JPH07503012A

JPH07503012A - 異種移植のための誘導された寛容

Info

Publication number: JPH07503012A
Application number: JP5512596A
Authority: JP
Inventors: サクス，デイビッド　エイチ．; コシミ，エイ．ベネディクト; サイクス，メガン
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1992-01-08
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 1995-03-30
Also published as: US6296846B1; DE69331778D1; DK0621786T3; ES2172514T3; EP0621786B1; PT621786E; EP0621786A4; AU3989597A; AU3017000A; EP0621786A1; DE69331778T2; WO1993013785A1; AU759994B2; AU3440093A; AU679437B2; CA2126094A1; ATE215375T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】異種移植のための誘導された寛容１豆立直１この発明は、器官移植に関するものである。

移植を必要とする患者の数が利用可能な器官の数を遥かに上回っているので、器官の獲得が、現在、器官移植における１つの主要な問題となっている。異種移植は、この問題に解決を与えることが出来る。系統発生的に、非ヒト霊長類は、ヒトに最も密接に関連しており、それ故、ドナーとしての第１の選択を代表し得る。１９６９年に、Ｒｅｅｍｔｓｍａ等は、チンパンジーからヒトへの最初の上首尾の腎臓異種移植を達成した（　Ｒｅｅｔｓ園ａ、　Ｋ、等、１９６４、　Ａｎｎ、　Ｓｕｒｇ、　１６０：３８４）　、　Ｌ／かしながら、霊長類ドナーの潜在的有用性は、不十分な数、法律及び倫理的問題並びに危険なウィルス病の媒介の可能性によって制限される。ブタは、繁殖特性が遺伝学的実験を可能にする少ない大型動物種の１つを代表し、小型ブタのＭＨＣホモ接合系統の開発を可能とする。小型ブタは、最大成体体重２００〜３００ボンド（９０，６〜１３５．９ｋｇ）に維持することが出来、解剖学的及び生理学的にヒトに近い。従って、小型ブタの器官は、すべての年齢のヒトに対する異種移植片として用いるのに適している。

自己の主要組織適合（ＭＨＣ）抗原に対する寛容は、胸腺におけるＴ細胞の成熟の間に生じる（　ＭｃＤｕｆｆｉｅ等、＋９８８．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１：１８４０）　、免疫系を個体発生の間にＭ　Ｍ　Ｃ抗原にさらすことは免疫系がそれらの抗原に対する反応性を失い、それ故、成熟する動物を特異的に寛容にする（Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ等、１９５３．　Ｎａｔｕｒｅ　１７２：６０３）　、移植免疫学者は、リンパ造血キメラによって成熟動物に寛容を誘導する手段を探してきた。全身照射（ＷＢＩ）及び骨髄移ｔｌＩ（ＢＭＴ）による成熟マウスにおけるＭ　Ｍ　Ｃバリヤーを越える寛容の誘導がマウスモデルにおいて広く研究されてきた（　Ｒａｙｆｉｅｌｄ等、＋９８３．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎ、　３６：１８３；　ＭａｙｕＩＩｌｉ等、　１９８９．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６９：２１３；　５ｙｋｅｓ等、　１９ｇ８．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　９＋２３　）　ｅ器官移植片への寛容を誘導する手段としてのＭＨＣ不適合ＢＭＴの利用は、幾つかの主要な不都合を伴い得る。１！備生活規制（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｒｅｇｉｍｅｎ　）は、固有の危険及び毒性を伴う致死的照射を含み；臨床適用可能性は、殆どの潜在的被移植者は適当なＭ　ＨＣ適合のドナーを何しないという事実により制限され、そしてＭＨＣバリヤーを越えるＢＭＴは重症の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす。ＧＶＨＤを防ぐための同種骨髄移植物におけるＴリンパ球の除去（Ｒｏｄｔ等、１９７１．　Ｅｕｒ、　Ｊ。

ｂａａ＋ｕｎｏ１．４：２５　）は、植え付けの失敗の増加した率を伴う　（Ｍａｒｔｉｎ等　、　＋９８８．　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　３：４４５；０’Ｒｅ１ｌｌｙ等、１９８５．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ｐｒｏｃ、１７：４５５；　Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ等、１９８５．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３５：９４１　）　、これらの欠点は、一般に、治療しなければ致命的である悪性の病気の治療に対しては許容されると考えられているが、それらは、器官移植のための準備生活規制の故にこの方法論（主要な合併症を伴わない訳ではないが、非特異的な免疫抑制剤が有効である）の適用をひどく制限する。

