発現している細胞で、ガンシクロビルによる治療の不存
在下において、再構築される。患者がその免疫系を再構成したとき、望ましい組
織移植が行われうる。移植にすぐ引き続いて、ガンシクロビルを用いた約1週間
の予防の治療が行われる。患者は、移植拒絶反応の始まりを明らかにしうる臨床
的兆候の発生をモニターされる。この場合、ガンシクロビルによる新しい治療が
行われうる。注意すべきは、この状態で、シクロスポリンのような従来の免疫抑
制剤治療を用いることができることである。
【0158】 さらなる治療モードにおいては、リンパ球は組織ドナーに由来してもよい。こ
の場合はそれらは移植を寛容し、手術手順はすなわち、GVHを抑制するため、
遺伝的に改変されたTリンパ球の投与後間もなくのGCV処理となる。
【0159】 4.免疫老化の予防についての治療的プロトコル 免疫システムは老化の主題であり、自己免疫疾患または新たな抗原に対する効
果的な免疫応答の立ち上げ不能のような免疫応答の貧弱な制御に特徴付けられる
【0160】 本応用では、治療は予防的なものである。患者がまだ若いうちは、患者からT
リンパ球を除去する。血球除去療法における108個のリンパ球の除去は容易で
あり、危険性もない。
【0161】 この操作は、数ヶ月のオーダーの時間間隔でかなりしばしば繰り返すことがで
きる。
【0162】 「記憶」細胞として知られるTリンパ球の副次的集団が循環していることは最
近認められた。この場合がそうでなければ、外科的にまたは成長因子等により集
結させた後に取り除かなければならない。
【0163】 好ましい手法において、Tリンパ球は、1010〜1011個になるまで培養され
増幅される。
【0164】 細胞は分配され、何年も凍結される。必要が生じたとき:すなわち免疫的問題
または免疫応答の立ち上げ困難の場合;Tリンパ球は溶解して対象に再注入され
る。
【0165】 この再注入は、全てまたは一部の凍結Tリンパ球を含み、循環Tリンパ球の全
または部分的除去に先行される。
【0166】 例えば、Tリンパ球のうちの、ただ1つのサブクラスをTリンパ球の他のサブ
クラスと置換するという計画もかなり可能である。例として、CD8リンパ球の
みを選択的に破壊して、前述の凍ったTリンパ球を選り分け、望まれたTリンパ
球のクラスのみを注入するか、Tリンパ球のそのまたは別のサブクラスによって
選択的に移植片を減少させることができる。
【0167】 すなわち、患者のTリンパ球は、その機能を果たすためにより良い、若いTリ
ンパ球と交換される。自己免疫疾患の場合において、同種反応性Tリンパ球は破
壊され、非攻撃性のTリンパ球によって置き換えられるのである。Tリンパ球集
団の老化と結びついた障害の場合は、これは予防的な治療である。実際に、それ
はTリンパ球のすなわち免疫系の「若返り」を構成する。
【0168】 参考文献 [1] P. Tibergheim, C.W. Reynolds, J. Keller, S. Spence, M. Deschaseaux,
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【図面の簡単な説明】
【図1】 標準的Tリンパ球交換の原理の概念図である。
【図2】 チミジンキナーゼを発現しているT細胞のGCV感受性である。脾臓細胞をC
onAの存在下で2日間培養し、GCV濃度を増加した後、トリチウム化したT
dR(GCV不存在下では100%の取り込みが観察された)でチャージした。
三角形、四角形、丸はTKの型の違いに対応している。上部の折れ線は非変換の
Tリンパ球に対応する。
【図3】 GCV7日間処理におけるGVHの予防効果である。X線照射のコントロール
グループは非移植X線照射マウス(n=15)により構成される。35日目の1
00%のマウスにおける致死的GVHは骨髄細胞と同種異系T−Ly細胞を同時
注射したことにより誘発された(n=25)。処理マウス(n=13)の生存率
は髄のみを受けた、すなわちGVHを開発しなかったマウス(n=15)で得ら
れたそれと比較した。
【図4】 CD4およびCD8リンパ球集団において自殺遺伝子を発現しているマウスに
おけるリンパ球性脈絡髄膜炎の薬理遺伝学的制御である。FVBまたはC57B
L/6マウスをX線照射し、FVBマウスもしくはトランスジェニックEPDT
KL20マウス由来の同系骨髄かまたは、同種異系の髄によって再構築した。免
疫系を再構築した後レシピエントはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV1
04pfu、Arm/53b株)を脳内感染して、GCVで7日間処理した(日に
2回の100mg/kg/dの腹膜内注射)。リンパ球においてTK遺伝子を発現して
いるマウスは保護され、生き残り、LCMVを排除し、抗LCMV抗体の高い力
