KR20210062030A - 하이브리드 흉선, 이의 제조 방법, 그리고 이종이식 내성을 유도하고 면역적격 및 흉선 기능을 회복시키기 위한 사용 방법 - Google Patents

하이브리드 흉선, 이의 제조 방법, 그리고 이종이식 내성을 유도하고 면역적격 및 흉선 기능을 회복시키기 위한 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210062030A
KR20210062030A KR1020217010702A KR20217010702A KR20210062030A KR 20210062030 A KR20210062030 A KR 20210062030A KR 1020217010702 A KR1020217010702 A KR 1020217010702A KR 20217010702 A KR20217010702 A KR 20217010702A KR 20210062030 A KR20210062030 A KR 20210062030A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
thymus
thymic
cells
tissue
species
Prior art date
Application number
KR1020217010702A
Other languages
English (en)
Inventor
메건 사익스
모센 코스라비-마할루에이
니콜 단즐
Original Assignee
더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 filed Critical 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
Publication of KR20210062030A publication Critical patent/KR20210062030A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3695—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the function or physical properties of the final product, where no specific conditions are defined to achieve this
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/065—Thymocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

본 개시내용은 하이브리드 돼지-인간 흉선 조직을 제조하고 하이브리드 흉선 조직을 사용하여 이종장기이식에서 내성을 유도하는 것에 관한 것이다. 하이브리드 흉선 조직은 또한 수용체에서 면역적격을 회복 또는 유도할 뿐만 아니라 T 세포 전구체가 수용체에서 성숙한 기능성 T 세포로 발달하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 촉진시키는 데 사용될 수 있다.

Description

하이브리드 흉선, 이의 제조 방법, 그리고 이종이식 내성을 유도하고 면역적격 및 흉선 기능을 회복시키기 위한 사용 방법
다른 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2018년 9월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/734,019호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
정부 이익 진술
본 발명은 미국 국립보건원이 수여한 AI084903, AI045897 및 AI106697에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
본 발명의 분야
본 개시내용은 이종장기이식에서 내성을 유도하기 위해 돼지-인간 하이브리드 흉선을 제조하고 하이브리드 흉선을 사용하는 것에 관한 것이다.
동종이계 공여체의 심각한 부족은 현재 수행되는 장기 이식의 수를 제한한다. 이러한 공급-수요 차이는 다른 종 유래의 장기의 사용(이종이식)에 의해 해소될 수 있다. 비-인간 영장류의 사용과 연관된 윤리적 문제와 비실용성을 고려하면, 돼지는 인간에게 가장 적합한 공여체 종으로 고려된다. 장기 크기 및 인간과의 생리학적 유사성에 추가적으로, 돼지를 빠르게 교배시키고 동종번식시키는 능력은 특히 인간에게 이식 공여체로서 기능하는 능력을 개선시킬 수 있는 유전자 변형을 가능하게 한다. 문헌[Sachs, Path. Biol. 42:217-219, 1994; Piedrahita et al., Am. J. Transplant, 4 Suppl. 6:43-50, 2004].
최근의 발전에도 불구하고, 이종이식에 대한 면역 반응은 여전히 강력하여, 이의 임상 사용을 제한한다. 비특이적 면역억제 요법과 결합된 이식은 높은 초기 이식편 내성과 연관이 있지만, 임상 장기 이식의 성공에 대한 주요 제한은 주로 만성 이식 거부로 인한 후기 이식편 손실이었다. 또한, 면역억제 요법은 종종 부작용을 가지거나 감염 위험을 증가시킨다. 이와 같이, 이종이식에 대한 면역 반응을 제어하는 방법은 이종이식 적용가능성을 크게 개선시킬 것이다.
Gal 유전자가 결여된 유전자 조작 돼지는 항-Galα1-3Gal (Gal) 천연 항체로 인해 비-인간 영장류에서 일반적인 거부반응을 회피한다. 문헌[Cooper D. A brief history of cross-species organ transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent)]. 2012 Jan; 25(1): 49-57. 이러한 발전에도 불구하고, T 세포-의존성 항체는 거부반응을 유발하는 다른 돼지 특이성을 인식할 수 있다. 문헌[Yang YG, Sykes M. Xenotransplantation: current status and a perspective on the future. Nat Rev Immunol. 2007 Jul; 7(7):519-31]. T 세포-억제는 비인간 영장류에서 돼지 이종이식 생존을 연장시켰지만, 이와 같은 처리는 독성이 매우 높다. 문헌[Yamada K, Sykes M, Sachs DH. Tolerance in xenotransplantation. Curr Opin Organ Transplant. 2017 Dec; 22(6):522-528].
T-세포 억제에 대한 대안적인 접근법은 내성 유도이다. 이종이식 내성 접근법은 혼합 키메리즘 유도 및 돼지 흉선 이식을 포함한다.
혼합 키메리즘은 수용체의 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포 수준에서 공여체에 대한 내성을 유도할 수 있다. 문헌[Griesemer A., Yamada K. and Sykes M., Xenotransplantation: Immunological hurdles and progress toward tolerance, Immunol. Rev. 2014; 258(1): 241-258. Sachs D. H., Kawai T. and Sykes M., Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2014; 4:a015529].
흉선 이종장기이식은 또한 강력한 내성을 유도할 수 있다. 문헌[Kalscheuer H, Onoe T, Dahmani A, Li HW, Hoelzl M, Yamada K, Sykes M. Xenograft Tolerance and Immune Function of Human T Cells Developing in Pig Thymus Xenografts. J Immunol. 2014 Apr 1; 192(7):3442-50]. 돼지 흉선 이식편은 시험관 내에서 공여체 돼지에 대해 특이적으로 반응하지 않는 마우스에서 다양하고 기능적인 인간 T 세포 레포토리를 생성할 수 있다. 문헌[Shimizu I, Fudaba Y, Shimizu A, Yang Y, and Sykes M. Comparison of human T cell repertoire generated in xenogeneic porcine and human thymus grafts. Transplantation. 2008 Aug 27; 86(4): 601-610. Nikolic B., J. P. Gardner, D. T. Scadden, J. S. Arn, D. H. Sachs, M. Sykes. Normal development in porcine thymus grafts and specific tolerance of human T cells to porcine donor MHC. J. Immunol. 1999 Mar 15; 162: 3402-3407. Habiro K, Sykes M, Yang YG. Induction of human T-cell tolerance to pig xenoantigens via thymus transplantation in mice with an established human immune system. Am J Transplant. 2009 Jun; 9(6):1324-9]. 이러한 접근법을 돼지에서 개코원숭이 모델로 확장하여 비인간 영장류에서 지속적인 돼지 신장 이종이식 생존을 달성하였다. 문헌[Yamada K, Yazawa K, Shimizu A, Iwanaga T, Hisashi Y, Nuhn M, O'Malley P, Nobori S, Vagefi PA, Patience C, Fishman J, Cooper DK, Hawley RJ, Greenstein J, Schuurman HJ, Awwad M, Sykes M, Sachs DH. Marked prolongation of porcine renal xenograft survival in baboons through the use of alpha1,3-galactosyltransferase gene-knockout donors and the cotransplantation of vascularized thymic tissue. Nat Med. 2005 Jan; 11(1):32-4].
그러나, 나머지 한계는 외래 항원을 효율적으로 인식하지 못하는 차선의 수용체의 면역 기능; 차선의 생존, 항상성 및 자가반응성 T 세포의 비효율적인 제거; 및 자가면역을 방지하기 위한 조절 T 세포의 양성 선택의 결여를 포함한다.
본 개시내용은 제1 종의 수용체 포유동물에서 제2 종의 공여체 포유동물로부터 수득된 이식편에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 하이브리드 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하되, 상기 하이브리드 흉선 조직은 제2 종 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함하는 단계; 및
(b) 공여체 포유동물 유래의 이식편을 수용체 포유동물에 이식하는 단계
를 포함한다.
일부 실시형태에서, 흉선 기능은 단계 (a)를 수행하기 전에 수용체 포유동물에서 본질적으로 부재한다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물은 영장류이고, 일부 실시형태에서 수용체 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 공여체 포유동물은 돼지이고, 일부 실시형태에서 공여체 포유동물은 미니 돼지(miniature swine)이다.
일부 실시형태에서, 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직은 태아 흉선 조직이다. 일부 실시형태에서, 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직은 신생아 흉선 조직이다.
일부 실시형태에서, 수용체 포유동물 유래의 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물의 흉선으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물 유래의 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 배아 줄기 세포는 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 공유하도록 유전자 조작된다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 단계 (a)에서 수용체 포유동물에 이식된다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 단계 (b) 이전에, 또는 단계 (b)와 동시에 수행된다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 수용체 포유동물 유래의 흉선 상피 세포를 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직에 도입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 제1 종의 수용체 포유동물 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직에 주입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 방법은 조혈모세포(HSC)를 수용체 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이식편은 세포, 조직 또는 장기를 포함한다.
추가 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은,
(i) 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직을 2-데옥시글루코스(2DG)로 처리하는 단계; 및
(ii) 제1 종의 수용체 포유동물 유래의 흉선 상피 세포를 2DG-처리 흉선 조직에 도입하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, 제1 종 유래의 흉선 상피 세포는 2DG-처리 흉선 조직에 주입되기 전에 매트리젤(Matrigel)에 현탁된다.
본 개시내용은 또한 제1 종의 수용체 포유동물에서 면역적격을 회복 또는 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하이브리드 흉선 조직을 제1 종의 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하되, 하이브리드 흉선 조직은 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함한다.
본 개시내용은 또한 T 세포 전구체가 제1 종의 수용체 포유동물에서 성숙한 기능성 T 세포로 발달하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 촉진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하이브리드 흉선 조직을 제1 종의 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하되, 하이브리드 흉선 조직은 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함한다.
이들 방법의 일부 실시형태에서, 흉선 기능은 도입 단계 전에 수용체 포유동물에서 본질적으로 부재한다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물은 도입 단계 전에 흉선제거를 받는다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물은 면역 장애를 가진다.
일부 실시형태에서, 공여체 포유동물은 돼지이고, 일부 실시형태에서 돼지는 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물은 영장류이다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물은 인간이다.
일부 실시형태에서, 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직은 태아 흉선 조직이다. 일부 실시형태에서, 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직은 신생아 흉선 조직이다.
일부 실시형태에서, 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물의 흉선으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 배아 줄기 세포는 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 공유하도록 유전자 조작된다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 수용체 포유동물에 이식된다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직에 도입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직에 주입함으로써 생성된다.
일부 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은,
(i) 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직을 2-데옥시글루코스(2DG)로 처리하는 단계; 및
(ii) 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 2DG-처리 흉선 조직에 도입하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, 제1 종 유래의 흉선 상피 세포는 2DG-처리 흉선 조직에 주입되기 전에 매트리젤에 현탁된다.
본 개시내용은 또한 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포 및 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직을 포함하는 단리된 하이브리드 흉선 조직 및 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제2 포유동물 종은 돼지이고, 일부 실시형태에서 돼지는 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 제1 포유동물 종은 영장류이다. 일부 실시형태에서, 수용체 포유동물은 인간이다.
일부 실시형태에서, 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직은 태아 흉선 조직이다. 일부 실시형태에서, 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직은 신생아 흉선 조직이다.
일부 실시형태에서, 흉선 상피 세포는 제1 포유동물 종 유래의 흉선으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포는 태아 흉선 조직으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포는 신생아 흉선 조직으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 흉선 상피 세포는 제1 포유동물 종 유래의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 흉선 상피 세포는 제1 포유동물 종과 HLA 대립유전자를 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 배아 줄기 세포는 제1 포유동물 종과 HLA 대립유전자를 공유하도록 유전자 조작된다.
본 개시내용은 또한 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포 및 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직을 포함하는 단리된 하이브리드 흉선 조직 및 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직을 2-데옥시글루코스(2DG)로 처리하는 단계; 및
(ii) 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포를 2DG-처리 흉선 조직에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포는 2DG-처리 흉선 조직에 주입되기 전에 매트리젤에 현탁된다.
본 발명을 예시하기 위해, 본 발명의 특정 실시형태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
도 1. 인간/돼지 하이브리드 흉선의 생성. 이식 후 12 내지 20주째에, 하이브리드 돼지/인간 흉선 및 인간 CD34+ 세포로 생성된 인간화 마우스를 안락사시키고 이식된 흉선을 제거한 다음 절편을 만들고 염색하여 2-광자 공초점 현미경을 사용하여 인간 TEC를 검출하였다. 도 1A, 도 1B 및 도 1C는 미주입(도 1A), 인간 태아 흉선 기질 세포(재태기간 20주)를 주입(도 1B), 및 소아 인간 흉선 기질 세포(4개월된 소아 인간 흉선 유래)를 주입(도 1C)한 이식된 돼지 흉선의 이미지를 나타낸다. B와 C의 화살표는 CK14+HLA-DR+ 세포를 가리키며, 상기 세포는 돼지 흉선 내부의 인간 TEC를 나타낸다. 도 1A 내지 도 1C에 나타낸 전체 섹션의 정량 분석은 도 1D에 도시되어 있다. 인간 태아 및 소아 흉선 및 돼지 흉선의 추가적인 대조군을 또한 정량 분석에 포함하였다. 이마리스콜록(ImarisColoc) 소프트웨어에 의해 분석을 수행하였으며, 상기 소프트웨어는 전체 흉선 섹션의 모든 CK14+ 세포 중 CK14+HLA-DR+ 세포의 공동국소화의 계산을 가능하게 하였다. 막대 위에 나타낸 숫자는 CK14+ 세포 중 CK14+HLA-DR+ 세포의 백분율이다. 도 1E 및 도 1F는 확장된 인간 흉선 중간엽 세포(TMC)(도 1E) 및 TEC(도 1F)의 대표적인 이미지를 나타내며, 이들 세포를 리버라제를 이용한 17세 소아 흉선의 분해 후 huCD45-고갈 인간 흉선 세포에서 3주 동안 3-D 매트리젤 배양 시스템에서 배양하였다. 도 1G 및 도 1H는 각각 확장된 TMC 및 TEC의 대표적인 유세포분석 특징을 나타낸다. CD105-CD326+은 TEC로서 간주되는 한편, CD105+CD326- 세포는 TMC로 간주된다.