比較的無毒の骨髄除去のない（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ　）骨髄植え付は及び特異的な移植寛容のための準備生活規制の利用がマウス種と組合せるための調和性（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）ラットに適用された（　５ｈａｒａｂｉ、　Ｙ、等、１９９０、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｌｅｄ、　１７２：１９５−２０２）　、この処置は、成熟Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４及びＣＤ８）並びにＮＫ細胞（ＮＫ１．１）を除去するためのモノクローナル抗体の投与を含んだ。これらのモノクローナル抗体は、準致死的線量（３００ラド）のＷＢＩ及び局所的な７００ラド線量の胸腺照射のみの後での異種間の骨髄の植え付けを可能にした。その結果のリンパ球再構成は、被移植者が準備生活規制から毒性影響を受けなかったので、従来の混合した異種間キメラのそれよりは優れていた（該キメラは、致死的照射及びＴ細胞涸渇させた同系及び異種個体の骨髄の混合物を用いる再構成により調製される）（Ｓｈａｒａｂｉ、　Ｙ、等、１９９０．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７罎１９５−２０２；１１ｄｓｔａｄ等、　１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３０７：１６８−１７０）　、更に、ウマの抗−ヒト抗−胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のポリクローナル調製物の静脈投与により霊長類及びヒトにおける皮膚同ｆｉｔ移植片の生存を長くする試みがなされた。このＡ　Ｔ’　Ｇを移植と同時に及び移植直後の数日間に注射した（（：ｏｓｉｍｊ、　Ａ、Ｂ、等、　１９７０．　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　６８二５４−６１　）。

不調和性（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）の種の組合せにおいて、免疫系の体液性の（抗体媒介の）成分は主要なバリヤーをもたらす。第１に血管新生した器官を不調和性種間で移植すると鯉は、血管内皮細胞の表面で発現される決定基を認識する天然の抗体が、血管吻合の数分以内に、補体及び凝固カスケードの活性化のために、器官の拒絶を引き起こす（）ｌａｍｅｅｒ、　Ｃ，等、１９７３．　Ｅｕｒ、　Ｓｕｇ、　Ｒｅｓ、　５：１６２；Ｈａｒｄｙ、　Ｍ、Ａ、等、１９８４．　Ｓ、　５ｌａｖｉｎ　Ｉｉ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｂ。

Ｖ、、　ｐ、５１５　’）　、ブタドナーからの心臓異種移植片を延長する試みにおいて、光圧する天然抗体は、ドナー特異的な腎臓の血液潅流（ｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　）により被移植者霊長動物の血液から吸収された（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｄ、に、Ｃ，等、１９８８、Ｊ、ｔ（ｅａｒｔ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、ヱ：２３ｇ−２４６；　Ｆｉｓｃｈｅｌ。

Ｒ，Ｊ、等、１９９０．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、　２２：１０７７　）　。

免豆立ｌ上一般に、この発明は、被移植者である第１の種の嗜乳動物例えば霊長類例えばヒトにおける、第２の種（例えば、不調和性種）の補乳類から得た移植片に対する寛容を誘導する方法を叙述する。その方法は、次を含む：移植片の移植の前又は移植と同時に、被移植者嗜乳動物に、第２の種の造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児肝若しくは牌臓細胞を導入１゛ること（好ましくは、造血幹細胞は、被移植者晴乳動物中の１つの部位に向かって進む）；及び造血幹細胞を被移植者哨乳動物中に導入する前に、被移植者哨乳動物のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に結合することが出来る抗体を被移植者晴乳動物中に導入して造血細胞のＮＫ媒介の拒絶を阻止すること。下記で一層詳細に説明するように、造血細胞は５Ｂ細胞及びＴ細胞レベルの両者における寛容を誘導することによって、被移植者に後続の移植片に対する準備をさせる。

好ましくは、造血細胞は、胎児肝若しくは牌臓又は未熟細胞（即ち、未分化造血幹細胞：これらの所望の細胞は、投与前に骨髄から分離することが出来る）を含む骨髄細胞であり、或は、かかる細胞を含む複合骨髄試料を用いることが出来る。

抗−ＮＫ抗体の１つの源は、抗−ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である。以下に論じるように、好ましくは、第２の抗−成熟Ｔ細胞抗体を更に投与することが出来、それはＴ細胞並びにＮＫ細胞を溶解させる。Ｔ細胞を溶解させることは、骨髄及び異種移植片の生存に対して有利である。抗−Ｔ細胞抗体は、抗−ＮＫ抗体と共に抗胸腺細胞抗血清中に存在する。抗＝ＮＫ又は抗−Ｔ細胞抗体の反復投与が好ましい。モノクローナル調製物を、この発明の方法において用いることが出来る。

好適具体例は、次を含む：被移植者唖乳動物へドナ一種特異的間質組織好ましくは造血間質組織例えば胎児肝若しくは胸腺を導入する工程：造血幹細胞移植前に被移植者哨乳動物へ被移植者補乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入する工程。

好適具体例は１次のようなものを含む：第２の種の同−ｎｌ乳動物が移植片及び造血細胞の両方のドナーであるもの：ドナー哨乳動物がブタ例えば小型ブタであるもの：導入を静脈注射により行なうもの；及び抗体が例えばウマ又はブタから得られる抗−ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であるもの。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植の前に被移植者哨乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで全身照射する工程；及び造血幹細胞移植の前に被移植者哨乳動物を約７００ラドで胸腺照射する工程。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植の前に第２の種の嗜乳動物から得た器官例えば肝臓若しくは腎臓を血液潅流することによって天然の抗体を被移植者哨乳動物の血液から吸収する工程。

