JP2000511888A - 混合キメリズム及び寛容 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、ドナー哺乳動物からの造血細胞及び移植片を投与することを含むレシピエント哺乳動物中の移植片に対する免疫寛容を促進する方法を特徴とする。これらのレシピエント及びドナー哺乳動物は、同じ種に由来しても異なる種に由来してもよい(例えば、ヒトレシピエント及びミニブタドナー)。造血細胞投与のための造血空間を、胸腺照射により、又はブレキナー、シクロスポリン、ステロイド若しくは他の免疫抑制性薬剤を用いる免疫抑制療法により造ることができる。更に、ドナー反応性のＴ細胞及びナチュラルキラー細胞を不活性化して、レシピエント哺乳動物による移植片の拒絶を阻止することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
混合キメリズム及び寛容発明の背景
この発明は、組織及び臓器の移植に関係する。発明の要約
この発明は、外来抗原に対する寛容を誘導する方法を提供する。これらの方法
は、造血空間を造るための照射特に調製用全身照射の必要性を最小化するか排除
する調製養生法を特徴とする。特に、比較的多数の幹細胞の投与は、胸腺空間の
創造と組み合わせて、寛容の誘導を、全身照射(ＷＢＩ)を必要とせずに、可能に
することが発見されてた。
従って、この発明は、第１の種のレシピエント哺乳動物における、第２の種の
ドナー哺乳動物由来の移植片に対する寛容を誘導する方法を特徴とする。この方
法は、例えば静脈注射により、レシピエント哺乳動物に、造血幹細胞を導入する
こと及び、好ましくは、移植片をレシピエントに移植することを含む。造血細胞
は、レシピエントに、Ｂ細胞及びＴ細胞レベルでの寛容を誘導することにより、
後続の移植片に対する準備をさせるものと考えられる。
レシピエント哺乳動物は、例えば、ヒトであってよい。ドナー哺乳動物は、例
えば、ブタ例えばミニブタであってよい。移植片は、好ましくは、不一致の種か
らのものである。移植片は、好ましくは、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)抗原、
好ましくは、クラスII抗原を発現する。特に好適な具体例において、レシピエン
トは、霊長類例えばヒトであり、ドナーは、ブタ例えばミニブタである。
本明細書の他所で論じるように、本発明者は、この方法が、造血空間を造るた
めの照射例えば全身照射の施与なしで実施できることを発見した。全身照射は、
造血空間を造り、そうして、植え付け、キメリズム及び寛容を促進するために、
当分野でしばしば用いられる。造血空間を造るための照射の必要性は、下記のス
テップの少なくとも１つを方法に取り入れることにより減じ又は完全に排除する
ことができる：
(１)十分多数のドナーの造血細胞をレシピエントに投与して、ドナー幹細胞を
植え付かせ、混合キメリズムを生じさせ、そして寛容を誘導すること(好ましく
は、これらの幹細胞は、ここに開示した処理例えば直ぐ後で説明する(２)、(３)
又は(４)の１つ以上と組み合わせて投与する)；
(２)造血空間を造る抗体又は薬物をレシピエントに投与すること。例えば、細
胞増殖の阻害剤例えばＤＳＧ又は代謝拮抗剤例えばブレキナー又は抗Ｔ細胞抗体
例えば抗ＣＤ４若しくは抗ＣＤ８抗体の一方若しくは両方を投与すること。
(３)宿主骨髄細胞と競争するドナー細胞の能力を増大させることにより、例え
ば、間質細胞を投与することにより又はドナー特異的な成長因子若しくはサイト
カインを投与することにより、植え付け及び混合キメリズムの形成を促進する処
理を与えること(例えば、ドナーは、ミニブタであり、ブタＳＣＦ、ブタＩＬ−
３又はブタＧＭ−ＳＣＦの１つ以上をレシピエントに投与する)。
(４)レシピエント中に胸腺空間を、例えばレシピエントの胸腺を照射すること
により、例えば１００〜１０，０００ラド、一層好ましくは３００〜７００ラド
(例えば、７００ラド)の胸腺照射を施与することにより、又は抗Ｔ細胞抗体を胸
腺細胞を不活性化するのに十分な投与量で投与することによって造ること。胸腺
空間を造るための他の方法には、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナー
又は免疫抑制性の化学物質又は薬物例えばラパマイシン、シクロスポリン若しく
はＦＫ５０６の投与が含まれる。胸腺空間を造るための処理は、造血幹細胞の投
与の前に投与し又は少なくとも投与開始すべきである。有効な処理は、単一陽性
の胸腺細胞を、造血空間の創造がない場合に例えば全身照射により造られた造血
空間がない場台に混合キメリズムの植え付け及び形成を最適にする程度に涸渇さ
せる。好適具体例において、患者の単一陽性胸腺細胞は、少なくとも２０，４０
，６０又は８０％涸渇される。１０〜９０％の涸渇を生じる処理が好ましい。こ
の処理の長さは、薬剤の投薬量及び効力によって変化するが、一般に、６０，３
０又は１５日未満である。この処理は、少なくとも７日間、一層好ましくは１０
日間又は１４日間持続すべきである。好適な処理のコースにおいて、例えば免疫
抑制性の化学物質又は薬物例えばシクロスポリンの投与を、７〜３０日間持続す
べきである。この処理例えばシクロスポリンの投与は、それが幹細胞の投与前に
完
了するような時点に開始すべきである。この薬剤の投与は、日ベースとするか、
又は所望の涸渇レベルを与える薬剤のレベルを維持する必要に応じたものとすべ
きである。特に好適な処理は、免疫抑制性の化学物質例えばシクロスポリンの７
日間より長期で且つ３０日間未満の投与である。ゲッ歯類における有用な養生法
は、幹細胞投与の３日前に終了する１４日間にわたる２０ｍｇ／ｋｇ／日のシク
ロスポリンである。
従って、好適具体例において、造血空間を造るための照射を必要とせずに寛容
を誘導するのに十分な量の造血幹細胞をレシピエントに投与する。好適具体例に
おいて、ドナーの造血細胞の数は、成体のレシピエント種で見出される骨髄細胞
の数の少なくとも２倍、少なくとも同数、又は少なくとも７５，５０，若しくは
２５％である。好適具体例において、ドナーの造血幹細胞の数は、成体のレシピ
エント種で見出される骨髄造血幹細胞の数の少なくとも２倍、少なくとも同数、
又は少なくとも７５，５０，若しくは２５％である。ドナー種の同系交配集団が
存在する場合、例えばドナー種がミニブタである場合、利用可能なドナー細胞の
数は、単一の動物から得ることのできる細胞数に限られない。従って、かかる場
合には、レシピエントに投与されるドナー細胞は、一匹より多い例えば２，３，
４匹又はそれより多くの動物からのものであってよい。以下で論じるように、ド
ナーの幹細胞は、２回以上の別々の投与にて与えることができる。
好適具体例において、混合キメリズムをレシピエントにおいて誘導し、混合キ
メリズムの状態を、造血空間の誘導なしで、例えば空間を造る照射(例えば、全
身照射)により造られた造血空間なしで形成する。
レシピエントに投与されるドナー細胞の数は、特定の投与において与えられる
幹細胞の数を増加させるか又はドナー幹細胞の反復投与を与えることにより増加
させることができる。
反復幹細胞投与は、移植片レシピエントにおける植え付け、混合キメリズム、
及び長期間の欠失性の寛容を促進することができる。従って、この発明は又、多
数回の造血幹細胞投与をレシピエントに与える方法をも含む。多数回の投与は、
実質的に、造血空間を造るための照射の必要性を減じ又は排除することができる
。投与は、移植片の移植の前、移植の時、又は移植後に与えることができる。
好適具体例において、幹細胞の多数回の投与を、移植片の移植の前に与える。２
，３，４，５回の又はそれより多い投与を与えることができる。造血幹細胞の投
与の間の期間は、変わり得る。好適具体例において、前の幹細胞投与の少なくと
も２日、１週間、１月又は６月後に；レシピエントがドナー抗原に対する宿主リ
ンパ球応答の徴候を示し始めた場合；キメリズムのレベルが減少した場合；キメ
リズムのレベルが予め決めた値を下回った場合；キメリズムのレベルがドナーの
ＰＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での染色がＰＢＭＣに結合しないイ
ソ型の対照での染色以下の場合、例えばドナー特異的モノクローナルがこれらの
細胞の１〜２％未満を染色する場合；又は一般に、ドナー抗原に対する寛容を維
持するのに十分な混合キメリズムのレベルを維持することが必要なときには、造
血幹細胞の引き続く投与を与える。
ドナー幹細胞の１回以上の移植片移植後投与を与えて、照射の必要性を最小化
し又は排除することもできる。造血幹細胞の移植片後投与を、幹細胞の前の投与
の少なくとも２日、１週間、１月又は６月後に；移植片の移植の少なくとも２日
、１週間、１月、６月後、又はレシピエントの寿命の任意の時点において；レシ
ピエントが拒絶の徴候を示し始めたとき(例えば、移植された臓器の機能の低下
により、宿主のドナー特異的抗体応答の変化により、又は宿主のドナー抗原に対
するリンパ球応答の変化により明示される)；キメリズムのレベルが減少したと
き；キメリズムのレベルが予め決めた値を下回ったとき；キメリズムのレベルが
ドナーのＰＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での染色がＰＢＭＣに結合
しないイソ型の対照での染色以下の場合、例えばドナー特異的モノクローナルが
これらの細胞の１〜２％未満を染色する場合；又は一般に、寛容を維持すること
が必要なとき或いは移植片の受容を延長することが必要なときに与えることがで
きる。
多数回の幹細胞投与を与える場合には、これらの投与の少なくとも１回は、成
体のレシピエント種で見出される骨髄細胞の数の少なくとも２倍、同数、又は少
なくとも７５,５０若しくは２５％である多数のドナーの造血細胞を含むことが
でき；成体のレシピエント種で見出される骨髄造血幹細胞の数の少なくとも２倍
、同数、又は少なくとも７５，５０若しくは２５％である多数のドナーの造血
幹細胞を含むことができる。
好適具体例において、この方法は、レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー
細胞好ましくは移植片反応性の又は異種反応性(例えば、ブタ反応性)のＮＫ細胞
を不活性化することを含む。これは、例えば、レシピエント哺乳動物に、そのレ
シピエント咄乳動物のナチュラルキラー細胞に結合することのできる抗体を導入