도 2. 인간 흉선 기질 세포(태아 흉선 유래)(TEC)를 돼지 흉선에 주입하여 생성된 하이브리드 흉선에서 CK14+HLA-DR+ 세포를 검출하였다. 도 2A: 인간 TEC 주입 없음. 도 2B: 인간 TEC 주입. 도 2C: 2-DG-처리 돼지 흉선 + 인간 태아 TEC 주입.
도 3. 하이브리드 흉선을 생성하는 데 사용하기 위한 방법 개발을 나타내는 결과. 도 3A는 돼지 태아 흉선 단편에 세포를 주입한 후 방출된 세포의 수를 나타내는 유세포분석 결과를 나타낸다. PBMC 세포를 매트리젤에 재현탁시켜 주입 후 이들 세포가 돼지 흉선 밖으로 누출되는 것을 방지하였다. 해동된 돼지 태아 흉선 단편에 세포를 주입하기 위해 3가지 상이한 방법을 사용하였다. 방법 A: V-바닥 96-웰 플레이트의 웰 내부에 조각을 배치하면서 해밀턴(Hamilton) 주사기를 사용하는 주입. 방법 B: PE50 튜빙을 사용하는 주입. 방법 C: 매트리젤이 고화될 때까지 조각을 포셉으로 웰 외부에 유지하면서 해밀턴 주사기를 사용하는 주입. 방출된 세포의 수를 유세포분석으로 결정하여 CFSE-염색된 주입 PBMC를 추적하였다. 도 3B 및 3c는 생체 외 돼지 흉선 단편에서 흉선세포를 고갈시키는 다양한 시약의 결과를 나타낸다. 도 3B는 각각의 시약으로 처리된 세포에 대한 총 살아있는 세포 수(상단 패널) 및 각각의 시약에 대해 처리된 세포에 대한 살아있는 세포의 백분율(하단 패널)의 그래프이다. 도 3C는 판독에서 사용되는 기질 세포를 포함하는 이중 음성(DN) 세포에 남아있는 살아있는 이중 양성 CD4 및 CD8 세포(DP) 또는 단일 양성(SP) CD4(SP-CD4) 또는 SP-CD8 세포의 비율의 그래프이다. 12시간 동안 2DG 100 nM로의 처리가 가장 낮은 비율을 초래하므로, 기질 세포를 보존하면서 흉선 세포를 제거하기 위한 가장 좋은 전략이었다.
도 4는 하이브리드 흉선을 준비하고 하이브리드 흉선을 수용체 마우스에 이식하기 위한 실험 계획.
도 5는 2DG로 처리되고 인간 흉선 기질 세포가 주입된 태아 돼지 흉선(그래프에서 원으로 표시됨), 2DG로 처리되지 않고 인간 흉선 기질 세포가 주입된 태아 돼지 흉선(그래프에서 사각형으로 표시됨), 및 2DG로 처리되고 인간 흉선 기질 세포가 주입되지 않은 태아 돼지 흉선(그래프에서 삼각형으로 표시됨)의 하이브리드 흉선 이식 후 인간 면역 세포 재구성의 수준의 그래프. 도 5A는 백혈구 내 hCD45+의 백분율을 나타낸다. 도 5B는 hCD45+에서 CD3+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 5C는 혈액 ㎕당 hCD45+ 세포 수를 나타낸다. 도 5D는 혈액 ㎕당 hCD3+ 세포 수를 나타낸다. 도 5E는 hCD3+에서 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 5F는 혈액 ㎕당 hCD4+ 세포 수를 나타낸다. 도 5G는 hCD45+에서 CD19+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 5H는 hCD45+에서 CD14+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 5I는 혈액 ㎕당 hCD19+ 세포 수를 나타낸다. 도 5J는 혈액 ㎕당 hCD14+ 세포 수를 나타낸다. 도 5K는 hCD3+에서 미경험 세포의 백분율을 나타낸다. 도 5L은 hCD3+에서 효과기 기억 세포의 백분율을 나타낸다.
도 6은 이식된 흉선 내에서 돼지 TEC와 혼합된 주입된 인간 TEC의 검출 이미지. 인간화 마우스로 이식된 미주입 돼지 흉선은 좌측에 도시되어 있고, 인간화 마우스로 이식된 하이브리드 흉선은 우측에 도시되어 있다.
도 7은 하이브리드 흉선을 가지는 마우스의 말초 T 세포가 인간 TEC 공여체에 부분적으로 내성이 있음을 시사하는 시험관내 T 세포 증식 결과의 그래프. 도 7A는 돼지 수지상 세포에 대한 다양한 이식된 흉선을 가지는 마우스의 T 세포 증식 반응을 나타낸다. 도 7B는 인간 돼지 수지상 세포에 대한 다양한 이식된 흉선을 가지는 마우스의 T 세포 증식 반응을 나타낸다. 인간 흉선 기질 세포가 주입되지 않은 태아 돼지 흉선은 원으로 표시되어 있고, 인간 흉선 기질 세포가 주입되고 2DG로 처리되지 않은 태아 돼지 흉선은 사각형으로 표시되어 있으며, 2DG로 처리된 인간 흉선 기질 세포가 주입된 태아 돼지 흉선은 삼각형으로 표시되어 있다.
도 8은 인간 흉선에서 발달한 것(HU/HU 마우스)과 비교하여 돼지 흉선에서 발달한(SW/HU 마우스) 인간 T 세포 중에서 인간 조직 제한 항원(TRA)(MART-1, NYESO1 및 소도 항원 IA-2)에 대한 반응성 증가를 나타내는 도면. 도 8A는 마우스 모델의 개략도이다. 도 8B는 인간 HSC 공여체 DC에 의해 제시된 인간 TRA(IA-2, MART-1 및 NYESO1)에 대한 마우스 유래의 인간 말초 T 세포(이식 후 18주)의 증식 반응을 나타내는 그래프이다.
도 9는 인간 흉선에서 개발한 것(HU/HU 마우스)과 비교하여 돼지 흉선에서 개발한(SW/HU 마우스) 인간 Treg 및 CD8 T 세포의 생존율이 더 낮음을 나타내는 도면. 도 9는 SW/HU 마우스와 비교하여 HU/HU 마우스에서 이식된 흉선 세포의 다양한 세포 및 SW/HU 마우스와 비교하여 HU/HU 마우스에서 비장/림프절의 다양한 세포를 나타내는 그래프이다. HU/HU 마우스 수는 원으로 표시되어 있고, SW/HU 마우스 수는 사각형으로 표시되어 있다. 도 9A는 이식된 흉선에서 총 흉선 세포 수를 나타낸다. 도 9B는 이식된 흉선에서 흉선 세포 하위세트의 백분율을 나타낸다. 도 9C는 이식된 흉선에서 SP-CD4+ 내의 Treg의 백분율을 나타낸다. 도 9D는 이식된 흉선에서 Ki67+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9E는 이식된 흉선에서 CD45RO+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9F는 이식된 흉선에서 CTLA-4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9G는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)의 총 세포 수를 나타낸다. 도 9H는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 hCD45+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9I는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 hCD45+ 내의 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9J는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)의 T 세포 내의 CD4 및 CD8 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9K는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 CD4+ 내의 Treg의 백분율을 나타낸다. 도 9L은 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 미경험 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9M은 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 EM 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9N은 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 HLA-DR+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9O는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 Ki67+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9P는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 hCD45RO+의 백분율을 나타낸다. 도 9Q는 마우스의 각각의 하위세트에서 비장 및 림프절(LN)에서 CTLA-4+의 백분율을 나타낸다.
도 10은 "하이브리드 흉선"에서 인간 TEC의 장기간(20주 초과) 지속성을 나타내는 도면. 도 10A는 인간 TEC가 주입되지 않은 것을 포함한 이식된 돼지 흉선(SW THY, 상단 좌측 패널), 인간 태아 TEC가 주입된 돼지 흉선(SW/태아 hu-TES THY, 상단 우측 패널), 인간 소아 TEC가 주입된 돼지 흉선(SW/소아 hu-TEC THY, 하단 좌측 패널) 및 인간 hPSC가 주입된 돼지 흉선(SW/hPSC-TEC THY, 하단 우측 패널)의 이미지이다. 도 10B는 인간 흉선(상단 우측) 및 hPSC-TEC 전구체가 주입된 SW 이식편(하단 좌측 패널)에서만 EPCAM+, CD105-음성 hu-TEC의 존재를 나타내고 미주입 SW THY 이식편(상단 좌측)에서는 나타내지 않는 다양한 장기간의 흉선 이식편 유래의 분해된 기질 중 게이팅된 CD45-음성 세포의 대표적인 유세포분석 염색 결과이다. 도 10C는 인간 ES-TEC-주입 SW 흉선 대 미주입 SW 흉선을 받은 다수의 마우스로부터 CD45- HLA-ABC+ EpCAM+(주입된 인간 TEC)의 백분율의 정량화 그래프이다.
도 11은 돼지 흉선에 hES-TEC를 주입하면 T 세포 발달을 증가시키고 말초 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 증가시킴을 나타낸다. 1~2×105개 hES-TEC가 주입(녹색 막대) 또는 주입되지 않은(투명 막대) 돼지 흉선을 2×105개 인간 태아 간-유래 CD34+ 세포를 정맥 주사한 흉선절제 NSG 마우스의 신피막 하에 이식하였다. 흉선 이식편 유래 비장세포 및 흉선세포를 이식 18 내지 22주 후에 유세포분석으로 분석하였다. 도 11A는 마우스의 각각의 그룹에서 인간 CD3+ T 세포의 절대 수의 그래프이다. 도 11B는 마우스의 각각의 그룹에서 인간 CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프이다. 도 11C는 마우스의 각각의 그룹에서 인간 CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프이다. 도 11D는 마우스의 각각의 그룹에서 비장의 단핵 세포에서 CD45RA+CCR7+ 세포로 정의된 최근 흉선 이주 CD31+CD4+ 미경험 세포의 절대 수의 그래프이다. 도 11E는 HuCD45, CD19, CD14, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO의 발현을 위해 염색된 마우스의 각각의 그룹에서 흉선세포에서 표시된 세포의 수의 그래프이다. 흉선세포는 huCD45+CD19-CD14- 세포로서 게이팅되었다. 총 인간 CD45 세포로서 게이팅된 흉선 이식편 절반으로부터 흉선세포의 절대 수, 이중 양성 CD4+CD8+, 단일 양성 CD4+CD8- 및 CD4-CD8+이 나타나 있다. SP CD4 및 CD8 세포는 더 성숙한 CD45RA+ 흉선세포와 비교하여 미성숙 CD45RO+로 추가로 서브게이팅되었다. 평균 + SEM은 2개의 독립적인 실험을 대표하는 hES-TEC가 주입된 돼지 흉선(n=6, 사각형) 및 돼지 흉선 단독(n=5, 삼각형)에 대하여 나타내어져 있다. 6×105개(SwTHY 및 SwTHY + TEC로부터 각각 n=1) 미만의 세포를 산출하는 흉선 이식편은 분석에서 제거되었다. SwTHY 단독을 SwTHY hES-TEC 주입 그룹과 비교하는 p-값을 결정하는 데 만-휘트니 검정(Mann-Whitney test)을 사용하였으며, 이 때 p<0.05는 유의한 것으로 간주하였다. *p<0.05, +p=0.05.
약어
SW- 돼지
HU- 인간
TEC- 흉선 상피 세포
TMC- 흉선 중간엽 세포
WBC- 백혈구
DP- 이중 양성 세포(CD4+, CD8+ 둘 다)
SP- 단일 양성 세포(CD4+ 또는 CD8+)
Treg- 조절 T 세포
LN- 림프절
TRA- 조직 제한 항원
2DG- 2D 글루코스
MACS- 자기 활성화 세포 분류
HSC- 인간 조혈 세포
본 개시내용은 생성된 인간 T-세포 레퍼토리의 최적 면역 기능으로 돼지 항원에 대한 면역 내성을 달성하기 위해 인간/돼지 하이브리드 흉선을 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 돼지 이종이식에 대한 내성이 발달할 수 있게 하면서 돼지 흉선에서 인간 T 세포의 기능 및 자가-내성을 개선시킴으로써 단순한 돼지 흉선을 사용할 때 직면하는 한계를 극복한다.
본 방법은 환자-특이적 흉선 상피 세포(TEC)를 포함하는 하이브리드 돼지-인간 흉선을 생성한다. 환자-특이적 TEC는 환자의 흉선으로부터 직접 수득하거나, 환자-특이적 유도 다능성 줄기 세포로부터 생성되거나, 환자와 인간 백혈구 항원(HLA) 대립유전자를 자연적으로 또는 인위적으로 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있다. 환자-특이적 TEC는 양성 선택에 참여할 수 있으며, 이는 말초에 있는 수용체 HLA 분자에 의해 제시된 외래 항원을 보다 용이하게 인식하는 T 세포를 생성한다. 추가적으로, 다수의 조직-특이적 항원(TSA)은 인간과 돼지 사이에서 상이하므로, 흉선에서 인간 TSA를 만드는 인간 TEC의 첨가는 자가면역으로부터의 보호를 보장하는 데 도움이 된다. 이와 같이, 돼지 흉선 대신에 하이브리드 흉선의 사용은 생성된 인간 T 세포 레퍼토리의 기능 및 자가-내성을 개선하고 이종이식 내성의 유도를 가능하게 할 수 있다.