他の面において、この発明は、被移植者補乳動物例えば霊長類例えばヒトに同種のドナー哨乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導する方法を叙述する。この方法は、次を含む：移植片の移植の前又は移植と同時に、嗜乳動物から得た造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児肝若しくは牌臓細胞を被移植者哨乳動物中に導入すること（好ましくは、造血幹細胞は被移植者哨乳動物中の１つの部位に向かって進む）；造血幹細胞を哨乳動物中に導入する前に被移植者哨乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を晴乳動物中に導入すること；造血幹細胞な哨乳動物中に導入する前に同一種の嗜乳動物から得た器官を血液潅流することによって天然の抗体を被移植者哨乳動物の血液から吸収すること；及び骨髄を咄乳動物中に導入する前に被移植者嗜乳動物を低線量照射してその嗜乳動物の骨髄を部分的に涸渇させること。

好適具体例は、次を含む：被移植者嗜乳動物にドナ一種特異的間質組織好ましくは造血間質組織例えば胎児肝若しくは胸腺な導入する工程；及び造血幹細胞移植の前に被移植者哨乳動物中に被移植者晴乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入する工程。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植の前に被移植者哨乳動物を低線量例えば１００ラドを超えるが４００ラドより低い線量で全身照射する工程：及び造血幹細胞移植の前に被移植者哨乳動物を例えば約７００ラドで胸腺照射する工程。

好適具体例は、次を含む二造血幹細胞移植の前に第２の種の哺乳動物から得た器官例えば肝臓若しくは腎臓を血液潅流することによって天然の抗体を被移植者哨乳動物の血液から吸収する工程。

他の面において、この発明は、第１の種の被移植者霊長類例えばヒトに第２の種（好ましくは、不調和性）の嗜乳動物例えば霊長類から得た移植片に対する寛容を誘導する方法を叙述する。この方法は、次を含む：被移植者霊長類にドナ一種特異的間質組織を導入すること；被移植者霊長類に第２の種の造血幹細胞を導入すること（好ましくは、造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児肝若しくは牌臓細胞は被移植者霊長類中の１つの部位に向がって進む）；及び及び被移植者霊長類中に被移植者霊長類のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を導入すること。

好適具体例は、次のようなものを含む二間質組織を造血幹細胞と同時に又は造血幹細胞の前に導入するもの；造血幹細胞を抗体と同時に又はそれより前に導入するもの；間質組織を造血幹細胞と同時に又はそれより前に導入し、そして造血幹細胞を抗体と同時に又はそれより前に導入するもの。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植の前に被移植者嗜乳動物中に被移植者哨乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入する工程。

好適具体例は、次のようなものを含む：第２の種の同−哺乳動物が移植片及び造血細胞の両方のドナーであるもの：ドナー哺乳動物がブタ例えば小型ブタであるもの、導入を静脈注射によって行なうもの：そして抗体が例λばウマ又はブタから得られた抗−ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であるもの。

好適具体例は、次を含む二造血幹細胞移植の前に被移植者哨乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで全身照射する工程；及び造血幹細胞移植の前に被移植者哺乳動物を例えば約７００ラドで胸腺照射する工程。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植の前に第２の種の哺乳動物から得た器官例えば肝臓若しくは腎臓を血液潅流することによって被移植者哨乳動物の血液から天然の抗体を吸収する工程。

他の面において、この発明は、被移植者霊長類例えばヒトに第２の種の哺乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導する方法を叙述する。この方法は、次を含む：被移植者霊長類中にドナ一種特異的な造血間質組織を導入すること：被移植者霊長類中に第２の種の造血幹細胞例えば骨髄細胞又は胎児肝若しくは牌臓細胞を導入すること（好ましくは、造血幹細胞は被移植者霊長類中の１つの部位に向かって進む）；及び被移植者霊長類中に哺乳動物から得た移植片を導入すること。

好ましくは、移植片を造血幹細胞と異なる器官から得る。

好適具体例は、次のようなものを含む：間質組織を造血幹細胞と同時に又はそれより前に導入するもの；造血幹細胞を移植片と同時に又はそれより前に導入するもの；間質組織を造血幹細胞と同時に又はそれより前に導入し、及び造血幹細胞を抗体と同時に又はそれより前に導入するもの。

好適具体例は、次を含む二造血幹細胞移植の前に被移植者嗜乳動物中に被移植者哨乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体を導入する工程。

好適具体例は次のようなものを含む：第２の種の同じ哺乳動物が移植片及び造血細胞両方のドナーであるもの；ドナー哺乳動物がブタ例えば小型ブタであるもの；誘導を静脈注射により行なうもの：及び抗体が例えばウマ又はブタから得られる抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清であるもの。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植前に被移植者哨乳動物を低線量例えば約１００〜４００ラドで全身照射する工程；及び造血幹細胞移植前に被移植者哨乳動物を例えば約７００ラドで胸腺照射する工程。

