DE69723888T2

DE69723888T2 - Gemischter Chimerismus und Toleranz

Info

Publication number: DE69723888T2
Application number: DE69723888T
Authority: DE
Inventors: Megan Sykes
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-08
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2017-05-09
Also published as: EP0918524A1; JP2000511888A; US6877514B2; ES2201977T3; WO1997041863A1; CA2253597A1; AU734665B2; US6412492B1; AU3120397A; DE69723888D1; US6006752A; ATE245990T1; EP0918524A4; US20030075187A1; US20040247579A1; US6718986B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Gewebe- und Organtransplantation.
Kawai et al. berichten in "Transplantation", Bd. 59, 256–262, 1995, dass sie ein nonmyeloablatives präparatives Regime entwickelt haben, das einen gemischten Chimärismus und renale Allotransplantat-Toleranz zwischen MHC-grundverschiedenen, nichthumanen Primaten erzeugen kann. Das Basis-Regime schließt ATG, nonmyeloablative Gesamtkörperbestrahlung (TBI, 300 rad), Thymus-Bestrahlung (TI, 700 rad) und Donator, Knochenmarkinfusion, Nieren-Allotransplantate von MHC-fehlangepassten Spendern ein, die mit verschiedenen Manipulationen des präparativen Regimes transplantiert wurden. Mit dem Basis-Regime allein behandelte Affen (n = 2) stießen innerhalb von 15 Tagen Allotransplantate ab. Mit dem Zusatz von Cyclosporin (CsA) für einen Monat (n = 3) entwickelte einer der Affen einen multilinearen, gemischten Chimärismus und eine Allotransplantat-Toleranz danach (> 430 Tage). Um die Toxizität des präparativen Regimes zu verringern, wurde TBI bis 150 rad an zwei aufeinanderfolgenden Tagen in anschließenden Untersuchungen aufgeteilt. Alle Affen erhielten dieses modifizierte Regime (n = 4) und entwickelten einen multilinearen Chimärismus unter Fieber-Nebenwirkungen und akzeptierten renale Allotransplantate langfristig ohne weitere Immunsuppression (196 Tage, 198 Tage, > 150 Tage und > 40 Tage). Bei Langzeit-Überlebenden wurde die Donator-spezifische Nichtreaktivität mit Hilfe der MLR und Hauttransplantation bestätigt. Drei mit dem Basis-Regime plus CaA, jedoch lediglich mit 150 rad TBI (n = 1) oder ohne TBI (n = 2) behandelte Affen entwickelten keinen multilinearen Chimärismus, und die Transplantate wurden unmittelbar nach der CsA-Unterbrechung (Tag 40 bis 50) abgestoßen. Die mit dem gleichen Regime, jedoch ohne DBM (n = 2) behandelten Affen stießen Nieren-Allotransplantate nach 52 Tagen ab. Die Autoren haben die Schlussfolgerung gezogen, dass mindestens eine transitorische Transplantat-Akzeptanz von DBM für die Auslösung einer Donator-spezifischen Toleranz in diesem Affenmodell als wesentlich erscheint.
Stewart et al. berichten in "Blut", Bd. 81, 2566–2571, 1993 über die erfolgreiche Langzeit-Transplantat-Akzeptanz von normalem männlichen Spenderknochenmark (BM), das in nichtcytoablatierte weibliche Mäuse übertragen wurde, was die Vermutung aufkommen lässt, dass bei Transplantat-Akzeptanz von Knochenmark "Nischen" erzeugt werden müssen. Sie verwendeten eine chromosomale Bändelung und eine Southern-Blot-Analyse zur Identifizierung von transplantierten männlichen Knochenmarkzellen und zeigten die Langzeitstabilität der chimären Knochenmarksubstanzen. Balb/C, BDF1 oder CBA-J-weibliche Wirttiere (ohne Bestrahlung) erhielten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen 40 × 10⁸ männliche Zellen (pro Tag) der gleichen Untersuchungen, die unter Verwendung von Tibia/Femur-Äquivalenten von normalem Knochenmark oder Knochenmark von Balb/C-Mäusen ausgeführt wurden, die 6 Tage zuvor mit 150 mg/kg 5-Fluorouracil (5-FU) behandelt wurden. Die Methoden der Chromosomen-Bändelung zeigten, dass 5% bis 46% Knochenmarkzellen männliches 3 bis 9 Monate-Posttransplantat mit normalem Spenderknochenmark der Southern-Blot-Analyse waren, indem die pY2-Probe verwendet wurde, die eine anhaltende Transplantat-Akzeptanz bei 21 bis 25 Monaten Posttransplantat zeigte, was im Bereich von 15% bis 42% männliche transplantierte Zellen im Knochenmark lag. Normales männliches Spenderknochenmark zeigte eine deutlich bessere Transplantat-Akzeptanz als 5-FU-vorbehandeltes männliches Knochenmark, wie bei 1 bis 12 Monaten Posttransplantat in nichtcytoablatierten weiblichen Empfängern gezeigt wurde. Der prozentuale Anteil männlicher transplantierter Zellen in BM lag im Bereich von 23% bis 78% bei Empfängern von normalem Spenderknochenmark und bei 0,1% bis 39% von Empfängern von 5-FU-Knochenmark. Die mittlere Transplantat-Akzeptanz für 6 Mäuse, die normales Knochenmark erhalten haben, betrug 38%, während die von 6 Mäusen, die Post-5-FU-Mark erhalten haben, 8% anhand von Assays von 1 bis 3 Monaten-Posttransplantation zeigten. Nach 10 bis 12 Monaten betrug die mittlere Transplantat-Akzeptanz der normalen Spendergruppe 46% im Vergleich zu 16% bei der 5-FU-Gruppe. Die Muster der Transplantat-Akzeptanz mit normalem und mit 5-FU-Mark waren ähnlich denen von Milz und Thymus. Die Autoren haben die Schlussfolgerung gezogen, dass diese Ergebnisse den Langzeit-Chimärismus zeigen, der nach Transplantation von normalem Spenderknochenmark auf nichtbestrahlten Wirtsmäusen erzeugt werden kann, und zeigten, dass keine Markzwischenräume für die erfolgreiche Transplantat-Akzeptanz geschaffen werden mussten. Sie schlugen vor, dass transplantiertes Mark bezüglich des Knochenmarkzwischenraum in Konkurrenz mit dem Wirts-Mark gleich ist. Schließlich wurde von ihnen berichtet, dass diese Daten zeigen, dass Post-5-FU-Balb/C-männliches Mark in der Repopulation von Balb/C-weiblichem Wirtsmark, Milz und Thymus deutlich unterlegen ist und haben vorgeschlagen, dass diese Population von Zellen nicht die ideale Population für Gen-Transferuntersuchungen sein kann.
Die WO 93/3785 beschreibt eine herbeigeführte Toleranz gegenüber Xenotransplantaten mir primären hämopoetischen Stammzellen-Transplantaten, das Bestrahlen des Empfänger-Säugers mit Ganzkörperbestrahlung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gewährt Medikamente für die Verwendung in Verfahren zum Herbeiführen von Toleranz gegenüber Fremd-Antigenen. Das Wesentliche der Verfahren sind präparative Regime, mit denen die Notwendigkeit für eine hämopoetische, raumerzeugende Bestrahlung und speziell der präparativen Ganzkörperbestrahlung eliminiert wird. Insbesondere ist entdeckt worden, dass die Verabreichung einer relativ großen Zahl von Stammzellen in Kombination mit der Erzeugung von Thymusraum die Herbeiführung einer Toleranz ohne das Erfordernis für eine Ganzkörperbestrahlung (WBI) ermöglichen kann.
Dementsprechend kennzeichnet die Erfindung die Verwendung von hämopoetischen Stammzellen in der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in einem Verfahren für die Herbeiführung von Toleranz in einem Empfänger-Säuger einer ersten Spezies gegenüber einem Transplantat von einem Spender-Säuger einer zweiten Spezies. Das Verfahren schließt ein: Einführen z. B. durch intravenöse Injektion in den Empfänger-Säuger von hämopoetischen Stammzellen; Erzeugen von Thymusraum in dem Empfänger bei Fehlen der Körperbestrahlung; und Implantieren des Transplantats in den Empfänger. Die hämopoetischen Zellen, soweit angenommen, bereiten den Empfänger für die kommende Transplantation vor, indem eine Toleranz gegenüber sowohl B-Zellen- als auch T-Zellen-Konzentrationen herbeigeführt wird.
Der Empfänger-Säuger kann beispielsweise ein Mensch sein. Der Spender-Säuger kann beispielsweise ein Schwein, z. B. ein Miniaturschwein sein. Das Transplantat stammt bevorzugt von einer anderen Spezies. Das Transplantat exprimiert ein überwiegendes Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Antigen, vorzugsweise ein Antigen der Klasse II. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Empfänger ein Primat, z. B. ein Mensch, und der Spender ein Schwein, z. B. ein Miniaturschwein.
Wie an anderer Stelle hierin diskutiert wird, haben die Erfinder entdeckt, dass dieses Medikament in dem Verfahren, das ohne die Verabreichung einer hämopoetischen raumschaffenden Bestrahlung, z. B. Ganzkörperbestrahlung, praktiziert werden kann. Die Ganzkörperbestrahlung wird oftmals auf dem Gebiet zur Erzeugung eines hämopoetischen Raumes verwendet und fördert damit Transplantat-Akzeptanz, Chimärismus und Toleranz. Die Notwendigkeit für eine hämopoetische raumschaffende Bestrahlung kann insgesamt durch Einbeziehung einer oder mehrerer der folgenden Schritte in dem Verfahren eliminiert werden:

(1) Verabreichen einer ausreichend großen Zahl von Spender-hämopoetischen Zellen an den Empfänger derart, dass Spenderstammzellen-Implantat zu einem gemischten Chimärismus führen und eine Toleranz herbeiführen, vorzugsweise werden die Stammzellen entweder in Kombination mit einer oder mehreren der hierin offenbarten Behandlungen verabreicht, z. B. (2), (3) oder (4), wie unmittelbar nachfolgend beschrieben wird;
(2) Verabreichen von hämopoetischen raumschaffenden Antikörpern oder Medikamenten an den Empfänger, z. B. Verabreichen eines Inhibitors für Zellproliferation, z. B. DSG, oder eines Antimetaboliten, z. B. Brequinar oder eines Anti-T-Zellen-Antikörpers, z. B. einen oder beide eines Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörpers;
(3) Bereitstellen von Behandlungen (andere als eine Ganzkörperbestrahlung), die die Transplantat-Akzeptanz fördern sowie die Bildung eines gemischten Chimärismus durch Verstärkung der Fähigkeit von Spenderzellen, mit den Wirts-Knochenmarkzellen in Konkurrenz zu treten, z. B. Verabreichen von Stromazellen oder Verabreichen von Donator-spezifischen Wachstumsfaktoren oder Zytokinen, z. B. wo es sich bei dem Spender um ein Miniaturschwein handelt, das Verabreichen von einem oder mehreren Schweine-SCF, Schweine-IL-3 oder Schweine-GM-SCF an den Empfänger;
(4) Erzeugen eines Thymusraumes in dem Empfänger, z. B. durch Bestrahlen des Thymus des Empfängers, z. B. durch Verabreichen von 1 bis 10 Gy (100 und 1.000 rad) und mehr bevorzugt zwischen 3 und 7 Gy (300 und 700 rad), z. B. 7 Gy (700 rad) einer Thymus-Bestrahlung, oder Verabreichen von Anti-T-Zellen-Antikörpern in ausreichender Dosis, um die Thymozyten zu inaktivieren. Andere Methoden für die Schaffung eines Thymusraums schließen ein: die Verabreichung von Steroiden, Kortikosteroiden, Brequinar oder einer immunsuppressiven chemischen Substanz oder Arzneimittel, z. B. Rapamycin, Cyclosporin oder FK506. Die Behandlung zur Schaffung eines Thymusraumes sollte mindestens vor Beginn vor der Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen erfolgen. Eine wirksame Behandlung sollte einzelne positive Thymozyten zu einem solchen Maße abschwächen, dass eine Transplantat-Akzeptanz und die Bildung eines gemischten Chimärismus bei Fehlen der Erzeugung eines hämopoetischen Raumes auf ein Optimum gebracht werden, z. B. ein hämopoetischer Raum, der durch Ganzkörperbestrahlung erzeugt wird. In den bevorzugten Ausführungsformen werden die einzelnen positiven Thymozyten des Patienten um mindestens 20, 40, 60 oder 80% geschwächt. Behandlungen, die zu einer Schwächung zwischen 10 und 90% führen, sind bevorzugt. Die Behandlungsdauer wird von der Dosierung abhängen sowie der Wirksamkeit des Mittels, in der Regel wird sie jedoch weniger als 60, 30 oder 15 Tage betragen. Die Behandlung sollte mindestens 7 Tage und mehr bevorzugt 10 oder 14 Tage dauern. In bevorzugten Behandlungsabläufen, z. B. die Verabreichung einer immunsuppressiven chemischen Substanz oder Arznei, z. B. Cyclosporin, sollte mindestens zwischen 7 und 30 Tagen dauern.

Die Behandlung, z. B. die Verabreichung von Cyclosporin, sollte zu einem solchen Zeitpunkt beginnen, dass sie vor der Verabreichung von Stammzellen beendet ist. Die Verabreichung des Mittels sollte auf einer täglichen Basis erfolgen oder nach Erfordernis, um eine Konzentration des Mittels aufrecht zu erhalten, das die gewünschte Menge der Abschwächung ermöglicht. Eine besonders bevorzugte Behandlung ist die Verabreichung einer immunsuppressiven chemischen Substanz, z. B. Cyclosporin, für mehr als 7 und weniger als 30 Tage. Ein anwendbarer Therapieplan in Nagetieren sind 20 mg/kg/Tag Cyclosporin für 14 Tage, der 3 Tage vor der Verabreichung von Stammzellen endet.
Damit wird dem Empfänger eine Menge an hämopoetischen Stammzellen verabreicht, die ausreichend ist, um Toleranz einzuleiten ohne Erfordernis einer hämopoetischen raumschaffenden Bestrahlung. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zahl von Spender-hämopoetischen Zellen mindestens das Doppelte oder mindestens gleich groß oder beträgt mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmarkzellen, die in einer erwachsenen Empfängerspezies angetroffen wird. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Zahl der Donator-hämopoetischen Stammzellen mindestens das 2-fache und ist mindestens gleich groß oder beträgt mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmarkhämopoetischen Stammzellen, die in der erwachsenen Empfängerspezies angetroffen wird. In dem Fall, wo eine Inzuchtpopulation der Spenderspezies existiert, z. B. wo die Spenderspezies ein Miniaturschwein ist, ist die Zahl der verfügbaren Spenderzellen nicht auf die Zahl der Zellen beschränkt, die von einem einzigen Tier erhalten werden kann. Somit können in derartigen Fällen die Spenderzellen, die dem Empfänger verabreicht werden, von mehr als einem Tier kommen, z. B. von zwei, drei, vier oder mehreren Tieren. Wie nachfolgend diskutiert wird, können die Donator-Stammzellen in zwei oder mehreren separaten Verabreichungen bereitgestellt werden.
Es wird in dem Empfänger ein gemischter Chimärismus erzeugt und der Zustand des gemischten Chimärismus in Abwesenheit der Erzeugung eines hämopoetischen Raums erzeugt, z. B. in Abwesenheit eines hämopoetischen Raumes, der durch eine raumerzeugende Bestrahlung geschaffen wird, z. B. durch Ganzkörperbestrahlung.
Die Zahl der Spenderzellen, die dem Empfänger verabreicht wird, kann entweder dadurch erhöht werden, dass die Zahl der in einer speziellen Verabreichung bereitgestellten Stammzellen erhöht wird, oder durch Gewährung wiederholter Verabreichung von Donator-Stammzellen.
Eine wiederholte Verabreichung von Stammzellen kann die Transplantat-Akzeptanz, den gemischten Chimärismus und die Langzeit-Abstoßungstoleranz in Transplantat-Empfängern bessern. Damit sind in die Erfindung auch Medikamente zur Verwendung in Verfahren einbezogen, in denen mehrfache hämopoetische Stammzellen-Verabreichungen an einen Empfänger vorgesehen sind. Mehrfache Verabreichung kann die Notwendigkeit zur hämopoetischen raumschaffenden Bestrahlung eliminieren. Die Verabreichungen können vor, zum Zeitpunkt oder nach einer Transplantation gegeben werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von Stammzellen vor der Implantation eines Implantats vorgesehen. Es können zwei, drei, vier, fünf oder mehr Verabreichungen vorgesehen werden. Die Dauer zwischen den Verabreichungen von hämopoetischen Stammzellen kann variiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine nachfolgende Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen vorgesehen nach mindestens 2 Tagen, einer Woche, einem Monat oder 6 Monaten nach der vorangegangenen Verabreichung von Stammzellen; wenn der Empfänger beginnt, auf das Donator-Antigen Anzeichen von Wirts-Lymphozytenreaktion zu zeigen; wenn der Wert des Chimärismus abnimmt; wenn der Wert des Chimärismus unterhalb eines vorbestimmten Wertes fällt; wenn der Wert des Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, wo die Anfärbung mir einem monoklonalen Antikörper, der auf ein Spender-PBMC-Antigen spezifisch ist, gleich einem Anfärben mit einer Isotyp-Kontrolle ist oder diese unterschreitet, die sich nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donator-spezifischen monoklonalen Anfärbungen weniger als 1 bis 2% der Zellen ausmachen; oder im Allgemeinen nach Erfordernis wenn es um einen Wert von gemischtem Chimärismus aufrecht zu erhalten, der ausreichend ist, um die Toleranz gegenüber dem Donator-Antigen aufrecht zu erhalten.
Einmalige oder mehrfache Post-Implantationsverabreichungen von Donator-Stammzellen können auch vorgesehen werden, um die Notwendigkeit einer Bestrahlung auf ein Minimum herabzusetzen oder zu eliminieren. Post-Transplantatverabreichung von hämopoetischen Stammzellen kann vorgesehen werden: mindestens 2 Tage, 1 Woche, einen Monat oder 6 Monate nach der vorangegangenen Verabreichung von Stammzellen; mindestens 2 Tage, 1 Woche, einen Monat, 6 Monate oder eine beliebige Zeit in der Lebensdauer des Empfängers nach der Implantation des Implantats; wenn der Empfänger beginnt, Anzeichen für die Abstoßung zu zeigen, z. B. zeigt sich dieses durch einen Rückgang der Funktion des transplantierten Organs, durch eine Änderung in der Wirts-spezifischen Donator-Antikörperreaktion, oder durch eine Änderung in der Reaktion der Wirtslymphozyten auf das Donator-Antigen; wenn der Wert des Chimärismus abnimmt, wenn der Wert des Chimärismus einen vorbestimmten Wert unterschreitet; wenn der Wert des Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, bei dem ein Anfärben mit monoklonalem Antikörper, der spezifisch für Donator-PBMC-Antigen einem Anfärben mit einer Isotyp-Kontrolle gleich ist oder diese unterschreitet, die nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donatorspezifischen monoklonalen Anfärbungen kleiner sind als 1 bis 2% der Zellen; oder im Allgemeinen nach Erfordernis wenn es um einen Wert von gemischtem Chimärismus aufrecht zu erhalten, der ausreichend ist, um die Toleranz gegenüber dem Donator-Antigen aufrecht zu erhalten.
Wenn mehrfache Stammzellen-Verabreichungen vorgenommen werden, können in eine oder mehrere der Verabreichungen eine Zahl von Donator-hämopoetischen Zellen einbezogen werden, die mindestens das 2-fache, das gleiche oder mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmarkzellen betragen, die in einer erwachsenen Empfängerspezies angetroffen werden, einschließlich eine Zahl von Donator-hämopoetischen Stammzellen, die mindestens das 2-fache beträgt, gleich ist oder mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der hämopoetischen Knochenmark-Stammzellen beträgt, die in einem Erwachsenen der Empfängerspezies angetroffen wird.