본 하이브리드 흉선/흉선 조직(예를 들어, 하이브리드 돼지-인간 흉선/흉선 조직)은 또한 적절한 흉선 기능이 부족하거나 T-세포 면역결핍(예를 들어, 성인의 흉선 노화)이 있는 환자에서 면역 재구성에 사용될 수 있다. 하이브리드 흉선/흉선 조직(예를 들어, 하이브리드 돼지-인간 흉선/흉선 조직)의 적용은 약리학 및 약물 스크리닝을 위한 이종 모델, 의료 이종 이식 내성 테스트 및 준비, 및 이식 또는 면역 장애 치료 동안 사용되는 면역원성을 유발할 수 있는 치료 분자(예를 들어, mAb)에 대한 내성 유도를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하이브리드 흉선 조직은 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직을 말하고 제1 종의 수용체 포유동물 유래의 흉선 상피 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간(예를 들어, 환자-특이적) 흉선 상피 세포(TEC)를 포함하는 돼지 흉선/흉선 조직(예를 들어, 태아 흉선/흉선 조직)이 인간 흉선/흉선 조직(예를 들어, 환자의 흉선/흉선 조직)으로부터 수득되는 경우에 하이브리드 흉선/흉선 조직이 구축된다. 또 다른 실시형태에서, 인간(예를 들어, 환자-특이적) TEC를 포함하는 돼지 흉선/흉선 조직(예를 들어, 태아 흉선/흉선 조직)이 인간(예를 들어, 환자-특이적) 유도 다능성 줄기 세포로부터 생성되는 경우 하이브리드 흉선/흉선 조직이 구축된다. 또 다른 실시형태에서, 인간 TEC를 포함하는 돼지 흉선/흉선 조직(예를 들어, 태아 흉선/흉선 조직)이 환자와 HLA 대립유전자를 자연적으로 공유하거나 그렇게 되도록 조작된 배아 줄기 세포로부터 생성되는 경우 하이브리드 흉선/흉선 조직이 구축된다.
돼지 흉선 이식편에 인간 TEC를 포함시키면 항원 인식에 기능적 영향을 미칠 수 있다.
본 개시내용은 제1 종의 수용체 포유동물에서 제2 종의 공여체 포유동물로부터 수득한 이식편에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 하이브리드 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하되, 하이브리드 흉선 조직은 제2 종 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함하는 단계; 및 (b) 수용체 포유동물에서 공여체 포유동물 유래의 이식편을 이식하는 단계를 포함할 수 있다. 공여체는 미니 돼지를 포함한 돼지일 수 있다. 수용체는 인간일 수 있다.
본 개시내용은 또한 생성된 영장류 T-세포 레퍼토리의 최적 면역 기능으로 돼지 항원에 대한 면역 내성을 달성하기 위해 영장류-돼지 하이브리드 흉선/흉선 조직을 생성하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 일 실시형태는 돼지 대 개코원숭이의 하이브리드 흉선/흉선 조직을 제공한다.
하이브리드 흉선/흉선 조직은 주로 혈관화된 흉선엽 또는 복합 흉선-신장 이식편으로 이식될 수 있다.
하이브리드 흉선/흉선 조직은 수용체에서 근육내로 이식될 수 있다. 하이브리드 흉선/흉선 조직은 수용체에서 사두근 근육에만 이식되거나 추가적인 이식 부위(예를 들어, 신장 피막 및 장막)와 함께 이식될 수 있다. 문헌[Wu et al., Xenogeneic Thymus Transplantation in A Pig-to-baboon Model, Transplantation, 2003, 75(3): 282-291].
이종장기이식의 수용체는 제1 포유동물 종의 포유동물이다. 이종장기이식의 공여체는 제2 포유동물 종의 포유동물을 말한다. 공여체 포유동물은 이종장기이식을 위한 세포, 조직, 및/또는 장기의 공여체이다.
본 개시내용은 제1 종의 수용체 포유동물에서 제2 종의 공여체 포유동물로부터 수득된 이식편에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 하이브리드 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하되, 상기 하이브리드 흉선 조직은 제2 종 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함하는 단계; 및 (b) 공여체 포유동물 유래의 이식편을 수용체 포유동물에 이식하는 단계를 포함한다. 단계 (a)는 단계 (b) 이전에, 또는 단계 (b)와 동시에 수행될 수 있다.
본 개시내용은 또한 제1 종의 수용체 포유동물에서 면역적격을 회복 또는 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하이브리드 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하되, 하이브리드 흉선 조직은 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함한다.
또한, 본 개시내용은 T 세포 전구체가 제1 종의 수용체 포유동물에서 성숙한 기능성 T 세포로 발달하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 촉진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하이브리드 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하되, 하이브리드 흉선 조직은 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직이고 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 흉선 기능은 하이브리드 흉선 조직이 도입되기 전에 수용체 포유동물에서 본질적으로 부재한다. 또 다른 실시형태에서, 수용체 포유동물은 하이브리드 흉선 조직이 도입되기 전에 흉선제거를 받는다. 또 다른 실시형태에서, 수용체 포유동물은 면역 장애를 가진다.
제2 종은 돼지, 예컨대 미니 돼지일 수 있다.
제1 종은 영장류, 예컨대 비인간 영장류 또는 인간일 수 있다.
일 실시형태에서, 수용체 포유동물은 인간이고 공여체 포유동물은 미니 돼지이다.
제2 종 유래의 흉선 조직은 태아 흉선 조직, 또는 신생아 흉선 조직일 수 있다.
제1 종 유래의 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물의 흉선으로부터 수득될 수 있다. 제1 종 유래의 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 생성될 수 있다. 제1 종 유래의 흉선 상피 세포는 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 자연적으로 공유할 수 있거나 수용체 포유동물과 HLA 대립유전자를 공유하도록 유전자 조작된다.
일 실시형태에서, 하이브리드 흉선 조직은 수용체 포유동물에 이식된다. 예를 들어, 하이브리드 흉선 조직은 주로 혈관화된 흉선엽 또는 복합 흉선-신장 이식편으로 이식될 수 있다.
하이브리드 흉선 조직은 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종의 공여체 포유동물 유래의 흉선 조직에 도입함으로써 생성될 수 있다. 하이브리드 흉선 조직은 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종 유래의 흉선 조직에 주입함으로써 생성될 수 있다.
하이브리드 흉선 조직은 (i) 제2 종 유래의 흉선 조직을 2-데옥시글루코스(2DG)로 처리하는 단계; 및 (ii) 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 2DG-처리 흉선 조직에 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.
단계 (ii)에서 흉선 상피 세포는 2DG-처리 흉선 조직에 주입되기 전에, 생체재료, 예컨대 매트리젤에 현탁될 수 있다.
흉선 상피 세포는 제2 종 유래의 흉선 조직에 주입되기 전에 생체재료(예를 들어, 매트리젤)에 현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 종 유래의 흉선 조직에 도입되기 전에, 제1 종 유래의 흉선 상피 세포는 생체재료와 조합될 수 있다(예를 들어, 생체재료에 현탁될 수 있다). 생체재료는 졸-겔, 단백질이 함유된 하이드로겔, 매트리젤, 세포가 있는 인공적으로 구축한 스캐폴드, 및 이들의 조합일 수 있다. 생체재료의 비제한적인 예는 또한 폴리에틸렌-이민 및 덱스트란 설페이트, 폴리(비닐실록산)에코폴리머폴리에틸렌이민, 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글라이콜), 폴리(락트산-글리콜산), 폴리(락트산), 폴리하이드록시발레레이트 및 공중합체, 폴리하이드록시뷰티레이트 및 공중합체, 폴리다이옥사논, 폴리무수물, 폴리(아미노산), 폴리(오쏘에스터), 폴리에스터, 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로스 중합체, 키토산, 알지네이트, 피브로넥틴, 세포외 기질 단백질, 빈쿨린, 한천, 아가로스, 히알루론산, 매트리젤 및 이들의 조합일 수 있다.
본 방법은 조혈모세포(HSC)를 수용체 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이식편은 세포, 조직 또는 장기를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이식편은 조혈모세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이식편은 골수를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이식편은 심장, 신장, 간, 췌장, 폐, 장, 피부, 소장, 기관, 각막, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시내용은 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포 및 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직을 포함하는 단리된 하이브리드 흉선 조직을 제공한다.
돼지 흉선을 면역적격의 T 세포-고갈 및 흉선이 절제된 수용체에게 이식하는 것을 포함하는 매우 이질적인 이종 공여체의 중심 T 세포 내성을 달성하기 위해 대안적인 접근법을 개발하였다. 이러한 연구는 마우스에서 개시되었고, 시험관내에서 현저하고 특이적인 무반응과 공여체-특이적 피부 이식편 생존의 연장을 입증하였다. 문헌[Lee LA, Gritsch HA, Sergio JJ, et al. Specific tolerance across a discordant xenogeneic transplantation barrier. ProcNatlAcadSciUSA. 1994; 91:10864-10867. Zhao Y, Swenson K, Sergio JJ, Arn JS, Sachs DH, Sykes M. Skin graft tolerance across a discordant xenogeneic barrier. Nature Med. 1996; 2:1211-1216]. 뮤린 모델은 이종 흉선 이식편에서 T 세포 재구성에 의해 부여된 내성 메커니즘 및 면역 기능에 대한 광범위한 연구를 가능하게 하였다. 흉선내 클론 결실은 이종 공여체와 수용체에게 새로 개발되는 흉선세포를 내성화하는 주요 메커니즘이다. 문헌[Zhao Y, Sergio JJ, Swenson KA, Arn JS, Sachs DH, Sykes M. Positive and negative selection of functional mouse CD4 cells by porcine MHC in pig thymus grafts. J Immunol. 1997; 159:2100-2107. Zhao Y, Rodriguez-Barbosa JI, Shimizu A, Swenson K, Sachs DH, Sykes M. Despite efficient intrathymic negative selection of host-reactive T cells, autoimmune disease may develop in porcine thymus-grafted athymic mice: Evidence for failure of regulatory mechanisms suppressing autoimmunity. Transplantation. 2002; 75:1832-1840]. 추가적인 연구는 잔류 마우스 항-돼지 반응의 억제에 있어 돼지 흉선 이식편에서 발생하는 Treg와 관련이 있다. 문헌[Zhao et al. The induction of specific pig skin graft tolerance by grafting with neonatal pig thymus in thymectomized mice. Transplantation. 2000; 69:1447-1451. Rodriguez-Barbosa et al. Enhanced CD4 reconstitution by grafting neonatal porcine tissue in alternative locations is associated with donor-specific tolerance and suppression of pre-existing xenoreactive T cells. Transplantation. 2001; 72:1223-1231]. 이전에 뮤린 MHC 대립유전자의 양성 및 음성 선택이 확인된 다양한 MHC 1배체형 및 TCR의 T 세포 수용체(TCR) 유전자이식 수용체 마우스를 사용하여, 돼지 흉선 이식편에서 양성 선택이 돼지 흉선 MHC에 의해 독점적으로 매개되고, 이 때 뮤린 조혈 세포로부터 기여는 없는 반면, 음성 선택은 돼지 및 마우스 MHC 둘 다에 의해 매개되고 이는 공여체 돼지 흉선 이식편에서 2가지 종 유래의 클래스 II MHC+ APC의 존재와 일치함이 입증되었다. 문헌[Zhao Y, Rodriguez-Barbosa JI, Zhao G, Shaffer J, Arn JS, Sykes M. Maturation and function of mouse T cells with a transgeneic TCR positively selected by highly disparate xenogeneic porcine MHC. Cell Mol Biol. 2000; 47:217-228. Zhao Y, Swenson K, Sergio JJ, Sykes M. Pig MHC mediates positive selection of mouse CD4+ T cells with a mouse MHC-restricted TCR in pig thymus grafts. J Immunol. 1998; 161:1320-1326]. 놀랍게도, 양성 선택에서 뮤린 MHC 참여의 결여 및 돼지 흉선 및 뮤린 수용체의 완전한 MHC 차이에도 불구하고, 이러한 T 세포는 뮤린 MHC 분자에 의해 제시된 단백질 항원으로의 면역화에 반응할 수 있었으며, 가장 중요한 것은 소거율이 CD4+ T 세포에 의존하는 기회감염성 병원체로부터 마우스를 보호하는 것이다. 문헌[Zhao et al. Immune restoration by fetal pig thymus grafts in T cell-depleted, thymectomized mice. J Immunol. 1997; 158:1641-1649]. 이러한 결과는 다양한 T 세포 레퍼토리가 이종 흉선 이식편에서 선택되면 수용체 MHC에서 외래 항원의 인식을 위한 충분한 교차반응이 일어날 수 있음을 입증하는 것으로 해석된다.
내성에 대한 돼지 흉선 이식 접근법은 인간 T 세포가 정상적으로 발달할 수 있고 돼지 흉선 이식편에서 돼지 이종항원에 대해 중추적으로 내성화된다는 원리검증을 제공하기 위해 인간화 마우스 모델로 확장되었다. 문헌[Nikolic B, Gardner JP, Scadden DT, Arn JS, Sachs DH, Sykes M. Normal development in porcine thymus grafts and specific tolerance of human T cells to porcine donor MHC. J Immunol. 1999; 162:3402-3407. Kalscheuer HO, T.; Dahmani, A.; Li, H.; Holzl, M.; Yamada, K.; Sykes, M. Xenograft tolerance and immune function of human T cell developing in pig thymus xenografts. J Immunology. 2014;192(7):3442-3450]. 돼지 흉선 이식편에서 발생하는 흉선 및 말초 인간 T 세포는 모두 공여체 돼지에 대하여 특이적인 무반응을 나타내고, 혼합 림프구 반응(MLR)에서 제3자 돼지 및 동종이계 인간에 대하여 온전한 반응을 나타낸다. 이러한 T 세포는 또한 MLR에서 인간 조혈모세포(HSC) 공여체 및 뮤린 수용체에 대해 무반응을 나타내며, 이는 흉선 이종이식에서 검출되는 인간 공여체 APC 및 뮤린 APC 둘 다의 음성 선택에 대한 기여를 반영한다. 문헌[Kalscheuer et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 2012;4(125):125ra130]. 중요한 것은, 돼지 흉선 이식편에서 발달하는 인간 T 세포에 대해 공여체-특이적 피부 이식편 내성이 관찰된다는 것이다.
