DE69434159T2

DE69434159T2 - Allogene und xenogene Transplantation

Info

Publication number: DE69434159T2
Application number: DE1994634159
Authority: DE
Inventors: David H. Newton Sachs
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1993-05-17
Filing date: 1994-05-16
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2014-05-17
Also published as: ATE283063T1; EP0699073B1; JP2006312647A; JPH09500616A; EP0699073A4; CA2162496A1; DE69433298D1; ATE253378T1; HK1029512A1; EP0699073A1; DE69433298T2; AU6952194A; AU688330B2; DE69434159D1

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung von: USSN 08/126 122, angemeldet am 23. September 1993; USSN 07/838 595, angemeldet am 9. Februar 1992; USSN 08/220 371, angemeldet am 29. März 1994; USSN 08/163 912, angemeldet am 7. Dezember 1993; USSN 08/114 072, angemeldet am 30. August 1993; USSN 08/150 739, angemeldet am 10. November 1993; USSN 08/212 228, angemeldet am 14. März 1994; und PCT/US94/01616, angemeldet am 14. Februar 1994.
Stand der Technik
Die Erfindung betrifft die Gewebe- und die Organtransplantation.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt mehrere Zusammensetzungen zur Induktion einer Toleranz gegenüber fremden Antigenen, z. B. gegenüber Antigenen auf allogenen oder xenogenen Gewebe- oder Organtransplantaten, bereit. Diese Zusammensetzungen können einzeln oder in Kombination miteinander eingesetzt werden. Z. B. wurde gefunden, dass die kurzzeitige Verabreichung eines Helferzellen reduzierenden Wirkstoffs, z. B. eine kurze hochdosierte Verabreichung von Cyclosporin A (CsA), signifikant die Transplantat-Akzeptanz verlängern kann. Die erfindungsgemäßen kurzzeitigen Verfahren zur Reduktion von Helferzellen können mit einem oder mehreren anderen Verfahren kombiniert werden, um die Transplantat-Akzeptanz zu verlängern. Z. B. kann eine kurze Behandlung mit einem hochdosierten Cyclosporin, das verabreicht wird, um eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden („unmatched") Spender-Klasse-I- und anderen, nicht übereinstimmenden Neben-(„minor"-)Spender-Antigenen zu induzieren, mit einer Transplantation von retroviral transformierten Knochenmarkzellen kombiniert werden, um eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Spender-Klasse-II-Antigenen zu induzieren. Eine kurze Behandlung mit einem hochdosierten Cyclosporin, das verabreicht wird, um eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Spender-Klasse-I- und anderen Neben-Antigenen zu induzieren, kann auch mit einer Implantation von Spender-Knochenmarkzellen kombiniert werden, um eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Spender-Klasse-II-Antigenen zu induzieren.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem Aspekt eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren, um eine Toleranz in einem Empfänger-Säuger, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, gegenüber einem Allotransplantat von einem Spenderprimaten zu induzieren, umfassend: Implantieren des Transplantats in den Empfänger; und Verabreichen einer kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung an den Empfänger, z. B. einer kurzen hochdosierten Cyclosporin-Gabe. Die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung wird allgemein etwa zu der Zeit verabreicht, zu der das Transplantat in den Empfänger eingebracht wird.
Vorzugsweise stimmt der Empfänger an einem ersten Genort, der die Transplantatabstoßung betrifft, z. B. einem MHC-Klasse-I- oder -II-Genort oder einem Neben-Antigen-Genort, nicht überein und stimmt an einem zweiten Genort, der die Transplantatabstoßung betrifft, z. B. einem MHC-Klasse-I- oder -II-Genort oder einem Neben-Antigen-Genort, überein oder toleriert eine Nichtübereinstimmung. Die Übereinstimmung an einem zweiten Genort kann durch Selektion eines Empfängers oder Spenders des geeigneten Genotyps erreicht werden. Der Empfänger kann gegenüber einer Nichtübereinstimmung an dem zweiten Genort durch ein beliebiges Verfahren der Toleranzinduktion tolerant gemacht werden, z. B. durch Verabreichung von Spender-Knochenmarkgewebe an den Empfänger, um eine Toleranz gegenüber auf dem Spender-Knochemark exprimierten Spender-Antigenen zu induzieren, durch Exprimieren eines MHC-Antigens des Spenders von einer Stammzelle des Empfängers, um eine Toleranz gegenüber dem Spender-Antigen zu induzieren, oder durch Ändern der immunologischen Eigenschaften des Transplantats, z. B. durch Maskieren, Spalten oder auf andere Weise Modifizieren von Zelloberflächenmolekülen auf dem Transplantat. In bevorzugten Ausführungsformen kann ein beliebiges der Verfahren, die eingesetzt werden können, um eine Übereinstimmung mit einem zweiten Genort zu erreichen oder eine Toleranz gegenüber diesem zu induzieren, verwendet werden, um eine Übereinstimmung mit einem dritten Genort, der die Transplantatabstoßung betrifft, z. B. einem MHC-Klasse-I- oder -II-Genort oder einem Neben-Antigen-Genort, zu erreichen oder eine Toleranz gegenüber diesem zu induzieren.
In bevorzugten Ausführungsformen stimmen der Empfänger und der Spender an einem Klasse-II-Genort überein, und die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung induziert eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Klasse-I- und/oder Neben-Antigenen auf dem Transplantat. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Toleranz gegenüber einem Klasse-II-Antigen durch ein anderes Verfahren als eine kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung induziert, und die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung induziert eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Klasse-I- und Neben-Antigenen auf dem Transplantat.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer der kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung etwa gleich dem Zeitraum, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden (bei Menschen beträgt diese üblicherweise 8 bis 12 Tage, vorzugsweise etwa 10 Tage), oder sie ist kürzer als derselbe; in stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer etwa gleich dem Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfachen des Zeitraums, den eine reife T-Zelle des Empfängers benötigt, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurde, oder sie ist kürzer als dieser.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit einer Behandlung verabreicht, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert, z. B. in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs in einer ausreichenden Konzentration, um dem gewünschten Effekt der Helferzellen reduzierenden Behandlung entgegenzuwirken, z. B. in Abwesenheit von Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion), bei einer Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs, z. B. in Abwesenheit von Prednison, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Helferzellen reduzierende Behandlung vor der Einführung des Transplantats oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; erfolgt die kurze Behandlung perioperativ oder erfolgt die kurze Behandlung postoperativ; oder sind der Spender und der Empfänger in Klasse-I übereinstimmend.
Verfahren zur Induktion einer Toleranz durch eine kurzzeitige Verabreichung eines Helferzellen reduzierenden Mittels, z. B. eine kurze hochdosierte Verabreichung von Cyclosporin A (CsA), können mit anderen Verfahren zur Induktion einer Toleranz kombiniert werden, z. B. Verfahren zur Implantation von transduzierten Knochenmarkzellen, um eine Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 008/126 122, angemeldet am 23. September 1993, beschrieben sind.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt eine Zusammensetzung, um in einem Empfänger-Säuger, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, einer ersten Art eine Toleranz gegenüber einem Transplantat von einem Säuger, z. B. einem Schwein, z. B. einem Miniaturschwein, einer zweiten Art zu induzieren, wobei das Transplantat vorzugsweise ein Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-)Antigen exprimiert. Das Verfahren umfasst das Einfügen einer DNA, die ein MHC-Antigen der zweiten Art codiert, in eine hämatopoetische Stammzelle, z. B. eine hämatopoetische Knochenmark-Stammzelle, des Empfänger-Säuges; das Ermöglichen der Expression der DNA, die das MHC-Antigen codiert, im Empfänger; vorzugsweise das Einbringen des Transplantats in den Empfänger; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung, z. B. einer kurzen hochdosierten Cyclosporin-Behandlung, an den Empfänger. Die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung wird im Allgemeinen etwa zu der Zeit verabreicht, in der das Transplantat in den Empfänger eingebracht wird.
In bevorzugten Ausführungsformen induziert die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Klasse-I- und/oder Neben-Antigenen auf dem Transplantat, das in den Empfänger eingeführt wird, anschließend an die Expression des MHC-Antigens.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer der kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung etwa gleich dem Zeitraum, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden, oder sie ist kürzer als derselbe; in stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer etwa gleich dem Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfachen des Zeitraums, den eine reife T-Zelle der Empfängerart benötigt, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurde, oder sie ist kürzer als dieser.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit einer Behandlung verabreicht, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert, z. B. in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs in einer ausreichenden Konzentration, um dem gewünschten Effekt der Helferzellen reduzierenden Behandlung entgegenzuwirken, z. B. in Abwesenheit von Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion) bei einer Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs, z. B. in Abwesenheit von Prednison, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Helferzellen reduzierende Behandlung vor der Einführung des Transplantats oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; erfolgt die kurze Behandlung perioperativ; oder erfolgt die kurze Behandlung postoperativ.
Bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, in denen die Zelle aus dem Empfänger-Säuger vor der DNA-Insertion entnommen und nach der DNA-Insertion wieder in den Empfänger-Säuger eingeführt wird; die DNA aus dem einzelnen Säuger gewonnen wird, aus dem das Transplantat gewonnen wird; die DNA aus einem einzelnen Säuger gewonnen wird, das mit dem einzelnen Säuger syngen ist, aus dem das Transplantat gewonnen wird; die DNA aus einem einzelnen Säuger gewonnen wird, das MHC-übereinstimmend und vorzugsweise identisch ist mit dem einzelnen Säuger, aus dem das Transplantat gewonnen wird; die DNA ein MHC-Gen der Klasse I umfasst; die DNA ein MHC-Gen der Klasse II umfasst; die DNA in die Zelle durch Transduktion eingefügt wird, z. B. durch ein Retrovirus, z. B. durch ein auf Moloney basierendes Retrovirus; und die DNA in Knochenmarkzellen und/oder peripheren Blutzellen des Empfängers mindestens 14, bevorzugt 30, stärker bevorzugt 60 und am stärksten bevorzugt 120 Tage exprimiert wird, nachdem die DNA in den Empfänger eingeführt wurde.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören; das Inaktivieren von Thymus-T-Zellen durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren: vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen, durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit z. B. etwa 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung oder durch Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem Immunsuppressivum, wie hier beschrieben, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Implantation eines Transplantats die natürlichen Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säuger entzogen werden, z. B. durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus einem Säuger der zweiten Art gewonnen wird. (Bei einer Organ-Hämoperfusion binden Antikörper im Blut an Antigene auf den Zelloberflächen des Organs und werden auf diese Weise aus dem Blut entfernt.)
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen das Einführen eines Antikörpers, der in der Lage ist, an reife T-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden, in den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen weiterhin den Schritt, in dem ein aus dem Spender gewonnenes Transplantat, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, um in einem Empfänger-Säuger, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, eine Toleranz gegenüber einem Transplantat zu induzieren, das aus einem Spender der gleichen Art gewonnen wird, wobei das Transplantat vorzugsweise ein MHC-Antigen exprimiert. Das Verfahren umfasst das Einfügen einer DNA, die ein MHC-Antigen des Spenders codiert, in eine hämatopoetische Stammzelle, z. B. eine hämatopoetische Knochenmark-Stammzelle, des Empfängers; das Ermöglichen der Expression der DNA, die das MHC-Antigen codiert, im Empfänger; vorzugsweise das Implantieren des Transplantats in den Empfänger; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung, z. B. einer kurzen hochdosierten Cyclosporin-Behandlung, an den Empfänger. Die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung wird im Allgemeinen etwa zu der Zeit verabreicht, zu der das Transplantat in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen induziert die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Klasse-I- und/oder Neben-Antigenen auf einem Transplantat, das in den Empfänger eingeführt wird, anschließend an die Expression des MHC-Antigens.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer der kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung etwa gleich dem Zeitraum, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden, oder sie ist kürzer als derselbe; in stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer etwa gleich dem Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfachen des Zeitraums, den eine reife T-Zelle der Empfängerart benötigt, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurde, oder sie ist kürzer als dieser.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit einer Behandlung verabreicht, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert, z. B. in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs in einer ausreichenden Konzentration, um dem gewünschten Effekt der Helferzellen reduzierenden Behandlung entgegenzuwirken, z. B. in Abwesenheit von Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion), bei einer Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs, z. B. in Abwesenheit von Prednison, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Helferzellen reduzierende Behandlung vor der Einführung des Transplantats oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; erfolgt die kurze Behandlung perioperativ oder erfolgt die kurze Behandlung postoperativ; oder sind der Spender und der Empfänger in Klasse-I übereinstimmend.
Bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, in denen die Zelle aus dem Empfänger vor der DNA-Insertion entnommen und nach der DNA-Insertion wieder in den Empfänger eingeführt wird; die DNA ein MHC-Gen der Klasse I umfasst; die DNA ein MHC-Gen der Klasse II umfasst; die DNA in die Zelle durch Transduktion eingefügt wird, z. B. durch ein Retrovirus, z. B. durch ein auf Moloney basierendes Retrovirus; und die DNA in Knochenmarkzellen und/oder peripheren Blutzellen des Empfängers mindestens 14, bevorzugt 30, stärker bevorzugt 60 und am stärksten bevorzugt 120 Tage exprimiert wird, nachdem die DNA in den Empfänger eingeführt wurde.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen das Einführen eines Antikörpers, der in der Lage ist, an reife T-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden, in den Empfänger.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Transplantat eine Leber oder eine Niere.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören; das Inaktivieren von Thymus-T-Zellen durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren: vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen, durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit z. B. etwa 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung oder durch Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem Immunsuppressivum, wie hier beschrieben, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Implantation eines Transplantats die natürlichen Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säugers entzogen werden, z. B. durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus einem Säuger der zweiten Art gewonnen wird. (Bei einer Organ-Hämoperfusion binden Antikörper im Blut an Antigene auf den Zelloberflächen des Organs und werden auf diese Weise aus dem Blut entfernt.)
Verfahren zur Induktion einer Toleranz mit einer kurzzeitigen Verabreichung eines Helferzellen reduzierenden Mittels, z. B. einer kurzen hochdosierten Verabreichung von Cyclosporin A (CsA), können mit anderen Verfahren zur Induktion einer Toleranz kombiniert werden, z. B. Verfahren zur Induktion einer Toleranz, bei denen die Implantation von Spender-Stammzellen verwendet wird, um eine Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 07/838 595, angemeldet am 19. Februar 1992, beschrieben sind.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt eine Zusammensetzung, um in einem Empfänger-Säuger einer ersten Art, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, eine Toleranz gegenüber einem Transplantat zu induzieren, das von einem Säuger einer zweiten, vorzugsweise einer diskordanten Art, z. B. einem Schwein, z. B. einem Miniaturschwein, oder einer diskordanten Primatenart erhalten wurde. Das Verfahren umfasst, vorzugsweise vor der Transplantation des Transplantats oder gleichzeitig damit, das Einführen, z. B. durch eine intravenöse Injektion, von hämatopoetischen Stammzellen, z. B. Knochenmarkzellen oder fetalen Leber- oder Milzzellen, der zweiten Art in den Empfänger-Säuger (vorzugsweise steuern („home") die hämatopoetischen Stammzellen gezielt zu einer Stelle im Empfänger-Säuger hin); (gegebenenfalls) das Inaktivieren der natürlichen Killerzellen des Empfänger-Säugers, z. B. indem vor dem Einführen der hämatopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger ein Antikörper in den Empfänger-Säuger eingeführt wird, der in der Lage ist, an natürliche Killerzellen des Empfänger-Säugers zu binden; vorzugsweise das Implantieren des Transplantats in den Empfänger; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung, z. B. einer kurzen Behandlung mit hochdosiertem Cyclosporin, an den Empfänger. Die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung wird im Allgemeinen zu der Zeit verabreicht, zu der das Transplantat in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen induziert die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Klasse-I- und/oder Neben-Antigenen auf dem Transplantat, das in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer der kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung etwa gleich dem Zeitraum, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden, oder sie ist kürzer als derselbe; in stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer etwa gleich dem Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfachen des Zeitraums, den eine reife T-Zelle der Empfängerart benötigt, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurde, oder sie ist kürzer als dieser.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit einer Behandlung verabreicht, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert, z. B. in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs in einer ausreichenden Konzentration, um dem gewünschten Effekt der Helferzellen reduzierenden Behandlung entgegenzuwirken, z. B. in Abwesenheit von Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion) bei einer Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs, z. B. in Abwesenheit von Prednison, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Helferzellen reduzierende Behandlung vor der Einführung des Transplantats oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; oder erfolgt die kurze Behandlung perioperativ, erfolgt die kurze Behandlung postoperativ.
Wie nachstehend noch genauer erklärt wird, bereiten die hämatopoetischen Zellen den Empfänger für die Transplantation vor, die folgt, indem sie eine Toleranz sowohl auf B-Zell- als auch auf T-Zell-Ebene induzieren. Vorzugsweise sind hämatopoetische Zellen fetale Leber- oder Milz- oder Knochenmarkzellen, umfassend unreife Zellen (d. h. undifferenzierte hämatopoetische Stammzellen; diese gewünschten Zellen können vor der Verabreichung aus dem Knochenmark abgetrennt werden), oder es kann eine komplexe Knochenmarkprobe verwendet werden, die solche Zellen enthält.
Eine Quelle eines Anti-NK-Antikörpers ist ein gegen menschliche Thymocyten gerichtetes polyclonales Antiserum. Wie nachstehend beschrieben, kann vorzugsweise auch ein zweiter, gegen reife T-Zellen gerichteter Antikörper verabreicht werden, der T-Zellen und außerdem NK-Zellen lysiert. Das Lysieren von T-Zellen ist für das Überleben von sowohl Knochenmark- als auch Xenotransplantaten vorteilhaft. In einem Anti-Thymocyten-Antiserum liegen Anti-T-Zellen-Antikörper zusammen mit Anti-NK-Antikörpern vor. Wiederholte Dosen eines Anti-NK- oder eines Anti-T-Zellen-Antikörpers können bevorzugt sein. In den Verfahren der vorliegenden Erfindung können monoclonale Präparate eingesetzt werden.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem ein Spenderart-spezifisches Stromagewebe, vorzugsweise ein hämatopoetisches Stromagewebe, z. B. fetale Leber oder Thymus, in den Empfänger-Säuger eingeführt wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Stromagewebe gleichzeitig mit den hämatopoetischen Stammzellen oder davor eingeführt; werden die hämatopoetischen Stammzellen gleichzeitig mit dem Antikörper oder davor eingeführt.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, in denen der gleiche Säuger der zweiten Art der Spender des Transplantats oder der hämatopoetischen Stammzellen oder von beiden ist; und der Antikörper ein gegen menschliche Thymocyten gerichtetes polyclonales Antiserum ist, das z. B. aus einem Pferd oder einem Schwein gewonnen wird.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören; das Inaktivieren von Thymus-T-Zellen durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren: vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit z. B. etwa 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung oder durch Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem Immunsuppressivum, wie hier beschrieben, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen die natürlichen Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säugers entzogen werden, z. B. durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus einem Säuger der zweiten Art gewonnen wird. (Bei einer Organ-Hämoperfusion binden Antikörper im Blut an Antigene auf den Zelloberflächen des Organs und werden auf diese Weise aus dem Blut entfernt.)
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen das Einführen eines Antikörpers, der in der Lage ist, an reife T-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden, in den Empfänger.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Schritt, in dem ein aus dem Spender gewonnenes Transplantat, das aus einem anderen Organ gewonnen wird als die hämatopoetischen Stammzellen, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, um in einem Empfänger-Säuger, vorzugsweise einem Primaten, z. B. einem Menschen, eine Toleranz gegenüber einem Transplantat zu induzieren, das aus einem Spender, z. B. der gleichen Art, gewonnen wird. Das Verfahren umfasst vorzugsweise vor der Transplantation des Transplantats oder gleichzeitig damit das Einführen, z. B. durch eine intravenöse Injektion, von hämatopoetischen Stammzellen, z. B. Knochenmarkzellen oder fetalen Leber- oder Milzzellen, eines Säugers, vorzugsweise des Spenders, in den Empfänger (vorzugsweise steuern die hämatopoetischen Stammzellen gezielt zu einer Stelle im Empfänger hin); (gegebenenfalls) das Inaktivieren von T-Zellen des Empfängers, z. B. indem vor dem Einführen der hämatopoetischen Stammzellen in den Empfänger ein Antikörper in den Empfänger eingeführt wird, der in der Lage ist, an T-Zellen des Empfängers zu binden; vorzugsweise das Implantieren des Transplantats in den Empfänger; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen Helferzellen reduzierenden Behandlung, z. B. einer kurzen Behandlung mit hochdosiertem Cyclosporin, an den Empfänger. Die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung wird im Allgemeinen zu der Zeit verabreicht, in der das Transplantat in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen induziert die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung eine Toleranz gegenüber nicht übereinstimmenden Klasse-I- und/oder Neben-Antigenen auf dem Transplantat, das in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer der kurzen, Helferzellen reduzierenden Behandlung etwa gleich dem Zeitraum, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden, oder sie ist kürzer als derselbe; in stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer etwa gleich dem Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfachen des Zeitraums, den eine reife T-Zelle der Empfängerart benötigt, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurde, oder sie ist kürzer als dieser.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit einer Behandlung verabreicht, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert, z. B. in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs in einer ausreichenden Konzentration, um dem gewünschten Effekt der Helferzellen reduzierenden Behandlung entgegenzuwirken, z. B. in Abwesenheit von Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion), bei einer Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen im Empfänger stimuliert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze, Helferzellen reduzierende Behandlung in Abwesenheit eines Steroid-Wirkstoffs, z. B. in Abwesenheit von Prednison, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Helferzellen reduzierende Behandlung vor der Einführung des Transplantats oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; oder die kurze Behandlung erfolgt perioperativ, die kurze Behandlung erfolgt postoperativ; der Spender und der Empfänger sind in Klasse-I übereinstimmend.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die hämatopoetischen Stammzellen gleichzeitig mit der Verabreichung des Antikörpers oder davor eingeführt; ist der Antikörper ein gegen menschliche Thymocyten gerichtetes polyclonales Antiserum; und wird das Antiserum aus einem Pferd oder einem Schwein gewonnen.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den weiteren Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen NK-Zellen des Empfängers inaktiviert oder entzogen werden, z. B. durch Einführen eines Antikörpers, der in der Lage ist, an NK-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden, in den Empfänger-Säuger; und diejenigen, in denen das gleiche Individuum der Spender von sowohl Transplantat als auch Knochenmark ist.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören; das Inaktivieren von Thymus-T-Zellen durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren: vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen, durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit z. B. etwa 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung oder durch Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem Immunsuppressivum, wie hier beschrieben, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den weiteren Schritt, in dem vor der Transplantation von Knochenmark die natürlichen Antikörper aus dem Blut des Empfängers durch Hämoperfusion eines Organs entzogen werden, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus dem Spender gewonnen wird.
Bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem Spenderartspezifisches Stromagewebe, vorzugsweise hämatopoetisches Stromagewebe, z. B. fetale Leber oder Thymus, in den Empfänger-Säuger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Schritt, in dem ein Transplantat, das aus einem anderen Organ gewonnen wird als die hämatopoetischen Stammzellen, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
Verfahren zur Induktion einer Toleranz durch eine kurze Verabreichung eines Helferzellen reduzierenden Mittels, z. B. eine kurze Behandlung mit hochdosiertem Cyclosporin (CsA), können mit noch anderen Verfahren zur Induktion einer Toleranz kombiniert werden, z. B. mit Verfahren, in denen die Implantation eines xenogenen Thymustransplantats verwendet wird, um eine Toleranz zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 08/163 912, angemeldet am 7. Dezember 1993, beschrieben sind; Verfahren zum Anheben des Aktivitätsniveaus eines Toleranz fördernden oder GVHD hemmenden Cytokins oder zum Absenken des Aktivitätsniveaus eines Toleranz hemmenden oder GVHD fördernden Cytokins, z. B. die Verfahren, die in USSN 08/114 072, angemeldet am 30. August 1993, beschrieben sind; Verfahren zur Verwendung von Nabelschnur-Blutzellen, um eine Toleranz zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 08/150 739, angemeldet am 10. November 1993, beschrieben sind; und Verfahren zur Induktion einer Toleranz, die in Sykes und Sachs, PCT/US 94/01616, angemeldet am 14. Februar 1994, beschrieben sind.
Außerdem wurde entdeckt, dass eine kurze Behandlung mit einem Immunsuppressivum, z. B. mit Cyclosporin, eingesetzt werden kann, um die Aktivität von T-Zellen zu verringern oder zu hemmen, die anderenfalls die Abstoßung eines Allotransplantats oder Xenotransplantats fördern würden.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren, um die Aktivität von T-Zellen, vorzugsweise die Aktivität von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, in einem Empfänger-Säuger, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, der ein Transplantat von einem Spender-Säuger erhält, zu verringern oder zu hemmen. Das Verfahren umfasst das Induzieren einer Toleranz gegenüber dem Transplantat; das Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff, z. B. mit Cyclosporin, an den Empfänger, die ausreichend ist, um T-Zellen, vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren; und vorzugsweise das Transplantieren des Transplantats in den Empfänger.
Eine Toleranz gegenüber dem Transplantat kann durch ein beliebiges Verfahren induziert werden, z. B. durch eines der hier beschriebenen Verfahren. Z. B. kann eine Toleranz induziert werden durch die Verabreichung von allogenen oder xenogenen hämatopoetischen Stammzellen eines Spenders, durch die Verabreichung von genetisch veränderten autologen Stammzellen, durch die Verabreichung einer kurzen Behandlung mit einem Helferzellen reduzierenden Wirkstoff oder durch Verändern der immunologischen Eigenschaften des Transplantats, z. B. durch Maskieren, Spalten oder ein anderes Modifizieren von Zelloberflächen-Molekülen des Transplantats.
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dauer der kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff etwa 30 Tage; etwa 8 bis 12 Tage oder weniger, vorzugsweise etwa 10 Tage; das etwa Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfache des 8 bis 12 oder 10 Tage umfassenden Zeitraums oder weniger.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze Behandlung vor oder etwa zu der Zeit begonnen, in der die Behandlung zur Induktion einer Toleranz begonnen wird, z. B. etwa zu der Zeit, in der xenogene, allogene, genetisch veränderte syngene oder genetisch veränderte autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; beginnt die kurze Behandlung an dem Tag, an dem die Behandlung zur Induktion einer Toleranz begonnen wird, z. B. an dem Tag, an dem xenogene, allogene, genetisch veränderte syngene oder genetisch veränderte autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; beginnt die kurze Behandlung innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen, bevor oder nachdem die Behandlung zur Induktion einer Toleranz begonnen wird, z. B. innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen, bevor oder nachdem xenogene, allogene, genetisch veränderte syngene oder genetisch veränderte autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze Behandlung mit einem Immunsuppressivum zusammen mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper verabreicht; ist die kurze Behandlung mit einem Immunsuppressivum ausreichend, um T-Zellen, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren, die durch eine auf Antikörper beruhende Inaktivierung von T-Zellen nicht inaktiviert werden würden, z. B. durch eine Inaktivierung durch intravenöse Verabreichungen von ATG-Antikörper- oder ähnlichen Präparaten.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Empfänger-Säuger keine Maus oder keine Ratte.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zum Inaktivieren von T-Zellen, vorzugsweise von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, können mit Verfahren zur Induktion einer Toleranz kombiniert werden, bei denen die Inaktivierung von T-Zellen wünschenswert ist. Die Anti-T-Zellen-Verfahren der Erfindung können anstelle von Verfahren zur Inaktivierung von T-Zellen oder zusätzlich dazu eingesetzt werden, die in solchen Verfahren zur Induktion einer Toleranz erforderlich sind oder hierfür geeignet sind. Z. B. können die gegen Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen gerichteten Verfahren der Erfindung zusammen mit Verfahren zur Implantation von transduzierten Knochenmarkzellen eingesetzt werden, um eine Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 008/126 122, angemeldet am 23. September 1993, beschrieben sind.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren, um in einem Empfänger-Säuger einer ersten Art die Akzeptanz eines Transplantats von einem Spender-Säuger einer zweiten Art zu fördern, wobei das Transplantat vorzugsweise ein Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-)Antigen exprimiert. Das Verfahren umfasst das Einfügen einer DNA, die ein MHC-Antigen der zweiten Art codiert, in eine hämatopoetische Stammzelle, z. B. eine hämatopoetische Knochenmark-Stammzelle, des Empfänger-Säugers; das Ermöglichen der Expression der DNA, die das MHC-Antigen codiert, im Empfänger; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff, z. B. einer kurzen Cyclosporin-Behandlung, an den Empfänger, die ausreichend ist, um T-Zellen, vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, des Empfängers zu inaktivieren. (Anderenfalls könnten Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen das Überleben des Transplantats oder der genetisch veränderten Zellen hemmen.)