好適具体例は、次を含む：造血幹細胞移植前に第２の種の哺乳動物から得た器官例えば肝臓又は腎臓を血液潅流することにより被移植者哨乳動物の血液から天然抗体を吸収する工程。

好適具体例は、次のようなものを含む：霊長類がカニクイザルであるもの：霊長類がヒトであるもの：間質組織が胎児肝であるもの：間質組織が胸腺であるもの；哺乳動物がブタ例えば小型ブタであるもの；移植片が肝臓であるもの；移植片が腎臓であるもの。

「寛容」とは、ここで用いる場合、阻止されなければ移植片の導入に応答して生じるであろう免疫応答を開始する被移植者の能力の阻止のことをいう。寛容は、体液性、細胞性、又は体液性及び細胞性応答の両者を含んでよい。

「不調和性種の組合せ」とは、ここで用いる場合、有血管器官を移植したときに非常に鋭敏な拒絶が起きる２つの種のことをいう、一般に、不・調和性種は、異なる目からのものであり、他方、不調和性でない種は、同じ目からのものである０例えば、ラットとマウスとは不調和性でない種であり（即ち、それらのＭＨＣ抗原は実質的に同じである）、且つそれらは同じゲラ菌目のメンバーである。

「造血幹細胞」とは、ここで用いる場合、成熟骨髄細胞及び／又はリンパ様細胞に発生し得る細胞のことをいう。

「小型ブタ」とは、ここで用いる場合、部分的に同系統繁殖させた小型ブタのことをいう。

「移植片」とは、ここで用いる場合、身体の一部、器官、組織、細胞又はこれらの一部分のことをいう。

「間質組織」とは、ここで用いる場合、器官の支持組織又はマトリックスのことをいい、その機能性要素又は臓器実質から区別される。

この発明の方法は、移植においてしばしば用いられる広いスペクトルの免疫抑制剤の望ましくない副作用を回避する。薬剤例えばプレドニゾン、イムラン、ＣｙＡ、最も最近ではＦＫ５０６はすべて移植の分野に重大な影響を有する。しかしながら、これらの薬剤はすべて免疫系の非特異的抑制を引き起こし、それ故、免疫機能を完全に排除しない間に注意深く滴定して拒絶を回避しなければならない、患者は、過剰若しくは過小免疫抑制、感染の主要な合併症及び拒絶のそれぞれに対抗して、彼らの人生の残りの間長期の免疫抑制剤治療に耐えなければならない。

この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。

１監立且ｌ移植した器官（異種移植片）が異種宿主内で拒絶の前に生存する時間を長くするために下記の手順をデザインした。その器官は、任意の器官例えば肝臓、例えば腎臓１例λば心臓であってよい、２つの主要戦略は、器官潅流による天然抗体の除去及び寛容誘導用骨髄の移植である。従って、移植のための被移植者の準備は、下記の工程の何れか又はすべてを含む。好ましくは、これらを下記の順序で行なう。

第１に、ウマ抗〜ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の調製物を被移植者に静脈注射する。この抗体調製物は、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。

もし排除されなければ、成熟Ｔ細胞は、骨髄移植組織及び感作後の異種移植片自身の両者の拒絶を促進するであろう。同様に重要なことには、ＡＴＧ調製物は又ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をも排除する。ＮＫ細胞は恐らく移植された器官に何の影響も有しないが、新たに導入された骨髄を拒絶するように直ちに作用するであろう。

これまでブタＡＴＧの調製物はウマ由来のＡＴＧより低力価であったが、任意の哺乳動物宿主から得た抗−ヒトＡＴＧも文月いることが出来る（例えば、ブタにおいて生成されたＡＴＧ）、ＡＴＧは、抗−ＮＫモノクローナル抗体より優れている（何故なら、後者は、一般に、すべての宿主ＮＫ細胞に対して溶解性でないが、他方、ＡＴＧ中のポリクローナル混合物はすべての宿主ＮＫ細胞を溶解させ得るからである）、シかしながら、抗−ＮＫモノクローナル抗体を用いることは出来る。

宿主Ｔ細胞が再生される時間中に宿主胸腺中にドナー抗原が存在することは宿主Ｔ細胞を寛容化することに重要である。もしドナー造血幹細胞が宿主胸腺中に確立され得ず、宿主Ｔ細胞再生前に寛容を誘導することが出来ないならば、骨髄除去のない生活規制中で、抗−被移植者Ｔ細胞抗体の反復投与が必要であろう。宿主Ｔ細胞の連続的涸渇は、数週間にわたって必要であろう。或は、例えば、もしこのアプローチが不成功であって寛容（ドナー皮膚移植片の受容、イン・ビトロでの特定の細胞性応答低下及び体液性寛容により測定）がこれらの動物において誘導されないならば、このアプローチは宿主の胸腺摘出を含むように改変することが出来る。胸腺摘出された被移植者において、宿主Ｔ細胞は、宿主胸腺中で分化する機会を有しないが、ドナー胸腺中では分化するに違いない。もしこれが不可能であるならば、この動物は免疫生成能力についてドナー胸腺中で発生するドナーＴ細胞に依存しなければならない。免疫生成能力は、非ドナー型同種異系ドナー皮膚移植片を拒絶し及び病原体含有環境中で生存する能力によって測定することが出来る。