뮤린 모델의 결과를 기반으로, 내성에 대한 흉선 이종장기이식 접근법은 대형 동물인 돼지-대-개코원숭이 종의 조합으로 확장되었다. 개코원숭이의 신장 피막 아래에 배치된 돼지 흉선 단편을 사용한 초기 연구는 대조군과 비교하여 약간의 T 세포 회복, 시험관내 공여체-특이적 저반응 및 공여체 피부 이식편 생존 연장을 입증하였다. 그러나, 이식 및 혈관화된 돼지 흉선 조직의 양은 매우 제한적이었다. 문헌[Wu et al. Xenogeneic thymus transplantation in a pig-to-baboon model. Transplantation. 2003;75(3):282-291]. 보다 강력한 흉선 기능을 달성하기 위하여, 상기에서 언급한 뮤린 데이터를 고려하여, 돼지 흉선에서 발생하는 공여체-특이적 Treg가 컨디셔닝 요법에 의해 고갈되지 않는 기존 T 세포를 억제하는 데 필요할 것으로 예상하고, 후속 연구는 동종이계 돼지 신장 이식 모델의 내성 유도에서 이미 효능을 나타낸 주로 혈관화된 돼지 흉선을 이용하였다. 문헌[Yamada K, Shimizu A, Utsugi R, et al. Thymic transplantation in minature swine. II. Induction of tolerance by transplantation of composite thymokidneys to thymectomized recipients. J Immunol. 2000; 164:3079-3086]. 흉선은 돼지의 신장 피막 아래에 자가 흉선 단편을 배치하거나 개코원숭이의 돼지 흉선엽의 직접 혈관 문합에 의해 몇 개월 이전에 공여체 돼지에서 준비된 복합 "흉선신장(thymokidney)" 이식편의 일부로서 이식되었다. 문헌[Yamada K, Yazawa K, Shimizu A, et al. Marked prolongation of porcine renal xenograft survival in baboons through the use of alpha1,3-galactosyltransferase gene-knockout donors and the cotransplantation of vascularized thymic tissue. Nature medicine. 2005;11(1):32-34]. 두 가지 접근법 모두 처음으로 개코원숭이에서 GalT 녹아웃 돼지 신장의 장기 생존을 야기하였다. 문헌[Tasaki et al., Rituximab treatment prevents the early development of proteinuria following pig-to-baboon xeno-kidney transplantation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2014; 25(4):737-744]. 이러한 처리를 받은 동물의 생존은 항-CD40L의 혈전증 합병증 및 미세변화병-유사 사구체병증으로 인한 단백뇨에 의해 제한되었으며, 이는 비혈전성 항-CD40을 사용하고 각각 리툭시맙과 CTLA4Ig를 투여함으로써 회피할 수 있다. 문헌[Yamada et al., Xenotransplantation: Where Are We with Potential Kidney Recipients? Recent Progress and Potential Future Clinical Trials. Curr Transplant Rep. 2017; 4(2):101-109].
돼지 흉선신장 이식편을 받은 개코원숭이는 돼지 흉선 이식편에서 드노보(de novo) 수용체(개코원숭이) 흉선세포발달(thymopoiesis), 말초에서 최근 흉선 이주의 출현 및 엘리스폿(Elispot) 및 MLR 분석에서 공여체-특이적 무반응의 증거뿐만 아니라, 비-Gal 천연 항체의 감소를 나타내었다. 문헌[Tanabe et al. Role of Intrinsic (Graft) Versus Extrinsic (Host) Factors in the Growth of Transplanted Organs Following Allogeneic and Xenogeneic Transplantation, Am J Transplant. 2017 Jul; 17(7):1778-1790]. 후자는 돼지 신장에 의한 흡수를 반영할 수 있지만, 보체 고정이나 상당한 병리 없이 이러한 이종이식에서 최소 IgM 결합이 검출되었다. 따라서, 이러한 모델로 얻은 결과는 영장류에서 내성을 유도하는 복합 흉선-신장 이종이식의 잠재력을 입증한다.
이종 돼지 흉선에서 인간 T 세포 레퍼토리를 생성하는 한계는 돼지 MHC에서 미생물 항원의 우선적인 인식을 포함하며, 이는 이식편을 보호하는 데 유용할 것이지만 숙주를 감염시키는 미생물 병원체에 대한 보호를 최적화하지 않을 뿐만 아니라 종래 T 세포를 음성으로 선택하고 인간 조직-제한 항원(TRA)를 인식하는 Tres를 양성으로 선택하는 것을 못한다. 실제로, 인간화 마우스에서의 연구는 인간 T 세포가 인간 흉선 이식편이 아닌 돼지에서 발달했을 때 면역화 후 인간 APC에 의해 제시되는 펩타이드에 대한 반응 감소를 나타내었다.
이러한 한계를 극복하기 위한 접근법은 "하이브리드 흉선"의 생성을 포함하며, 여기서 흉선절제 표본에서 수득하거나 줄기 세포로부터 생성된 수용체 흉선 상피 세포는 돼지 흉선 조직에 주입된다. 출생후 흉선 공여체로부터 하이브리드 흉선이 생성되었으며, 여기서 하이브리드 흉선은 인간 T 세포 사이에서 인간 TRA에 대한 내성을 촉진시킨다.
돼지 흉선 이식편은 정상적이고 다양한 뮤린 또는 인간 T 세포 레퍼토리의 발달을 지지하는 것으로 나타났으며, 이들 T 세포는 이종 돼지 공여체에게 특히 내성이 있음을 나타내었다. 그러나, 말초에서 수용체 HLA 분자에 의해 제시된 외래 항원의 인식은 차선책이다. 따라서, 면역 기능은 최적보다 더 낮을 수 있다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 이는 돼지-인간 하이브리드 흉선 이식편에서 수용체 TEC를 제공함으로서 극복될 수 있는데, 그 이유는 이들 TEC가 양성 선택에 참여하여, 말초에서 수용체 HLA 분자에 의해 제시되는 외래 항원을 보다 용이하게 인식할 수 있는 T 세포를 생성할 것이기 때문이다. 돼지 흉선 이식편의 경우, 말초에서 "양성 선택" 리간드를 찾지 못하는 T 세포의 생존, 항상성 및 기능은 차선책이다. 양성 선택 리간드는 흉선세포가 MHC/펩타이드 복합체를 인식하는 낮은 친화성 T 세포 수용체를 가질 때 프로그래밍된 세포 사멸로부터 흉선세포를 구출하는 TEC 상의 MHC/펩타이드 복합체이다. 돼지-인간 하이브리드 흉선에서 수용체 TEC를 제공하면 말초에서 수용체 세포 상의 동일한 리간드를 찾을 T 세포의 양성 선택을 가능하게 하여, 정상적인 생존, 항상성 및 기능을 부여한다. 돼지 흉선 이식편의 경우, TEC는 다르게는 말초에서 매우 특이적인 조직에서만 발현되는 항원(즉, 조직-특이적 항원, TSA)을 생성한다. TEC에 의한 TSA의 이러한 발현의 2가지 중요한 결과는 다음과 같다: a) 흉선세포를 강하게 인식하여 레퍼토리에서 이러한 자가반응 T 세포를 제거하는 흉선세포의 클론 결실; b) 조절 T 세포를 인식하여, 말초에서 자가면역을 방지하기 위한 안전망을 추가하는 조절 T 세포의 양성 선택. 많은 TSA가 인간과 돼지 사이에서 상이하므로, 돼지-인간 하이브리드 흉선 이식편에서 인간 TSA를 만들기 위한 인간 TEC의 추가는 자가면역으로부터 보호를 보장하는 데 도움이 될 것이다.
요약하면, 단순한 돼지 흉선 대신에 하이브리드 흉선의 사용은 돼지에 대한 내성이 발달할 수 있게 하면서 돼지 흉선에서 생성되는 인간 T 세포 레퍼토리의 기능 및 자가-내성을 개선시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 수용체는 흉선절제를 받는다. 또 다른 실시형태에서, 수용체는 흉선제거를 받지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 수용체는 연령으로 인해 낮은 속도의 흉선세포발달이 있다. 또 다른 실시형태에서, 수용체는 노화 흉선을 가진다.
본 하이브리드 흉선/흉선 조직을 사용하는 흉선 이종장기이식은 혼합 키메리즘 유도와 조합될 수 있거나 조합되지 않을 수 있다. 예를 들어, 흉선 이종장기이식이 지속성 혼합 돼지-인간 키메리즘을 이용하여 혼합 키메리즘 유도와 조합될 때, 돼지 및 인간 APC는 둘 다 천연 인간 흉선 및 돼지 흉선 이종이식에 존재할 것이며, 이는 조혈 세포 상에서 발현되는 돼지 또는 인간 항원을 인식하는 흉선세포의 평생 음성 선택을 보장한다. 게다가, 돼지 또는 인간 TRA를 인식하는 종래 T 세포는 관련 종의 흉선에서 결실될 것이며 반대 종의 흉선에서의 발달로 인해 결실을 벗어난 T 세포는 다른 흉선에서 발달하는 TRA-특이적 Treg에 의해 적절하게 억제될 것이다. 혼합 돼지 키메리즘은 알려지지 않은 이종 표적을 인식하는 천연 항체의 내성을 보장할 것이며 NK 세포도 또한 내성화될 것이다.
이종장기이식은 이종장기이식을 수행하는 능력이 장기 이종이식 전에 내성 프로토콜(예를 들어, 혼합 키메리즘 유도)의 적용을 선택적으로 허용하기 때문에, 그 자체는 사망한 인간 공여체로부터의 동종이식보다 더 용이하게 내성 유도를 야기한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 먼저 수용체의 면역계를 내성화하는 단계, 내성이 달성되었는지 확인하는 단계 및 후속적으로 면역억제없이 또는 단기의 면역억제 과정으로 장기 이식을 장기 이식을 수행하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 제1 종의 수용체 포유동물(예를 들어, 영장류, 예컨대 인간)에서 제2 종의 포유동물, 예를 들어 돼지로부터 수득된 이식편에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 이식편의 이식 전 또는 이식과 동시에, 하이브리드 흉선/흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하는 단계; 및 (선택적으로) 이식편을 수용체에 이식하는 단계를 포함한다. 하이브리드 흉선/흉선 조직은 T-세포 수준에서 면역학적 내성을 유도함으로써 다음 이식편을 위한 수용체를 준비한다.
본 개시내용은 수용체에서 이종이식 내성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하이브리드 흉선/흉선 조직을 수용체에 도입하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 하이브리드 흉선/흉선 조직을 받은 무흉선 T 세포-고갈 수용체의 숙주 T 세포는 하이브리드 흉선/흉선 조직에서 성숙할 수 있다. 이식된 하이브리드 흉선/흉선 조직에서 성숙하는 숙주 T 세포는 면역적격이 있다.
본 개시내용은, T 세포 전구체를 생성할 수 있지만 흉선 기능이 결핍되어 정상적인 면역 반응을 위한 충분한 수의 성숙한 기능성 T 세포를 생성할 수 없는, 숙주 또는 수용체, 예를 들어 영장류 숙주 또는 수용체, 예를 들어 인간에서 면역적격을 회복 또는 유도하는(또는 T 세포 전구체가 기능성 성숙한 T 세포로 성숙하거나 발달하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 촉진시키는) 방법을 제공한다. 방법은 수용체에 하이브리드 흉선/흉선 조직을 도입하여 숙주 T 세포가 이식된 하이브리드 흉선/흉선 조직에서 성숙할 수 있도록 하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 수용체/숙주는 영장류, 예를 들어 인간이고, 공여체는 돼지, 예를 들어 미니 돼지이다.
방법은 하이브리드 흉선/흉선 조직의 수용을 용이하게 하거나, 그렇지 않으면 방법을 최적화하는 다른 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 간 또는 비장 조직, 예컨대 태아 또는 신생아 간 또는 비장 조직이 흉선 조직과 함께 이식되고; 공여체 조혈 세포, 예를 들어 제대혈 줄기 세포 또는 태아 또는 신생아 간 또는 비장 세포가 수용체에게 투여되며, 예를 들어 태아 간 세포의 현탁액이 복강내 또는 정맥내로 투여된다. 수용체는, 예컨대 하이브리드 흉선/흉선 조직이 도입되기 전 또는 도입 당시에, 흉선절제를 받을 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 (바람직하게는 흉선 조직을 수용체에 도입하기 전 또는 도입 시점에) 예를 들어 수용체에 수용체의 NK 세포와 결합할 수 있는 항체를 도입함으로써 수용체의 자연 살해(NK) 세포를 고갈, 불활성화 또는 억제시켜, 흉선 조직의 NK 매개 거부반응을 방지하는 단계; (바람직하게는 흉선 조직을 수용체에 도입하기 전 또는 도입 시점에) 예를 들어 수용체에 수용체의 T 세포와 결합할 수 있는 항체를 도입함으로써 숙주 T 세포 기능을 고갈, 불활성화 또는 억제시키는 단계; (바람직하게는 흉선 조직을 수용체에 도입하기 전 또는 도입 시점에) 예를 들어 수용체에 수용체의 CD4, 또는 CD4+ 세포와 결합할 수 있는 항체를 도입함으로써 숙주 CD4+ 세포 기능을 고갈, 불활성화 또는 억제시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태는 (바람직하게는 흉선 조직 또는 조혈모세포 이식 전에) 예를 들어 다음 중 하나 이상에 의해 조혈 공간을 생성하는 단계를 포함한다: 저선량, 예를 들어 약 100 내지 400 ㎭의 전신 방사선 조사로 수용체 포유동물을 방사선조사, 골수억제 약물의 투여, 또는 (바람직하게는 흉선 조직 이식 전에) 수용체의 골수를 고갈 또는 부분적으로 고갈시키기 위한 조혈모세포 불활성화 또는 고갈 항체의 투여.