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dauer der kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff etwa 30 Tage; etwa 8 bis 12 Tage oder weniger, vorzugsweise etwa 10 Tage; das etwa Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfache des 8 bis 12 oder 10 Tage umfassenden Zeitraums oder weniger.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Empfänger-Säuger ein Primat, z. B. ein Mensch, und der Spender-Säuger ist ein Schwein, z. B. ein Miniaturschwein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze Behandlung vor der Einführung der genetisch veränderten Stammzellen in den Empfänger oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; beginnt die kurze Behandlung an dem Tag, an dem die genetisch veränderten Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; beginnt die kurze Behandlung innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach dem Einführen der genetisch veränderten Stammzellen in den Empfänger.
Die kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff wird zusammen mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper verabreicht; die kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff ist ausreichend, um T-Zellen, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren, die durch eine auf Antikörper basierende Inaktivierung von T-Zellen nicht inaktiviert werden würden, z. B. durch eine Inaktivierung durch intravenöse Verabreichungen von ATG- oder ähnlichen Antikörperpräparaten.
Bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, in denen die Zelle aus dem Empfänger-Säuger vor der DNA-Insertion entnommen und nach der DNA-Insertion wieder in den Empfänger-Säuger eingeführt wird; die DNA aus dem einzelnen Säuger gewonnen wird, aus dem das Transplantat gewonnen wird; die DNA aus einem einzelnen Säuger gewonnen wird, der mit dem einzelnen Säuger syngen ist, aus dem das Transplantat gewonnen wird; die DNA aus einem einzelnen Säuger gewonnen wird, der MHC-übereinstimmend und vorzugsweise identisch ist mit dem einzelnen Säuger, aus dem das Transplantat gewonnen wird; die DNA ein MHC-Gen der Klasse I umfasst; die DNA ein MHC-Gen der Klasse II umfasst; die DNA in die Zelle durch Transduktion eingefügt wird, z. B. durch ein Retrovirus, z. B. durch ein auf Moloney basierendes Retrovirus; und die DNA in Knochenmarkzellen und/oder peripheren Blutzellen des Empfängers mindestens 14, bevorzugt 30, stärker bevorzugt 60 und am stärksten bevorzugt 120 Tage exprimiert wird, nachdem die DNA in den Empfänger eingeführt wurde.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Implantation von hämatopoetischen Stammzellen ein hämatopoetischer Raum im Empfänger geschaffen wird, um das Anwachsen und Überleben der implantierten Stammzellen zu fördern, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung, z. B. 700 Rad einer Thymusbestrahlung, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem natürliche Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säugers entzogen werden, z. B. durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus einem Säuger der zweiten Art gewonnen wird. (Bei einer Organ-Hämoperfusion binden Antikörper im Blut an Antigene auf den Zelloberflächen des Organs und werden auf diese Weise aus dem Blut entfernt.)
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen weiterhin den Schritt, in dem ein Transplantat, das aus dem Spender gewonnen wird, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, um bei einem Empfänger-Säuger, vorzugsweise einem Primaten, z. B. einem Menschen, die Akzeptanz eines Transplantats, das von einem Spender der gleichen Art gewonnen wird, zu fördern, wobei das Transplantat ein MHC-Antigen exprimiert. Das Verfahren umfasst das Einfügen einer DNA, die ein MHC-Antigen des Spenders codiert, in eine hämatopoetische Stammzelle, z. B. eine hämatopoetische Knochenmark-Stammzelle des Empfängers; das Ermöglichen der Expression der DNA, die das MHC-Antigen codiert, im Empfänger; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff, z. B. eine kurze Cyclosporin-Behandlung, an den Empfänger, die ausreichend ist, um T-Zellen des Empfängers, vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren. (Anderenfalls könnten Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen das Überleben des Transplantats oder der genetisch veränderten Zellen hemmen.)
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dauer der kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff etwa 30 Tage; etwa 8 bis 12 Tage oder weniger, vorzugsweise etwa 10 Tage; das etwa Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfache des 8 bis 12 oder 10 Tage umfassenden Zeitraums oder weniger.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze Behandlung vor der Einführung der genetisch veränderten Stammzellen in den Empfänger oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; beginnt die kurze Behandlung an dem Tag, an dem die genetisch veränderten Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; beginnt die kurze Behandlung innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach dem Einführen der genetisch veränderten Stammzellen in den Empfänger.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff zusammen mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper; ist die kurze Verabreichung eines Immunsuppressivums ausreichend, um T-Zellen, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren, die durch eine auf Antikörper beruhende Inaktivierung von T-Zellen nicht inaktiviert werden würden, z. B. durch eine Inaktivierung durch intravenöse Verabreichungen von ATG- oder ähnlichen Antikörperpräparaten.
Bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, in denen die Zelle aus dem Empfänger vor der DNA-Insertion entnommen und nach der DNA-Insertion wieder in den Empfänger eingeführt wird; die DNA ein MHC-Gen der Klasse I umfasst; die DNA ein MHC-Gen der Klasse II umfasst; die DNA in die Zelle durch Transduktion eingefügt wird, z. B. durch ein Retrovirus, z. B. durch ein auf Moloney basierendes Retrovirus; und die DNA in Knochenmarkzellen und/oder peripheren Blutzellen des Empfängers mindestens 14, bevorzugt 30, stärker bevorzugt 60 und am stärksten bevorzugt 120 Tage exprimiert wird, nachdem die DNA in den Empfänger eingeführt wurde.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Implantation von hämatopoetischen Stammzellen im Empfänger ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, um das Anwachsen und Überleben der implantierten Stammzellen zu fördern, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung, z. B. einer 700 Rad Thymus-Bestrahlung, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem natürliche Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säugers entzogen werden, z. B. durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus einem Säuger der zweiten Art gewonnen wird. (Bei einer Organ-Hämoperfusion binden Antikörper im Blut an Antigene auf den Zelloberflächen des Organs und werden auf diese Weise aus dem Blut entfernt.)
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen weiterhin den Schritt, in dem ein aus dem Spender gewonnenes Transplantat, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
Erfindungsgemäße Verfahren zum Inaktivieren von T-Zellen, vorzugsweise von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, können mit Verfahren zur Induktion einer Toleranz kombiniert werden, bei denen die Implantation von Spender-Stammzellen eingesetzt wird, um eine Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 07/838 595, angemeldet am 19. Februar 1992, beschrieben sind, hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren, um in einem Empfänger-Säuger einer ersten Art, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, eine Akzeptanz eines Transplantat zu fördern, das aus einem Säuger einer zweiten, vorzugsweise einer diskordanten Art, z. B. einem Schwein, z. B. einem Miniaturschwein, oder einer diskordanten Primatenart gewonnen wurde. Das Verfahren umfasst das Einführen, z. B. durch eine intravenöse Injektion, von hämatopoetischen Stammzellen, z. B. Knochenmarkzellen oder fetalen Leber- oder Milzzellen, der zweiten Art in das Empfänger-Säugetier (vorzugsweise steuern die hämatopoetischen Stammzellen gezielt zu einer Stelle im Empfänger-Säuger hin); (gegebenenfalls) das Inaktivieren von natürlichen Killerzellen des Empfänger-Säugers, z. B. indem vor dem Einführen der hämatopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger ein Antikörper in den Empfänger-Säuger eingeführt wird, der in der Lage ist, an natürliche Killerzellen des Empfänger-Säugers zu binden; (gegebenenfalls) das Inaktivieren von T-Zellen des Empfänger-Säugers, z. B. indem vor dem Einführen der hämatopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger ein Antikörper in den Empfänger-Säuger eingeführt wird, der in der Lage ist, an T-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff, z. B. einer kurzen Cyclosporin-Behandlung, an den Empfänger, die ausreichend ist, um T-Zellen des Empfängers, vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren. (Anderenfalls könnten Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen das Anwachsen oder Überleben der genetisch veränderten Zellen hemmen.)
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dauer der kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff etwa 30 Tage; etwa 8 bis 12 Tage oder weniger, vorzugsweise etwa 10 Tage; das etwa Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfache des 8 bis 12 oder 10 Tage umfassenden Zeitraums oder weniger.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze Behandlung vor der Einführung der Stammzellen in den Empfänger oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; beginnt die kurze Behandlung an dem Tag, an dem die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; beginnt die kurze Behandlung innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach dem Einführen der Stammzellen in den Empfänger.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff zusammen mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper oder mit einer Thymus-Bestrahlung, z. B. 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung, oder mit beiden; ist die kurze Verabreichung eines Immunsuppressivums ausreichend, um T-Zellen, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren, die durch eine auf Antikörper beruhende Inaktivierung von T-Zellen nicht inaktiviert werden würden, z. B. durch eine Inaktivierung durch intravenöse Verabreichungen von ATG-Antikörperpräparaten.
Wie nachstehend noch genauer erklärt wird, bereiten die hämatopoetischen Zellen den Empfänger auf das Transplantat vor, das folgt, indem sie sowohl auf der B-Zell- als auch auf der T-Zell-Ebene eine Toleranz induzieren. Vorzugsweise sind die hämatopoetischen Zellen fetale Leber- oder Milzzellen oder Knochenmarkzellen, umfassend unreife Zellen (d. h. undifferenzierte hämatopoetische Stammzellen; diese gewünschten Zellen können vor der Verabreichung aus dem Knochenmark abgetrennt werden), oder es kann eine komplexe Knochenmarkprobe verwendet werden, die solche Zellen enthält.
Eine Quelle eines Anti-NK-Antikörpers ist ein gegen menschliche Thymocyten gerichtetes polyclonales Antiserum. Wie nachstehend beschrieben, kann vorzugsweise auch ein zweiter, gegen reife T-Zellen gerichteter Antikörper verabreicht werden, der T-Zellen und außerdem NK-Zellen lysiert. Das Lysieren von T-Zellen ist für das Überleben von sowohl Knochenmark- als auch Xenotransplantaten vorteilhaft. In einem Anti-Thymocyten-Antiserum liegen Anti-T-Zellen-Antikörper zusammen mit Anti-NK-Antikörpern vor. Wiederholte Dosen eines Anti-NK- oder eines Anti-T-Zellen-Antikörpers können bevorzugt sein. In den Verfahren der Erfindung können monoclonale Präparate eingesetzt werden.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem ein Spenderart-spezifisches Stromagewebe, vorzugsweise ein hämatopoetisches Stromagewebe, z. B. fetale Leber oder Thymus, in den Empfänger-Säuger eingeführt wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Stromagewebe gleichzeitig mit den hämatopoetischen Stammzellen oder davor eingeführt; werden die hämatopoetischen Stammzellen gleichzeitig mit einem Anti-NK- oder T-Zellen-Antikörper oder davor eingeführt.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, in denen der gleiche Säuger der zweiten Art der Spender des Transplantats oder der hämatopoetischen Zellen oder von beiden ist; und der Anti-T- oder Anti-NK-Zellen-Antikörper ein gegen menschliche Thymocyten gerichtetes polyclonales Antiserum ist, das z. B. aus einem Pferd oder einem Schwein gewonnen wird.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen im Empfänger ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, um das Anwachsen und Überleben der implantierten Stammzellen zu fördern, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger- Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung, z. B. 300 bis 700 Rad einer Thymusbestrahlung, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen natürliche Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säugers entzogen werden, z. B. durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. einer Leber oder einer Niere, das aus einem Säuger der zweiten Art gewonnen wird. (Bei einer Organ-Hämoperfusion binden Antikörper im Blut an Antigene auf den Zelloberflächen des Organs und werden auf diese Weise aus dem Blut entfernt.)
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen weiterhin den Schritt, in dem ein aus dem Spender gewonnenes Transplantat, z. B. ein Transplantat, das aus einem anderen Organ gewonnen wird als die hämatopoetischen Stammzellen, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Stammzellen vor der Transplantation des Transplantats oder gleichzeitig damit in den Empfänger eingeführt.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, um in einem Empfänger-Säuger, vorzugsweise einem Primaten, z. B. einem Menschen, eine Akzeptanz eines Transplantats aus einem Spender der gleichen Art zu fördern. Das Verfahren umfasst: das Einführen, z. B. durch eine intravenöse Injektion, von hämatopoetischen Stammzellen, z. B. Knochenmarkzellen oder fetalen Leber- oder Milzzellen, eines Säugers, vorzugsweise des Spenders in den Empfänger (vorzugsweise steuern die hämatopoetischen Stammzellen gezielt zu einer Stelle im Empfänger hin); (gegebenenfalls) das Inaktivieren von T-Zellen des Empfängers, z. B. indem vor dem Einführen der hämatopoetischen Stammzellen in den Empfänger ein Antikörper in den Empfänger eingeführt wird, der in der Lage ist, an T-Zellen des Empfängers zu binden; und vorzugsweise das Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff, z. B. einer kurzen Behandlung mit Cyclosporin, an den Empfänger, die ausreichend ist, um T-Zellen des Empfängers, vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren. (Die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen könnten anderenfalls das Einwachsen oder Überleben der veränderten Zellen hemmen.)
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dauer der kurzen Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff etwa 30 Tage; etwa 8 bis 12 Tage oder weniger, vorzugsweise etwa 10 Tage; das etwa Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfache des 8 bis 12 oder 10 Tage umfassenden, vorstehend erwähnten Zeitraums oder weniger.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die kurze Behandlung vor der Einführung der Stammzellen in den Empfänger oder etwa zur gleichen Zeit damit begonnen; beginnt die kurze Behandlung an dem Tag, an dem die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; beginnt die kurze Behandlung innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach dem Einführen der Stammzellen in den Empfänger.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff zusammen mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper oder einer Thymus-Bestrahlung, z. B. 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung, oder mit beiden; ist die kurze Behandlung mit einem Immunsuppressivum ausreichend, um T-Zellen, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, zu inaktivieren, die durch eine auf Antikörper beruhende Inaktivierung von T-Zellen nicht inaktiviert werden würden, z. B. durch eine Inaktivierung durch eine intravenöse Verabreichung von ATG-Antikörperpräparaten.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Anti-T-Zellen- oder NK-Zellen-Antikörper ein gegen menschliche Thymocyten gerichtetes polyclonales Antiserum; und das Antiserum wird aus einem Pferd oder einem Schwein gewonnen.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den weiteren Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen NK-Zellen des Empfängers inaktiviert werden, z. B. indem ein Antikörper, der in der Lage ist, an NK-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden, in den Empfänger-Säuger eingeführt wird; und diejenigen, in denen das gleiche Individuum der Spender von sowohl Transplantat als auch Knochenmark ist.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Schritt, in dem vor der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen im Empfänger ein hämatopoetischer Raum geschaffen wird, um das Einwachsen und Überleben der implantierten Stammzellen zu fördern, z. B. durch Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit einer niedrig dosierten, z. B. zwischen etwa 100 und 400 Rad, Ganzkörper-Bestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers zu zerstören oder teilweise zu zerstören.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung, z. B. 700 Rad einer Thymus-Bestrahlung, an den Empfänger.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen den weiteren Schritt, in dem vor der Transplantation von Knochenmark die natürlichen Antikörper aus dem Blut des Empfängers durch Hämoperfusion eines Organs, z. B. der Leber oder einer Niere, die aus dem Spender gewonnen wird, absorbiert werden.
Bevorzugte Ausführungsformen umfassen die Schritt, in dem ein Spenderartspezifisches Stromagewebe, vorzugsweise ein hämatopoetisches Stromagewebe, z. B. fetale Leber oder Thymus, in den Empfänger-Säuger eingeführt wird.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen weiterhin den Schritt, in dem ein aus dem Spender gewonnenes Transplantat, z. B. ein Transplantat, das aus einem anderen Organ gewonnen wird als die hämatopoetischen Stammzellen, z. B. eine Leber oder eine Niere, in den Empfänger eingeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Stammzellen vor der Transplantation des Transplantats oder gleichzeitig damit in den Empfänger eingeführt.
Erfindungsgemäße Verfahren zum Inaktivieren von T-Zellen, vorzugsweise von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, können zusammen mit noch anderen Verfahren zur Induktion einer Toleranz eingesetzt werden, bei denen die Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen wünschenswert ist. Z. B. können die erfindungsgemäßen Anti-Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen-Verfahren zusammen mit Verfahren eingesetzt werden, bei denen die Implantation eines xenogenen Thymustransplantats genutzt wird, um eine Toleranz zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 08/163 912, angemeldet am 7. Dez. 1993, beschrieben sind; Verfahren zum Anheben des Aktivitätsniveaus eines Toleranz fördernden oder GVHD hemmenden Cytokins oder zum Absenken des Aktivitätsniveaus eines Toleranz-hemmenden oder GVHD fördernden Cytokins, z. B. die Verfahren, die in USSN 08/114 072, angemeldet am 30. August 1993, beschrieben sind; Verfahren zur Verwendung von Nabelschnur-Blutzellen, um eine Toleranz zu induzieren, z. B. die Verfahren, die in USSN 08/150 739 beschrieben sind; und Verfahren zur Induktion einer Toleranz, die in Sykes und Sachs, PCT/US 94/01616, angemeldet am 14. Februar 1994, beschrieben sind.
„Ein immunsuppressiver Wirkstoff, der in der Lage ist, Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu inaktivieren", wie er hier verwendet wird, ist ein Mittel, z. B. ein chemisches Mittel, z. B. ein Arzneistoff, der, wenn er in einer geeigneten Dosierung verabreicht wird, zur Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen führt. Beispiele solcher Mittel sind Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin. Anti-T-Zellen-Antikörper sind zur Verwendung als solche Mittel nicht bevorzugt, da sie vergleichsweise weniger wirksam sind, die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu inaktivieren. Ein Mittel sollte in einer ausreichenden Dosis verabreicht werden, so dass eine signifikante Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zustande kommt, die durch die Verabreichung eines Anti-T-Zellen-Antikörpers, z. B. eines Anti-ATG-Präparats, nicht inaktiviert werden. Mutmaßliche Mittel und geeignete Konzentrationen davon können durch in vitro- oder in vivo-Tests vorab durchgemustert werden, z. B. durch Verabreichen des mutmaßlichen Mittels an ein Versuchstier, Entnahme einer Probe von Thmyus- oder Lymphknotengewebe und Testen der Probe in einem in vitro- oder in vivo-Test auf das Vorliegen von aktiven T-Zellen. Solche vorab durchgemusterten mutmaßlichen Mittel können sodann in Transplantationstests noch weiter getestet werden.
„Eine kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Wirkstoff", wie sie hier eingesetzt wird, bedeutet eine vorübergehende, nicht chronische Behandlung. Die Behandlung sollte beginnen, bevor die Behandlung zur Induktion der Toleranz begonnen wird oder etwa zur gleichen Zeit damit, z. B. etwa zu der Zeit, in der xenogene, allogene, genetisch veränderte syngene oder genetisch veränderte autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden, z. B. kann die kurze Behandlung an dem Tag beginnen, an dem die Behandlung zur Induktion einer Toleranz begonnen wird, z. B. an dem Tag, an dem xenogene, allogene, genetisch veränderte syngene oder genetisch veränderte autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden, oder die kurze Behandlung kann innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach dem Einsetzen der Behandlung zur Induktion einer Toleranz begonnen werden, z. B. innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach dem Einführen von xenogenen, allogenen, genetisch veränderten syngenen oder genetisch veränderten autologen Stammzellen in den Empfänger. Die kurze Behandlung kann einen Zeitraum andauern, der gleich oder kürzer ist als etwa 8 bis 12 Tage, vorzugsweise etwa 10 Tage, oder einen Zeitraum, der etwa gleich oder kürzer ist als das Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfache des 8 bis 12 Tage oder 10 Tage umfassenden Zeitraums. Am besten dauert die kurze Behandlung etwa 30 Tage. Die Dosierung sollte ausreichend sein, um einen Blutspiegel aufrechtzuerhalten, der ausreichend ist, um Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu inaktivieren. Bei Primaten wurde gefunden, dass eine Dosierung von etwa 15 mg/kg/Tag wirksam ist.
Der hier verwendete Begriff „Lymphknoten- oder Thymus-T-Zellen" bezieht sich auf T-Zellen, die gegenüber einer Inaktivierung durch traditionelle Verfahren der T-Zell-Inaktivierung resistent sind, z. B. eine Inaktivierung durch eine einzelne intravenöse Verabreichung von Anti-T-Zellen-Antikörpern, z. B. Antikörpern, z. B. eines ATG-Präparats.
Der hier verwendete Begriff „Reduktion von Helferzellen" bedeutet die Reduktion von T-Zell-Helferzellen durch die Hemmung der Freisetzung von mindestens einem Cytokin, z. B. einem beliebigen Vertreter von IL-2, IL-4, IL-6, Gamma-Interferon oder TNF, aus T-Zellen des Empfängers zu der Zeit der ersten Exposition mit einem Antigen, gegenüber dem eine Toleranz gewünscht wird. Die Hemmung, die bei der T-Zell-Sekretion eines Cytokins des Empfängers induziert wird, muss ausreichend stark sein, so dass der Empfänger gegenüber einem Antigen tolerant gemacht wird, das während der Reduktion der Helferzellen verabreicht wird. Man will sich zwar auf keine bestimmte Theorie festlegen, nimmt jedoch an, dass das Ausmaß der Reduktion so groß ist, dass die anfängliche plötzliche Freisetzung von IL-2 im Wesentlichen verhindert wird, welche die erste Erkennung eines fremden Antigens begleitet, jedoch nicht alle reifen T-Zellen eliminiert, wobei diese Zellen zum Ausbilden und Produzieren einer Toleranz wichtig sein können.
„Ein Helferzellen reduzierender Wirkstoff", wie er hier verwendet wird, ist ein Wirkstoff, z. B. ein immunsuppressiver Wirkstoff, der zur Reduktion einer Cytokin-Freisetzung führt. Beispiele von Helferzellen reduzierenden Wirkstoffen sind Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin. Anti-T-Zellen-Antikörper sind zur Verwendung als Helferzellen reduzierende Wirkstoffe nicht bevorzugt, da sie T-Zellen eliminieren können. Ein Helferzellen reduzierender Wirkstoff muss in einer ausreichenden Dosis verabreicht werden, so dass ein Hemmniveau der Cytokin-Freisetzung erreicht wird, das zu einer Toleranz führt. Der Helferzellen reduzierende Wirkstoff sollte in Abwesenheit von Behandlungen verabreicht werden, welche die Freisetzung eines Cytokins, z. B. von IL-2, fördern. Mutmaßliche Helferzellen reduzierende Wirkstoffe können durch in vitro- oder in vivo-Tests vorab durchgemustert werden, z. B. indem der mutmaßliche Wirkstoff mit T-Zellen in Kontakt gebracht wird und die Fähigkeit der behandelten T-Zellen bestimmt wird, ein Cytokin, z. B. IL-2, freizusetzen. Die Hemmung der Cytokin-Freisetzung zeigt die Wirksamkeit des mutmaßlichen Wirkstoffs als ein Helferzellen reduzierender Wirkstoff an. Solche vorab durchgemusterten mutmaßlichen Wirkstoffe können sodann in einem Nierentransplantations-Test noch weiter getestet werden. In einem Nierentransplantations-Test wird ein mutmaßlicher Helferzellen reduzierender Wirkstoff auf Wirksamkeit getestet, indem der mutmaßliche Wirkstoff an einen Empfänger-Affen verabreicht wird und danach eine Niere aus einem Klasse-II übereinstimmenden, Klasse-I- und Neben-Antigen nicht übereinstimmenden Spender-Affen in den Empfänger implantiert wird. Eine Toleranz gegenüber der Spenderniere (die sich durch eine verlängerte Akzeptanz des Transplantats zeigt) zeigt an, dass der mutmaßliche Wirkstoff bei der getesteten Dosierung ein Helferzellen reduzierender Wirkstoff ist.
„Kurze Behandlung mit einem Helferzellen reduzierenden Wirkstoff", wie sie hier verwendet wird, bedeutet eine vorübergehende, nicht chronische Behandlung. Die Behandlung sollte vor der Transplantation des Transplantats oder etwa zur gleichen Zeit damit beginnen. Andererseits kann die Behandlung auch beginnen, bevor der Empfänger das erste Mal den Spender-Antigenen ausgesetzt wird, oder sie kann etwa zu diesem Zeitpunkt beginnen. Am besten entspricht die Dauer der Behandlung etwa dem Zeitraum, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden, oder sie ist kürzer als derselbe. Die Dauer der Behandlung kann auf einen Zeitraum ausgedehnt werden, der etwa gleich dem Zwei-, Drei-, Vier-, Fünf- oder Zehnfachen des Zeitraums ist, den eine reife T-Zelle der Empfängerart benötigten, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurde, oder er ist kürzer als dieser. Die Dauer wird normalerweise mindestens dem Zeitraum entsprechen, den reife T-Zellen der Empfängerart benötigen, um mit der Abstoßung eines Antigens zu beginnen, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert wurden. Bei Schweinen und Affen ist eine Behandlung von zwölf Tagen ausreichend. Experimente mit Cyclosporin A (10 mg/kg) bei Schweinen zeigen, dass sechs Tage nicht ausreichend sind. Andere Experimente mit Affen zeigen, dass IL-2, das am Tag 8, 9 oder 10 der Behandlung mit Cyclosporin A verabreicht wird, zur Abstoßung des transplantierten Gewebes führt. Somit sind 8, 9 oder 10 Tage bei Schweinen möglicherweise nicht ausreichend. Bei Affen ist eine Dosis von 10 mg/kg Cyclosporin mit einem Blutspiegel von etwa 500 bis 1000 ng/ml ausreichend, um eine Toleranz gegenüber Klasse-II übereinstimmenden, Klasse-I- und Neben-Antigen nicht übereinstimmenden Nieren zu induzieren. Der gleiche Blutspiegel von 500 bis 1000 ng/ml ist ausreichend, um bei Schweinen eine Toleranz zu induzieren. Eine langfristige Verabreichung von 5 mg/kg verhindert die Abstoßung (durch eine langfristige Immunsuppression), führt jedoch nicht zu einer Toleranz.
Der hier verwendete Begriff „Toleranz" bezieht sich auf die Hemmung der Immunantwort des Empfängers eines Transplantats, die anderenfalls z. B. als Antwort auf die Einführung eines Nicht-Selbst-MHC-Antigens in den Empfänger stattfinden würde. Eine Toleranz kann humorale, zelluläre oder sowohl humorale als auch zelluläre Antworten umfassen.
Der hier verwendete Begriff „hämatopoetische Stammzelle" bezieht sich auf eine Zelle, z. B. eine Knochenmarkzelle, die in der Lage ist, sich zu einer reifen myeloiden und/oder lymphoiden Zelle zu entwickeln. Stammzellen, die aus dem Nabelschnurblut des Empfängers oder des Spenders stammen, können in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden. Vgl. das US-Patent 5 192 553. Die vorliegende Erfindung enthält nicht die Verwendung von menschlichem Embryomaterial.
Der hier verwendete Begriff „MHC-Antigen" bezieht sich auf ein Proteinprodukt eines oder mehrerer MHC-Gene; der Begriff umfasst Fragmente oder Analoga von Produkten von MHC-Genen, die in einem Empfängerorganismus eine Immunantwort hervorrufen können. Beispiele von MHC-Antigenen umfassen die Produkte (und Fragmente oder Analoga davon) der menschlichen MHC-Gene, d. h. der HLA-Gene. MHC-Antigene beim Schwein, z. B. beim Miniaturschwein, umfassen die Produkte (und Fragmente oder Analoga davon) der SLA-Gene, z. B. des DRB-Gens.
Der hier verwendete Begriff „Miniaturschwein" bezieht sich auf ein vollständiges oder teilweises Inzucht-Tier.