In bevorzugten Ausführungsformen dienen die Medikamente zur Verwendung in Verfahren, worin passivierende natürliche Killerzellen einbezogen sind, vorzugsweise Transplantat-reaktionsfähige oder Xeno-reaktionsfähige, z. B. Schwein-reaktionsfähige, NK-Zellen des Empfänger-Säugers. Dieses kann durch Einführen in den Empfänger-Säuger eines Antikörpers erreicht werden, der zum Binden an natürlichen Killerzellen des Empfänger-Säugers in der Lage ist. Die Verabreichung von Antikörpern oder eine andere Behandlung zur Inaktivierung von natürlichen Killerzellen kann vor dem Einführen der hämopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger oder vor der Transplantation des Transplantats in den Empfänger erfolgen. Dieser Antikörper kann gleich einem Antikörper sein oder von diesem verschieden sein, der zum Inaktivieren von T-Zellen verwendet wird.
In bevorzugten Ausführungsformen dienen die Medikamente zur Verwendung in dem Verfahren, worin das Inaktivieren von T-Zellen einbezogen ist, bevorzugt Transplantat-reaktionsfähige oder Xenoreaktionsfähige, z. B. Schwein-reaktionsfähige T-Zellen des Empfänger-Säugers. Dieses kann beispielsweise durch Einführen in den Empfänger-Säuger eines Antikörpers erfolgen, der in der Lage ist, an T-Zellen des Empfänger-Säugers zu binden. Die Verabreichung von Antikörpern oder eine andere Behandlung zur Inaktivierung von T-Zellen kann vor dem Einführen der hämopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger oder vor dem Transplantieren des Transplantats in den Empfänger erfolgen. Dieser Antikörper kann einem Antikörper gleich sein oder von diesem verschieden sein, der zum Inaktivieren natürlicher Killerzellen verwendet wird.
Eine der Quellen für Anti-NK-Antikörper ist Antihuman-Thymozyten-polyklonales Antiserum. Vorzugsweise kann auch ein zweiter, anti-reifer T-Zellen-Antikörper verabreicht werden, der T-Zellen sowie NK-Zellen auflöst. Das Auflösen von T-Zellen ist sowohl für das Knochenmark als auch für das Transplantat-Überleben vorteilhaft. Es sind Anti-T-Zellen-Antikörper zusammen mit Anti-NK-Antikörpern im Anti-Thymozyten-Antiserum vorhanden. Wiederholte Dosierungen von Antikörpern, z. B. Anti-NK- oder Anti-T-Zellen-Antikörper, können bevorzugt sein. Monoklonale Präparate können zusammen mit den Medikamenten der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen erhält der Empfänger keine Behandlungen, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen stimuliert. Beispielsweise sollte der Empfänger keine Substanz erhalten, z. B. ein Steroid-Medikament, z. B. Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion) bei einer Dosierung oder Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen in dem Empfänger stimuliert. Vorzugsweise ist der Empfänger frei von einer solchen Behandlung vom Zeitpunkt der ersten Verabreichung von Stammzellen bis zur Implantation des Implantats oder so lange, bis sich ein gemischter Chimärismus und eine Toleranz eingestellt haben.
In bevorzugten Ausführungen sind in die Medikamente zur Verwendung in dem Verfahren die Verabreichung einer kurzzeitigen unterstützenden reduzierenden Behandlung einbezogen, z. B. ein Arzneimittel oder ein anderes chemisches Mittel, das den nicht angepassten Antigenen der Klasse I und/oder kleineren Antigenen Toleranz auf dem Transplantat vermittelt, das in den Empfänger eingeführt wird. Die kurzzeitige unterstützende reduzierende Behandlung, z. B. eine kurzzeitige hohe Dosierung von Cyclosporin, wird im Allgemeinen zu dem Zeitpunkt vorgenommen, zu dem das Transplantat in den Empfänger eingeführt wird. Die Dauer der kurzzeitigen unterstützenden reduzierenden Behandlung ist ungefähr gleich der Dauer oder kürzer als diese, die für reife T-Zellen der Empfängerspezies erforderlich ist, um eine Abstoßung eines Antigens einzuleiten, nachdem es zuerst durch das Antigen stimuliert worden ist; in mehr bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer ungefähr gleich der Dauer oder kürzer als das 2-fache, 3-fache, 4-fache, 5-fache oder 10-fache der Dauer, die für eine reife T-Zelle der Empfängerspezies erforderlich ist, um eine Abstoßung eines Antigens einzuleiten, nachdem in diese erstmalig durch das Antigen stimuliert worden ist. Diese Methoden wurden detaillierter in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung 08/458.720, eingereicht am 1. Juni, 1995, beschrieben. Die Methoden von 08/458.720 können mit den hierin beschriebenen Methoden kombiniert werden.
Eine der bevorzugten Ausführungsformen schließt ein: den Schritt des Einführens in den Empfänger-Säuger von Donatorspezies-spezifischen Stroma-Gewebe, bevorzugt hämopoetisches Stroma- Gewebe, z. B. Foetal-Leber oder Thymus. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Stroma-Gewebe gleichzeitig mit oder vor den hämopoetischen Stammzellen eingeführt; die hämopoetischen Stammzellen werden gleichzeitig mit oder vor dem Antikörper eingeführt.
Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen Behandlungen zur weiteren Inaktivierung von Empfänger-T-Zellen ein, insbesondere Thymus-Lymphknoten-Thymozyten oder T-Zellen. Thymus- oder Lymphknoten-Thymozyten oder T-Zellen könnten ansonsten die Transplantat-Akzeptanz oder das Überleben der verabreichten Zellen hemmen. Eine solche Inaktivierung kann durch eine oder mehrere der folgenden erreicht werden: Bestrahlen des Thymus des Empfänger-Säugers nur einer Strahlungsdosis, die ausreichend ist, um Thymozyten zu inaktivieren, z. B. 1 bis 10 Gy (100 bis 1.000 rad) und mehr bevorzugt zwischen 3 und 7 Gy (300 und 700 rad), z. B. etwa 3,5 oder 7 Gy (350 oder 700 rad) Thymus-Bestrahlung; Verabreichung von einer oder wiederholten Dosismengen eines Anti-T-Zellen- oder Anti-Thymozyten-Antikörpers; oder Verabreichen an den Empfänger einer kurzzeitigen immunsuppressiven chemischen Substanz oder Arzneimittels, wie hierin beschrieben wird. Das Inaktivieren von Thymozyten oder T-Zellen kann vor der hämopoetischen Stammzellen- oder Transplantat-Transplantation vorgenommen werden. In bevorzugten Ausführungsformen dient das Medikament zur Verwendung in dem Verfahren, worin das Verringern oder Hemmen von Thymozyten- oder T-Zellen-Aktivität einbezogen sind, bevorzugt die Aktivität von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, durch Verabreichen an den Empfänger für eine kurze Dauer ein immunsuppressives Mittel, z. B. eine chemische Substanz oder ein Arzneimittel, z. B. Cyclosporin, in ausreichender Menge zur Inaktivierung von Thymozyten- oder T-Zellen, bevorzugt Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen. Die Dauer der kurzzeitigen Behandlung mit dem immunsuppressiven Mittel beträgt ungefähr 30 Tage; näherungsweise gleich oder weniger als 8 bis 12 Tage, vorzugsweise etwa 10 Tage; ungefähr gleich oder weniger als das 2-fache, 3-fache, 4-fache, 5-fache oder 10-fache der Dauer von 8 bis 12 oder 10 Tagen. Die kurzzeitige Behandlung kann beginnen: bevor die Behandlung zur Herbeiführung der Toleranz begonnen hat oder etwa zum Zeitpunkt dieser, z. B. etwa zum Zeitpunkt der Einführung der Stammzellen in den Empfänger; an dem Tag, an dem die Behandlung zur Herbeiführung der Toleranz begonnen hat, z. B. an dem Tage der Einführung der Stammzellen in den Empfänger; innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tage vor oder nach der Behandlung zur Herbeiführung der Toleranz, z. B. innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tage vor oder nach der Einführung von Stammzellen in den Empfänger. Die kurzzeitige Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel kann in Verbindung mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper erfolgen. Die kurzzeitige Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel sollte hinsichtlich der Konzentration und der Dauer ausreichend sein, um T-Zellen zu inaktivieren, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, die durch eine Inaktivierung von T-Zellen auf Antikörper-Basis nicht inaktiviert werden würden, z. B. Inaktivierung durch intravenöse Verabreichungen von ATG-Antikörper oder ähnliche Präparate.
Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen ein: bevorzugt vor der hämopoetischen Stammzellen-Transplantation den Schritt der Abreicherung natürlicher Antikörper aus dem Blut des Empfänger-Säugers. Die Abreicherung kann beispielsweise durch Kontaktieren des Blutes der Empfänger mit einem Epitop erfolgen, welches vorgeformte Anti-Donator-Antikörper absorbiert. Der Epitop kann mit einem unlöslichen Substrat gekuppelt und z. B. als eine Affinitätssäule vorgesehen werden, z. B. eine α1-3-Galactose-Verknüpfung von Epitop-Affinitätsmatrix, z. B. Matrix-gebundenes lineares B-Typ-VI- Kohlehydrat, das zur Verabreichung von natürlichen Antikörpern verwendet werden kann. Die Abreicherung kann auch durch Blutdurchspülung eines Organs erfolgen, z. B. einer Leber oder einer Niere, das von einem Säuger der Donator-Spezies erhalten wurde. (In einem Organ binden die Antikörper der Blutdurchspülung an Antigenen auf den Zelloberflächen des Organs und werden dadurch aus dem Blur entfernt).
Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen solche ein, bei denen der gleiche Säuger der zweiten Spezies der Spender von einem oder sowohl dem Transplantat als auch den hämopoetischen Zellen ist; und der Antikörper ein Antihuman-Thymozyten-polyklonales-Antiserum ist, das z. B. von einem Pferd oder Schwein erhalten wird.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren den Schritt des Einführens in den Empfänger eines Transplantats ein, das von dem Spender erhalten wurde und das von einem anderen Organ als den hämopoetischen Stammzellen erhalten wird, z. B. einem Herz, einer Pankreas, Leber oder Niere.
Verfahren, für die die Medikamente der Erfindung angezeigt sind, für die die Notwendigkeit zur hämopoetischen raumschaffenden Bestrahlung verringert oder eliminiert ist, können angewendet werden, wenn homologe Stammzellen implantiert werden. Dementsprechend kennzeichnet die Erfindung in einem anderen Aspekt die Verwendung von hämopoetischen Stammzellen in der Herstellung eines Medikaments für ein Verfahren zum Einleiten von Toleranz in einem Empfänger-Säuger einer ersten Spezies gegenüber einem Transplantat von einem Spender-Säuger der gleichen Spezies. Der Empfänger-Säuger kann beispielsweise ein Primat sein, z. B. ein Mensch. Das Transplantat exprimiert bevorzugt ein größeres Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Antigen und vorzugsweise ein Antigen der Klasse II.
Das Verfahren schließt ein: Einführen, z. B. durch intravenöse Injektion, in den Empfänger-Säuger von hämopoetischen Stammzellen, die Thymusraum in dem Empfänger bei Fehlen einer Ganzkörperbestrahlung schaffen und Implantieren des Implantats in den Empfänger. Man nimmt an, dass die hämopoetischen Zellen den Empfänger für das Transplantat vorbereiten, welches folgt, indem sowohl gegenüber den Mengen der B-Zelle als auch der T-Zellen Toleranz herbeigeführt wird.
Dieses Verfahren kann ohne die Verabreichung einer hämopoetischen raumschaffenden Bestrahlung erfolgen, z. B. Ganzkörperbestrahlung. Die Ganzkörperbestrahlung wird oftmals auf dem Gebiet zur Erzeugung von hämopoetischem Raum angewendet und fördert damit die Transplantat-Akzeptanz, den Chimärismus und die Toleranz. Die Notwendigkeit für eine hämopoetische raumschaffende Bestrahlung kann vollständig eliminiert werden, indem ein oder mehrere der folgenden Schritte in das Verfahren einbezogen werden:

(1) Verabreichen einer ausreichend großen Zahl von Spender-hämopoetischen Zellen an den Empfänger derart, dass die Donator-Stammzellen-Einpflanzung zu einem gemischten Chimärismus führt und eine Toleranz herbeiführt, wobei die Stammzellen bevorzugt in Kombination mir einer oder mehreren der hierin offenbarten Behandlungen verabreicht werden, z. B. die nachfolgenden (2) oder (3);
(2) Verabreichen von hämopoetischen raumschaffenden Antikörpern oder Arzneimitteln an den Empfänger, z. B. Verabreichen eines Inhibitors für Zellproliferation, z. B. DSG, oder eines Antimetaboliten, z. B. Brequinar, oder eines Anti-T-Zellen-Antikörpers, z. B. einen oder beide eines Anti-CD4 oder Anti-CD8-Antikörpers;
(3) Erzeugen von Thymusraum in dem Empfänger, z. B. durch Bestrahlen des Thymus des Empfängers, z. B. durch Verabreichen zwischen 1 und 10 Gy (zwischen 100 und 1.000 rad), mehr bevorzugt zwischen 3 und 7 Gy (300 und 700 rad) z. B. 7 Gy (700 rad) von Thymus-Bestrahlung oder durch Verabreichen von Anti-T-Zellen-Antikörpern in ausreichender Dosierung zur Inaktivierung von Thymozyten. Andere Methoden zur Erzeugung von Thymusraum schließen ein: die Verabreichung von Steroiden, Kortikosteroiden, Brequinar oder einer immunsuppressiven chemischen Substanz oder Arzneimittels, z. B. Rapamycin, Cyclosporin oder FK506. Die Behandlung zur Erzeugung von Thymusraum sollte vorgenommen werden oder mindestens vor der Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen beginnen. Eine wirksame Behandlung sollte einzelne positive Thymozyten abreichern bis zu einem Umfang, in welchem die Transplantat-Akzeptanz und die Erzeugung von gemischtem Chimärismus bei Fehlen der Schaffung von hämopoetischem Raum z. B. hämopoetischer Raum, der durch Ganzkörperbestrahlung erzeugt wird, auf ein Optimum gebracht werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind einzelne positive Thymozyten des Patienten mindestens um 20, 40, 60 oder 80% abgereichert. Behandlungen, die zu einer Abreicherung zwischen 10 und 90% führen, sind bevorzugt. Die Behandlungsdauer wird in Abhängigkeit von der Dosierung und der Wirksamkeit des Mittels variieren, wird in der Regel jedoch weniger als 60, 30 oder 15 Tage betragen. Die Behandlung sollte mindestens 7 Tage und mehr bevorzugt 10 oder 14 Tage dauern. In bevorzugten Behandlungen, z. B. bei der Verabreichung einer immunsuppressiven chemischen Substanz oder Arzneimittels, z. B. Cyclosporin, sollte diese mindestens 7 bis 30 Tage dauern. Die Behandlung, z. B. die Verabreichung von Cyclosporin, sollte zu einem Zeitpunkt beginnen, bei dem die Verabreichung von Stammzellen beendet worden ist. Die Verabreichung des Mittels sollte auf täglicher Basis oder nach Erfordernis erfolgen, um einen Wert des Mittels aufrecht zu erhalten, der den gewünschten Wert der Abreicherung ermöglicht. Eine besonders bevorzugte Behandlung ist die Verabreichung einer immunsuppressiven chemischen Substanz, z. B. Cyclosporin, für mehr als 7 und weniger als 30 Tage. Ein anwendbares Regime in Nagetieren sind 20 mg/kg/Tag Cyclosporin für 14 Tage, das am dritten Tag vor der Verabreichung von Stammzellen endet.

Damit wird eine Menge von hämopoetischen Stammzellen, die zur Herbeiführung der Toleranz ausreichend ist, ohne dass eine hämopoetische, raumerzeugende Bestrahlung notwendig ist, an den Empfänger verabreicht. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Zahl der Donator-hämopoetischen Zellen mindestens das 2-fache oder ist mindestens gleich oder beträgt mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmarkzellen, die in einem Erwachsenen der Empfängerspezies angetroffen wird. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Zahl der Donator-hämopoetischen Stammzellen mindestens das 2-fache, ist midestens gleich oder beträgt mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmark-hämopoetischen Stammzellen, die in einem Erwachsenen der Empfängerspezies angetroffen wird.
In dem Empfänger wird ein gemischter Chimärismus herbeigeführt und der Zustand des gemischten Chimärismus in Abwesenheit der Herbeiführung eines hämopoetischen Raumes erzeugt, z. B. in Abwesenheit eines hämopoetischen Raumes, der erzeugt wird durch raumerzeugende Bestrahlung, z. B. durch Ganzkörperbestrahlung.
Die Zahl der an einen Empfänger verabreichten Donator-Zellen kann entweder erhöht werden durch Erhöhung der Zahl in einer speziellen Verabreichung vorgesehenen Stammzellen oder durch wiederholte Verabreichung von Donator-Stammzellen.
Wiederholte Verabreichung von Stammzellen kann die Transplantat-Akzeptanz verbessern, den gemischten Chimärismus sowie die langzeitige Abstoßungstoleranz in Transplantatempfängern. Damit sind in die Erfindungen auch Medikamente zur Verwendung in Verfahren einbezogen, in denen mehrfache Verabreichungen von hämopoetischen Stammzellen an einen Empfänger vorgesehen sind. Mehrfache Verabreichung kann die Notwendigkeit zur hämopoetischen raumerzeugenden Bestrahlung eliminieren. Verabreichungen können vor der Transplantat-Implantation erfolgen, können zu diesem Zeitpunkt erfolgen oder danach. In bevorzugten Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von Stammzellen vor der Implantation eines Implantats vorgesehen. Es können zwei, drei, vier, fünf oder mehrere Verabreichungen vorgesehen werden. Die Dauer zwischen den Verabreichungen von hämopoetischen Stammellen kann variiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann eine nachfolgende Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen vorgesehen werden: mindestens 2 Tage, 1 Woche, einen Monat oder 6 Monate nach der vorangegangenen Verabreichung von Stammzellen; sobald der Empfänger beginnt, Anzeichen für Wirtslymphozytenreaktion auf Donator-Antigen zu zeigen; sobald der Wert des Chimärismus abnimmt; wenn der Wert des Chimärismus unterhalb eines vorbestimmten Wertes fällt; wenn der Wert des Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, bei dem die Anfärbung mit monoklonalem Antikörper, der spezifisch auf ein Donator-PBMC-Antigen ist, gleich einem Anfärben mir einer Isotyp-Kontrolle ist oder diese unterschreitet, die nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donatorspezifischen monoklonalen Anfärbungen weniger als 1 bis 2% der Zellen sind; oder in der Regel nach Erfordernis, um einen Wert des gemischten Chimärismus aufrecht zu erhalten, der ausreichend ist, um Toleranz gegenüber Donator-Antigen zu bewahren.