특정 실시형태는 (바람직하게는 흉선 조직 또는 조혈모세포 이식 전에) 다음 중 하나 이상에 의해 흉선 T 세포를 불활성화시키는 단계를 포함한다: 예를 들어 약 700 ㎭의 흉선 방사선조사로 숙주를 방사선조사하는단계, 수용체에게 항 T 세포 항체, 예를 들어 항-CD4 및/또는 항-CD8 단클론성 항체의 1회 이상의 용량을 투여하는 단계, 또는 수용체에게 단기 과정의 면역억제제를 투여하는 단계.
특정 실시형태는, 예를 들어 다음 중 하나 이상에 의해 천연 항체를 고갈시키거나 다르게는 불활성화시키는 단계를 포함한다: 천연 항체를 고갈 또는 불활성화시키는 약물, 예를 들어 데옥시스페르구알린의 투여; 항-IgM 항체의 투여, 또는, 예를 들어 공여체 종 유래의 공여체 장기, 예를 들어 신장 또는 간의 혈액관류에 의해, 예를 들어 숙주 혈액과 공여체 항원의 접촉에 의한, 숙주 혈액으로부터 천연 항체의 흡착.
수용체에 의한 이식편의 수용을 촉진시키기 위한 다른 방법이 본 명세서에 개시된 방법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 흉선 조직에 대한 내성은 또한 공여체 항원, 예를 들어 공여체 MHC 유전자를 발현하는 핵산을 수용체의 세포, 예를 들어 조혈모세포에 삽입하고, 유전자 조작된 세포를 수용체에 도입함으로써 유도될 수 있다. 예를 들어, 인간 수용체 줄기 세포는 돼지 MHC 유전자, 예를 들어 돼지 클래스 I 또는 클래스 II MHC 유전자, 또는 클래스 I 및 클래스 II 유전자 둘 다를 발현하도록 조작될 수 있으며, 세포는 하이브리드 흉선 조직을 받을 인간 수용체에서 이식될 수 있다. 수용체 영장류, 예를 들어 인간에게 삽입될 때, 공여체 MHC 유전자의 발현은 공여체 항원에 대한 후속 노출에 대한 내성을 초래하고 따라서 흉선 조직에 대한 내성을 유도할 수 있다.
예를 들어 조혈모세포의 이식에 의해 내성을 유도하는 방법은 또한 본 명세서에 개시된 방법과 조합될 수 있다.
내성을 유도하는 다른 방법은 또한 흉선 조직의 수용을 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단기 과정의 고용량 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린의 투여에 의해 유도될 수 있는, 예를 들어 헬퍼 T 세포의 억제는 내성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 방법에서, 헬퍼 T 세포는 이식편의 이식 직후 비교적 짧은 기간 동안 억제되며, 만성 면역억제를 필요로 하지 않거나 포함하지 않는다.
예를 들어 사이토카인 활성 수준을 변경시키거나, 이식편대수용체병을 억제함으로써 공여체 조직의 내성을 촉진시키거나 수용을 촉진시키는 다른 방법이 또한 본 방법과 함께 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 공여체 포유동물로부터 이식편을 받은 수용체 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간에서 T 세포 활성, 바람직하게는 흉선 또는 림프절 T 세포의 활성을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 이식편에 대한 내성을 유도하는 단계; 수용체에게 T 세포, 바람직하게는 흉선 또는 림프절 T 세포를 불활성화시키는 데 충분한 단기 과정의 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "흉선-기능 결핍"은 T 세포의 성숙을 지지하는 개체의 흉선의 능력이 정상적인 개체와 비교하여 손상된 상태를 말한다. 흉선 결핍 상태는 흉선 또는 흉선 기능이 본질적으로 부재인 상태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "내성"은, 예를 들어 수용체에 비자가 MHC 항원을 도입하는 것에 반응하여, 그렇지 않으면 일어날 것인, 예를 들어 공여체 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 이식편 수용체 능력의 억제 또는 감소를 말한다. 내성은 체액성, 세포성, 또는 체액성과 세포성 반응을 둘 다 포함할 수 있다. 내성의 개념은 완전한 내성 및 부분 내성을 둘 다 포함한다. 즉, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 내성은 예를 들어 공여체 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 이식편 수용체 능력의 임의의 억제 정도를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "조혈모세포"는 성숙한 골수 및/또는 림프계 세포로 발달할 수 있는 세포를 말한다. 바람직하게는, 조혈모세포는 골수 및/또는 림프계 계통의 장기 재증식이 가능하다. 수용체 또는 공여체의 제대혈로부터 유래된 줄기 세포는 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "미니 돼지"는 완전히 또는 부분적으로 근친교배된 미니 돼지를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "이식편"은 신체 부분, 장기, 조직, 세포, 또는 이의 일부를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "기질 조직"은 기능적 요소 또는 실질(parenchyma)과 구별되는 장기의 지지 조직 또는 매트릭스를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 면역적격을 회복, 유도, 또는 촉진시키는 것은 다음 중 하나 또는 둘 다를 의미한다: (1) 수용체에서 성숙된, 수용체-성숙 기능성 T 세포의 수를 증가시키는 것 또는 성숙한 기능성 공여체-T 세포를 제공하는 것 또는 이들 둘 다에 의해 (본 개시내용의 방법으로 처리하지 않을 때 보이는 것보다) 수용체에서 성숙한 기능성 T 세포의 수를 증가시키는 것; 또는 (2) 예를 들어 리콜 항원에 대한 피부 반응을 증가시키는 증력에 의해 측정되는 바와 같이, 수용체의 면역-반응성을 개선시키는 것, 또는 예를 들어 항원에 대한 증식 반응, 예를 들어 파상풍 항원 또는 동종항원에 대한 반응의 개선에 의해, 예를 들어 시험관내 테스트에 의해 측정되는 바와 같이 수용체의 T 세포의 반응성을 개선시키는 것.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, T 세포 전구체가 성숙한 T 세포로 성숙하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 유도하는 것은 T 세포가 성숙할 수 있는 공여체 흉선 조직을 제공함으로써, 수용체에서 수용체 기원의 기능성 성숙한 T 세포의 수를 증가시키는 것, 또는 성숙한 기능성 공여체 T 세포를 수용체에게 제공하는 것 또는 둘 다를 의미한다. 증가는 부분적, 예를 들어 성숙한 기능성 T 세포의 수준을 본질적으로 정상적인 면역 반응을 초래하는 수준까지 올리지 않는 증가이거나 또는 부분적, 예를 들어 성숙한 기능성 T 세포의 수용체 수준을 본질적으로 정상적인 면역 반응을 초래하는 수준까지 올리지 못하는 증가일 수 있다.
특정 실시형태에서, 장기 이식 또는 흉선 대체를 위한 수용체의 준비는 다음 단계 중 임의의 것 또는 전부를 포함한다. 이는 다음 순서로 수행될 수 있다.
먼저, 말 항-인간 흉선세포 글로불린(ATG)의 제제를 수용체에게 정맥 주사한다. 항체 제제는 성숙한 T 세포 및 자연 살해 세포를 제거한다. 제거되지 않으면, 성숙한 T 세포는 흉선 이식, 및 감작 후 이종이식 장기 둘 다의 거부반응을 촉진시킬 수 있다. ATG 제제는 또한 자연 살해(NK) 세포를 제거한다. NK 세포는 아마도 이식된 기관에는 영향을 미치지 않지만, 새로 도입된 흉선 조직을 즉시 거부하는 작용을 할 수 있다. 지금까지 돼지 ATG 제제가 말-유래 ATG보다 더 낮은 역가를 가졌지만, 임의의 포유동물 숙주로부터 수득된 항-인간 ATG, 예를 들어 돼지에서 생성된 ATG가 또한 사용될 수 있다. 항-NK 단클론성 항체는 일반적으로 모든 숙주 NK 세포에 대해 용해성이 아닌 반면, ATG의 다클론성 혼합물은 모든 숙주 NK 세포를 용해할 수 있으므로, ATG는 항-NK 단클론성 항체보다 우수하다. 그러나, 항-NK 단클론성 항체가 사용될 수 있다. 상대적으로 심한 면역손상을 입은 개체에서, 이 단계는 필요하지 않을 수 있다. 이종 흉선에서 숙주(또는 공여체) T 세포가 성숙함에 따라 이들 세포는 흉선 조직에 대해 내성이 있을 것이다. 대안적으로, 숙주 면역계가 점진적으로 회복됨에 따라, 흉선 조직에 대한 내성을 유도하기 위해 숙주를 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
최적으로, 수용체는 흉선절제를 받을 수 있다. 흉선절제된 수용체에서, 수용체 T 세포는 수용체 흉선에서 분화할 기회가 없지만, 하이브리드 흉선 조직에서 분화해야 한다. 일부 경우에, 빈혈을 회피하기 위해 수용체의 비장을 절제하는 것이 필요할 수 있다.
둘째로, 수용체는 저선량 방사선을 투여받을 수 있다. 이 단계는 (새로 주입된 골수 세포를 위한 조혈 공간을 생성함으로써) 골수 이식에서 유익하다고 생각되지만, 골수 이식을 수반하지 않는 흉선 이식편에서는 덜 중요하다. 그러나, 치사량 이하 선량, 예를 들어 약 100 ㎭, 또는 100 ㎭ 초과 및 약 400 ㎭ 미만의 선량의 전신 방사선, 및 700 ㎭의 국소 흉선 방사선이 사용될 수 있다.
셋째로, 천연 항체는 수용체의 혈액으로부터 흡착될 수 있다. 항체 제거는 수용체의 혈액을 공여체 또는 공여체 종 항원에 노출시킴으로써, 예를 들어 수용체-천연 항체를 흡착하기 위해 공여체 종의 간의 혈액관류에 의해 달성될 수 있다. 미리 형성된 천연 항체(nAb)는 이식편 거부반응의 주요 동인이다. 천연 항체는 이종 내피 세포에 결합하고 주로 IgM 클래스에 속한다. 이들 항체는 이종 공여체의 항원에 대한 임의의 알려진 이전 노출과는 무관하다. 이러한 천연 항체를 생성하는 B 세포는 T 세포-독립적인 경향이 있으며, 일반적으로 발달 동안 이들 항원에 대한 노출에 의해 자가 항원에 대해 내성화된다. 다시 말하면, 이 단계는 적어도 초기에는 비교적 심각한 면역손상 환자에서 필요하지 않을 수 있다.
하이브리드 흉선 조직은 수용체에서 이식된다. 태아 또는 신생아 간 또는 비장 조직이 포함될 수 있다.
이들 절차 전부를 포함하여 이들 절차 중 하나 또는 임의의 조합은 이식된 흉선 조직 또는 또 다른 이종 기관의 생존을 도울 수 있다.
본 개시내용의 방법은 이종 이식편에 대해 내성을 부여하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 여기서 이식편 공여자는 비인간 동물, 예를 들어 돼지, 예를 들어 미니 돼지이고, 이식편 수용체는 영장류, 예를 들어 인간이다.
이종이식의 공여체 및 내성-유도 흉선 조직을 공급하는 개체는 동일한 개체일 수 있거나 가능한 한 밀접한 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, 고도로 또는 완전히 근친교배된 공여체의 콜로니로부터 이종이식을 유도하는 것이 바람직하다.
제2 포유동물 종(즉, 공여체)은 비-인간 포유동물 종, 예컨대 돼지 종(예를 들어, 미니 돼지 종) 또는 비-인간 영장류 종일 수 있다. 제1 포유동물 종의 비제한적인 예는 돼지, 설치류, 비-인간 영장류, 소, 염소, 및 말을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 포유동물 종(즉, 공여체)은 적어도 부분적으로 근친교배된 미니 돼지이다(예를 들어, 돼지는 돼지 백혈구 항원(SLA) 유전자좌에서 동형접합성이고/거나, 다른 모든 유전자좌의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상에서 동형접합성임). 유전자 조작은 전적으로 또는 부분적으로 근친교배된 돼지(예를 들어, 미니 돼지, 유전자이식 돼지 등)에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 근친교배된 메사추세츠 종합 병원(MGH) 미니 돼지가 본 방법에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 40년 넘게 근친교배되어 왔고 모든 유전자 좌에서 동형접합성인 MGH 미니 돼지를 포함한다. 일 실시형태에서, 근친교배된 SLAdd 미니 돼지가 사용될 수 있다. 문헌[Mezrich et al. and Sachs, Histocompatible miniature swine: An inbred large-animal model. Transplantation,　2003;　75:904-907]. 미국 국립 돼지 연구 자원 센터(NSRRC, RADIL, 미주리 대학, 미국 미주리주 컬럼비아 소재)의 돼지가 또한 본 방법에서 사용될 수 있다.
제1 포유동물 종(즉, 수용체)은 영장류, 예컨대 비-인간 영장류(예를 들어, 개코원숭이, 또는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey), 또는 인간일 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 종은 인간이다.
다양한 실시형태에서, 공여체(제2 종) 및 수용체(제1 종)는 상이한 종이다. 예를 들어, 공여체는 비-인간 동물, 예를 들어 미니 돼지이고, 수용체는 인간이다.
또한 본 개시내용에 제2 포유동물 종의 이와 같은 공여체 동물 유래의 이식편을 제1 포유동물 종(예를 들어, 인간)의 수용체 포유동물에 이식하는 방법이 포함된다.
본 유전자이식 공여체 동물의 세포, 조직, 장기 또는 체액은 이식(예를 들어, 이종장기이식)에 사용될 수 있다. 이식을 위해 공여체 동물로부터 채취한 이식편은 심장, 신장, 간, 췌장, 폐 이식, 장, 피부, 갑상선, 골수, 소장, 기관, 각막, 사지, 뼈, 내분비선, 혈관, 결합 조직, 전구 줄기 세포, 혈액 세포, 조혈 세포, 랑게르한스섬, 뇌 세포 및 내분비 및 다른 장기 유래의 세포, 체액, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 조혈 세포(예를 들어, 조혈모세포, 림프구, 골수 세포), 췌장 세포(예를 들어, 베타-섬 세포), 신장 세포, 심장 세포 또는 간 세포이다.