Der hier verwendete Begriff „Transplantat" bezieht sich auf einen Körperteil, ein Organ, ein Gewebe oder auf Zellen. Transplantate können bestehen aus Organen, z. B. Leber, Niere, Herz oder Lunge; aus Körperteilen, z. B. Knochen oder Skelettmatrix; aus Gewebe, z. B. Haut, Eingeweide, endokrinen Drüsen; oder aus Vorläufer-Stammzellen der verschiedenen Typen.
Der hier verwendete Begriff „eine Kombination diskordanter Arten" bezieht sich auf zwei Arten, bei denen eine hyperakute Abstoßung auftritt, wenn ein Transplantat von der einen Art auf die andere Art transplantiert wird. Im Allgemeinen sind diskordante Arten Vertreter unterschiedlicher Ordnungen, während nicht-diskordante Arten zur gleichen Ordnung gehören. Z. B. sind Ratten und Mäuse nicht-diskordante Arten, d. h. ihre MHC-Antigene sind im Wesentlichen ähnlich, und sie sind Mitglieder der gleichen Ordnung, der Nagetiere.
Der hier verwendete Begriff „Stromagewebe" bezieht sich auf das Stützgewebe oder die Matrix eines Organs, im Unterschied zu seinen funktionellen Elementen oder zu seinem Parenchym.
Die Helferzellen supprimierenden Verfahren der Erfindung verhindern die unerwünschten Nebenwirkungen einer langfristigen oder chronischen Verabreichung von Immunsuppressiva mit einem breiten Spektrum, die häufig bei Transplantationen eingesetzt werden. Arzneistoffe, wie Prednison, Imuran, CyA und kürzlich FK-506, die langfristig oder chronisch verabreicht werden, gaben auf dem Gebiet der Transplantation eine entscheidenden Anstoß. Jedoch lösen alle diese Arzneistoffe eine unspezifische Suppression des Immunsystems aus, die entsprechend eingestellt werden muss, so dass zwar eine Abstoßung verhindert wird, die Immunfunktion jedoch nicht vollständig ausgeschaltet wird. Patienten, die für den Rest ihres Lebens mit einer chronischen immunsuppressiven Therapie behandelt werden müssen, sehen sich ernsten Komplikationen ausgesetzt, die durch eine zu starke oder zu schwache Immunsuppression zustande kommen können, wodurch eine Infektion bzw. eine Abstoßung ausgelöst werden kann. Die Helferzellen supprimierenden Verfahren der Erfindung beruhen auf der Verabreichung einer vorübergehenden, kurzzeitigen, hochdosierten Helferzellen reduzierenden Behandlung.
Die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen des Empfängers sind für eine signifikante Resistenz gegenüber implantierten Transplantaten verantwortlich, z. B. gegenüber transplantierten hämatopoetischen Zellen oder transplantierten Organen. Es wurde gefunden, dass die üblichen Verfahren der Entfernung oder Inaktivierung von T-Zellen, z. B. die Verabreichung von gegen T-Zellen gerichteten Antikörpern, häufig das optimale Ausmaß der Entfernung oder Inaktivierung von T-Zellen knapp verfehlen. Insbesondere versagen solche Verfahren dabei, ein optimales Ausmaß der Entfernung oder Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen bereitzustellen. Die Verfahren der Erfindung, bei denen der Empfänger eine kurzzeitige Behandlung mit einem Immunsuppressivum, z. B. mit Cyclosporin, erhält, das in der Lage ist, die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen des Empfängers zu inaktivieren, führen zu einer gründlicheren Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen und somit zu einer verbesserten Akzeptanz des transplantierten Gewebes.
Die Retrovirus-Methoden der Erfindung ermöglichen die Rekonstitution des Knochenmarks des Transplantat-Empfängers mit transgenen autologen Knochenmarkzellen, die allogene oder xenogene MHC-Gene exprimieren. Die Expression der transgenen MHC-Gene verleiht eine Toleranz gegenüber Transplantaten, welche die Produkte dieser oder nah verwandter MHC-Gene präsentieren. Somit stellen diese Verfahren die Induktion einer spezifischen Transplantationstoleranz durch einen somatischen Transfer von MHC-Genen bereit. Durch die Retrovirus-Methoden der Erfindung werden die unerwünschten Nebenwirkungen der Breitspektrum-Immunsuppressiva vermieden, die häufig bei Transplantationen eingesetzt werden.
Eine Toleranz gegenüber Transplantationsantigenen kann anhand der Induktion eines lymphohämatopoetischen Chimärismus durch eine Knochenmark-Transplantation (BMT) erreicht werden. Eine BMT über die MHC-Grenzen hinweg birgt zwei Hauptrisiken: wenn die reifen T-Zellen nicht aus dem Mark-Inokulum entfernt werden, kann es sein, dass der Empfänger eine schwere Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD) ausbildet; eine Entfernung dieser Zellen führt häufig zu einem Versagen beim Anwachsen des Transplantats. Die Retrovirus-Verfahren der Erfindung, die durch eine Rekonstitution des Knochenmarks des Empfängers mit autologen (im Gegensatz zu allogenen oder heterologen) Knochenmarkzellen eine spezifische Toleranz induzieren, machen es möglich, dass eine Toleranz mit einem minimalen Risiko einer GVHD bereitgestellt wird, wobei nur ein minimaler Bedarf besteht, die T-Zellen aus dem Mark-Inokulum zu entfernen.
Die Retrovirus-Verfahren der Erfindung können mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Suppression von Helferzellen und zur Inaktivierung von T-Zellen kombiniert werden, um die Akzeptanz eines Transplantats zu verlängern.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Transplantation von hämatopoetischen Zellen werden die unerwünschten Nebenwirkungen von Breitspektrum-Immunsuppressiva vermieden, die häufig bei Transplantationen eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Transplantation von hämatopoetischen Zellen können mit den Verfahren der Erfindung zur Suppression von Helferzellen und zur Entfernung von T-Zellen kombiniert werden, um die Akzeptanz eines Transplantats zu verlängern.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden genauen Beschreibung und aus den Patentansprüchen ersichtlich.
Genaue Beschreibung
Zuerst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
Zeichnungen
In 1 ist das Retrovirus-Konstrukt GS4.5 schematisch dargestellt.
In 2 sind das Provirus-Genom GS4.5 und die erwarteten Transkripte schematisch dargestellt.
Die 3a und 3b sind Darstellungen des durchflusscytometrischen Profils von transduzierten Zellen.
In 4 ist der Transduktionstest schematisch dargestellt.
In 5 sind die genetischen Karten der Stämme C57/BL/10, B10.AKM und B10.MBR schematisch dargestellt.
6 ist eine Darstellung des FACS-Profils von Milzzellen aus einem Empfänger eines transduzierten Knochenmarks.
In den 7a und 7b ist das Überleben gegen die Zeit von Experimenten mit Hauttransplantaten graphisch dargestellt.
In den 8a bis d sind die FACS-Analysen von Thymocyten aus Transplantat abstoßenden Organismen und aus Kontrollen graphisch dargestellt.
In 9 ist der Vektor N2-B19-H2b schematisch dargestellt.
Übersicht
Die Erfindung stellt mehrere Verfahren zur Induktion einer Toleranz gegenüber fremden Antigenen bereit, z. B. gegenüber Antigenen auf allogenen oder xenogenen Gewebe- oder Organtransplantaten. Diese Verfahren können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Z. B. wurde entdeckt, dass eine kurzzeitige Verabreichung eines Helferzellen reduzierenden Wirkstoffs, z. B. eine kurze, hochdosierte Behandlung mit Cyclosporin A (CsA), die Akzeptanz eines Transplantats signifikant verlängert. (Vorzugsweise verhindert das Helferzellen reduzierende Behandlungsschema der Erfindung im Wesentlichen die anfängliche plötzliche Freisetzung von IL-2, welche die erste Erkennung eines Antigens begleitet, jedoch eliminiert es nicht die reifen T-Zellen. Dies unterscheidet sich von den Behandlungen mit Anti-T-Zellen-Antikörpern, durch die reife T-Zellen entfernt werden).
Außerdem wurde entdeckt, dass eine kurze Behandlung mit einem Immunsuppressivum, z. B. mit Cyclosporin, verwendet werden kann, um T-Zellen zu inaktivieren, die anderenfalls die Abstoßung eines Transplantats fördern würden.
Im nachstehenden Abschnitt I werden Experimente beschrieben, die die Wirkung einer durch Cyclosporin induzierten Toleranz gegenüber Nieren-Allotransplantaten bei Primaten zeigen. Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Suppression von Helferzellen können mit anderen Verfahren kombiniert werden, um die Transplantat-Akzeptanz zu verlängern. Im nachstehenden Abschnitt II wird die Transplantation von Retrovirus transformierten Knochenmarkzellen diskutiert, wodurch eine Toleranz gegenüber einer MHC-Disparität induziert wird. Dieses Verfahren kann mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Suppression von Helferzellen kombiniert werden, z. B. einer kurzen Verabreichung von hochdosiertem Cyclosporin, um eine Toleranz gegenüber Klasse-I- und anderen Neben-Disparitäten zu induzieren.
Im nachstehenden Abschnitt III wird die Transplantation von Knochenmarkzellen diskutiert, um eine Toleranz gegenüber einer MHC-Disparität zu induzieren. Dieses Verfahren kann mit einer kurzen Behandlung mit einem hochdosierten Cyclosporin kombiniert werden, um eine Toleranz gegenüber Klasse-I- und anderen Neben-Disparitäten zu induzieren. Eine kurze Verabreichung von Cyclosporin zum Entfernen von T-Zellen kann auch mit einem Knochenmark-Transplantat kombiniert werden.
I. Eine kurze, nach der Transplantation erfolgte Behandlung mit hochdosiertem Cyclosporin (verabreicht in Abwesenheit von Mitteln, die eine Cytokin-Freisetzung stimulieren) verlängert die Akzeptanz von teilweise übereinstimmenden Allotransplantaten in Primaten
Nierentransplantationen wurden zwischen Cynomolgus-Affen durchgeführt, wobei diese mit oder ohne eine kurze Behandlung mit einer T-Zell-Helferzelleneliminierenden Immunsuppression in Form einer kurzen Behandlung mit hochdosiertem Cyclosporin erfolgten. Dieses Schema verlängerte signifikant die Akzeptanz der Transplantate. Die Affen, die nach der Transplantation eine Behandlung mit dem hochdosierten Cyclosporin (ohne Prednison) erhielten, waren gegenüber den Nierentransplantaten aus den MLC-(gemischte Lymphocytenkultur-Test)nicht-reaktiven, Klasse-I- und Neben-Antigen nicht übereinstimmenden Spendern länger als 65 Tage tolerant, vgl. nachstehend. Die Affen, die nach der Transplantation kein Cyclosporin erhielten, stießen die Transplantate mit der gleichen Disparität in weniger als 20 Tagen ab. Diese Arbeit wird nachstehend noch ausführlicher besprochen.
Tiere: Cynomolgus-Affen wurden von den Charles River Research Laboratories bezogen. Die Tiere wurden unter Quarantäne gestellt, auf ein ganzes Spektrum von Krankheitserregern getestet und danach in Räumen mit kontrollierter Umgebung genau nach den Vorschriften des NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals, in einer AAALAC-anerkannten Einrichtung gehalten.
Typisierung: Die Tiere wurden durch einen herkömmlichen Komplementvermittelten Cytotoxizitäts-Test auf Klasse-I-Antigene und durch MLC-Nicht-Reaktivität auf Klasse-II-Übereinstimmung typisiert.
Immunsuppression: Ein intravenöses Präparat von CsA (Sandimmune, i. v.) wurde von Sandoz Pharmaceuticals Corporation, Hanover, N. J., bezogen. Die Affen erhielten 12 Dosen von etwa 10 mg/kg, wobei die erste Dosis vier Stunden vor der Revaskularisierung des Transplantats verabreicht wurde. Das CsA wurde in 250 ml einer normalen Kochsalzlösung verdünnt und innerhalb von einer Stunde intravenös infundiert. Das CsA wurde ohne andere immunsuppressive Wirkstoffe verabreicht. Die Dauer der Therapie betrug 12 Tage. Die geeignete Dosierung in Schweinen beträgt etwa 15 mg/kg, intramuskulär verabreicht. Die Dosierung sollte in jedem Tier so erfolgen, dass ein Blutspiegel von etwa 500 bis 1000 ng/ml aufrechterhalten bleibt.
Nierenfunktion, Abstoßung und Pathologie: Die Nierenfunktion wurde anhand der Kreatinin- und BUN-Spiegel im Serum verfolgt. Die Pathologie wurde anhand von Biopsien ermittelt. Die Biopsien wurden am Tag 7, danach zwei Monate lang wöchentlich und anschließend monatlich durchgeführt.
Ergebnisse: Die Kontrollempfänger (kein Cyclosporin) stießen die transplantierten Nieren in weniger als 15 Tagen ab. Die Ergebnisse mit sechs Cyclosporin behandelten Tieren waren wie folgt: Tier 1 verendete am Tag 65 (d. h. 65 Tage nach der Transplantation), wobei das Transplantat abgestoßen wurde (es sollte beachtet werden, dass die Blutspiegel von Cyclosporin bei diesem Tier während der ersten sieben Tage nach der Transplantation unter 500 ng/ml lagen); Tier 2 verendete am Tag 65 aufgrund einer bei einer Biopsie aufgetretenen Blutung, wobei die transplantierte Niere zum Zeitpunkt des Todes normal war; Tier 3 verendete am Tag 82, wobei am Tag 55 eine gewisse Abstoßung zu sehen war; Tier 4 war am Tag 70 noch normal (zu diesem Zeitpunkt lief das Experiment noch); Tier 5 war am Tag 40 noch normal (zu diesem Zeitpunkt lief das Experiment noch); und Tier 6 war am Tag 26 noch normal (zu diesem Zeitpunkt lief das Experiment noch).
II. Eine kurze Verabreichung von hochdosiertem Cyclosporin (verabreicht in Abwesenheit von Behandlungen, welche die Freisetzung von Cytokinen stimulieren, z. B. in Abwesenheit von Prednison) zur Induktion einer Toleranz gegenüber Klasse-I- und anderen Neben-Disparitäten in Kombination mit einer Implantation von Retrovirus transformierten Knochenmarkzellen zur Induktion einer Toleranz gegenüber einer Klasse-II-Disparität
Retrovirus-Transformation
Die Retrovirus-Transformation macht es möglich, das Knochenmark eines Transplantat-Empfängers mit transgenen Knochenmarkzellen, vorzugsweise mit autologen Knochenmarkzellen, die allogene oder xenogene MHC-Gene exprimieren, zu rekonstituieren. Die Expression der transgenen MHC-Gene verleiht eine Toleranz gegenüber den Transplantaten, welche die Produkte dieser oder nah verwandter MHC-Gene präsentieren. Somit stellen diese Verfahren durch eine somatische Übertragung von MHC-Genen die Induktion einer spezifischen Toleranz gegenüber Transplantaten bereit. Die retrovirale Einführung von MHC-Genen kann alleine oder in Kombination mit den hier beschriebenen Verfahren zur Reduktion der T-Zellen-Helferzellen eingesetzt werden. Diese Vorgehensweise wird nachstehend ausführlich beschrieben.
MHC-Gene: Die MHC-Gene wurden für eine Vielzahl von Arten bereits gründlich aufgeklärt. Z. B. wurden die HLA-Gene des Menschen, vgl. z. B. Hansen et al., 1989, „The Major Histocompatibility Complex", in: Fundamental Immunology, 2. Aufl., W. E. Paul, Hrsg., Raven Press Ltd., New York, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, und die SLA-Gene des Schweins, vgl. z. B. Sachs et al., 1988, Immunogenetics 28: 22–29, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, cloniert und charakterisiert.
Ein Gen, das ein MHC-Antigen codiert, kann in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden, um eine Toleranz gegenüber einem Transplantat zu verleihen, welches dieses oder ein nah verwandtes MHC-Antigen präsentiert. Die Verfahren der Erfindung können eingesetzt werden, um eine Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten bereitzustellen, wobei z. B. sowohl der Spender des Transplantats als auch der Empfänger Menschen sind, und um eine Toleranz gegenüber xenogenen Transplantaten bereitzustellen, wobei z. B. der Spender des Transplantats ein nicht menschliches Tier, z. B. ein Schwein, z. B. ein Miniaturschwein, und der Empfänger des Transplantats ein Mensch ist.
Das Individuum, welches die MHC-Gene liefert, sollte dem Individuum, welches das Transplantat liefert, genetisch so ähnlich wie möglich sein, insbesondere bezüglich der MHC-Gene. Z. B. ist es bei allogenen Transplantaten, wobei sowohl der Spender des Implantats als auch der Empfänger des Implantats ein Mensch ist, bevorzugt, MHC-Gene vom Spender zu verwenden. In dieser Ausführungsform können MHC-Sonden, z. B. eine Sonde aus einer dritten Person oder eine synthetische Consensus-Sonde, eingesetzt werden, um eine DNA zu isolieren, die das MHC-Gen oder die MHC-Gene des Spenderindividuums des Implantats codiert. Hierdurch wird die engste Übereinstimmung zwischen den Genen, die zur Bereitstellung der Toleranz verwendet werden, und den Genen möglich, die die MHC-Antigene auf dem Transplantat exprimieren.
Bei xenogenen Transplantaten sollte es sich bei dem Implantat-Spenderindividuum und bei dem Individuum, das die Toleranz verleihende DNA liefert, um dasselbe Individuum handeln, oder die Individuen sollten so nah verwandt wie möglich sein. Z. B. ist es bevorzugt, Transplantatgewebe von einer Kolonie von Spendern zu gewinnen, bei der eine hochgradige Inzucht besteht, und die, stärker bevorzugt, für die MHC-Gene homozygot ist. Hierdurch wird es möglich, dass die einzelne clonierte MHC-Sequenz für viele Transplantat-Empfänger verwendet wird.
Transformation von Knochenmarkzellen: MHC-Gene können in Knochenmarkzellen durch beliebige Verfahren eingeführt werden, durch die eine Expression dieser Gene mit einer Rate und für einen Zeitraum ermöglicht wird, die ausreichend sind, um eine Toleranz zu verleihen. Diese Verfahren umfassen z. B. die Transfektion, Elektroporation, den Beschuss mit einer Partikelkanone und die Transduktion durch virale Vektoren, z. B. durch Retroviren.
Rekombinante Retroviren sind ein bevorzugtes Freisetzungssystem. Sie wurden in den letzten Jahren als Vehikel für den Gentransfer entwickelt und intensiv erforscht, vgl. z. B. Eglitis et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 19. Das einfachste Retrovirus-Vektorkonstrukt ist ein solches, in dem die Strukturgene des Virus durch ein einzelnes Gen ersetzt werden, das dann unter der Kontrolle der in der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Virus enthaltenen regulatorischen Elemente transkribiert wird. Die verschiedensten Einzelgen-Vektor-Grundgerüste wurden schon eingesetzt, umfassend das murine Moloney-Leukämievirus (MoMuLV). Von diesem Typ von Grundgerüst können Retrovirus-Vektoren hergeleitet werden, die mehrere Insertionen unterschiedlicher Gene, z. B. eines Gens für einen selektierbaren Marker und eines zweiten Gens von Interesse, unter der Kontrolle eines inneren Promotors möglich machen, vgl. z. B. Gilboa, 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 29.
Die Elemente für die Konstruktion von Vektoren für die Expression eines Proteinprodukts sind dem Fachmann bekannt, z. B. die Auswahl der richtigen Promotoren. Die effizienteste Expression aus Retrovirus-Vektoren lässt sich feststellen, wenn zur Steuerung der Transkription „starke" Promotoren eingesetzt werden, z. B. der SV40-Promotor oder die LTR-Promotoren, eine Übersicht hiervon findet sich in Chang et al., 1989, Int. J. Cell Cloning 7: 264. Diese Promotoren sind konstitutiv und erlauben im Allgemeinen keine gewebespezifische Expression. Im Fall der Klasse-I-Gene, die normalerweise in allen Geweben exprimiert werden, ist jedoch eine ubiquitäre Expression aus funktionellen Gründen akzeptabel. Die Promotoren von Haushaltsgenen, z. B. der Promotor der Thymidinkinase, sind geeignete Promotoren für die Expression von Klasse-II-Genen.
Durch die Verwendung effizienter Verpackungszelllinien können sowohl die Effizienz als auch das Spektrum der Infektiosität der produzierten rekombinanten Viren gesteigert werden, vgl. Miller, 1990, Human Gene Therapy 1: 5. Murine Retrovirus-Vektoren eigneten sich für eine effiziente Übertragung von Genen in murine embryonale Zellen, vgl. z. B. Wagner et al., 1985, EMBO J. 4: 663; Griedley et al., 1987, Trends Genet. 3: 162; und in hämatopoetische Stammzellen, vgl. z. B. Lemischka et al., 1986, Cell 45: 917–927; Dick et al., 1986, Trends in Genetics 2: 165–170.
Eine kürzliche Verbesserung in der Retrovirus-Technologie, mit der viel höhere Virustiter erreicht werden können als es früher möglich war, umfasst eine Amplifikation durch eine fortlaufende Übertragung zwischen ecotropen und amphotropen Verpackungszelllinien, das sogenannte „Ping-Pong"-Verfahren, vgl. z. B. Kozak et al., 1990, J. Virol. 64: 3500–3508; Bodine et al., 1989, Prog. Clin. Biol. Res. 319: 589–600.
Die Effizienz der Transduktion kann durch eine Vorselektion des infizierten Marks vor dem Einführen in die Empfänger gesteigert werden, wobei es auf diejenigen Knochenmarkzellen angereichert wird, die hohe Spiegel des selektierbaren Gens exprimieren, vgl. z. B. Dick et al., 1985, Cell 42: 71–79; Keller et al., 1985, Nature 318: 149–154. Außerdem wird es durch die kürzlich eingeführten Verfahren zur Steigerung der Virustiter möglich, dass eine effiziente Transduktion auch erreicht werden kann, indem Virus enthaltende Überstände verwendet werden, anstatt dass eine direkte Inkubation mit den Virus produzierenden Zelllinien erfolgen muss, vgl. z. B. Bodine et al., 1989, Prog. Clin. Biol. Res. 319: 589–600. Da die Replikation der zellulären DNA für die Integration der Retrovirus-Vektoren ins Wirtsgenom erforderlich ist, kann es wünschenswert sein, die Frequenz zu erhöhen, mit der die Ziel-Stammzellen aktiv den Zyklus durchlaufen, z. B. indem die Zielzellen induziert werden, sich durch eine in vitro-Behandlung mit Wachstumsfaktoren zu teilen, vgl. z. B. Lemischka et al., 1986, Cell 45: 917–927, wobei eine Kombination von IL-3 und IL-6 offensichtlich die größte Wirksamkeit zeigt, vgl. z. B. Bodine et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 8897–8901, oder indem der Empfänger 5-Fluorouracil ausgesetzt wird, vgl. z. B. Mori et al., 1984, Jpn. J. Clin. Oncol. 14, Erg. 1: 457–463, und zwar vor der Ernte des Marks, vgl. z. B. Lemischka et al., 1986, Cell 45: 917–927; Chang et al., 1989, Int. J. Cell Cloning 7: 264–280.
N2A oder andere auf Moloney basierende Vektoren stellen bevorzugte Retrovirus-Vektoren für die Transduktion menschlicher Knochenmarkzellen dar.
Vorbereitendes Behandlungsschema, das bei der Einführung transformierter Knochenmarkzellen erforderlich ist: Wenn ein Empfänger auf Knochenmarkzellen vorbereitet wird, muss seine Immunantwort ausgeschaltet werden, die ansonsten möglicherweise ein Einwachsen des Transplantat verhindern würde.
Die vorbereitenden Behandlungsschemata, die erforderlich sind, um ein Einwachsen modifizierter autologer hämatopoetischer Stammzellen möglich zu machen, sind vermutlich viel weniger toxisch als die Verfahren, die für eine allogene Knochenmark-Transplantation erforderlich sind – wobei vorzugsweise lediglich die Entfernung von reifen T-Zellen anhand von monoclonalen Antikörpern erforderlich ist, wie kürzlich in einem Mausmodell gezeigt wurde, vgl. Sharabi et al., 1989, J. Exp. Med. 169: 493–502. Es ist möglich, dass eine vorübergehende Expression ausreichend sein kann, um eine Toleranz zu induzieren, die sodann durch das Transplantat aufrechterhalten wird, auch wenn die Expression auf den hämatopoetischen Zellen verloren gegangen ist, wie bei Herztransplantaten in einem gemischten xenogenen Knochenmark-Transplantationsmodell festgestellt wurde, vgl. Ildstad et al., 1985, Transplant. Proc. 17: 535–538.
Transplantation und Reduktion von Helferzellen: Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Reduktion von Helferzellen können zusammen mit einer Transplantation des Transplantats verabreicht werden, wie vorstehend beschrieben.
Länger anhaltende Expression eines Klasse-II-Gens des Schweins in murinen Knochenmark-Hämatopoesezellen durch einen Retrovirus-vermittelten Gentransfer
Übersicht: Die Wirksamkeit eines Gentransfers zur Induktion einer Transplantationstoleranz in einem Miniaturschwein-Modell wurde gezeigt, indem Retrovirus-Vektoren in Doppelkopie verwendet wurden, die so konstruiert waren, dass sie einen Arzneistoffresistenz-Marker (Neomycin) und eine Klasse-II-DRB-cDNA des Schweins exprimierten. Infektiöse Partikel, die diese Vektoren enthielten, wurden mit einem Titer von > 1 × 10⁶ G418-resistenten koloniebildenden Einheiten pro ml produziert, wobei sowohl ecotrope als auch amphotrope Verpackungszelllinien verwendet wurden. Die durchflusscytometrische Analyse von DRA-transfizierten murinen Fibroblasten, die anschließend mit Virus enthaltenden Überständen transduziert wurden, zeigte, dass die übertragenen Sequenzen ausreichend waren, um eine DR-Oberflächenexpression hervorzubringen. Die gemeinsame Kultivierung eines murinen Knochenmarks mit Hochtiter-Erzeugerlinien führt zur Transduktion von 40% der Granulocyten/Makrophagen koloniebildenden Einheiten (KBE-GM); dies wurde durch die Häufigkeit der Koloniebildung unter G418-Selektion bestimmt. Nach fast fünf Wochen in der langfristigen Knochenmarkkultur enthielt das Virus exponierte Mark immer noch G418-resistente KBE-GM, und zwar mit einer Häufigkeit von 25%. Außerdem enthielten im Wesentlichen alle transduzierten und selektierten Kolonien DRB-spezifische Transkripte. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein signifikanter Teil von sehr primitiven myelopoetischen Vorläuferzellen mit dem DRB-rekombinanten Vektor transduziert werden kann und dass die Vektorsequenzen in der differenzierten Nachkommenschaft dieser Zellen exprimiert werden. Diese Experimente werden nachstehend noch ausführlich beschrieben.
Konstruktion und Durchmusterung von SLA-DRB-rekombinanten Retroviren: Wie beim Menschen, vgl. Lee et al., 1982, Nature 299: 750–752; Das et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3543–3547, ist die Sequenz des DRA-Gens des Schweins minimal polymorph. Deshalb sollte die Transduktion von allogenen DRB-cDNAs in Knochenmarkzellen ausreichend sein, um eine Expression von allogenen Klasse-II-DR-Molekülen auf den Zellen zu ermöglichen, die zur Expression dieses Antigens bestimmt sind.
Einzelheiten von Retrovirus-Konstrukten sind in 1 dargestellt. Zwei Typen von Retrovirus-Konstrukten, GS4.4 und GS4.5, wurden hergestellt. Das Schema in 1 zeigt das Retrovirus-Konstrukt GS4.5. Die Pfeile in 1 geben jeweils die Richtung der Transkription an. In GS4.5 ist die Richtung der DRB-cDNA-Transkription die gleiche wie bei der Virustranskription. In GS4.4 (nicht dargestellt) wurden der TK-Promotor und die DRB-cDNA in die 3'-LTR von N2A in umgekehrter Transkriptionsrichtung, bezogen auf die Virustranskription, eingefügt, und das 3'-RNA-Prozessierungssignal des Affenvirus 40 wurde angefügt. pBSt bezieht sich auf die Bluescript-Vektorsequenz (Stratagene). Der Promotor der Thymidinkinase (TK) war innerhalb des aus 215 Basenpaaren (bp) bestehenden PvuII-PstI-Fragments aus dem TK-Gen des Herpes-simplex-Virus enthalten, vgl. McKnight, 1980, Nucleic Acids Res. 8: 5949–5964. Das 3'-RNA-Prozessierungssignal des Affenvirus 40 war innerhalb des 142 bp großen HpaI-SmaI-Fragments des Plasmids pBLCAT3 enthalten, vgl. Luckow et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 5490–5497, (vgl. 1). Die Sequenzanalyse der Übergänge des Promotors, der Klasse-II-cDNA und der Vektorsequenzen bestätigte, dass die Elemente der Konstrukte richtig ligiert waren.
