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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
eines nicht humanen Säugetierorgans,
das ein Kompositgewebeimplantat umfasst, zur Verwendung bei einer
Organtransplantation und auf Verfahren zur Erzielung eines hämatopoetischen
Chimärismus
und einer stabilen spenderspezifischen Immuntoleranz bei einem Säuger als Transplantatempfänger.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Induktion einer spenderspezifischen Immuntoleranz bleibt immer noch
ein exklusives Ziel der die Allotransplantation und Xenotransplantation betreffenden
Forschung. Unter einer Immuntoleranz wird der Zustand der immunologischen
Nichtreaktivität – Fehlen
einer Immunantwort – eines
Patienten gegen ein Antigen verstanden, wofür eine Toleranz induziert worden
ist. Bei der Einsetzung eines Transplantats bezieht sich dieser
Ausdruck auf die Hemmung der Fähigkeit
des Empfängers
des Transplantats, eine Immunantwort aufzubauen, zu der es sonst als
Antwort auf die Einführung
eines nicht eigenen MHC Antigens (MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex)
durch das Transplantat in den Empfänger kommen würde.
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Neuere
Studien haben sich auf Thymustransplantate als Mittel zur Entwicklung
einer Immuntoleranz beim Transplantatempfänger, nämlich beim Wirt, konzentriert.
So haben beispielsweise Nikolic und Mitarbeiter gezeigt, dass Schweinethymustransplantate
in immundefizienten Mäusen
eine normale Entwicklung polyklonaler funktionaler humaner T Zellen
unterstützen
und dass die T Zellen dann eine spezifische Toleranz gegen spenderspezifische
MHC Antigene aufweisen; Journal of Immunology, Band 162, Seiten
3402 bis 3407 (1999). Zhao und Mitarbeiter haben berichtet, dass
eine Transplantation von fötalem
Schweinethymus und von Leber auf eine transient immunsupprimierte
Maus zu einer Toleranz der Empfängermaus
gegen eine anschließende
Transplantation von Schweinehaut führt; Nature Medicine, Band
2, Seiten 1211 bis 1216 (1996).
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Von
Lambrigts und Mitarbeitern wurde das Konzept eines Thymoorgans eingeführt, das
autologe Thymustransplantationen unter die Nierenkapsel oder in
das Herz eines Schweinemodells umfasst [Lambrigts et al., Xenotransplantation
3, 296 (1996)], wobei auch über
den Erhalt eines stabilen Intrakardialtransplantats des Thymusgewebes
in ein später transplantiertes
Herz berichtet wurde [Lambrigts et al., Xenotransplantation 66,
810 (1998)]. Yamada und Mitarbeiter berichteten, dass in einem Miniaturschweinemodell
thymektomierte disparate Empfänger
der Klasse I eines allogenen Thymonierekomposits (Niere mit vaskularisiertem
autologen Thymusgewebe unter ihrer Kapsel), die während einer
Zeitdauer von 12 Tagen Cyclosporin erhielten, eine stabile Nierenfunktion
ohne Anzeichen einer Abstoßung
und ein spenderspezifisches Fehlen einer Immunantwort zeigten. Am
postoperativen Tag (POD) 14 enthielt das Thymusgewebe in der Thymoniere
dendritische Zeilen vom Typ des Empfängers, und am POD 60 erschienen
in der Thymusmedulla bezüglich
der Klasse I positive Thymozyten vom Typ des Empfängers, was auf
eine Thymopoese hinweist. Die T Zellen haben sich sowohl als Empfänger als
auch als Spender MHC restriktiert erwiesen. Daraus wurde von Yamada
und Mitarbeitern geschlossen, dass die Anwesenheit von vaskularisiertem
Spenderthymusgewebe zur Induktion einer Toleranz gegen Klasse I
disparate Nierenallotransplantate bei thymektomierten Empfängern fähig ist
[Yamada et al., Journal of Immunology 164, 3079 bis 3086 (2000);
Yamada et al., Transplantation 68, 1684 bis 1692 (1999), siehe auch Sachs,
Clinical Immunology 95, S63 bis S68 (2000)].
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Es
wird jedoch angenommen, dass das früher beschriebene Thymoorgan
ungeeignet ist zur Aufrechterhaltung einer langzeitig stabilen Immuntoleranz
nach Einbau eines allogenen oder eines xenogenen Transplantats.
Eine der wesentlichen Funktionen des implantierten Thymusgewebes
ist vor allem die Schaffung einer Stelle für eine negative Selektion sich
entwickelnder Thymozyten zur Selbsttoleranz durch dendritische Zellen.
Beim bisher beschriebenen Thymoorganmodell wird diese Funktion schließlich durch
die irreversible Depletion an vom Spender abgeleiteten dendritischen
Zellen des Implantatgewebes kompromittiert. Dendritische Zellen
haben im allgemeinen eine Halbwertszeit von etwa einem Monat oder
weniger. Im Laufe der Zeit geht daher die Fähigkeit zur negativen Selektion
sich entwickelnder Thymozyten zur Aufrechterhaltung einer Toleranz
gegen den Spender verloren.
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Derzeit
gibt es keine Berichte über
Mittel zur Aufrechterhaltung einer Produktion und Verfügbarkeit
dendritischer Zellen oder ihrer Vorläufer bei einem Thymoorgan.