공여체 동물의 골수 세포(BMC), 또는 조혈모세포(예를 들어, 태아 간 현탁액 또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포)가 수용체에게 주입될 수 있다.
방법은 또한 다음 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다: T 세포를 억제하거나, 보체를 차단하거나, 그렇지 않으면 이식편에 대한 수용체 면역 반응을 하향 조절하는 치료.
내성을 촉진시키고/거나 이식편의 면역 인식을 감소시키는 치료는 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린, FK506), 항체(예를 들어, 항-T 세포 항체, 예컨대다클론성 항-흉선세포 항혈청(ATG), 및/또는 단클론성 항-인간 T 세포 항체, 예컨대 LoCD2b), 방사선조사, 및 혼합 키메리즘을 유도하는 방법의 사용을 포함한다. 미국 특허 제6,911,220호; 제6,306,651호; 제6,412,492호; 제6,514,513호; 제6,558,663호; 및 제6,296,846호. 문헌[Kuwaki et al., Nature Med., 11(1):29-31, 2005. Yamada et al., Nature Med. 11 (1):32-34, 2005].
일부 실시형태에서, 수용체는 흉선절제 및/또는 비장절제를 받았다. 흉선 방사선조사가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 수용체는 저선량의 방사선(예를 들어, 100 ㎭ 내지 400 ㎭의 치사량 이하 선량의 전신 방사선)이 투여받는다. 국소 흉선 방사선이 또한 사용될 수 있다.
수용체는 보체를 고갈시키는 작용제, 예컨대 코브라 독 인자로 처리될 수 있다.
천연 항체는 장기 관류, 및/또는 내성-유도 골수의 이식에 의해 제거될 수 있다. 천연 항체는 공여체 종의 간의 혈액관류에 의해 수용체의 혈액으로부터 흡수될 수 있다. 이식에 사용되는 세포, 조직, 또는 장기는 이들이 숙주의 천연 항체에 의해 인식되지 않도록 유전자 변형될 수 있다(예를 들어, 세포는 a-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 결핍임).
일부 실시형태에서, 방법은 인간 항-인간 CD154 mAb, 마이코페놀레이트 모페틸, 및/또는 메틸프레드니솔론을 이용한 처리를 포함한다. 방법은 또한 지지 요법에 유용한 작용제, 예컨대 항염증제(예를 들어, 프로스타사이클린, 도파민, 간시클로버, 레보플록사신, 시메티딘, 헤파린, 안티트롬빈, 에리스로포이에틴, 및 아스피린)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 공여체 기질 조직이 투여된다.
면역억제 작용제로도 지칭되는 면역억제제는 면역계의 하나 이상의 양태, 예컨대 체액성 또는 세포성 면역계 또는 보체 시스템의 성분의 기능 또는 활성을 감소시키는 임의의 화합물일 수 있다.
면역억제제의 비제한적인 예는, (1) 대사길항제, 예컨대 퓨린 합성 억제제(예컨대, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소(IMPDH) 억제제, 예를 들어 아자티오프린, 마이코페놀레이트, 및 마이코페놀레이트 모페틸), 피리미딘 합성 억제제(예를 들어, 레플루노미드 및 테리플루노미드), 및 엽산길항제(예를 들어, 메토트렉세이트); (2) 칼시뉴린 억제제, 예컨대 타크로리무스, 사이클로스포린 A, 피메크롤리무스, 및 보클로스포린; (3) TNF-알파 억제제, 예컨대 탈리도마이드 및 레날리도마이드; (4) IL-1 수용체 길항제, 예컨대 아나킨라; (5) 포유동물 라파마이신 표적(mTOR) 억제제, 예컨대 라파마이신(시롤리무스), 데포롤리무스, 에베로리무스, 템시롤리무스, 조타롤리무스, 및 비올리무스 A9; (6) 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손; 및 (7) 다수의 세포 또는 혈청 표적 중 임의의 하나에 대한 항체(항-림프구 글로불린 및 항-흉선세포 글로불린을 포함함)를 포함한다.
비제한적인 예시적 세포 표적 및 이의 각각의 억제제 화합물은 보체 성분 5(예를 들어, 에쿨리주맙); 종양 괴사 인자(TNF)(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세톨리주맙 페골, 아펠리모맙 및 골리무맙); IL-5(예를 들어, 메폴리주맙); IgE(예를 들어, 오말리주맙); BAYX(예를 들어, 네렐리모맙); 인터페론(예를 들어, 파랄리모맙); IL-6(예를 들어, 엘실리모맙); IL-12 및 IL-13(예를 들어, 레브리키주맙 및 우스테키누맙); CD3(예를 들어, 무로모납-CD3, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙); CD4(예를 들어, 클레놀릭시맙, 케릭시맙 및 자놀리무맙); CD11a(예를 들어, 에팔리주맙); CD18(예를 들어, 에를리주맙); CD20(예를 들어, 아푸투주맙, 오크렐리주맙, 파스콜리주맙); CD23(예를 들어, 루밀릭시맙); CD40(예를 들어, 테네릭시맙, 토랄리주맙); CD62L/L-셀렉틴(예를 들어, 아셀리주맙); CD80(예를 들어, 갈릭시맙); CD147/바시긴(basigin)(예를 들어, 가빌리모맙); CD154(예를 들어, 루플리주맙); BLyS(예를 들어, 벨리무맙); CTLA-4(예를 들어, 이필리무맙, 트레멜리무맙); CAT(예를 들어, 베르틸리무맙, 레르델리무맙, 메텔리무맙); 인테그린(예를 들어, 나탈리주맙); IL-6 수용체(예를 들어, 토실리주맙); LFA-1(예를 들어, 오둘리모맙); 및 IL-2 수용체/CD25(예를 들어, 바실릭시맙, 다클리주맙, 이놀리모맙)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
수용체의 천연 항체는 장기 관류, 및/또는 내성-유도 골수 이식에 의해 제거될 수 있다.
일 실시형태에서, 수용체는 (예를 들어 이식 전 제-3일, 제-2일, 제-1일에, 예를 들어 대략 25 내지 100 ㎎/㎏, 예를 들어 50 ㎎/㎏의 용량으로) 정맥 내로 주입되는 말 항-인간 흉선세포 글로불린(ATG)의 제제로 처리된다. 항체 제제는 성숙한 T 세포 및 자연 살해 세포를 제거한다. ATG 제제는 또한 자연 살해(NK) 세포를 제거한다. 임의의 포유동물 숙주로부터 수득한 항-인간 ATG가 또한 사용될 수 있다. 추가적으로, 추가 T 세포 고갈이 지시되면, 수용체는 단클론성 항-인간 T 세포 항체, 예컨대 LoCD2b(이머지 바이오테라퓨틱스 인코포레이티드(Immerge BioTherapeutics, Inc.), 미국 매사추세츠주 케임브리지 소재)로 처리될 수 있다. 골수 이식의 경우, 수용체는 저선량 방사선을 투여받을 수 있다. 일부 경우에, 수용체는 보체를 고갈시키는 작용제, 예컨대 코브라 독 인자로 (예를 들어, 제-1일에) 처리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유지 요법(예를 들어, 이식 직전에 시작하여 이식 후 적어도 며칠 동안 계속)은 인간 항-인간 CD154 mAb를 이용한 처리를 포함한다. 마이코페놀레이트 모페틸(MMF)은 전혈 수준을 유지하기 위해 투여될 수 있다. 메틸프레드니솔론은 또한 이식 일에 시작하여 그 이후 다음 3 내지 4주에 걸쳐 용량을 줄이면서 투여될 수 있다.
지지 요법(예를 들어, 제0일 내지 제14일)에 유용한 다양한 작용제는 항염증제, 예컨대 프로스타사이클린, 도파민, 간시클로버, 레보플록사신, 시메티딘, 헤파린, 안티트롬빈, 에리스로포이에틴, 및 아스피린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 공여체 기질 조직이 투여된다. 공여체 기질 조직은 태아 간, 흉선, 및/또는 태아 비장으로부터 수득될 수 있고, 수용체, 예를 들어 신장 피막으로 이식될 수 있다. 흉선 조직은 혈관재형성을 위해 자가 신장 피막 아래에 이식함으로써 이식을 위해 준비될 수 있다. 이질적인 종의 장벽을 가로지르는 줄기 세포 생착 및 조혈작용은 공여체 종 유래의 조혈 기질 환경을 제공함으로써 향상될 수 있다. 기질 매트릭스는 조혈 세포와 이의 기질 환경 사이의 상호작용에 필요한 종-특이적 인자, 예컨대 조혈 성장 인자, 접착 분자, 및 이의 리간드를 공급한다.
간은 태아에서 조혈작용의 주요 부위이므로, 태아 간은 또한 조혈모세포의 공급원으로서 골수에 대한 대안으로 사용될 수 있다. 각각의 장기는 숙주로 이식된 각각의 미분화 줄기 세포의 분화를 지지할 수 있는 장기 특이적 기질 매트릭스를 포함한다. 이식에 대한 대안 또는 부가물로서, 태아 간 세포는 유체 현탁액으로 투여될 수 있다.
공여체의 골수 세포(BMC), 또는 또 다른 조혈모세포의 공급원, 예를 들어 태아 간 현탁액이 수용체에게 주입될 수 있다. 공여체 BMC는 수용체의 적절한 부위를 향하여 이동하고 남아있는 숙주 세포와 함께 연속적으로 성장한 다음 증식하여, 키메라 림프조혈 집단을 형성한다. 이 과정에 의해, 새로 형성되는 B 세포(및 이들이 생성하는 항체)는 공여체 항원에 대해 노출되어, 이식이 자가로 인식될 것이다. 공여체에 대한 내성은 또한 조혈모세포, 예를 들어 BMC의 생착이 달성된 동물의 T 세포 수준에서 관찰된다. 이종 공여체의 사용은 동일한 동물 유래 또는 유전적으로 일치하는 동물 유래의 골수 세포 및 장기를 사용할 수 있게 한다.
실시예
본 발명은 하기의 실험 세부사항으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자는 논의된 구체적인 방법 및 결과가 이후의 청구범위에서 보다 완전하게 기재된 바와 같이 단지 본 발명을 예시한다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
실시예 1 - 최적의 면역 기능을 가지는 돼지 항원에 대한 면역 내성을 달성하기 위한 인간/돼지 하이브리드 흉선의 생성
이종이식에 대한 강력한 면역 반응은 과도한 독성없이 종래의 면역억제로 제어하기 어렵다. 흉선 이식은 이종장기이식에 대한 T 세포 내성을 유도하는 유망한 접근법이다. 이전에 인간 조혈모세포(HSC) 및 돼지(SW) 흉선 이식편을 이용하여 생성된 인간화 마우스가 2가지 종 모두에 대해 내성이 있음이 밝혀졌다. 그러나, 이러한 접근법에는 여전히 몇 가지 난제가 존재한다. 첫째, 돼지 흉선의 SW MHC에서 선택된 T 세포는 말초에서 인간 MHC(HLA)에 의해 제시된 항원을 최적으로 인식하지 못할 수 있다. 둘째, SW 흉선 상피 세포(TEC)는 인간 조직-제한 항원(TRA)을 표시하지 않으므로, 음성 선택이 손상되고 또한 인간 TRA에 특이적인 TReg의 결여가 있을 수 있다. 본 명세서에 기재된 인간/돼지 하이브리드 흉선을 생성함으로써 이러한 문제를 극복하였다.
방법
인간/돼지 하이브리드 흉선을 생성하기 위하여, 리버라제를 이용한 인간 태아(재태기간 20주) 및 소아(4개월) 흉선의 분해 후 인간 CD45+ 세포의 자기 고갈에 의해 흉선 기질 세포를 단리하였다. 인간 CD45- 세포를 매트리젤에 재현탁시키고, 이를 해당과정을 억제하는 2-데옥시글루코스로 처리하여 태아 SW 흉선에서 돼지 흉선세포의 수를 감소시킨 냉동/해동 태아 SW 흉선 조직에 주입하였다(도 2A 내지 도 2C).
그 후 이들 주입된 SW 흉선을 방사선조사된 NOD scid 공통 γ 사슬 녹아웃(NSG) 마우스에 이식한 다음, 동일한 huTEC 공여체 또는 동종이계 공여체 유래의 인간 태아 간-유래 CD34+ HSC를 주입하였다. 이식 후 12 내지 20주째에, 이식된 흉선을 제거한 다음 절편을 만들고 염색하여 2-광자 공초점 현미경을 사용하여 인간 TEC를 검출하였다(도 1A 내지 도 1D). 흉선 퇴화로 인해 성체 흉선에서 TEC의 수가 감소함에 따라, 17세 공여체 유래의 흉선-유래 huTEC 및 흉선 중간엽 세포(TMC)를 2D 매트리젤 매트릭스에서 확장시키고 세포를 태아 돼지 흉선 조직에 주입한 다음, 인간화 마우스에 이식하였다(도 1E 내지 도 1H).
결과
HuTEC-주입 SW 흉선은 기능적이었고 인간화 마우스에서 인간 흉선세포발달을 지지하였다. 사이토케라틴(CK) 14+ HLA-DR+ 세포 및 CK8+ HLA-DR+ 세포뿐만 아니라, CK8+ CK14+ HLA-DR+ 세포를 인간 태아 및 소아 공여체 둘 다에 의해 생성된 하이브리드 흉선에서 검출하였다. 이들 TEC를 널리 분포시켰으며, 돼지 TEC와 혼합하였다(도 1A 내지 도 1D). 17세의 흉선 EpCAM+ TEC를 단일 계대로 5배 확장시켰다. 시험관내-확장 인간 TEC 및 중간엽 세포를 이용하여 생성된 하이브리드 흉선은 인간 TEC를 포함하였다(도 1E 내지 도 1H).