Diese Retrovirus-Konstrukte wurden in die amphotrope Verpackungszelllinie PA317 transfiziert, und die Transfektanten wurden in einem G418 enthaltenden Medium selektiert. Insgesamt 24 und 36 Clone, die mit den rekombinanten Plasmiden GS4.4 bzw. GS4.5 transfiziert waren, wurden durch PEG-Fällung von Kulturüberständen und Slot-Blot-Analyse der Virus-RNA getestet. Von diesen wurde bei 8 bzw. 12 Clonen gefunden, dass sie für DRB positiv waren, wobei jedoch das DRB-Signal bei den aus GS4.4 hergeleiteten Clonen durchweg schwächer war. Die Analyse von genomischen und gespleißten Transkripten aus GS4.5-Zellen durch eine Dot-Blot-Analyse von PEG gefällten Partikeln zeigte in den verschiedenen, durch GS4.5 transfizierten Clonen eine Heterogenität unter den Virustranskripten. In einem Experiment enthielten zwei Clone DRB⁺/Neo⁺-Virus-RNA, zwei enthielten DRB⁺/Neo^–-RNA, zwei enthielten DRB^–/Neo⁺-RNA und einer zeigte kein Klasse-II- oder Neo-Signal. Die Bestimmung des Titers der G418-Resistenz (G418^r) der Überstände von den DRB-positiven Clonen bestätigte, dass der durchschnittliche Titer, der durch die mit GS4.5 transfizierten Clone erzeugt wurde (10³ bis 10⁴ KBE/ml), signifikant höher war als der Titer der GS4.4 transfizierten Clone (10² bis 10³ KBE/ml). Deshalb wurden die weiteren Transduktionsexperimente mit dem besten Clon durchgeführt, der CS4.5 C4 genannt wurde und einen anfänglichen G418^r-Titer von 3 × 10⁴ KBE/ml erzeugte.
Die Plasmidherstellung, die Clonierungsverfahren, die DNA-Sequenzierung, die RNA-Präparationen, Northern-Blots und RNA-Slot-Blots wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt, vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor). Die letzten Waschgänge der Blots erfolgten in 0,1 × SSPE (1 × SSPE = 0,18 M NaCl/10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM EDTA), 30 Min. bei 60°C.
Die Verpackungszelllinien PA317, Miller et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2895–2902, GP+E-86, Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62: 1120–1124, psiCRIP, Danos et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464, und ihre Derivate wurden bei 37°C in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; GIBCO) mit 10% (Vol./Vol.) fetalem Rinderserum (CELLect Silver; Flow Laboratories) gehalten, das mit 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (Whittaker Bioproducts) und den Antibiotika Penicillin (5 Einheiten/ml) und Streptomycin (5 μg/ml) angereichert war.
Erhöhen des Virustiter des Clons C4: Da kürzlich erhaltene Ergebnisse zeigten, dass Überstände, die hohe Retrovirus-Titer enthielten, die besten Kandidaten für die Transduktion von Knochenmarkzellen waren, vgl. Bodine et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738–3742, wurde der Titer des Produzenten-Clons C4 durch eine „Ping-Pong"-Amplifikation erhöht, vgl. Bestwick et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5404–5408. Der Überstand von beinahe konfluenten C4-Kulturen wurde eingesetzt, um die ecotropen Verpackungszellen GP+E-86 zu transduzieren, anschließend erfolgte eine G418-Selektion. 48 Clone wurden isoliert und durch PEG-Fällung auf die Produktion von Viruspartikeln durchgemustert. Die Überstände von 18 dieser Clone erwiesen sich bei der Dot-Blot-Analyse der Virus- RNA als DRB-positiv und zeigten G418^r-Titer zwischen 0,5 und 3,5 × 10⁴ KBE/ml. Anschließend wurde ein positiver Clon durch die Ping-Pong-Technik mit der amphotropen Hygromycin-resistenten Verpackungslinie psiCRP amplifiziert. Die Überstände von 48 Hygromycin-resistenten Clonen wurden durch eine PEG-Fällung auf das Vorliegen einer DRB-positiven Virus-RNA getestet, außerdem wurden ihre G418^r-Titer bestimmt. Alle diese Clone erwiesen sich bei der Dot-Blot-Analyse mit den DRB-Sonden als positiv und erzeugten Titer zwischen 1 × 10⁵ und 1 × 10⁷ KBE/ml. Der amphotrope Clon GS4.5 A4, der den höchsten Titer erzeugte, wurde durch den S⁺L^–-Test auf das Vorliegen eines Helfervirus getestet. Dabei wurde kein Replikations-kompetentes Helfervirus nachgewiesen.
Eine Amplifikation des Virustiters wurde durch das Ping-Pong-Verfahren erreicht. Da es Hinweise darauf gibt, dass die Verpackungszellen psiCRIP weniger dazu neigen, Helferviren zu produzieren, als PA317, wenn man bestimmte Typen von Vektoren einsetzt, vgl. Miller, 1990, Hum. Gene Therapy 1: 5–14, wurden rekombinante DRB-Virionen hergestellt, indem die Produzenten-Kombination psiCRIP/GP-E-86 eingesetzt wurde. Damit wurden Titerwerte von mehr als 1 × 10⁷ KBE/ml erhalten, wobei keine amphotropen Helferviren nachweisbar waren, dies bestätigt, dass mit dieser Strategie sichere Viruspartikel produziert wurden, die für in vivo-Experimente geeignet waren.
Die Northern-Blot-Analyse der GS4.5 produzierenden Clone C4, A9 und A4, die jeweils von einer unterschiedlichen Verpackungszelllinie stammten, zeigte ein konserviertes Hybridisierungsmuster. Dabei wurden RNA-Spezies, die dem Virusgenom der ganzen Länge, dem gespleißten Neo-Transkript und der DRB-Transkriptionseinheit entsprachen, zusammen mit weiteren RNA-Spezies festgestellt. Die in diesen Experimenten festgestellten hochmolekularen Spezies können möglicherweise ein Durchlese-Transkript konstituieren, das vom TK-Promotor aus beginnt und in der anderen langen terminalen Wiederholung (LTR) endet. Im Gegensatz zu vielen der durch Transfektion erhaltenen Virion produzierenden Clone die fehlerhafte DRB-Transkripte präsentierten, zeigten diejenigen, die durch Transduktion erhalten wurden, stabile DRB-Hybridisierungsmuster; dies legt nahe, dass während der Amplifikationsprozedur keine Rekombinationsereignisse stattfanden.
Die Retrovirus-Titer wurden wie folgt bestimmt. Replikations-defekte Retroviruspartikel wurden aus Verpackungszelllinien hergestellt, die anfangs mit einem rekombinanten Konstrukt transfiziert wurden, wobei das herkömmliche Verfahren der Calciumphosphat-Fällung eingesetzt wurde, vgl. Wigler et al., 1978, Cell 14: 725–733. Die Retrovirus-Produktion wurde durch den Arzneistoffresistenz-Titer (G418-resistente koloniebildende Einheiten pro ml, KBE/ml), wie beschrieben, bestimmt, Bodline et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738–3742. Außer für die Linie psiCRIP wurde die Selektion durch G418 (GIBCO) mit dem Wirkstoff bei 500 μg/ml zehn bis zwölf Tage durchgeführt. Die Hygromycin-B-Selektion erfolgte bei den von psiCRIP stammenden Verpackungsclonen zehn Tage lang in einem Medium, das den Wirkstoff mit 50 μg/ml enthielt. Der Titer von Replikationskompetenten Helferviren wurde auf. felinen PG4-Zellen durch das S⁺L^–-Verfahren bestimmt, vgl. Bassen et al., 1971, Nature 229: 564–566.
Die PEG-Fällung von Viruspartikeln wurde wie folgt durchgeführt. Die in 1 ml Kulturüberstand enthaltenen Virionen wurden mit 0,5 ml eines 30% (Gew./Vol.) Polyethylenglykols (PEG) 30 Min. bei 4°C gefällt. Nach der Zentrifugation wurden die Pellets mit einem Gemisch aus RNase-Inhibitoren (Vanadyl-Ribonuclease-Komplex, BRL) behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Danach wurden die Pellets in 15,7% (Vol./Vol.) Formaldehyd resuspendiert und serielle Verdünnungen auf eine Nitrocellulose-Membran getüpfelt.
Analyse der DRB-Transkription in Verpackungszell-Clonen: Um zu testen, ob innerhalb der verschiedenen Produzenten-Clone eine genaue Transkription der eingeführten DRB-cDNA erfolgte, wurden Northern-Blots, welche die aus diesen Clonen isolierten RNAs enthielten, mit den DRB- und Neo-Sonden hybridisiert. 2 zeigt die Struktur des Provirus-Genoms und die erwarteten Größen der Transkripte, die entweder von den Virus-LTR- oder TK-Promotoren initiiert wurden. Jeder der drei GS4.5 enthaltenden Clone, die von den Zellen PA317 (Clon C4), GP+E-86 (Clon A9) und psiCRIP (Clon A4) stammten, zeigte DRB-positive Transkripte. Wie beschrieben, Hantzopoulos et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3519–3523, wurden die ungespleißte genomische RNA (Bande a) und das gespleißte Neo-Transkript (Bande b) festgestellt. Außerdem wurde ein nur mit der DRB-Sonde hybridisierbares Transkript nachgewiesen, das der Größe entspricht (1700 Basen, Bande c), die für die DRB-cDNA-Transkriptionseinheit vorausgesagt wurde.
Oberflächenexpression des SLA-DR-Antigens auf transduzierten Fibroblasten: Ein in vitro-Test wurde entwickelt, um die Oberflächenexpression des SLA-DR-Antigens auf murinen Fibroblasten zu untersuchen. Die in 3 dargestellten Profile der Durchflusscytometrie (FCM) machen deutlich, dass G418^r-Titer von 3 × 10⁴ (Clon C4) ausreichend waren, um die Expression des DR-Antigens auf der Zelloberfläche von transduzierten DRA-Transfektanten zu fördern. In 3 geben die durchgezogenen Linien die DR-Expression auf der Zelloberfläche an (Bindung des Anti-DR-Antikörpers) (22% und 75% der gesamten Population von Zellen drei Tage nach der Transduktion mit GS4.5 C4, (B), bzw. GS4.5 A4, (C)); die gestrichelten Linien zeigen die Bindung des Anti-Maus-Klasse-I-Antikörpers (positive Kontrolle); und die gepunkteten Linien geben die Bindung des Anti-Schwein-CD8-Antikörpers an (negative Kontrolle). 22% der gesamten Population von transduzierten Zellen waren DR-positiv, und Subclone hielten die Klasse-II-Expression mehr als fünf Monate aufrecht. Der Anstieg des Titers (Clon A4) stand in einem direkten Zusammenhang mit einem Anstieg der Zahl der transduzierten Zellen (75% der transduzierten Population war DR-positiv) und mit der Stärke des DR-Signals.
Der Test der Klasse-II-Transduktion wurde, wie in 4 schematisch dargestellt, durchgeführt. NIH-3T3-Zellen wurden mit der SLA-DRA^d-cDNA transfiziert, die in einen Plasmid-Expressionsvektor eingefügt worden war, vgl. Okayama et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2: 161–170. Etwa 3 × 10⁴ Zellen einer stabilen DRA-Transfektante (Clon 11/12.2F), die einen hohen Spiegel der DRA-mRNA exprimierte, wurden sodann über Nacht mit 1 ml eines DRB enthaltenden Retrovirus-Überstands transduziert. Anschließend wurden die Zellen in frischem DMEM, das mit 10% fetalem Rinderserum und Antibiotika angereichert war, weitere zwei Tage gezüchtet und sodann durch eine FCM-Analyse auf eine Zelloberflächen-Expression des DR-Antigens getestet.
Der hier beschriebene Klasse-II-Transduktions-Test stellt ein schnelles und einfaches Verfahren bereit, mit dem sowohl die Expression als auch der funktionelle Titer von Retrovirus-Konstrukten getestet werden kann. Indem Zellen verwendet werden, die mit DRA transfiziert sind, wird die Notwendigkeit einer langwierigen doppelten Selektion nach der Transduktion durch zwei getrennte Vektoren vermieden, vgl. Yang et al., 1987, Mol. Cell Biol. 1: 3923–3928; Korman et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2150–2154. Die Zelloberflächen-Expression von DR-Heterodimeren wurde durch eine FCM-Analyse drei Tage nach der Transduktion gezeigt, wodurch ein direkter Beweis bereitgestellt wird, dass die übertragenen Sequenzen ausreichend waren, um einen signifikanten Spiegel der DR-β-Kette zu erzeugen. Noch wichtiger ist, dass dieser Test die Bestimmung „funktioneller" Titer möglich macht; diese beruhen auf der Expression des Gens von Interesse und nicht auf der Expression des unabhängig davon regulierten Arzneistoffresistenz-Markers.
Die SLA-DBR-Sonde war ein EcoRI-cDNA-Fragment, das die vollständige codierende Sequenz der DR-β-Kette enthielt, vgl. Gustafsson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9798–9802. Die Sonde des Neomycin-Phosphotransferase-Gens (Neo) war das BclI-XhoI-Fragment des Retrovirus-Plasmids N2A, vgl. Hantzopoulos et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3519–3523.
Expression der Schweine-DRB-cDNA, transduziert in murine Knochenmark-Vorläuferzellen: Die Effizienz, mit der myeloide clonogene Vorläufer transduziert wurden, wurde bestimmt, indem mit und ohne eine selektierende Menge von G418 auf KBE-GM getestet wurde, nachdem die Knochenmarkzellen den von GS4.5 hergeleiteten Virionen ausgesetzt worden waren. Der Vergleich der Zahl der Kolonien, die sich in Gegenwart und in Abwesenheit des Arzneistoffs bildeten, zeigte bei zwei Experimenten, dass etwa 40% der anfänglichen Population von myeloiden Vorläuferzellen transduziert waren. Die Häufigkeit von G418^r-KBE-GM wurde wieder bestimmt, nachdem eine Probe des transduzierten. Marks unter langfristigen Kulturbedingungen 33 Tage expandiert worden war. 25% der Vorläuferzellen, die nach 33 Tagen in Kultur vorlagen, brachten unter G418-Selektion immer noch Kolonien hervor. Die aus KBE-GM hervorgegangenen Kolonien wurden auf das Vorliegen von DRB-spezifischen Transkripten untersucht, indem RNA in cDNA umgewandelt und dann eine PCR-Amplifikation durchgeführt wurde, wie hier und in Shafer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9670, beschrieben. Ein 360 bp großes DRB-spezifisches Produkt wurde in fünf von sechs G418 selektierten Kolonien aus frisch transduziertem Mark nachgewiesen, wohingegen alle sechs Kolonien positiv waren, die genauso aus transduzierten Vorläuferzellen hergeleitet wurden, die nach 33 Tagen in Kultur vorlagen. Eine weitere Bande von 100 bp, die in einigen der Proben zu sehen war, spiegelt möglicherweise die stochastische Natur unspezifischer Priming-Ereignisse wider. DRB-spezifische Transkripte wurden auch in der gesamten Population von Arzneistoff-resistenten Kolonien und in Produzentenzellen nachgewiesen, nicht jedoch in Kontrollen, z. B. einer gesamten Population von nicht-transduzierten Kolonien, Fibroblasten, die zur Bereitstellung der Carrier-RNA verwendet wurden, und einer gesamten Population von transduzierten Kolonien, die wie vorstehend, jedoch ohne reverse Transkriptase, verarbeitet wurden. Diese letzeren Ergebnisse zeigen, dass das PCR-Signal von der Synthese von cDNA abhängig war, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass für das amplifizierte Fragment ein Provirus und nicht eine Virus-Information verantwortlich war.
Kürzlich wurden verbesserte Verfahren aufgezeigt, mit denen die langfristige Expression von transduzierten Genen im hämatopoetischen Kompartiment verbessert werden kann, und zwar u. a. durch Modifikationen des Virus-Designs, Erhöhung der Virustiter, Verwendung von Wachstumsfaktoren, um Vorläuferzellen zu stimulieren, und Selektion von Stammzellen vor der Transduktion, vgl. Bodine et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738–3742; Bodine et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8897–8901; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 439–443; Kang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9803–9807; Bender et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1426–1434. Die Experimente hier zeigen, dass sich die Technik des Gentransfers mit Hilfe von Retroviren dazu eignet, die Expression von Genen des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes der Klasse II zu erreichen, die in hämatopoetische Zellen übertragen wurden. Um die Effizienz zu bestimmen, mit der die bezüglich der Entwicklung primitiven hämatopoetischen Zellen transduziert wurden, wurde die Häufigkeit von G418^r KBE-GM festgestellt, nachdem infizierte Markzellen, die 33 Tage in langfristigen Kulturen gehalten wurden, expandiert wurden. Die Expression der exogenen DRB-cDNA wurde auch in den Zellen überwacht, die von transduzierten KBE-GM hergeleitet waren, die entweder unmittelbar nach der Infektion oder nach einer längeren Kulturperiode vorlagen. Im Wesentlichen waren alle einzeln getesteten Kolonien für ein DRB-spezifisches Transkript positiv; dies legt nahe, dass der rekombinante DRB-Vektor für die Expression in murinen hämatopoetischen Zellen geeignet ist.
Die Knochenmarkzellen wurden aus dem Femur von 6 bis 12 Wochen alten weiblichen C57/BL/10-Mäusen gewonnen und, wie beschrieben, zubereitet, vgl. Ildstad et al., 1984, Nature 307: 168–170. Methylcellulose-Kolonietests auf Granulocyten/Makrophagen koloniebildende Einheiten (KBE-GM), vgl. Eaves et al., 1978, Blood 52: 1196–1210, wurden, wie beschrieben, durchgeführt, wobei 5% (Vol./Vol.) eines murinen Interleukin-3-Kulturzusatzes (Collaborative Research) verwendet wurden. Langfristige Dexter-Typ-Knochenmarkkulturen wurden in 60-mm-Kulturschalen mit 2 × 10⁷ kernhaltigen Zellen initiiert, Eaves et al., 1987, CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 7: 125–138.
Die Knochenmarkzellen wurden, im Wesentlichen wie beschrieben, transduziert, Bodine et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8897–8901. Kurz gesagt wurde das Knochenmark aus 6 bis 12 Wochen alten weiblichen C57BL/10-Spendern geerntet, die zwei Tage mit 5-Fluorouracil (150 mg/kg) behandelt worden waren. Eine Vorstimulation erfolgte, indem 1 × 10⁶ Zellen pro ml zwei Tage in langfristigem Dexter-Typ-Knochenmark-Kulturmedium inkubiert wurden, zu dem 7,5% eines Interleukin-3-Kulturzusatzes und rekombinantes menschliches Interleukin-6 zugegeben wurden (200 Einheiten/ml; Geschenk von J. Jule, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Die Markzellen wurden 48 Stunden transduziert, indem 5 × 10⁶ Zellen pro 10-cm-Platte, die annähernd konfluente Virus-Produzenten enthielt, Polybrene (8 mg/ml) und die vorstehend angegebenen Cytokine zugegeben wurden.
Der Nachweis von DRB-spezifischen Transkripten in von KBE stammenden Kolonien wurde wie folgt durchgeführt. Zellen, die einzelnen KBE-Kolonien entsprachen, und solche, die Kolonien entsprachen, die auf einer ganzen Platte vorlagen (gesamte), wurden zuerst aus Methylcellulose-Kulturen durch Verdünnung in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung und Zentrifugation extrahiert. Danach wurden diese Zellen mit 1 × 10⁶ NIH-3T3-Zellen kombiniert (um eine Carrier-RNA bereitzustellen), und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Guanidinisothiocyanat/CsCl-Verfahrens zubereitet. Eine Erststrang-cDNA wurde aus 20 μg der Gesamt-RNA unter Verwendung des Invitrogen Red Module-Kits hergestellt. Danach wurde die cDNA 50 Zyklen einer PCR-Amplifikation unterworfen, und zwar in Gegenwart der SLA-DRB-spezifischen Oligonucleotide 04 (5'-CCACAGGCCTGATCCCTAATGG) (SEQ ID Nr. 1) und 17 (5'-AGCATAGCAGGAGCCTTCTCATG) (SEQ ID Nr. 2) unter Verwendung des Cetus GeneAmp-Kits gemäß den Empfehlungen (Perkin-Elmer/Cetus). Die Reaktionsprodukte wurden nach einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve-Agarose-Gel (FMC) durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Die FCM-Analyse wurde mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer FAC-Scan II (Becton Dickenson) an Zellen durchgeführt, die gefärbt waren mit: dem gegen DR gerichteten monoclonalen Antikörper 40D, vgl. Pierres et al., 1980, Eur. J. Immunol. 10: 950–957, mit einem Anti-H-2^d-allo-Antiserum oder mit dem gegen Schweine-CD8 gerichteten monoclonalen Antikörper 76-2-11, vgl. Pescovitz et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 1495–1505, worauf mit Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziegen-Anti-Maus-Antikörper folgten (Boehringer Mannheim).
Expression einer allogenen Klasse-II-cDNA in Knochenmarkzellen des Schweins, transduziert mit einem rekombinanten Retrovirus
Ein MHC-Gen (DRB) wurde in clonogene Vorläuferzellen aus dem Schwein übertragen, indem ein rekombinanter Retrovirus-Vektor (GS4.5) verwendet und ein Transduktionsprotokoll eingesetzt wurde, das so entworfen wurde, dass es in vivo anwendbar ist. Sowohl das selektierbare Arzneistoffresistenz-Gen als auch die durch diesen Vektor übertragene allogene Klasse-II-cDNA wurden in der Nachkommenschaft dieser transduzierten Vorläufer exprimiert. Die Expression des Neo-Gens wurde durch die Koloniebildung unter G418-Selektion funktionell überwacht, während das Vorliegen von Klasse-II-Transkripten durch eine PCR-Analyse nachgewiesen wurde. Mit diesem letzteren Verfahren wurde die transkriptionale Expression von sowohl endogenen als auch von Viren stammenden DRB-Genen in transduzierten und selektierten Kolonien gezeigt.
Primäre Schweine-Fibroblasten wurden zusammen mit Hochtiter-Virus-Überständen gezüchtet und anschließend durch Northern-Blotting unter Verwendung von Sonden analysiert, die für DRB und Neo spezifisch waren. Ein spezifisches Transkript wurde festgestellt, das nur mit der DRB-Sonde hybridisierbar war und das an die Position wanderte, die für die DRB-cDNA-Transkriptionseinheit vorausgesagt worden war (1700 Basen), die vom TK-Promotor aus beginnt und an der LTR-3'-RNA-Prozessierungsstelle endet.
Um zu bestimmen, ob die GS4.5 enthaltenden Virionen myelopoetische Vorläufe zellen des Schweins transduzieren können, wurde ein auf KBE-GM des Schweins angepasster Kolonietest eingesetzt. Die Transduktionen wurden durchgeführt, indem das Knochenmark aus einem Spender des SLAC-Haplotyps in einem Hochtiter-Virus-Überstand inkubiert wurde. Beim Vergleich der Zahl der Kolonien, die sich in Gegenwart und in Abwesenheit von G418 bildeten, zeigte sich bei insgesamt fünf unabhängigen Experimenten, dass 5% bis 14% der KBE-GM transduziert waren.
Kolonien von Zellen, die von transduzierten KBE-GM hergeleitet waren, wurden auf das Vorliegen von DRB-spezifischen Transkripten untersucht, indem die RNA in cDNA umgewandelt und danach eine PCR-Amplifikation durchgeführt wurde. Unter Verwendung einer polymorphen Sau3Al-Restriktionsstelle, die auf dem endogenen DRB^c-Gen nicht vorlag, wurde das Vorliegen von DRB^d-spezifischen Transkripten eindeutig gezeigt. Eine Gel-Elektrophorese des PCR-Produkts machte deutlich, dass ein 183/177 bp großes Dublettmolekül, welches das aus dem Vektor stammende DRB^d-Transkript anzeigt, nicht nur in den Proben amplifiziert wurde, die aus Pools von transduzierten und selektierten KBE-GM-Nachkommen stammten, sondern auch in solchen, die von mindestens vier von sechs getesteten einzelnen Kolonien stammten. Ein 360 bp großes PCR-Fragment, das endogene DRB^c-Transkripte anzeigt, wurde auch nicht nur wie erwartet aus den PBL amplifiziert, die von einem SLAC-Spender isoliert worden waren, sondern auch aus den Proben der vereinigten Kolonien und außerdem aus einer Anzahl von Proben von einzelner Kolonien.
Die Konstruktion des Retrovirus GS4.5 und die Produktion von Hochtiter-Virus-Überständen erfolgten, wie vorstehend beschrieben. Der Nachweis von DRB-spezifischen Transkripten in den von KBE stammenden Kolonien durch eine PCR der cDNA erfolgte, wie vorstehend und im Folgenden beschrieben. Knochenmark von einem SLA^c-Spender wurde den GS4.5 enthaltenden Virionen ausgesetzt, und die G418 selektierten Kolonien wurden auf das Vorliegen von DRB^c-(endogenen) und DRB^d-(vom Vektor stammenden)spezifischen Transkripten durch eine PCR der cDNA getestet, worauf eine Spaltung mit Sau3Al und eine Agarose-Gel-Elektrophorese folgten. Die Kontrollen waren wie folgt: eine Matrize, synthetisiert entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit der reversen Transkriptase; eine Matrize, die hergeleitet war von Zellen, die GS4.5 enthaltende Virionen produzierten, von PBL, die aus SLA^c- oder SLA^d-Spendern isoliert worden waren, und von nicht-tranduzierten Erzeugerzellen, die als Carrier-RNA verwendet wurden.
Die Transduktion von Knochenmark wurde wie folgt durchgeführt. Das Knochenmark von Schweinen wurde, wie früher beschrieben, geerntet (Pennington et al., 1988, Transplantation 45: 21–26), und sodann wurden die Transduktionen durchgeführt, indem die Knochenmarkzellen in Hochtiter-Virus-Überständen bei einem MOI-Wert von 3 bis 5 in Gegenwart von 8 μg Polybrene pro ml bei 37°C fünf Stunden inkubiert wurden. Die myeloiden Vorläufer wurden durch Koloniebildung in Methylcellulose-Kulturen unter Verwendung eines durch PHA stimulierte Schweine-Lymphocyten konditionierten Mediums als Quelle von Wachstumsfaktoren getestet. Das selektive Medium enthielt 1,2 mg/ml des G418-Wirkstoffs.
Die transduzierten Knochenmarkzellen wurden an ein letal bestrahltes Miniaturschwein verabreicht. Nach fünf Wochen wurden Lymphocyten des peripheren Bluts durch Southern-, Northern- und Zelloberflächen-FACS-Analysen untersucht. Bei allen diesen Tests wurde gezeigt, dass das transduzierte allogene Klasse-II-Gen in diesen Zellen vorlag und dass die Expression des Produkts dieses Gens erfolgte. Insbesondere machte die Northern-Analyse Banden deutlich, die für die transkribierte cDNA charakteristisch waren, und die FACS-Analyse mit einer Kombination von Alloantiseren und monoclonalen Antikörpern gegen DR zeigte, dass das transduzierte Allel von DR-beta auf der Oberfläche der peripheren Lymphocyten vorlag.