価を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 5/10 C12Q 1/02 4C087 15/09 (A61K 39/395 D C12Q 1/02 35:14) //(A61K 39/395 C12N 5/00 B 35:14) 15/00 A (72)発明者 ボイエ,オリヴィエ フランス国、エフ−75018 パリ、リュ・ オルドネ 100ビス (72)発明者 トマ−ヴァスラン,ヴェロニク フランス国、エフ−94320 ティエ、サン ティエ・マルトレ 9 (72)発明者 サルツマン,ジャン−ルー フランス国、エフ−75005 パリ、リュ・ クロード・ベルナール 70 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA10 CA02 DA03 EA02 GA11 GA18 HA17 4B063 QQ08 QQ13 QR77 QR80 QS38 4B065 AA93X AA94X AB01 AC14 BA02 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA962 ZB022 ZB082 ZB112 ZB152 4C085 AA13 AA14 BB31 EE01 GG02 4C087 AA01 BB43 NA14 ZA96 ZB02 ZB08 ZB11 ZB15

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 一定のTリンパ球集団を投与することを含む、対象中のTリ
    ンパ球を置換する方法。
  2. 【請求項2】 その対象のTリンパ球を減少し、決定されたTリンパ球集団
    を投与することを含む、対象中のTリンパ球集団を置換する方法。
  3. 【請求項3】 改変されたTリンパ球集団を投与することを含む、請求項2
    記載の方法。
  4. 【請求項4】 投与されるTリンパ球集団が対象に関して自家または同系の
    Tリンパ球を含む、請求項1または請求項3のいずれか1項記載の方法。
  5. 【請求項5】 投与されるTリンパ球集団が対象に関して同種異系のTリン
    パ球を含む、請求項1または請求項3のいずれか1項記載の方法。
  6. 【請求項6】 投与されるTリンパ球集団が遺伝的に改変されたTリンパ球
    を含む、請求項3記載の方法。
  7. 【請求項7】 改変されたTリンパ球が毒性産物をコードする核酸を含む、
    請求項6記載の方法。
  8. 【請求項8】 核酸が条件付き毒性を有するタンパク質をコードする、請求
    項7記載の方法。
  9. 【請求項9】 核酸がチミジンキナーゼをコードする、請求項8記載の方法
  10. 【請求項10】 改変されたTリンパ球が治療用の産物をコードする核酸を
    含む、請求項6記載の方法。
  11. 【請求項11】 改変されたTリンパ球がウイルスベクターを用いて遺伝的
    に改変されている、請求項6記載の方法。
  12. 【請求項12】 ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはAAV
    である、請求項10記載の方法。
  13. 【請求項13】 改変されたTリンパ球集団が免疫学的に改変されたTリン
    パ球を含む、請求項3記載の方法。
  14. 【請求項14】 免疫学的改変が、改変されたTリンパ球のレパートリーの
    改変を含む、請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】 改変されたTリンパ球の集団が、増強された免疫性を生じ
    させるTリンパ球を含む、請求項3記載の方法。
  16. 【請求項16】 改変されたTリンパ球の集団が、増強された免疫性を生じ
    させるTリンパ球を含む、請求項6記載の方法。
  17. 【請求項17】 改変されたTリンパ球の集団が、増強された免疫性を生じ
    させるTリンパ球を含む、請求項12記載の方法。
  18. 【請求項18】 Tリンパ球減少工程が、対象に1種以上の免疫抑制剤を投
    与することを含む、請求項2記載の方法。
  19. 【請求項19】 Tリンパ球減少工程が、対象に特異的Tリンパ球免疫抑制
    剤を投与することを含む、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項20】 免疫抑制剤が血清または抗CD3、CD4および/または
    CD8抗体である、請求項18記載の方法。
  21. 【請求項21】 さらにそのタンパク質によって毒性代謝産物へ形質転換さ
    れる薬物の対象への投与を含む、請求項8記載の方法。
  22. 【請求項22】 ・1種以上の免疫抑制剤;および ・Tリンパ球集団を含む組成物 を含む組成物。
  23. 【請求項23】 ・自殺遺伝子を含むTリンパ球集団; ・自殺遺伝子によって毒性代謝産物に形質転換され得る薬物 を含む、請求項22記載の組成物。
  24. 【請求項24】 ・対象からTリンパ球を取り出し;そして ・それらのTリンパ球および/またはTリンパ球副次的集団においてレパートリ
    ー矯正を引き起こす ことを含む、改変されたTリンパ球組成物を調製する方法。
  25. 【請求項25】 レパートリー矯正が障害にかかわる抗原に特異的なTリン
    パ球の減少によって行われる、請求項24記載の方法。
  26. 【請求項26】 免疫病態により攻撃された、または攻撃されうる対象にT
    リンパ球の集団を投与するための、請求項1または請求項3のいずれか1項記載
    の方法。
  27. 【請求項27】 対象が、組織または細胞移植を受けている、請求項26記
    載の方法。
  28. 【請求項28】 細胞免疫系の老化により攻撃された、または攻撃されうる
    対象にTリンパ球集団を投与するための、請求項1または請求項3のいずれか1
    項記載の方法。
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