Die scheinbare Toleranz, welche von den Forschern auf diesem Gebiet
erreicht worden ist, muss daher im besten Fall nur transient gewesen
sein.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
wurde nun ein neuer Aufbau und ein neues Mittel geschaffen zur Erzielung
eines hämatopoetischen
Chimärismus
in einem Transplantatempfänger
und zur Induktion einer stabilen Langzeittoleranz in einem Säugetierempfänger eines
allogenen oder xenogenen nicht humanen transplantierten Organs. Spezieller
bezieht sich die Erfindung auf eine Implantation in das Empfängerorgan
einer neuen und sich selbst ergänzenden
Quelle für
hämatopoetische Spenderzellen
(oder histokompatible Spendenzellen), zu denen dendritische Zellen
oder ihre Vorläufer gehören. Diese
neue Quelle umfasst die im wesentlichen intakte hämatopoetische
Stromamikroumgebung (HSM) des Knochenmarks. Ein Beispiel für eine im
wesentlichen intakte HSM umfasst einen intakten Knochenmarkpfropf
oder Knochenmarkzylinder, vorzugsweise in einer Größenordnung
von 1 bis 5 mm3, der chirurgisch aus dem
Knochenmark eines nicht humanen Säugetierspenders entfernt worden
ist. Im Unterschied zu typischen injizierbaren Knochenmarkpräparationen,
die im wesentlichen bestehen aus einem Stammzellinokulum in einem
ansonsten nicht funktionalen Detritus an zerstörten Geweben und Zellen, sorgt
die neue und im wesentlichen intakte HSM Komponente der Erfindung
für eine
Mikroumgebung, die eine fortgesetzte Hämatopoese im Thymoorganpfropf
begünstigt.
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Insbesondere
ist erfindungsgemäß erkannt worden,
dass ein Kompositgewebekonstrukt, das als erste Komponente ein Spenderthymusgewebe
(oder ein mit dem Spender histokompatibles Gewebe) und als zweite
Komponente ein im wesentlichen intaktes Gewebe der hämatopoetischen
Stromamikroumgebung (HSM) eines Spenderknochenmarks (oder eines
mit dem Spender histokompatiblen Knochenmarks) umfasst, für eine de
novo und kontinuierliche Produktion an nicht humanen dendritischen
Zellen vom Typ des Spenders im Transplantatempfänger sorgt. Ferner sorgt ein
solches vaskularisiertes Kompositgewebekonstrukt für eine anhaltende
sich selbst ergänzende
Quelle für
spendertypische dendritische und andere von Knochenmark abgeleitete
Zellen, welche befähigt
sind zur Migration zum Spenderthymusgewebe und zur Unterstützung einer
Differenzierung und Entwicklung von Thymozyten.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird ein Thymoknochenmarkkompositorgan, das alternativ
hierin auch als ein Thymarkkompositorgan bezeichnet wird, ex vivo
hergestellt und das soeben beschriebene Kompositgewebekonstrukt als
eine einheitliche Vorrichtung in das Spenderorgan implantiert.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung kann ein Thymarkkompositorgan auch ex vivo hergestellt
werden durch eine separate Implantation der oben beschriebenen Thymusgewebekomponente
und HSM Komponente von Knochenmark in das Organ.
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Die
an T Zellen depletierten oder sonst wie konditionierten Empfänger eines
solchen Thymarkkompositorgans werden vom Organ toleriert, da die sich
regenerierende T Zellpopulation des Wirts heranreift (durch positive
und negative Selektion) in der Gegenwart einer anhaltenden Produktion
dendritischer Zellen des Spenders, die von Knochenmark deriviert
sind.
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Die
entstehenden gemischten Chimären sind
immunkompetent und auch immuntolerant gegen sich selbst und auch
gegen den Spender. Eine Langzeittoleranz ist möglich, da die Erfindung für eine kontinuierliche
Ergänzung
an dendritischen Zellen sorgt, was die kontinuierliche Funktionalität der thymischen
oder peripheren negativen Selektion oder des anergischen Prozesses
innerhalb des Empfängers
sichert und somit auch den sich selbst fortsetzenden Zustand einer
spenderspezifischen Toleranz gegen das Transplantat. Die Erfindung
sorgt daher für
ein Mittel zur Sicherung einer langzeitig stabilen Toleranz gegen
transplantierte Gewebe oder Organe unter Fehlen von Abstoßungen oder
aberranten Autoimmunantworten durch im Wesentlichen Bereitstellung
einer transplantierbaren und tragbaren Maschine für eine Toleranz
im Kompositgewebekonstrukt der Erfindung.
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Das
Thymarkkompositorgan der Erfindung kann verwendet werden zur Induktion
einer Toleranz bei einem Säugetiertransplantatempfänger eines
allogenen Organs, nämlich
eines Organs der gleichen Spezies, oder eines xenogenen Organs,
nämlich
eines Organs einer unterschiedlichen Spezies. Das erfindungsgemäße Kompositorgan
eignet sich besonders zur Erzeugung eines hämatopoetischen Chimärismus und
zur Induktion einer Toleranz bei einem Xenotransplantatempfänger, insbesondere
einem humanen Empfänger
eines nicht humanen Säugerorgans,
vor allem Sus scrofa, nämlich
dem Schwein.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen, worin zeigen:
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1 eine
schematische Ansicht einer Ausführungsform
einer tragbaren Maschine zur Toleranzinduktion nach der Erfindung.