Es können eine oder mehrere Post-Implantationsverabreichungen von Donator-Stammzellen vorgesehen werden, um die Notwendigkeit einer Bestrahlung zu eliminieren. Eine Post-Transplantationsverabreichung von hämopoetischen Stammzellen kann vorgesehen werden: mindestens 2 Tage, 1 Woche, einen Monat oder 6 Monate nach der vorangegangenen Verabreichung von Stammzellen; mindestens 2 Tage, 1 Woche, einen Monat, 6 Monate oder zu jeder beliebigen Zeit in der Lebensdauer des Empfängers nach der Implantation des Implantats; wenn der Empfänger beginnt, Anzeichen einer Abstoßung zu zeigen, z. B. zeigt sich dieses durch eine Abnahme der Funktion des transplantierten Organs, durch eine Änderung der Wirts-Donator-spezifischen Antikörperreaktion oder durch eine Änderung in der Wirts-Lymphozytenreaktion auf Donator-Antigen; wenn der Wert des Chimärismus abnimmt; wenn der Wert des Chimärismus unterhalb eines vorbestimmten Wertes fällt; wenn der Wert des Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, bei dem die Anfärbung mir monoklonalem Antikörper, der spezifisch auf ein Donator-PBMC-Antigen ist, gleich einem Anfärben mit einer Isotyp-Kontrolle ist oder diese unterschreitet, die nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donator-spezifischen monoklonalen Anfärbungen weniger als 1 bis 2% der Zellen sind; oder in der Regel nach Erfordernis, um eine Toleranz aufrecht zu erhalten oder ansonsten die Akzeptanz eines Transplantats zu verlängern.
Sofern mehrfache Stammzellen-Verabreichungen vorgenommen werden, können eine oder mehrere der Verabreichungen eine Zahl von Donator-hämopoetischen Zellen einschließen, die mindestens das 2-fache beträgt, gleich ist oder mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmarkzellen beträgt, die in einem Erwachsenen der Empfängerspezies angetroffen wird; einschließlich eine Zahl von Donatorhämopoetischen Stammzellen, die mindestens das 2-fache beträgt, gleich ist oder mindestens 75, 50 oder 25% der Zahl der Knochenmark-hämopoetischen Stammzellen beträgt, die in einem Erwachsenen der Empfängerspezies angetroffen wird.
In bevorzugten Ausführungsformen dient das Medikament zur Verwendung in einem Verfahren, welches die Inaktivierung natürlicher Killerzellen einschließt, vorzugsweise Transplantat-reaktionsfähige oder Donator-reaktionsfähige NK-Zellen des Empfänger-Säugers. Dieses kann erreicht werden, indem beispielsweise in den Empfänger-Säuger ein Antikörper eingeführt wird, der zum Binden an natürlichen Killerzellen des Empfänger-Säugers in der Lage ist. Die Verabreichung von Antikörpern oder eine andere Behandlung zur Inaktivierung natürlicher Killerzellen kann vor dem Einführen der hämopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger erfolgen oder vor dem Transplantieren des Transplantats in den Empfänger. Dieser Antikörper kann von dem Antikörper gleich oder verschieden sein, der zum Inaktivieren von T-Zellen verwendet wird.
In bevorzugten Ausführungsformen dient das Medikament zur Verwendung in dem Verfahren, welches das Inaktivieren von T-Zellen einschließt, vorzugsweise Transplantat-reaktionsfähige oder Donator-reaktionsfähige T-Zellen des Empfänger-Säugers. Dieses kann beispielsweise erfolgen, indem in den Empfänger-Säuger ein Antikörper eingeführt wird, der zum Binden an T-Zellen des Empfänger-Säugers in der Lage ist. Die Verabreichung von Antikörpern oder eine andere Behandlung zum Inaktivieren von T-Zellen kann vor dem Einführen von hämopoetischen Stammzellen in den Empfänger-Säuger erfolgen oder vor dem Implantieren des Implantats in den Empfänger. Dieser Antikörper kann dem Antikörper gleich oder von diesem verschieden sein, der zum Inaktivieren von natürlichen Killerzellen verwendet wird.
Eine der Quellen von Anti-NK-Antikörper ist Antihumanthymozyten-polyklonales Antiserum. Bevorzugt kann ein zweiter anti-reifer T-Zellen-Antikörper ebenfalls verabreicht werden, der T-Zellen sowie NK-Zellen auflöst. Das Auflösen von T-Zellen ist sowohl für das Knochenmark als auch für das Transplantatüberleben vorteilhaft. Anti-T-Zellen-Antikörper liegen zusammen mit Anti-NK-Antikörpern im Antithymozyten-Antiserum vor. Wiederholte Dosierungen von Antikörpern, z. B. Anti-NK- oder Anti-T-Zellen-Antikörper, können bevorzugt sein. Monoklonale Präparate können zusammen mit den Medikamenten der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen erhält der Empfänger keine Behandlungen, die das Freisetzen eines Cytokins durch reife T-Zellen stimulieren. Beispielsweise sollte der Empfänger keine Substanz erhalten, z. B. ein Steroid-Arzneimittel, z. B. Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion), bei einer Dosierung oder Konzentration, die die Freisetzung eines Cytokins durch reife T-Zellen in dem Empfänger stimuliert. Vorzugsweise ist der Empfänger frei von einer solchen Behandlung zum Zeitpunkt, zu dem die Stammzellen erstmalig verabreicht werden, und zwar so lange, bis das Transplantat implantiert ist oder bis sich ein gemischter Chimärismus und Toleranz eingestellt haben.
In bevorzugten Ausführungsformen dienen die Medikamente für die Verwendung in dem Verfahren, welches die Verabreichung einer kurzfristigen unterstützenden reduzierenden Behandlung einschließt, z. B. ein Arzneimittel oder eine andere chemische Substanz, die den nicht angepassten Antigenen der Klasse I und/oder kleineren Antigenen auf dem Transplantat Toleranz vermittelt, das in den Empfänger eingeführt wurde. Die kurzzeitige unterstützende reduzierende Behandlung, z. B. eine kurzzeitige Behandlung mit hochdosiertem Cyclosporin, wird in der Regel zum einem Zeitpunkt verabreicht, zu dem das Transplantat in den Empfänger eingeführt wird. Die Dauer der kurzzeitigen unterstützenden reduzierenden Behandlung ist ungefähr gleich oder kürzer als die Dauer, die für reife T-Zellen der Empfängerspezies erforderlich ist, um eine Abstoßung eines Antigens einzuleiten, nachdem dieses erstmalig durch das Antigen stimuliert wurde; in mehr bevorzugten Ausführungsformen ist die Dauer näherungsweise gleich oder kürzer als das 2-, 3-, 4-, 5- oder 10-fache der Dauer, die für eine reife T-Zelle der Empfängerspezies erforderlich ist, um eine Abstoßung eines Antigens nach erstmaliger Stimulierung durch das Antigen herbeizuführen. Diese Verfahren wurden detaillierter in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung 08/458.720, eingereicht am 1. Juni, 1995, beschrieben. Die Verfahren der 08/458.720 können mit den hierin beschriebenen Verfahren kombiniert werden.
Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen Medikamente für die Verwendung in den Behandlungen zur weiteren Inaktivierung von Empfänger-T-Zellen ein und speziell Thymus-Lymphknoten-Thymozyten oder T-Zellen. Thymus- oder Lymphknoten-Thymozyten oder T-Zellen könnten ansonsten die Transplantat-Akzeptanz oder das Überleben der verabreichten Zellen hemmen. Eine derartige Inaktivierung kann durch eine oder mehrere der folgenden erreicht werden: Bestrahlen des Thymus des Empfänger-Säugers mit einer Strahlungsdosis die ausreichend ist, Thymozyten zu inaktivieren, z. B. 1 bis 10 Gy (100 bis 1.000 rad), mehr bevorzugt zwischen 3 bis 7 Gy (300 bis 700 rad), z. B. etwa 3,5 oder 7 Gy (350 oder 700 rad) einer Thymus-Bestrahlung; Verabreichen einer oder wiederholter Dosismengen eines Anti-T-Zellen- oder Anti-Thymozyten-Antikörpers; oder Verabreichen an den Empfänger einer kurzzeitigen Behandlung mit einer immunsuppressiven chemischen Substanz oder Arzneimittel, wie hierin beschrieben wird. Die Inaktivierung von Thymozyten oder T-Zellen kann vor der Transplantation des Transplantats oder der hämopoetischen Stammzellen vorgenommen werden. In bevorzugten Ausführungsformen dienen die Medikamente zur Verwendung für das Verfahren, welches die Herabsetzung oder die Hemmung von Thymozyten- oder T-Zellen-Aktivität einschließt, vorzugsweise die Aktivität von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, durch Verabreichen an den Empfänger einer kurzzeitigen Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel, z. B. Cyclosporin, die ausreichend ist, um Thymozyten oder T-Zellen zu inaktivieren, vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen. Die Dauer der kurzzeitigen Behandlung mit dem immunsuppressiven Mittel beträgt: näherungsweise 30 Tage; näherungsweise gleich oder weniger als 8 bis 12 Tage und vorzugsweise etwa 10 Tage; näherungsweise gleich oder weniger als das 2-, 3-, 4-, 5- oder 10-fache der Dauer von 8 bis 12 oder 10 Tagen. Die kurzzeitige Behandlung kann beginnen: vor oder etwa zum Zeitpunkt der Behandlung zur Herbeiführung der Toleranz, z. B. etwa zum Zeitpunkt der Einführung von Stammzellen in den Empfänger; am Tag des Beginns der Behandlung zur Herbeiführung der Toleranz, z. B. an dem Tag, an dem die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tagen vor oder nach der Behandlung zur Herbeiführung der Toleranz, z. B. innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tagen vor oder nach der Einführung von Stammzellen in den Empfänger. Die kurzzeitige Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel kann in Verbindung mit einem Anti-T-Zellen-Antikörper erfolgen. Die kurzzeitige Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel sollte mit ausreichender Konzentration und Dauer erfolgen, um T-Zellen zu aktivieren, z. B. Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, die sonst durch eine Inaktivierung von T-Zellen auf Antikörper-Basis nicht aktiviert werden würden, z. B. eine Inaktivierung durch intravenöse Verabreichungen von ATG-Antikörper oder ähnliche Präparate.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Endung ein Medikament für die Verwendung in dem Verfahren, worin eine Toleranz gegenüber einem Transplantat von einem Spender-Säuger einbezogen ist oder eine Verlängerung der Akzeptanz. Das Verfahren umfasst: Verringerung oder Hemmung der Thymozyten- oder T-Zellen-Aktivität und vorzugsweise der Aktivität von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen, durch Verabreichen an den Empfänger einer kurzzeitigen Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel, z. B. einem Arzneimittel oder einer anderen chemischen Substanz, z. B. Cyclosporin, die ausreichend sind, um Thymozyten oder T-Zellen und vorzugsweise Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu inaktivieren. Die Dauer der kurzzeitigen Behandlung mit immunsuppressivem Mittel beträgt: näherungsweise 30 Tage; näherungsweise gleich oder weniger als 8 bis 12 Tage, bevorzugt etwa 10 Tage; näherungsweise gleich oder weniger als das 2-, 3-, 4-, 5- oder 10-fache der Dauer von 8 bis 12 oder 10 Tagen. Die kurzzeitige Behandlung kann beginnen: vorzugsweise vor der Einführung des Donatorgewebes in den Empfänger und endet 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tage vor der Einführung des Donatorgewebes.
In bevorzugten Ausführungsformen; ist der Empfänger ein Primat, z. B. ein Mensch, und das Transplantat ein Allotransplantat; Empfänger ist ein Primat, z. B. ein Mensch, und der Spender kommt von einer zweiten Spezies, z. B. eine zweite Primatenspezies oder ein Schwein.
Dieses Verfahren kann mit jedem beliebigen der anderen hierin beschriebenen Verfahren kombiniert werden.
"Kombination mit diskordanten Spezies", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf 2 Spezies, in denen eine hyperakute Abstoßung erfolgt, wenn ein Transplantat von dem einen zum anderen transplantiert wird. Im Allgemeinen kommen diskordante Spezies von unterschiedlichen Ordnungen, während nicht diskordante Spezies von der gleichen Ordnung kommen. Beispielsweise sind Ratten und Mäuse nicht diskordante, konkordante Spezies. Konkordante Spezies-Kombinationen zeigen keine hyperakute Abstoßung.
"Transplantat", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Körperteil, Organ, Gewebe oder Zellen. Organe wie beispielsweise Leber, Niere, Herz oder Lunge oder andere Körperteile, wie beispielsweise Knochen- oder Skelettmatrix, Gewebe, wie beispielsweise Haut, Eingeweide, innersekretorische Drüsen oder Stammzellen von Vorfahren verschiedener Arten, sind alle Beispiele für Transplantate.
"Hilfe-reduzierendes Mittel", wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein Mittel, z. B. ein immunsuppressives Arzneimittel, das zu einer Verringerung der Cytokin-Freisetzung führt. Beispiele für Hilfe-reduzierende Mittel sind Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin. Ana-T-Zell-Antikörper sind, da sie T-Zellen eliminieren können, zur Verwendung als Hilfe-reduzierende Mittel nicht bevorzugt. Ein Hilfereduzierendes Mittel muss in ausreichender Dosis verabreicht werden, um eine Hemmung der Freisetzung von Cytokin in einem solchen Maß zu liefern, dass eine Toleranz die Folge ist. Das Hilfe-reduzierende Mittel sollte in Abwesenheit von Behandlungen verabreicht werden, die die Freisetzung von Cytokinen, z. B. IL-2, fördern. Die vermutlichen, Hilfe-reduzierenden Mittel können mit Hilfe von in vitro oder in vivo-Tests einem Prescreening unterworfen werden, indem z. B. das vermutliche Mittel mit T-Zellen in Kontakt gebracht und die Fähigkeit der behandelten T-Zellen zur Freisetzung eines Cytokins, z. B. IL-2, geprüft wird. Die Hemmung der Cytokin-Freisetzung ist kennzeichnend für die Wirksamkeit des vermutlichen Mittels als ein Hilfe-reduzierendes Mittel. Ein derartiges Prescreening von vermutlichen Mitteln kann dann in einem Assay eines Nierentransplantats weiter getestet werden. In einem Assay eines Nierentransplantats wird ein vermutliches Hilfe-reduzierendes Mittel auf seine Wirksamkeit getestet, indem das vermutliche Mittel einem Empfänger-Affen verabreicht und anschließend eine Niere von einem entsprechend Klasse II angepassten, Klasse I und geringerem Antigen fehlangepassten Spender-Affen in den Empfänger transplantiert wird. Die Toleranz gegenüber der Spender-Niere (was sich durch eine verlängerte Transplantat-Akzeptanz des Transplantats zeigte) ist kennzeichnen dafür, dass das vermutliche Mittel mit der getesteten Dosierung ein Hilfe-reduzierendes Mittel ist.
"Hilfereduzierung", wie der Begriff hierin verwendet wird, bedeutet die Reduzierung von T-Zellen-Hilfe durch die Hemmung der Freisetzung mindestens eines Cytokins, z. B. irgendeines der IL-2, IL-4, IL-6, γ-Interferon oder TNF, von T-Zellen des Empfängers zum Zeitpunkt der ersten Exponierung an einem Antigen, dem gegenüber eine Toleranz gewünscht wird. Die Hemmung, die in der T-Zellen-Sekretion eines Cytokins in einem Empfänger erzeugt wird, muss so ausreichend sein, dass der Empfänger gegenüber einem Antigen tolerant ist, das während der Reduzierung der Hilfe verabreicht wird. Ohne an die Lehre gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass der Umfang der Reduzierung so erfolgt, dass weitgehend der erste Ausbruch von II-2 eliminiert wird, der die erste Erkennung eines Fremd-Antigen begleitet, wobei jedoch nicht alle reifen T-Zellen eliminiert werden, bei denen es sich um die Zellen handelt, die in der Ausbildung und Erzeugung der Toleranz wichtig sind.
"Hämopoetischer Raum", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen im Knochenmark erzeugten Zustand, der die Transplantat-Akzeptanz der verabreichten Stammzellen fördert. Der am häufigsten gegangene Weg zum Erzeugen eines hämopoetischen Raums ist die Bestrahlung des Knochenmarks in der Ganzkörperbestrahlung.
"Hämopoetische Stammzelle", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Zelle, z. B. eine Knochenmarkzelle, oder eine Foetal-Leber- oder Milzzelle, die zum Entwickeln in alle Myeloid- und Lymphoid-Linien in der Lage ist und aufgrund der Fähigkeit zur Selbsterneuerung eine langzeitige hämopoetische Rekonstitution gewähren kann. "Hämopoetische Stammzelle", wie der Begriff hierin verwendet wird, beziehen sich auf Zellen, die nicht von Human-Embryozellen erhalten worden sind. Gereinigte Präparate von hämopoetischen Zellen oder Präparate, wie beispielsweise Knochenmark, in die alle anderen Zell-Typen einbezogen sind, können in den Medikamenten der Erfindung verwendet werden. Ohne an eine Lehre gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die hämopoetischen Stammzellen an einer Stelle in dem Empfänger-Säuger weilen. In das Präparat sollten unreife Zellen einbezogen sein, d. h. undifferenzierte hämopoetische Stammzellen, wobei diese angestrebten Zellen von einem Präparat abgetrennt oder ein komplexes Präparat verabreicht werden kann. Beispielsweise können im Fall von Knochenmark-Stammzellen die gewünschten primitiven Zellen aus einem Präparat abgetrennt werden oder es kann eine komplexe Knochenmarkprobe unter Einbeziehung solcher Zellen verwendet werden. Hämopoetische Stammzellen können von foetalen, neonatalen, unreifen oder reifen Tieren kommen. Stammzellen, die von Nabelschnurblut des Empfängers oder des Spenders stammen, lassen sich in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden. Siehe hierzu die US-P-5.192.553 und die US-P-5.004.681.
"Immunsuppressives Mittel, das zur Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen in der Lage ist", wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein Mittel, z. B. ein chemisches Mittel, z. B. ein Arzneimittel, das, wenn es in einer geeigneten Dosierung verabreicht wird, zu der Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen führt. Beispiele für derartige Mittel sind Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin. Ebenfalls können Anti-T-Zellen-Antikörper verwendet werden. Ein Mittel sollte in ausreichender Dosierung verabreicht werden, um zu einer signifikanten Inaktivierung von Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu führen, die durch Verabreichung eines Anti-T-Zellen-Antikörpers nicht inaktiviert werden, z. B. eines Anti-ATG-Präparats. Vermutliche Mittel und anwendbare Konzentrationen davon können mit Hilfe von in vitro- oder in vivo-Tests einem Prescreening unterworfen werden, indem z. B. das vermutliche Mittel einem Testtier verabreicht wird, eine Probe eines Thymus- oder Lymphknotengewebes entnommen wird und auf Vorhandensein aktiver T-Zellen in einem in vitro- oder in vivo-Assay getestet wird. Derartige vermutliche Mittel aus einem Prescreening können anschließend in Transplantat-Assays weiter getestet werden.
"Thymus- oder Lymphknoten- oder Thymozyten oder -T-Zellen", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf Thymozyten oder T-Zellen, die gegenüber einer Inaktivierung durch traditionelle Methoden von T-Zellen-Inaktivierung resistent sind, z. B. Inaktivierung durch eine einzelne intravenöse Verabreichung von Anti-T-Zellen-Antikörpern, z. B. Antikörper, z. B. ein ATG-Präparat.
"Thmyus-Bestrahlung", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezeichnet eine Behandlung, bei der mindestens die Hälfte und vorzugsweise mindestens 75, 90 oder 95% der verabreichten. Bestrahlung auf den Thmyus gezielt ist. Eine Ganzkörperbestrahlung wird selbst dann, wenn der Thmyus in den Prozess der Verabreichung der Ganzkörperbestrahlung bestrahlt wird, nicht als Thymus-Bestrahlung angesehen.
"MHC-Antigen", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Proteinprodukt eines oder mehrerer MHC-Gene, wobei der Begriff Fragmente oder Analoga von Produkten von MHC-Genen einschließt, die eine Immunantwort in einem Empfänger-Organismus hervorrufen können. Beispiele für MHC-Gene schließen die Produkte (und Fragmente oder Analoga davon) der Human-MHC-Gene ein, d. h. die HLA-Gene. MHC-Antigene in Schwein, z. B. Zwergschwein, schließen die Produkte (und Fragmente sowie Analoga davon) der SLA-Gene ein, z. B. das DRB-Gen.