Allogene Toleranz
Entwicklung der Stamm-Kombination B10.MBR – B10.AKM: Bei einem Versuch, Stämme aufrechtzuerhalten, die für den MHC echt kongen sind, wurde vor mehr als 15 Jahren ein Programm entwickelt, in dem jede kongene Linie mit einem Partnerstamm mit herkömmlichem Hintergrund fortgesetzt rückgekreuzt wurde. Die rückgekreuzten Tiere wurden untereinander gekreuzt, und die geeignete Nachkommenschaft wurde durch eine serologische Typisierung selektiert, um jede kongene Linie wieder zu etablieren. Hierbei wurde C57BL/10 als der eine Referenz-Hintergrund-Stamm eingesetzt, und alle anderen kongenen Linien auf dem B10-Hintergrund wurden einmal alle sechs bis zehn Generationen mit dieser C57BL/10-Linie rückgekreuzt.
Während der Rückkreuzung der jeweiligen kongenen Linie mit ihrer Nachkommen-Referenzlinie besteht natürlich die Möglichkeit, dass ein Rekombinationsereignis innerhalb des MHC stattfindet. Durch die Typisierung der Kreuzungs-(F2-)Generation können solche Rekombinationsereignisse serologisch aufgedeckt werden, und wenn die Rekombinante einen neuen Haplotyp bereitstellt, der für genetische Studien interessant sein könnte, wird er ausgekreuzt und danach untereinander gekreuzt, wodurch ein homozygoter neuer rekombinanter H-2-Haplotyp erzeugt wird. Eine der wertvollsten Rekombinanten, die von dieser Kolonie stammen, ist die Linie B10.MBR, vgl. Sachs et al., 1979, J. Immunol. 123: 1965–1969, die von einem Rekombinationsereignis während der Rückkreuzung von B10.AKM auf C57BL/10 hergeleitet wurde. Da dieser Stamm der erste war, bei dem K^b von I^k getrennt wurde, wurde er sehr häufig in Studien der R-2-Immungenetik eingesetzt. Außerdem bietet der Stamm B10.MBR in Kombination mit dem parentalen B10.AKM-Stamm die Möglichkeit, ein isoliertes K-Gen zu untersuchen, da dies der einzige MHC-Unterschied zwischen diesen beiden Stämmen ist. Somit könnte, wie in 5 erläutert wird, die Einführung des K^b-Gens in B10.AKM-Knochenmark-Stammzellen theoretisch zur Expression aller Zelloberflächen-MHC-Antigene des B10.MBR führen. Die Expression auf von Knochenmark hergeleiteten Zellpopulationen erzeugt eine Transplantationstoleranz gegenüber dem Produkt des transduzierten Gens, und diese Toleranz kann anhand eines Gewebetransplantats aus dem Stamm B10.MBR getestet werden.
Rekonstitution von myelo-entfernten Mäusen mit einem transduzierten Knochenmark: 80 angehende B10-AKM-Spendermäuse wurden am Tag –7 mit 150 mg/kg 5FU behandelt. Das Knochenmark wurde aus diesen Mäusen am Tag –5 geerntet, mit gegen CD4 und gegen CD8 gerichteten monoclonalen Antikörpern (mAbs) plus Komplement behandelt, um die reifen T-Zellen zu entfernen, und fünf Tage mit einem N2-B19-H2b-Virus enthaltenden Überstand (H2) der Verpackungszelllinie psi-Crip gezüchtet. Als Kontrolle wurde die eine Hälfte des Marks mit dem Überstand von Kontroll-Verpackungszellen kultiviert, die nicht N2-B19-H2b enthielten (A2). Am Tag Null erhielten 45 B10.AKM-Empfänger 10 Gy einer Ganzkörper-Bestrahlung (TBI), worauf die Verabreichung verschiedener Konzentration von gezüchteten Knochenmarkzellen (A2 oder H2) folgte.
K^b-Expression: Am Tag 13 wurden mehrere Tiere, die die niedrigsten Dosen von gezüchteten Knochenmarkzellen erhalten hatten, getötet und einzelne Milzkolonien geerntet und durch PCR auf das Vorliegen der N2-B19-H2b-DNA analysiert. Außerdem wurden Milzzellsuspensionen hergestellt und auf eine Zelloberflächen-Expression von K^b untersucht, und zwar durch eine Durchfluss-Mikrofluorometrie auf einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS). Die FACS-Analysen zeigten, dass alle Tiere, die das H2 behandelte Mark erhalten hatten, einen gewissen Anstieg der K^b-Expression gegenüber der Kontrollfärbung mit dem nicht-reaktiven Antikörper aufwiesen. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt; diese zeigt ein FACS-Profil von Milzzellen aus einem Empfänger eines transduzierten Knochenmarks: A = Anti-K^b-Antikörper; B = Kontrollantikörper. Die Milzzellen aus Empfängern eines nicht-transduzierten Marks waren auch negativ. Außerdem zeigte die PCR-Analyse, dass jede untersuchte Kolonie die transduzierte DNA enthielt. Danach wurden die Tiere überwacht, indem FACS- und PCR-Analysen an den peripheren Blut-Lymphocyten (PBL) durchgeführt wurden. Die PCR-Analysen waren am Tag 28 und erneut am Tag 40 positiv. Die FACS-Analysen auf die Zelloberflächen-Expression waren jedoch variabel, wobei die PBL aus den meisten H2-Tieren eine leichte Verschiebung des gesamten Peaks der Färbung mit Anti-K^b zeigten, und zwar im Vergleich zu den PBL aus A2-Tieren, die mit dem gleichen Antikörper gefärbt waren, oder im Vergleich zu den PBL aus H2-Tieren, die mit dem nicht-reaktiven HOPC-Antikörper gefärbt waren.
Allogene Transplantate: Am Tag 40 wurde die Haut von B10.MBR-(K^b-spezifisch) und von B10.BR-(Kontrolle, Klasse-I von Dritten ungleichen)Spendern auf alle Tiere transplantiert. Das Überleben der Transplantate wurde täglich durch eine Person blind ausgewertet (d. h. die Bewertungen erfolgten ohne Wissen, welches Transplantat von welchem Spenderstamm stammte), bis die Abstoßung vollständig abgelaufen war. Die Überlebenszeiten sind in 7 dargestellt, wobei sie eine deutliche spezifische Verlängerung der Überlebenszeit der B10.MBR-Hauttransplantate auf den Empfängern von K^b transduzierten BMC (7B), nicht jedoch auf den Empfänger des Kontrollmarks anzeigen (7A). Eines der Tiere mit einem lang anhaltenden intakten B10.MBR-Hauttransplantat wurde am Tag 114 getötet, sodann wurden die Zellsuspensionen seiner lymphoiden Gewebe durch FACS untersucht und mit ähnlichen Zellsuspensionen aus einem Tier verglichen, das sein B10.MBR-Hauttransplantat abgestoßen hatte. Hierbei ließ sich in der Färbung von Thymuszellen mit einem Anti-K^b-mAb ein deutlicher Unterschied feststellen. Die Zellsuspensionen wurden zubereitet und entweder mit dem Anti-K^b-mAb 28-8-6 oder mit dem Kontrollantikörper HOPC1 gefärbt. Eine Subpopulation von Thymuszellen aus dem toleranten Tier zeigte eine deutlich stärkere Färbung mit 28-8-6 im Vergleich zu der Färbung mit HOPC1, während im Färbungsmuster von Thymocyten aus dem Tier, das sein Transplantat verloren hatte, kein wesentlicher Unterschied zu sehen war. 8 zeigt die FACS-Analysen von Thymocyten aus dem Tier, das das Hauttransplantat abgestoßen hat (8A, B), und aus dem Tier, das das Hauttransplantat akzeptiert hat (8C, D), wobei die Färbung mit dem Kontrollantikörper HOPC1 (8A, C) und mit dem spezifischen Anti-K^b-Antikörper erfolgte (8B, D). Ein ähnlicher Vergleich der Färbungsmuster auf Knochenmarkzellen zeigte das Vorliegen einer K^b-Expression auf geringem Niveau auf einer Zellpopulation im Mark der toleranten Maus, nicht jedoch der Maus, die ihr Hauttransplantat abgestoßen hatte. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass eine pluripotente Stammzelle oder eine frühe Vorläuferzellen-Population K^b in der toleranten Maus exprimierte, nicht jedoch in der abstoßenden Maus, und dass diese BMC-Stammzelle eine kontinuierliche Quelle des K^b-Antigens auf Zellen im Thymus bereitstellte, die für die Inaktivierung von sich entwickelnden Thymocyten mit K^b-reaktiven TCR kritisch sind. Dabei ist von Interesse, dass die K^b-Expression nicht auf den Splenocyten der toleranten Maus nachgewiesen wurde und dass im Allgemeinen die Splenocyten-Expression nicht mit der Toleranz gegenüber den Hauttransplantaten korrelierte. Da die Milz T-Zellen enthält, die im Thymus reifen, legen diese Ergebnisse nahe, dass entweder die Thymocyten die Expression von K^b einbüßen, wenn sie reifen, oder dass die K^b-tragenden Thymocyten dieses Tiers Zellen einer nicht-lymphoiden Linie waren, z. B. Makrophagen.
Langfristige Expression: Wie vorstehend beschrieben, sind die kongenen Mausstämme B10.AKM und B10.MBR identisch, mit Ausnahme der MHC-Region der Klasse I. Ein rekombinantes Retrovirus, das das Klasse-I-Gen aus dem B10.MBR-Stamm (H-2K^b) enthielt, gekoppelt an einen B19-Parvovirus-Promotor (B19-H2K^b) und ein Gen für Neomycin-Resistenz (neo^r), wurde in B10.AKM(H-2K^k)-Markzellen eingeführt. Als Kontrolle wurde ein rekombinantes Retrovirus, das nur das neo^r-Gen enthielt, in B10.AKM-Markzellen eingeführt. Das transduzierte Mark wurde in letal bestrahlte AKM-Empfänger injiziert, die mit einem gegen CD8 gerichteten monoclonalen Antikörper vorbehandelt worden waren. Zwölf Wochen nach der BMT wurde eine quantitative PCR durchgeführt; dabei wurde gezeigt, dass die B19-H-2K^b-Provirus-Sequenzen in 5 bis 30% der peripheren Blutzellen in allen Empfänger-Tieren vorlagen. Eine reverse Transkriptase-PCR wurde eingesetzt, um die B19-H-2K^b-mRNA in der RNA nachzuweisen, die aus dem Knochenmark und der Milz aus einer Untergruppe von Empfänger-Tieren isoliert worden war.
Konstruktion des K^b-Retrovirus-Vektors: Die Retrovirus-Vektoren stammten aus dem auf dem murinen Malony-Leukämievirus basierenden Vektor N2, Armentano et al., 1987, J. Virol. 61: 1647–1650. Die codierenden Regionen innerhalb dieses Virus wurden während seiner Konstruktion entfernt und durch das Gen eines selektierbaren Markers, der Neomycin-Phosphotransferase (Neo), ersetzt, das vom LTR-Promotor des Virus aus transkribiert wird und eine Arzneistoffresistenz gegenüber G418 bereitstellt. Anschließend wurde dieses konventionelle Virus N2 noch weiter modifiziert, und zwar durch die Insertion eines von einem Parvovirus stammenden Promotors, B19, Liu et al., 1991, J. Virol. (im Druck), stromabwärts von Neo, gefolgt von 1,6 kb einer cDNA, welche das Klasse-I-Antigen H-2K^b codiert, wodurch das neue rekombinante Virus N2-B19-H26 hergestellt wird. In 9 ist der Retrovirus-Vektor N2-B19-H26 dargestellt: P = PstI; X = XhoI; H = HindIII; E = EcoRI; B = BamHI. Diese letzere cDNA wurde von Waneck et al. bei der Konstruktion einer H-2^b-cDNA-Bank für ihre Zwecke hergeleitet, Waneck et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1358–1370.
Virus-produzierende Zelllinien wurden entwickelt, indem die Verpackungszelllinien für eine amphotrope (psi-Crip), Danos et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464, und für eine ecotrope (psi-2), Sambrook et al., 1989, „Molecular cloning: A laboratory manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Virusproduktion verwendet wurden. Diese Zelllinien wurden spezifisch entwickelt, so dass sie Strukturproteine des Virus erzeugen und hiermit das rekombinante defekte Virus hergestellt werden kann. Die Produktion von Viren wurde erreicht, indem psi-Crip mit N2-B19-H2b transfiziert wurde. Danach wurden sowohl amphotrope als auch ecotrope Erzeugerzelllinien gemeinsam kultiviert, wodurch mehrere Integrationsereignisse und eine hohe Expression ermöglicht wurden [d. h., die „Ping-Pong"-Technik, vgl. Bestwick et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5404–5408]. Bei dieser Technik kann durch die gemeinsame Züchtung die Virus-Antigen-Rezeptor-Blockade durch endogen ausgeschiedene Proteine überwunden werden, da amphotrope und ecotrope Viren unterschiedliche Rezeptoren erkennen. Danach wurden die ecotropen Virus-produzierenden psi-2-Clone selektiert, die G418-Resistenz-Titer auf 3T3-Zellen von mehr als 10⁷ KBE/ml erzeugten.
Um sicherzustellen, dass K^b von dem rekombinanten Virus exprimiert wurde, wurden die transduzierten 3T3-Zellen mit einem monoclonalen Antikörper gefärbt, der für dieses Antigen spezifisch war, anschließend wurden sie durch Durchfluss-Mikrofluorometrie analysiert. Diese Experimente zeigten deutlich eine Expression auf hohem Niveau des vom Virus hergeleiteten K^b.
Die Tiere und ihre Haltung waren wie folgt. Der Stamm B10.BMR [Sachs et al., 1979, J. Immunol. 123: 1965–1969] wurde dem Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, etwa vor sechs Jahren zur Verfügung gestellt, jetzt sind aus dieser Quelle spezifische Pathogen-freie Stammtiere dieses Stamms verfügbar. Die Tiere sollten bei der Ankunft in autoklavierte Mikroisolator-Käfige gebracht werden, die autoklaviertes Futter und autoklaviertes angesäuertes Trinkwasser enthalten. Beim Umgang mit den Tieren sollten sterile Vorschriften eingehalten werden, anhand derer die Tiere Pathogen-frei gehalten werden können, so dass mit ihnen auswertbare Überlebensstudien durchgeführt werden können.
Die Knochenmark-Transplantation wurde wie folgt ausgeführt. Techniken für eine Knochenmark-Transplantation in Mäusen sind dem Fachmann bekannt, vgl. z. B. Sykes et al., 1988, J. Immunol. 140: 2903–2911. Kurz gesagt werden die Empfänger-Mäuse B10.AKM in einem Alter von 12 bis 16 Wochen letal bestrahlt (1025 R, ¹³⁷Cs-Quelle, 110 R/Min.) und innerhalb von acht Stunden mit 2,5 × 10⁶ Knochenmarkzellen rekonstituiert, die aus der Tibia und dem Femur von Spendern des gleichen Geschlechts im Alter von 6 bis 14 Wochen gewonnen wurden. Die Tiere werden in sterilisierten Mikroisolator-Käfigen gehalten und erhalten autoklaviertes Futter und autoklaviertes angesäuertes Trinkwasser. Für diese Studien sind einige Modifikationen dieses allgemeinen Verfahrens erforderlich, da das syngene Knochenmark mit einem allogenen Gen transduziert wurde und da das Knochenmark von 5FU-behandelten Mäusen stammt, die niedrigere Gesamtzellzahlen, jedoch einen höheren Stammzellengehalt als normale Mäuse aufweisen sollten. Deshalb sieht das Protokoll wie folgt aus:

1. Die Spender werden mit 5-Fluoruracil, 150 mg/kg, i. v., am Tag –7 behandelt, um die pluripotenten Stammzellen zu induzieren, in den Zyklus einzutreten.
2. Knochenmark wird von den Spendern am Tag –5 geerntet, und T-Zellen werden mit mAbs und Komplement entfernt.
3. Danach wird das Knochenmark fünf Tage in einem Überstand von einer ecotropen Verpackungszelllinie (B17H2Kb-18) gezüchtet, die einen hohen Titer von nicht-infektiösen Retrovirus-Partikeln produziert, die das K^b-Gen enthalten (vgl. nachstehend). IL-3 und IL-6 werden zu den Kulturen zugegeben.
4. Am Tag 0 wird die Empfänger-Maus B10.AKM letal bestrahlt (10,25 Gy) und danach mit 2,5 × 10⁶ BMC rekonstituiert, die mit dem K^b-Gen transduziert sind. Die Kontrolltiere werden genauso behandelt, außer dass sie Knochenmark erhalten, das mit einem Überstand von einer ähnlichen ecotropen Verpackungszelllinie in Kontakt gebracht worden war, die keinem K^b enthaltenden Vektor ausgesetzt worden war. Der Empfänger kann auch mit einem gegen CD8 gerichteten monoclonalen Antikörper vorbehandelt werden.

Die zellulären und serologischen Tests werden wie folgt durchgeführt.
Test der Anti-Klasse-I-Zellen vermittelten Lympholyse (CM): Die Milzen werden aus den BMT-Empfängern und aus den normalen Mäusen entnommen, die Erythrocyten werden unter Verwendung von ACK-Puffer lysiert, und eine Einzelzellsuspension wird hergestellt. Die Zellen werden durch ein 100-Mesh-Nylonfilter filtriert, gewaschen und mit 4 × 10⁶ pro ml in Vollmedium resuspendiert, das aus RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum, 0,025 mM 2-Mercaptoethanol, 0,01 M Hepes-Puffer, 0,09 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin besteht. 90 μl der Responderzellen werden zusammen mit den bestrahlten (30 Gy) Stimulator-Splenocyten zu Costar-Rundboden-Platten mit 96 Vertiefungen zugegeben. Die Kulturen werden in zwei Reihen von jeweils drei Replikaten angeordnet, und nach fünf Tagen Inkubation in 6% CO₂ bei 37°C werden aus der zweiten Reihe der Triplikate zweifache serielle Verdünnungen hergestellt, so dass die cytolytische Kapazität bei insgesamt fünf unterschiedlichen Responder : Ziel-Verhältnissen untersucht werden kann. Danach werden ⁵¹Cr-markierte, 2-Tage mit Concanavalin-A induzierte Lymphoblasten mit 10⁴ Blasten pro Vertiefung zugegeben und vier Stunden bei 37°C in 6% CO₂ inkubiert. Die Platten werden anhand des Titertek-Überstand-Sammelsystems (Skatron, Inc., Sterling, VA) geerntet und die Freisetzung von ⁵¹Cr unter Verwendung eines automatischen Gammazählers bestimmt. Die cytolytische Kapazität wird in der plattierten ursprünglichen Zellkultur direkt gemessen, so dass die Messung auf der Zahl der plattierten Responder beruht, und nicht auf der Zahl der am Ende des fünftägigen Inkubationszeitraums vorliegenden lebenden Zellen. Diese Methode wurde in diesem Labor entwickelt und schon mehrere Jahre für die Analyse der Antworten von Milzzellen aus einzelnen Tieren erfolgreich eingesetzt [Sykes, M., et al., 1988, J. Immunol. 140: 2903–2911]. Die prozentuale spezifische Lyse wird anhand der folgenden Formel berechnet: % spezifische Lyse = experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung × 100% × 100% maximale Freisetzung – spontane Freisetzung
Grenzwert-Verdünnungs-Analysen: Die Responder- und Stimulatorzellen (6 × 10⁵, mit 30 Gy bestrahlt) werden sieben Tage in Vollmedium, das 13% TCGF (Lectin-inaktivierter ConA-Überstand, gewonnen aus BALB/c-ConA aktivierten Splenocyten) enthält, in Platten mit 96 Vertiefungen gemeinsam gezüchtet. Die Vertiefungen die 10⁵ (24 Vertiefungen), 3 × 10⁴ (24 Vertiefungen), 10⁴ (30 Vertiefungen), 3000 (30 Vertiefungen), 1000 (30 Vertiefungen), 300 (30 Vertiefungen) und 100 (30 Vertiefungen) Responderzellen enthalten, werden vorbereitet. Zu jeder Vertiefung werden am Tag sieben 3000 ⁵¹Cr-markierte ConA-Blasten zugegeben, anschließend wird die Freisetzung von ⁵¹Cr in vier Stunden gemessen. Vertiefungen werden als positiv bewertet, wenn die Freisetzung von ⁵¹Cr 3 Standardabweichungen größer als die durchschnittliche ⁵¹Cr-Freisetzung in den 24 Vertiefungen ist, die nur Stimulatorzellen plus ähnliche Zahlen von Zielzellen enthalten. Anhand der Poisson-Verteilung wird die Häufigkeit von Vorläufer-CTLs bestimmt, die das jeweilige Ziel erkennen, und die statistische Analyse erfolgt durch die Chi-Quadrat-Methode von Taswell, Taswell, 1981, J. Immunol. 126: 1614.
Durchfluss-Mikrofluorometrie: Eine einfarbige und zweifarbige Durchflusscytometrie wird durchgeführt, und anschließend werden aus den zweifarbigen Daten die Prozentsätze der Zellen bestimmt, die einen bestimmten Phänotyp exprimieren, wie früher ausführlich beschrieben von Sykes, 1990, J. Immunol. 145: 3209–3215. Das Softwareprogramm Lysis II (Becton Dickenson) wird eingesetzt, um Granulocyten von Lymphocyten zu unterscheiden, indem ein Gating auf der Basis von Vorwärtswinkel- und 90°-Lichtstreuung durchgeführt wird. Die Zellsortierung erfolgt auf einem Zellsortierer Coulter Epics Elite. Die Zellsuspensionen für die Durchflusscytometrie, PBL-, BMC-, Thymocyten-, Splenocyten- und Lymphknotensuspensionen, werden, wie früher beschrieben, hergestellt, Sykes, M., et al., 1988, J. Immunol. 140: 2903–2911; Sykes, M., 1990, J. Immunol. 145: 3209– 3215; Sharabi, Y., et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 195–202. Gesamte periphere Leukocytensuspensionen (einschließlich Ganulocyten) werden hergestellt, indem das heparinisierte Blut zwei Minuten bei 14 000 UpM in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert wird, worauf ein Absaugen der Leukocyten-Manschettenschicht folgt. Diese Zellen werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und gewaschen. Die Erythrocyten (RBC), die in dem restlichen Pellet als Verunreinigung vorliegen, werden lysiert, indem sie fünf Sekunden 4,5 ml destilliertem H₂O ausgesetzt werden, mit anschließender Gewinnung in 0,5 ml 10 × PBS.
Zellfärbung: Eine einfarbige und eine zweifarbige Färbung werden durchgeführt, wie früher beschrieben, Sykes, 1990, J. Immunol. 145: 3209–3215; Sykes, et al., 1988, J. Immunol. 141: 2282–2288. Immer wenn nur eine direkte Färbung eingesetzt wird, wird der Kulturüberstand des Ratten-Anti-Maus-RcτR-mAb 2.4G2 eingesetzt, Unkeless, J. C., 1979, J. Exp. Med. 150: 580–596, um eine auf der FcτR-Bindung beruhende unspezifische Bindung zu blockieren. Die folgenden mAbs werden verwendet. Der biotinylierte murine K^b-spezifische IgG2a-mAb 28-8-6, Ozato et al., 1981, J. Immunol. 126: 317–321, und zur Kontrolle der murine IgG2a-mAb HOPC1 (mit keiner bekannten spezifischen Bindung an murine Antigene) werden durch Reinigung auf einer Protein-A-Sepharose-Säule hergestellt und durch die in unserem Labor verwendeten Standardverfahren biotinyliert; der Ratten-Anti-MAC1-mAB M1/70, Springer et al., 1979, Eur. J. Immunol. 9: 301, wird als Kulturüberstand verwendet und durch den Maus-Anti-Ratte-IgG-spezifischen mAb MAR18.5 gefärbt; der FITC-markierte Rattten-Anti-Maus-Granulocyten-Antikörper Gr1 wird von Zymed bezogen; der FITC-markierte Ratten-Anti-Maus-Thy1.2-mAb wird von Becton-Dickinson bezogen; der FITC-markierte Maus-Anti-Mensch-CD3-mAb Leu4 (Becton-Dickinson) wird als direkt FITC-markierter Antikörper der negativen Kontrolle eingesetzt.
Immunfluoreszenz des Thymusgewebes: Das Gewebe wird 24 Stunden in L15-Medium inkubiert, um die Hintergrund-Färbung zu reduzieren, danach wird es geschnitten und zum Einfrieren in Isopentan in OCT-Verbindung eingebettet. Auf einem Kryostaten werden gefrorenen Schnitte hergestellt (Dicke 4 μm), diese sodann getrocknet, in Aceton fixiert und in PBS gewaschen. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper (mit 28-8-6) erfolgt in Gegenwart von 2% normalem Mausserum, um die Fc-Rezeptoren zu sättigen. Nach 45 Minuten werden die Objektträger viermal gewaschen und das FITC konjugierte sekundäre Reagens zugegeben (monoclonaler Ratten-Anti-Maus-IgG2a-FITC, bezogen von Pandex). Nach 45 Minuten Inkubation mit dem sekundären Reagens werden vier Waschgänge durchgeführt, und das Gewebe wird fixiert. Danach werden die Schnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop durch eine Person untersucht, die nicht weiß, aus welcher Gruppe von Tieren das Gewebe gewonnen wurde.
Die Manipulationen und Tests des Knochenmarks wurden wie folgt durchgeführt:
Transduktion muriner Knochenmark-Stammzellen: Die Verfahren, die zur Transduktion von Knochenmarkzellen verwendet wurden, wurden schon früher beschrieben, Karlsson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6062–6066. Das Knochenmark wird aus 6 bis 12 Wochen alten weiblichen B10.AKM-Spendern geerntet, die zwei Tage vorher mit 150 mg/kg 5-FU behandelt wurden. Nach der T-Zell-Entfernung (vgl. vorstehend) wird das Mark aufgeteilt, und 10⁷ Zellen pro 10 cm-Platte werden fünf Tage in Gegenwart von 8 μg Polybrene pro ml, 10% FCS, 0,6% IL-3 enthaltendem Überstand, 0,6% IL-6 enthaltendem Überstand und frischen Überständen von B19H2K^b- oder N2-Zellen gezüchtet. Der IL-3 und IL-6 enthaltende Überstand ist ein 48-Stunden-Überstand von COS-7-Zellen, transfiziert mit dem murinen rIL-3-Gen enthaltenden Plasmid pCD-IL-3 bzw. mit dem murinen rIL-6-Gen enthaltenden Plasmid pCD-IL-6 (beide Plasmide wurden von Dr. Frank Lee, DNAX Corp., zur Verfügung gestellt). Die IL-3 enthaltenden Überstände werden titriert, indem die Proliferation der IL-3-abhängigen Zelllinie 32D in Gegenwart von Verdünnungen dieser Überstände getestet wird, und IL-6 wird auf ähnliche Weise titriert, indem die IL-6-abhängige Linie T1165 als Indikatorzelllinie eingesetzt wird. Außerdem testen wir die Wirkung von murinem SCF auf die Knochenmark-Transduktion, wie kürzlich von Zsebo et al., 1990, Cell 63: 125–201, beschrieben.
Die Virus enthaltenden Überstände werden täglich erneuert, indem die nicht-haftende Schicht jeder Plate geerntet wird, sodann die Zellen abzentrifugiert und in einem frisch geernteten, filtrierten Virus enthaltenden B19H2K^b- oder N2-Überstand mit Zusatzstoffen resuspendiert werden. Nach fünf tagen werden die nicht-haftenden und die haftenden BMC geerntet, gewaschen und mit 2,5 × 10⁶ pro ml in Medium 199 mit Hepes-Puffer und Gentamicin plus Heparin, 10 U/ml, resuspendiert. Ein ml dieser Suspension wird den bestrahlten Mäusen i. v. injiziert.