することにより達成することができる。抗体の投与、又は他のナチュラルキラー
細胞を不活性化する処理は、造血幹細胞をレシピエント哺乳動物に導入する前に
又はレシピエントにおける移植片の移植の前に与えることができる。この抗体は
、Ｔ細胞を不活性化するのに用いる抗体と同じであっても異なってもよい。
好適具体例において、この方法は、レシピエント哺乳動物のＴ細胞を、好まし
くは、移植片反応性の又は異種反応性(例えば、ブタ反応性)のＴ細胞を不活性化
することを含む。これは、例えば、レシピエント哺乳動物に、そのレシピエント
咄乳動物のＴ細胞に結合することのできる抗体を導入することにより達成するこ
とができる。抗体の投与、又は他のＴ細胞を不活性化する処理は、造血幹細胞を
レシピエント哺乳動物に導入する前に又はレシピエントにおける移植片の移植の
前に与えることができる。この抗体は、ナチュラルキラー細胞を不活性化するの
に用いる抗体と同じであっても異なってもよい。
抗ＮＫ抗体の一つの源は、抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である。好ま
しくは、Ｔ細胞並びにＮＫ細胞を溶解させる第二の抗成熟Ｔ細胞抗体をも投与す
ることができる。Ｔ細胞を溶解させることは、骨髄及び移植片生存の両方に有利
である。抗Ｔ細胞抗体は、抗胸腺細胞抗血清中に、抗ＮＫ抗体と共に存在する。
抗体例えば抗ＮＫ又は抗Ｔ細胞抗体の反復投与量は、好適であり得る。モノクロ
ーナル標品を、この発明の方法において用いることができる。
好適具体例において、レシピエントは、成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出
を刺激する処理を受けない。例えば、レシピエントは、ステロイド薬物例えばプ
レドニゾン(１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，
２０−トリオン)等の物質を、そのレシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイ
トカインの放出を剌激する投薬量又は濃度で受けるべきではない。好ましくは、
レシピエントは、幹細胞を最初に投与する時点から移植片を移植するまで又は混
合キメリズム及び寛容が確立されるまで、かかる処理を受けない。
好適具体例において、この方法は、レシピエントに導入された移植片上の不一
致のクラスＩ及び／又はマイナー抗原に対する寛容を誘導する補助の減少処理例
えば薬物又は他の化学剤の短期コースの投与をふくむ。この補助の減少処理の短
期コース例えば高投与量シクロスポリンの短期コースは、一般に、移植片をレシ
ピエントに導入する時点に施与する。この補助の減少処理の短期コースの継続期
間は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が抗原により最初に剌激を受けた後にその抗
原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ等しいかそれより短く；一層好適な具
体例においては、この継続期間は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が抗原により最
初に剌激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２，３，４，５
又は１０倍にほぼ等しいかそれより短い。これらの方法は、共有の出願である第
０８／４５８,７２０号(１９９５年６月１日出願)に一層詳細に記載されており
、それを参考として本明細書中に援用する。この第０８／４５８,７２０号の方
法は、ここに記載の方法と組み合わせることができる。
他の好適具体例は、レシピエント哺乳動物に、ドナー種特異的な間質組織好ま
しくは造血間質組織(例えば、胎児肝又は胸腺)を導入するステップを含む。好適
具体例において、間質組織を、造血幹細胞と同時に又は該幹細胞の前に導入し；
造血幹細胞を、抗体と同時に又は抗体の前に導入する。
他の好適具体例は、更に、レシピエントのＴ細胞特に胸腺又はリンパ節の胸腺
細胞又はＴ細胞を不活性化する処理を含む。そうでないと、胸腺又はリンパ節の
胸腺細胞又はＴ細胞は、投与された細胞の植え付け又は生存を阻害するであろう
。かかる不活性化は、次の少なくとも１つにより達成することができる：レシピ
エント哺乳動物の胸腺を、胸腺細胞を不活性化するのに十分な照射線量で照射す
ること、例えば１００〜１，０００ラド、一層好ましくは３００〜７００ラド(
例えば、約３５０又は７００ラド)の胸腺照射；抗Ｔ細胞又は抗胸腺細胞抗体の
単一又は反復投与量を投与すること；又はレシピエントに、ここに記載したよう
な免疫抑制性の化学物質又は薬物の短期コースを施与すること。胸腺細胞又はＴ
細胞の不活性化は、造血幹細胞又は移植片の移植の前に行うことができる。好適
具体例において、この方法は、胸腺細胞又はＴ細胞活性を、好ましくは胸腺又は
リンパ節のＴ細胞の活性をレシピエントに胸腺細胞又はＴ細胞(好ましくは、胸
腺又はリンパ節のＴ細胞)を不活性化するのに十分な免疫抑制性薬剤(例えば化学
物質又は薬物例えばシクロスポリン)の短期コースを施与することにより減じ又
は阻害することを含む。免疫抑制性薬剤の短期コースの継続期間は、ほぼ３０日
間に等しく；約８〜１２日間以下、好ましくは約１０日間であり；約８〜１２又
は１０日間の２，３，４，５又は１０倍以下である。この短期コースは、寛容を
誘導する処理を開始する時点の前又はその時点付近に、例えば幹細胞をレシピエ
ントに導入する時点付近に始めることができ；寛容を誘導する処理を開始する日
に、例えば幹細胞をレシピエントに導入する日に始めることができ；寛容を誘導
する処理を開始する前又は後１，２，４，６，８，１０又は３０日以内、例えば
幹細胞をレシピエントに導入する１，２，４，６，８，１０又は３０日前又は後
以内に始めることができる。免疫抑制剤の短期コースは、抗Ｔ細胞抗体と共に施
与することができる。免疫抑制剤の短期コースは、Ｔ細胞例えば胸腺又はリンパ
節Ｔ細胞(これらは、Ｔ細胞の抗体ベースの不活性化例えばＡＴＧ抗体等の製剤
の静脈投与による不活性化によっては不活性化されないであろう)を不活性化す
るのに十分な濃度及び継続期間であるべきである。
他の具体例は(適宜)、造血幹細胞移植の前に、例えばレシピエント哺乳動物を
低線量例えば４００ラド未満の、好ましくは３００ラド未満の、一層好ましくは
２００又は１００ラド未満の全身照射で照射してレシピエントの骨髄を涸渇させ
又は部分的に涸渇させることにより造血空間を造るステップを含む。ここで論じ
るように、この処理は、減じ又は完全に排除することができる。
他の好適具体例は、好ましくは造血幹細胞移植の前にレシピエント哺乳動物の
血液から天然の抗体を涸渇させるステップを含む。涸渇は、例えば、レシピエン
トの血液を予め形成した抗ドナー抗体を吸収するエピトープと接触させることに
より達成することができる。このエピトープを不溶性基質と結合して、例えば、
アフィニティーカラムとして供給することができる。例えば、α１−３ガラクト
ース結合エピトープアフィニティーマトリクス例えばマトリクス結合した線状Ｂ
VI型炭水化物を用いて天然の抗体を涸渇させることができる。涸渇は又、ドナー
種の哺乳動物から得た臓器例えば肝臓又は腎臓を血液灌流することによっても達
成することができる。（臓器血液灌流において、血液中の抗体は、臓器の細胞表
面上の抗原に結合し、それ故、血液から除去される。）
他の好適具体例は、第二の種の同じ哺乳動物が移植片及び造血細胞の一方又は
両方のドナーであるもの；及び抗体が、例えばウマ又はブタから得られた抗ヒト
胸腺細胞ポリクローナル抗血清であるものを含む。
好適具体例において、この方法は、レシピエントに、ドナーから得た移植片を
導入するステップを含み、それは、造血幹細胞以外の異なる臓器例えば心臓、膵
臓、肝臓又は腎臓から得られる。
造血空間を作る照射の必要性を実質的に減じ又は排除するこの発明の方法を、
同種異系の幹細胞を移植する場合に用いることができる。従って、他の面におい
て、この発明は、第一の種のレシピエント哺乳動物において、同じ種のドナー哺
乳動物由来の移植片に対する寛容を誘導する方法を特徴とする。このレシピエン
ト哺乳動物は、例えばヒトであってよい。移植片は、好ましくは、主要組織適合
性複合体(ＭＨＣ)抗原、好ましくはクラス抗II原を発現する。
この方法は、例えば静脈注射により、レシピエント哺乳動物に、造血幹細胞を
導入すること；及び好ましくは、移植片をそのレシピエントに移植することを含
む。これらの造血細胞は、レシピエントに、Ｂ細胞及びＴ細胞レベルの両方にお
いて寛容を誘導することにより、後続の移植片に対する準備をさせるものと考え
られる。
この方法は、造血空間を造る照射例えば全身照射の施与なしで実施することが
できる。全身照射は、造血空間を造り、そうして、植え付け、キメリズム及び寛
容を促進するために、当分野でしばしば用いられる。造血空間を造るための照射
の必要性は、下記のステップの少なくとも１つを方法に取り入れることにより減
じ又は完全に排除することができる：
(１)十分多数のドナーの造血細胞をレシピエントに投与して、ドナー幹細胞を
植え付かせ、混合キメリズムを生じさせ、そして寛容を誘導すること(好ましく
は、これらの幹細胞は、ここに開示した処理例えば直ぐ後で説明する(２)又は(
３)の１つ以上と組み合わせて投与する)；
(２)造血空間を造る抗体又は薬物をレシピエントに投与すること。例えば、細
胞増殖の阻害剤例えばＤＳＧ又は代謝拮抗剤例えばブレキナー又は抗Ｔ細胞抗体
例えば抗ＣＤ４若しくは抗ＣＤ８抗体の一方若しくは両方を投与すること。
(３)レシピエント中に胸腺空間を、例えばレシピエントの胸腺を照射すること
により、例えば１００〜１０，０００ラド、一層好ましくは３００〜７００ラド
(例えば、７００ラド)の胸腺照射を施与することにより、又は抗Ｔ細胞抗体を胸
腺細胞を不活性化するのに十分な投与量で投与することによって造ること。胸腺
空間を造るための他の方法には、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナー
又は免疫抑制性の化学物質又は薬物例えばラパマイシン、シクロスポリン若しく
はＦＫ５０６の投与が含まれる。胸腺空間を造るための処理は、造血幹細胞の投
与の前に投与し又は少なくとも投与開始すべきである。有効な処理は、単一陽性