결론
돼지 흉선으로 인간 흉선 기질 세포의 주입은 인간/돼지 하이브리드 흉선을 생성하는 효과적인 접근법이다. 더 나이가 있는 흉선 유래의 인간 TEC는 본 명세서에 기재된 프로토콜로 시험관내에서 확장될 수 있으며, 돼지 이식편에서 장기적으로 검출가능하였다.
실시예 2 - 하이브리드 흉선을 생성하기 위한 방법의 개발
주입 방법
세포를 매트리젤에 재현탁시켜 주입 후 세포가 돼지 흉선에서 새는 것을 방지하였다. 원리의 증거로, 이 실험에서는 인간 흉선 상피 세포 대신에 인간 PBMC를 사용하였다. 먼저, 1000만개의 인간 PBMC를 추적 염료인 CFSE(2.5μM)로 염색하였다. CFSE-염색 PBMC(8백만개 세포)를 ㎕당 50,000개 세포의 세포 농도로 얼음 위의 140㎕ 매트리젤에 재현탁시켰다. 해동된 돼지 태아 흉선 단편으로 세포를 주입하기 위한 3가지 상이한 방법:
Figure pct00001
방법 A: V-바닥 96-웰 플레이트의 웰 내부에 조각을 배치하면서 해밀턴 주사기를 사용하여 주입(5 내지 8㎕);
Figure pct00002
방법 B: PE50 튜빙을 사용하여 주입(20㎕);
Figure pct00003
방법 C: 매트리젤이 고화될 때까지 조각을 포셉으로 웰 외부에 유지하면서 해밀턴 주사기를 사용하여 주입(4 내지 6㎕).
주입된 모든 조각을 10% FBS를 보충한 DMEM/F12 배지를 포함하는 96-웰 플레이트의 상이한 웰로 옮겼다. 3시간 후, 조각을 리버라제로 분해시켰다. 방출된 세포의 수를 유세포분석에 의해 결정하여 CFSE-염색한 주입 PBMC를 추적하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 3가지 모든 주입 방법에 있어서, 주입된 세포의 적어도 일부가 회수되었다.
요약하면, 주입 전 매트리젤 중 세포의 재현탁화는 돼지 흉선 조직에서 주입된 세포를 유지시키는 데 도움이 되었다. 매트리젤은 코닝 라이프 사이언스(Corning Life Sciences) 및 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)에 의해 생산 및 시판되는 엔젤브레쓰-홈-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm: EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 젤라틴 단백질 혼합물에 대한 상표명이다.
인간 흉선 기질 세포의 거부반응을 방지하기 위한 돼지 흉선세포의 고갈 방법
항-돼지 CD3 면역독소 및 보체-매개 독성을 포함하여 생체외 돼지 흉선 단편에서 흉선세포를 고갈시키는 다양한 전략이 있다(보체 및 항-돼지 CD2의 공급원으로서 토끼 혈청 이용). 그러나, 이들 2가지 전략은 효과적이지 않았다. 전자 전략은 돼지 흉선세포에서 아포토시스를 더 높은 농도로 유도하고, SP 및 DP T 세포뿐만 아니라 비-T 세포를 살해하였으며, 흉선에 많은 수의 살아있는 흉선세포 집단을 남겼다. 후자 전략은 생체외 흉선 단편에서 돼지 흉선세포를 고갈시키는 데 효과적이지 않았다. 결과는 나타내지 않았다.
이들 결과를 고려하여, 다음 방법을 사용하여 생체 외에서 돼지 흉선세포를 고갈시키는 데 다음 시약을 테스트하였다:
Figure pct00004
제0일: 돼지 흉선 조각을 해동하고, 이를 다음 중 하나와 함께 인큐베이션한다(3중):
a) 사이클로스포린 A
b) 하이드로코르티손
c) 노치 억제제(감마 세크레타제 억제제=GSi)
d) ABT-737
e) 2 데옥시구아노신
f) 2D 글루코스
g) 처리 없음
Figure pct00005
다른 시점에서, 조직을 분해하고 죽은 세포와 아포토시스 세포 백분율에 대해 테스트하였다. 도 3B를 참조한다.
2-데옥시글루코스(2DG, 100mM)를 이용한 12시간 동안 생체 외 컨디셔닝은 기질 세포를 살아있게 유지시키면서, 흉선세포를 고갈시키는 가장 좋은 접근법이었다. 기질 세포를 포함하는 이중 음성(DN) 세포에 남아 있는 살아있는 이중 양성 CD4 및 CD8 세포(DP) 또는 단일 양성(SP) CD4(SP-CD4) 또는 SP-CD8 세포의 비율을 판독값으로 사용하였다. 12시간 동안 2DG 100 nM으로 처리하면 비율이 가장 낮았으므로, 기질 세포를 보존하면서 흉선세포를 제거하기 위한 가장 좋은 전략이었다. 도 3C를 참조한다.
하이브리드 흉선의 생성
인간 흉선 기질 세포의 주입을 위해 돼지 흉선세포를 고갈시키기 위한 2DG 처리 및 해밀턴 주사기(상기 기재된 방법 C)를 사용하여, 하이브리드 흉선을 생성하고 생체내에서 테스트하였다. 구체적으로, 2개 바이알의 태아 돼지 흉선을 해동하였다. 가능한 한 많은 흉선세포를 방출하기 위해 위아래로 피펫팅한 후, 조각의 절반을 12시간 동안 100mM 2DG로 처리하고 나머지 절반은 미처리 상태로 유지하였다.
다음 날, 6개 바이알의 인간 태아 흉선을 해동시켰다. 가능한 한 많은 흉선세포를 방출하기 위해 위아래로 피펫팅한 후, 리버라제를 사용하여 기질 세포를 분해 및 방출시키고 단일-세포 현탁액을 제조하였다. 자기-활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 인간 CD45+ 세포를 고갈시킨 후, 1000만개의 흉선 기질 세포를 150㎕의 차가운 매트리젤에 ㎕당 66,000개 세포의 농도로 용해시켰다. 대략 10㎕의 세포(대략 660,000개의 흉선 기질 세포)를 각각의 태아 돼지 흉선 조각(2DG-처리 및 미처리)에 주입하였다. 매트리젤이 고화될 때까지 실온에서 약 2분 동안 조각을 포셉으로 유지시켰다. 그 후, 각각의 조각을 10% 인간 혈청이 있는 배지를 포함하는 96-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 대조군으로서, 일부 조각에는 인간 혈청 기질 세포를 주입하지 않았다. 인큐베이터에서 10분 후, 면역결핍 NSG 마우스로의 이식을 위해 플레이트를 얼음 위에서 마우스 시설로 옮겼다. 수용체 마우스는 이전에 흉선절제를 받았으므로, 원래의 마우스 흉선이 없었으며, 흉선세포발달을 위한 유일한 장소는 이식된 흉선 단편이었다. 수용체 NSG 마우스를 먼저 방사선조사(100 cG)한 다음, 인간 태아 간-유래 CD34+ 조혈모세포(HSC)를 주입하였다. 그 후, 각각의 수용체 마우스의 신장 피막 아래에 하나의 흉선 조각을 이식하였다.
실험 계획은 도 4에 나타낸다.
이식 후 2 내지 3주마다 마우스에서 채혈하고, 인간 면역 세포 재구성 수준을 평가하였다. 도 5에 나타내 바와 같이, 2DG를 이용한 돼지 흉선 단편의 처리는 이식된 흉선에서 인간 흉선세포발달에 영향을 미치지 않았다.
이식 후 20주째에, 마우스를 안락사시키고 이식된 흉선을 제거한 다음 OCT에서 냉동시켰다. 냉동절편 후, 슬라이드를 인간 HLA-DR, 사이토케라틴 8(CK8, 피질 흉선 상피 세포(TEC)의 마커) 및 CK14(수질 TEC의 마커)에 대한 항체로 염색하였다. CK 항체는 인간과 돼지 둘 다에 대해 교차반응하므로, HLA-DR을 사용하여 인간과 돼지 TEC를 구별하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 돼지 TEC와 혼합하여 주입된 인간 TEC는 이식된 흉선 내에서 검출되었다. CK에 대해 음성인 HLA-DR+ 세포는 골수에서 이식된 흉선으로 이동한 HSC-유래 항원-제시 세포였다.
시험관내 T 세포 증식 결과는 하이브리드 흉선을 가지는 마우스의 말초 T 세포가 인간 TEC 공여체에 대해 부분적으로 내성이 있음을 시사하였다(도 7B).
모든 마우스 유래의 인간 T 세포는 돼지 공여체 수지상 세포(DC)에 대해 내성이 있었지만, SLA-CC 제3자 돼지 수지상 세포(DC)에 대해서는 내성이 없었다(도 7A).
모든 마우스 유래의 인간 T 세포는 인간 HSC-공여체 DC에 대해 내성이 있었다(도 7B).
돼지 흉선을 가지는 마우스 유래의 인간 T 세포는 인간 흉선 공여체-DC(인간 HSC에 대한 동종이계) 및 인간 알로(allo)-DC 모두에 반응하여 유사한 수준으로 증식하였다.
하이브리드 흉선을 가지는 마우스 유래의 인간 T 세포는 알로-DC와 비교하여 인간 흉선 공여체-DC에 반응하여 감소된 수준으로 증식하였다(도 7B).
실시예 3 - 인간 흉선에서 발달한 것( HU / HU 마우스)과 비교하여 돼지 흉선에서 발달한(SW/ HU 마우스) 인간 T 세포 중에서 인간 조직 제한 항원( TRA )(MART-1, NYESO1 및 소도 항원 IA- 2)에 대한 반응성 증가
방법
돼지 흉선에서 발달하는 인간 TRA-특이적 T 세포의 음성 선택이 결여되어 있다는 가설을 평가하기 위해, 동일한 인간 태아 간 CD34+ HSC 및 자가 인간 태아 흉선(HU/HU) 또는 돼지 태아 흉선(SW/HU)을 이용하여 2가지 그룹의 인간화 마우스를 생성하였다. 도 8A를 참조한다. 2가지 그룹 모두에서, 천연 마우스 흉선을 제거하여 흉선세포발달이 인간 또는 돼지 흉선에서만 일어나는 것을 보장하였다. 이식 후 약 22주째에, 마우스를 안락사시키고 MACS를 사용하여 풀링된 림프절(LN) 및 비장 세포에서 마우스 CD45+ 세포를 고갈시켰다. 나머지 세포를 이들 TRA에 대한 반응으로 T 세포 증식을 측정하기 위해 상이한 인간 TRA 단백질이 로딩된 자가 HSC-유래 수지상 세포와 함께 공동배양하였다.
결과
도 8B에 나타낸 바와 같이, SW/HU 마우스의 인간 말초 T 세포는 자가 인간 DC에 의해 제시된 인간 TRA(IA-2, MART-1 및 NYESO1)에 대해 상당히 증가된 증식 반응을 나타내었다. 이들 TRA의 아미노산 서열은 인간과 돼지 간에 상당히 상이하다. 이러한 결과는 돼지 흉선에서 인간 TRA-특이적 T 세포의 음성 선택의 결여를 뒷받침하고 하이브리드 흉선을 사용하는 것에 대한 필요성을 입증하였다.
실시예 4 - 인간 흉선에서 발달한 것( HU / HU 마우스)과 비교하여 돼지 흉선에서 발달한(SW/HU 마우스) 인간 Treg 및 CD8 T 세포의 더 낮은 생존
방법
실시예 3에서 생성한 마우스(SW/HU 및 HU/HU 마우스)를 이식 후 약 24주째에 안락사시켰다. 이식된 흉선과 풀링된 비장 및 림프절(자궁경부, 겨드랑이, 상완 및 장간막 LN)을 채취하였다. 흉선세포, 비장 및 LN 세포를 물리적 힘(2개 슬라이드 사이에서 흉선 조직을 으스러뜨리고 주사기 플런저를 사용하여 70㎛ 세포 스트레이너를 통해 비장과 LN을 으스러뜨림)에 의해 단리하였다. ACK 용해 완충액(깁코(Gibco))를 사용하여 비장 세포에서 RBC를 용해시켰다. 단리 세포를 혈구계를 사용하여 계수하였다. 세포의 총수를 계수한 후, 각각의 흉선 및 풀링된 비장 및 LN 유래의 20만 내지 100만개 세포를 유세포분석을 위해 도 9에 나타낸 항체로 염색하였다. BD 포르테사(BD Fortessa) 유세포분석 기계를 이용하여 세포를 판독하고 플로우조(Flowjo) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
비장 및 LN 세포뿐만 아니라 이식된 흉선 세포의 수는 SW/HU 마우스와 비교하여 HU/HU 마우스에서 현저하게 더 높았다(도 9A 및 도 9G). DP(이중 양성 CD4+ CD8+) 및 SP 세포(SP-CD4 또는 SP-CD8 단일 양성)의 비율은 HU/HU 및 SW/HU 마우스 사이의 이식된 흉선에서 유사하였다(도 9B). 기능성 흉선은 SP 세포보다 DP의 비율이 더 높아야 한다.
또한, SP-CD4 세포에서 Treg(조절 T 세포)의 분획은 유사하였다(도 9C). 증식 (Ki67+) SP-CD4 및 Treg 세포의 수준은 HU/HU 흉선과 비교하여 SW/HU 흉선에서 더 높았다(도 9D 및 도 9F). 또한, SW/HU 흉선 Treg의 더 높은 분획은 CD45RO를 발현하였다(도 9E).
흉선에서 유사한 수준의 SP-CD4 및 SP-CD8 세포와 달리, SW/HU 마우스는 T 세포 중 CD8 세포의 비율이 더 낮았고 또한 말초(비장 및 림프절, 도 9I 내지 도 9K)에서 CD4 세포 중 Treg의 비율이 더 낮았다. 이러한 결과는 2가지 이들 세포 하위세트가 생존을 위해 선택된 동일한 MHC와 상호작용할 필요가 있음을 나타내었다. SW/HU 마우스의 말초에서 CD4 및 CD8 세포 하위세트 둘 다에서 미경험에서 기억 전환율이 더 높은 것으로 나타났다(도 9L 및 도 9M). 말초 CD4, CD8 및 Treg 세포 내에서 Ki67+(증식)(도 9O), HLA-DR+(활성화)(도 9N), CD45RO+(도 9P), 및 CTLA-4+ 세포(도 9Q)의 비율은 HU/HU 및 SW/HU 사이에서 상이하지 않았다.