"Zwergschwein", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezeichnet die gesamte oder partielle I-Linie des Schweins.
"Hämopoetische raumerzeugende Bestrahlung", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezeichnet die auf das hämopoetische Gewebe gerichtete Bestrahlung, d. h. auf das Gewebe, in welchem Stammzellen angetroffen werden, z. B. das Knochenmark. Diese ist von ausreichender Intensität, um eine wesentliche Zahl von hämopoetischen Zellen zu töten oder zu inaktivieren. Sie wird oftmals in Form einer Ganzkörperbestrahlung gegeben.
"Thymusraum", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezeichnet einen durch eine Behandlung erzeugten Zustand, der die Wanderung von hämopoetischen Zellen eines Typs zu und/oder die Entwicklung in dem Thymus eines Spenders erleichtert, was die Wirts-Thymozyten zerstören oder inaktivieren kann, die die Donator-Antigene erkennen. Es wird angenommen, dass der Effekt durch Eliminierung von Wirtszellen in dem Thymus vermittelt wird.
"Kurzzeitige Behandlung mit einem Hilfe-reduzierenden Mittel", wie der Begriff hierin verwendet wird, bedeutet einen vorübergehenden, nicht chronischen Behandlungsablauf. Die Behandlung sollte vor oder etwa zum Zeitpunkt der Transplantation des Transplantats beginnen. Alternativ kann die Behandlung vor oder etwa zum Zeitpunkt der ersten Exponierung des Empfängers an Donator-Antigenen beginnen. Die Behandlung dauert wahlweise eine Zeit, die näherungsweise gleich oder kürzer ist als die Dauer, die für die T-Zellen der Empfänger-Spezies erforderlich ist, um eine Zurückweisung eines Antigens nach seiner erstmaligen Stimulierung durch das Antigen eingeleitet. Die Dauer der Behandlung kann bis zu einer Zeit verlängert werden, die näherungsweise gleich oder kürzer ist als das 2-fache, 3-, 4-, 5- oder 10-fache der Zeitdauer, die für eine reife T-Zelle der Empfänger-Spezies erforderlich ist, um ein Antigen nach der ersten Stimulierung durch das Antigen abzuweisen. Die Dauer wird in der Regel mindestens gleich der Zeit sein, die für reife T-Zellen der Empfänger-Spezies erforderlich ist, um ein Antigen nach seiner ersten Stimulierung durch das Antigen abzuweisen. In Schweinen und Affen sind etwa 12 Tage einer Behandlung ausreichend. Versuche mit Cyclosporin A (10 mg/kg) haben in Schweinen gezeigt, dass 6 Tage nicht ausreichend sind. Andere Versuche in Affen zeigen, dass IL-2, das am Tag 8, 9 oder 10 einer Cyclosporin A-Behandlung verabreicht wird, zu einer Abstoßung des transplantierten Gewebes führen wird. Somit sind wahrscheinlich 8, 9 oder 10 Tage in Schweinen nicht ausreichend. In Affen ist eine Dosis von 10 mg/kg Cyclosporin mit einem Blutwert von etwa 500 bis 1.000 ng/ml ausreichend, um eine Toleranz in Klasse II, angepasster Klasse I und geringen Antigen-fehlangepassten Nieren auszulösen. Der gleiche Blutwert von 500 bis 1.000 ng/ml ist ausreichend, um in Schweinen eine Toleranz einzuleiten. Eine langfristige Verabreichung von 5 mg/kg verhindert eine Abstoßung (durch langzeitige Immunsuppression), führt jedoch nicht zur Toleranz.
"Kurze Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel", wie der Begriff hierin verwendet wird, bedeutet einen vorübergehenden und nicht chronischen Behandlungsablauf. Die Behandlung sollte vor oder etwa zum Zeitpunkt des Beginns der Behandlung zur Einleitung der Toleranz beginnen, z. B. etwa zum Zeitpunkt, zu dem in dem Empfänger xenogene, allogene, genetisch bearbeitete syngenetische oder genetisch bearbeitete autologe Stammzellen eingeführt werden, beispielsweise kann die kurzzeitige Handlung an dem Tag beginnen, an dem die Behandlung zur Einleitung der Toleranz aufgenommen wird, z. B. an dem Tag, an dem xenogene, allogene, genetisch bearbeitete syngenetische oder genetisch bearbeitete autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden, oder die kurzzeitige Behandlung kann innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nach der Behandlung zur Einleitung der Toleranz beginnen, z. B. innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen vor oder nachdem xenogene, allogene, genetisch bearbeitete syngenetische oder genetisch bearbeitete autologe Stammzellen in den Empfänger eingeführt wurden. Die kurzzeitige Behandlung kann über eine Dauer erfolgen, die gleich ist oder kürzer als etwa 8 bis 12 Tage, bevorzugt etwa 10 Tage, oder über eine Dauer, die näherungsweise gleich ist oder kürzer als das 2-fache, 3-, 4-, 5- oder 10-fache der Dauer von 8 bis 12 oder 10 Tagen. Im optimalen Fall währt die kurzzeitige Behandlung etwa 30 Tage. Die Dosierung sollte ausreichend sein, um einen ausreichenden Blutwert aufrecht zu erhalten, um Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen zu inaktivieren. In Primaten hat sich eine Dosierung von näherungsweise 15 mg/kg/Τag als wirksam erwiesen.
"Stroma-Gewebe", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf Stützgewebe oder Matrix eines Organs im Unterschied zu seinen funktionellen Elementen oder Parenchym.
"Toleranz", wie der Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Hemmung einer Immunantwort des Transplantats eines Empfängers, die ansonsten erfolgen würde, z. B. in Reaktion auf die Einführung eines Nonself-MHC-Antigens in den Empfänger. Die Toleranz kann humorale, celluläre oder sowohl humorale als auch celluläre Antworten umfassen. "Toleranz", wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet nicht nur die vollständige immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen, sondern auch die teilweise immunologische Toleranz, d. h. einen Toleranzgrad gegenüber einem Antigen, der größer ist als er sein würde, wenn das Medikament der vorliegenden Erfindung nicht zum Einsatz gelangen würde. Die Toleranz, wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet eine Donator-Antigen-spezifische Hemmung des Immunsystems gegenüber dem breiten Spektrum der Hemmung des Immunsystens, wie es bei immunsuppressiven Mitteln angetroffen wird.
Die Medikamente der vorliegenden Erfindung eliminieren die Notwendigkeit für eine hämopoetische raumerzeugende Behandlung, z. B. Bestrahlung, bei zahlreichen Methoden der Toleranzerzeugung.
Mit Hilfe der Medikamente der vorliegenden Erfindung erlaubt die Erzeugung des Thymusraums, z. B. durch Thymus-Bestrahlung, die Inaktivierung von Empfänger-peripheren T-Zellen und Thymozyten und die Verabreichung einer ausreichend großen Zahl von xenogenen oder allogenen Donator-Stammzellen die Einleitung von Toleranz ohne den Patienten einer WBI zu unterwerfen. Die Erzeugung eines Thymusraums kann die Menge der Donator-reaktiven Thymozyten reduzieren, wobei jedoch zusätzlich Schritte (entsprechend der Beschreibung hierin) hinzugefügt werden können, um das Reaktionsvermögen von Donator-Thymozyten zu verringern.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Patentansprüchen offensichtlich.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Zunächst werden die Zeichnungen beschrieben.
ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung einer multilinearen Analyse einer Donator-Repopulation in Tieren, bei denen entweder eine Injektion (---) oder 5 Injektionen (___) von BMC verabreicht wurden;
2 (linke Seite) ist eine graphische Darstellung einer langfristigen Donator-Monozyten-(O), Granulozyten
und B-Zellen
-Reppulation in WBC von stabilen Chimären unter B -Mäusen, die Anti-CD4 und -CD8 mAbs an den Tagen 5, 1 und 7, 6 Gy TI am Tag 0 erhalten haben, und zwar mit 174 × 10⁶ B10. A BMC über 5 Tage von Tag 0 bis 4 (n = 7). Standardabweichungen sind an jedem Messwert angegeben. Die rechte Seite zeigt, dass die relativen mittleren Abweichungen ±SD von Gesamt-CD4 (Δ) und
-Zllen von Spender auf WBC der gleichen Mause zuruckgehen wie sie auf der linken Seite gezeigt sind;
3 ist eine Darstellung der CML-Antworten von Milzzellen von stabilen gemischten Chimären. B6-Mäuse, die mit Anti-CD4 und -CD8 mAbs am den Tagen 5, 1 und 7 behandelt wurden, TI am Tag 0 und hohe Dosis B10.A BMC (174 × 10⁶ Zellen über die Tage 0 bis 4) wurden 25 bis 29 Wochen post-BMTanalysiert. Das CML-Reaktionsvermögen gegenüber Wirts-Typ (oben links), Spender-Typ (oben rechts) und einer dritten Partei (untere Seite)-Stimulatoren und Targets ist dargestellt für: (☐) eine gemischte Chimäre; (*) ein non-BMT-Kontrolle/(O) eine normale B6-Maus und
eine normale B10.A-Maus. Die prozentuale spezifische Auflösung wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: 100% × (experimentelle ⁵¹Cr-Freisetzung-spontane ⁵¹Cr-Freisetzung)/(maximale ⁵¹Cr-Freisetzung- spontane ⁵¹Cr-Freisetzung). Die Graphik an der Unterseite der Figur zeigt ein Maximum der prozentualen spezifischen Auflösung, das für 3 zusätzliche Chimären erhalten wurde.
4 ist eine graphische Darstellung, die die spezifische Akzeptanz von Donator-spezifischen Hauttransplantaten in B6-Empfängern von allogenen B10.A BMT (174 × 10⁶ Tage 0 bis 4) nach Behandlung nur Anti-CD4 und -CD8 mAbs an den Tagen 5, 1 und 7 mit 7 Gy von TI am Tag 0 zeigt. Linke Seite: Überlebenszahl von Donator-Typ-Haut an ähnlich behandelten non-BMT-Kontrollmäusen (___) und BMT-Empfängern (---). Rechte Seite: Überlebenszahl einer dritten Partei (SJL/J)-Haut an der gleichen Gruppe von Mäusen. Das Transplantieren wurde 7 Wochen post-BMT ausgeführt;
5 ist eine Darstellung der spezifischen Deletion von Vβ5+ und Vβ11+-Zellen unter CD4+-Milzzellen und unter reifen (Klasse I^hoch)-Wirts-Typ (K^b-hoch)-Thymozyten von Chimären, die 24 bis 29 Wochen post-BMT getötet wurden. Bei b10.A-Kontrollmäusen wurden anstelle dessen gegatterte H-2D^bhoch-Thymozyten analysiert. B6-Mäuse erhielten 174 × 10⁶ B10.A BMC über die Tage 0 bis 4 nach Konditionierung mit Anti-CD4 und -CD8 mAbs und 7 Gy TI. Die FCM-Analyse wurde an 10⁴ gegatterten Zellen für jede Population ausgeführt, die von Interesse war. Die Gesamtzahl der TCRaβ ^hoch-Zellen in dem gleichen Gate wurde ebenfalls bestimmt und die für jede individuelle Vβ erhaltenen Ergebnisse korrigiert, indem der Anteil von TCRaβ^hoch-Zellen dividiert wurde. Die Ergebnisse sind dargestellt für stabile Chimären (n = 6), *kennzeichnet P < 0,05; ***, P < 0,005; ****, P < 0,0005; *****, P < 0,00005 im Vergleich zu gleichzeitig und ähnlich behandelten non-BMT-Kontrollen (n = 4).
ÜBERBLICK
Die Erfindung gewährt mehrere Medikamente für die Erzeugung von Toleranz gegenüber Fremdantigenen, z. B. Antigenen auf allogenem oder xenogenem Gewebe oder Organtransplantaten. Diese Medikamente dienen für die Verwendung in Verfahren, die einzeln oder in Kombination zur Anwendung gelangen können.
Das Kapitel I präsentiert nachfolgend Tierversuche, in denen gezeigt wird, dass Transplantat-Akzeptanz, gemischter Chimärismus und Toleranz erzeugt werden können, ohne dass die Notwendigkeit für eine hämopoetische raumerzeugende Bestrahlung besteht.
In Kapitel II werden nachfolgend die Quellen für die Zellen zur Transplantation beschrieben.
In dem nachfolgenden Kapitel III wird die Implantation von Knochenmarkzellen zur Herbeiführung von Toleranz im Bezug auf MHT-Disparität diskutiert.
I. BEISPIEL 1: EINFLUSS VON THMYUS-BESTRAHLUNG AUF SYNGENETISCHE IMPLANTAT-AKZEPTANZ UNTER ANWENDUNG HOHER DOSISMENGEN VON SPENDER-KNOCHENMARK TIERE:
Es wurden weibliche C57BL/6NCR (B6; H-2b. Ly-5.2) und weibliche Ly-5 kongene B6.Ly-5.2 (Ly-5.1)-Mäuse von der Frederick Cancer Research Facility (Frederick, MD) erhalten. Die Ly-5-Allele wurden nach der Nomenklatur von Morse et al. (1987. Immunogenetics 25 : 71) beschrieben. Alle Mäuse wurden in sterilen Mikroisolator-Käfigen untergebracht, in denen sie autoklaviertes Futter und autoklaviertes, angesäuertes Trinkwasser erhielten. Die Empfänger waren altersangepasst und wurden im Alter von 12 bis 16 Wochen verwendet.
BMT:
C57BL/6NCR (B6; H-2b. Ly-5.2)-Mäuse erhielten 100 ml jedes von Ascites-enthaltenden Anti-CD4 mAb GK1.5 und Anti-CD8 mAb 2.43 intraperitoneal an den Tagen –6 und –1 und +7. Das Volumen von Ascites enthielt 1 bis 2 mg GK1.5 und 1,25 bis 1,5 mg von 2,43 bzw. entsprechend der Messung durch Ratten-IgG2b-spezifischer ELISA. Die Tiere wurden entweder mit 0, 3,5 oder 7 Gy Thymus-Bestrahlung am Tage 0 bestrahlt. Eine Reihe von Mäusen wurde mir einer Dosis von 200 Millionen Knochenmarkzellen (BMC) behandelt. Eine zweite Reihe von Mäusen wurde beginnend am Tag 0 und täglich wiederholt für eine Gesamtdauer von 5 Tagen mit 40 Millionen (insgesamt 200 Millionen Zellen) BMC von Ly-5 kongenen B6.Ly-5.2 (Ly-5.1)-Mäusen behandelt, die intravenös verabreicht wurden. BM-Zellen (BMC's, 200 × 10⁶) wurden von dem Schienbein und dem Oberschenkel geschlechtsangepassten B6, Ly-5.2-Spendem im Alter von 6 bis 14 Wochen erhalten. Die T-Zellen-Abreicherung wurde entsprechend der Beschreibung von Sykes et al. (1990. PNAS, 87: 5633–5637) unter Verwendung von Anti-CD4 und -CD8 mAbs und Kaninchen-Komplement ausgeführt.
ZELLZÄHLUNGEN:
Es wurde heparinisiertes peripheres Blut auf einem automatischen Zellzähler (System 9000; Serono-Baker Diagnostics Inc. Allentown, PA) analysiert.
PHÄNOTYPING:
Das Phänotyping wurde zu verschiedenen Zeiten beginnend zwei Wochen nach BMT ausgeführt. Von den Tieren wurde Blut aus dem Schwanz genommen und weiße Blutzellen (WBC) durch hypotonischen Schock präpariert. Die Suspensionen von Milzzellen, Thymozyten, BMC und BM-Kolonnien wurden ebenfalls analysiert. Das Anfärben mit sowohl Donator-spezifischem als auch Empfänger-spezifischem mAB wurde an jeder Chimäre und Kontroll-Tier ausgeführt. Die Zellen wurden mit 20 ml unverdünntem Kulturüberstand von A20-1.7 (Anti-Ly-5.1 mAB; Maus-IgG2a) oder 104-2.1 (Anti-Ly-5.2 mAB; Maus-IgG2a)(Hybridoma freundlicherweise bereitgestellt durch Dr. S. Kimura, Sloan Kettering Cancer Institute. New York, NY) für 30 min bei 4°C inkubiert und anschließend 2 Mal gewaschen. Um ein nicht spezifisches FcgR-Binden von markierten Antikörpern zu blocken, wurde 10 ml unverdünnter Kulturüberstand von 2.4G2 (Ratten-Antimaus-FcgR mAb) der ersten Inkubation zugesetzt. Zellgebundene mAbs wurde mit Fluorescein-Isothiocyanat (FTTC)-konjugierter Ratten-Antimaus-IgG2a mAb (Zymed laboratories. Inc. Mundelein, IL) detektiert, die für 30 min bei 4°C inkubiert wurden, gefolgt von 2 Wäschen und Analyse auf einem FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). In allen Versuchen wurde der Prozentanteil von Zellen, die sich mit jeder mAb anfärben lassen, aus einfarbigen Fluoreszens-Histogrammen und Vergleich mit denen ermittelt, die von normalen Tieren vom Spender-Typ und Wirts-Typ erhalten wurden, die als positive und negative Kontrollen verwendet wurden. Der prozentuale Anteil von als positiv angesehenen Zellen nach dem Anfärben mit einer mAb wurde unter Verwendung einer Fraktion ermittelt, die als der Fluoreszens-Wert bei Beginn des positiven Peaks für die Anfärbung der positiven Kontrolle ausgewählt wurde, sowie durch Subtrahieren des prozentualen Anteils der Zellen, die mit irrelevanter mAb angefärbt wurden (nicht reaktionsfähige IgG2a mAb HOPC1 plus FITC-konjugiert-Antimaus-IgG2a mAb). Der relative prozentuale Anteil des Färbens einer Chimäre mit mAb wurde unter Anwendung der Formel berechnet: 100% × (positive prozentuale netto-Chimären) – (positive prozentuale negative Kontrollen)/(positive prozentuale netto-Kontrollen) – (positive prozentuale negative netto-Kontrollen), worin der positive Prozentanteil sich auf den Prozentanteil bezieht, der nach der Subtraktion des Anfärbens mit HOPC1 erhalten wird, wobei positive und negative Kontrollen Zellen von entsprechenden normalen Ly-5.1+- und Ly-5.2+-Mäusen waren. Bei den Testzellen-Populationen, in denen das Anfärben mit einer anti-Ly-5 mAb geringer war als bei der negativen Kontrolle und der berechnete prozentuale Chimärismus daher kleiner als 0 war, wurden die Werte mit 0 angegeben. Unter Anwendung dieser Berechnungsmethode ließen sich weniger als 0,1% kontaminierende Ly-5.1+-Zellen in künstlichen Ly-5.2 (99,9%)/Ly-5.1 (0,1%)-Mischungen detektieren. Allerdings war kein sichtbarer positiver Peak in künstlichen Mischungen detektierbar, die 0,1 oder weniger Ly-5.1+-Zellen enthielten, war jedoch sichtbar mit 1% kontaminierenden Ly-5.1+-Zellen (Daten nicht gezeigt). Alle hämopoetischen Linien ließen sich stark mit anti-Ly-5 mAb anfärben. Unter Anwendung der Vorwärts- und 90°-Lichtstreuung (FSC bzw. SSC) dot-plots-Lymphozyten (FSC- und SSC-arme Population), Granulozyten (SSC-reiche Population) und Monozyten (FSC-reiche, jedoch SSC-arme Population) wurden Populationen gegattert und der Chimärismus separat für jede Population ermittelt. Alle SSC-reichen Zellen in dem Granulozyten-Gate, ließen sich mit FITC-konjugierter Antimaus-Granulozyten-mAb (Gr-1) anfärben. Tote Zellen wurden durch Gattern von Low-FSC/High-Propidiumiodid-zurückhaltenden Zellen ausschließen.