貧血を回避するために被移植者を牌臓摘出することも又必要であるか又は望ましいであろう。

第２に、新たに注入される骨髄細胞に場所を空けるために被移植者に低線量の照射を加える。致死量にまで達しない１００〜４００ラドの線量の全身照射に７００ラドの局所的胸腺照射を加えるとこの目的に有効であることが見出された。

第３に、ドナ一種の肝臓の血液潅流により天然の抗体を被移植者の血液から吸収する。前もって形成された天然抗体（ｎＡｂ）は、移植片拒絶の第−次作用因である。天然抗体は、異種個体の内皮細胞に結合し、第１にＩｇＭクラスのものである。これらの抗体は、異種個体ドナーの抗原への如何なる公知の以前の露出からも独立である。これらの天然抗体を生成するＢ細胞はＴ細胞非依存性である傾向があり、通常は発生中に自己抗原にさらされることによりこれらの抗原対して寛容となる。新たに発生するＢ細胞を寛容化するｔ！！溝は未知である。肝臓は、腎臓よりも一層効果的な天然抗体の吸収剤である。

骨髄除去のない手順における第４工程は、ドナーの間質組織好ましくは胎児肝、胸腺及び／又は胎児牌臓がら得た間質組織を被移植者中に好ましくは腎臓被膜中に移植することである。幹細胞の植え付は及び本質的に異なる種のバリヤーを超える造血をドナ一種からの造血間質環境を供給することによって増進する。間質マトリックスは、造血細胞とそれらの間質環境との相互作用に必要な種特異的因子例えば造血増殖因子、接着分子及びそれらのリガンドを供給する。

肝臓は胎児における主要な造血部位であるので、胎児肝も又骨髄の代りに造血幹細胞の源として働くことが出来る。胸腺は、Ｔ細胞成熟の主要部位である。各器官は、宿主に移植された各未分化幹細胞の分化を支持し得る器官特異的なマトリックスを含む、成熟胸腺を用いることは出来るが、妊娠の十分初期に得られた胎児組織はＧＶＨＤを引き起こし得る成熟Ｔリンパ球を含まないので好ましい。胎児組織は又、移植時に成熟組織より良好に生存する傾向がある。ＧＶＨＤに対する更なる用心として、胸腺間質組織を移植前に例えば１０００ラドで照射することが出来る。移植のための別法として又は付加物として、胎児肝細胞を！！濁液にて投与することが出来る。

最後に、ドナーの骨髄細胞（ＢＭＣ）又は他の造血幹細胞の源例えば胎児肝懸濁液を被移植者に注入する。ドナーのＢＭＣは、被移植者の適当な部位に向かって進み、残っている宿主細胞と共に連続的に成長し、そして増殖してキメラリンパ造血集団を形成する。この工程により、新たに生成するＢ細胞（及びそれらが生成する抗体）をドナー抗原にさらして移植組織が自己とじて認識吉れるようにする。ドナーに対する寛容は、造血幹細胞例えばＢＭＣの植え付けが達成された動物においてＴ細胞レベルでも観られる。器官移植片をかかる被移植者内に骨髄キメラを誘導した後数か月装置いた場合、ドナーに対する天然抗体は消失し、移植片は免疫系の体液性及び細胞性両者の力により受容されるであろう。このアプローチは、器官移植を造血細胞例えばＢＭＴ例えば胎児肝懸濁液の移植後十分長期間達成することを可能にするという更なる利点を有する。１４種個体ドナーの利用は、同じ動物又は遺伝的に適合する動物からの骨髄細胞及び器官を利用する可能性を与える。

これらの手順の何れも移植した器官の生存を助は得るが、最良の結果はすべての工程を組合せて用いた場合に達成される。この発明の方法を用いて同種移植片に寛容を与え（例えば、移植片ドナーと被移植者の両者がヒトである）、及び異種移植片に寛容を与λることが出来る（例えば、移植片ドナーが非ヒト動物例えばブタ例えば小型ブタであり、移植片の被移植者が霊長類例えばヒトである）。

異種間移植の場合において、移植組織のドナー及び寛容誘導用造血細胞又は潅流すべき肝臓を提供する個体は同一個体であるか又は可能な限り密接に関連しているべきである６例えば、移植組織を、高度に同血統繁殖させたドナーの個体群から引き出すことは好ましい。

１　なプロトコール小型ブタドナーからの腎臓の受容者としてのカニクイザルを準備するための下記のプロトコールにおいで、ゼロ時間を５被移植者の動脈及び静脈カニユ−レ中レ流すべき肝臓に接続し、た時点と定義する。

−１日に、市販のウマ抗−ヒト抗−胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）調製物（０１）Ｊｏｈｎ）を被移植者に注射する。