Das gezeigte Kompositgewebekonstrukt umfasst ein Mischmasch aus Sektionen
von Thymusgewebe und Knochenmarkgewebe innerhalb eines Stützmittels,
das von einem Abschnitt eines Intestinalsacks (linkes Bild) stammt. Ebenfalls
schematisch dargestellt (rechtes Bild) ist das Netzwerk an Blutgefäßen, welche
das vaskularisierte Komposit mit dem umgebenden Gewebe seines Säugerwirts
verbinden.
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2 eine
schematische Darstellung eines Komposits einer Knochenmarkniere,
einer Thymoniere und einer Thymoknochenmarkniere (auch als Thymarkniere
bezeichnet) ex vivo nach der Erfindung.
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3 eine
makroskopische Abbildung einer Nierenkapsel einer Maus, die eine
ektotopische Implantation von syngenem Knochenmarkstroma (linkes Bild)
oder nur Knochenmark enthält,
das unter die Nierenkapsel implantiert ist (rechtes Bild) ex vivo
(der Pfeil zeigt das Stroma des Knochenmarks und die Niere). Fünf Wochen
post Transplantation (Tx) hat sich um die Implantationsstelle des
BM (Knochenmarks) herum eine extensive Angiogenese gebildet, die
das Knochenmark als weißes
Gewebe erscheinen lässt.
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4 im
linken Bild eine weitere makroskopische Abbildung einer Nierenkapsel
der Maus, wie sie im Zusammenhang mit der 3 beschrieben worden
ist, und im rechten Bild eine Fotomikrografie eines Querschnitts
des Stromaimplantats von Knochenmark 5 Wochen post Transplantation
von regeneriertem, nämlich
von Blut durchströmtem
Knochenmark (20-fache Vergrößerung,
Anfärbung
mit H und E).
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5 im
linken Bild eine 10-fach vergrößerte Fotomikrografie
und im rechten Bild eine 40-fach vergrößerte Fotomikrografie einer
Sektion von xenogenem Knochenmark (Nacktratte → RAG 1 Maus), das ektopisch
unter die Nirenkapsel einer Maus implantiert worden ist, zum Zeitpunkt
4 Wochen post Transplantation (Tx) (Anfärbung mit H und E).
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6 20-fach
vergrößerte Fotomikrografien von
Sektionen eines xenogenen Knochenmarks (Nacktratte → RAG1 Maus),
das ektopisch unter die Nierenkapsel einer Maus implantiert worden
ist, zu den Zeitpunkten 8 Wochen (linke Abbildung) und 16 Wochen
Tx (rechte Abbildung) (Anfärbung
mit H und E).
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7 im
linken Bild eine 10-fach vergrößerte Fotomikrografie
und im rechten Bild eine 20-fach vergrößerte Fotomikrografie von syngenem
Knochenmarkgewebe und Thymusgewebe, welches ektopisch unter die
Nierenkapsel am Mausmodell implantiert worden ist (Anfärbung mit
H und E), zum Zeitpunkt 4 Wochen Tx (Anfärbung mit H und E).
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8 Fotomikrografien
einer mit H und E angefärbten
Sektion (linkes Bild) und einer immunohistochemisch angefärbten Sektion
(auf CD 45 positive Leukozyten) (rechtes Bild) eines xenogenen Knochenmarks
(Ratte → Maus),
das ektopisch unter eine Nierenkapsel implantiert worden ist, wobei
die Pfeile einmal zum Knochenmarkimplantat (linkes Bild) und zum
anderen Mal auf CD 45 positive Leukozyten im Knochenmarkimplantat
(rechtes Bild) gerichtet sind.
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9 Fotomikrografien
von Anti-Maus → Ratte
CD 45 angefärbten
Sektionen (linkes Bild) und von Anti-Ratte → Maus CD 45 angefärbten Sektionen (rechtes
Bild) der Milz einer Maus, welche das Fehlen einer Kreuzreaktivität bestätigen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Das
eine Toleranz induzierende Kompositgewebekonstrukt umfasst ein funktionales
Thymusgewebe und eine im wesentlichen intakte hämatopoetische Stromamikroumgebung
(HSM) des Knochenmarks.
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Wesentlich
ist dabei, dass die Thymusgewebekomponente des Kompositgewebekonstrukts
der Erfindung eine sequestierte und architektonisch organisierte
Mikroumgebung liefert, die zur Entwicklung reifer T Zellen aus einfachen
Thymozyten beiträgt.
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Maturation
von T Zellen im Thymus
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Das
Verfahren zur Maturation von T Lymphozyten über die Thymozytenstufe unter
Bildung reifer T Zellen ist ausreichend charakterisiert worden [s. beispielsweise
Charles A. Janeway und Paul Travers, Immunobiology, The Immune System
in Health and Disease, 2. Auflage, 6. Kapitel, Current Biology Ltd./Garland
Publishing Inc. (1996). Kurz gesagt, werden dabei T Lymphozyten
gebildet durch Differenzierung von Lymphoidvorläufern im hämatopoetischen Stroma durch
Wanderung von Knochenmark zur Peripherie und schließlich zum
Thymus, wo die Zellen verschiedenen Stufen einer Differenzierung und
Selektion unterzogen werden, und zwar vorwiegend im Cortex (die
Medulla enthält
im allgemeinen nur reife T Zellen). Dabei treten die Lymphozyten
zuerst als doppelt negative Zellen in den Thymus ein, welche weder
den T Zellrezeptor noch eines der beiden Corezeptormoleküle CD4 und
CD8 exprimieren, und werden in ein epitheliales Netzwerk eingebettet, das
als Thymusstroma bekannt ist, welches für eine induktive Mikroumgebung
zur Differenzierung und Entwicklung sorgt. Nach einer Initialphase
der Proliferation in der subkapsularen Zone des Cortex differenzieren
die Lymphozyten (die auch als subkortikale Lymphoblasten bezeichnet
werden) zu doppelt positiven Zellen unter Expression des T Zellrezeptors
und der beiden Corezeptoren CD4 und CD8. Die dabei entstehenden
unreifen Thymozyten (kortikale Thymozyten) unterliegen dann zwei
Arten einer Selektion, nämlich
einer positiven Selektion zur Erkennung von eigenem MHC: eigenen
Peptidkomplexen und einer negativen Selektion zur Erkennung von
eigenen Peptidkomplexen: eigenem MHC, was sonst die T Zellen in
der Peripherie triggern würde.
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Positive Selektion von
Thymozyten
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Eine
positive Selektion von Thymozyten wird normalerweise im Kortex mediiert
durch MHC tragende kortikale Epithelzellen. Eine solche positive
Selektion stellt sicher, dass alle reifen T Zellen die Fähigkeit
besitzen, auf fremde Peptide zu antworten, welche durch eigene MHC
präsentiert
werden, nämlich, dass
die reifen T Zellen eigene MHC restriktierte Zellen sind. Zellen,
die nicht mit ihren restciktierenden MHC Molekülen auf dem Thymusepithel zusammentreffen,
bleiben doppelt positiv und sterben im Thymus innerhalb von 3 oder
4 Tagen nach ihrer letzten Teilung, so dass sie von Makrophagen
eingefangen werden.
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Thymozyten,
die das positive Selektionsverfahren überleben, exprimieren nur einen
der beiden Corezeptoren, nämlich
CD4 oder CD8. Zusätzlich haben
reife CD4 tragende T Zellen Rezeptoren, welche Peptide erkennen
können,
die an eigene MHC Moleküle
der Klasse II gebunden sind, während
die CD8 tragenden T Zellen Rezeptoren aufweisen, welche Peptide
erkennen können,
die an eigene MHC Moleküle
der Klasse I gebunden sind. Somit bestimmt eine positive Selektion
auch den Phänotyp der
Zelloberfläche
der reifen T Zelle durch deren Ausrüstung mit einem Corezeptor,
der für
eine effiziente Erkennung von Antigenen erforderlich ist.
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Negative Selektion von
Thymozyten
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Die
doppelt positiven Zellen müssen
auch einem Spülverfahren
unterzogen werden, durch welches potentiell selbst reaktive T Zellen
eliminiert werden. Die Spülfunktion
des Thymus wird als negative Selektion bezeichnet. Eine negative
Selektion dürfte an
der kortikomedullaren Verbindung am stringentesten sein, wo nahezu
reife medullare Thymozyten Antigen präsentierenden Zellen (APC) begegnen,
die auch zu einer Aktivierung reifer T Zellen in den peripheren
Lymphoidgeweben führen.
Die APC sind umfasst von von Knochenmark abgeleiteten dendritischen
(interdigitierenden) Zellen und auch von Makrophagen. Die durch
diese Zellen präsentierten
eigenen Antigene sind daher die wichtigste Quelle für potentielle
Autoimmunantworten, so dass T Zellen, die auf solche eigene Peptide
antworten, im Thymus eliminiert werden müssen. Eine klonale Deletion durch
den Komplex von eigenem Peptid: eigenem MHC erzeugt ein Repertoire
an reifen T Zellen, das nicht auf die eigenen Antigene reagiert,
die durch ihre eigenen APC exprimiert werden, so dass sich eine Eigentoleranz
ergibt. Die überlebenden
reifen T Zellen entweichen aus der Medulla in den peripheren Kreislauf
[s. Janeway und Travers, id. oben, 6:15 bis 6:31 J.
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Somit
sind sowohl eine positive als auch eine negative Selektion erforderliche
konkomittierende Umstände
zur Erzeugung eines brauchbaren und nicht schädigenden Repertoires an T Zellrezeptoren.
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Unter
einem funktionalen Thymusgewebe wird daher ein Gewebe des Thymus
verstanden, das eine Mikroumgebung hat, die zur Prozessierung naiver
einfacher Thymozyten zum Stadium reifer T Zellen in einem Säuger befähigt ist.
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Die
Thymuskomponente des erfindungsgemäßen Kompositorgans sollte daher
zwecks Begründung
eines funktionalen Thymusgewebes insbesondere eine solche Menge
an Thymusstroma unter Einschluss kortikaler Epithelzellen und medullarer
Epithelzellen enthalten, dass hierdurch eine positive und negative
Selektion von Thymozyten unter Bildung reifer T Zellen unterstützt wird,
die über
eine Spendereigenerkennung und eine Spendereigentoleranz verfügen.
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Der
Thymus neigt zu einer Schrumpfung und Einrollung nach der Pubertät, so dass
es in der Praxis schwierig oder sogar unmöglich sein kann, von einem
erwachsenen Organspender ausreichendendes oder funktionierendes
autologes Thymusgewebe zu bekommen. Bei einer Ausführungsform
der Erfindung stammt das Thymusgewebe daher von einem Tier, das
mit dem Organspender histokompatibel ist. Ein Beispiel für ein histokompatibles
Tier ist ein Säuger
des gleichen Inzuchtstamms wie der Organspender. Thymusgewebe kann
daher von einem jungen (oder wahlweise auch neonatalen oder fötalen) Spenderschwein
geerntet und in ein Organ eines erwachsenen Schweineorganspenders
mit identischem Inzuchtstamm implantiert werden.
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Unter
einer Implantation oder Transplantation oder einer Pfropfung wird
hierin eine Insertion eines Gewebes oder eines Organs in einen lebenden Säugerempfänger unter
Bedingungen verstanden, die eine Vaskularisierung des Gewebes oder
Organs ermöglichen,
wobei sich die dazu analogen Begriffe Implantat, Transplantat oder
Pfropf auch auf das so insertierfe Gewebe oder Organ beziehen sollen, nämlich ein
implantiertes oder transplantiertes oder gepfropftes Gewebe oder
Organ. Zu Bedingungen, die ein Vaskularisation eines Pfropfs in
einem Säuger begünstigen,
gehören
ein lokalisiertes Gewebebett an der Stelle des Pfropfs, die über eine
extensives Netzwerk zur Blutversorgung verfügt. Ein Beispiel für eine geeignete
Stelle in der Niere zur Insertion eines Gewebes oder Organs zwecks
Förderung
einer Vaskularisation ist unter die Nierenkapsel an das Parenchym
angrenzend. Geeignete Stellen am Herzen zur Insertion eines Gewebes
oder Organs zwecks Förderung
einer Vaskularisation sind die subepikardialen Fettpolster, welche
die rechten und linken Atrioventrikularfurchen überlagern, die rechten und
linken Atrialanhänge,
das Aortopulmonarfenster oder die freie Wand des rechten Ventrikels.
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Eine
chirurgische Entfernung des Thymus oder eines Teils hiervon vom
Thymusspender sollte so sorgfältig
erfolgen, dass die Integrität
der Stromamikroumgebung des Thymus erhalten bleibt. Das Thymusgewebe
kann von seiner nativen Umgebung durch sorgfältige Dissektion entfernt werden.
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Die
zweite Komponente des Kompositgewebekonstrukts der Erfindung umfasst
eine funktionale hämatopoetische
Stromamikroumgebung (HSM) des Knochenmarks. Die HSM sollte histokompatibel
sein mit der Thymusgewebekomponente und auch mit dem Organspender.
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Unter
einer funktionalen hämatopoetischen Stromamikroumgebung
wird ein Gewebe verstanden, das von Knochenmark erhalten worden
ist und eine Mikroumgebung aufweist, die eine hämatopoetische Entwicklung und
Differenzierung in einem Säuger
bewirken kann.
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Hämatopoetische
Stromamikroumgebung
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Der
Prozess, durch welchen T Lymphozyten im Knochenmark als Ergebnis
der Differenzierung lymphoider Vorläuferzellen gebildet werden,
welche von totipotenten hämatopoetischen
Stammzellen abgeleitet sind, ist intensiv untersucht worden. Die
Stromazellen beinhalten Endothelzellen, welche die Sinusse des Knochenmarks
bilden, und retikuläre
Adventialzellen, die über
Charakteristiken verfügen, welche
mit Adipozyten, Fibroblasten und Muskelzellen konsistent sind [Chabord
et al., Blood 66:1138 (1985), Chabord et al., Exp. Hemtaol., 18:276 (1990)].
Es bereits seit langer Zeit anerkannt, dass Stromazellen im Knochenmark
das Strukturgerüst
für eine
Hämatopoese
bilden [Mayani et al. Eur. J. Hatmat. 49:225 bis 233 (1992)]. Bestimmte
Studien haben gezeigt, dass ein direkter Kontakt zwischen Stromazellen
und Blutzellen, eine Stromazellenproduktion durch die extrazellulare
Knochenmarkmatrix und eine Zytokinsynthese durch Stromazellen insgesamt relevant
sind für
die Bildung verschiedener Blutzellen [s.
US 5 733 541 A , welche hiermit
eingeführt
wird]. Ein direkter Kontakt mit den Stromazellen ist auch als notwendig
erkannt worden, um Stammzellen langzeitig in einer Knochenmarkkultur
aufrecht erhalten zu können
[Dexter et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 3:432 bis 441 (1987)). Es
sind auch bereits Stromazelllinien von menschlichem Knochenmark
etabliert worden, die einer Hämatopoese
widerstehen [s. beispielsweise
US 5 879 940 A , welche hierdurch ebenfalls
eingeführt
ist]. Ferner ist berichtet worden, dass Stromazellen befähigt sind
zur Übertragung
der hämatopoetischen
Mikroumgebung des Spenders nach einer allogenen Knochenmarktransplantation.
Gurevitch und Mitarbeiter haben über
Daten berichtet, die nahe legen, dass eine Transplantation von Spenderknochenmark
in der hämatopoetischen
Stromamikroumgebung zu einer Erhöhung
des Chimärismus
der Donorzellen und zur Schaffung von Bedingungen für ein langzeitiges Überleben
sowohl allogener als auch xenogener Pfropfe beitragen kann [Transplantation 68:1362
bis 1368 (1999)].
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Die
hämatopoetische
Stromakomponente des Thymarkkompositorgans der Erfindung muss für eine ausreichend
intakte Mikroumgebung sorgen, so dass eine hämatopoetische Entwicklung aufrechterhalten
bleibt, sobald das Gewebe im Empfänger revaskularisiert ist.
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Eine
chirurgische Entfernung von Knochenmark kann daher unter Anwendung
wohlbekannter chirurgischer Techniken durchgeführt werden, durch welche die
Integrität
der hämatopoetischen
Stromamikroumgebung des Knochenmarks beibehalten wird. Zu hierfür geeigneten
Quellen für
Knochenmark gehören
die Oberschenkelknochen (Femora) und die Unterschenkelknochen (Tibia).
So lässt
sich beispielsweise Knochenmark mechanisch aus dem Femoralkanal
durch einen Mandrin oder Trokar unter Bildung von Pfropfen herauspressen,
in denen die HSM praktisch intakt bleibt.
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Alternativ
können
auch gezüchtete
hämatopoetische
Stromazellkulturen, wie sie in der Literatur beschrieben werden
(s. beispielsweise
US
5 879 940 A , welche hiermit eingeführt wird), verwendet werden,
um für
die erforderliche hämatopoetische
Stromamikroumgebung zu sorgen.
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Vorzugsweise
sind die Thymusgewebekomponente und die Knochenmarkkomponente jeweils bestrahlt,
um die Anzahl an hämatopoetischen
Vorläufern
(Progenitoren) zu erniedrigen. Eine solche Bestrahlung kann durchgeführt werden
in vivo, nämlich
vor einer Entfernung (im Fall eines nicht humanen Säugerspenders)
und/oder ex vivo, nämlich nach
einer Entfernung und vor einer Implantation in einen Empfänger und/oder
nach einer Reimplantation in einen nicht humanen Empfänger.
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Das
Knochenmark kann entweder vom Spendersäuger, der für ein Organ zur Transplantation
sorgt, oder von einem histokompatiblen Individuum (beispielsweise
vom gleichen Inzuchtstamm) geerntet werden.
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Zur
Herstellung eines erfindungsgemäßen Kompositorgans
ist es wesentlich, dass das Thymusgewebe und das Knochenmarkgewebe
innerhalb des Gewebekonstrukts oder Organs in inniger Assoziation
ex vivo angeordnet wird.
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Unter
einer solchen innigen Assoziation wird verstanden, dass die zwei
Gewebearten so ausreichend benachbart angeordnet sind, dass vom
Knochenmarkgewebe freigegebene hämatopoetische Zellen
(beispielsweise dendritische Zellen oder ihre Vorläufer) zu
einer Migration zum Thymusgewebe fähig sind.
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Die
innige Assoziation, nämlich
die enge physikalische Positionierung, der beiden Gewebearten ist
ein essentieller Faktor zur Erzielung einer Toleranzinduktion, da
eine solche innige Assoziation für einen Übergang
dendritischer Zellvorläufer
vom HSM Knochenmark zum Thymusgewebe erforderlich ist, wo die dendritischen
Zellen bei der deletionalen Selektion von Thymozyten zur Aufrechterhaltung
einer eigenen Toleranz des Pfropfs eine Rolle spielen. Eine solche
Migration kann erfolgen durch Gewebeparenchym entlang chemotaktischer
Gradienten oder durch einen Eintritt in die Blutzirkulation und/oder
das Lymphgefäßsystem.
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Es
ist besonders bevorzugt, dass wenigstens ein Teil der Thymusgewebekomponente
und der Knochenmarkgewebekomponente in direktem Kontakt miteinander
stehen. Die Oberfläche
des Direktkontakts kann optimiert werden durch Aufteilung des verfügbaren Thymusgewebes
und Knochenmarkgewebes in Anteile und durch gemeinsame Vermischung
einer Vielzahl der kombinierten Gewebeanteile im Gewebekompositkonstrukt
oder Organ der Erfindung ex vivo. Alternativ dazu können Knochenmarkpfropfe
auch ex vivo auf dem Thymuspfropfgewebe deponiert werden, wie dies
schematisch in der 2 gezeigt ist.
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Zur
Aufrechterhaltung einer strukturellen Integrität des Komposits und auch zur
Erleichterung einer innigen Assoziation der Gewebe ist es vorteilhaft, die
Gewebe mit einem biokompatiblen permeablen oder semipermeablen membranartigen
Material zu umgeben, das eine Vaskularisation der eingeschlossenen
Gewebe erlaubt. Ein solches Material kann bequemerweise beispielsweise
vom Intestinalsack des Gewebespenders genommen werden.
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Das
Kompositgewebekonstrukt umfasst daher miteinander vermischte Sektionen
oder Pfropfe aus Thymusgewebe und HSM Gewebe des Knochenmarks, was
alles umgeben ist von einem vom Intestinalsack stammenden Stützmittel.
Ein solches Kompositgewebekonstrukt ist in der 1 gezeigt.
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Nach
erfolgter Herstellung kann dieses Kompositgewebekonstrukt, worin
die Gewebe in vermischter Form coexistieren, chirurgisch in ein
vaskularisiertes transplantierbares Organ implantiert werden, wie
eine Niere oder ein Herz oder sonst wo in einen vorselektierten
Organspender.
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Selbstverständlich erleidet
das Kompositgewebekonstrukt nach Implantation in einen Säuger anfänglich wenigstens
ein gewisses Ausmaß an
Atrophie und Zellverlust. In einer an Blut reichen Wirtsum gebung
wird das implantierte Gewebe aber rasch durch den Wirt revaskularisiert
(wie dies im rechten Bild der 1 gezeigt
ist), so dass die Gewebe wieder ihre normale Funktion aufnehmen.
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Es
kann aber notwendig sein, den Transplantatpatienten während einer
definierten Zeitdauer nach erfolgter Transplantation einer Behandlung
mit einem herkömmlichen
Immunsuppressivum zu unterziehen, nämlich beispielsweise bis zu
+120 Tagen, oder vorzugsweise bis zu etwa +90 Tagen, wie +30 Tagen.
Zu Beispielen für
hierzu geeignete Verbindungen gehören Cyclosporine, Rapamycine
oder Ascomycine oder deren immunsuppressive Analoga, wie Cyclosporin
A, Cyclosporin G, FK-506, Rapamycin oder 40-O-(2-Hydroxy)ethylrapamycin,
oder auch Corticosteroide, Cyclophosphamid, Azathiopren, Methotrexat,
Brequinar, Leflunomid, Mizoribin, Mycophenolsäure, Mycophenolatmofetil (MMF),
Deoxyspergualine, wie 15-Deoxyspergualin, und Analoga hiervon, 2-Amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propan-1,3-diolhydrochlorid,
Corticosteroide, wie Methotrexat, Prednisolon, Methylprednisolon
oder Dexamethason, oder sonstige immunmodulatorische Verbindungen,
wie CTLA4-Ig, oder Anti-LFA-1 oder Anti-ICAM Antikörper oder
Antikörper
für Leukozytenrezeptoren
oder deren Liganden, wie Antikörper für MHC, CD2,
CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD40, CD45, CD58, CD152 (CTLA-4)
oder CD154 (CD40 Ligand).
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Das
Kompositgewebekonstrukt, welches Thymogewebe und HSM Gewebe vom
Knochenmark umfasst, kann chirurgisch direkt in ein vorselektiertes
Organ eines Spendertiers, beispielsweise eines Schweins, implantiert
werden, um es schließlich in
einen Säugerempfänger, wie
einen Menschen, zu transplantieren. Alternativ aber weniger bevorzugt als
eine erste Herstellung eines Kompositgewebekonstrukts ist es auch
möglich,
jede Thymusgewebekomponente und jede HSM Knochenmarkgewebekomponente
als diskrete Komponente in das Organ zu implantieren und so ein
erfindungsgemäßes Kompositorgan
zu bilden.
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Das
entstandene Organ, welches die gepfropften Gewebe in inniger Assoziation
und vorzugsweise in einer Kontaktbeziehung enthält, wird als Kompositorgan
von Thymoknochenmark (oder Thymark) bezeichnet. Das vorselektierte
Organ kann beispielsweise eine Niere, ein Herz, eine Lunge oder eine
Kombination aus Herz und Lunge, Leber oder Pankreas sein. Eine Ausführungsform
für eine
Thymoknochenmarkniere (Thymarkniere) ist schematisch in der 2 gezeigt.
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Die
Implantation der Thymogewebe und Knochenmarkgewebe kann ex vivo
durchgeführt werden,
nämlich
nach der Entfernung des Organs vom Spender und vor deren Implantation
in den Empfänger.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung kann man die diskreten Thymogewebe und HSM Knochenmarkgewebe
oder das Kompositgewebekonstrukt auch in den vorgesehenen Organspender
an einer anderen geeigneten und von Blut durchströmten Stelle
implantieren und nicht gleich zu Anfang in das zu transplantierende
Organ. Dieses Kompositgewebekonstrukt kann dann zu einer späteren Zeit
bis zur Zeit einer Transplantation in das selektierte Organ übertragen
werden.
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Optional
kann einer Transplantation des Gewebekompositkonstrukts oder des
Thymoknochenmarkkompositorgans der Erfindung auch eine Vorkonditionierung
des Empfängers
zur Depletion reifer T Zellen vorausgehen. Eine solche Vorkonditionierung
kann beispielsweise durchgeführt
werden durch Bestrahlung des Patienten oder Verabreichung eines ausreichenden
Immunotoxins an den Patienten, wie dies beispielsweise beschrieben
ist in WO 98 39 363 A1, um hierdurch die Population an T Zellen
des Patienten um beispielsweise wenigstens log 2 und vorzugsweise
wenigstens log 3 zu depletieren.
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Die
Empfänger
von Thymarkkompositorganen der Erfindung sind gemischt hämatopoetische Chimären, welche
Knochenmarkvorläuferzellen
sowohl des Empfängers
als auch des Spenders besitzen. Beide Arten an reifen T Zellpopulationen
sind im Empfänger
vorhanden, wobei die T Zellen des Spenders durch eine positive Selektion
im Thymus restriktiert sind und so das Spender MHC + Antigen erkennen
können.
Wirtantigen präsentierende
Zellen (APC) in der Peripherie stellen sicher, dass immunkompetente
Wechselwirkungen auftreten können. Zusätzlich erhalten
solche Empfänger
eine sich selbst erneuernde Quelle an Spender APC von der implantierten
hämatopoetischen
Stromamikroumgebung des Knochenmarks des Spenders (oder des mit dem
Spender histokompatiblen Knochenmarks) unter Einschluss dendritischer
Zellen, die sich in der kortikomedullaren Verbindung zum implantierten Thymusgewebe
lokalisieren. Spenderthymozyten differenzieren und reifen im implantierten
Thymusgewebe, so dass sie diese Stelle passieren und hierdurch einer
negativen Selektion zum Wirt in der gleichen Weise unterzogen werden,
wie Wirtsthymozyten negativ im Wirtsthymus selbst selektiert werden, so
dass das transplantierte Individuum sowohl immunkompetent und tolerant
für sich
selbst als auch für
den Spender gemacht wird. Auf diese Weise sorgt das Thymarkgewebekomposit
der Erfindung für
eine tragbare Maschine zur Induktion einer Toleranz beim transplantierten
Individuum.
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Die
erfindungsgemäße tragbare
Maschine eignet sich besonders zur Errichtung eines hämatopoetischen
Chimärismus
und Einleitung einer Toleranz bei Xenotransplantatempfängern und
insbesondere bei humanen Empfängern
von Schweineorganen.
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Die
Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert, welche
nur zu Illustrationszwecken dienen und den Schutzumfang der Erfindung
in keiner Weise beschränken
sollen.
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Beispiele
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Knochenmark-Thymus-Implantation
unter die Nierenkapsel
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Spender-
und Empfängermäuse vom
Stamm C57BL/6, die von Jackson Labs erhalten worden sind, werden
mit einem Cocktail aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (4 mg/kg)
anästhesiert.
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Alle
langen Knochen (Femurknochen) des Spendertiers werden entfernt und
das hämatopoetische
Stromagewebe wird gesammelt durch Entfernung des Knochenhalses und
Spülung
der Knochenmarkkavität
mit kalter isotonischer Kochsalzlösung. Das gesammelte Knochenmark
wird zusammengefasst und in ein Rohr pelletisiert.
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Der
Spenderthymus wird gesammelt und in ein steriles Gewebekulturschälchen übertragen,
das mit steriler kalter Kochsalzlösung gefüllt ist. Der Thymus wird mit
Scheren in kleine Stückchen
unterteilt (2 mm × 4
mm).
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A Knochenmarkimplantation
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Das
Empfängertier
wird auf seine rechte Seite gelegt. Die linke Niere wird durch einen
10 bis 12 mm langen Schnitt freigelegt. Durch die Nierenkapsel wird
zur Gewebeimplantation unter Bildung eines Tunnels mit einer Pinzette
mit feiner Spitze ein 1 mm Schnitt gemacht. Sodann wird unter die
Nierenkap sel syngenes Knochenmarkgewebe eingebracht (2, oberes
Bild, und 3, linkes Bild). Nach beendeter Implantation
wird der Abdominalschnitt durch Vernähen geschlossen.
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Das
implantierte Knochenmark wird zur histologischen Beurteilung zu
verschiedenen Zeitintervallen geerntet. Um die Stelle des implantierten
Knochenmarks herum bildet sich eine extensive Angiogenese (3,
rechtes Bild). Fünf
Wochen nach der Transplantation zeigt eine histologische Untersuchung
ein regeneriertes Knochenmark unter der Nierenkapsel (4,
rechtes Bild).
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Dieses
regenerierte Knochenmarkgewebe lässt
sich auch in einer xenogenen Anordnung, nämlich einer Anordnung Ratte-zu-Maus,
entweder zu einem frühen
Zeitpunkt (5) oder zu einem späteren Zeitpunkt
(6) beobachten. Eine immunhistochemische Untersuchung
ergibt, dass die unter der Nierenkapsel vorhandenen Zellen vom Spender, nämlich einer
Ratte, stammen und CD45+ Leukozyten sind (8 und 9).
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B Knochenmarkthymusimplantation
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Die
Präparierung
des Empfängertiers
erfolgt wie oben beschrieben. Unter die Renalkapsel wird zuerst
Knochenmarkgewebe und dann Thymusgewebe eingebracht (2,
unteres Bild). Dieses Verfahren wird mehrmals wiederholt. Die Endgröße des Implantats
beträgt
etwa 6 mm × 4
mm. Eine histologische Untersuchung zum Zeitpunkt von 4 Wochen post
Transplantation zeigt, dass sich unter der Renalkapsel regenerierte
Komponenten von Knochenmark und Thymus gebildet haben (7).