TRANSPLANTATAKZEPTANZ OHNE THYMUS-BESTRAHLUNG:
Es wurden an zwei Tiergruppen entweder eine Injektion von 20 × 10⁷ BMC oder 5 Injektionen auf täglicher Basis von 40 × 10⁶ BMC verabreicht. Die multilineare Analyse von Spenderrepopulation zeigte, dass alle Linien 10 bis 25% lang anhaltenden Chimärismus zeigten, der für mindestens 30 Wochen stabil blieb (1). Auf diese Weise konnten, wenn mehrfache hohe Dosen von Knochenmarkzellen in die Empfängermaus injiziert wurden, eine stabile Transplantatakzeptanz von hämopoetischen Stammzellen erhalten werden.
TRANSPLANTATAKZEPTANZ MIT THYMUS-BESTRAHLUNG:
Es wurden erheblich höhere Werte der Transplantatakzeptanz in der CD4-T-Zellen-Population beobachtet, wenn die Mäuse mit Thymus-Strahlung vorbehandelt wurden (Tabelle 1), die von näherungsweise 0 bis 10% bis zu 20 bis 60% erhöht wurde. Die Repopulation von Monozyten-Linien wurde von einem Wert von näherungsweise 20% bis zwischen 30 und 40% erhöht. Dieses steht in Übereinstimmung mit den zuvor gezeigten Ergebnissen, dass 3,5 Gy WBI ausreichend sind, um eine stabile Transplantatakzeptanz in der synogenen Reihe zu ermöglichen. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obgleich eine Transplantatakzeptanz in Abwesenheit entweder von WBI oder TI erreicht werden kann, eine relativ geringe Dosis der Thymus-Bestrahlung (3,5 Gy) einen höheren Wert der Syngen-Transplantatakzeptanz zu erhalten möglich macht.
TABELLE 1
BEISPIEL 2: AUSLÖSUNG HOHER WERTE VON ALLOGENER HÄMOPOETISCHER REKONSTITUTION UND DONATOR-SPEZIFISCHER TOLERANZ OHNE MYELOSUPPRESSIVE KONDITIONIERUNG
Pluripotente hämopoetische Stammzellen (PHSC)-Implantatakzeptanz in nicht konditionierten Empfängern lieferten hohe Dosismengen von syngenem oder Ly5-kongenem Knochenmark. Eine allogene PHSC-Transplantatakzeptanz wurde durch Verabreichen einer hohen Dosis (200 × 10⁶) von vollständig MHC-fehlangepassten B10.A (H-2^B) BMC bis B6 (H-2^b)-Empfängern erzielt. Die Empfänger wurden lediglich durch Abreichern von Anti-CD4 und Anti-CD8 mAbs an den Tagen –5, –1 und 7 konditioniert. Der anfängliche Chimärismus wurde unter peripheren Blut-Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten mit Peak-Werten von 15 bis 33% Donatorzellen bei 4 bis 6 Wochen post-BMT erreicht. Allerdings war der anfängliche T-Zellen-Chimärismus gering (< 10%), und der multilineare Chimärismus neigte zur Abnahme im Verlaufe der Zeit. Tabelle 2 zeigt die geringen Werte von Chimärismus in Milz, Knochenmark und Thymus von Tieren, die 12 bis 25 Wochen nach BTM getötet wurden.
Um Transplantatakzeptanz zu optimieren, wurde Thymusraum durch Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung (TI) erzeugt. B6-Mäuse erhielten wie vorstehend Anti-T-Zellen-mAbs, 7 Gy TI am Tag 0 und insgesamt 174 × 10⁶ vollständig MCH-fehlangepasste B 10.A BMC an den Tagen 0 bis 4. In 7 von 10 Tieren stellten die Donatorzellen einen hohen Anteil der WBC-Monozyten, Granulozyten, B-Zellen und CD4- und CD8-Zellen zu allen Zeitpunkten (2). In 7 Tieren war die Menge der anfänglichen Donator-CD4-T-Zellen ähnlich derjenigen anderer Linien, wobei der Chimärismus in allen Linien während der gesamten 6-monatigen Nachfolgezeit stabil war (2). Allerdings nahm in 3 Tieren trotz anfänglicher hoher Werte des Chimärismus die Donator-Repräsentation in einigen oder in allen Linien im Verlaufe der Zeit ab (Daten nicht gezeigt).
Die Empfänger des TI-enthaltenden allogenen BMT-Regimes mit hoher Dosis wurden 24 bis 29 Wochen nach BMT getötet und der Chimärismus in anderen Geweben bewertet. Die stabilsten WBC-Chimären zeigten einen wesentlichen Chimärismus unter BMC, Milz-B- und -T-Zellen und Klasse I^reich, reife Thymozyten (Tabelle 2). Diese Thymi enthielten auch Donator Klasse I^arm, unreife Thymozyten. Anders als bei den stabilen Chimären enthielten die Thymi von den 3 "unstabilen" Chimären (Tabelle 2) wenige Donator-derivierte Klasse I^reich-Zellen und zeigten variable Milz-T- und -B-Zellen und BMC-Chimärismus (Tabelle 2).
Der in den meisten Mäusen beobachtete stabile multilineare Chimärismus mit hohem Wert demonstriert, dass eine wesentliche allogene PHSC-Transplantatakzeptanz ohne WBI in Mäusen erzielt werden kann, die T-Zellen abreichernde mAbs, 7 Gy TI erhielten sowie hoch dosiertes allogenes Knochenmark. Die Spender-Repräsentation war ähnlich derjenigen, wie sie in ähnlich behandelten Empfängern von Ly5-kongenem Knochenmark beobachtet wurden, was darauf hinweist, dass die immunologische Alloresistenz vollständig überwunden war. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit unseren früheren Untersuchungen, die demonstrieren, dass die kleinste Barriere für die Empfänger-NK-Zellen in Bezug auf allogene pH-Assay-Implantatakzeptanz leicht durch Verabreichung von zusätzlichem BMC überwunden werden könnte, was nahelegt, dass die NK-Zellen-vermittelte Resistenz sättigungsfähig ist. Die Beobachtung, dass größere Zahlen von allogen als syngen gereinigten Stammzellen benötigt werden, um die letal bestrahlten Mäuse zu retten, kann ein Versagen wiederspiegeln, die 7-Zellenvermittelte Allo-Resistenz vollständig zu überwinden. Das Vorhandensein von "erleichternden"-Zellpopulationen im gesamten Knochenmark-Inokulum hat unsere Ergebnisse sicherlich nicht beeinträchtigt, da derartige Zell-Typen, wie allgemein bekannt gemacht worden ist, die CD4- oder CD8- und Donator-CD4- und -CD8-Zellen exprimieren, durch im Kreislauf zum Zeitpunkt der BMT vorhandene mAbs abgereichert werden.
Die Mäuse wurden auf Myelosuppression ausgewertet. Es wurden vollständige Blutzählungen an den Tagen –1, 1, 3, 6, 8, 10, 13 und 20 für Tiere ermittelt, die TI am Tag 0 mit oder ohne mAb-Behandlungen ohne BMT erhalten haben. In den Empfängern von TI±mAbs erreichten die WBC-Zählungen einen Tiefpunkt von 3.000/μl am Tag 1 und kehrten zum normalen Wert am B. Tag zurück. Der kleinste Wert, der in jeder einzelnen Maus erreicht wurde, betrug 2.600/μl. Weder die Thrombozyten-Zählungen noch die Hämoglobin-Konzentrationen nahmen zu irgendeinem Zeitpunkt in irgendeiner Gruppe wesentlich ab. Alle Tiere überlebten ohne klinische Toxizität. Daher bewirkte die Wirts-Konditionierung mit mAbs/TI keine klinisch signifikante Myelosuppression oder Toxizität, erlaubte jedoch eine PGHSC-Transplantatakzeptanz von allogenem Knochenmark mit hoher Dosierung.
Allogene BMT-Rezipienten hoher Dosierung zeigten keinen detektierbaren Gewichtsverlust oder andere klinische Anzeichen für akute oder chronische GVHD. Der Zeitablauf der T-Zellen-Wiederherstellung verlief ähnlich in Tieren, die eine mAbs/TΙ-Konditionierung mit oder ohne hoch dosierter allogener BMT erhielten, wobei die Thymus- und Milzzellen-Ausbeuten in beiden Gruppen ähnlich waren. Die Tatsache, dass die Empfänger von klinischen Stigmata oder lymphoider Atrophie in Zusammenhang mit GVHD frei waren, spiegelt wahrscheinlich die Abreicherung an reifen T-Zellen in Spendermark durch mAbs wieder, die in dem Serum zum Zeitpunkt der BMT noch vorhanden ist.
Zur Bewertung der Toleranz wurden gemischte Lymphozyten-Reaktionen (MLR) und Zell-vermittelte Lympholyse (CML)-Untersuchungen in BMT-Empfängern und gleichzeitig an ähnlich behandelten non-MBT-Kontrollen 24 bis 29 Wochen nach der Konditionierung ausgeführt. Alle 4 Tiere mit stabilem multilinearem Chimärismus zeigten eine spezifische CML-Toleranz gegenüber Spender und Wirt mit ähnlichen Reaktionen gegen eine dritte Partei wie die non-BMT-Kontrollmäuse (3). Die letztere Gruppe zeigte ähnliche Anti-B10.A-Reaktionen zu denen von unbehandelten B6-Mäusen (3). 4 von 6 stabilen Chimären zeigten Donator-spezifische MLR-Unempfindlichkeit während 2 Tiere in der Regel überempfindlich waren. Im Gegensatz dazu zeigten alle 4 non-BMT-Kontrollen ähnliche Anti-B10.A-Reaktionen zu denen von B6-Mäusen (P < 0,01 im Vergleich zu BMT-Mäusen). Insgesamt demonstrieren die Ergebnisse der Donator-spezifischen CML- und MLR-Toleranz in Mäusen, die hoch dosiertes allogenes BMT mit einem non-myelosuppressiven Konditionieren erhalten haben.
Von 2 "unstabilen Chimären" in Tabelle 2 zeigte eine eine Donator-spezifische CML-Unempfindlichkeit, während eine andere eine allgemeine Unempfindlichkeit im Bezug auf CML zeigte. 2 von 3 unstabilen Chimären zeigten Donator-spezifische MLR-Unempfimdlichkeit, während die dritte eine verallgemeinerte Unempfindlichkeit zeigte (Daten nicht gezeigt). Das robuste Verhalten, das bei den konditionierten non-BMT-Kontrollen beobachtet wurde, schließt das Konditionierungsregime selbst als Ursache dieser Überempfindlichkeit aus, wobei sein Vorhandensein in unstabilen Chimären und das Fehlen eines Nachweises für GVHD für eine GVH-vermittelte Immunschwäche eine unwahrscheinliche Erklärung ist. Die Kreuz-Reaktivität von Antigenen einer dritten Partei mit Donator-Antigenen, gegenüber denen die Tiere tolerant waren, ist die wahrscheinlichste Erklärung für die schwachen Reaktionen der dritten Partei bei einigen BMT-Empfängern.
Da einige sowohl unstabile als auch stabile Chimären eine Donator-spezifische Unempfindlichkeit in vitro zeigten, kann die Abnahme im Chimärismus in unstabilen Chimären ein empfindlicherer Indikator für eine unvollständige Toleranz sein als MLR oder CML. Alternativ kann ein abnehmender Chimärismus nicht immunologische Mechanismen widerspiegeln, wie beispielsweise eine schwach PHSC-Transplantatakzeptanz. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Toleranz mit Hilfe der strengsten Tests der Hauttransplantation bewertet. Alle stabilen Chimären akzeptierten dauerhaft Spender-Hauttransplantate, kamen jedoch zu einer raschen Abstoßung bei Transplantaten dritter Parteien, wodurch eine Donator-spezifische Toleranz demonstriert wird (4). Eine der unstabilen Chimären, in denen der abnehmende Chimärismus auf die T-Zellen-Linie beschränkt war ("unstabile Chimäre"#2, Tabelle 2), akzeptierte ebenfalls Donator-Haut. Die anderen der 2 unstabilen Chimären stießen chronisch Haut vom Donator-Typ an den Tagen 105 bzw. 48 ab. In stabilen Chimären blieb wiederholte Spender-Haut, die 31 Wochen post-BMT transplantiert worden war (und die ursprünglichen Transplantate) in einem perfekten Zustand bis zu dem Zeitpunkt der Tötung 3 bis 8 Wochen später. Damit zeigten diese Tiere unter den strengsten Kriterien der Hauttransplantation eine dauerhafte Donator-spezifische Toleranz.
Es wurde die Vβ-Nutzung analysiert, um den Mechanismus der Toleranz in Chimären zu untersuchen, die mit hoch dosiertem allogenen Knochenmark erzeugt wurden. Die Donator-Linie, B10.A, exprimiert I-E, was erforderlich ist, um Mtv-derivierte Superantigene zu präsentieren, die in dem B6/B10-Hintergrund-Genom kodiert sind. Die Entwicklung von Thymozyten, deren TCR Vβ11 oder Vβ5 enthält und die sich an diesen Superantigenen binden, wurde in B10.A-Mäusen abgeschwächt, nicht jedoch in B6 (H-2^b)-Mäusen, die kein I-E exprimieren (5). Es wurden Vβ11+ und Vβ5+-reife Wirtsthymozyten (gegatterte H-2K^bereich-Zellen) und periphere CD4+-Zellen ausgezählt. Langfristig stabile Chimären zeigten eine Abschwächung von Vβ5- und Vβ11-CD4+-Zellen unter PBL, Splenozyten und Milzzellen und reife B6-Thymozyten ähnlich den normalen B10.A-Spendern. Diese Vβ wurden in non-BMT-Kontrollen nicht abgeschwächt. Die prozentualen Anteile von Kontroll-Vβ8.1/2-Zellen waren in allen Gruppen normal (5; PBL-Daten nicht gezeigt). Die "unstabilen Chimären" in Tabelle 2 zeigten weniger vollständige Abschwächung von Vβ5+- und Vβ11+-Wirts-Typ-Thymozyten (1,4–4,2% Vβ5, 1,1–5,1% Vβ11) und CD4-Milzzellen und PBL (nicht gezeigt), als dies bei stabilen Chimären der Fall war. Damit stand die vollständige Deletion von Vβ, das Donator I-E-plus-Superantigene erkennt, in Korrelation mit dem Vorhandensein einer Donator-spezifischen Hauttransplantationstoleranz und einem permanent stabilen gemischten Chimärismus, was nahe legt, dass die Intrathymus-Deletion ein Toleranzmechanismus ist.
Da hämopoetische Zellen wirksam eine klonale Deletion im Thymus auslösen können, haben wir nach Donator-I-E in Empfängerthymi unter Anwendung immunhistochemischer Methoden gesucht. Donator-I-E-plus-Zellen waren eindeutig 24 bis 29 Wochen post-BMT in Thymi der meisten stabilen Chimären detektierbar (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu enthielten 2 von 3 unstabilen Chimären keine detektierbaren Donator-I-E-plus-Zellen in ihrem Thymi (Tabelle 2). Insgesamt demonstrieren diese Ergebnisse eine Korrelation zwischen der langfristigen Intrathymus-Präsenz von Donator-derivierten Klasse II+-Zellen und einer vollständigen Deletion von Vβ, die Superantigene erkennt, die durch Donator-MHC-Moleküle präsentiert werden. Wirts-Klasse II+-Zellen waren normalerweise in den Thymi aller Empfänger verteilt. Die Thymus-Bestrahlung war für die Optimierung eines stabilen Chimärismus (Tabelle 1) und eine dauerhafte Hauttransplantationstoleranz entscheidend. Obgleich 7 Gy TI nicht signifikant myelosuppressiv waren, erlaubten sie hohe Werte einer PHSC-Transplantatakzeptanz und eine dauerhafte, deletionale, Donator-spezifische Toleranz.
Peripherer Chimärismus kann durch die hohen Dosen von Knochenmark ohne die Notwendigkeit einer ganzen Bestrahlung erreicht werden. Um jedoch die zentrale deletionale Toleranz zu erreichen, ist es am Besten, in dem Thymus Raum zu schaffen, um die Entwicklung hoher Werte von intrathymischem Chimärismus zu ermöglichen. Dieses kann durch Bestrahlung erreicht werden oder durch die Verwendung mehrfacher Verabreichungen von Anti-T-Zell-Antikörpern oder mit Arzneimitteln, die den Thymus abreichern. Es kann ein Wert einer Thymus-Bestrahlung zwischen 3 und 7 Gy ausreichend sein.
MATERIALIEN UND METHODEN
TIERE:
Es wurden weibliche C57BL/6 (B6:H-2^b), B10.A (B10.A:H-2^a), K^k, I-A^k, I-E^k, D^d), BALB/c (H-2^d), SJL (H-2^a) und A.SW (H-2^a)-Mäuse von Frederick Cancer Research Center, Frederick, MD oder von The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME bezogen. Die Mäuse wurden in einer speziellen Pathogen-freien Mikroisolatorumgebung gehalten.
KONDITIONIERUNG UND BMT:
Altersangepasste (7 bis 14 Wochen alt) weibliche B6-Empfängermäuse erhielten 2 mg bzw. 1,4 mg Ratten-IgG2b-Antimaus-CD4-mAb GK1.5 (Dialynas et al., J. Immunol. 131: 2445–2451 (1983) bzw. Antimaus CD8 mAb 2.43 (Sarmiento J. Immunol. 125: 2665 (1980) intraperitoneal (i. p.) an den Tagen –5, –1 und 7 im Bezug auf BMT. Eine selektive Thymus-Bestrahlung von 7 Gy wurde am Tag 0 gegeben (Sharabi et al., J. Exp. Med. 169: 493–502 (1989). (35–40 × 10⁶) unbehandeltes BMC von B10.A-Mäusen wurde täglich jeweils an den Tagen 0 bis 4 insgesamt 5 Injektionen verabreicht (insgesamt 174–200 × 10⁶ BMC).
MAPS:
Nicht spezifisches FcgR-Binden war geblocktes Antimaus-FcgR mAb 2,4 G2 (Sherman et al., Immunogenetics 12: 183–189 (1981). FITC-konjugierte mAbs, einschließlich Anti-CD4 (Pharmingen, San Diego, CA), Anti-CD8 (Caltag, San Francisco, CA und Pharmingen), Anti-MAC1 (Caltage) und Ratten-Antimaus-IghM (ymed) mAbs sowie Anti-TCRaβ, -Vb5, -Vb11 und -Vb8.1/2 mAbs, wurde von Pharmingen erworben. Die negative Kontroll-mAb HOPC1-FITC ohne Reaktionsvermögen auf Mauszellen wurde in unserem Laboratorium hergestellt. Biotinyliertes Anti-H-2D^d mAb 34-2-12 (Ozato et al., Transplantation 34: 113–120 (1982)), Anti-H-2K^b mAb 5F1 (Sherman et al., Immunogenetics 12: 183–189 (1981)) und Kontroll mAb HOPC1 wurden mit Phycoerythrin-Streptavidin (PEA) entwickelt. Phycoerythrin-konjugiertes Anti-CD4 mAb (Pharmingen, San Diego, CA) und nicht spezifische Ratten-IgG2a (negative Kontrolle) wurden von Pharmingen erworben.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE (FCM)-ANALYSE VON MEHRLINEAREM CHIMÄRISMUS
Es wurde die allogene Rekonstitution verschiedener Linien in WBC, Milz-Mark und Thymus mit Hilfe der Zweifarb-FCM ausgewertet. Die Vorwärtswinkel- und 90°-Lichtstreuungseigenschaften wurden benutzt, um Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten in WBC entsprechend der Beschreibung zu unterscheiden. Die Zweifarb-FCM wurde eingesetzt, um Donator- und Wirtszellen spezieller Linien zu unterscheiden, und der prozentuale Anteil von Donatorzellen wurde berechnet, wie beschrieben wurde (Lee et al., Transplantation 61: 125–132 (1996); und Tomita et al., J. Immunol. 153: 1087–1098 (1994)), in den Kontrollfärbungen von Quadranten subtrahiert wurden, die Donator- und Wirtszellen eines speziellen Phäno-Typs enthielten, und Dividieren der prozentualen Netto-Donator-Zellen durch die Summe von prozentualen Netto-Donator-plus Wirtszellen dieses Phäno-Typs. Tote Zellen wurden durch Gating von schwachen FSC/reichen Propidiumiodid-zurückhattenden Zellen ausgeschlossen. Bei der Analyse von T-Zellen-Rezeptor (TCR) Vβ-Familien wurden 10⁴ gegatterte CD4+-T-Zellen (PBL und Milz) oder 10⁴ gegatterte H-2-Klasse I^reiche-Thymozyten entsprechend der Beschreibung analysiert (Tomita et al., J. Immunol. 153: 1087–1098 (1994)). Klasse I^reiche-Thymozyten enthielt hauptsächlich reife, einzelne, positive T-Zellen (Scollay et al., J. Immunol. 124: 2845 (1980).