ＡＴＧは、除去しなければ寛容を誘導するために用いる骨髄細胞の拒絶を引き起こすであろう成熟′ｒ細胞及びナチュラルキラー細胞を除去する。被移植者に麻酔をかけてＩＶカテーテルを被移植者中に挿入し、モして６ｒｎｌのヘパリン化全血液を注射前に取り出す。次いで、ＡＴＧ調製物を静脈注射する（５０ｍｇ／ｋｇ）、６ｍｌのヘパリン化した全血液の試料を３０分、２４時間及び４８時間の時点で試験用に引き出す、血液試料を、ナチュラルキラー細胞活性における抗体処理の効果について分析しくＫ５６２標的において試験する）、ＦＡＣ３分析によりＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１６を含むリンパ球サブポピユレーションについて分析する。両アッセイからの予備データは、両グループの細胞がＡＴＧの投与によって除去されることを示している。もし成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞が除去されないならば、ＡＴＧをこの手順のもっと遅い時点に、器官移植の前後で再投与することが出来る。

致死量に達しない照射を被移植者に−１〜−８日に加える。照射は、被移植者の内因性ＢＭＣを十分に除去して新たに導入された外来ＢＭＣの造血を刺激するために必要である。致死量に達しない全身照射は、被移植者に対する毒性を最小にする植付けを可能にするのに十分である。被移植者のカニクイザルに両側（ＴＲＢＩコバルト遠隔放射線療法ユニットから全身照射（１５０ラド）を１０ラド／分で加えた。植付けを促進するために胸腺の局所的照射（７００ラド）も用いた。

天然抗体は、器官拒絶の第１の原因である。移植前に被移植者６循環系から天然抗体を除去するために、０日に小型ブタ肝臓を用いて下記のように天然抗体（ｎＡｂ）の手術的吸収を行なった。−９０分に、ブタドナーに麻酔をかけて標準的手術手順により肝臓を取り出す準備をする。−６０分に、被移植者のサルに麻酔をかける。周辺ＩＶカテーテルを挿入し、６　ｍ　ｌの全血液試料を引き出す、正中線切開により、腹大動脈及び大静脈を取り出す。血液採取のためのサイドボートを含むシラスティックカニユーレをこれらの血管内に挿入する。

−３０分に肝臓をイン・シｔ・ウ−（ｉｎ　５ｉｔｕ　）で色が薄くなるまで潅流し、次いで、ブタドナーから取り出して冷リンゲル乳酸塩中に置（。この肝臓をサルにおいて再ン猛流する直前まで冷却保存する。肝臓のバイオプシーを行なう、−１０分に肝臓を、暖か（なる（３７度）まで暖かいアルブミン溶液で潅流する。

０時間に、被移植者の動脈及び静脈カニユーレをドナーの肝臓の門静脈及び大静脈に接続して潅流を開始する。肝臓バイオプシーを３０分及び６０分にそれぞれ行なう。被移植者の血液試料も３０分及び６０分にそれぞれ血清用に取り出す。

６０分に肝臓をカニユーレから離し、被移植者の大血管を修復する。有害な抗体を被移植者のザルから吸収する機能を果たしてきたその肝臓を捨てる。血清用の更なる血液試料を、被移植者から、２．２４及び４８時間に引き出す。この手順をブタ肝臓の２つの順次的潅流にて実施したとき、第２の肝臓は、潅流の間中穏やかな虚血性変化の証拠を示さなかった。３０分の潅流の終りに、第２の肝臓は、大体正常な外観を呈し、２つの隣接するカニユーレ中の流入する動脈血に比べて暗い色の流出する静脈血により証明されるように、機能しているように見えた。これらの肝臓からの組織切片は正常であったが、免疫蛍光染色は内皮細胞上にＩｇＭを示した。血清試料は、天然抗体の減少を示した。

移植した器官の長期生存なＴ細胞及びＢ細胞媒介の寛容によって促進するために、ドナー骨髄細胞を被移植者に投与してキメラ骨髄を形成する。骨髄中のドナー抗原の存在は、新たに発生するＢ細胞及び新たに感作されたＴ細胞がドナーの抗原を自己として認識することを可能にし、それにより、ドナーから移植された器官に対する寛容を誘導する。ドナーのＢＭＣを安定化するために、胎児肝、胸腺及び／又は胎児牌臓の組織スライス形態のドナー間質組織を被移植者の腎臓被膜下に移植する。間質組織は、好ましくは、造血幹細胞例えばＢＭＣ若しくは胎児肝細胞懸濁液の投与と同時に又はその前に移植すキメリズムの後に、２色フローサイトメトリーを利用することが出来る。このアッセイは、モノクローナル抗体を用いて、ドナーのクラスＩ主要組織適合抗原と被移植者のクラスＩ主要組織適合抗原に対する白血球に共通の抗原とを識別する。

ＢＭＣを、更に、器官移植と同時に又はその前に、注射することが出来る。骨髄を採取し、前に記載された（　Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ等、１９８８．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４５：２ｌ−２６）　ようにして静脈注射する（７．５Ｘ１０”／ｋｇ）。天然抗体が寛容が誘導される前に再発することが見出され、これらの抗体が移植片に障害を引き起こすならば、プロトコールを改変してＢＭＴの後に体液性の寛容が器官移植の前に確立されるのに十分な時間を与えることが出来上述のアプローチを移植拒絶の問題を共同作用的に阻止するためにデザインする。腎臓を天然抗体の肝臓吸収の後に、寛容を誘導するための骨髄移植を用いないで、カニクイザルに移植した場合、腎臓機能は、腎臓の拒絶の前１〜２日間継続した。この手順の４工程（肝Ｉｌｉ！潅流による天然抗体の吸収、ＡＴＧの投与、致死量に達しない照射及び骨髄の注入、及びその後のブタ腎臓の霊長類被移植者への移ｔｆｆｌ）を実施した場合には、腎臓は拒絶の前に７日間生存した。移植した器官の拒絶にもかかわらず、被移植者は健康を維持した。

ブタ胎児肝及び胸腺間質組織を２匹の致死量に達しない照射をした５ＣＩＤマウスの腎臓被膜下に移植した場合、移植後２週間で末梢血液の白血球の２５〜５０％がドナー系統であった。胸腺を伴わずに胎児肝を受けた第３の動物においては、有意の程度のキメリズムは検出されなかった。これらの手順は如何なる化学的免疫抑制剤も使用しなかった。

１立且差上他の具体例は、後述の請求の範囲内にある。

例えば、移植される移植片は、肝臓、腎臓、心臓等の器官、骨又は骨格マトリックス等の身体の部分、皮膚、腸、内分泌腺等の組織、或は、種々の型の前駆細胞からなってよい。

この発明の方法は、他の咄乳動物被移植者（例えば、アカゲザル、ヒト）及び他の哺乳動物ドナー（例えば、霊長類、ブタ、ヒツジ、イヌ）について用いることが出来る。

この発明の詳細な説明したように組合せても、又は別々に用いてもよい。

骨髄細胞を導入する方法は、特に（１）造血幹細胞の注入と移植片の移植との間の時間間隔を増大させる；（２）注入する造血幹細胞の量を増やすか若しくは減らす；　（３）注入する造血幹細胞の数を変える；　（４）造血幹細胞の送達方法を変える；　（５）造血幹細胞の組織源を変える（例えば、胎児肝細胞懸濁液を用いることが出来る）；又は（６）造血幹細胞のドナー源を変えることによって変えることが出来る。移植片ドナーから得られる造血幹細胞が好ましいが、造血幹細胞は、他の個体又は種から得ることが出来、或は、遺伝子工学的に同血統繁殖させたドナー系統又はイン・ビトロ細胞培養から得ることが出来る。

造血幹細胞の移植のための被移植者の準備をする方法は、変えることが出来る。

例えば、被移植者には、牌臓摘出又は胸腺摘出を受けさせることが出来る。後者は、Ｊ＃髄除去のない準備生活規制の前（例えば、−１４日）に施すのが好ましい。

天然抗体の血液潅流は、（１）他の有血管器官例えば肝臓、腎臓、腸を利用することが出来る；　（２）複数の一連の器官を利用することが出来る；　（３）各器官を潅流する時間の長さを変えることが出来る；　（４）潅流される器官のドナーを変えることが出来る。被移植者の照射は、（１）致死量に達しない範囲より低い全身照射の吸収線量を変えること；　（２）異なる身体の部位を標的とすること（例えば、胸腺、牌臓）；　（３）照射の率を変えること（例えば、１０ラド／分、１５ラド／分）；又は（４）照射と造血幹細胞の移植との時間間隔を変えること；　（１〜１４日の任意の時間間隔を用いることが出来、ある場合には４〜７日の時間間隔を用いるのが有利であり得る）を利用することが出来る。

造血細胞移植前に導入する抗体を、（１）Ｔ細胞サブセット又はＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体を利用すること（例えば、Ｈｅｒｃｅｎｄ等の米国特許第４，７７２，５５２号に記載された抗−ＮＫＨｌ、）；　（２）抗−ヒトＡＴＧを他の晴乳動物宿主にて調製すること；或は（３）上述の宿主の何れかにおいて調製した抗−サルＡＴＧを利用することによって変えることが出来る。

血液潅流の別法として又は付加的方法として、過剰の造血細胞の投与によって宿主抗体を涸渇させることが出来る。

造血細胞移植例えばＢＭＴの前に導入する間質組織を、（１）胎児肝及び胸腺組織を細胞懸濁液として投与すること：　（２）胎児肝又は胸腺間質組織を何れか一方のみ投与すること；　（３）間質移植物を他の包まれた良く血管生成した部位に移植すること：又は（４）成体胸腺若しくは胎児牌臓を間質組織源として使用することによって変えることが出来る。

他の具体例は下記の請求の範囲内にある。

フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，、ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　Ｋ（７２）発明者　サイクス、メガンアメリカ合衆国　０２１２９−４２３０　マサチューセッツ、チャールストン、エイス　ストリート１９７．ナンバー３０１

Claims

【特許請求の範囲】

１．第１の不調和性種の被移植者哺乳動物における第２の種の哺乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導するために該被移植者哺乳動物に導入されるべき薬剤の製造における該第２の種の哺乳動物からの造血幹細胞の利用であって、該造血幹細胞を導入する前に該被移植者哺乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を該被移植者哺乳動物に導入する、上記の利用。
２．第１の種の被移植者哺乳動物における第２の不調和性ドナー種の哺乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導するために該被移植者哺乳動物に導入されるべき薬剤の製造における該第１の種の被移植者哺乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体の利用であって、該抗体の導入に続いて該第２の種の哺乳動物の造血幹細胞を被移植者哺乳動物に導入して該造血幹細胞が該被移植者哺乳動物中の１つの部位に向かって進心ようにする、上記の利用。
３．前記の造血幹細胞の導入のための前記の哺乳動物の準備のための薬剤の製造においてドナー種特異的な間質組織の利用を更に含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の利用。
４．前記の造血幹細胞の導入のための前記の哺乳動物の準備において前記の被移植者哺乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体の利用を更に含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の利用。
５．前記の造血幹細胞が骨髄細胞を含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の利用。
６．前記の骨髄細胞の導入のための前記の哺乳動物の準備のための薬剤の製造において前記の被移植者哺乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体の利用を更に含む、請求の範囲第５項に記載の利用。
７．前記の骨髄細胞の導入のための前記の哺乳動物の準備のための薬剤の製造におけるドナ一種特異的な間質組織の利用を更に含む、請求の範囲第５項に記載の利用。
８．第２の種の同じ哺乳動物が移植片及び造血幹細胞の両者のドナーである、請求の範囲第１項又は第２項に記載の利用。
９．前記のドナー哺乳動物がブタである、請求の範囲第１項に記載の利用。
１０．前記のブタが小型ブタである、請求の範囲第９項に記載の利用。
１１．前記の抗体が抗一ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である、請求の範囲第２項に記載の利用。
１２．前記の抗血清がウマ又はブタから得られる、請求の範囲第１１項に記載の利用。
１３．前記の被移植者哺乳動物の胸腺に低線量照射を供給する装置の製造における放射線源の利用を更に含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の利用。
１４．第２の種の哺乳動物から得た器官を血液灌流することによって前記の被移植者哺乳動物の血液から天然抗体を吸収する装置の製造における灌流装置の利用を更に含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の利用。
１５．被移植者哺乳動物における同一種のドナー哺乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導するための薬剤及び装置の製造方法であって、製薬上許容し得るキャリアー物質を哺乳動物から得た造血幹細胞と混合して該造血幹細胞が前記の被移植者哺乳動物中の１つの部位に向かって進むようにし、製薬上許容し得るキャリアー物質を前記の被移植者哺乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体と混合し、同一種の哺乳動物から得た器官を血液灌流するための灌流装置を用意し、そして被移植者哺乳動物を低線量放射線で照射して該哺乳動物の骨髄を部分的に涸渇させるための放射線源を供給することを含む、上記の方法。
１６．前記の造血幹細胞が骨髄細胞を含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。
１７．製薬上許容し得るキャリアー物質を前記の被移植者哺乳動物の成熟Ｔ細胞に結合し得る抗体と混合することを更に含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。
１８．被移植者哺乳動物の胸腺を照射するための放射線源を供給することを更に含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。
１９．第１の不調和性種の被移植者哺乳動物における第２の種の哺乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導するための薬剤の製造における前記の第２の種の哺乳動物の霊長類ドナー種特異的な間質組織の利用であって、間質組織に加えて、前記の第２の種の造血幹細胞及び被移植者哺乳動物のナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を該被移植者哺乳動物に導入する、上記の利用。
２０．前記の造血幹細胞が骨髄細胞を含む、請求の範囲第１９項に記載の利用。
２１．前記の被移植者哺乳動物に導入するための移植片の準備において、前記の造血幹細胞ではなくて前記の哺乳動物の異なる器官から得た組織の利用を更に含む、請求の範囲第２０項に記載の利用。
２２．前記の間質組織が胎児肝である、請求の範囲第２０項に記載の利用。
２３．前記の間質組織が胸腺である、請求の範囲第２０項に記載の利用。
２４．前記の移植片が肝臓である、請求の範囲第２１項に記載の利用。
２５．前記の移植片が腎臓である、請求の範囲第２１項に記載の利用。
２６．霊長類における第２の種の哺乳動物から得た移植片に対する寛容を誘導するために該霊長類に導入されるべき薬剤の製造におけるドナー種特異的な造血間質組織の利用であって、更に、霊長類に第２の種の霊長類骨髄細胞を導入して該骨髄細胞が該霊長類中の１つの部位に向かって進むようにし、且つ該第２の種の哺乳動物から得た移植片を該霊長類に導入する、上記の利用。