Test auf murine KBE-GM: Um den Test auf die Knochenmark-Vorläuferzellen, die als KBE-GM (koloniebildende Einheit Granulocyt/Makrophage) bekannt sind, durchzuführen, werden die Knochenmarkzellen in Plattierungsmedium suspendiert, das aus IMDM-Medium besteht, enthaltend 30% definiertes fetales Rinderserum (FBS) (HyClone, Logan, UT), 10^–4 M β-Mercaptoethanol, Antibiotika, 5% (Vol./Vol.) murines IL-3-Kultursupplement (Collaborative Research Inc., Bedford, MA) und 0,8% Methylcellulose (erhalten durch Zugabe von 36% (Vol./Vol.) einer kommerziell hergestellten Lösung, bezogen von Terry Fox Laboratory, Vancouver). Anschließend werden 1,1 ml dieser Suspension in 35-mm-Gewebekulturplatten verteilt (in doppelter Ausführung) und in einen Inkubator bei 37°C gestellt. Die resultierenden, von KBE-GM stammenden Kolonien werden nach fünf bis sieben Tagen unter dem Mikroskop gezählt. Transduzierte KBE-GM werden selektiert, indem 0,9 μg/ml des G418-Wirkstoffs zum Kulturmedium zugefügt werden. Anschließend wird die Transduktionshäufigkeit durch den Anteil der KBE-GM bestimmt, die Kolonien in Gegenwart und in Abwesenheit des Arzneistoffs bilden.
Die molekularen Verfahren waren wie folgt:
Konstruktion des Vektors N2-B19-H2b: Dieser Vektor wurde konstruiert, indem mit dem ursprünglichen Retrovirus-Vektor N2 begonnen wurde, vgl. Eglitis et al., 1985, Science 230: 1395–1398, der durch Shimada modifiziert wurde, um eine weitere BamHI-Stelle unmittelbar 3' zur XhoI-Stelle einzufügen. Er umfasst die K^b-cDNA, die vorher im Vektor pBG367 cloniert war, wie von G. Waneck beschrieben, vgl. Waneck et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1358–1370. Dieses Gen wurde unter die Kontrolle des B19-Promotors gestellt, wobei es sich um einen hochwirksamen, von einem Parvovirus stammenden Promotor handelt, Liu et al., 1991, J. Virol. [im Druck], um das Konstrukt N2-B19-H2b zu produzieren.
Die Southern-Blot-Analyse kann mit einer DNA durchgeführt werden, die aus PBL-, Thymocyten-, BMC-, Splenocyten- oder Lymphknotenzellsuspensionen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren extrahiert wurde, vgl. Ausubel et al., 1989, Current protocols in molecular biology; John Wiley & Sons, New York, und das Testen mit Sonde wird mit dem Fragment von der K^b-cDNA durchgeführt, das aus pBG367 durch EcoRI freigesetzt wurde. Die genomische DNA wird mit Enzymen gespalten, die in der Lage sind, zwischen den transduzierten K^b- und anderen Klasse-I-Genen des B10.AKM-Stamms zu unterscheiden. Aus bekannten Sequenzen lässt sich ableiten, dass EcoRI für diesen Zweck zufriedenstellend sein könnte, da es aus der transduzierten K^b-cDNA eine 1,6-kb-Bande freisetzen sollte, die sich von den beiden erwarteten endogenen K^k- und D^q-Klasse-I-Banden von B10.AXM unterscheidet, vgl. Arnold et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 9473–9485; Lee et al., J. Exp. Med. 168: 1719–1739. Um jedoch sicherzustellen, dass es kein Durcheinander mit Banden gab, die aus anderen Klasse-I- und Klasse-I-ähnlichen Genen freigesetzt wurden, testen wir an der DNA von B10.AKM zuerst mehrere Enzyme und wählen dann die geeigneten Restriktionsenzym-Kombinationen aus.
Die PCR-Analyse der DNA kann unter Verwendung der Primer durchgeführt werden, für die in unseren einleitenden Untersuchungen gezeigt wurden, dass sie wirksam sind (vgl. 4):
5'-Primer: 5'-GGCCCACACTCGCTGAGGTATTTCGTC-3' (deckt das 5'-Ende des α1-Exons ab) (SEQ ID Nr.: 3);
3'-Primer: 5'-GCCAGAGATCACCTGAATAGTGTGA-3' (deckt das 5'-Ende des α2-Exons ab) (SEQ ID Nr.: 4).
Die DNA wird 25 Zyklen einer PCR-Amplifikation unterworfen, wobei diese spezifischen Oligonucleotide und der CetusGeneAmp-Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingesetzt werden. Außerdem wird ³²P-dCTP zur PCR-Reaktion zugefügt, um die Produkte nach der Elektrophorese durch eine Autoradiographie sichtbar machen zu können.
Die RNA kann aus 5 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ Zellen unter Verwendung der Guanidinisothiocyanat- und CsCl-Verfahren isoliert werden, Chirgwin et al., 1979, Biochem. 18: 5294–5308, und wird sodann für die Northern-Analysen, RNase-Schutz-Analysen und für die PCR-Analysen der durch die reverse Transkriptase erzeugten Produkte eingesetzt. Für Situationen, in denen weniger als 5 × 10⁶ Zellen verfügbar sind, z. B. nach einer Blutabnahme aus den Schwänzen der einzelnen Mäuse, verwenden wir den QuickPrep mRNA Purification-Kit (Amgen) als miniaturisiertes Verfahren zum Präparieren von RNA.
Die Northern-Analysen können anhand von Standardverfahren, vgl. Ausubel et al., 1989, Current protocols in molecular biology; John Wiley & Sons, New York, und der gleichen, von der K^b-cDNA stammenden Sonde durchgeführt werden. Die vom Vektor stammende K^b-mRNA ist größer als die endogenen Klasse-I-Transkripte (2,5 kb gegenüber 1,6 kb), und zwar aufgrund des Einschlusses von Vektorsequenzen zwischen dem 3'-Ende der cDNA und der Polyadenylierungsstelle in der viralen 3'-LTR. Deshalb sollte es einfach sein, die vom Vektor stammende K^b-mRNA von den endogenen Transkripten zu unterscheiden, die möglicherweise mit einer K^b-cDNA-Sonde kreuzhybridisieren könnten. Außerdem setzen wir Sonden ein, die von einmaligen Nicht-K^b-Sequenzen des Transkripts hergeleitet sind (z. B. von B19- oder N2 hergeleiteten Vektorsequenzen).
Die RNase-Schutz-Analysen sind empfindlicher als herkömmliche Northern-Blots, jedoch noch quantitativ. Zum Herstellen von Ribo-Sonden werden Verfahren eingesetzt, die auf den veröffentlichten Methoden beruhen, vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Kurz gesagt wird die K^b-cDNA in einen Plasmidvektor cloniert, der die Promotorsequenzen der T3- und T7-RNA-Polymerase enthält (die Plasmide Bluescript oder Bluescribe von Stratagene). Unter Verwendung einer geeigneten Polymerase und von ³²P-Nucleotiden wird die Transkription der Insertion in Gang gesetzt, anschließend wird die radioaktive K^b-RNA gereinigt. Danach wird diese Sonde mit verschiedenen RNA-Präparaten inkubiert, worauf die Behandlung mit Ribonuclease folgt. Das Vorliegen einer RNA wird durch Elektrophorese auf einem Sequenzierungsgel festgestellt.
Die PCR wird nach der Behandlung der RNA mit der reversen Transkriptase als ein hochempfindliches Verfahren eingesetzt, um das K^b-Transkript nachzuweisen. Geeignete Primer werden entworfen, mit denen die vom Retrovirus stammenden Transkripte spezifisch amplifiziert werden können (der eine Primer deckt die 5'-UT-Region des Konstrukts ab und der zweite stammt aus der cDNA-Sequenz). Kurz gesagt wird die RNA durch das GuSCN/CsCl-Verfahren hergestellt, sodann wird die Erststrang-cDNA aus 5 μg der Gesamt-RNA unter Verwendung des SuperScript-Präamplifikationssystems erzeugt (BRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Die PCR-Amplifikationen werden 50 Zyklen lang durchgeführt, vgl. Hansen et al., J. Immunol. 118: 1403–1408, wobei der Cetus-GeneAmp-Kit eingesetzt wird (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Die Reaktionsprodukte werden nach der Elektrophorese auf einem 3% NuSieve-Agarose-Gel sichtbar gemacht (FMC BioProducts, Rockland, ME).
Übertragung allogener MHC-Gene plus Cyclosporin
Früher wurde schon bei teilweisen Inzucht-Miniaturschweinen gezeigt, dass Unterschiede in den Klasse-II-MHC-Loci eine kritische Rolle dabei spielen, wenn das Schicksal von primär vaskularisierten Allotransplantaten bestimmt werden soll. Cyclosporin, das früh in der Zeit nach der Transplantation verabreicht wird, hat einheitlich eine Toleranz gegenüber Klasse-II übereinstimmenden, Klasse-I-nicht-übereinstimmenden Nieren-Allotransplanten zur Folge. Jedoch erzeugt Cyclosporin alleine keine Toleranz über eine ganze MHC-Grenze hinweg. Übereinstimmend mit der Wichtigkeit der Klasse II induziert eine allogene Knochenmark-Transplantation über die Klasse-II-Grenzen hinweg eine Toleranz gegenüber Nierentransplantaten, die mit der Klasse II der Knochenmarkspender übereinstimmen, die jedoch von den Empfängern vollständig verschieden waren. Im folgenden Experiment wurde eine spezifische Transplantationstoleranz gegenüber einem vollständig SLA-verschiedenen Nierentransplantat durch eine autologe Knochenmark-Transplantation induziert, bei der das Mark des Empfängers vor der Transplantation durch eine Transduktion mit einem Retrovirus-Expressionsvektor, der ein allogenes SLA-Klasse-II-Gen trug, genetisch modifiziert wurde. Die Retrovirus-Expressionsvektoren enthielten eine cDNA für entweder SLA-DRB^a oder für -DRB^c und außerdem einen Arzneistoff-Selektionsmarker (Neo), wobei die Hochtiter-Virus-Überstände anhand amphotroper Verpackungszelllinien hergestellt wurden. Das Knochenmark von fünf an dieser Studie beteiligten Tieren wurde am Tag 2 geerntet und anschließend zusammen mit einem Virus enthaltenden Überstand für entweder ein allogenes (n = 4) oder ein syngenes (n = 1) MHC-Gen etwa 48 Stunden gezüchtet. Nach einer letalen Bestrahlung (10 Gy in zwei Fraktionen mit einem Abstand von 24 Stunden) an den Tagen –1 und 0 wurden die Tiere am Tag 0 mit 0,4 bis 1,3 × 10⁸ Zellen pro kg transplantiert. Die Wirksamkeit des Gentransfers wurde anhand eines Tests auf koloniebildende Einheiten auf Granulocyten/Makrophagen-Vorläufer (KBE-GM) in Gegenwart von G418 getestet, so dass auf Neomycin-Resistenz selektiert wurde. Die Häufigkeit der G418-resistenten KBE-GM variierte signifikant zwischen den Tieren (6,5 bis 25,9%) unmittelbar nach der Transduktion und nahm mit der Zeit langsam ab. Alle Tiere erlangten ihre Fähigkeit, auf allogene Stimuli zu reagieren, im dritten Monat nach der Knochenmark-Transplantation wieder, dies wurde durch eine MLR getestet. Außerdem wurden für „Blockierungs-" MLR-Untersuchungen mAbs eingesetzt, die für DQ- und DR-Moleküle des MHC der Klasse-II spezifisch waren, um die Erkennungszeichen von DQ und DR voneinander zu trennen. In Tests, in denen Zellen von Empfängern von Knochenmark-Transplantaten eingesetzt wurden, die mit dem allogenen DRB-Gen transduziert worden waren, war der DR-Anteil der Antwort auf die Zellen vom Gen-Spendertyp stark vermindert, dies macht deutlich, dass das transduzierte Gen wirksam war, eine DR-spezifische Nicht-Reaktivität zu induzieren. Diese Wirkung wurde bei allen Versuchstieren festgestellt, wobei sie jedoch bei der DRB^d zu cc-Kombination stärker ausgeprägt war als bei der DRB^a zu gg-Richtung. Bei einer MRL, bei der Zellen aus einem Kontrolltier eingesetzt wurden, das mit einem syngenen Gen transduziert worden war, zeigte die Blockierung von DR oder DQ bei der MLR ein Reaktivitätsmuster, das mit dem identisch war, das bei naiven Tieren des gleichen Haplotyps festgestellt wurde. Fünf Monate nach der BMT wurden die Tiere mit Nierentransplantaten provoziert, die mit der Klasse II des Spender-Gentyps übereinstimmten und mit dem ursprünglichen Haplotyp des Empfängers vollständig nicht übereinstimmten. Cyclosporin, 10 bis 15 mg/kg pro Tag, wurde zwölf Tage i. v. verabreicht, um eine Toleranz gegenüber der MHC-Klasse-I- und Neben-Antigen-Disparität zu induzieren. Drei Tiere stießen ihre Nierentransplantate an den Tagen 8, 22 und 40 ab. Die schnelle Abstoßung am Tag 8 legte eine Sensibilisierung nahe, die ein unerwünschter Effekt der Expression des allogenen Genprodukts sein könnte. Bei keinem dieser Empfänger konnte anhand einer Durchflusscytometrie das Vorliegen von gegen den Spendertyp gerichteten Antikörpern nachgewiesen werden. Ein Tier wurde tolerant und wies am Tag 101 nach der Transplantation normale Kreatininspiegel auf. Das Tier, welches das Knochenmark erhielt, das mit einem syngenen Gen transduziert worden war, machte eine schwere Abstoßungsreaktion mit hohen Kreatininspiegeln und pathologischen Gefäßveränderungen durch. Der Empfänger mit dem am längsten überlebenden Nierentransplantat erhielt auch das am wirksamsten transduzierte autologe Knochenmark; dies war anhand der anfänglichen Häufigkeit der G418^r-KBE-GM beurteilt worden. In diesem einen Fall wurden, während der Transduktion mit dem allogenen DRB-Retrovirus- Expressionsvektor, zum Kulturmedium rekombinante Cytokine zugefügt (Pixy 321 (Pixy ist ein Mensch-GM-CSF/IL3-Fusionsprotein), 100 Einheiten/ml; Maus-Stammzellen-Wachstumsfaktor, 20 Einheiten/ml; obwohl diese Cytokine eingesetzt wurden, können auch Cytokine aus der gleichen Art wie die Zelle, die transformiert wird, verwendet werden). Die Cytokine haben möglicherweise zur Transduktion von pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen verschiedener Linien geführt, umfassend die Vorläufer von dendritischen Zellen, die schließlich eine DRB-spezifische Hyporeaktivität induzierten. Diese Experimente machen deutlich, dass ein somatischer Klasse-II-MHC-DRB-Gentransfer in Knochenmarkzellen entscheidende funktionelle Konsequenzen auf die Immunantworten des Empfängers hat. Die Immunfunktion war in vitro, und noch wichtiger in vivo, signifikant verändert, wobei eine Spender-spezifische Verlängerung des Überlebens eines vollständig nicht übereinstimmenden Nierentransplantats induziert wurde. Die Transduktion von allogenen Knochenmark-Stammzellen mit MHC-Genen stellt ein Verfahren bereit, um eine Toleranz über die MHC-Grenzen hinweg zu induzieren, und zwar durch einen Mechanismus, der mit dem lymphohämatopoetischen Chimärismus vergleichbar ist. Die in den hier beschriebenen Experimenten eingesetzte letale Bestrahlung kann durch ein nicht-myelo-entfernendes konditionierendes Schema ersetzt werden, das es möglich machen würde, dass das Einwachsen des Knochenmark-Transplantats in einer für die Klinik besser geeigneten Art und Weise erfolgen kann.
III. Induktion einer Toleranz zusammen mit einer Knochenmark-Transplantation
Eine kurze Behandlung mit einem hochdosierten Cyclosporin (verabreicht in Abwesenheit von Behandlungen, z. B. einer Behandlung mit Prednison, die eine Cytokin-Freisetzung stimulieren) zur Induktion einer Toleranz gegenüber Klasse-I- und anderen Neben-Disparitäten, kombiniert mit einer Implantation von Knochenmarkzellen. induziert eine Toleranz gegenüber einer Klasse-II-Disparität
Xenotransplantate: Das folgende Verfahren wurde entwickelt, um die Zeit zu verlängern, die ein transplantiertes Organ (ein Xenotransplantat) in einem xenogenen Wirt überlebt, bevor es abgestoßen wird. Das Organ kann ein beliebiges Organ sein, z. B. eine Leber, eine Niere oder ein Herz. Die Hauptstrategien bestehen in der Entfernung der natürlichen Antikörper durch Organperfusion, in der Transplantation eines Toleranz induzierenden Knochenmarks, gegebenenfalls in der Implantation von Stromagewebe des Spenders, und gegebenenfalls in der Verabreichung einer kurzen Behandlung mit einem Helferzellen reduzierenden Wirkstoff etwa zu der Zeit der Einführung des Transplantats, wie vorstehend beschrieben, wobei die Vorbereitung des Empfängers auf die Transplantation beliebige oder alle diese Schritte umfasst. Vorzugsweise werden sie in der folgenden Reihenfolge durchgeführt.
Zuerst wird ein Präparat eines gegen menschliche Thymocyten gerichteten Globulins (ATG) des Pferdes in den Empfänger intravenös injiziert. Das Antikörperpräparat entfernt reife T-Zellen und natürliche Killerzellen. Wenn man die reifen T-Zellen nicht entfernen würde, würden sie die Abstoßung sowohl des Knochenmark-Transplantats als auch, nach einer Sensibilisierung, des Xenotransplantats selbst fördern. Genauso wichtig ist es, dass das ATG-Präparat auch die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) entfernt. Die NK-Zellen haben möglicherweise keine Wirkung auf das implantierte Organ, sie würden jedoch sofort wirken und das neu eingeführte Knochenmark abstoßen. Außerdem kann ein Anti-Mensch-ATG-Präparat eingesetzt werden, das aus einem beliebigen Säugerwirt gewonnen wurde, z. B. ein in Schweinen hergestelltes ATG, wobei jedoch bisher Präparate von Schweine-ATG einen niedrigeren Titer aufwiesen als das aus Pferden stammende ATG. ATG wirkt besser als die gegen NK gerichteten monoclonalen Antikörper, da die Letzteren im Allgemeinen nicht für alle NK-Zellen lytisch sind, während das polyclonale Gemisch in dem ATG-Präparat in der Lage ist, alle NK-Zellen des Wirts zu lysieren. Jedoch können auch gegen NK-Zellen gerichtete monoclonale Antikörper eingesetzt werden.
Das Vorliegen eines Spender-Antigens im Thymus des Wirts während der Zeit, in der sich die T-Zellen des Wirts nach der Transplantation regenerieren, ist eine kritische Phase für die tolerierenden Wirts-T-Zellen. Wenn die hämatopoetischen Stammzellen des Spenders nicht in der Lage sind, im Thymus des Wirts etabliert zu werden und eine Toleranz zu induzieren, bevor sich die T-Zellen des Wirts regenerieren, sind während des nicht-myelo-entfernenden Schemas möglicherweise wiederholte Dosen von gegen die Empfänger-T-Zellen gerichteten Antikörpern erforderlich. So kann es mehrere Wochen lang erforderlich sein, die T-Zellen des Wirts kontinuierlich zu entfernen. Andererseits kann, z. B. wenn diese Vorgehensweise nicht erfolgreich ist und eine Toleranz (die durch die Akzeptanz eines Hauttransplantats des Spenders, durch die spezifische zelluläre Hyporeaktivität in vitro und durch die humorale Toleranz gemessen wird) in diesen Tieren nicht induziert wird, die Vorgehensweise so modifiziert werden, dass eine Thmyektomie beim Wirt durchgeführt wird. Bei thymektomierten Empfängern haben die T-Zellen des Wirts keine Möglichkeit, sich im Thymus des Wirts zu differenzieren, vielmehr müssen sie sich im Thymus des Spenders differenzieren. Wenn dies nicht möglich ist, ist das Tier für die Immunkompetenz auf die T-Zellen des Spenders angewiesen, die sich im Thymus des Spenders entwickeln. Die Immunkompetenz kann durch die Fähigkeit gemessen werden, ein Hauttransplantat von einem allogenen Spender des Nicht-Spender-Typs abzustoßen und in einer Pathogen-enthaltenden Umgebung zu überleben.
Auch kann es erforderlich oder wünschenswert sein, den Empfänger zu splenektomieren, um eine Anämie zu verhindern.
Zweitens wird an den Empfänger eine niedrig dosierte Bestrahlung verabreicht, um für die neu injizierten Knochenmarkzellen Platz zu schaffen. Dabei wurde gefunden, dass eine subletale Dosis zwischen 100 und 400 Rad Ganzkörper-Bestrahlung plus 700 Rad örtliche Thymus-Bestrahlung für diesen Zweck geeignet sind.
Drittens werden die natürlichen Antikörper aus dem Blut des Empfängers durch Hämoperfusion einer Leber der Spenderart absorbiert. Die vorher gebildeten natürlichen Antikörper (nAb) sind die primären Elemente bei der Abstoßung eines Transplantats. Die natürlichen Antikörper binden an xenogene Endothelzellen und bestehen hauptsächlich aus der IgM-Klasse. Diese Antikörper sind unabhängig von jeglicher bekannten früheren Exposition gegenüber den Antigenen des xenogenen Spenders. B-Zellen, die diese natürlichen Antikörper produzieren, sind eher von T-Zellen unabhängig und werden normalerweise gegenüber Selbst-Antigenen tolerant gemacht, indem sie während der Entwicklung mit diesen Antigenen in Kontakt gekommen sind. Der Mechanismus, wodurch die sich neu entwickelnden B-Zellen tolerant gemacht werden, ist nicht bekannt. Die Leber kann die natürlichen Antikörper wirksamer absorbieren als die Niere.
Der vierte Schritt in dem nicht-myelo-entfernenden Verfahren besteht darin, ein Stromagewebe des Spenders, das vorzugsweise aus einer fetalen Leber, Thymus und/oder fetalen Milz gewonnen wird, in den Empfänger zu transplantieren, vorzugsweise in die Nierenkapsel. Das Einwachsen der transplantierten Stammzellen und die Hämatopoese über die Grenzen ungleicher Arten hinweg werden gesteigert, indem eine hämatopoetische Stroma-Umgebung aus der Spenderart bereitgestellt wird. Die Stromamatrix liefert artspezifische Faktoren, die für Wechselwirkungen zwischen hämatopoetischen Zellen und ihrer Stroma-Umgebung erforderlich sind, z. B. hämatopoetische Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle und ihre Liganden.
Da die Hämatopoese im Fetus hauptsächlich in der Leber erfolgt, kann die fetale Leber auch als Alternative zu Knochenmark als eine Quelle der hämatopoetischen Stammzellen dienen. Der Thymus ist der Ort, an dem die Reifung der T-Zellen hauptsächlich erfolgt. Jedes Organ umfasst eine organspezifische Stromamatrix, die die Differenzierung der entsprechenden undifferenzierten Stammzellen unterstützen kann, die in den Wirt implantiert wurden. Obwohl auch ein erwachsener Thymus eingesetzt werden kann, ist ein fetales Gewebe bevorzugt, das ausreichend früh in der Gravidität gewonnen wird, da es frei ist von reifen T-Lymphocyten, die eine GVHD auslösen können. Außerdem überleben fetale Gewebe, wenn sie transplantiert werden, eher als erwachsene Gewebe. Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme gegen die GVHD kann man das Stromagewebe des Thymus vor der Transplantation bestrahlen, z. B. mit 1000 Rad. Als Alternative oder zusätzlich zur Transplantation können fetale Leberzellen in einer flüssigen Suspension verabreicht werden.
Fünftens werden Knochenmarkzellen (BMC) oder eine andere Quelle von hämatopoetischen Stammzellen, z. B. eine Suspension fetaler Leberzellen, des Spenders in den Empfänger injiziert. Die Spender-BMC steuern gezielt zu geeigneten Stellen des Empfängers hin und wachsen kontinuierlich zusammen mit den restlichen Wirtszellen und vermehren sich, so dass sie eine chimäre lymphohämatopoetische Population erzeugen. Durch diesen Prozess werden die sich neu bildenden B-Zellen (und die Antikörper, die sie produzieren) den Spender-Antigenen ausgesetzt, so dass das Transplantat als Selbst erkannt wird. Eine Toleranz gegenüber dem Spender lässt sich auch auf der T-Zell-Ebene bei den Tieren feststellen, bei denen das Einwachsen transplantierter hämatopoetischer Stammzellen, z. B. BMC, erreicht wurde. Wenn ein Organtransplantat in einen solchen Empfänger eingebracht wird, und zwar mehrere Monate, nachdem der Knochenmark-Chimärismus induziert wurde, werden die natürlichen Antikörper gegen den Spender verschwunden sein, und das Transplantat sollte sowohl durch den humoralen Arm als auch durch den zellulären Arm des Immunsystems akzeptiert werden. Diese Vorgehensweise hat den zusätzlichen Vorteil, dass die Organtransplantation ausreichend lang nach der Transplantation der hämatopoetischen Zellen, z. B. einer BMT, z. B. einer Suspension der fetalen Leber, durchgeführt werden kann, so dass sich zum Zeitpunkt der Organtransplantation der normale Gesundheitszustand wieder eingestellt und die Immunkompetenz wieder erholt hat. Durch die Verwendung xenogener Spender wird es möglich, Knochenmarkzellen und Organe aus dem gleichen Tier oder aus genetisch übereinstimmenden Tieren zu verwenden.
Schließlich wird eine kurze Behandlung mit einem Helferzellen reduzierenden Wirkstoff, z. B. eine kurze Behandlung von hochdosiertem CSA, an den Empfänger verabreicht. Wie vorstehend beschrieben, wird die Behandlung etwa zu der Zeit der Implantation oder etwas vorher begonnen und so lange fortgesetzt, wie die Stimulation einer reifen T-Zelle und die Initiierung der Abstoßung dauert. Obwohl beliebige dieser Verfahren dazu geeignet sind, das Überleben eines transplantierten Organs zu verbessern, werden die besten Ergebnisse erreicht, wenn alle Schritte in Kombination eingesetzt werden. Die Verfahren der Erfindung können eingesetzt werden, um eine Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten, wobei z. B. sowohl der Spender des Transplantats als auch der Empfänger Menschen sind, und gegenüber xenogenen Transplantaten bereitzustellen, wobei z. B. der Spender des Transplantats ein nicht menschliches Tier, z. B. ein Schwein, z. B. ein Miniaturschwein, und der Empfänger des Transplantats ein Primat, z. B. ein Mensch, ist.
Obwohl beliebige dieser Verfahren dazu geeignet sind, das Überleben eines transplantierten Organs zu verbessern, werden die besten Ergebnisse erreicht, wenn alle Schritte in Kombination eingesetzt werden. Die Verfahren der Erfindung können eingesetzt werden, um eine Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten, wobei z. B. sowohl der Spender des Transplantats als auch der Empfänger Menschen sind, und gegenüber xenogenen Transplantaten zu verleihen, wobei z. B. der Spender des Transplantats ein nicht menschliches Tier, z. B. ein Schwein, z. B. ein Miniaturschwein, und der Empfänger des Transplantats ein Primat, z. B. ein Mensch, ist.
Im Fall von xenogenen Transplantaten sollten der Spender des Transplantats und das Individuum, das entweder die Toleranz induzierenden hämatopoetischen Zellen oder die Leber bereitstellt, die perfundiert werden soll, das gleiche Individuum sein, oder sie sollten so nah wie möglich verwandt sein. Z. B. ist es bevorzugt, dass das Implantatgewebe von einer Kolonie von Spendern stammt, bei der eine hochgradige Inzucht besteht.
Ausführliches Protokoll
Im folgenden Protokoll, mit dem ein Cynomolgus-Affe auf den Empfang einer Niere von einem Miniaturschwein-Spender vorbereitet wird, ist die Zeit Null als der Zeitpunkt definiert, an dem die arteriellen und venösen Kanülen des Empfängers mit der Leber verbunden werden, die perfundiert werden soll.
Am Tag –1 wird dem Empfänger ein kommerzielles Präparat (Upjohn) mit einem Anti-Mensch-Anti-Thymocyten-Globulin (ATG) des Pferdes injiziert. ATG entfernt die reifen T-Zellen und die natürlichen Killerzellen, die anderenfalls eine Abstoßung der Knochenmarkzellen bewirken würden, welche zur Induktion einer Toleranz eingesetzt werden. Der Empfänger wird anästhesiert, ein i. v.-Katheter wird in den Empfänger eingeführt, und 6 ml eines heparinisierten Vollblut-Präparats werden vor der Infektion entnommen. Danach wird das ATG-Präparat intravenös injiziert (50 mg/kg). Proben des heparinisierten Vollbluts zu je 6 ml werden für den Test zu den Zeitpunkten 30 Min., 24 Stunden und 48 Stunden entnommen. Die Blutproben werden auf die Wirkung der Antikörper-Behandlung auf die Aktivität der natürlichen Killerzellen (Test auf K562-Zielen) und durch eine FACS-Analyse auf Lymphocyten-Subpopulationen untersucht, umfassend CD4, CD8, CD3, CDIIb und CD16. Einleitende Ergebnisse aus beiden Tests zeigen, dass beide Gruppen von Zellen durch die Verabreichung von ATG entfernt werden. Wenn reife T-Zellen und NK-Zellen nicht entfernt sind, kann die ATG-Behandlung zu späteren Zeitpunkten während des Verfahrens erneut verabreicht werden, und zwar sowohl vor als auch nach der Organtransplantation.
Eine subletale Bestrahlung wird zwischen den Tagen –1 und –8 an den Empfänger verabreicht. Die Bestrahlung ist erforderlich, um ausreichend viele der endogenen BMC des Empfängers zu entfernen, so dass die Hämatopoese der neu eingeführten fremden BMC stimuliert wird. Eine subletale Ganzkörper-Bestrahlung ist ausreichend, um ein Anwachsen des Transplantats zu ermöglichen, und übt nur minimale toxische Effekte auf den Empfänger aus. Eine Ganzkörper-Bestrahlung (150 Rad) wurde an die Cynomolgus-Affen-Empfänger aus einer bilateralen Kobalt-Teletherapie-Einheit (TRBC) mit 10 Rad/Min. verabreicht. Außerdem erfolgte eine lokale Bestrahlung des Thymus (700 Rad), um das Einwachsen des Transplantats zu erleichtern.
Die natürlichen Antikörper sind die primäre Ursache einer Organabstoßung. Um die natürlichen Antikörper aus dem Kreislauf des Empfängers vor der Transplantation zu entfernen, erfolgt am Tag 0 eine wirksame Absorption der natürlichen Antikörper (nAb) unter Verwendung der Leber eines Miniaturschweins wie folgt. Zum Zeitpunkt –90 Minuten wird das Spender-Schwein anästhesiert und die Leber durch herkömmliche Operationstechniken zur Entnahme präpariert. Zum Zeitpunkt –60 Minuten wird der Empfänger-Affe anästhesiert. Ein peripherer i. v.-Katheter wird eingeführt und eine 6-ml-Probe Vollblut entnommen. Durch einen Mittelschnitt werden die abdominale Aorta und die Vena cava freigelegt. Silikongummi-Kanülen mit Seitenöffnungen für die Blutentnahme werden in die Blutgefäße eingeführt.
Zum Zeitpunkt –30 Minuten wird die Leber in situ so lange perfundiert, bis sie blass wird, danach wird sie aus dem Spender-Schwein entnommen und in kaltes Ringer-Laktat gelegt. Die Leber wird gerade bis zur Reperfusion im Affen kalt gehalten. Eine Leberbiopsie wird entnommen. Zum Zeitpunkt –10 Minuten wird die Leber mit einer warmen Albuminlösung so lange perfundiert, bis sie warm ist (37 Grad).
Zum Zeitpunkt 0 werden die arteriellen und venösen Kanülen des Empfängers mit der Pfortader und Vena cava der Spenderleber verbunden, und die Perfusion wird begonnen. Zum Zeitpunkt 30 Minuten bzw. 60 Minuten werden Leberbiopsien entnommen. Außerdem werden vom Empfänger nach 30 bzw. 60 Minuten Blutproben für Serum entnommen. Zum Zeitpunkt 60 Minuten wird die Verbindung zwischen der Leber und den Kanülen unterbrochen und die großen Blutgefäße des Empfängers wiederhergestellt. Die Leber wird verworfen, nachdem sie ihre Funktion erfüllt hat, die schädlichen natürlichen Antikörper aus dem Empfänger-Affen zu absorbieren. Aus dem Empfänger werden zu den Zeitpunkten 2, 24 und 48 Stunden weitere Blutproben für Serum entnommen. Wenn diese Prozedur als zwei aufeinander folgende Perfusionen von Schweinelebern durchgeführt wurde, zeigte die zweite Leber keinen Hinweis auf schwache ischämische Veränderungen während der Perfusion. Am Ende einer 30-minütigen Perfusion sah die zweite Leber größtenteils normal aus und schien zu funktionieren; dies wurde durch die dunklere Farbe des ausströmenden venösen Bluts im Vergleich zum einströmenden arteriellen Blut in den zwei nebeneinander liegenden Kanülen deutlich. Die Gewebeschnitte aus den Lebern waren normal, jedoch zeigten Immunfluoreszenz-Färbungen IgM auf Endothelzellen. In den Serumproben wurde eine Abnahme der natürlichen Antikörper festgestellt.
Um ein langfristiges Überleben des transplantierten Organs durch eine T-Zellen- und B-Zellen vermittelte Toleranz zu fördern, werden Knochenmarkzellen des Spenders an den Empfänger verabreicht, so dass sich ein chimäres Knochenmark bildet. Das Vorliegen von Spender-Antigenen im Knochenmark macht es möglich, dass die sich neu entwickelnden B-Zellen und die neu sensibilisierten T-Zellen die Antigene des Spenders als Selbst erkennen, und induziert dadurch eine Toleranz gegenüber dem transplantierten Organ aus dem Spender. Um die Spender-BMC zu stabilisieren, wird ein Stromagewebe des Spenders, in Form von Gewebeschnitten fetaler Leber, Thymus und/oder fetaler Milz, unter die Nierenkapsel des Empfängers transplantiert. Das Stromagewebe wird vorzugsweise gleichzeitig mit oder vor der Verabreichung der hämatopoetischen Stammzellen, z. B. BMC oder einer Suspension fetaler Leberzellen, transplantiert.
Der Chimärismus kann anhand einer zweifarbigen Durchflusscytometrie verfolgt werden. In diesem Test werden monoclonale Antikörper eingesetzt, mit denen zwischen den Haupthistokompatibilitäts-Antigenen der Klasse I des Spenders und den herkömmlichen Leukocyten-Antigenen versus den Haupthistokompatibilitäts-Antigenen der Klasse I des Empfängers unterschieden werden kann. Die BMC können ihrerseits entweder gleichzeitig mit der Organtransplantation oder davor injiziert werden. Das Knochenmark wird geerntet und intravenös injiziert (7,5 × 10⁸/kg), wie früher beschrieben (Pennington et al., 1988, Transplantation 45: 21–26). Sollte festgestellt werden, dass die natürlichen Antikörper noch vor der Induktion der Toleranz wieder auftreten und sollten diese Antikörper eine Schädigung des Transplantats auslösen, kann das Protokoll so modifiziert werden, dass nach der BMT und vor der Organtransplantation eine ausreichende Zeit gewartet wird, in der sich eine humorale Toleranz etablieren kann.
Die vorstehend beschriebenen Vorgehensweisen sind so gestaltet, dass sie das Problem der Organabstoßung synergistisch verhindern. Wenn eine Niere in einen Cynomolgus-Affen transplantiert wird, nachdem die Leber-Absorption der natürlichen Antikörper erfolgt ist, jedoch ohne dass eine Knochenmark-Transplantation zur Induktion einer Toleranz eingesetzt wird, funktioniert die Niere ein bis zwei Tage, anschließend kommt es zur Abstoßung der Niere. Wenn die vier Schritte des Verfahrens durchgeführt wurden (Absorption der natürlichen Antikörper durch die Leber-Perfusion, Verabreichung von ATG, subletale Bestrahlung und Knochenmark-Infusion, anschließend Transplantation einer Schweineniere in einen Empfänger-Primaten), überlebte die Niere sieben Tage, bevor es zur Abstoßung kam. Trotz der Abstoßung des transplantierten Organs blieb der Empfänger gesund.
Wenn fetale Leber- und Thymus-Stromagewebe des Schweins unter die Nierenkapsel von zwei subletal bestrahlten SCID-Mäusen transplantiert wurden, stammten zwei Wochen nach der Transplantation 25 bis 50% der Leukocyten des peripheren Bluts vom Spender. Beim dritten Tier, das eine fetale Leber ohne Thymus erhielt, wurde kein signifikantes Ausmaß an Chimärismus nachgewiesen.
Die Verfahren der Erfindung können, wie beschrieben, in Kombination eingesetzt werden, oder ein Teil davon kann angewendet werden.
Das Verfahren zum Einführen von Knochenmarkzellen kann verändert werden, insbesondere indem (1) das Zeitintervall zwischen dem Injizieren der hämatopoetischen Stammzellen und dem Implantieren des Transplantats verlängert wird; indem (2) die Menge der injizierten hämatopoetischen Stammzellen vergrößert oder verkleinert wird; indem (3) die Anzahl der Injektionen mit den hämatopoetischen Stammzellen variiert wird; indem (4) das Verfahren zur Übertragung der hämatopoetischen Stammzellen variiert wird; indem (5) die Gewebequelle der hämatopoetischen Stammzellen variiert wird, z. B. kann eine Suspension fetaler Leberzellen verwendet werden; oder indem (6) der Spender der hämatopoetischen Stammzellen variiert wird. Obwohl hämatopoetische Stammzellen bevorzugt sind, die vom Spender des Transplantats stammen, können die hämatopoetischen Stammzellen auch aus anderen Individuen oder Arten oder aus genetisch veränderten Inzucht-Spenderstämmen oder aus einer in vitro-Zellkultur gewonnen werden.
Die Verfahren, mit denen der Empfänger auf das Transplantat hämatopoetischer Stammzellen vorbereitet wird, können variiert werden. Z. B. kann beim Empfänger eine Splenektomie oder einem Thymektomie durchgeführt werden. Die Letztere würde vorzugsweise vor dem nicht-myelo entfernenden Behandlungsschema durchgeführt werden, z. B. am Tag –14.
Bei der Hämoperfusion natürlicher Antikörper bestehen verschiedene Möglichkeiten: (1) können andere vaskuläre Organe verwendet werden, z. B. Leber, Niere, Darm; (2) können mehrere Organe hintereinander eingesetzt werden; (3) kann die Länge der Zeit variieren, die jedes Organ perfundiert wird; (4) kann der Spender des perfundierten Organs variieren. Die Bestrahlung des Empfängers kann wie folgt eingesetzt werden: (1) die absorbierte Dosis der Ganzkörper-Bestrahlung unter der subletalen Dosis kann variieren; (2) unterschiedliche Körperteile (z. B. Thymus, Milz) können das Ziel sein; (3) die Bestrahlungsrate kann variieren (z. B. 10 Rad/Min., 15 Rad/Min.); oder (4) das Zeitintervall zwischen der Bestrahlung und der Transplantation der hämatopoetischen Stammzellen kann variieren, wobei ein beliebiges Zeitintervall zwischen 1 und 14 Tagen verwendet werden kann und die Verwendung eines Zeitintervalls von 4 bis 7 Tagen gewissen Vorteile haben kann. Antikörper, die vor der Transplantation der hämatopoetischen Zellen eingeführt werden, können wie folgt variiert werden: indem (1) monoclonale Antikörper gegen T-Zellen-Untergruppen oder NK-Zellen eingesetzt werden (z. B. Anti-NKH1_A, wie im US Patent Nr. 4 772 552 von Hercend et al. beschrieben, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist); indem (2) ein Anti-Mensch-ATG in anderen Säuger-Wirten zubereitet wird (z. B. im Affen, Schwein, Kaninchen, Hund); oder indem (3) ein Anti-Affen-ATG eingesetzt wird, das in einem der vorstehend erwähnten Wirte hergestellt wurde.
Die Verfahren der Erfindung können mit anderen Säuger-Empfängern (z. B. Rhesusaffen) durchgeführt werden, außerdem können andere Säuger-Spender genutzt werden (z. B. Primaten, Schafe oder Hunde). Als Alternative oder zusätzlich zur Hämoperfusion können die Antikörper des Wirts entfernt werden, indem ein Überschuss an hämatopoetischen Zellen verabreicht wird.
Stromagewebe, das vor der Transplantation der hämatopoetischen Zellen, z. B. BMT, eingeführt wird, kann wie folgt variiert werden: indem (1) das fetale Leber- und Thmyusgewebe als eine flüssige Zellsuspension verabreicht wird; indem (2) ein fetales Leber- oder Thymus-Stromagewebe, jedoch nicht beides verabreicht wird; indem (3) ein Stromatransplantat in andere eingekapselte, gut vaskularisierte Stellen eingeführt wird; oder indem (4) als Quelle des Stromagewebes ein erwachsener Thymus oder eine fetale Milz eingesetzt wird.
Toleranz gegenüber vollständig MHC nicht übereinstimmenden Nieren-Allotransplantaten im chimären Schwein
Es wurde bereits gezeigt, dass der Übereinstimmung des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes (MHC) der Klasse II eine entscheidende Bedeutung für das Erreichen einer Toleranz gegenüber Nierentransplantaten (KTx) im Miniaturschwein zukommt. Wenn die Antigene der Klasse II übereinstimmen, kann eine langfristige spezifische Toleranz über die Grenze der MHC-Klasse-I- und Neben-Antigene (MA) hinweg gleichmäßig induziert werden, indem eine kurze Behandlung mit Cyclosporin erfolgt. Jedoch erzeugt das Cyclosporin diese Wirkung nicht über eine vollständige MHC-Grenze hinweg. Eine Knochenmark-Transplantation (BMT) über Einzel-Haplotyp-Klasse-II-MHC + MA-Grenzen hinweg erzeugt vollständig chimäre Tiere, wie durch FCM bestätigt wurde. Diese Chimären stellen die normale zelluläre Immunfunktion zwei bis drei Monate nach der BMT wieder her, wie durch MLR und CML getestet wurde. Vier solche chimären Tiere (vgl. Tabelle 1, Nr. 1 bis 4) erhielten Nierentransplantate von Spendern, die in der Klasse II mit den BMT-Spendern übereinstimmten und mit den Empfängern vollständig nicht übereinstimmten. Eine 12-tägige Behandlung mit Cyclosporin (10 mg/kg/Tag) war die einzige Immunsuppression, die auf die Nierentransplantation folgte. Bei allen vier Schweinen blieben die normalen Kreatinin-(Cr-)Werte (< 2 mg%) länger als 300 Tage bestehen, und ein Empfänger lebt seit über drei Jahren mit einer guten Nierenfunktion (Cr < 2 mg%) und einer Transplantathistologie, die eine minimale Rand-Abstoßung zeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Induktion einer Toleranz gegenüber Antigenen der Klasse II durch eine BMT es möglich macht, dass eine kurze Behandlung mit Cyclosporin eine spezifische Toleranz (wie durch Hauttransplantate getestet) gegenüber vollständig allogenen Nierentranplantaten induzieren kann. Daraufhin haben wir die Spezifität dieses Phänomens untersucht, indem wir bestimmt haben, ob ein in Einzel-Haplotyp Klasse-II + MA nicht übereinstimmendes BMT die durch Cyclosporin induzierte langfristige Akzeptanz von Nierentransplantaten fördern kann, die mit sowohl dem Empfänger als auch dem BMT-Spender vollständig nicht übereinstimmten (Tabelle 1, Nr. 5 bis 10). Eine 12-tägige Behandlung mit Cyclosporin ermöglichte ein langfristiges Überleben solcher Nierentransplantate in chimären Empfängern. Das Tier Nr. 5 war noch am Leben, und es ging ihm klinisch gut, wobei es normale Cr-Werte aufwies; die Histologie jedoch zeigt eine Rand-Abstoßung. Das Tier Nr. 6 wurde 18 Monate nach der Nierentransplantation getötet, wobei es eine sich verschlechternde Nierenfunktion aufwies (Cr > 11 mg%). Das Tier Nr. 7 wurde sechs Monate nach der Nierentransplantation aufgrund einer Sepsis getötet, wobei die Nierentransplantate eine mittelmäßig ausgeprägtes tubulointestinales Infiltrat ohne Hinweise auf einen Gefäßschaden zeigten. Die beiden langfristig überlebenden Tiere (Schweine Nr. 3 und 5) wurden kürzlich auf die Anti-Spender-Reaktivität getestet. CML und MLR zeigten eine spezifische Nicht-Reaktivität auf Zellen vom Typ des Nierentransplantat-Spenders. Die Schweine Nr. 8 bis 10 erhielten ein Nierentransplantat von herausgezüchteten („outbred") Yorkshire-Spendern. Diese Tiere entwickelten ein irreversibles Nierenversagen, das kurz nach Beenden der Cyclosporin-Therapie begann.
Tabelle 1
Somit macht eine kurze postoperative Behandlung mit Cyclosporin bei MHC-Klasse-II nicht übereinstimmenden BMT-Empfängern die Induktion einer Toleranz gegenüber Nierentransplantaten möglich, die Klasse-II übereinstimmend mit dem BMT-Spender sind. Eine langfristige Nicht-Reaktivität gegenüber Nierentransplantaten, die sowohl mit dem Empfänger als auch mit dem BMT-Spender vollständig nicht übereinstimmen, kann in einigen Fällen erreicht werden, dies hängt offensichtlich vom Grad der Verschiedenheit an mehreren Loci ab (zu vergleichen mit dem Unterschied zwischen Inzucht- und herausgezüchteten Spendern).
Eine kurze Behandlung mit Cyclosporin zum Unterdrücken der T-Zell-Funktion bei einer allogenen Nierentransplantation bei Primaten
Das folgende Experiment zeigt, dass ein gemischter Chimärismus, der während einer nicht-myelo-entfernenden Behandlung zum erfolgreichen Anwachsen eines Transplantats erhalten wird, in der Lage ist, einen lymphohämatopoetischen Chimärismus verschiedener Linien und eine langfristige Toleranz gegenüber Nierenallotransplantaten zwischen vollständig MHC nicht übereinstimmenden Cynomolgus-Affen zu erzeugen. Eine vollständige Entfernung der lymphohämatopoetischen Elemente des Wirts ist weder erforderlich noch wünschenswert, wenn eine Knochenmark-Transplantation als Toleranz induzierendes Behandlungsschema eingesetzt wird. Vielmehr ist es vorteilhaft, einen Zustand eines gemischten Chimärismus zu erreichen, wobei das Vorliegen bestimmter vom Donor stammenden Elemente eine spezifische Toleranz induziert, während die Antigen präsentierenden Zellen des Wirtstyps eine normale Immunkompetenz aufrechterhalten.
In murinen Studien wurde gezeigt, dass die Entfernung der reifen T-Zellen des Wirts wichtig ist, um einen gemischten Chimärismus zu erreichen. In einleitenden Studien unter Verwendung von vollständig MHC nicht übereinstimmenden Cynomolgus-Affen wurden verschiedene monoclonale Antikörper gegen die reifen T-Zellen-Untergruppen (Anti-CD4 und Anti-CD8) und außerdem verschiedene Quellen des Anti-Thymocyten-Globulins (ATG) als T-Zellen entfernendes Reagens getestet. Obwohl diese Antikörper zu einer deutlichen Entfernung von T-Zellen im peripheren Blut führten, machten Biopsien von Lymphknoten deutlich, dass noch restliche T-Zellen übrig blieben, die häufig mit Antikörpern beschichtet waren. Um die Funktion der T-Zellen noch weiter zu unterdrücken, wurde eine einmonatige Behandlung mit einem i. m. Präparat von Cyclosporin (CyA) in Öl zu dem Vorbereitungsbehandlungsschema zugefügt. Diese Behandlung hatte während der Wirkstoffverabreichung therapeutische Spiegel von Cyclosporin zur Folge, wobei die Spiegel in einem Zeitraum von drei Wochen nach Beendigung der Arzneistoffverabreichung allmählich abnahmen. Das grundlegende Protokoll für ein nicht-letales Vorbereitungsbehandlungsschema sah wie folgt aus: Cynomolgus-Affen mit einem Gewicht von 6 bis 10 kg (Charles River Primates, Wilmington, MA) wurden mit 300 Rad einer WBI behandelt, entweder als Einzeldosis (Nr. M393) am Tag –6 oder als zwei Fraktionen von 150 Rad jeweils am Tag –6 und am Tag –5 (Nr. M3093 und Nr. M3293). Die 700 Rad-Thymus-Bestrahlung wurde am Tag –1 verabreicht. Das Anti-Mensch-Thymocyten-Globulin (ATG) des Pferdes (Upjohn) wurde mit 50 mg/kg an den Tagen –2, –1 und 0 i. m. verabreicht. Die orthotope Nierentransplantation erfolgte am Tag 0 durch einen Mittelschnitt, wobei End-zu-Seite-Anastomosen der Nierenarterie und der Nierenvene des Spenders in die Aorta bzw. Vena cava des Empfängers durchgeführt wurden und wobei eine Ureter-Ureter-Anasomose für die Harndränage verwendet wurde. Das Knochenmark wurde aus zwei Rippen des Spenders geerntet, als Einzelzellsuspension zubereitet und am Ende der Nierentransplantation in den Empfänger i. v. infundiert. Die Behandlung mit Cyclosporin (Sandimmun, 15 mg/kg/Tag, suspendiert in Olivenöl), i. m., wurde am Tag 0 begonnen und 27 Tage fortgesetzt.
Der Affe Nr. 393 wurde am Tag 8 pancytopenisch und benötigte in den nächsten zwei Wochen drei Bluttransfusionen, hierfür wurde ein in der Blutgruppe übereinstimmendes, bestrahltes Vollblut verwendet. Danach erholten sich die peripheren Blutkomponenten nach und nach und waren am Tag 30 normal. Die Nierenfunktion war über 250 Tage normal geblieben, und eine Biopsie am Tag 215 zeigte eine normale Niere.
Aufeinanderfolgende durchflusscytometrische (FMC) Analysen wurden an diesem Tier durchgeführt, indem ein monoclonaler Anti-Klasse-I-Antikörper verwendet wurde, bei dem vorher bestimmt wurde, dass er den Spender vom Wirt unterscheiden kann, und indem lymphoide, monocytische und neutrophile Populationen analysiert wurden, die durch die Streuprofile bestimmt worden waren. Ein deutlicher Beweis für den Chimärismus wurde in allen drei Subpopulationen erstmals am Tag 10 nachgewiesen und blieb bei gleichbleibend hohen Spiegeln bestehen, bis die Cyclosporin-Behandlung am Tag 27 beendet wurde. Danach nahmen die in jeder Subpopulation nachgewiesenen Chimärismus-Spiegel ab, wobei der Chimärismus jedoch durch FCM bei den Lymphocyten (1,5%) und bei den Monocyten (29%) sogar noch am Tag 203 nachweisbar war, dies war der letzte Testtag. Außerdem wurden in einem Knochenmarkaspirat am Tag 203 durch FCM 11,2% Spenderzellen nachgewiesen.
Die gemischten Lymphocyten-Reaktionen, die vor der Transplantation und am Tag 159 nach der Transplantation durchgeführt wurden, zeigten einen spezifischen Rückgang der Anti-Spender-Reaktivität (Tabelle 2).
Dieses Ergebnis, zusammen mit der normalen Nierenfunktion und der normalen Nierenhistologie ohne jegliche zusätzliche exogene Immunsuppression seit Tag 27, lässt uns folgern, dass in diesem Tier durch das Etablieren eines gemischten Chimärismus eine spezifische Transplantationstoleranz induziert wurde. Zwei weitere Tiere wurden nach dem gleichen Protokoll, jedoch mit einem intravenösen Cyclosporin-Präparat behandelt, dies führte nach Beendigung zu einem plötzlichen Abfall der Cyclosporin-Spiegel im Blut, und nicht zu einem allmählichen Abnehmen der Spiegel innerhalb eines Zeitraums von drei Wochen. Eines dieser Tiere starb am Tag 12 während der Aplasie-Phase an einer Sepsis, und beim anderen Tier waren nach Beenden der Cyclosporin-Behandlung keine Hinweise auf Chimärismus nachweisbar, und obwohl dieses Tier am Tag 100 noch lebte, zeigte es anhand von klinischen und pathologischen Kriterien einen Verlauf, der für eine chronische Abstoßung sprach.
Um die Toxizität des Vorbereitungsbehandlungsschemas abzuschwächen, modifizierten wir anschließend das Bestrahlungsprotokoll. Bei dem einen Tier (Nr. 3893) wurde die WBI auf 1,5 Gy verringert. Dieses Tier entwickelte keinen gemischten Chimärismus und stieß das Nierentransplantat ab (Kreatinin = 12,1, am Tag 47). Bei zwei weiteren Tieren (Nr. 3093 und Nr. 3292) wurde die WBI bei 3,0 Gy beibehalten, wurde jedoch auf 1,5 Gy an zwei aufeinander folgenden Tagen fraktioniert (–6 und –5), anstatt eine Einzeldosis zu verabreichen. Diese beiden Tiere entwickelten einem gemischten Chimärismus mehrerer Arten, der erstmals am Tag 11 bzw. am Tag 20 nachweisbar war. Bei den Tieren zeigte dieses Vorbereitungsbehandlungsschema eine viel geringere Toxizität als bei den Tieren, die eine nicht fraktionierte Bestrahlung erhalten hatten, und beide blieben chimär, mit einer normalen Nierenfunktion zum Zeitpunkt dieser Niederschrift (Tag 40 bzw. Tag 25).
Nieren-Xenotransplantation vom Schwein auf den Affen durch eine Vorgehensweise für gemischtes-Chimärismus-
Das folgende Experiment zeigt die Induktion einer Toleranz in Affen gegenüber Schweineorganen mittels einer Vorgehensweise eines xenogenen lymphohämatopoetischen Chimärismus, für die früher gezeigt wurde, dass sie in konkordanten Nagersystemen wirksam ist. Bisher haben 16 Cynomolgus-Affen Nierentransplantate des Schweins zusammen mit einem xenogenen Knochenmark aus dem gleichen Spender erhalten. Das Vorbereitungsbehandlungsschema für diese Xenotransplantate umfasste: (1) das Konditionieren mit einer nicht-myeloentfernenden Ganzkörper-Bestrahlung (WBI) und einer Thymus-Bestrahlung; (2) die Entfernung der vorher gebildeten mAbs mittels einer Perfusion des Affenbluts durch eine Schweineleber; (3) eine Splenektomie; (4) die Entfernung der T-Zellen mit ATG und/oder mAbs; und (5) eine postoperative Immunsuppression mit Cyclosporin und bei einigen Tieren mit Anti-IgM-mAbs. Zehn Tiere haben mehr als vier Tage überlebt, wobei die längste Überlebenszeit 13 Tage betrug und bis zum Tag 11 eine normale Nierenfunktion vorlag. Bei diesem Tier wurden im peripheren Blut nur am Tag 10 nach der Transplantation Schweinezellen nachgewiesen, dies legt einen vorübergehenden xenogenen Chimärismus nahe. Bei zwei Affen wurde vor der Nieren-Xenotransplantation nur eine Splenektomie und Schweineleber-Perfusion durchgeführt. Bei einem dieser Tiere, dem keine weitere Immunsuppression nach der Transplantation verabreicht wurde, funktionierte die Niere drei Tage, danach ging die Funktion rasch verloren, am Tag 5 erfolgte die vollständige Abstoßung. Die Analyse der Seren dieses Affen durch Durchflusscytometrie zeigte das Wiederauftreten hoher IgM-Titer, die mit der Abstoßung korrelierten. Beim zweiten Tier wurden nach der Transplantation Cyclosporin, 15 mg/kg/Tag, i. v. und 15-Desoxyspergualin (DSG), 6 mg/kg/Tag, i. v. verabreicht. Die Niere funktionierte bis zum Tag 7, danach versagte sie und wurde am Tag 8 entnommen. Die pathologische Untersuchung zeigte ein fokales entzündliches Infiltrat und außerdem interstitielle Blutungen an verschiedenen Stellen. Das Infiltrat enthielt etwa 20% T-Zellen, dies wurde durch Färbung mit den mAbs gegen CD3, CD4 und CD8 bestimmt. Die natürlichen IgM-Antikörper wurden bei diesem Tier während der Leberperfusion effizient entfernt, und es fiel auf, dass sie danach im Serum nicht mehr auftraten, wobei ein Anstieg der IgG-Spiegel am Tag 7 begann, dies korreliert mit dem Beginn des Nierenversagens. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass (1) die Antworten der natürlichen Antikörper (IgM) durch die Komponenten des Vorbereitungsbehandlungsschema wirksam eliminiert werden können, umfassend Schweineleber-Absorption und postoperative Suppression mit DSG; und dass (2) die T-Zellen supprimierenden Komponenten des Vorbereitungsbehandlungsschemas (d. h. Bestrahlung, Cyclosporin und ATG) erforderlich sind, um die zellulären und sekundären (IgG-) Antworten in diesen Experimenten zu verhindern.
Andere Ausführungsformen
Stomagewebe, das vor der Transplantation der hämatopoetischen Stammzellen, z. B. BMT, eingeführt wird, kann variiert werden, indem (1) das fetale Leber- und Thymusgewebe als eine flüssige Zellsuspension verabreicht wird; indem (2) ein fetales Leber- oder Thymus-Stromagewebe, jedoch nicht beides, verabreicht wird; indem (3) ein Stromatransplantat in andere eingekapselte, gut vaskularisierte Stellen eingeführt wird; und indem (4) als Quelle des Stromagewebes ein erwachsener Thymus oder eine fetale Milz eingesetzt wird.
Die hier beschriebenen Verfahren zur Induktion einer Toleranz gegenüber einem allogenen Antigen oder einem allogenen Transplantat oder zur Förderung der Akzeptanz eines allogenen Antigens oder eines allogenen Transplantats können eingesetzt werden, wenn zwischen dem Spender und dem Empfänger ein beliebiger Grad von Nicht-Übereinstimmung an MHC-Loci oder anderen Loci vorliegt, welche die Abstoßung eines Transplantats beeinflussen. Vorzugsweise liegt eine Nicht-Übereinstimmung an mindestens einem MHC-Locus oder an mindestens einem anderen Locus vor, der die Erkennung und Abstoßung vermittelt, z. B. einem Neben-Antigen-Locus. Hinsichtlich der MHC-Loci der Klasse I und der Klasse II können der Spender und der Empfänger: übereinstimmen an Klasse I und nicht übereinstimmen an Klasse II; nicht übereinstimmen an Klasse I und übereinstimmen an Klasse II; nicht übereinstimmen an Klasse I und nicht übereinstimmen an Klasse II; übereinstimmen an Klasse I und übereinstimmen an Klasse II. Bei jeder dieser Kombinationen können andere Loci, welche die Erkennung und Abstoßung steuern, z. B. Neben-Antigen-Loci, übereinstimmen oder nicht übereinstimmen. Wie vorstehend angegeben, ist es bevorzugt, dass an mindestens einem Locus eine Nicht-Übereinstimmung vorliegt. Nicht-übereinstimmend am MHC der Klasse I bedeutet nicht-übereinstimmend für einen oder mehrere MHC-Loci der Klasse I, z. B. im Fall eines Menschen, nicht-übereinstimmend an einem oder mehreren Loci von HLA-A, HLA-B oder HLA-C, oder im Fall eines Schweins, nicht-übereinstimmend an einem oder mehreren SLA-Loci der Klasse I, z. B. den Schweine-A- und B-Loci. Nicht-übereinstimmend an MHC-Klasse-II bedeutet nicht-übereinstimmend an einem oder mehreren MHC-Klasse-II-Loci, z. B. im Fall eines Menschen, nicht-übereinstimmend an einem oder mehreren Loci von DPα, DPβ, DQα, DQβ, DRα oder DRβ, oder im Fall eines Schweins, nicht-übereinstimmend an einem oder mehreren SLA-Klasse-II-Loci, z. B. nicht-übereinstimmend am DQα oder β oder DRα oder β.
Die hier beschriebenen Verfahren zur Induktion einer Toleranz gegenüber einem allogenen Antigen oder einem allogenen Transplantat kann eingesetzt werden, wenn zwischen dem Spender und dem Empfänger in einem gemischten Lymphocyten-Test ein beliebiger Grad der Reaktivität vorliegt, wenn z. B. keine, eine niedrige, eine mittlere oder eine hohe gemischte Lymphocyten-Reaktivität zwischen dem Spender und dem Empfänger vorliegt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die gemischte Lymphocyten-Reaktivität dazu verwendet, um die Nicht-Übereinstimmung für die Klasse II zu definieren, und die Erfindung umfasst Verfahren zur Durchführung allogener Transplantationen zwischen Individuen mit einem beliebigen Grad von Nicht-Übereinstimmung an der Klasse II, der durch einen gemischten Lymphocyten-Test definiert wird. Serologische Tests können verwendet werden, um eine Nicht-Übereinstimmung an Klasse-I- oder -II-Loci zu bestimmen, und die Erfindung umfasst Verfahren zur Durchführung allogener Transplantationen zwischen Individuen mit einem beliebigen Grad von Nicht-Übereinstimmung an der Klasse I und/oder der Klasse II, der durch serologische Verfahren gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Durchführung allogener Transplantationen zwischen Individuen, die sowohl an Klasse I als auch Klasse II nicht-übereinstimmend sind, wie durch serologische Tests und/oder durch einen gemischte Lymphocyten-Reaktivitäts-Test bestimmt wird.
Die Verfahren der Erfindung sind besonders geeignet, um ein Gewebe oder ein Organ auszutauschen, das von einer neoplastischen Störung befallen ist, insbesondere einer Störung, die gegenüber den normalen Therapieverfahren, z. B. gegenüber Chemotherapie oder Bestrahlung, resistent ist. Die Verfahren der Erfindung können zur Induktion einer Toleranz gegenüber einem Transplantat eingesetzt werden, z. B. einem Allotransplantat, z. B. einem Allotransplantat von einem Spender, der nicht übereinstimmt an einem oder mehreren Klasse-I-Loci, an einem oder mehreren Klasse-II-Loci oder an einem oder mehreren Loci der Klasse I und Klasse II. In bevorzugten Ausführungsformen: umfasst das Transplantat ein Gewebe aus dem Verdauungstrakt oder den Eingeweiden, z. B. Gewebe aus dem Magen oder Darmgewebe, z. B. Dünndarm, Dickdarm oder Colon; ersetzt das Transplantat einen Teil des Verdauungstrakts des Empfängers, z. B. den gesamten oder einen Teil des Verdauungstrakts oder der Eingeweide, z. B. den Magen, Darm, z. B. Dünndarm, Dickdarm oder Colon.
Eine Toleranz, wie hier verwendet, bezieht sich nicht nur auf eine vollständige immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen, sondern auch auf eine teilweise immunologische Toleranz, z. B. auf einen Grad von Toleranz gegenüber einem Antigen, der größer ist als das Ergebnis, das ohne Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zustande kommen würde.
Wie hier beschrieben, ist es häufig wünschenswert, den Empfänger eines Transplantats einer Bestrahlung auszusetzen, um die Entwicklung eines gemischten Chimärismus zu fördern. Der Erfinder hat entdeckt, dass es möglich ist, einen gemischten Chimärismus mit einer geringeren Bestrahlungstoxizität zu induzieren, indem die Strahlendosis fraktioniert wird, d. h. indem die Bestrahlung in zwei oder mehr Expositionen oder Sitzungen verabreicht wird. Demgemäß kann in einem beliebigen Verfahren der Erfindung, das eine Bestrahlung eines Empfängers, z. B. eines Primaten, z. B. eines Menschen, eines Xenotransplantats oder Allotransplantats erforderlich macht, die Bestrahlung entweder in einer einzelnen Exposition erfolgen, oder sie kann, stärker bevorzugt, in zwei oder mehr Expositionen oder Sitzungen fraktioniert werden. Die Summe der fraktionierten Dosierungen entspricht vorzugsweise, z. B. in Rad oder Gy, der Bestrahlungsdosis, die zu einem gemischten Chimärismus führen kann, wenn sie in einer einzelnen Exposition verabreicht wird. Die Fraktionen sind vorzugsweise etwa gleich in der Dosierung. Z. B. kann eine Einzeldosis von 700 Rad z. B. durch zwei Fraktionen von 350 Rad oder durch sieben Fraktionen von 100 Rad ersetzt werden. Außerdem kann in den Verfahren der Erfindung eine Hyperfaktionierung der Bestrahlungsdosis eingesetzt werden. Die Fraktionen können am gleichen Tag verabreicht werden, oder sie können einen Abstand von einem, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Tagen voneinander haben. Die Ganzkörper-Bestrahlung, die Thymus-Bestrahlung oder beide können fraktioniert werden.
Der Erfinder hat außerdem entdeckt, dass ein großer Teil des Vorbereitungsbehandlungsschemas oder das ganze Vorbereitungsbehandlungsschema an einen Empfänger, z. B. einen Empfänger eines Allotransplantats oder eine Xenotransplantats, innerhalb weniger Tage, vorzugsweise innerhalb von 72, 48 oder 24 Stunden, der Transplantation von tolerierenden Stammzellen und/oder des Transplantats verabreicht werden kann. Dies ist insbesondere im Fall von Menschen geeignet, die Transplantate aus Leichen erhalten. Demgemäß können in einem beliebigen Verfahren der Erfindung, in dem die Verabreichung von Behandlungen vor der Transplantation von Stammzellen und/oder eines Transplantats erforderlich ist, z. B. Behandlungen, um Antikörper des Wirts zu inaktivieren oder zu entfernen, Behandlungen, um T-Zellen oder NK-Zellen des Wirts zu inaktivieren, oder eine Bestrahlung, die Behandlungen) innerhalb weniger Tage, vorzugsweise innerhalb von 72, 48 oder 24 Stunden, der Transplantation der Stammzellen und/oder des Transplantats verabreicht werden. Insbesondere an einen Empfänger-Primaten, z. B. einen Menschen, von Allotransplantaten kann eine oder können alle Behandlungen, um Antikörper des Wirts zu inaktivieren oder zu entfernen, Behandlungen, um T-Zellen oder NK-Zellen des Wirts zu inaktivieren, oder eine Bestrahlung, innerhalb weniger Tage, vorzugsweise innerhalb von 72, 48 oder 24 Stunden, der Transplantation von Stammzellen und/oder des Transplantats verabreicht werden. Z. B. kann eine Behandlung zur Entfernung von T-Zellen und/oder NK-Zellen des Empfängers, z. B. eine Verabreichung von ATG, am Tag –2, –1 und 0 verabreicht werden, und eine WBI, Thymus-Bestrahlung und die Stammzellen, z. B. Knochenmark-Stammzellen, können am Tag 0 verabreicht werden. (Das Transplantat, z. B. ein Nieren-Allotransplantat, wird am Tag 0 transplantiert.
Die Verfahren der Erfindung können eine Splenektomie des Empfängers beinhalten.
Wie hier beschrieben, kann eine Hämoperfusion, z. B. eine Hämoperfusion mit einem Spenderorgan, verwendet werden, um die natürlichen Antikörper des Wirts zu entfernen. Andere Verfahren zum Entfernen oder Inaktivieren der natürlichen Antikörper auf andere Weise können zusammen mit den hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden. Z. B. können Arzneistoffe, die natürliche Antikörper entfernen oder inaktivieren, z. B. Desoxyspergualin (DSG) (Bristol), oder Anti-IgM-Antikörper an den Empfänger eines Allotransplantats oder eines Xenotransplantats verabreicht werden. Ein oder mehrere Vertreter von DSG (oder ähnlichen Arzneistoffen), Anti-IgM-Antikörpern und Hämoperfusion können eingesetzt werden, um die natürlichen Antikörper des Empfängers in den erfindungsgemäßen Verfahren zu entfernen oder andersartig zu inaktivieren. Dabei wurde gefunden, dass DSG in einer Konzentration von 6 mg/kg/Tag, i. v., geeignet ist, die Funktion der natürlichen Antikörper beim Schwein gegen Nierentransplantate des Cynomolgus-Affen zu unterdrücken.
Bei einigen der hier beschriebenen Verfahren wird eine letale Bestrahlung eingesetzt, um einen hämatopoetischen Raum zu schaffen und dadurch einen Empfänger auf die Verabreichung von allogenen, xenogenen, syngenen oder genetisch veränderten autologen Stammzellen vorzubereiten. In den hier beschriebenen Verfahren, insbesondere den Primaten-Verfahren oder den klinischen Verfahren, ist es bevorzugt, einen hämatopoetischen Raum für die Verabreichung solcher Zellen durch nicht-letale Verfahren zu schaffen, z. B. durch Verabreichung von subletalen Bestrahlungsdosen, von Knochenmark zerstörenden Arzneistoffen oder Antikörpern. Die Verwendung von subletalen Dosierungen bei der Knochenmarkzerstörung macht es möglich, dass im Empfänger ein gemischter Chimärismus entsteht. Ein gemischter Chimärismus ist im Allgemeinen einer vollständigen oder letalen Zerstörung des Knochenmarks des Empfängers vorzuziehen, worauf eine vollständige Rekonstitution des Empfängers mit den verabreichten Stammzellen folgt.
In Ausführungsformen der Erfindung sind auch andere Verfahren zur Inaktivierung von Thymus-T-Zellen enthalten. Einige der hier beschriebenen Verfahren umfassen die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung, um die Thymus-T-Zellen des Wirts zu inaktivieren oder die durch Thymus-T-Zellen vermittelten Antworten des Wirts auf Spender-Antigene auf andere Weise abzuschwächen. Dabei wurde entdeckt, dass die Thymus-Bestrahlung, die in den allogenen oder xenogenen Verfahren der Erfindung erforderlich ist, ergänzt oder ersetzt werden kann durch andere Verfahren, welche die durch Thymus-T-Zellen vermittelte Antwort des Wirts abschwächen (z. B. durch Entfernen der Thymus-T-Zellen und/oder Herunter-Regulieren eines oder mehrerer Vertreter von T-Zell-Rezeptor (TCR), CD4-Co-Rezeptor oder CD8-Co-Rezeptor). Z. B. kann die Thymus-Bestrahlung ergänzt oder ersetzt werden durch Anti-T-Zellen-Antikörper (z. B. gegen CD4 und/oder gegen CD8 gerichtete monoclonale Antikörper), die ausreichend häufig, in ausreichender Dosierung und eine ausreichende Zeit verabreicht werden, um die durch Thymus-T-Zellen vermittelte Antwort des Wirts abschwächen.
Beste Ergebnisse werden erhalten, wenn die Anti-T-Zellen-Antikörper wiederholt verabreicht werden. Z. B. können Anti-T-Zellen-Antikörper ein-, zwei-, dreimal oder öfter vor der Transplantation von Spender-Knochenmark verabreicht werden. Typischerweise wird eine vor der Knochenmark-Transplantation verabreichte Dosis von Antikörpern an den Patienten etwa fünf Tage vor der Knochenmark-Transplantation appliziert. Außerdem können noch weitere frühere Dosen sechs, sieben oder acht Tage vor der Knochenmark-Transplantation gegeben werden. Es kann wünschenswert sein, eine erste Behandlung zu verabreichen, dann die vor der Knochenmark-Transplantation durchgeführten Verabreichungen alle ein bis fünf Tage zu wiederholen, bis der Patient im Serum übermäßig viele Antikörper enthält und die Entfernung der peripheren T-Zellen zu etwa 99% erfolgt ist, und dann die Knochenmark-Transplantation durchzuführen. Die Anti-T-Zellen-Antikörper können auch ein-, zwei-, dreimal oder öfter nach der Knochenmark-Transplantation verabreicht werden. Typischerweise wird eine nach der Knochenmark-Transplantation verabreichte Behandlung etwa 2 bis 14 Tage nach der Knochenmark-Transplantation appliziert. Die nach der Knochenmark-Transplantation verabreichte Behandlung kann so oft wie nötig wiederholt werden. Wenn mehr als eine Verabreichung gegeben wird, können die Verabreichungen in einem Abstand von etwa einer Woche erfolgen. Weitere Dosen können appliziert werden, wenn der Patient den Eindruck macht, dass sich die T-Zellen früh oder unerwünscht erholen. Vorzugsweise werden die Anti-T-Zellen-Antikörper mindestens einmal (und vorzugsweise zwei-, dreimal oder öfters) vor einer Spender-Knochenmark-Transplantation und mindestens einmal (und vorzugsweise zwei-, dreimal oder öfters) nach einer Spender-Knochenmark-Transplantation verabreicht.
Die folgenden Experimente zeigen, dass weitere T-Zellen zerstörende Antikörper die Thymus-Bestrahlung in einem nicht-myelo entfernenden konditionierenden Behandlungsschema ersetzten können und ein Einwachsen von allogenen Knochenmark-Transplantaten und die Induktion einer Spender-spezifische Toleranz möglich machen.
Ein nicht-myelo-entfernendes konditionierendes Behandlungsschema mit niedriger Toxizität, das ein Einwachsen von allogenen Knochenmark-Transplantaten und die Induktion einer Spender spezifischen Toleranz bei Mäusen möglich macht, wurde früher beschrieben. Ein Schema, das die Vorbehandlung mit zerstörenden Dosierungen von gegen CD4 und gegen CD8 gerichteten monoclonalen Antikörpern am Tag –5, die Verabreichung von 3 Gy Ganzkörper-Bestrahlung und 7 Gy Thymus-Bestrahlung am Tag 0 umfasst, gefolgt von einer Verabreichung von vollständig MHC-nicht-übereinstimmenden Spender-Knochenmarkzellen, ermöglicht die Induktion eines permanenten gemischten Chimärismus und einer Hauttransplantat-Toleranz. Der Schritt der Thymus-Bestrahlung wurde in diesem Protokoll durch eine weitere Behandlung mit den gegen CD4 und gegen CD8 gerichteten monoclonalen Antikörpern ersetzt. Der Chimärismus mehrerer Linien wurde in den B10-(H-2^b)-Mäusen, die eine allogene (B10.A, H-2^a)-Knochenmark-Transplantation am Tag erhalten, worauf eine Ganzkörper-Bestrahlung von 3 Gy, mit oder ohne Thymus-Bestrahlung, und eine Behandlung mit monoclonalen Antikörpern in verschiedenen Zeitplänen vor und nach der Knochenmark-Transplantation erfolgte, verglichen. Die meisten (50 von 52) Tiere, die entweder eine Thymus-Bestrahlung oder mindestens zwei vor der Knochenmark-Transplantation erfolgende Behandlungen mit monoclonalen Antikörpern erhalten hatten, zeigten im peripheren Blut einen langfristigen gemischten allogenen Chimärismus mehrerer Linien (dies wurde durch durchflusscytometrische Analysen gezeigt). Im Gegensatz dazu entwickelte nur eines von acht Tieren, die nur eine vor der Knochenmark-Transplantation erfolgende Behandlung mit monoclonalen Antikörpern ohne eine Thymus-Bestrahlung erhalten hatten, einen anhaltenden (mehr als 20 Wochen) gemischten Chimärismus. Alle chimären Tiere akzeptierten Spender-Hauttransplantate mehr als 100 Tage und stießen BALB/c-Transplantate von Dritten innerhalb von 14 Tagen ab. Somit konnte ein gemischter Chimärismus und eine Spender-spezifische Hauttransplantat-Akzeptanz induziert werden, ohne dass eine Thymus-Bestrahlung eingesetzt wurde, wenn mindestens zwei vor der Knochenmark-Transplantation erfolgende Behandlungen mit monoclonalen Antikörpern appliziert wurden. (Die Behandlungen mit den monoclonalen Antikörpern hatten einen Abstand zueinander von etwa fünf Tagen, wobei die letzte Behandlung einen Tag vor der Knochenmark-Transplantation verabreicht wurde.) Jedoch waren das Niveau der Spender-T-Zellen-Rekonstitution in den Tieren am höchsten, die nach der Knochenmark-Transplantation eine Thymus-Bestrahlung oder weitere Behandlungen mit monoclonalen Anti-T-Zellen-Antikörpern erhalten hatten. 11 von 20 Mäusen, die zwei vor der Knochenmark-Transplantation erfolgende Behandlungen mit monoclonalen Antikörpern (wobei die Behandlungen mit den monoclonalen Antikörpern einen Abstand zueinander von etwa fünf Tagen hatten und die letzte Behandlung einen Tag vor der Knochenmark-Transplantation verabreicht wurde) und keine Thymus-Behandlung erhalten hatten, zeigten relativ niedrige Niveaus einer Spender-T-Zellen-Rekonstitution (weniger als 20% Spender, mehr als 80% Wirt) nach sechs Wochen, und neun dieser Tiere zeigten nach 20 Wochen eine deutliche Abnahme der Spenderzellen in allen Linien. Im Gegensatz dazu zeigten 12 von 12 gleich behandelten Tieren, die eine oder zwei weitere nach der Knochenmark-Transplantation erfolgende Behandlungen mit monoclonalen Antikörpern erhalten hatten (wobei die Behandlungen mit den monoclonalen Antikörpern in einem Abstand von etwa sieben Tagen appliziert wurden und die erste Behandlung sieben Tage nach der Knochenmark-Transplantation verabreicht wurde), nach sechs Wochen hohe Niveaus einer Spender-T-Zellen-Rekonstitution (im Durchschnitt 86 ± 12% Spender), wobei die hohen Niveaus der Spender-Rekonstitution in allen Linien 20 Wochen bestehen blieb. Somit kann eine zweite Dosis von vor der Knochenmark-Transplantation verabreichten T-Zellen entfernenden monoclonalen Antikörpern die Thymus-Bestrahlung ersetzen und in unserem Behandlungsschema die Induktion einer Toleranz ermöglichen, wobei jedoch weitere monoclonale Antikörper, die eine oder zwei Wochen nach der Knochenmark-Transplantation verabreicht werden, möglicherweise die Fähigkeit steigern können, einen dauerhaften gemischten Chimärismus und Toleranz verlässlich zu induzieren. Die Fähigkeit, dass wiederholte Behandlungen mit gegen T-Zellen gerichteten monoclonalen Antikörpern in diesem Behandlungsschema die Thymus-Bestrahlung ersetzen können, spiegelt mit größter Wahrscheinlichkeit ihre Fähigkeit wider, die Thymocyten des Wirts zu entfernen, die der Zerstörung durch die anfängliche Behandlung mit den monoclonalen Antikörpern entkommen sind. Diese monoclonalen Antikörper zerstören die meisten T-Zellen des Wirts und induzieren eine Herunter-Regulation von TCR- und CD4- und CD8-Co-Rezeptoren auf den wenigen verbliebenen Zellen. Bei diesen Tieren ist eine frühe Migration von aus dem Spender-Knochenmark stammenden Zellen zum Thymus des Wirts mit einer kompletten clonalen Deletion der reifen Thymocyten vom Wirtstyp mit dem TCR assoziiert, der Spender-Antigene erkennt. Obwohl in den Milzen von Chimären eine kleine Population von Wirts-T-Zellen mit solchen TCR bestehen bleibt, reagieren diese Zellen anergisch auf eine Stimulation über ihren TCR. Diese Zellen sind möglicherweise durch eine Herunter-Regulation von CD4 oder CD8 nach der Behandlung mit den monoclonalen Antikörpern der Zerstörung entkommen. Somit wird mit diesem relativ untoxischen Behandlungsschema ein Einwachsen hämatopoetischer Stammzellen-Transplantate und eine spezifische Toleranz erreicht, indem der größte Teil des vorliegenden Repertoires der T-Zellen vernichtet und die Entwicklung neuer T-Zellen in Gegenwart eines im Thymus vorliegenden Spender-Antigens zugelassen wird und indem bei den wenigen verbliebenen T-Zellen des Wirts in der Peripherie eine Anergie induziert wird.

Claims

Verwendung eines anderen immunsuppressiven Arzneimittels als eines Anti-T-Zellen-Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren, um bei einem Empfängerprimaten eine Taleranz gegenüber einem Allotransplantat von einem Spenderprimaten zu induzieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Verabreichen eines Anti-T-Zellen-Antikörpers an den Empfängerprimaten, Implantieren des Allotransplantats in den Empfänger und Verabreichen einer kurzen Behandlung mit dem immunsuppressiven Arzneimittel an den Empfänger, um eine Toleranz gegenüber dem Allotransplantat zu induzieren, vorausgesetzt, daß der Spenderprimat nicht ein menschliches Embryo ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die kurze Behandlung mit dem immunsuppressiven Arzneimittel allgemein etwa zu der Zeit zu verabreichen ist, in der das Implantat in den Empfänger eingebracht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher der Empfänger an einem ersten Genort, der die Transplantatabstoßung betrifft, nicht übereinstimmt und an einem zweiten Genort, der die Transplantatabstoßung betrifft, übereinstimmt oder eine Nichtübereinstimmung toleriert.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Dauer der kurzen Behandlung mit dem immunsuppressiven Arzneimittel annähernd dem Zeitraum entspricht oder kürzer ist als der Zeitraum, der erforderlich ist, damit reife T-Zellen der Empfängerart die Abstoßung eines Antigens einleiten, nachdem sie zuerst durch das Antigen stimuliert worden sind.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die kurze Behandlung mit dem immunsuppressiven Arzneimittel in der Abwesenheit einer Behandlung zu verabreichen ist, die in dem Empfänger das Freisetzen von Zytokin durch reife T-Zellen stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die kurze Behandlung mit dem immunsuppressiven Arzneimittel in der Abwesenheit von Prednison zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das immunsuppressive Arzneimittel Cyclusporin A umfaßt.
Verwendung eines immunsuppressiven Arzneimittels zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren, um bei einem Empfängerprimaten eine Toleranz gegenüber einem von einem Spender der gleichen Art gewonnenen Transplantat zu induzieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Einfügen einer DNA, die ein MHC-Antigen des Spenders codiert, in eine Hämatopoese-Stammzelle des Empfängers, Ermöglichen der Expression der DNA, die das MHC-Antigen codiert, in dem Empfänger, Implantieren des Transplantats in den Empfänger und Verabreichen einer kurzen Behandlung mit dem immunsuppressiven Arzneimittel an den Empfänger, um eine Toleranz gegenüber dem Transplantat zu induzieren, vorausgesetzt, daß der Spender nicht ein menschliches Embryo ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Verfahren außerdem einschließt: in den Empfängerprimaten Hämatopoese-Stammzellen des Spenderprimaten einzubringen.
Verwendung eines Immunsuppressivums zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zum Vermindern oder Hemmen der Aktivität von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen in einem Empfängersäugetier, das ein Transplantat von einem Spendersäugetier erhält, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Induzieren einer Toleranz gegenüber dem Transplantat, Verabreichen einer kurzen Behandlung mit dem Immunsuppressivum an den Empfänger, die ausreicht, um die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu inaktivieren, und Transplantieren des Transplantats in den Empfänger, vorausgesetzt, daß der Spender nicht ein menschliches Embryo ist.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der die Dauer der kurzen Behandlung mit dem Immunsuppressivum annähernd 30 Tagen entspricht.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der die kurze Behandlung begonnen wird, bevor die Behandlung zum Induzieren einer Toleranz begonnen wird, oder etwa zu dieser Zeit.
Verwendung eines Immunsuppressivums zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren, um in einem Empfängersäugetier die Annahme eines von einem Spender der gleichen Art gewonnenen Transplantats zu fördern, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Einfügen einer DNA, die ein MHC-Antigen des Spenders codiert, in eine Hämatopoese-Stammzelle des Empfängers, Ermöglichen der Expression der DNA, die das MHC-Antigen codiert, in dem Empfänger, und Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem Immunsuppressivum an den Empfänger, die ausreicht, um die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen des Empfängers zu inaktivieren, vorausgesetzt, daß der Spender nicht ein menschliches Embryo ist.
Verwendung eines Immunsuppressivums, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren, um in einem Empfängersäugetier die Annahme eines von einem Spender der gleichen Art gewonnenen Transplantats zu fördern, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Einbringen von Hämatopoese-Stammzellen des Spenders in den Empfänger, und Verabreichen einer kurzen Behandlung mit einem Immunsuppressivum an den Empfänger, die ausreicht, um die Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen des Empfängers zu inaktivieren, vorausgesetzt, daß der Spender nicht ein menschliches Embryo ist.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der die Hämatopoese-Stammzellen dem Empfänger vor dem Implantieren des Allotransplantats zu verabreichen sind.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der die Hämatopoese-Stammzellen dem Empfänger gleichzeitig mit dem Implantieren des Allotransplantats zu verabreichen sind.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher der Empfänger ein Mensch ist.