GEMISCHTE LYMPHOZYTENREAKTIONEN (MLR):
Splenozyten wurden in 3-fachen Mulden mir einem Gehalt von 4 × 10⁵ Respondern mit 4 × 10⁵ Stimulatoren (30 Gy) in RPMI 1640-Medium aufgezogen, das ergänzt war mit 15% (Volumen/Volumen) kontrolliert verarbeitetem Serumaustausch (CPSR-2; Sigma), 4% Nährmischung (7,3 mg/ml L-Glutamin, 4 × nichtessentielle Aminosäuren (Gibco), 2,75 mg/ml Natriumpyruvat, 250 U/ml Penicillin und 250 mg/ml Streptomycin), 1% Hepes-Puffer und 10 mM 2-Mercaptoethanol bei 37°C in 5% CO₂ für 3 bis 4 Tage, bevor sie mit 3H-markiertem Thymidin gepulst wurden und 18 Stunden später geerntet wurden. Der Stimulationsindex (S. I.) wurde errechnet, indem die Reaktionen von Antidonator und Anti-dritte Partei mit den Anti-Wirtsreaktionen verglichen wurden, die ähnlich den Hintergrund-Zählungen waren (d. h. cpm ohne Stimulatorzellen-Population).
ZELLVERMITTELTE LYMPHOLYSE (CML)-REAKTIONEN:
CML-Reaktionen wurden entsprechend der Beschreibung ausgeführt (Sykes et al., J. Immunol. 140: 2903–2911 (1988)) mit der Ausnahme, dass 8 × 10⁵ Responder mit 8 × 10⁵ Stimulatoren (30 Gy Bestrahlung) in jeder Mulde in Kultur genommen wurden und 8000⁵¹Cr-markierte, 48 Stunden, Konkanavalin A-Lymphoblasten am Tag 5 zugesetzt wurden.
HAUTTRANSPLANTATION:
Es wurden Schwanzhaut-Transplantate voller Dicke vom Donator-Typ und einer dritten Partei (SJL) implantiert, wie beschrieben wurde (Sharabi et al., J. Exp. Med. 169: 493–502 (1989)). Die Transplantate wurden als angenommen definiert, wenn sie sich im Bezug auf Schwanzhaare und Schuppen in perfektem Zustand befanden, und wurden als abgestoßen zum Zeitpunkt des vollständigen Absterbens betrachtet oder wenn sie einen trockenen Schorf bildeten.
IMMUNHISTOCHEMIE:
Es wurden 4 Mikrosektionen von gefrorenem Thymus-Gewebe präpariert und mit mAbs ISCR3 gefärbt (Watanabe et al., Transplantation 36: 712–718 (1983)) (Maus-IgG2b-Ana-I-E), mir 25-9-17 (Maus-IgG_2a-Anti-I-A^b) (Ozato et al., J. Immunol. 126: 317–321 (1981)), HOPC-1 (Maus-IgG_2a-Isotop-Kontrolle) oder 74-11-10 (Maus-IgG_2b-Isotop-Kontrolle), entwickelt mit biotinylierten Ratten-Antimaus IgG_2a oder – Anti-IgG_2b (Pharmingen), Streptavidin-Meerrettichperoxidase und Substrat, wie beschrieben wurde (Tomita et al., J. Immunol. 153: 1087–1098 (1994)). Die gefärbten Sektionen wurden von einem Betrachter analysiert, der nicht wusste, von welchem Tier das Gewebe erhalten worden war.
STATISTISCHE ANALYSE:
Die statistische Signifikanz wurde unter Anwendung des Student-Tests für Vergleichszwecke ermittelt. Ein p-Wert kleiner als 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
II. HERKUNFT VON ZELLEN FÜR DIE ALLOGENE STAMMZELLEN-TRANSPLANTATION:
Ein lebender Humanspender kann etwa 7,5 × 10⁸ Knochenmarkzellen/kg liefern. Medikamente der Erfindung dienen für Verfahren, in die die Verabreichung von mindestens dem 2- oder 3-fachen dieser Zahl (pro kg) und vorzugsweise mindestens das 10-, 15- oder 20-fache dieser Zahl einbezogen werden kann. Die restlichen Knochenmarkzellen können durch die ex vivo-Expansion oder Amplifikation von Human-Stammzellen beschafft werden. Die ex vivo-Expansion wurde von Emerson, 1996, Blood 87: 3082 untersucht. Methoden für die ex vivo-Expansion wurden detaillierter in Petzer et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1470; Zundstra et al., 1994, Bio Technology 12: 909 und WO 95 11692 Davis et al. beschrieben. Quellen für hämopoetische Stammzellen schließen Knochenmarkzellen ein, mobilisierte periphere Blutzellen und, sofern verfügbar, Nabelschnur-Blutzellen.
HERKUNFT VON ZELLEN FÜR XENOGENE STAMMZELLEN-TRANSPLANTATION:
Im Fall von Inzucht-Donator-Tieren, z. B. Inzucht-Zwergschwein, stehen sehr große Mengen von Stammzellen zur Verfügung, da die Zahl, die bereitgestellt werden kann, nicht durch die Zahl beschränkt ist, die von einem einzigen Spender geerntet werden kann.
In dem Fall, wo es sich bei dem Empfänger um einen Primaten handelt, z. B. einen Menschen, und der Spender ein Schwein ist, z. B. ein Zwergschwein, können 7,5 x 10⁹ oder mehr und bevorzugt zwischen 7,5 × 10⁹ und 15 × 10¹⁰ Schweine-Knochenmarkzellen/kg verabreicht werden, obgleich dieses von Faktoren abhangen wird, wie beispielsweise die Intensität des präparativen Regimes und die Gesundheit des einzelnen Empfängers. Wie hierin diskutiert wird, lassen sich diese Zellen mit mehr als einer Verabreichung bereitstellen.
BESTIMMUNG DER ZAHL DER SCHWEIN-KNOCHENMARKZELLEN, DIE ZUR HERBEIFÜHRUNG DER TOLERANZ BENÖTIGT WIRD
Das folgende System kann zur Bestimmung oder Verfeinerung der Zahl von Schweinezellen angewendet werden, die zum Transplantieren und Herbeiführen von Toleranz in einem Schwein/Primat-Modell benötigt wird. Es werden an Cynomolgus-Affen unterschiedliche Dosierungen von Donator-Zellen verabreicht und die Zahl der Zellen, die für die Herbeiführung von Chimärismus und der Erzeugung von Toleranz erforderlich ist, mit Hilfe der beschriebenen Assays bestimmt. Der Zeitpunkt "Null" ist als derjenige Moment festgelegt, zu dem die arteriellen und venösen Kanülen des Empfängers mit der zu perfundierenden Leber verbunden werden.
Der Thymusraum wird durch Verabreichung von 7 Gy (700 rad) Thymus-Bestrahlung zwischen den Tagen –1 und –8 erzeugt. WBI wird nicht verabreicht.
Am Tag –1 wird in den Empfänger ein kommerzielles Präparat (Upjohn) von Meerrettich-Antihuman-Antithymozytenglobulin (ATG) injiziert. Der Empfänger ist anästhesiert, es wird ein IV-Katheter in den Empfänger eingeführt und 6 ml heparinisiertes Vollblut vor der Infusion entnommen. Das ATG-Präparat wird sodann intravenös injiziert (50 mg/kg). Es werden 6 ml Proben von heparinisiertem Vollblut für Testzwecke zu den Zeitpunkten 30 min, 24 Stunden und 48 Stunden entnommen. Die Blutproben werden auf die Wirkung der Antikörperbehandlung an der natürlichen Killerzellen-Aktivität (Testen an K562-Targets) und durch FACS-Analyse für Lymphozyten-Subpopulationen analysiert, einschließlich CD4, CD8, CD3, CDIIb und CD16. Sofern reife T-Zellen und NK-Zellen nicht eliminiert wurden, kann zu späteren Zeiten in der Prozedur ATG erneut verabreicht werden.
Zur Entfernung natürlicher Antikörper aus dem Kreislauf des Empfängers vor der Transplantation wird am Tag Null eine operative Absorption natürlicher Antikörper (nAB) ausgeführt, indem Zwergschweinleber wie folgt verwendet wird. Bei –90 min wird der Schwein-Spender anästhesiert und die Leber zur Entfernung mit Hilfe von operativen Standardprozeduren vorbereitet. Bei –60 min wird der Empfänger-Affe anästhesiert. Es wird ein peripherer IV-Katheter eingeführt und eine 6 ml Probe Vollblut entnommen. Durch den Mittellinieneinschnitt werden die Abdominalaorta und die Hohlvene isoliert. In die Blutgefäße werden Selastik-Kanülen eingeführt, die Seitenöffnungen für die Blutentnahme enthalten.
Bei –30 min wird die Leber in situ perfundiert, bis sie hell wird, und dann aus dem Schwein-Spender entnommen und in kaltes Ringers-Lactat gegeben. Die Leber wird bis unmittelbar vor der Reperfusion in dem Affen kalt gehalten. Es wird eine Leber-Biopsie entnommen. Bei –10 min wird die Leber mit warmer Albumin-Lösung perfundiert, bis die Leber warm ist (37°C).
Zum Zeitpunkt Null werden die Arterien- und Venenkanülen des Empfängers mit der Pfortader und Hohlvene der Spender-Leber verbunden und mit der Perfusion begonnen. Die Leber-Biopsien werden bei 30 min bzw. 60 min genommen. Ebenfalls werden Proben des Empfänger-Bluts für Serum bei 30 min bzw. 60 min entnommen. Bei 60 min wird die Leber von den Kanülen getrennt und die großen Blutgefäße des Empfängers wiederhergestellt. Die Leber hat ihre Funktion zur Aufnahme schädlicher natürlicher Antikörper aus dem Empfänger-Affen ausgeführt und wird verworfen. Zusätzliche Blutproben für Serum werden von dem Empfänger bei 2, 24 und 48 Stunden entnommen. Die Organperfusion kann durch eine Perfusion einer α1-3-Galactose-Bindung-Epitop-Affinitätsmatrix ersetzt werden, z. B. in Form einer Affinitätssäule, z. B. nur Matrix-gebundenem linearen B-Typ-VI-Kohlenhydrat.
Die Knochenmarkzellen des Schwein-Spenden werden durch intravenöse Injektion verabreicht. Das Knochenmark wird geerntet und intravenös wie früher beschrieben injiziert (Pennington et al., 1988, Transplantation 45: 21–26). Im typischen Fall werden in Regimen 7,5 × 10⁸/kg Knochenmark-Zellen verabreicht, die WBI enthalten. Die ersten Versuche zur Ermittlung einer geeigneten Zahl von Zellen, die in einem Regime zu verabreichen sind, denen WBI fehlt, sollten mit einem Dosierungsbereich eines mehrfachen bis zum 20-fachen dieser Zahl beginnen. Mehrfache Verabreichungen sind an der höheren Seite des Dosierungsbereichs wünschenswert. Schwein-Cytokine können verabreicht werden, um eine Transplantatakzeptanz zu verbessern.
Um den Chimärismus zu verfolgen, können Zweifarb-Durchflusszytometrie zur Anwendung kommen. Dieser Assay verwendet monoklonale Antikörper, um zwischen überwiegenden Donator-Klasse I-Histokompatibilitäts-Antigenen und Leukozyten-üblichen Antigenen gegenüber überwiegenden Klasse I-Histokompatibilitäts-Antigenen des Empfängers zu unterscheiden. Alternativ kann ein Chimärismus mit Hilfe der PCR verfolgt werden. Sollte ein Wiederauftreten natürlicher Antikörper vor der Erzeugung von Toleranz festgestellt werden und sollten diese Antikörper Schäden an dem Spendergewebe hervorrufen, so lässt sich das Protokoll modifizieren, um eine ausreichende Zeit zum Verfolgen des BMT bei humoraler Toleranz zu ermöglichen, die vor der Organtransplantation hergestellt wird. Die Toleranz gegenüber dem Donator-Antigen kann mit Hilfe von Standardmethoden verfolgt werden, z. B. mit Hilfe von MLR-Assays.
III. DIE ERZEUGUNG VON TOLERANZ MIT KNOCHENMARK-TRANSPLANTATION
Die folgende Prozedur wurde konzipiert, um die Zeitdauer zu erhöhen, in der ein transplantiertes Organ (ein Xenotransplantat) in einem xenogenen Wirt vor der Abstoßung überlebt. Bei dem Organ kann es sich um jedes beliebige Organ handeln, z. B. eine Leber, eine Niere, ein Pankreas oder ein Herz. Die Hauptstrategien der Methode schließen eine oder mehrere der folgenden ein: Die Eliminierung natürlicher Antikörper, z. B. durch Inkontaktbringen des Empfänger-Bluts mir Epitopen, das mit dem Donatorreaktionsfähigen natürlichen Antikörper reagiert; Inaktivierung von Wirts-T-Zellen; Inaktivierung von Wirts-NK-Zellen; Transplantation von Toleranz-erzeugenden Stammzellen, z. B. Knochenmark-Stammzellen, gegebenenfalls die Implantation von Donator-Stromgewebe oder die Verabreichung von Donator-Cytokinen; sowie die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung. Die Kombination einer ausreichend großen Zahl von verabreichten Donator-Stammzellen in Verbindung mit Thymus-Bestrahlung eliminiert den Bedarf für WBI. Die Methode schließt alle oder jeden beliebigen dieser Schritte ein. Bevorzugt wird sie in der folgenden Reihenfolge ausgeführt.
Erstens, wird in den Empfänger intravenös ein Präparat aus Pferde-Antihuman-Thymozytenglobulin (ATG) injiziert. Das Antikörper-Präparat eliminiert reife T-Zellen und natürliche Killerzellen. Sofern diese nicht eliminiert werden, würden reife T-Zellen die Abstoßung sowohl des Knochenmarktransplantats als auch nach der Sensibilisierung das Xenotransplantat selbst fördern. Das ATG-Präparat eliminiert außerdem natürliche Killerzellen (NK). NK-Zellen haben wahrscheinlich keinen Einfluss auf das transplantierte Organ, wurden jedoch sofort dahingehend wirken, das neu eingeführte Knochenmark abzuweisen. Antihuman-ATG, das von einem beliebigen Säugerwirt erhalten wird, kann zur Anwendung gelangen, z. B. ATG, das in Schweinen erzeugt wird, obgleich bisher Präparate von Schwein-ATG einen niedrigeren Titer hatten als Pferde-deriviertes ATG. ATG ist monoklonalen Anti-NK-Antikörpern überlegen, da letztere in der Regel nicht alle Wirts-NK-Zellen auflösen, während die polyklonale Mischung in ATG in der Lage ist, sämtliche Wirts-NK-Zellen aufzulösen. Allerdings können monoklonale Anti-NK-Antikörper verwendet werden.
Das Vorhandensein von Donator-Antigen in dem Wirts-Thymus während der Zeitdauer, wenn Wirts-T-Zellen sich nach der Transplantation regenerieren, ist für das Tolerieren von Wirts-T-Zellen entscheidend. Wenn hämopoetische Donator-Stammzellen nicht in der Lage sind, sich in dem Wirts-Thymus zu etablieren und eine Toleranz zu erzeugen, bevor Wirts-T-Zellen regeneriert werden, können wiederholte Dosierungen von Anti-Empfänger-7-Zellen-Antikörpern während des nichtmyeloablativen Regimes erforderlich sein. Es kann eine anhaltende Verabreichung von Wirts-T-Zellen über mehrere Wochen erforderlich sein.
Ebenfalls kann es notwendig sein oder wünschenswert, an dem Empfänger eine Splenektomie vorzunehmen, um eine Anämie zu vermeiden.
Zweitens, werden aus dem Blur des Empfängen durch Hämoperfusion natürliche Antikörper absorbiert. Vorgeformte natürliche Antikörper (nAB) sind die vorrangigen Mittel der Transplantat- Abstoßung. Natürliche Antikörper binden an xenogenen Endothelzellen. Diese Antikörper sind von jeder bekannten früheren Exponierung an Antigenen des xenogenen Donators unabhängig. Der Mechanismus, nach dem sich neu entwickelnde B-Zellen toleriert werden, ist unbekannt. Eine α1-3-Galactose-Bindung-Epitop-Affinitätsmatrix, z. B. in Form einer Affinitätssäule, z. B. Matrix-gebundenes lineares B-Typ-VI-Kohlenhydrat, ist für die Entfernung von Anti-Schwein-Antikörpern aus dem Blut des Empfängers nützlich.
Der dritte Schritt in der nonmyeloablativen Prozedur besteht darin, Donator-spezifische Wachstumsfaktoren oder Cytokine zuzuführen, um die Transplantationsakzeptanz von Donator-Stammzellen zu verbessern.
Da die Leber der Hauptort von Hämopoese in dem Foetus ist, kann die fetale Leber auch als eine Alternative zu Knochenmark als eine Quelle von hämopoetischen Stammzellen dienen. Der Thymus ist der Hauptort der T-Zell-Reifung. Jedes Organ enthält eine organspezifische Stromamatrix, die eine Differenzierung der entsprechenden nicht differenzierten Stammzellen, die in den Wirt implantiert werden, trägt. Obgleich ein Erwachsener Thymus verwendet werden kann, wird fetales Gewebe, das ausreichend früh in der Gestation erhalten wird, bevorzugt, da es frei von reifen T-Lymphozyten ist, die GVHD hervorrufen können. Bei der Transplantation haben fetale Gewebe außerdem eine Neigung, eher zu überleben als reife Gewebe. Als eine hinzukommende Vorsichtsmaßnahme gegen GVHD, kann Thymus-Stroma-Gewebe vor der Transplantation bestrahlt werden, z. B. mit 10 Gy (1.000 rad). Als eine Alternative oder als zusätzliche Maßnahme zur Implantation können fetale Leberzellen in flüssiger Suspension verabreicht werden.
Viertens werden Knochenmarkzellen (BMC) oder eine andere Quelle für hämopoetische Stammzellen, z. B. eine Suspension von fetaler Leber, des Spenders dem Empfänger injiziert. Donator-BMC weilt an geeigneten Stellen des Empfängers und wächst in Nachbarschaft mit verbleibenden Wirtszellen und vermehrt sich und bildet eine chimäre lymphohämatopoetische Population. In diesem Prozess werden neu gebildete B-Zellen (und die Antikörper, die sie erzeugen) an Donator-Antigenen exponiert, so dass sich das Transplantat als "eigenes" erkennt. Die Toleranz zum Spender wird in Tieren auch bei der T-Zellen-Menge beobachtet, in denen hämopoetische Stammzellen, z. B. BMC, mit Transplantationsakzeptanz erzielt worden sind. Wenn ein Organtransplantat in einen Empfänger mehrere Monate nach der Erzeugung eines Knochenmark-Chimärismus eingesetzt wird, werden natürliche Antikörper gegen den Spender verschwunden sein und das Transplantat sollte sowohl von den humoralen als auch den zellulären Armen des Immunsystems akzeptiert sein. Diese Vorgehensweise hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie es möglich macht, die Organtransplantation ausreichend lange nach der Transplantation von hämopoetischen Zellen, z. B. BMT, z. B. eine Suspension von fetaler Leber, ausgeführt werden kann, so dass ein normaler Gesundheitszustand und Immunkompetenz zum Zeitpunkt der Organtransplantation hergestellt worden sind. Die Verwendung von xenogenen Donatoren bietet die Möglichkeit der Verwendung von Knochenmarkzellen und Organen von dem gleichen Tier oder von genetisch angepassten Tieren.
Viele der auf dem Gebiet diskutierten Verfahren verwenden eine Ganzkörperbestrahlung, um einen hämopoetischen Raum zu schaffen und dadurch die Transplantatakzeptanz zu verbessern. Die Notwendigkeit einer Bestrahlung kann durch Verabreichen einer ausreichenden Zahl von Donator-Knochenmarkzellen eliminiert werden. Dieses sollte mit einer Behandlung kombiniert werden, z. B. einer Thymus-Bestrahlung, die einen Thymusraum erzeugt.
Schließlich lassen sich T-Zellen und speziell Thymus- oder Lymphknoten-T-Zellen weiter unterdrücken, indem an den Empfänger eine kurzzeitige Behandlung mit einem immunsuppressiven Mittel verabreicht wird, z. B. mit Cyclosporin.
Obgleich jede beliebige dieser Prozeduren das Überleben eines implantierten Organs unterstützen kann, werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn alle Schritte in Kombination zur Anwendung gelangen. Medikamente der vorliegenden Erfindung dienen zur Verwendung in den Verfahren, die zur Anwendung gelangen können, um den allogenen Transplantaten Toleranz zu vermitteln, wo beispielsweise sowohl der Transplantat-Spender als auch der Empfänger Menschen sind, aber auch xenogenen Transplantaten, wo beispielsweise der Transplantat-Spender ein nonhumanes Tier ist, z. B. ein Schwein, z. B. ein Zwergschwein, und der Transplantat-Empfänger ein Primat ist, z. B. ein Mensch.
Im Fall von xenogenen Transplantaten sollten der Spender des Implantats und die Person, die entweder die Toleranz-erzeugenden hämopoetischen Zellen liefert oder die zu perfundierende Leber, das gleiche Individuum sein oder sollten möglichst nahe verwandt sein. Beispielsweise nimmt man bevorzugt Implantat-Gewebe von einer Kolonnie von Spendern, die stark inzüchtig ist.
DETAILLIERTES PROTOKOLL
In dem folgenden Protokoll zur Vorbereitung eines Cynomolgus-Affen für die Aufnahme einer Niere von einem Zwergschwein als Spender ist der Zeitpunkt 0 als derjenige Moment definiert, wo die arteriellen und venösen Kanülen des Empfängers mit der zu perfundierenden Leber verbunden werden.
Am Tag –1 wird ein kommerzielles Präparat (Upjohn) von Pferde-Antihuman-Anti-Thymozytenglobulin (ATG) in den Empfänger injiziert. Das ATG eliminiert reife T-Zellen und natürliche Killerzellen, die ansonsten eine Abweisung der Knochenmarkzellen hervorrufen würden, die zur Erzeugung von Toleranz verwendet werden. Der Empfänger wird anästhesiert und ein IV-Katheter in den Empfänger eingeführt und 6 ml heparinisiertes Vollblut vor der Infusion entnommen. Das ATG-Präparat wird sodann intravenös injiziert (50 mg/kg). Es werden 6 ml-Proben von heparinisiertem Vollblut für Testzwecke zu den Zeitpunkten 30 min, 24 Stunden und 48 Stunden entnommen. Die Blutproben werden auf die Wirkung von Antikörper-Behandlung auf natürliche Killerzellen-Aktivität (Prüfung an K562-Targets) und mit Hilfe der FACS-Analyse auf Lymphozyten-Subpopulationen analysiert, einschließlich CD4, CD8, CD3, CDIIb und CD16. Erste Daten von beiden Assays zeigen, dass beide Gruppe von Zellen durch die Verabreichung von ATG eliminiert wurden. Sofern reife T-Zellen und NK-Zellen nicht eliminiert wurden, kann das ATG zu späteren Zeitpunkten in der Prozedur erneut verabreicht werden, und zwar sowohl vor als auch nach der Organtransplantation.
Eine in vielen Methoden auf dem Gebiet verabreichte subletale Bestrahlung wird unterlassen, indem die Zahl von verabreichten Stammzellen erhöht wird und indem 7 Gy (700 rad) Thymus-Strahlung verabreicht wurden. Die Thymus-Bestrahlung wird am Tag 0 gegeben.
Die Hauptwsache für die Organ-Abstoßung sind natürliche Antikörper. Um natürliche Antikörper aus dem Kreislauf des Empfängers vor der Transplantation zu entfernen, wird am Tag 0 eine operative Absorption von natürlichen Antikörpern (nAB) ausgeführt, indem eine Leber von Zwergschweinen wie folgt verwendet wird. Zum Zeitpunkt –90 min wird der Schwein-Spender anästhesiert. Die Leber wird zur Entfernung nach operativen Standardprozeduren vorbereitet. Zum Zeitpunkt –60 min wird der Empfänger- Affe anästhesiert. Es wird ein peripherer IV-Katheter eingeführt und eine 6 ml-Probe Vollblut entnommen. Durch den Mittellinien-Einschnitt werden die abdominale Aorta und die Hohlvene isoliert. In die Blutgefäße werden Silastik-Kanülen eingeführt, die Seitenöffnungen zur Blutprobe-Entnahme enthalten.
Bei –30 min wurde die Leber in situ perfundiert, bis sie hell wurde, und wurde anschließend von dem Schwein-Spender entnommen und kaltes Ringers-Lactat gegeben. Die Leber wurde bis unmittelbar vor der erneuten Perfusion in dem Affen kalt gehalten. Es wurde eine Leberbiopsie genommen. Bei –10 min wurde die Leber mit warmer Albumin-Lösung so lange perfundiert, bis die Leber warm wurde (37°C).
Zum Zeitpunkt 0 wurden die arteriellen und venösen Kanülen des Empfängers mit der Pförtnervene und der Hohlvene der Spender-Leber verbunden und die Perfusion begonnen. Bei 30 min bzw. 60 min wurden Leberbiopsien entnommen. Ebenfalls wurden Blutproben des Empfängers für Serum bei 30 min bzw. 60 min entnommen. Bei 60 min wurde die Leber von den Kanülen abgetrennt und die großen Blutgefäße des Empfängers wiederhergestellt. Die Leber, die ihre Funktion zum Absorbieren schädlicher natürlicher Antikörper von dem Empfänger-Affen ausgeführt hatte, wurde verworfen. Es wurden zusätzliche Blutproben für Serum von dem Empfänger bei 2, 24 und 48 Stunden entnommen. Sofern diese Prozedur an 2 aufeinander folgenden Perfusionen von Schweine-Lebern ausgeführt wurde, zeigte die zweite Leber keine Anzeichen für mäßige ischämische Änderungen während der Perfusion.
Zur Förderung des Langzeit-Überlebens des implantierten Organs durch eine T-Zellen- und B-Zellen-vermitelte Toleranz wurde dem Empfänger zur Erzeugung von chimärem Knochenmark Spender-Knochenmarkzellen verabreicht. Das Vorhandensein von Donator-Antigenen in dem Knochenmark ermöglicht eine neuerliche Entwicklung von B-Zellen und erneut sensibilisierte T-Zellen, um Antigene des Spenders als eigene zu erkennen und dadurch Toleranz für das vom Spender implantierte Organ vollzogen. Zur Stabilisierung der Donator-BMC wurde Donator-Stroma-Gewebe in Form von Gewebescheiben einer fetalen Leber, Thymus und/oder fetale Milz unter der Nierenkapsel des Empfängers transplantiert. Stroma-Gewebe wird bevorzugt gleichzeitig mit oder vor der Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen, z. B. BMC, oder eine Suspension von fetalen Leberzellen implantiert. Es werden ausreichend Stammzellen verabreicht, um die Notwendigkeit einer präparativen oder hämopoetischen raumerzeugenden Strahlung zu eliminieren.
Um den Chimärismus zu verfolgen, kann eine Zweifarb-Durchflusszytometrie zur Anwendung gelangen. Dieser Assay nutzt monoklonale Antikörper, um zwischen vorhenschenden Donator Klasse I-Histokompatibilität-Antigenen und Leukozyten übliche gemeinsame Antigenen gegenüber vorhenschenden Empfänger Klasse I-Histokompatibilitäts-Antigenen zu unterscheiden. BMC kann wiederum entweder gleichzeitig mit oder vor der Organtransplantation injiziert werden. Knochenmark wird geerntet und intravenös wie früher beschrieben injiziert (Pennington et al., 1988, Transplantation 45: 21–26). Sollte festgestellt werden, dass natürliche Antikörper vor der Erzeugung von Toleranz wieder auftreten und sollten diese Antikörper eine Beschädigung am Transplantat hervorrufen, so kann das Protokoll modifiziert werden, um vor der Organtransplantation nach der BMT für die Herstellung der humoralen Toleranz ausreichend Zeit zu lassen.
Die vorstehend beschriebenen Vorgehensweisen sind so konzipiert, dass sie das Problem der Transplantat-Abstoßung synergistisch vermeiden.
Die Medikamente der Erfindung dienen zur Verwendung in Verfahren, die entsprechend der Beschreibung in Kombination oder zum Teil eingesetzt werden können.
Das Verfahren zum Einführen von Knochenmarkzellen kann speziell dann verändert werden, wenn (1) der Zeitabstand zwischen dem Injizieren hämopoetischer Stammzellen und dem Implantieren des Implantats erhöht wird; (2) die Menge der injizierten hämopoetischen Stammzellen erhöht wird; (3) die Zahl der Injektionen von hämopoetischen Stammzellen variiert wird; (4) die Methode der Zuführung von hämopoetischen Stammzellen variiert wird; (5) die Gewebe-Herkunft von hämopoetischen Stammzellen variiert wird, so kann beispielsweise eine Suspension von fetalen Leberzellen verwendet werden; oder (6) wenn die Herkunft des Spenders für hämopoetische Stammzellen variiert wird. Obgleich hämopoetische Stammzellen, die von dem Transplantat-Spender kommen, bevorzugt werden, können hämopoetische Stammzellen von anderen Individuen oder Spezies erhalten werden oder von genetisch bearbeiteten Inzucht-Spenderstämmen oder von einer in vitro-Zellkultur.
Methoden zur Vorbereitung des Empfängers für die Transplantation von hämopoetischen Stammzellen lassen sich variieren. Beispielsweise kann der Empfänger einer Splenektomie unterzogen werden. Letztere würde vorzugsweise vor dem nonmyeloablativen Regime erfolgen, z. B. am Tag –14.
Die Hämoperfusion natürlicher Antikörper kann: (1) Gebrauch von anderen Gefäßorganen machen, z. B. Leber, Niere, Eingeweide; (2) Gebrauch von mehrfachen sequentiellen Organen oder Affinitätsmatrizen machen; (3) die Zeitdauer variieren, in der das jeweilige Organ oder die Affinitätsmatrizen perfundiert werden; (4) den Spender des perfundierten Organs variieren. Vor der hämopoetischen Zelltransplantation eingeführte Antikörper lassen sich variieren durch: (1) Verwendung von monoklonalen Antikörpern auf T-Zellen-Subsets oder NK-Zellen (z. B. Anti-NKH1_A, wie in der US-P-4.772.552 von Hercend et al. beschrieben wurde); (2) Herstellen von Anti-Human-ATG in anderen Mammalia-Wirten (z. B. Affe, Schwein, Kaninchen, Hund); oder (3) Verwenden von Anti-Affe-ATG, hergestellt in einem beliebigen der vorgenannten Wirten.
Die Medikamente der Erfindung dienen zur Verwendung in den Verfahren, die bei anderen Säuger-Empfängern eingesetzt werden können (z. B. Rhesusaffen) und andere Mammalia-Spender verwenden können (z. B. Primaten, Schaf oder Hunde).
Als eine Alternative oder zusätzlich zur Hämoperfusion könne Wirts-Antikörper durch Verabreichung eines Überschusses von hämopoetischen Zellen abgereichert werden.
Stroma-Gewebe, das vor der Transplantation von hämopoetischen Zellen eingeführt wird, z. B. BMT, kann variiert werden durch: (1) Verabreichen der fetalen Leber und von Thymus-Gewebe als eine flüssige Zellsuspension; (2) Verabreichen von fetaler Leber- oder Thymus-Stroma-Gewebe, jedoch nicht beides zusammen; (3) ein Stroma-Implantat in andere gekapselte und gut mit Blutgefäßen versorgte Stellen einbringen, oder (4) Verwenden von reifem Thymus oder fetaler Milz als Quelle für Stroma-Gewebe.
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Medikamente die hierin beschrieben wurden, um an einem allogenen Antigen oder einem allogenen Transplantat Toleranz zu erzeugen oder die Akzeptanz zu verbessern, können dort verwendet werden, wo es zwischen Spender und Empfänger ein gewisses Maß an Fehlpaarung an MHC-Loci oder anderen Loci gibt oder mindestens einem andere Locus, der die Erkennung und Abstoßung vermittelt, z. B. ein kleinerer Antigen-Locus. Im Bezug auf Klasse I- und Klasse II-MHC-Loci können Spender und Empfänger sein: angepasst an Klasse I und fehlangepasst an Klasse II; fehlangepasst an Klasse I und angepasst an Klasse II; fehlangepasst an Klasse I und fehlangepasst an Klasse II; angepasst an Klasse I, angepasst an Klasse II. Bei jeder beliebigen dieser Kombinationen können andere Loci, die die Erkennung und Abstoßung kontrollieren, z. B. kleinere Antigen-Loci, angepasst oder fehlangepasst sein. Wie vorstehend ausgeführt, gibt es vorzugsweise mindestens einen Locus der fehlangepasst ist. "Fehlangepasst" an MHC-Klasse 1 bedeutet fehlangepasst an einen oder mehrere MHC-Klasse I-Loci, z. B. im Fall von Menschen fehlangepasst an ein oder mehrere der HLA-A, HLA-B oder HLA-C, oder in dem Fall von Schwein fehlangepasst an ein oder mehrere SLA-Klasse I-Loci, z. B. die Schwein-A- oder -B-Loci. "Fehlangepasst" an MHC-Klasse II bedeutet fehlangepasst an einen oder mehrere MHC-Klasse II-Loci, z. B. im Fall von Menschen fehlangepasst an ein oder mehrere von DPα, DPβ, DQα, DQβ, DRα oder DRβ, oder im Fall von Schwein fehlangepasst an einem der SLA-Klasse II-Loci, z. B. fehlangepasst an DQα oder β, oder DRα oder β.
Die Medikamente dienen zur Verwendung in den Verfahren, die hierin für die Erzeugung von Toleranz gegenüber einem allogenen Antigen oder allogenen Transplantat beschrieben wurden und können dort verwendet werden, wo es zwischen Spender und Empfänger einen auch nur geringfügigen Grad eines Reaktionsvermögens in einem gemischten Lymphozyten-Assay gibt, z. B. wo es keine, eine geringe, eine mittlere oder hohe Reaktionsfähigkeit von gemischten Lymphozyten zwischen dem Spender und Empfänger gibt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die gemischte Lymphozyten-Reaktionsfähigkeit angewendet, um eine Fehlpaarung für Klasse II zu definieren, wobei in die Erfindung Medikamente zur Verwendung in den Verfahren zum Herstellen von allogenen Transplantaten zwischen Individuen mit einem gewissen Grad von Fehlanpassung an Klasse II entsprechend der Festlegung in einem gemischten Lymphozyten-Assay einbezogen sind. Serologische Tests können verwendet werden, um die Fehlanpassung an Klasse I- oder II-Loci zu bestimmen, wobei die Erfindung Medikamente zur Verwendung in den Verfahren zum Ausführen von allogenen Transplantaten zwischen Individuen mit einem auch nur geringen Grad von Fehlpaarung an Klasse I oder II einbezieht, die mit Hilfe serologischer Methoden gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kennzeichnet die Erfindung Medikamente zur Verwendung in Verfahren für die Ausführung von allogenen Transplantaten zwischen Individuen, die entsprechend einer Bestimmung mit Hilfe serologischer und/oder gemischter Lymphozyten Reaktions-Assays sowohl an Klasse I als auch an Klasse II fehlangepasst sind.
Die Medikamente der Endung sind besonders verwendbar zum Austausch eines Gewebes oder Organs, das von einer Tumorerkrankung befallen ist und speziell einer Erkrankung, die gegenüber normalen Therapiearten beständig ist, z. B. Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie. Die Medikamente der Erfindung können verwendet werden, um einem Transplantat, z. B. einem Allotransplantat, z. B. einem Allotransplantat von einem Spender Toleranz zu vermitteln, der fehlangepasst ist einer oder mehreren Klasse I-Loci, einem oder mehreren Klasse II-Loci oder einem oder mehreren Loci an jeder der Klasse I und II. In bevorzugten Ausführungsformen sind in das Transplantat einbezogen: Gewebe aus dem Verdauungstrakt oder Eingeweide, z. B. Gewebe aus dem Magen oder Darmgewebe, z. B. Dünndarm, Dickdarm oder Colon; wobei das Transplantat einen Teil des Verdauungssystems des Empfänger ersetzt, z. B. den gesamten Verdauungstrakt oder Eingeweide oder einen beliebigen Teil davon, z. B. den Magen; Darm, z. B. Dünndarm, Dickdarm oder Colon.
Die Medikamente der Endung eliminieren die Notwendigkeit für eine präparative WB-Bestrahlung. Wenn allerdings eine Bestrahlung verabreicht wird, ist es möglich, einen gemischten Chimärismus mit weniger Strahlungstoxizität durch Unterteilen der Strahlendosis zu erzeugen, d. h. durch Zuführung der Strahlung in zwei oder mehreren Exponierungen oder Sitzungen. Dementsprechend kann in jeder beliebigen Ausführung der Endung, bei der die Strahlung eines Empfängers geboten ist, z. B. ein Primat, z. B. ein Mensch, ein Empfänger eines Xenoplantats oder Aloplantats, die Strahlung entweder in einer einzigen Exponierung zugeführt werden oder kann, was mehr bevorzugt ist, in zwei oder mehrere Exponierungen oder Sitzungen unterteilt werden. Die Summe der unterteilten Dosismengen ist vorzugsweise gleich, z. B. in "rad" oder in "Gy", der Strahlungsdosis, die bei einer einzigen Exponierung zu einem gemischten Chimärismus führen kann. Die Unterteilungen sind vorzugsweise in der Dosismenge näherungsweise gleich. In den Verfahren der Erfindung kann auch eine Hyperfraktionierung der Strahlendosis zur Anwendung gelangen. Die Anteile können am gleichen Tag zugeführt werden oder lassen sich in Abständen von einem Tag, 2, 3, 4, 5 oder mehreren Tagen unterteilen.
Thymus-Bestrahlung kann unterteilt werden. Beispielsweise kann eine einzige Dosis von 7 Gy (700 rad) ersetzt werden durch z. B. 2 Anteile von 3,5 Gy (350 rad) oder 7 Anteilen von 1 Gy (100 rad).
Die Medikamente der Endung lassen sich in Verfahren verwenden, in die eine Splenektomie des Empfängers einbezogen ist.
Wie hierin diskutiert, lässt sich eine Hämoperfusion, z. B. Hämoperfusion mit einem Spender-Organ, zur Abreicherung der natürlichen Antikörper des Wirts anwenden. Andere Verfahren zur Abreicherung oder einer Inaktivierung natürlicher Antikörper auf andere Weise lassen sich mit jedem beliebigen der hierin beschriebenen Verfahren anwenden. Beispielsweise können Arzneimittel, die natürliche Antikörper abreichern oder inaktivieren, z. B. Deoxyspergualin (DSG) (Bristol), oder Anti-IgM-Antikörper dem Empfänger eines Allotransplantats oder eines Xenotransplantats verabreichen. Es lassen sich ein oder mehrere DSG (oder ähnliche Arzneimittel), Anti-IgM-Antikörper und Hämoperfusion anwenden, um natürliche Antikörper des Empfängen in Verfahren einschließlich Medikamenten für die Erfindung abzureichern oder auf andere Weise zu inaktivieren. Es ist festgestellt worden, dass DSG bei einer Konzentration von 6 mg/kg/Tag i. v. zur Unterdrückung der Funktion natürlicher Antikörper in Schwein-zu-Cynomolgus-Nieren-Transplantaten verwendbar ist.
Im Gegensatz zum vollständigen Austausch der Stammzellen des Empfängers durch Donator-Zellen wird in jedem beliebigen, hierin beschriebenen Verfahren und speziell bei Primaten oder klinischen Verfahren die Bildung eines gemischten Chimärismus bevorzugt.
Alternative Verfahren für die Inaktivierung von Thymus-T-Zellen sind ebenfalls in Ausführungsformen der Erfindung einbezogen. Einige der hierin beschriebenen Verfahren schließen die Verabreichung einer Thymus-Bestrahlung ein, um Wirts-Thymus-T-Zellen zu inaktivieren oder auf andere Weise die durch die Thymus-T-Zellen des Wirts vermittelten Reaktionen auf Donator-Antigenen herabzusetzen. Es ist entdeckt worden, dass die Thymus-Bestrahlung, die bei allogenen oder xenogenen Verfahren der vorliegenden Erfindung geboten ist, ergänzt oder ersetzt werden kann durch andere Behandlungen, mit denen die durch Thymus-T-Zellen des Wirts vermittelte Reaktion verringert werden kann (z. B. durch Abreicherung von Thymus-T-Zellen und/oder durch Abwärtsmodulierung eines oder mehrerer der T-Zellen-Rezeptoren (TCR), DC4-Corezeptoren oder CD8-Corezeptoren). Beispielsweise kann die Thymus-Bestrahlung ergänzt oder ersetzt werden durch Anti-T-Zellen-Antikörper (Anti-CD4- und/oder Anti-CD8-monoklonale Antikörper), die ausreichend oft in ausreichender Dosierung für eine ausreichende Zeitdauer verabreicht werden, um die durch die Thymus-T-Zellen des Wirts vermittelte Reaktion verringert zu werden.
Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten die Anti-T-Zellen-Antikörper wiederholt verabreicht werden, beispielsweise können die Anti-T-Zellen-Antikörper einmal, zweimal, dreimal oder mehrere Male vor der Transplantation von Spender-Knochenmark verabreicht werden. Im typischen Fall wird dem Patienten eine Vor-Knochenmark-Transplantationsdosis von Antikörpern etwa 5 Tage vor der Knochenmark-Transplantation gegeben. Darüber hinaus können auch frühere Dosierungen 6, 7 oder 8 Tage vor der Knochenmark-Transplantation gegeben werden. Es kann wünschenswert sein, eine erste Behandlung zu verabreichen, um dann wiederholt Vor-Knochenmark-Verabreichungen alle 1 bis 5 Tage zu geben, bis der Patient einen Überschuss an Antikörpern im Serum und etwa 99% Abreicherung an peripheren T-Zellen zeigt, um dann die Knochenmark-Transplantation auszuführen. Anti-T-Zellen-Antikörper können auch einmal, zweimal, dreimal oder mehrere Male nach der Spender-Knochenmark-Transplantation verabreicht werden. Im typischen Fall wird eine Nach-Knochenmark-Transplantationsbehandlung etwa 2 bis 14 Tage nach der Knochenmark-Transplantation gegeben. Die Nach-Knochenmark-Transplantation kann so oft wiederholt werden, wie erforderlich ist. Sofern mehr als eine Verabreichung erfolgt, können die Verabreichungen einen Abstand von etwa einer Woche haben. Zusätzliche Dosierungen können dann gegeben werden, wenn der Patient einer frühzeitigen oder unerwünschten T-Zellen-Wiederherstellung unterliegt. Vorzugsweise werden Anti-T-Zellen-Antikörper mindestens einmalig (und vorzugsweise 2, 3 oder mehrere Male) vor der Spender-Knochenmark-Transplantation und mindestens einmal (vorzugsweise 2, 3 oder mehrere Male) nach der Spender-Knochenmark-Transplantation verabreicht.
Einige der Verfahren schließen hierin die Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen an einen Empfänger ein. In vielen dieser Verfahren werden hämopoetische Stammzellen vor oder zum Zeitpunkt der Implantation eines Implantats (ein Allotransplantat oder Xenotransplantat) verabreicht, wobei die Hauptaufgabe der Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen in der Erzeugung einer Toleranz gegenüber dem Transplantat besteht. Die Erfinder haben festgestellt, dass eine oder mehrere aufeinander folgende Verabreichungen (z. B. eine zweite, dritte, vierte, fünfte oder weitere folgende Verabreichungen) von hämopoetischen Stammzellen in der Erzeugung und/oder Bewahrung von Toleranz wünschenswert sein können. Damit schließt die Erfindung auch Verfahren ein, bei denen hämopoetische Stammzellen an einen Empfänger verabreicht werden, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, die zuvor eine Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen als Teil eine der hierin beschriebenen Verfahren erhalten haben.
Ohne an eine Lehre gebunden sein zu wollen, geht der Erfinder davon aus, dass die wiederholte Verabreichung von Stammzellen den Chimärismus und möglicherweise eine langzeitige deletionale Toleranz in Transplantat-Empfängern fördern kann. Dementsprechend können in jedes der hierin bezeichneten Verfahren, in das die Verabreichung hämopoetischer Stammzellen einbezogen ist, ferner mehrfache Verabreichungen von Stammzellen einbezogen werden. In bevorzugten Ausführungsformen: werden eine erste und eine zweite Verabreichung von Stammzellen vor der Implantation eines Transplantats vorgesehen; eine erste Verabreichung von Stammzellen vorgesehen vor der Implantation eines Transplantats und eine zweite Verabreichung von Stammzellen vorgesehen zum Zeitpunkt der Implantation des Transplantats. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: eine erste Verabreichung von Stammzellen ist vorgesehen vor oder zum Zeitpunkt der Implantation eines Transplantats und eine zweite Verabreichung von Stammzellen vorgesehen nach der Implantation eines Transplantats. Die Dauer zwischen den Verabreichungen von hämopoetischen Stammzellen kann variiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine nachfolgende Verabreichung hämopoetischer Stammzellen vorgesehen: mindestens 2 Tage, 1 Woche, 1 Monat oder 6 Monate nach der vorangegangengen Verabreichung von Stammzellen; mindestens 2 Tage, 1 Woche, 1 Monat oder 6 Monate nach der Implantation des Transplantats.
In das Verfahren kann ferner der Schritt der Verabreichung einer zweiten oder folgenden Dosis von hämopoetischen Stammzellen einbezogen werden: wenn der Empfänger Anzeichen einer Abstoßung zu zeigen beginnt, z. B. zeigt sich dieses durch eine Abnahme der Funktion des transplantierten Organs, durch eine Änderung der Reaktion des Donator-spezifischen Antikörpers des Wirts oder durch eine Änderung in der Lymphozyten-Reaktion des Wirts zum Donator-Antigen; wenn der Wert des Chimärismus abnimmt; wenn der Wert des Chimärismus einen vorbestimmten Wert unterschreitet; wenn der Wert des Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, bei dem das Anfärben mir einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für ein Donator-PBMC-Antigen ist, einer Isotyp-Kontrolle gleich ist oder diese unterschreitet, die nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donator-spezifischen monoklonalen Anfärbungen weniger als 1 bis 2% der Zellen sind; oder im Allgemeinen nach Erfordernis, um die Toleranz aufrecht zu erhalten oder die Akzeptanz eines Transplantats auf andere Weise zu verlängern. Damit dienen die Medikamente der Endung zur Verwendung in Verfahren, welche unter Einschluss eines weiteren Schrittes zur Bestimmung modifiziert werden können, ob ein Patient, der eine oder mehrere Verabreichungen hämopoetischer Stammzellen erhalten hat, eine nachfolgende Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen benötigt und, wenn dieses so ist, dem Empfänger eine nachfolgende Dosis von hämopoetischen Stammzellen verabreicht wird.
In jedes der Verfahren, auf die hierin Bezug genommen wurde, kann die Verbreichung von Mitteln einbezogen werden, wie beispielsweise 15-Deoxyspergualin, Mycophenolat-Mofetil, Brequinar-Natrium oder ähnliche Mittel, die die Erzeugung, Werte oder Aktivität von Antikörpern in den Empfängern hemmen. Eines oder mehrere dieser Mittel können verabreicht werden: vor der Implantation von Spender-Gewebe, z. B. 1, 2 oder 3 Tage oder 1, 2 oder 3 Wochen vor der Implantation von Spender-Gewebe; zum Zeitpunkt der Implantation von Spender-Gewebe; oder nach der Implantation von Spender-Gewebe, z. B. 1, 2 oder 3 Tage oder 1, 2 oder 3 Wochen nach der Implantation eines Transplantats.
Die Verabreichung des Mittels kann eingeleitet werden; wenn der Empfänger Anzeichen einer Abstoßung zu zeigen beginnt, was sich beispielsweise durch eine Abnahme der Funktion des verpflanzten Organs bemerkbar macht, durch eine Änderung in der Wirt-Spender-spezifischen Antikörper-Reaktion oder durch eine Änderung in der Wirt-Lymphozyten-Reaktion auf das Donator-Antigen; wenn der Wert von Chimärismus abnimmt; wenn der Wert von Chimärismus einen vorbestimmten Wert unterschreitet; wenn der Wert von Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, wo das Anfärben mit einem monoklonalen Antikörper, der auf ein Donator-PBMC-Antigen spezifisch ist, gleich dem Anfärben mit einer Isotyp-Kontrolle ist oder diese unterschreitet, die nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donatorspezifischen monoklonalen Anfärbungen kleiner sind als 1 bis 2% der Zellen; oder in der Regel wenn die Notwendigkeit besteht, Toleranz aufrecht zu erhalten oder die Akzeptanz eines Transplantats auf andere Weise zu verlängern.
Die Dauer, über die das Mittel verabreicht wird (oder die Dauer, über die klinisch wirksame Werte in dem Patienten aufrecht erhalten werden), kann langfristig sein, z. B. für 6 Monate oder mehr oder 1 Jahr oder mehr, oder kann kurzfristig sein, z. B. weniger als 1 Jahr, mehr bevorzugt 6 Monate oder weniger, mehr bevorzugt 1 Monat oder weniger und mehr bevorzugt 2 Wochen oder weniger. Die Dauer wird in der Regel midestens etwa 1 Woche betragen und vorzugsweise mindestens etwa 2 Wochen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dauer 2 oder 3 Wochen.
Bevorzugte Ausführungsformen schließen die Verabreichung von 15-Deoxyspergualin (6 mg/kg/Tag) für etwa 2 Wochen beginnend an dem Tag der Implantation des Transplantats ein.
Einige der Verfahren, auf die hierin Bezug genommen wurde, schließen die Verabreichung von hämopoetischen Stammzellen an einen Empfänger ein. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Verabreichung von einem oder mehreren Cytokinen und vorzugsweise ein Cytokin von der Spezies, von der die Stammzellen kommen, die Transplantatakzeptanz, den gemischten Chimärismus und Toleranz fördern kann oder die Akzeptanz eines Transplantats auf andere Weise verlängern kann. Die Anwendung derartiger Cytokine kann die Notwendigkeit für eine Ganzkörperbestrahlung eliminieren. Damit sind in die Erfindung auch Medikamente zur Verwendung in Verfahren einbezogen, in denen an den Empfänger ein oder mehrere Cytokine verabreicht werden, z. B. ein Donator-Spezies-Cytokin.
Ohne an eine Lehre gebunden sein zu wollen, gehen die Erfinder davon aus, dass die Cytokine und speziell Donator-Spezies-Cytokine die Transplantatakzeptanz und/oder Funktion von Donator-Stammzellen oder deren Nachkommenzellen fördern. Dementsprechend kann in jedes der Verfahren, auf die hierin Bezug genommen wurde und in das die Verabreichung hämopoetischer Stammzellen einbezogen ist, außerdem die Verabreichung eines Cytokins einbezogen sein, z. B. SCF, IL-3 oder GM-CSF. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Cytokin ein solches, das in seiner Wechselwirkung mit Targetzellen Spezies-spezifisch ist.
Die Verabreichung eines Cytokins kann vor, zum Zeitpunkt oder nach der Implantation eines Transplantats oder der Implantation von Stammzellen beginnen.
In das Verfahren kann ferner der Schritt einer Verabreichung einer ersten oder nachfolgenden Dosis eines Cytokins an den Empfänger einbezogen sein: wenn der Empfänger Anzeichen einer Abstoßung zu zeigen beginnt, was sich beispielsweise durch eine Abnahme der Funktion des transplantierten Organs bemerkbar macht, durch eine Änderung in der Wirt-Donator-spezifischen Antikörper-Reaktion oder durch eine Änderung in der Wirt-Lymphozyten-Reaktion auf das Donator-Antigen; wenn der Wert von Chimärismus abnimmt; wenn der Wert von Chimärismus einen vorbestimmten Wert unterschreitet; wenn der Wert von Chimärismus einen Wert erreicht oder diesen unterschreitet, bei dem das Anfärben mit einem monoklonalen Antikörper, der auf ein Donator-PBMC-Antigen spezifisch ist, gleich einem Anfärben mit einer Isotyp-Kontrolle ist oder diese unterschreitet, die nicht an PBMC's bindet, z. B. wenn die Donatorspezifischen monoklonalen Anfärbungen weniger sind als 1 bis 2% der Zellen; oder in der Regel wenn es notwendig ist, die Toleranz aufrecht zu erhalten oder die Akzeptanz eines Transplantats auf andere Weise zu verlängern. Somit dienen die Medikamente der Erfindung für Verfahren, die so modifiziert werden können, dass ein weiterer Schritt einbezogen ist um zu bestimmen, wann ein Patient eine Cytokin-Therapie benötigt, und wenn dieses so ist, die Verabreichung eines Cytokins erfolgt.
Die Dauer über die das Cytokin /die Cytokine verabreicht wird/werden (oder die Dauer über die klinisch wirksame Mengen in den Patienten aufrecht erhalten werden) kann langfristig sein, z. B. 6 Monate oder mehr oder 1 Jahr oder mehr, oder kann kurzfristig sein, z. B. 1 Jahr oder weniger, mehr bevorzugt 6 Monate oder weniger, mehr bevorzugt 1 Monat oder weniger und mehr bevorzugt 2 Wochen oder weniger. Die Dauer wird in der Regel mindestens etwa 1 Woche betragen und vorzugsweise mindestens etwa 2 Wochen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Empfänger ein Primat, z. B. ein Mensch, und der Spender kommt von einer anderen Spezies, beispielsweise ist der Spender ein Schwein, und: es wird Schwein-SCF verabreicht; Schwein-IL-3 verabreicht; eine Kombination von Schwein-SCF und Schwein-IL-3 verabreicht; ein Schwein-spezifischer, hämopoeseverstärkender Faktor, z. B. Schwein-GM-SCF verabreicht, z. B. nach der Implantation von Stammzellen, z. B. etwa 1 Monat nach der Implantation von Stammzellen.
In jedem beliebigen Verfahren, auf das hierin Bezug genommen wurde, kann zusätzlich zu beliebigen Anti-T-Zellen-Antikörpern und anstelle dieser ein Anti-CD2-Antikörper und vorzugsweise ein monoklonaler, z. B. BTI-322, oder ein monoklonaler verwendet werden, der auf ein ähnliches oder überlappendes Epitop gerichtet ist.
Weitere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Patentansprüche.

Claims

Verwendung von Blutstammzellen (hämatopoietischen Stammzellen) in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Förderung der Toleranz in einem Empfänger-Säuger einer ersten Spezies gegenüber einem Transplantat, das von einem Spender-Säuger einer zweiten Spezies erhalten wird, welches Verfahren umfasst: Einführen in den Empfänger-Säuger Blutstammzellen der zweiten Spezies; Erzeugung eines Thymusraumes in dem Empfänger bei Abwesenheit einer Ganzkörperbestrahlung und Einführen des Transplantats in den Empfänger worin die Zahl der Spender-Stammzellen, die verabreicht werden, ausreichend ist, so dass ein gemischter Chimärismus ohne hämatopoietisch raumerzeugende Strahlung erzeugt werden kann und worin die Blutstammzellen nicht von einem menschlichen Embryo erhalten werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Transplantat in dem Verfahren vom Schwein ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei in dem Verfahren das Schwein ein Miniaturschwein ist.
Verwendung von Blutstammzellen in der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in einem Verfahren zur Auslösung von Toleranz in einem Empfänger-Säuger gegenüber einem Transplantat, das von einem Spender-Säuger der gleichen Spezies erhalten wird, wobei das Verfahren umfasst: Einführen in den Empfänger-Säuger Blutstamzellen des Spenden; Erzeugung eines Thymusraumes bei Abwesenheit von Ganzkörperbestrahlung in dem Empfänger; und Implantieren des Transplantats in den Empfänger, worin die Zahl der Spender-Stammzellen, die verabreicht werden, ausreichend ist, so dass ein gemischter Chimärismus ohne hämatopoietisch raumerzeugende Strahlung erzeugt werden kann und worin die Blutstammzellen nicht von einem menschlichen Embryo erhalten werden.
Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei in dem Verfahren der Empfänger ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei in dem Verfahren der Thymusraum erzeugt wird durch Verabreichen an den Empfänger von einem oder mehreren der Folgenden: Thymusbestrahlung, Steroide, Corticosteroide, Brequinar oder eine immunosuppressive chemische Substanz oder Medikament.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei in dem Verfahren der Thymusraum erzeugt wird durch Verabreichen von Thymusbestrahlung an den Empfänger.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei in dem Verfahren der Thymusraum erzeugt wird durch Verabreichen einer immunosuppressiven chemischen Substanz oder Medikament an den Empfänger.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei in dem Verfahren der Thymusraum erzeugt wird durch Verabreichen einer kurzen Folge von Cyclosporin an den Empfänger.
Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei in dem Verfahren an den Empfänger mehrfache Verabreichungen von Blutstammzellen gewährt werden.
Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, ferner umfassend in dem Verfahren das Inaktivieren von Spender-reaktiven T-Lymphozyten des Empfänger-Säugen.
Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, ferner umfassend in dem Verfahren das Inaktivieren von Spender-reaktiven NK-Zellen an den Empfänger-Säuger.
Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei in dem Verfahren das Transplantat eine Niere umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei welchem in dem Verfahren das Transplantat eine Leber umfasst.