이러한 결과는 하이브리드 흉선을 사용하는 것에 대한 필요성을 추가로 입증하였다.
실시예 5 - 배아 줄기 세포 -유래 TEC(ES-TEC)를 이용한 하이브리드 흉선의 생성 및 하이브리드 흉선에서 인간 TEC의 장기 지속성
방법
흉선절제된 면역결핍 NSG(Nod/Scid/Ilr2g-/-) 마우스의 신장 피막 아래에 이식하기 전에 인간 태아 또는 소아 흉선 기질 세포(hu-TEC) 또는 hPSC-TEC 전구체(1~2×105개 TEC)를 태아 돼지 흉선 조직(SW THY)에 주입하였으며, 이는 2×105개 인간 태아 간-유래 CD34+ 세포를 정맥내 주입하였다. 대조군에는 인간 TEC가 주입되지 않은 태아 돼지 흉선 조직을 이식하였다.
이식 후 약 20주째에, 이식된 흉선을 제거한 다음 절편을 만들고 염색하여 2-광자 공초점 현미경을 사용하여 인간 TEC를 검출하였다.
그 후, 세포를 기질로부터 방출시키고 유세포분석으로 세포의 수를 결정하였다.
결과
도 10에 나타낸 바와 같이, "하이브리드 흉선"에서는 인간 TEC가 장기간(20주 초과) 지속되었다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 인간 TEC가 주입되지 않은 돼지 흉선을 포함한 모든 이식편(상단 좌측 패널)은 인간 HSC-유래 HLA-DR+ APC(녹색) 및 돼지/인간 CK14+ TEC(적색)를 가진다. 그러나, 하이브리드 흉선만이 검출가능한 HLA-DR+ CK14+ 인간 TEC(황색 색상, 화살표 참조)를 가진다.
장기간의 흉선 이식편 유래의 분해된 기질 중 게이팅된 CD45-음성 세포의 유세포분석 염색 결과는 인간 흉선(도 10B, 상단 우측) 및 hPSC-TEC 전구체가 주입된 SW 이식편(도 10B, 하단 좌측)에서만 EPCAM+, CD105-음성 hu-TEC의 존재를 나타내고, 미주입 SW THY 이식편(도 10B, 상단 좌측)에서는 나타내지 않았다. 또한 도 10C를 참조한다.
실시예 6 - 돼지 흉선에 hES - TEC를 주입하면 T 세포 발달 증가 및 말초 CD4 + 및 CD8 + T 세포 증가를 촉진시킨다
방법
흉선절제된 면역결핍 NSG(Nod/Scid/Ilr2g-/-) 마우스의 신장 피막 아래에 이식하기 전에 hES-TEC(1~2×105개 TEC)를 태아 돼지 흉선 조직(SW THY)에 주입하였으며, 이는 2×105개 인간 태아 간-유래 CD34+ 세포를 정맥내 주입하였다. 대조군에는 인간 TEC가 주입되지 않은 태아 돼지 흉선 조직을 이식하였다.
이식 후 18 내지 22주째에 흉선 이식편 유래의 비장세포 및 흉선세포를 유세포분석으로 분석하였다.
결과
도 11A 내지 도 11D에 나타낸 바와 같이, hES-TEC가 주입된 흉선 이식편은 인간 비장 CD3+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 비장의 단핵 세포의 CD45RA+CCR7+ 세포로 정의된 최근 흉선 이주 CD31+CD4+ 미경험 세포의 절대 수가 더 높았다.
말단 분화의 말기 단계를 평가하기 위해, 흉선세포를 HuCD45, CD19, CD14, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO의 발현에 대해 염색하였다. 도 11E에 나타낸 바와 같이, hES-TEC가 주입된 흉선 이식편은 총 흉선세포의 수가 더 높았을 뿐만 아니라, 인간 CD45 세포, 이중 양성 CD4+CD8+, 단일 양성 CD4+CD8-, CD4-CD8+, 및 미성숙 CD45RO+의 수가 더 높았다.
본 발명의 범주는 상기에 구체적으로 나타내고 기재한 것에 의해 제한되지 않는다. 당업자는 서술된 물질, 구성, 구조 및 치수의 예에 대한 적합한 대안이 있음을 인식할 것이다. 특허 및 다양한 간행물을 포함한 수많은 참고문헌이 본 발명의 설명에서 인용되고 논의되어 있다. 이와 같은 참고문헌의 인용 및 논의는 단지 본 발명의 설명을 명확히 하기 위해 제공된 것이며, 임의의 참고문헌이 본 명세서에 기재된 본 발명에 대한 선행기술임을 인정하는 것이 아니다. 본 명세서에서 인용되고 논의된 모든 참고문헌은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 본 명세서에 기재된 것의 변경, 변형 및 다른 구현은 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본 발명의 특정 실시형태가 나타내어지고 기재되었지만, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 상기 설명에 제시된 문제는 제한이 아닌 단지 예시로서 제공된 것이다.

Claims (28)

  1. 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포 및 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직을 포함하는, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 종은 돼지인, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  3. 제2항에 있어서, 상기 돼지는 미니 돼지인, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 종은 영장류 또는 인간인, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직은 태아 흉선 조직 또는 신생아 흉선 조직인, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  6. 제1항에 있어서, 상기 흉선 상피 세포는 상기 제1 포유동물 종 흉선으로부터 수득된, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  7. 제1항에 있어서, 상기 흉선 상피 세포는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포로부터 생성된, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  8. 제7항에 있어서, 상기 흉선 상피 세포는 상기 제1 포유동물 종과 HLA 대립유전자를 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성된, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  9. 제7항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포는 상기 제1 포유동물 종과 HLA 대립유전자를 공유하도록 유전자 조작된, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 흉선 조직은 상기 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 상기 제2 종 유래의 흉선 조직에 도입함으로써 생성되는, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  11. 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 흉선 조직은 상기 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 상기 제2 종 유래의 흉선 조직에 주입함으로써 생성되는, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  12. 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 흉선 조직은,
    (i) 제2 종 유래의 흉선 조직을 2-데옥시글루코스(2DG)로 처리하는 단계; 및
    (ii) 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 2DG-처리 흉선 조직에 도입하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (ii)에서 상기 흉선 상피 세포는 2DG-처리 흉선 조직에 주입되기 전에 매트리젤(Matrigel)에 현탁되는, 단리된 하이브리드 흉선 조직.
  14. 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법으로서,
    (i) 제2 포유동물 종 유래의 흉선 조직을 2-데옥시글루코스(2DG)로 처리하는 단계; 및
    (ii) 제1 포유동물 종 유래의 흉선 상피 세포를 2DG-처리 흉선 조직에 도입하는 단계
    를 포함하는, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (ii)에서 상기 흉선 상피 세포는 상기 2DG-처리 흉선 조직에 주입되기 전에 매트리젤에 현탁되는, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제2 종은 돼지인, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 돼지는 미니 돼지인, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 제1 종은 영장류 또는 인간인, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 흉선 조직은 태아 흉선 조직 또는 신생아 흉선 조직인, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 흉선 상피 세포는 상기 제1 포유동물 종의 흉선으로부터 수득된, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 흉선 상피 세포는 상기 제1 포유동물 종의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 상기 제1 포유동물 종의 배아 줄기 세포로부터 생성된, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 흉선 상피 세포는 상기 제1 포유동물 종과 HLA 대립유전자를 공유하는 배아 줄기 세포로부터 생성되는, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포는 상기 제1 포유동물 종과 HLA 대립유전자를 공유하도록 유전자 조작된, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  24. 제14항에 있어서, 상기 하이브리드 흉선 조직은 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종 유래의 흉선 조직에 도입함으로써 생성되는, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 하이브리드 흉선 조직은 제1 종 유래의 흉선 상피 세포를 제2 종 유래의 흉선 조직에 주입함으로써 생성되는, 하이브리드 흉선 조직을 제조하는 방법.
  26. 제1 종의 수용체 포유동물에서 제2 종의 공여체 포유동물로부터 수득된 이식편에 대한 내성을 유도하는 방법으로서,
    (a) 제1항의 하이브리드 흉선 조직을 수용체 포유동물에 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 공여체 포유동물 유래의 이식편을 상기 수용체 포유동물에 이식하는 단계
    를 포함하는, 제1 종의 수용체 포유동물에서 제2 종의 공여체 포유동물로부터 수득된 이식편에 대한 내성을 유도하는 방법.
  27. 제1 종의 수용체 포유동물에서 면역적격을 회복 또는 유도하는 방법으로서,
    제1항의 하이브리드 흉선 조직을 상기 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하는, 제1 종의 수용체 포유동물에서 면역적격을 회복 또는 유도하는 방법.
  28. T 세포 전구체가 제1 종의 수용체 포유동물에서 성숙한 기능성 T 세포로 발달하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 촉진시키는 방법으로서,
    제1항의 하이브리드 흉선 조직을 상기 수용체 포유동물에 도입하는 단계를 포함하는, T 세포 전구체가 제1 종의 수용체 포유동물에서 성숙한 기능성 T 세포로 발달하는 흉선-의존성 능력을 회복 또는 촉진시키는 방법.
KR1020217010702A 2018-09-20 2019-09-19 하이브리드 흉선, 이의 제조 방법, 그리고 이종이식 내성을 유도하고 면역적격 및 흉선 기능을 회복시키기 위한 사용 방법 KR20210062030A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862734019P 2018-09-20 2018-09-20
US62/734,019 2018-09-20
PCT/US2019/051865 WO2020061272A1 (en) 2018-09-20 2019-09-19 Hybrid thymus. methods of making, and methods of using to induce xenograft tolerance, restore immunocompetence and thymic function

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210062030A true KR20210062030A (ko) 2021-05-28

Family

ID=69887850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217010702A KR20210062030A (ko) 2018-09-20 2019-09-19 하이브리드 흉선, 이의 제조 방법, 그리고 이종이식 내성을 유도하고 면역적격 및 흉선 기능을 회복시키기 위한 사용 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210207101A1 (ko)
EP (1) EP3853355A4 (ko)
JP (1) JP2022501042A (ko)
KR (1) KR20210062030A (ko)
CN (1) CN113330110A (ko)
BR (1) BR112021005275A2 (ko)
CA (1) CA3113202A1 (ko)
MX (1) MX2021003308A (ko)
WO (1) WO2020061272A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114653226B (zh) * 2022-04-07 2022-08-23 浙江大学 一种用于血液灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU723003C (en) * 1995-08-04 2004-01-29 General Hospital Corporation, The Transgenic swine and swine cells having human HLA genes
WO2010143529A1 (ja) * 2009-06-09 2010-12-16 国立大学法人名古屋大学 多能性幹細胞を胸腺上皮へ分化誘導する方法
CA2822117A1 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of autologous t-cells in mice
CA3173076A1 (en) * 2013-02-27 2014-09-04 The Regents Of The University Of California Generation of thymic epithelial progenitor cells in vitro
WO2017192602A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 Emory University Uses of epithelial-to-mesenchymal inhibitors in generating pacemaker cells

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021003308A (es) 2021-05-13
US20210207101A1 (en) 2021-07-08
BR112021005275A2 (pt) 2021-06-15
EP3853355A1 (en) 2021-07-28
CA3113202A1 (en) 2020-03-26
EP3853355A4 (en) 2022-07-27
WO2020061272A1 (en) 2020-03-26
JP2022501042A (ja) 2022-01-06
CN113330110A (zh) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2201977T3 (es) Quimerismo mixto y tolerancia.
JP2020096632A (ja) 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織および臓器
Sykes Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation
Yoon et al. Corneal xenotransplantation: Where are we standing?
Auchincloss Jr Xenografting: a review
Adigbli et al. Humanization of immunodeficient animals for the modeling of transplantation, graft versus host disease, and regenerative medicine
Rosen et al. State of the art: role of the dendritic cell in induction of allograft tolerance
Xie et al. Delayed donor bone marrow infusion induces liver transplant tolerance
US20210207101A1 (en) Hybrid Thymus, Methods of Making, and Methods of Using to Induce Xenograft Tolerance, Restore Immunocompetence and Thymic Function
Fitch et al. Introducing thymus for promoting transplantation tolerance
JP7395174B2 (ja) 免疫抑制作用又は免疫寛容誘導作用を評価する方法、及び免疫寛容誘導剤
Zhao et al. The critical role of mouse CD4+ cells in the rejection of highly disparate xenogeneic pig thymus grafts
US20180153145A1 (en) Humanized mice and uses thereof
Good Progress toward production of immunologic tolerance with no or minimal toxic immunosuppression for prevention of immunodeficiency and autoimmune diseases
Matar et al. The MHC-characterized miniature swine: lessons learned from a 40-year experience in transplantation
Shinohara et al. Allogeneic offspring produced by induction of PD-L1 in spermatogonial stem cells via self-renewal stimulation
McCallion et al. Strategies to induce tolerance
US20220330530A1 (en) Method of making human mouse xenografts
WO2020121988A1 (ja) 免疫抑制作用又は免疫寛容誘導作用を評価する方法、及び免疫寛容誘導剤
Adigbli et al. Transplantation Publish Ahead of Print
ES2445523T3 (es) Procedimientos de tratamiento de enfermedad por trasplante de órganos o tejidos alógenos o xenógenos
Stahl A Study of Macrophages in the Aging Liver and in the Host Response to Engineered Lung Scaffolds
CA3158295A1 (en) Humanized mouse model with human immune system
Sun et al. Immunology of transplantation
Kover et al. Initiation of rejection of established islet allografts by third-party thyroid allografts and splenic dendritic cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination