ES2231499T3 - Construccion tisular compuesta de timo-medula y organo para inducir tolerancia. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un órgano compuesto que comprende: (a) seleccionar un órgano trasplantable de un mamífero no humano; (b) implantar en dicho órgano trasplantable ex vivo un primer componente tisular que comprende tejido tímico funcional y (c) implantar en dicho órgano trasplantable ex vivo un segundo componente tisular que comprende un microentorno estromático hematopoyético (HSM) del componente de médula en asociación íntima con dicho primer componente tisular, siendo dichos primer y segundo componentes tisulares histocompatibles con el órgano.

Description

Construcción tisular compuesta de timo-médula y órgano para inducir tolerancia.

Campo de la invención

La presente invención proporciona un método para preparar un órgano de mamífero no humano que comprende un implante tisular compuesto para uso en el trasplante de órganos, y métodos para conseguir quimerismo hematopoyético y tolerancia inmunológica estable con especificidad de donante en un receptor de un trasplante mamífero.

Antecedentes de la invención

La inducción de tolerancia inmunológica con especificidad de donante sigue siendo un objetivo difícil de conseguir en la investigación de alo y xeno-trasplantes. La expresión "tolerancia inmunológica" se refiere a un estado de falta de respuesta por el sistema inmune de un paciente sometido a la exposición al antígeno al que se ha inducido la tolerancia. En situación de un trasplante, en particular, se refiere a la inhibición de la capacidad del receptor del injerto de crear una respuesta inmune que se produciría de otra manera en respuesta a la introducción de antígenos del injerto que no son autoantígenos del MHC en el receptor.

Ciertos estudios recientes se han centrado en injertos de timo como forma de desarrollar tolerancia inmunológica en el receptor de un trasplante (es decir "hospedador"). Por ejemplo, Nikolic y colaboradores demostraron que injertos de timo porcino en ratones inmunodeficientes mantuvieron el desarrollo normal de células T humanas funcionales policlonales; y que las células T eran específicamente tolerantes a Ag del MHC con especificidad de donante, Journal of Immunology, 1999, 162:3402-3407 (1999). Zhao y colaboradores informaron que el injerto de ratones inmunosuprimidos transitoriamente con timo e hígado de cerdo fetal confería tolerancia en el receptor murino a un posterior injerto de piel porcina, Nature Medicine 2:1211-1216 (1996).

Lambrigts y colaboradores introdujeron el concepto de un "timo-órgano" que comprende injertos de timo autólogos debajo de la cápsula renal o en el corazón de un modelo porcino [Lambrigts et al, Xenotransplantation 3:296- (1996)]; e informaron sobre la obtención de injertos intracardíacos estables del tejido tímico en un corazón trasplantado posteriormente [Lambrigts et al., Transplantation 66:810- (1998)]. Yamada y colaboradores informan que en un modelo de cerdo miniatura, receptores disparados de clase I timectomizados de un "timo-riñón" alogénico compuesto (riñón con tejido tímico autólogo vascularizado debajo de su cápsula) que recibían un transcurso de 12 días de ciclosporina, tenían una función renal estable sin signos de rechazo, y falta de respuesta con especificidad de donante. En el día 14 después de la operación ("POD"), el tejido tímico del timo-riñón contenía células dendríticas del tipo del receptor; y en el POD 60, aparecieron timocitos positivos de clase I del tipo del receptor en la médula tímica, indicando timopoyesis. Se descubrió que las células T estaban restringidas al MHC tanto del receptor como del donante. Yamada y colaboradores concluyeron que la presencia de tejido tímico del donante vascularizado puede inducir tolerancia a aloinjertos de riñón disparados de clase I en receptores timectomizados [Yamada et al., Journal of Immunology 164:3079-3086 (2000); Yamada et al., Transplantation 68: 1684-1692 (1999); véase también Sachs, Clinical Immunology 95:S63-S68 (2000)].

Sin embargo, creemos que el timo-órgano descrito anteriormente es inadecuado para mantener una tolerancia inmunológica estable a largo plazo en una situación de trasplante alogénico o xenogénico. En particular, una de las funciones esenciales del tejido tímico implantado es proporcionar un sitio para la selección negativa de timocitos en desarrollo para la autotolerancia por células dendríticas. En el modelo de timo-órgano descrito hasta ahora, está función finalmente se ve comprometida por la reducción irreversible de la población de células dendríticas del tejido de injerto derivadas del donante. Las células dendríticas, en general, tienen una vida media de aproximadamente un mes o menos. De esta manera, a lo largo del tiempo se perderá la capacidad de selección negativa de timocitos en desarrollo para mantener tolerancia al donante. Actualmente no se ha informado sobre ningún medio para mantener la producción y disponibilidad de células dendríticas o sus precursores a un timo- órgano. De esta manera, la aparente tolerancia conseguida por los trabajadores de la técnica anterior en este campo debe ser, en el mejor de los casos, sólo transitoria.

Sumario de la invención

Ahora hemos ideado una nueva composición y medios para conseguir quimerismo hematopoyético en el receptor de un injerto, y para inducir tolerancia estable, a largo plazo, en un receptor mamífero de un órgano trasplantado no humano alogénico o xenogénico. Más específicamente, nuestra invención contempla la implantación en el receptor de órganos de una nueva fuente auto-renovadora de células hematopoyéticas del donante (o histocompatibles con el donante), incluyendo células dendríticas o sus precursores. Esta nueva fuente comprende el microentorno estromático hematopoyético (HSM) de la médula ósea substancialmente intacto. Un ejemplo de tal HSM substancialmente intacto comprende un tapón o cilindro de médula ósea intacta, preferiblemente del orden de 1-5 mm^{3}, que se ha extraído quirúrgicamente de la médula ósea de un donante mamífero no humano. A diferencia de las preparaciones típicas inyectables de médula ósea, que constan esencialmente de un inóculo de células madre en un detrito por lo demás no funcional de tejidos y células rotas, el nuevo componente de HSM substancialmente intacto de la invención proporciona un microentorno que es favorable para la hematopoyesis continuada dentro del injerto de timo-órgano.

En particular, nuestro descubrimiento es que una construcción tisular compuesta que comprende, como primer componente, tejido tímico del donante (o histocompatible con el donante) y, como segundo componente, tejido substancialmente intacto del microentorno estromático hematopoyético (HSM) de médula ósea del donante (o histocompatible con el donante), proporciona una producción de novo y continua de células dendríticas del tipo del donante no humano en el receptor del trasplante; y además, que tal construcción tisular compuesta vascularizada proporciona una fuente auto-renovadora sostenida de células dendríticas del tipo del donante y otras células derivadas de médula ósea capaces de emigrar al tejido tímico del donante y de ayudar a la diferenciación y desarrollo de timocitos.

En una realización preferida de la invención, se prepara ex vivo un órgano compuesto de "timo-médula ósea" -denominado como alternativa en este documento un órgano compuesto de "timo-médula", y se implanta la construcción tisular compuesta que se acaba de describir como un dispositivo unitario en el órgano del donante.

En una realización alternativa de la invención, puede prepararse ex vivo un órgano compuesto de timo-médula implantando por separado el componente de tejido tímico descrito anteriormente y el componente de HSM de médula ósea en el órgano.

Los receptores de tal órgano compuesto de timo-médula en los que ha reducido la población de células T o que se han acondicionado de otra manera se volverán tolerantes al órgano debido a que la regeneración de la población de células T del hospedador habrá madurado (por medio de una selección positiva y negativa) en presencia de la producción sostenida de células dendríticas derivadas de médula del donante.

Las quimeras mixtas resultantes son tanto inmunocompetentes como tolerantes a sí mismas y al donante. Es posible conseguir una tolerancia a largo plazo porque la invención proporciona una renovación continuada de células dendríticas, asegurando la funcionalidad continuada del proceso anérgico o de selección negativa tímica o periférica dentro del receptor y, de esta manera, un estado de autoperpetuación de tolerancia con especificidad de donante al injerto. Nuestra invención proporciona un medio para asegurar una tolerancia estable a largo plazo a tejidos u órganos trasplantados, en ausencia de rechazo o respuestas autoinmunes aberrantes, proporcionando esencialmente un "motor" portátil trasplantable de tolerancia en la construcción tisular compuesta de la invención.

El órgano compuesto de timo-médula de la invención puede utilizarse para inducir tolerancia en el mamífero receptor de un trasplante de un órgano alogénico (es decir, de la misma especie) o xenogénico (es decir, de una especie diferente). El órgano compuesto de la invención es particularmente útil para crear quimerismo hematopoyético e inducir tolerancia en el receptor de un xenotrasplante, especialmente un receptor humano de un órgano de mamífero no humano (especialmente, Sus scrofa, es decir cerdo).

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 vista esquemática de una realización de un "motor portátil" para la inducción de tolerancia de acuerdo con la invención. La construcción tisular compuesta representada comprende secciones tisulares mezcladas de timo y médula ósea dentro de un medio de soporte procedente de una sección de saco intestinal (véase el panel de la izquierda). También se representa esquemáticamente (panel de la derecha) la red de vasos sanguíneos que conectan el compuesto vascularizado con el tejido circundante de su hospedador mamífero.

Fig. 2 Representación esquemática de un compuesto de "médula ósea-riñón", un compuesto de "timo-riñón", y un compuesto de "timo-médula ósea" (también conocido como "timo-médula'')-riñón" ex vivo, de acuerdo con la invención.

Fig. 3 Aspecto macroscópico de una cápsula de riñón de ratón que contiene estroma de médula ósea singénica implantada ectópicamente (panel de la izquierda) o médula ósea implantada bajo la cápsula renal (panel de la derecha) ex vivo (la flecha indica el estroma de la médula ósea y el riñón). Cinco semanas después del trasplante ("Tx"), se ha formado una angiogénesis extensiva alrededor del sitio del implante de médula ósea, apareciendo la médula ósea como un tejido blanco.

Fig. 4 (Panel de la izquierda) imagen macroscópica adicional de la cápsula renal de ratón como se describe en relación con la fig. 3. (Panel de la derecha) fotomicrografía de la sección transversal del implante estromático de médula ósea 5 semanas después del trasplante, que muestra la médula ósea "regenerada", es decir, bañada con sangre (20 aumentos, tinción H & E).

Fig. 5 Fotomicrografías de 10 aumentos (panel de la izquierda) y de 40 aumentos (panel de la derecha) de sección de médula ósea xenogénica (de rata desnuda a ratón RAG 1) implantada ectópicamente debajo de la cápsula renal de ratón, 4 semanas después del trasplante (tinción H & E).

Fig. 6 Fotomicrografía de 20 aumentos de sección de médula ósea xenogénica (de rata desnuda a ratón RAG-1) implantada ectópicamente debajo de la cápsula renal de ratón, 8 semanas (panel de la izquierda) y 16 semanas (panel de la derecha) después de Tx (tinción H & E).

Fig. 7 Fotomicrografías de 10 aumentos (panel de la izquierda) y 20 aumentos (panel de la derecha) de tejido singénico de médula ósea y timo implantado ectópicamente debajo de la cápsula renal en el modelo de ratón (tinción H & E), 4 semanas después del Tx (tinción H & E).

Fig. 8 Fotomicrografías de sección teñida con H & E (panel de la izquierda) y sección teñida por inmunohistoquímica (para leucocitos CD45 positivos) (panel de la derecha) de médula ósea xenogénica (de rata a ratón) implantada ectópicamente debajo de la cápsula renal. Las flechas indican el implante de médula ósea (panel de la izquierda) y los leucocitos CD45+ en el implante de médula ósea (panel de la derecha).

Fig. 9 Fotomicrografías de secciones transversales de bazo de ratón teñidas con anticuerpo de ratón anti-CD45 de rata (panel de la izquierda) y anticuerpo de rata anti-CD45 de ratón (panel de la derecha) para confirmar la ausencia de reactividad cruzada.

Descripción detallada de la invención

La construcción tisular compuesta para inducir tolerancia comprende tejido tímico funcional y un microentorno estromático hematopoyético (HSM) substancialmente intacto de la médula ósea.

Es esencial que el componente de tejido tímico de la construcción tisular compuesta de la invención proporcione un microentorno secuestrado y organizado arquitecturalmente que conduzca al desarrollo de células T maduras a partir de timocitos virgen.

Maduración de células T en el timo. El proceso de maduración de linfocitos T hasta la fase de timocito, para formar células T maduras, se ha caracterizado bien [véase, por ejemplo, Charles A. Janeway y Paul Travers, Immunobiology - the Immune System in Health and Disease, 2d ed., Ch. 6, Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc. (1996)]. En resumen, los linfocitos T formados por diferenciación de precursores linfoides en el estroma hematopoyético de la médula ósea migran desde la médula ósea a la periferia y finalmente alcanzan el timo, donde las células se someten a diversas etapas de diferenciación y selección, principalmente en la corteza (la médula generalmente contiene sólo células T maduras). Los linfocitos primero entran en el timo como células doble negativas, que ni expresan el receptor de células T ni ninguna de las dos moléculas co-receptoras, CD4 y CD8, y se incluyen en una red epitelial conocida como estroma tímico, que proporciona un microentorno inductor para la diferenciación y el desarrollo. Después de una fase inicial de proliferación en la zona subcapsular de la corteza, los linfocitos (también denominados "linfoblastos subcorticales") se diferencian en células dobles positivas, que expresan el receptor de células T y co-receptores tanto CD4 como CD8. Los timocitos inmaduros resultantes ("timocitos corticales") posteriormente experimentan dos tipos de selección: selección positiva para el reconocimiento de complejos auto-MHC:autopéptido, y selección negativa para el reconocimiento complejos de autopéptido:auto-MHC que de otra manera activarían a las células T en la periferia.

Selección Positiva de Timocitos. La selección positiva de timocitos normalmente está mediada en la corteza por células epiteliales corticales que llevan MHC. La selección positiva asegura que todas las células T maduras podrán responder a péptidos extraños presentados por auto-MHC, es decir, que las células T maduras estarán "restringidas a auto-MHC". Las células que no encuentran sus moléculas del MHC de restricción en el epitelio tímico siguen siendo doble positivas y mueren en el timo en 3 o 4 días desde su última división, eliminándose posteriormente por los macrófagos.

Los timocitos que sobreviven al proceso de selección positiva expresan sólo uno de los dos co-receptores, CD4 o CD8. Además, las células T maduras que llevan CD4 tienen receptores que reconocen péptidos unidos a moléculas auto-MHC de clase II, mientras que las células T que llevan CD8 tienen receptores que reconocen péptidos unidos a moléculas auto-MHC de clase I. De esta manera, la selección positiva también determina el fenotipo de la superficie celular de la célula T madura, equipándolo con un co-receptor que requiere un reconocimiento de antígenos eficaz.

Selección Negativa de Timocitos. Las células doble positivas también deben experimentar un proceso de purga en el que se eliminen las células T potencialmente auto-reactivas. La función de purga del timo se denomina selección negativa. Se cree que la selección negativa más rigurosa se realiza en la unión corticomedular, donde los "timocitos medulares" casi maduros encuentran células presentadoras de antígenos (APC) que también activan a las células T maduras en los tejidos linfoides periféricos. Las APC comprenden células dendríticas derivadas de médula ósea ("interdigitantes"), así como macrófagos. Por lo tanto, los autoantígenos presentados por estas células son la fuente más importante de respuestas autoinmunes potenciales, y las células T que responden a tales autopéptidos deben eliminarse en el timo. Deleción clonal por el autopéptido: el complejo auto-MHC genera un repertorio de células T maduras que no responden a los autoantígenos expresados por sus propias APC, estableciendo auto-tolerancia. Las células T maduras supervivientes salen de la médula a la circulación periférica [véase Janeway y Travers, id, en 6:15-6:31].

De esta manera, tanto la selección positiva como la selección negativa son concomitantes necesarios para producir un repertorio útil y no perjudicial de receptores de células T.

Por consiguiente, por "tejido tímico funcional" se entiende el tejido del timo que tiene un microentorno que puede procesar timocitos virgen hasta la fase de células T maduras en un mamífero.

Por lo tanto, el componente tímico del órgano compuesto de la presente invención, para constituir un "tejido tímico funcional", en particular, debe comprender una porción suficiente de estroma tímico, incluyendo células epiteliales corticales y células epiteliales medulares, para mantener la selección positiva y negativa de los timocitos para producir células T maduras que tengan una auto-reconocimiento de donante y una auto-tolerancia de donante.

Como el timo tiende a encogerse o a involucionarse después de la pubertad, en la práctica puede ser difícil, si no imposible, obtener un tejido tímico suficiente o de función autóloga a partir de un donante de órganos adulto. Por consiguiente, en una realización de la invención, el tejido tímico procede de un animal que es histocompatible con el donante de órganos. Un ejemplo de un animal histocompatible es un mamífero de la misma cepa endogámica que el donante de órganos. De esta manera, el tejido tímico puede recogerse a partir de un donante juvenil (o, como alternativa, recién nacido o fetal) e implantarse en un órgano de un donante de órganos porcino adulto de una cepa endogámica idéntica.

Se entenderá que el término "implante", "trasplante" o "injerto", como se usa en este documento, hace referencia al hecho de insertar tejido o un órgano dentro de un receptor mamífero vivo en condiciones que permitan que el tejido o el órgano se vascularice; y también hace referencia al tejido u órgano insertado de esta manera (es decir, "implantado", "trasplantado" o "injertado"). Las condiciones que favorecen la vascularización de un injerto en un mamífero comprenden un lecho de tejido localizado en el sitio del injerto que tiene una red de suministro de sangre extensiva. Por ejemplo, un sitio apropiado en el riñón para insertar un tejido o un órgano para promover la vascularización es por debajo de la cápsula renal, adyacente al parénquima. Los sitios apropiados en el corazón en los que se inserta tejido o un órgano para promover la vascularización comprenden las capas de grasa subepicárdica que recubren las ranuras atrioventriculares derecha e izquierda; los apéndices auriculares derecho e izquierdo; la ventana aortopulmonar; o la pared libre del ventrículo derecho.

La eliminación quirúrgica del timo o de una parte del mismo de un donante de timo debe realizarse con cuidado de conservar la integridad del microentorno estromático del timo. El tejido tímico puede retirarse de su entorno nativo por disección cuidadosa.

El segundo componente de la construcción tisular compuesta de la invención comprende un microentorno estromático hematopoyético (HSM) funcional de la médula ósea. El HSM debe ser histocompatible con el componente de tejido tímico, así como con el donante de órganos.

Por "microentorno estromático hematopoyético funcional" se entiende el tejido obtenido a partir de médula ósea que tiene un microentorno que es capaz de realizar un desarrollo y diferenciación hematopoyética en un mamífero.

Microentorno Estromático Hematopoyético. El proceso por el que se inducen linfocitos T en la médula ósea como resultado de la diferenciación de células progenitoras linfoides descendientes de células madre hematopoyéticas totipotentes, se ha estudiado ampliamente. Las células estromáticas incluyen células endoteliales que constituyen los sinus de la médula ósea y células reticulares adventicias que tienen características consistentes con los adipocitos, fibroblastos y células musculares [Chabord et al., Blood 66: 1138 (1985), Chabord et al., Exp. Hematol. 18:276 (1990)]. Desde hace mucho tiempo se ha apreciado que las células estromáticas de la médula proporciona un soporte estructural para la hematopoyesis [Mayani et al. Eur. J. Hatmat. 49:225-233 (1992)]. Ciertos estudios han demostrado que el contacto directo entre célula estromática y célula sanguínea, la producción de células estromáticas de la matriz extracelular de la médula ósea y la síntesis de citoquinas por células estromáticas son relevantes para la formación de diversas células sanguíneas. [véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.733.541, incorporada como referencia]. Se ha descubierto que para el mantenimiento de células madre en un cultivo de médula ósea a largo plazo, es necesario el contacto directo con las células estromáticas [Dexter et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 3:432-441 (1987)]. Se han establecido líneas de células estromáticas de médula humana que sostienen la hematopoyesis [véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.879.940, incorporada como referencia]. Se ha indicado que las células estromáticas pueden transferir el microentorno hematopoyético del donante después del trasplante alogénico de médula ósea. Gurevitch y colaboradores presentaron datos que sugerían que el trasplante de médula ósea del donante dentro del microentorno estromático hematopoyético puede aumentar el quimerismo de las células del donante y proporcionar condiciones de supervivencia a largo plazo tanto de trasplantes alogénicos como de trasplantes xenogénicos, Transplantation 68:1362-1368 (1999).

El componente estromático hematopoyético del órgano compuesto de timo-médula de la presente invención debe proporcionar un microentorno suficientemente intacto de forma que se mantenga el desarrollo hematopoyético una vez que el tejido se ha revascularizado en el receptor.

Por consiguiente, puede realizarse una eliminación quirúrgica de médula ósea usando técnicas quirúrgicas bien conocidas para conservar el integridad del microentorno estromático hematopoyético de la médula ósea. Las fuentes adecuadas de médula incluyen los huesos largos (fémur) y la tibia. Por ejemplo, puede prensarse mecánicamente la médula del canal femoral por medio de un mandril o trocar para producir tapones en los que el HSM queda substancialmente intacto.

Como alternativa, pueden utilizarse cultivos de células estromáticas hematopoyéticas cultivadas, como se describe en la bibliografía (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.879.940, incorporada como referencia) para proporcionar el microentorno estromático hematopoyético requerido de la invención.

Preferiblemente, el componente de tejido tímico y el componente de médula ósea se irradian para reducir el número de progenitores hematopoyéticos. La irradiación pueden realizarse in vivo, es decir, antes de la extracción (en el caso de un donante mamífero no humano) y/o ex vivo, es decir, después de la eliminación y antes de la implantación en un receptor, y/o después de la reimplantación en un receptor no humano.

La médula ósea puede recogerse del mamífero donante que proporciona un órgano para el trasplante o de un individuo histocompatible (por ejemplo, de la misma cepa endogámica).

Para preparar un órgano compuesto de la invención, es esencial que el tejido tímico y el tejido de médula de ósea se dispongan dentro de la construcción tisular o dentro del órgano en asociación íntima ex vivo.

Por "asociación íntima" se entiende que los dos tipos de tejido están dispuestos de una manera suficientemente próxima como para que las células hematopoyéticas (por ejemplo, células dendríticas o sus precursores) liberadas del tejido de médula ósea puedan migrar al tejido tímico.

La asociación íntima, es decir, la colocación física próxima, de los dos tipos de tejido es un factor esencial para conseguir inducción de tolerancia, ya que se necesita tal asociación íntima para un tránsito eficaz de precursores de células dendríticas desde el HSM de la médula ósea al tejido tímico, donde las células dendríticas participan en una selección delecional de los timocitos para mantener auto-tolerancia a injertos. Dicha migración puede realizarse a través del parénquima del tejido, siguiendo gradientes quimiotácticos, o entrando en la circulación sanguínea y/o linfática.

Es muy preferido que al menos una porción del componente de tejido tímico y el componente de tejido de médula ósea estén en contacto directo. El área de superficie de contacto directo puede optimizarse dividiendo los tejidos disponibles de timo y médula ósea en porciones, y mezclando una pluralidad de las porciones de tejido combinadas dentro de la construcción tisular compuesta u órgano de la invención ex vivo. Como alternativa, los tapones de médula ósea pueden depositarse en el tejido de injerto tímico ex vivo como se representa esquemáticamente en la fig. 2.

Para mantener la integridad estructural del compuesto y para facilitar la asociación íntima de los tejidos, es ventajoso rodear los tejidos con un material membranoso permeable o semipermeable biocompatible que permita la vascularización de los tejidos encerrados. Tal material puede proceder convenientemente, por ejemplo, del saco intestinal del donante de tejidos.

De esta manera, la construcción tisular compuesta comprende secciones mezcladas o tapones de tejido tímico y tejido de HSM de la médula ósea rodeado por un medio de soporte derivado de saco intestinal. Tal construcción tisular compuesta se representa en la figura 1.

Una vez preparada, esta construcción tisular compuesta en la que los tejidos coexisten de una forma mezclada, después puede implantarse quirúrgicamente en un órgano trasplantable vascularizado tal como un riñón o corazón, o en otro sitio, en un donante de órganos pre-seleccionado.

Es de esperar que la construcción tisular compuesta, cuando se introduzca en un mamífero, experimente inicialmente al menos una cierta cantidad de atrofia y pérdida de células. Sin embargo, en el entorno de un hospedador rico en sangre, el tejido implantado rápidamente se revascularizará por el hospedador (como se representa en la figura 1, panel de la derecha) de forma que los tejidos reanuden su funcionamiento normal.

De esta manera, puede ser necesario administrar un tratamiento inmunosupresor convencional al paciente del trasplante durante un periodo de tiempo definido después del trasplante (por ejemplo, durante un periodo de hasta aproximadamente +120 días o, preferiblemente, durante un periodo de hasta aproximadamente +90 días, por ejemplo, +30 días). Los ejemplos de compuestos adecuados incluyen ciclosporinas, rapamicinas o ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno, metotrexato; brequinar, leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetil (MMF); desoxispergualinas (por ejemplo, 15-desoxispergualina) y análogos, clorhidrato de 2-amino-2-[2-[(4-octilfenil)etil]propano-1,3-diol, corticosteroides (por ejemplo, metotrexato, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona) u otros compuestos inmunomoduladores (por ejemplo, CTLA4-Ig); anticuerpos anti-LFA-1 o anti-ICAM, o anticuerpos contra receptores de leucocitos o sus ligandos (por ejemplo, anticuerpos contra MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD40, CD45, CD58, CD152 (CTLA-4), o CD 154 (o ligando CD40).

La construcción tisular compuesta que comprende tejido tímico y HSM de la médula ósea puede implantarse por medios quirúrgicos directamente en un órgano preseleccionado de un animal donante (por ejemplo, un cerdo) para trasplantar finalmente este órgano en un mamífero receptor (por ejemplo, un ser humano). Como alternativa, pero menos preferiblemente, en lugar de preparar primero una construcción tisular compuesta, es posible implantar el componente de tejido tímico y el componente de HSM de médula ósea como un componente discreto en el órgano para formar un órgano compuesto de la invención.

El órgano resultante que contiene los tejidos injertados en asociación íntima, y preferiblemente en contacto, se denomina órgano compuesto de "timo-médula ósea" (o "timo-médula"). El órgano preseleccionado puede comprender, por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, corazón-pulmón combinado, hígado o páncreas. En la fig. 2 se representa esquemáticamente una realización de un timo-médula ósea ("timo-médula")-riñón.

La implantación de los tejidos tímico y de médula ósea puede realizarse ex vivo (es decir, después de haber extraído el órgano del donante y antes de haberlo trasplantado al receptor).

En otra realización de la invención, los tejidos discretos tímico y HSM-médula ósea o la construcción tisular compuesta pueden implantarse en el donante de órganos, no inicialmente en el órgano a trasplantar, sino en otra localización bañada de sangre adecuada. La construcción tisular compuesta después puede transferirse al órgano seleccionado en un momento posterior, incluyendo hasta el momento del trasplante.

Opcionalmente, el pre-acondicionamiento del receptor para reducir la población de células T maduras puede preceder al trasplante de la construcción tisular compuesta o del órgano compuesto de timo-médula ósea de la invención. El pre-acondicionamiento puede realizarse, por ejemplo, por irradiación o administrando al paciente suficiente inmunotoxina tal como se describe en el documento PCT WO 98/39363 para reducir la población de células T del paciente, por ejemplo, en al menos dos y preferiblemente en al menos 3 log.

Los receptores de los órganos compuestos de timo-médula de la invención son quimeras hematopoyéticas mezcladas que poseen células precursoras de médula ósea tanto del receptor como del donante. En el receptor están presentes los dos tipos de poblaciones de células T maduras, estando restringidas las células T del donante por medio de la selección positiva en el timo al reconocimiento del antígeno MHC + del donante. Las células presentadoras de antígenos (APC) del hospedador presentes en la periferia aseguran que se producen interacciones inmunocompetentes. Además, tales receptores reciben una fuente auto-renovadora de APC procedente del microentorno estromático hematopoyético implantado de la médula ósea del donante (o histocompatible con el donante), incluyendo células dendríticas que se localizan en la unión corticomedular del tejido tímico implantado. Según se diferencian y maduran los timocitos del donante en el tejido tímico implantado, pasan a través de este sitio y se someten a una selección negativa en el donante de la misma forma que los timocitos del hospedador se seleccionaron negativamente con respecto a sí mismos en el timo del hospedador, haciendo que el individuo trasplantado sea tanto inmunocompetente como tolerante a sí mismo y al donante. De esta manera, el compuesto tisular de timo-médula de la invención proporciona un "motor portátil" para inducir tolerancia en el individuo trasplantado.

El "motor portátil" de la invención es particularmente útil para establecer quimerismo hematopoyético e inducir tolerancia en receptores de xenotrasplantes, y en particular en receptores humanos de órganos de cerdo.

Los siguientes ejemplos tienen sólo fines ilustrativos y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención de manera alguna.

Ejemplos Implantación de médula ósea/timo debajo de la cápsula renal

Se anestesian ratones donantes y receptores de la cepa C57Bl/6 obtenida de Jackson Labs con una mezcla de Ketamina (100 mg/kg) y xilazina (4 mg/kg).

Se retiran todos los huesos largos del animal donante, y se recoge el tejido estromático hematopoyético extrayendo el cuello del hueso y lavando abundantemente la cavidad de la médula con solución salina isotónica fría. La médula ósea recogida se reúne y se sedimenta en un tubo.

Se recoge timo del donante y se transfiere a una placa de cultivo de tejidos estéril rellena con solución salina estéril fría. El timo se divide en pequeñas piezas con unas tijeras (2 mm x 4 mm).

A. Implantación de médula ósea

El animal receptor se pone sobre su lado derecho. Se expone el riñón izquierdo a través de una incisión de 10 a 12 mm. Se realiza un corte de 1 mm con un fórceps de punta fina a través de la cápsula renal para implantar el tejido, creando un túnel. El tejido de médula ósea singénico se suministra a través de la cápsula renal (panel superior de la fig. 2 y panel izquierdo de la fig. 3). Después de terminar la implantación, la incisión abdominal se sutura.

La médula ósea implantada se recoge para una evaluación histológica a diversos intervalos. Se forma una extensa angiogénesis alrededor del sitio de implantación de la médula ósea (panel derecho de la fig. 3). Cinco semanas después del trasplante, la evaluación histológica muestra una médula ósea "regenerada" debajo de la cápsula renal (panel derecho de la fig. 4).

Este tejido de médula ósea regenerado también se observa en una situación xenogénica, es decir, de rata a ratón, bien en puntos de tiempo tempranos (fig. 5) o en puntos de tiempo posteriores (fig. 6). La inmunohistoquímica revela que las células presentes debajo de la cápsula renal son leucocitos CD45+ procedentes del donante (es decir, de rata) (fig. 8 y fig. 9).

B. Implantación de médula ósea/timo

La preparación del animal receptor es como se ha descrito anteriormente. Se suministra tejido de médula ósea debajo de la cápsula renal seguido de tejido de timo (panel inferior de la fig. 2). Este procedimiento se repite varias veces. El tamaño final del implante es de aproximadamente 6 mm x 4 mm. La evaluación histológica a las 4 semanas después del trasplante muestra componente regenerados de médula ósea y timo debajo de la cápsula renal (fig. 7).

Claims (8)

1. Un método para preparar un órgano compuesto que comprende:

(a) seleccionar un órgano trasplantable de un mamífero no humano;

(b) implantar en dicho órgano trasplantable ex vivo un primer componente tisular que comprende tejido tímico funcional y

(c) implantar en dicho órgano trasplantable ex vivo un segundo componente tisular que comprende un microentorno estromático hematopoyético (HSM) del componente de médula en asociación íntima con dicho primer componente tisular, siendo dichos primer y segundo componentes tisulares histocompatibles con el órgano.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el primer y el segundo componentes tisulares se implantan al mismo tiempo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el primer componente tisular y el segundo componente tisular están contenidos dentro de una construcción compuesta de tejido por un medio de soporte biocompatible que permite la vascularización de dichos componentes tisulares.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el primer y el segundo componentes tisulares están en una relación de contacto.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el órgano trasplantable es un riñón.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el órgano trasplantable es un corazón.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el órgano trasplantable es de un cerdo.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, donde el primer y el segundo componente tisulares son de origen porcino autólogo o no autólogo.