の胸腺細胞を、造血空間の創造がない場合に例えば全身照射により造られた造血
空間がない場台に混合キメリズムの植え付け及び形成を最適にする程度に涸渇さ
せる。好適具体例において、患者の単一陽性胸腺細胞は、少なくとも２０，４０
，６０又は８０％涸渇される。１０〜９０％の涸渇を生じる処理が好ましい。こ
の処理の長さは、薬剤の投薬量及び効力によって変化するが、一般に、６０，３
０又は１５日未満である。この処理は、少なくとも７日間、一層好ましくは１０
日間又は１４日間持続すべきである。好適な処理のコースにおいて、例えば免疫
抑制性の化学物質又は薬物例えばシクロスポリンの投与を、７〜３０日間持続す
べきである。この処理例えばシクロスポリンの投与は、それが幹細胞の投与前に
完了するような時点に開始すべきである。この薬剤の投与は、日ベースとするか
、又は所望の涸渇レベルを与える薬剤のレベルを維持する必要に応じたものとす
べきである。特に好適な処理は、免疫抑制性の化学物質例えばシクロスポリンの
７日間より長期で且つ３０日間未満の投与である。ゲッ歯類における有用な養生
法は、幹細胞投与の３日前に終了する１４日間にわたる２０ｍｇ／ｋｇ／日のシ
クロスポリンである。
従って、好適具体例において、造血空間を造るための照射を必要とせずに寛容
を誘導するのに十分な量の造血幹細胞をレシピエントに投与する。好適具体例に
おいて、ドナーの造血細胞の数は、成体のレシピエント種で見出される骨髄細胞
の数の少なくとも２倍、少なくとも同数、又は少なくとも７５，５０，若しくは
２５％である。好適具体例において、ドナーの造血幹細胞の数は、成体のレシピ
エント種で見出される骨髄造血幹細胞の数の少なくとも２倍、少なくとも同数、
又は少なくとも７５，５０，若しくは２５％である。
好適具体例において、混合キメリズムをレシピエントにおいて誘導し、混合キ
メリズムの状態を、造血空間の誘導なしで、例えば空間を造る照射(例えば、全
身照射)により造られた造血空間なしで形成する。
レシピエントに投与されるドナー細胞の数は、特定の投与において与えられる
幹細胞の数を増加させるか又はドナー幹細胞の反復投与を与えることにより増加
させることができる。
反復幹細胞投与は、移植片レシピエントにおける植え付け、混合キメリズム、
及び長期間の欠失性の寛容を促進することができる。従って、この発明は又、多
数回の造血幹細胞投与をレシピエントに与える方法をも含む。多数回の投与は、
実質的に、造血空間を造るための照射の必要性を減じ又は排除することができる
。投与は、移植片の移植の前、移植の時、又は移植後に与えることができる。好
適具体例において、幹細胞の多数回の投与を、移植片の移植の前に与える。２，
３，４，５回の又はそれより多い投与を与えることができる。造血幹細胞の投与
の間の期間は、変わり得る。好適具体例において、前の幹細胞投与の少なくとも
２日、１週間、１月又は６月後に；レシピエントがドナー抗原に対する宿主リン
パ球応答の徴候を示し始めた場合；キメリズムのレベルが減少した場合；キメリ
ズムのレベルが予め決めた値を下回った場合；キメリズムのレベルがドナーのＰ
ＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での染色がＰＢＭＣに結合しないイソ
型の対照での染色以下の場合、例えばドナー特異的モノクローナルがこれらの細
胞の１〜２％未満を染色する場合；又は一般に、ドナー抗原に対する寛容を維持
するのに十分な混合キメリズムのレベルを維持することが必要なときには、造血
幹細胞の引き続く投与を与える。
ドナー幹細胞の１回以上の移植片移植後投与を与えて、照射の必要性を最小化
し又は排除することもできる。造血幹細胞の移植片後投与を、幹細胞の前の投与
の少なくとも２日、１週間、１月又は６月後に；移植片の移植の少なくとも２日
、１週間、１月、６月後、又はレシピエントの寿命の任意の時点において；レシ
ピ
エントが拒絶の徴候を示し始めたとき(例えば、移植された臓器の機能の低下に
より、宿主のドナー特異的抗体応答の変化により、又は宿主のドナー抗原に対す
るリンパ球応答の変化により明示される)；キメリズムのレベルが減少したとき
；キメリズムのレベルが予め決めた値を下回ったとき；キメリズムのレベルがド
ナーのＰＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での染色がＰＢＭＣに結合し
ないイソ型の対照での染色以下の場合、例えばドナー特異的モノクローナルがこ
れらの細胞の１〜２％未満を染色する場合；又は一般に、寛容を維持することが
必要なとき或いは移植片の受容を延長することが必要なときに与えることができ
る。
多数回の幹細胞投与を与える場合には、これらの投与の少なくとも１回は、成
体のレシピエント種で見出される骨髄細胞の数の少なくとも２倍、同数、又は少
なくとも７５,５０若しくは２５％である多数のドナーの造血細胞を含むことが
でき；成体のレシピエント種で見出される骨髄造血幹細胞の数の少なくとも２倍
、同数、又は少なくとも７５，５０若しくは２５％である多数のドナーの造血幹
細胞を含むことができる。
好適具体例において、この方法は、レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー
細胞好ましくは移植片反応性の又はドナー反応性のＮＫ細胞を不活性化すること
を含む。これは、例えば、レシピエント哺乳動物に、そのレシピエント哺乳動物
のナチュラルキラー細胞に結合することのできる抗体を導入することにより達成
することができる。抗体の投与、又は他のナチュラルキラー細胞を不活性化する
処理は、造血幹細胞をレシピエント哺乳動物に導入する前に又はレシピエントに
おける移植片の移植の前に与えることができる。この抗体は、Ｔ細胞を不活性化
するのに用いる抗体と同じであっても異なってもよい。
好適具体例において、この方法は、レシピエント哺乳動物のＴ細胞を、好まし
くは、移植片反応性の又はドナー反応性のＴ細胞を不活性化することを含む。こ
れは、例えば、レシピエント哺乳動物に、そのレシピエント哺乳動物のＴ細胞に
結合することのできる抗体を導入することにより達成することができる。抗体の
投与、又は他のＴ細胞を不活性化する処理は、造血幹細胞をレシピエント哺乳動
物に導入する前に又はレシピエントにおける移植片の移植の前に与えることがで
きる。この抗体は、ナチュラルキラー細胞を不活性化するのに用いる抗体と同じ
であっても異なってもよい。
抗ＮＫ抗体の一つの源は、抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である。好ま
しくは、Ｔ細胞並びにＮＫ細胞を溶解させる第二の抗成熟Ｔ細胞抗体をも投与す
ることができる。Ｔ細胞を溶解させることは、骨髄及び移植片生存の両方に有利
である。抗Ｔ細胞抗体は、抗胸腺細胞抗血清中に、抗ＮＫ抗体と共に存在する。
抗体例えば抗ＮＫ又は抗Ｔ細胞抗体の反復投与量は、好適であり得る。モノクロ
ーナル標品を、この発明の方法において用いることができる。
好適具体例において、レシピエントは、成熟Ｔ細胞によるサイトカインの放出
を刺激する処理を受けない。例えば、レシピエントは、ステロイド薬物例えばプ
レドニゾン(１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，
２０−トリオン)等の物質を、そのレシピエントにおける成熟Ｔ細胞によるサイ
トカインの放出を刺激する投薬量又は濃度で受けるべきではない。好ましくは、
レシピエントは、幹細胞を最初に投与する時点から移植片を移植するまで又は混
合キメリズム及び寛容が確立されるまで、かかる処理を受けない。
好適具体例において、この方法は、レシピエントに導入された移植片上の不一
致のクラスＩ及び／又はマイナー抗原に対する寛容を誘導する補助の減少処理例
えば薬物又は他の化学剤の短期コースの投与をふくむ。この補助の減少処理の短
期コース例えば高投与量シクロスポリンの短期コースは、一般に、移植片をレシ
ピエントに導入する時点に施与する。この補助の減少処理の短期コースの継続期
間は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が抗原により最初に刺激を受けた後にその抗
原の拒絶を開始するのに要する期間とほぼ等しいかそれより短く；一層好適な具
体例においては、この継続期問は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が抗原により最
初に刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２，３，４，５
又は１０倍にほぼ等しいかそれより短い。これらの方法は、共有の出願である第
０８／４５８,７２０号(１９９５年６月１日出願)に一層詳細に記載されており
、それを参考として本明細書中に援用する。この第０８／４５８,７２０号の方
法は、ここに記載の方法と組み合わせることができる。
他の好適具体例は、更に、レシピエントのＴ細胞特に胸腺又はリンパ節の胸腺
細胞又はＴ細胞を不活性化する処理を含む。そうでないと、胸腺又はリンパ節の
胸腺細胞又はＴ細胞は、投与された細胞の植え付け又は生存を阻害するであろう
。かかる不活性化は、次の少なくとも１つにより達成することができる：レシピ
エント哺乳動物の胸腺を、胸腺細胞を不活性化するのに十分な照射線量で照射す
ること、例えば１００〜１，０００ラド、一層好ましくは３００〜７００ラド(
例えば、約３５０又は７００ラド)の胸腺照射；抗Ｔ細胞又は抗胸腺細胞抗体の
単一又は反復投与量を投与すること；又はレシピエントに、ここに記載したよう
な免疫抑制性の化学物質又は薬物の短期コースを施与すること。胸腺細胞又はＴ
細胞の不活性化は、造血幹細胞又は移植片の移植の前に行うことができる。好適
具体例において、この方法は、胸腺細胞又はＴ細胞活性を、好ましくは胸腺又は
リンパ節のＴ細胞の活性をレシピエントに胸腺細胞又はＴ細胞(好ましくは、胸
腺又はリンパ節のＴ細胞)を不活性化するのに十分な免疫抑制性薬剤(例えばシク
ロスポリン)の短期コースを施与することにより減じ又は阻害することを含む。
免疫抑制性薬剤の短期コースの継続期間は、ほぼ３０日間に等しく；約８〜１２
日間以下、好ましくは約１０日間であり；約８〜１２又は１０日間の２,３,４，
５又は１０倍以下である。この短期コースは、寛容を誘導する処理を開始する時
点の前又はその時点付近に、例えば幹細胞をレシピエントに導入する時点付近に
始めることができ；寛容を誘導する処理を開始する日に、例えば幹細胞をレシピ
エントに導入する日に始めることができ；寛容を誘導する処理を開始する前又は
後１，２，４，６，８，１０又は３０日以内、例えば幹細胞をレシピエントに導
入する１，２，４，６，８，１０又は３０日前又は後以内に始めることができる
。免疫抑制剤の短期コースは、抗Ｔ細胞抗体と共に施与することができる。免疫
抑制剤の短期コースは、Ｔ細胞例えば胸腺又はリンパ節Ｔ細胞(これらは、Ｔ細
胞の抗体ベースの不活性化例えばＡＴＧ抗体等の製剤の静脈投与による不活性化
によっては不活性化されないであろう)を不活性化するのに十分な濃度及び継続
期間であるべきである。
他の具体例は(適宜)、造血幹細胞移植の前に、例えばレシピエント哺乳動物を
低線量例えば４００ラド未満の、好ましくは３００ラド未満の、一層好ましくは
２００又は１００ラド未満の全身照射で照射してレシピエントの骨髄を涸渇させ
又は部分的に涸渇させることにより造血空間を造るステップを含む。ここで論じ
るように、この処理は、減じ又は完全に排除することができる。
他の面において、この発明は、ドナー哺乳動物由来の移植片に対する寛容を誘
導し又は受容を延長する方法を特徴とする。この方法は、胸腺細胞又はＴ細胞の
活性好ましくは胸腺又はリンパ節のＴ細胞の活性を、そのレシピエントに、胸腺
細胞又はＴ細胞好ましくは胸腺又はリンパ節のＴ細胞を不活性化するのに十分な
免疫抑制剤例えばシクロスポリン等の薬物又は他の化学物質の短期コースを施与
することにより減じ又は阻害することを含む。この免疫抑制剤の短期コースの継
続期間は、約３０日間に等しく；約８〜１２日間以下、好ましくは約１０日間で
あり；約８〜１２又は１０日間の２，３，４，５又は１０倍以下である。この短
期コースは、ドナー組織のレシピエントへの導入の前に、好ましくは、ドナー組
織の導入の１，２，４，６，８，１０又は３０日前に開始することができる。
好適具体例において、レシピエントは、霊長類例えばヒトであり、移植片は、
同種異系移植片であり；レシピエントは、霊長類例えばヒトであり、ドナーは、
第二の種例えば第二の霊長類又はブタに由来する。
この方法は、ここに記載の任意の他の方法と組み合わせることができる。
「不一致の種の組合せ」は、ここで用いる場合、移植片を一方から他方へ移植
した場合に、超急性拒絶が起きる２つの種をいう。一般に、不一致の種は、異な
る目に由来し、他方、不一致でない種は、同じ目に由来する。例えば、ラットと
マウスは、不一致でない調和性の種である。調和性の種の組合せは、超急性拒絶
を示さない。
「移植片」は、ここで用いる場合、身体の部分、臓器、組織又は細胞をいう。
臓器例えば肝臓、腎臓、心臓又は肺、或いは他の身体部分例えば骨又は骨格マト
リクス、組織例えば皮膚、腸、内分泌腺、或いは、種々の型の前駆幹細胞は、す
べて移植片の例である。
「補助の減少剤」は、ここで用いる場合、サイトカイン放出の減少を生じる薬
剤例えば免疫抑制性の薬物である。補助の減少剤の例は、シクロスポリン、ＦＫ
−５０６及びラパマイシンである。抗Ｔ細胞抗体は、Ｔ細胞を排除することがで
きるので、補助の減少剤として用いるのに好適でない。補助の減少剤は、寛容を
生じるサイトカイン放出の阻害のレベルを与えるのに十分な投与量で投与しなけ
ればならない。この補助の減少剤は、サイトカイン例えばＩＬ−２の放出を促進
する処理なしで投与すべきである。推定の補助の減少剤は、イン・ビトロ又はイ
ン・ビボ試験により、例えば推定の薬剤をＴ細胞と接触させて処理されたＴ細胞
のサイトカイン例えばＩＬ−２を放出する能力を測定することにより予備スクリ
ーニングすることができる。サイトカイン放出の阻害は、推定の薬剤の補助の減
少剤としての効力を示すものである。かかる予備スクリーニングした推定の薬剤
を、次いで、腎臓移植アッセイにおいて更に試験することができる。腎臓移植ア
ッセイにおいては、推定の補助の減少剤を効力について、その推定の薬剤をレシ
ピエントのサルに投与し、次いで、クラスIIマッチでクラスＩ及びマイナー抗原
ミスマッチのドナーサルからの腎臓をこのレシピエントに移植することにより試
験する。ドナー腎臓に対する寛容(移植片の延長された受容により示される)は、
推定の薬剤が、試験した投薬量において、補助の減少剤であることを示す。
「補助の減少」は、ここで用いる場合、寛容が望まれる抗原に最初にさらした
ときの、レシピエントのＴ細胞からの少なくとも一種のサイトカイン例えばＩＬ
−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６、ガンマインターフェロン又はＴＮＦのいずれかの放
出の阻害によるＴ細胞補助の減少を意味する。レシピエントのＴ細胞のサイトカ
イン分泌において誘導される阻害は、補助の減少中に投与される抗原に対してレ
シピエントが寛容化されるだけ十分なものでなければならない。理論に拘束され
るものではないが、減少のレベルは、外来抗原の最初の認識に伴うＩＬ−２の初
期バーストを実質的に排除するが、すべての成熟Ｔ細胞(これらの細胞は、寛容
の教育及び生成に重要であり得る)を排除するのではないものであると考えられ
る。
「造血空間」は、ここで用いる場合、投与された幹細胞の植え付けを促進する
骨髄内に造られる状況をいう。造血空間を造る最も普通の方法は、全身照射を用
いる骨髄の照射によるものである。
「造血幹細胞」は、ここで用いる場合、すべての骨髄及びリンパ系列に発生し
得て、自己回復できることにより、長期間の造血再構成を与えることができる細
胞例えば骨髄細胞又は胎児肝若しくは脾臓細胞をいう。造血細胞の精製標品又
は他の細胞型を含有する骨髄などの標品を、この発明の方法において用いること
ができる。理論に拘束されることは望まないが、造血幹細胞は、レシピエント哺
乳動物においてある部位に向かうと考えられる。この標品は、未成熟細胞即ち未
分化造血幹細胞を含むべきであり；これらの所望の細胞は、標品から分離するこ
とができ、又は複合標品を投与することができる。例えば、骨髄幹細胞の場合、
所望の初期の細胞を標品から分離することができ、又はかかる細胞を含む複合骨
髄試料を用いることができる。造血幹細胞は、胎児、新生児、未成熟又は成熟動
物由来であってよい。レシピエント又はドナーの臍帯血に由来する幹細胞を、こ
の発明の方法において用いることができる。米国特許第５，１９２，５５３号(
本明細書中に参考として援用する)及び米国特許第５，００４，６８１号(本明細
書中に参考として援用する)を参照されたい。
「胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化することのできる免疫抑制剤」は、ここ
で用いる場合、適当な投薬量で投与した場合に胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の不活性
化を生じる薬剤例えば化学薬剤例えば薬物である。かかる薬剤の例は、シクロス
ポリン、ＦＫ−５０６及びラパマイシンである。抗Ｔ細胞抗体も又、用いること
ができる。薬剤は、抗Ｔ細胞抗体例えば抗ＡＴＧ製剤の投与によって不活性化さ
れない胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の有意の不活性化を生じるのに十分な投与量で投
与すべきである。推定の薬剤及びその有用な濃度を、例えば、その推定の薬剤を
試験動物に投与し、胸腺又はリンパ節組織の試料を取り出し、そしてイン・ビト
ロ又はイン・ビボアッセイにて活性なＴ細胞の存在について試験することにより
、イン・ビトロ又はイン・ビボ試験により予備スクリーニングすることができる
。かかる予備スクリーニングした推定の薬剤を、次いで、更に、移植アッセイに
おいて試験することができる。
「胸腺又はリンパ節又は胸腺細胞又はＴ細胞」は、ここで用いる場合、Ｔ細胞
不活性化の伝統的方法による不活性化例えば抗Ｔ細胞抗体例えば抗−体例えばＡ
ＴＧ製剤の単一の静脈投与による不活性化に耐性の胸腺細胞又はＴ細胞をいう。
「胸腺照射」は、ここで用いる場合、施与した照射の少なくとも半分、好まし
くは少なくとも７５，９０又は９５％が胸腺を標的とする処理をいう。全身照射
は、その全身照射の送達の過程で胸腺が照射されるとしても、胸腺照射とは考え
ない。
「ＭＨＣ抗原」は、ここで用いる場合、１つ以上のＭＨＣ遺伝子の蛋白質産物
をいい；この用語は、レシピエント生物において免疫応答を引き起こすことので
きるＭＨＣ遺伝子産物の断片又はアナログを包含する。ＭＨＣ抗原の例には、ヒ
トＭＨＣ遺伝子例えばＨＬＡ遺伝子の産物（及びその断片又はアナログ）が含ま
れる。ブタ例えばミニブタ中のＭＨＣ抗原は、ＳＬＡ遺伝子例えばＤＲＢ遺伝子
の産物(及びその断片及びアナログ)を包含する。
「ミニブタ」は、ここで用いる場合、完全に又は部分的に同系交配のブタをい
う。
「造血空間を造るための照射」は、ここで用いる場合、造血組織即ち幹細胞が
見出される組織例えば骨髄に向けた照射をいう。それは、相当数の造血細胞を殺
し又は不活性化するのに十分な強度のものである。
「胸腺空間」は、ここで用いる場合、ドナー抗原を認識する宿主の胸腺細胞を
消去し又は不活性化する型のドナー造血細胞の胸腺への移動及び／又は胸腺にお
ける発生を促進する処理により造られた状態をいう。この効果は、胸腺中の宿主
細胞の排除により媒介されるものと考えられる。
「補助の減少剤の短期コース」は、ここで用いる場合、一時的な非慢性的処理
のコースを意味する。この処理は、移植片の移植の前に又はほぼ移植の時点にお
いて開始すべきである。或いは、この処理は、レシピエントが最初にドナー抗原
にさらされる時点の前又はほぼその時点において開始することができる。最適に
は、この処理を、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が最初に抗原により刺激された後
にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間にほぼ等しいかそれ以下の時間にわ
たって続ける。この処理の継続期間は、レシピエント種の成熟Ｔ細胞が最初に抗
原により刺激された後にその抗原の拒絶を開始するのに要する期間の２,３,４,
５又は１０倍にほぼ等しいかそれ以下の時間に及び得る。この継続期間は、通常
、少なくともレシピエント種の成熟Ｔ細胞が最初に抗原により刺激された後にそ
の抗原の拒絶を開始するのに要する時間に等しい。ブタ及びサルにおいては、約
１２日間の処理で十分である。サルにおける他の実験は、シクロスポリンＡ処理
の８,９又は１０日目に投与したＩＬ−２が移植組織の拒絶を生じることを示
す。従って、８，９又は１０日目は、おそらく、ブタにおいては、十分でない。
サルでは、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンの投与量(約５００〜１，０００ｎ
ｇ／ｍｌの血中レベル)が、クラスIIマッチしクラスＩ及びマイナー抗原ミスマ
ッチの腎臓に対する寛容を誘導するのに十分である。同じ血中レベル(５００〜
１，０００ｎｇ／ｍｌ)は、ブタにおける寛容を誘導するのに十分である。５ｍ
ｇ／ｋｇの長期投与は、(長期間の免疫抑制により)拒絶を阻止するが、寛容を誘
導しない。
「免疫抑制剤の短期コース」は、ここで用いる場合、一時的な非慢性的処理の
コースを意味する。この処理は、寛容を誘導する処理を開始する時点の前に又は
ほぼその時点において、例えば、異種の、同種異系の、遺伝子工学処理した同系
の、又は遺伝子工学処理した自家移植した幹細胞をレシピエントに導入する時点
の近辺で開始すべきであり、例えば、この短期コースは、寛容を誘導する処理を
開始する日に、例えば、異種の、同種異系の、遺伝子工学処理した同系の、又は
遺伝子工学処理した自家移植した幹細胞をレシピエントに導入する日に開始する
ことができ、或いは、この短期コースは、寛容を誘導する処理を開始する前後１
，２，４，６，８又は１０日以内に開始することができ、例えば、異種の、同種
異系の、遺伝子工学処理した同系の、又は遺伝子工学処理した自家移植した幹細
胞をレシピエントに導入する前後１，２，４，６，８又は１０日以内に開始する
ことができる。この短期コースは、約８〜１２日以下の期間好ましくは約１０日
間にわたって、又は８〜１２又は１０日間の２，３，４，５又は１０倍にほぼ等
しいか又はそれ以下の期間続けることができる。最適には、この短期コースは、
約３０日間続ける。その投薬量は、胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに
十分な血中レベルを維持するのに十分であるべきである。約１５ｍｇ／ｋｇ／日
の投薬量が霊長類において有功であることが見出された。
「間質組織」は、ここで用いる場合、臓器の機能的要素又は実質と区別される
支持組織又はマトリクスをいう。
「寛容」は、ここで用いる場合、移植片レシピエントの免疫応答の阻害をいい
、阻害しなければ、該免疫応答が、例えば異物のＭＨＣ抗原のレシピエントへの
導入に応答して生じる。寛容は、体液性、細胞性、又は体液性と細胞性の両方の
応
答を包含することができる。寛容は、ここで用いる場合、抗原に対する完全な免
疫学的寛容だけでなく、部分的な免疫学的寛容、即ちこの発明の方法を用いなか
ったならば見られたであろうものより大きい抗原に対する寛容の程度をもいう。
寛容は、ここで用いる場合、免疫抑制剤を用いて見られる免疫系の広いスペクト
ルの阻害に対して、免疫系のドナー抗原特異的な阻害をいう。
この発明の方法は、寛容誘導の多くの方法における造血空間を造るための処理
例えば照射の必要性を最小化し又は排除する。
この発明の方法において、胸腺照射、レシピエントの末梢Ｔ細胞及び胸腺細胞
の不活性化及び十分多数の異種又は同種異系のドナー幹細胞の投与による胸腺空
間の創造は、レシピエントをＷＢＩにかけずに、寛容の誘導を可能にする。胸腺
空間の誘導は、ドナー反応性胸腺細胞のレベルを減じるが、更なるステップ(こ
こに記載)を加えて、更に、ドナー胸腺細胞反応性を減じることができる。
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らか
となろう。
詳細な説明
先ず、図面を簡単に説明する。図面
図１は、ＢＭＣの単一の注射(----)又は５回の注射(―)を受けた動物における
ドナー再増殖の多系統分析の描写である。
図２(左パネル)は、長期間のドナーの単球(〇)、顆粒球(■)及びＢ細胞(中実
三角形)の、抗ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂを−５、−１及び７日目に受け、６Ｇｙ
のＴＩを０日目に受けた(０〜４日目の５日間にわたって１７４×１０6のＢ１０
．Ａ ＢＭＣを伴う)Ｂ６マウス間の安定キメラのＷＢＣにおける再増殖のグラ
フである(ｎ＝７)。標準偏差を各データ点に示してある。右パネルは、左パネル
に示したのと同じマウスのＷＢＣにおけるドナー起源の全ＣＤ４(△)及びＣＤ８
(■)細胞の平均±ＳＤパーセンテージを示す。
図３は、安定な混合キメラ由来の脾臓細胞のＣＭＬ応答の描写である。−５、
−１及び７日目に抗ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂで処理し、０日目にＴＩで処理し、
そして高投与量のＢ１０．Ａ ＢＭＣ(０〜４日目にわたる１７４×１０6細胞)
で処理したＢ６マウスを、ＢＭＴ後２５〜２９週間分析した。宿主型(上段左パ
ネル)、ドナー型(上段右パネル)及び第三者(下段パネル)の刺激剤及び標的に対
するＣＭＬ反応性を、混合キメラ(□)；非ＢＭＴ対照(＊)／正常Ｂ６マウス(○)
;正常Ｂ１０．Ａマウス(◆)について示す。特異的溶解パーセントを、次の式を
用いて計算した：１００％×(実験51Ｃｒ放出−自然51Ｃｒ放出)／(最大51Ｃｒ
放出−自然51Ｃｒ放出)。この図の下段の表は、３つの更なるキメラについて得
られた最大特異的溶解％を示す。
図４は、同種異系Ｂ１０．Ａ ＢＭＴ(１７４×１０6、０〜４日目)のＢ６レ
シピエントにおけるドナー特異的な皮膚移植片の特異的受容(−５，−１及び７
日目の抗ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂ処理及び０日目の７ＧｙのＴＩ処理後)を示す
グラフである。左パネルは、同様に処理した非ＢＭＴ対照マウス(―)とＢＭＴレ
シピエント(---)におけるドナー型皮膚の生存である。右パネルは、同じグルー
プのマウスにおける第三者(ＳＪＬ／Ｊ)の皮膚の生存である。移植は、ＢＭＴ後
７週にて行った。
図５は、ＢＭＴ後２４〜２９週目に犠牲にしたキメラのＣＤ４＋脾臓細胞間の
及び成熟(クラスＩhigh)宿主型(Ｋbhigh)胸腺細胞間のＶβ５＋及びＶβ１１＋
細胞の特異的消失の描写である。ｂ１０．Ａ対照マウスについては、ゲートした
Ｈ−２Ｄbhigh胸腺細胞を代わりに分析した。Ｂ６マウスは、抗ＣＤ４及びＣＤ
８ｍＡｂ及び７ＧｙのＴＩで調整した後０〜４日目に１７４×１０6のＢ１０．
Ａ ＢＭＣを受けた。１０4のゲートされた細胞に対して、関心ある各集団につ
いてのＦＣＭ分析を行った。同じゲート中のＴＣＲａβhigh細胞の全数をも測定
し、個々のＶβについて得られた結果を、ＴＣＲａβhigh細胞の画分で割ること
により補正した。安定キメラについての結果を与える(ｎ＝６)。＊は、Ｐ＜０．
０５を；＊＊＊は、Ｐ＜０．００５を；＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００５を；＊＊
＊＊＊は、Ｐ＜０．００００５を示す(同時に同様に処理した非ＢＭＴ対照(ｎ＝
４)と比較)。概観
この発明は、外来抗原例えば同種異系又は異種の組織又は臓器移植片上の抗原
に対する寛容を誘導する幾つかの方法を提供する。これらの方法は、個別に又は
組み合わせて用いることができる。
下記の第Ｉ節は、植付け、混合キメリズム及び寛容を、造血空間を造るための
照射を必要としないで誘導できる動物試験を提供する。
下記の第II節は、移植のための細胞源を説明する。
下記の第III節は、ＭＨＣ不同に対する寛容を誘導するための骨髄細胞の移植
を論じる。
Ｉ.実施例１：高投与量のドナー骨髄を用いる同系の植付けに対する胸腺照射の
効果
動物 雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲ(Ｂ６；Ｈ−２ｂ．Ｌｙ−５．２)及びＬｙ−
５コンジェニックＢ６．Ｌｙ−５．２(Ｌｙ−５．１)マウスをFrederick Cancer
Research Facility(メリーランド、Frederick在)から得た。Ｌｙ−５対立遺伝子は、M
orse等の命名法(1987.Immunogenetics 25:71)に従って記載する。すべてのマウ
スを滅菌したマイクロアイソレーターケージに収容し、オートクレーブにかけた
食餌を与え、オートクレーブをかけた酸性化飲料水を与えた。レシピエントを、
週齢を合わせて、１２〜１６週齢で用いた。
ＢＭＴ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲ(Ｂ６；Ｈ−２ｂ．Ｌｙ−５．２)マウスは、−
６日及び−１日及び＋７日に、腹腔内注射により、抗ＣＤ４ｍＡｂＧＫ１．５及
び抗ＣＤ８ｍＡｂ ２．４３を含む腹水を各々１００ｍｌ受けた。この容積の腹
水は、ラットＩｇＧ２ｂ特異的ＥＬＩＳＡにより測定して、１〜２ｍｇのＧＫ１
．５及び１．２５〜１．５ｍｇの２．４３をそれぞれ含んだ。０日目に、動物を
、０，３．５又は７Ｇｙの胸腺照射により照射した。１シリーズのマウスを、２
億の骨髄細胞(ＢＭＣ)の一投与量により処理した。第２のシリーズのマウスを、
Ｌｙ−５コンジェニックＢ６．Ｌｙ−５．２(Ｌｙ−５．１)マウス由来の４００
０万のＢＭＣでＯ日目０処理し、全部で５日間毎日繰り返した(全部で２億のＢ
ＭＣ)(これらを、静脈投与した)。ＢＭ細胞(ＢＭＣ、２００×１０6)を、性の一
致した６〜１４週齢のＢ６，Ｌｙ−５．２ドナーの脛骨及び大腿骨から得
た。Ｔ細胞涸渇を、Sykes等(1990.PNAS,87:5633-5637)に記載されたように、抗
ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂ及びラット補体を用いて行った。
細胞計数 ヘパリン化した末梢血液をAutomatcd Cell Counter(Systcm 9000;S
erono-Baker Diagnostics Inc.,ペンシルベニア、Allentown在)にて分析した。
表現型分類 ＢＭＴの２週間後に始めて、様々な時点で表現型分類を行った。
動物を尾から採血し、全血液細胞（ＷＢＣ）を、低張ショックにより調製した。
脾臓細胞、胸腺細胞の懸濁液。ＢＭＣ及びＢＭコロニーも又、分析した。ドナー
特異的及びレシピエント特異的なｍＡｂでの染色を、各キメラ及び対照用動物に
対して行った。細胞を、Ａ２０−１．７(抗Ｌｙ−５．１ｍＡｂ；マウスＩｇＧ
２ａ)又は１０４−２．１(抗Ｌｙ−５．２ｍＡＢ；マウスＩｇＧ２ａ)(ハイブリ
ドーマは、ニューヨーク、New York在、Sloan Kettering Cancer InstituteのS.Kimura
博士から親切に提供された)の２０ｍＬの未希釈の培養上清と３０分間４℃でイ
ンキュベートし、次いで、２回洗った。標識した抗体の非特異的ＦｃｇＲ結合を
ブロックするために、１０ｍＬの２．４Ｇ２(ラット抗マウスＦｃｇＲｍＡｂ)の
未希釈培養上清を最初のインキュベーションに加えた。細胞結合したｍＡｂを、
フルオロセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合したラット抗マウスＩｇＧ２
ａｍＡｂ(Zymed laboratories.Inc.イリノイ、Mundelein在)を用いて検出した(３０
分間４℃でインキュベートした後に、２回洗い、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickin
son,カリフォルニア、Mountain View在)にて分析した)。すべての実験において、各ｍＡ
ｂで染色される細胞のパーセンテージを、一色蛍光ヒストグラム及び正常のドナ
ーと宿主型動物(これらを、陽性及び陰性対照として用いた)から得られるものと
の比較から決定した。ｍＡｂでの染色後に陽性と考えられた細胞のパーセンテー
ジは、選択したカットオフを用い(陽性対照株の陽性ピークの開始時における蛍
光レベルとして)、且つ無関係のｍＡｂ(非反応性ＩｇＧ２ａ ｍＡｂ ＨＯＰＣ
１及びＦＩＴＣ結合した抗マウスＩｇＧ２ａ ｍＡｂ)で染色した細胞のパーセ
ンテージを減じることにより測定した。ｍＡｂを用いたキメラの相対的染色パー
セントを、次の式を用いて計算した：１００％×(正味の陽性キメラパーセント)
−(正味の陰性対照陽性パーセント)／(正味の陽性対照陽性パーセント)−(正味
の陰性対照陽性パーセント)。式中、正味の陽性パーセントは、ＨＯＰＣ１での
染
色を減じた後に得られるパーセンテージをいい、陽性及び陰性対照は、適当な正
常のＬｙ−５．１＋及びＬｙ−５．２＋マウスに由来する細胞であった。抗Ｌｙ
−５ｍＡｂでの染色が陰性対照の染色より弱く、それ故、計算されたキメリズム
パーセントが０より小さい試験細胞集団については、これらの値は、０と報告さ
れる。この計算方法を用いて、０．１％未満の夾雑Ｌｙ−５．１＋細胞を、人工
のＬｙ−５．２(９９．９％)／Ｌｙ−５．１(０．１％)混合物において検出する
ことができた。しかしながら、可視的な陽性ピークは、０．１；又は一層少ない
Ｌｙ−５．１＋細胞を含む人工的混合物において検出できなかったが、１％夾雑
Ｌｙ−５．１＋細胞では可視的であった(データは示してない)。すべての造血系
統は、抗Ｌｙ−５ｍＡｂで強く染色された。フォワード及び９０度光散乱(それ
ぞれ、ＦＳＣ及びＳＳＣ)のドットプロットを用いて、リンパ球(ＦＳＣ及びＳＳ
Ｃ−低集団)、顆粒球(ＳＳＣ−高集団)及び単球(ＦＳＣ−高であるが、ＳＳＣ−
低の集団)の集団をゲートし、キメリズムを各集団について別々に測定した。顆
粒球ゲート中のすべてのＳＳＣ−高細胞は、ＦＩＴＣ結合した抗マウス顆粒球ｍ
Ａｂ(Ｇｒ−１)で染色された。死んだ細胞は、低ＦＳＣ／高ヨウ化プロピジウム
保持細胞をゲートで除くことにより排除した。胸腺照射を用いない植付け ２つのグループの動物に、２０×１０7ＢＭＣの
一回の注射又は４０×１０6ＢＭＣの１日ベースの５回の注射を施与した。ドナ
ー再増殖の多系統分析は、すべての系統が少なくとも３０週間にわたって安定で
あり続ける１０〜２５％長期のキメリズムを示すことを示した(図１)。従って、
多数回の高投与量の骨髄細胞をレシピエントマウスに注射した場合には、造血幹
細胞の安定な植付けが生じ得る。
胸腺照射を用いる植付け マウスを胸腺照射(表１)を用いて前処理した場合に
は、かなり高レベルの植付けがＣＤ４Ｔ細胞集団において認められた(約０〜１
０％から２０〜６０％に増加)。単球系統の再増殖は、約２０％のレベルから３
０〜４０％に増加した。これは、３．５ＧｙのＷＢＩが同系定植において安定な
植付けを可能にするのに十分であるという以前に示された結果と一致する。これ
らの結果は、植付けは、ＷＢＩ又はＴＩなしで達成し得るが、比較的低線量の胸
腺照射(３.５Ｇｙ)が一層高レベルの同系の植付けを得ることを可能にするこ
とを示している。実施例２：同種異系の造血再構成及びドナー特異的寛容の骨髄抑制性調節を用い
ない高レベルの誘導
多能性造血幹細胞(ＰＨＳＣ)は、高投与量の同系の又はＬｙ５コンジェニック
骨髄を受けた未調節のレシピエントにおいて植付く。同種異系ＰＨＳＣの植付け
は、高投与量(２００×１０6)の完全にＭＨＣミスマッチのＢ１０.Ａ(Ｈ−２a)
ＢＭＣのＢ６(Ｈ−２b)レシピエントへの投与により達成された。これらのレシ
ピエントは、−５，−１及び７日目に抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８ｍＡｂを涸渇させる
ことによってのみ調節した。初期キメリズムを、末梢血液リンパ球、単球及び顆
粒球間で達成した(ＢＭＴ後４〜６週で、１５〜３３％のドナー細胞のピークレ
ベル)。しかしながら、初期Ｔ細胞キメリズムは、低く(＜１０％)、多系統キメ
リズムは、時間と共に減少する傾向があった。表２は、ＢＭＴの１２〜２５週後
に犠牲にした動物の脾臓、骨髄及び胸腺における低レベルのキメリズムを示して
いる。
植付けを最適にするために、胸腺照射(ＴＩ)の施与により胸腺空間を誘導した
。Ｂ６マウスは、上記のように抗Ｔ細胞ｍＡｂを受け、０日目に７ＧｙのＴＩを
、そして全部で１７４×１０6の完全にＭＨＣミスマッチのＢ１０．ＡＢＭＣを
０〜４日目に受けた。１０匹の動物の内の７匹において、ドナー細胞は、高比率
のＷＢＣ単球、顆粒球、Ｂ細胞並びにＣＤ４及びCＤ８細胞をすべての時点にお
いて構成した(図２)。７匹の動物において、初期ドナ−ＣＤ４Ｔ細胞のレベルは
、他の系統のそれと類似し、すべての系統におけるキメリズムは、６ケ月の追跡
期間中安定であった(図２)。しかしながら、３匹の動物においては、最初には高
レベルのキメリズムであっても、ドナー表現は、幾つかの又はすべての系統にお
いて、時間を超えて減少した(データは示してない)。
ＴＩを含む高投与量の同種異系ＢＭＴ養生法のレシピエントを、ＢＭＴの２４
〜２９週後に犠牲にし、キメリズムを他の組織において評価した。最も安定なＷ
ＢＣキメラは、ＢＭＣ、脾臓Ｂ細胞及びＴ細胞並びにクラスＩhigh、成熟胸腺細
胞間の実質的キメリズムを示した(表２)。これらの胸腺は又、ドナーのクラスＩlow
、未成熟胸腺細胞をも含んだ。安定なキメラと異なり、３匹の「不安定な」
キメラ(表２)からの胸腺は、僅かのドナー由来のクラスＩhigh細胞しか含まず、
変化しやすい脾臓Ｔ及びＢ細胞並びにＢＭＣキメリズムを示した(表２)。
殆どのマウスで認められた安定な高レベルの多系統キメリズムは、実質的な同
種異系のＰＨＳＣの植付けが、Ｔ細胞を涸渇させるｍＡｂ、７ＧｙのＴＩ及び高
投与量の同種異系骨髄を受けたマウスにおいてＷＢＩなしで達成され得ることを
示している。ドナーの表現は、同様に処理したＬｙ５コンジェニック骨髄のレシ
ピエントにおいて認められたものと類似したが、これは、免疫学的同種異系抵抗
性が完全に克服されたことを示している。これらの結果は、レシピエントのＮＫ
細胞による同種異系ＰＨＳＣ植付けに対する最小バリヤーが更なるＢＭＣの投与
により容易に克服され得たことを示す我々の以前の研究と一致し、これは、ＮＫ
細胞媒介の抵抗が飽和可能であることを示唆している。同系の精製した幹細胞よ
り多数の同種異系細胞が、致死的に照射されたマウスを救助するのに必要とされ
るという観察は、Ｔ細胞媒介の同種異系抵抗を完全に克服することができないこ
とを反映しているのであろう。全骨髄接種物中の「促進する」細胞集団の存在は、
かかる細胞型は、一般に、ＣＤ４又はＣＤ８を発現すると報告されており、ドナ
ーＣＤ４及びＣＤ８細胞は、ＢＭＴの時に循環中に存在するｍＡｂにより涸渇さ
れるので、我々の結果に影響したということはありそうもないことである。 これらのマウスを骨髄抑制について評価した。完全な血液計数を、ＴＩを０日
目に受けた動物(ｍＡｂ処理は行い又は行わず、ＢＭＴは行わない)について、−
１，１，３，６，８，１０，１３及び２０日目に測定した。ＴＩ±ｍＡｂのレシ
ピエントにおいては、平均ＷＢＣ計数は、１日目に、３，０００／μｌの最下点
に達し、８日目までに正常に戻った。任意の個々のマウスにおいて到達された最
低レベルは、２，６００／μｌであった。血小板計数もヘモグロビン濃度も、何
れのグループでも、何れの時間にも、有意に減少しなかった。すべての動物は、
何らの臨床的毒性を有さずに生存した。従って、ｍＡｂ／ＴＩでの宿主の調節は
、臨床的に、有意の骨髄抑制又は毒性を引き起こさず、しかも高投与量の同種異
系骨髄からのＰＧＨＳＣの植付けを可能にする。
高投与量の同種異系のＢＭＴのレシピエントは、検出可能な体重減少又は他の
急性若しくは慢性のＧＶＨＤの臨床的徴候を示さなかった。Ｔ細胞回収のタイミ
ングは、ｍＡｂ／ＴＩ調節を受けた動物(高投与量の同種異系ＢＭＴは、行い又
は行わない)において同様であり、胸腺及び脾臓細胞生成は、両グループにおい
て同様であった。ＧＶＨＤと関連する臨床的徴候又はリンパ退行からのレシピエ
ントの自由度は、おそらく、ＢＭＴの時に血清中にまだ存在しているｍＡｂによ
るドナー骨髄中の成熟Ｔ細胞の涸渇を反映している。
寛容を評価するために、混台リンパ球反応(ＭＬＲ)及び細胞媒介のリンパ球溶
解(ＣＭＬ)研究を、ＢＭＴレシピエント及び同時の同様に処理した非ＭＢＴ対照
において、調節の２４〜２９週後に行った。安定な多系統キメリズムを有する４
匹のすべての動物は、ドナー及び宿主に対する特異的ＣＭＬ寛容を示したが、非
ＢＭＴ対照マウスと類似の抗第三者応答を伴った(図３)。後者のグループは、未
処理のＢ６マウスと類似の抗Ｂ１０．Ａ応答を示した(図３)。６匹の安定なキメ
ラの内の４匹は、ドナー特異的なＭＬＲ不寛容を示したが、他方、２匹の動物は
、一般に、低反応性であった。対照的に、すべての４匹の非ＢＭＴ対照は、Ｂ６
マウスと類似の抗Ｂ１０．Ａ応答を示した(ＢＭＴマウスと比べて、Ｐ＜０．０
１)。全体として、これらの結果は、非骨髄抑制性調節を伴う高投与量の同種異
系ＢＭＴを受けたマウスにおけるドナー特異的なＣＭＬ及びＭＬＲ寛容を示す。
表２の２匹の「不安定なキメラ」の内で、１匹は、ドナー特異的なＣＭＬ不寛
容を示し、他の１匹は、ＣＭＬにおける一般化された不寛容を示した。３匹の不
安定なキメラの内の２匹は、ドナー特異的なＭＬＲ不寛容を示したが、他方、第
三者は、一般化された不寛容を示した(データは示してない)。調製した非ＢＭＴ
対照について認められた強い応答は、調節養生法自体を、この低応答性の原因と
して排除し、不安定キメラ中のその存在、及びＧＶＨＤの証拠の欠如は、ＧＶＨ
と関連した免疫不全をありそうもない説明にする。第三者抗原の、動物が寛容で
あるドナー抗原との交叉反応性は、幾つかのＢＭＴレシピエントにおける弱い第
三者応答の故に、最もありそうな説明である。
幾つかの不安定並びに安定キメラは、ドナー特異的な不寛容をイン・ビトロで
示したので、不安定キメラにおけるキメリズムの減少は、ＭＬＲ又はＣＭＬより
一層鋭敏な不完全寛容の指標であり得る。或いは、キメリズムの減少は、非免疫
学的機構(例えば、乏しいＰＨＳＣ植付け)を反映し得る。これらの可能性を区別
するために、最も厳格な試験である皮膚移植により寛容を評価した。すべての安
定なキメラは、ドナーの皮膚移植片を永久に受容したが、第三者移植片は急速に
拒絶され、それにより、ドナー特異的な寛容が示されている(図４)。キメリズム
の減少がＴ細胞系統に限られている一匹の不安定キメラ(「不安定キメラ」＃２、
表２)も、ドナーの皮膚を受容した。他の２匹の不安定キメラは、ドナー型皮膚
を、それぞれ、１０５日及び４８日目までに慢性的に拒絶した。安定キメラにお
いて、ＢＭＴの３１週後に移植された反復ドナー皮膚(及び元の移植片)は、３〜
８週間後に犠牲にする時まで、完全な状態のままであった。従って、皮膚移植の
最も厳重な基準によって、これらの動物は、永久的なドナー特異的な寛容を示し
た。
高投与量の同種異系骨髄により調製したキメラにおける寛容の機構を調べるた
めにＶβ使用を分析した。Ｂ６／Ｂ１０バックグラウンドゲノム中にコードされ
るＭｔｖ由来のスーパー抗原を与えるのに必要なドナー株であるＢ１０．Ａは、
Ｉ−Ｅを発現する。ＴＣＲがＶβ１１又はＶβ５(これらは、これらのスーパー
抗原に結合する)を含む胸腺細胞の発生は、Ｂ１０．Ａマウスでは、消失するが
、Ｉ−Ｅを発現しないＢ６(Ｈ−２b）マウスでは、消失しない(図５)。Ｖβ１１
＋及びＶβ５＋成熟宿主胸腺細胞(ゲートされたＨ−２Ｋbhigh細胞)及び末梢
ＣＤ４＋細胞を数えた。長期間安定なキメラは、ＰＢＬ中のＶβ５及びＶβ１１
ＣＤ４＋細胞、脾臓細胞及び成熟Ｂ６胸腺細胞の消失を示した(正常Ｂ１０．Ａ
ドナーと類似)。これらのＶβは、非ＢＭＴ対照においては、消失しなかった。
対照Ｖβ８．１／２細胞のパーセンテージは、すべてのグループにおいて正常で
あった(図５；ＰＢＬデータは示してない)。表２の「不安定キメラ」は、安定キ
メラよりも、Ｖβ５＋及びＶβ１１＋宿主型胸腺細胞(１．４〜４．２％のＶβ
５，１．１〜５．１％のＶβ１１)及びCＤ４脾臓細胞及びＰＢＬ(示してない)の
一層完全でない消失を示した。従って、ドナーＩ−Ｅプラススーパー抗原を認識
するＶβの完全な消失は、ドナー特異的な皮膚移植片の寛容及び永久の安定な混
合キメリズムの存在と関連し、これは、胸腺内での消失が寛容の機構であること
を示唆している。
造血細胞は、効率的に、胸腺におけるクローン消失を誘導することができるの
で、我々は、レシピエント胸腺中で、免疫組織化学を用いて、ドナーのＩ−Ｅを
探した。ドナーのＩ−Ｅ＋細胞は、ＢＭＴの２４〜２９週後に、殆どの安定キメ
ラの胸腺において、明らかに、検出可能であった(表２)。対照的に、３匹の不安
定キメラの内の２匹は、それらの胸腺中に検出可能なドナーのＩ−Ｅ＋細胞を含
まなかった(表２)。全体として、これらの結果は、ドナー由来のクラスII＋細胞
の長期間の胸腺内の存在と、ドナーＭＨＣ分子により提示されたスーパー抗原を
認識するＶβの消失との間の相関関係を示している。宿主のクラスII＋細胞は、
すべてのレシピエントの胸腺に正常に分布された。胸腺照射は、安定キメリズム
の最適化及び永久の皮膚移植片の寛容に必須であった(表１)。７ＧｙのＴＩは、
有意に骨髄抑制性でなかったが、それは、高レベルのＰＨＳＣ植付け及び永久の
、消失性の、ドナー特異的な寛容を可能にした。
末梢キメリズムは、高投与量の骨髄により達成され得、全身照射の必要はない
。しかしながら、中央消失性寛容を達成するには、高レベルの胸腺内キメリズム
を発生させるために胸腺中に空間を造るのが最善である。これは、照射により又
は抗Ｔ細胞抗体の多数回の投与の利用により又は胸腺を消失させる薬物により達
成することができる。３〜７Ｇｙの胸腺照射のレベルは、適当であり得る。
材料及び方法動物
雌のＣ５７ＢＬ／６(Ｂ６：Ｈ−２b)、Ｂ１０．Ａ(Ｂ１０．Ａ：Ｈ−２a
、Ｋk、Ｉ−Ａk、Ｉ−Ｅk、Ｄd)、ＢＡＬＢ／ｃ(Ｈ−２d)、ＳＪＬ（Ｈ−２a）
及びＡ．ＳＷ(Ｈ−２a)マウスを、Frederick CamcerResearch Facility(メリーランド
、Frederick在)又はThe Jackson Laboratory(メイン、Bar Harbor在)から購入した
。マウスを特殊な病原体を含まないマイクロアイソレーター環境中に維持した。調節及びＢＭＴ
週齢のマッチした(７〜１４週齢)雌のＢ６レシピエントマウス
は、２ｍｇ及び１．４ｍｇのラットＩｇＧ2b抗マウスＣＤ４ｍＡｂＧＫ１．５(D
ialynas等、J.Immunol.131:2445-2451(1983),参考として本明細書中に援用する)
及び抗マウスＣＤ８ｍＡｂ２．４３(Sarmiento J.Immunol.125:2665(1980)、参
考として本明細書中に援用する)を、それぞれ、ＢＭＴに関して、−５，−１及
び７日目に、腹腔内注射(ｉ．ｐ．)により受けた。７Ｇｙの選択的胸腺照射を０
日目に与えた(Sharabi等、J.Exp.Med.169:493-502(1989)、参考として本明細書
中に援用する)。３５〜４０×１０6のＢ１０．Ａマウス由来の未処理のＢＭＣを
、０〜４日目に毎日(全部で５回の注射)投与した(全部で、１７４〜２００×１
０6ＢＭＣ)。ｍＡｂ
非特異的ＦｃｇＲ結合を、抗マウスＦｃｇＲｍＡｂ２．４Ｇ２ブロック
した(Sherman等、Immunogenetics 12:183-189(1981)、参考として本明細書中に
援用する)。ＦＩＴＣ結合したｍＡｂは、抗ＣＤ４(Pharmingen,カリフォルニア、San Di
cgo在)、抗ＣＤ８(Caltag,カリフォルニア、San Diego在及びPharmingen)及び抗ＭＡＣ
１(Caltage)及びラット抗マウスＩｇｈＭ(ｙｍｅｄ)ｍＡｂ、並びに抗ＴＣＲａ
β、−Ｖｂ５，−Ｖｂ１１及びＶｂ８．１／２ｍＡｂ(Pharmingenより購入)を包
含した。陰性対照ｍＡｂＨＯＰＣ１−ＦＩＴＣ(マウス細胞に対する反応性を有
しない)を、我々の研究室で調製した。ビオチン化抗Ｈ−２ＤdｍＡｂ３４−２−
１２(Ozato等、Transplantation 34:113-120(1982)、参考として本明細書中に援
用する)、抗Ｈ−２ＫbｍＡｂ５Ｆ１(Sherman等、Immunogenctics 12:183-189(19
81)、参考として本明細書中に援用する)及び対照用ｍＡｂＨＯＰＣ１を、フィコ
エリトリン−ストレプトアビジン(ＰＥＡ)を用いて開発した。フィトエリトリン
結合した抗ＣＤ４ｍＡｂ(Pharmingen,カリフォルニア、SanDiego在)及び
非特異的ラットＩｇＧ２ａ(陰性対照)を、Pharmingenより購入した。多系統キメリズムのフローサイトメトリー(ＦＣＭ)分析
ＷＢＣ中の種々の系統
の同種異系再構成、脾臓骨髄及び胸腺を２色ＦＣＭにより評価した。フォワード
アングル及び９０度光散乱特性を用いて、記載のように、ＷＢＣ中のリンパ球、
顆粒球及び単球を区別した。２色ＦＣＭを用いて、特定の系統のドナーと宿主を
区別し、ドナー細胞のパーセンテージを記載されたようにして(Lee等、Transpla
ntation 61:125-132(1996);及びTomita等J.Immunol.153:1087-1098(1994)、参考
として本明細書中に援用する)、特定の型のドナー及び宿主細胞を含む四分円か
らの対照用染色を減じ、正味のドナー細胞のパーセンテージをその表現型のドナ
ープラス宿主細胞のすべての正味のパーセンテージで割ることにより計算した。
死んだ細胞を、低ＦＳＣ／高ヨウ化プロピジウム反応性細胞をゲートで除くこと
により排除した。Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)Ｖβファミリーの分析のために、１
０4のゲートされたＣＤ４＋Ｔ細胞(ＰＢＬ及び脾臓)又は１０4のゲートされたＨ
−２クラスＩhigh胸腺細胞を記載されたように分析した(Tomita等、J.Immunol.1
53:1087-1098(1994)、参考として本明細書中に援用する)。クラスＩhigh胸腺細
胞は、主として、成熟した単一陽性Ｔ細胞を含む(Scollay等、J.Immunol.124:28
45(1980)、参考として、本明細書中に援用する)。混合リンパ球反応(ＭＬＲ)
脾臓細胞を、１５％(ｖ／ｖ)の制御された処理され
た血清置換物(ＣＰＳＲ−２；Sigma)、４％栄養混合物(７．３ｍｇ／ｍｌ Ｌ−
グルタミン、４×非必須アミノ酸(Gibco)、２．７５ｍｇ／ｍｌ ピルビン酸ナ
トリウム、２５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び２５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン
)、１％Ｈｅｐｅｓ緩衝液及び１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを補ったＲ
ＰＭＩ１６４０培地中の４×１０5の応答者及び４×１０5の剌激者(３０Ｇｙ)を
含むウェル中で、３７℃で、５％ＣＯ２中で、３〜４日間、それらが3Ｈ標識さ
れたチミジンでパルスラベルされるまで、三連で、培養し、１８時間後に収穫し
た。刺激インデックス(Ｓ．Ｉ．)を、抗ドナー及び抗第三者応答を抗宿主応答(
これらは、バックグラウンド計数(即ち、刺激者細胞集団がないときのｃｐｍ)と
類似した)と比較することにより計算した。細胞媒介のリンパ球溶解(ＣＭＬ)反応
ＣＭＬ反応を、記載されたように行った
(Sykcs等、J.Immunol.140:2903-2911(1988)、参考として本明細書中に援用する)
、但し、８×１０5の応答者を、各ウェル中で、８×１０5の刺激者(３０Ｇｙ照
射したもの)と培養し、８０００の51Ｃ標識した４８時間コンカナバリンＡリン
パ芽球を５日目に加えた。皮膚移植
ドナー型及び第三者(ＳＪＬ)の全層尾皮膚移植片を、記載されたよう
に移植した(Sharabi等、J.Exp.Med.169:493-502(1989)、参考として本明細書中
に援用する)。移植片を、それらが、完全な状態で、尾毛及びうろこを有するな
らば、受容されたと規定し、完全に脱落したとき又は乾いたかさぶたを形成した
ときに拒絶されたとみなした。免疫組織化学
４ミクロンの切片を凍結胸腺組織から調製し、ｍＡｂＩＳＣＲ(W
atanabe等、Transplantation 36:712-718(1983)、参考として本明細書中に援用
する)(マウスＩｇＧ2b抗Ｉ−Ｅ)、２５−９−１７(マウスＩｇＧ2a抗Ｉ−Ａb)(O
zato等、J.Immunol.126:317-321(1981)、参考として本明細書中に援用する)、Ｈ
ＯＰＣ−１(マウスＩｇＧ2aアイソトープ対照)又は７４−１１−１０(マウスＩ
ｇＧ2bアイソトープ対照)で染色し、ビオチン化ラット抗マウスＩｇＧ2a又は抗
ＩｇＧ2b(Pharmingen)、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼと基
質を用いて、記載されたように発色させた(Tomita等、J.Immunol.153:1087-1098
(1994)、参考として本明細書中に援用する)。染色された切片を、組織が得られ
た動物を知らない観察者が分析した。統計的分析
平均値の比較にスチュアートのｔ検定を用いて、統計的有意を決定
した。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意であると考えた。
II．同種異系幹細胞移植のための細胞源
生きているヒトドナーは、約７．５×１０8の骨髄細胞／ｋｇを提供すること
ができる。この発明の方法は、この数の少なくとも２乃至３倍の投与(ｋｇ当た
り)を、好ましくは、この数の少なくとも１０，１５又は２０倍の投与を含むこ
とができる。骨髄細胞の必要数は、ヒト幹細胞のエキス・ビボ拡大又は増幅によ
り与えることができる。エキス・ビボ拡大は、Emerson,1996,Blood 87:3082に
概説されており、参考として本明細書中に援用する。エキス・ビボ拡大の方法は
、Petzer等、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1470;Zindstra等、1994,Bio Tec
hnology 12:909;及びＷＯ９５１１６９２(Ｄａｖｉｓ等)に、一層詳細に記載さ
れており、これらのすべてを参考として本明細書中に援用する。造血幹細胞源に
は、骨髄細胞、動員された末梢血液細胞、及び利用可能であれば臍帯血細胞が含
まれる。
異種幹細胞移植のための細胞源
同系のドナー動物例えば同系のミニブタの場合には、供給できる数が、単一ド
ナーから収穫し得る数に限定されないので、非常に多数の幹細胞が利用可能であ
る。
レシピエントが霊長類例えばヒトであり、ドナーがブタ例えばミニブタである
場合は、７．５×１０9以上の好ましくは７．５×１０9〜１５×１０10のブタの
骨髄細胞／ｋｇを投与することができる(もっとも、これは、調製養生法の強度
及び個々のレシピエントの健康状態等の因子により変化する)。ここで論じるよ
うに、これらの細胞は、２回以上の投与にて与えることができる。
寛容を誘導するのに必要なブタ骨髄細胞数の測定
下記のシステムを用いて、ブター霊長類モデルにおいて植付けて、寛容を誘導
するのに必要なブタ細胞数を決定し又は正確にすることができる。種々の投与量
のドナー細胞をカニクイザルに投与して、キメリズムの確立及び寛容の誘導に必
要な細胞数を記載したアッセイにより測定することができる。時間０を、レシピ
エントの動脈及び静脈カニューレを灌流すべき肝臓に接続した瞬間として定義す
る。
胸腺空間を、７００ラドの胸腺照射を−１〜−８日目に施与することにより誘
導する。
−１日目に、ウマ抗ヒト抗胸腺グロブリン(ＡＴＧ)の市販品(Upjohn)レシピエ
ントに注射する。このレシピエントを麻酔し、カテーテルIVをそのレシピエント
に挿入し、６ｍｌのヘパリン化全血を注入前に取り出す。次いで、ＡＴＧ製剤(
５０ｍｇ／ｋｇ)を静脈注射する。ヘパリン化全血液の６ｍｌの試料を試験のた
めに、３０分、２４時間及び４８時間の時点に吸い出す。血液試料を、抗体処理
のナチュラルキラー細胞に対する効果について分析し(Ｋ５６２標的にて試験)、
リンパ球サブポピュレーション(ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ
１６を含む)についてＦＡＣＳ分析により分析する。成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞が
排除されなければ、ＡＴＧを、この手順のもっと遅い時に再投与することができ
る。
天然抗体を移植前にレシピエントの循環から除去するために、０日目に、天然
抗体(ｎＡＢ)の機能的吸着をミニブタ肝臓を用いて下記のように行う。−９０分
に、ブタドナーを麻酔して、肝臓を、標準的な操作手順により取り出す用意をす
る。−６０分に、レシピエントのサルを麻酔する。末梢カテーテルIVを挿入して
全血液の６ｍｌの試料を吸い出す。中線切開により、腹大動脈及び大静脈を引き
出す。血液サンプリング用のサイドポートを有するシラスティックカニューレを
、これらの血管に挿入する。
−３０分に、肝臓を、イン・シトゥーで、それが白くなるまで灌流し、次いで
、ブタドナーから取り出して冷リンゲルラクテート中に置く。この肝臓を、サル
における再灌流の直前まで冷やしておく。肝臓バイオプシーを行う。−１０分に
、この肝臓を、暖めたアルブミン溶液で、肝臓が暖まる(３７度)まで、灌流する
。
０時間において、レシピエントの動脈及び静脈カニューレをドナーの肝臓の門
脈及び大静脈に接続して、灌流を開始する。肝臓バイオプシーを、３０分と６０
分に、それぞれ、行う。レシピエントの血液の試料をも、血清用に、３０分と６
０分に、それぞれ、吸い出す。６０分に、この肝臓をカニューレから分離して、
レシピエントの大血管を修復する。このレシピエントのサルから有害な天然抗体
を吸着する機能を果たした肝臓を捨てる。血清用の更なる血液試料を、レシピエ
ントから、２，２４及び４８時間目に吸い出す。臓器灌流を、α１−３ガラクト
ース結合エピトープアフィニティーマトリクス(例えば、アフィニティーカラム
形態、例えばマトリクスに結合したリニアーＢVI型炭水化物)の灌流により置き
換えることができる。
ブタドナー骨髄細胞を、静脈注射により投与する。骨髄を、以前に記載された
ようにして(Pennington等、1988,Transplantation 45:21-26)収穫し、静脈注射
する。典型的には、７．５×１０8／ｋｇの骨髄細胞を、ＷＢＩを含む養生法に
おいて投与する。ＷＢＩを欠く養生法において投与すべき細胞の適当な数を決定
する初
期の試験は、その数の数倍〜２０倍の投与量の範囲で開始すべきである。投薬量
範囲の上端においては、複数回の投与が望ましい。ブタのサイトカインを投与し
て、植付けを促進することができる。
キメリズムの後に、２色のフローサイトメトリーを利用することができる。こ
のアッセイは、モノクローナル抗体を用いて、ドナークラスＩ主要組織適合性抗
原と、レシピエントクラスＩ主要組織適合性抗原に対する白血球共通抗原との間
を区別する。或いは、キメリズムの後にＰＣＲを行うことができる。寛容が誘導
される前に天然抗体が再発することが見出され、これらの抗体がドナー組織にダ
メージを生じるならば、このプロトコールを改変して、ＢＭＴ後に体液性寛容が
確立されるのに十分な時間を与えてから臓器を移植する。ドナー抗原に対する寛
容の後に、標準的方法例えばＭＬＲアッセイを行うことができる。
III．骨髄移植による寛容の誘導
下記の手順をデザインして、拒絶前の、異種宿主における移植臓器(異種移植
片)の生存時間を長引かせた。この臓器は、任意の臓器例えば肝臓、腎臓、膵臓
又は心臓であってよい。この方法の主なストラテジーには、次のうちの少なくと
も１つが含まれる：天然抗体の排除(例えば、レシピエントの血液をドナー反応
性の天然抗体と反応するエピトープと接触させることによる)；宿主Ｔ細胞の不
活性化；宿主ＮＫ細胞の不活性化；寛容を誘導する幹細胞例えば骨髄幹細胞の移
植(適宜のドナー間質組織を移植又はドナーサイトカインを投与)；及び胸腺照射
の施与。胸腺照射と組み合わせた十分多数の投与されたドナー幹細胞は、ＷＢＩ
の必要性を有意に減じ又は排除する。この方法は、これらのステップの何れか又
はすべてを含む。好ましくは、それらを、下記の順序で行う。
第１に、ウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン(ＡＴＧ)製剤を、レシピエントに静脈
注射する。この抗体製剤は、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。
排除されなければ、成熟Ｔ細胞は、骨髄移植物の拒絶及び感作後の移植片自体の
拒絶の両方を促進するであろう。ＡＴＧ製剤は又、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞
をも排除する。ＮＫ細胞は、おそらく、移植された臓器に何の影響も有しないが
、新たに導入された骨髄を直ぐに拒絶するように作用するであろう。任意の哺乳
動
物宿主から得られた抗ヒトＡＴＧ例えばブタで生成されたＡＴＧを用いることが
できる(もっとも、今までは、ブタＡＴＧ製剤は、ウマ由来のＡＴＧより低力価
であった)。抗ＮＫモノクローナル抗体は、一般に、すべての宿主ＮＫ細胞を溶
解させるものではないが、ＡＴＧ中のポリクローナル混合物はすべての宿主ＮＫ
細胞を溶解させ得るので、ＡＴＧは、抗ＮＫモノクローナル抗体より優れている
。しかしながら、抗ＮＫモノクローナル抗体を用いることはできる。
宿主Ｔ細胞が移植後再生中であるときの宿主の胸腺中のドナー抗原の存在は、
宿主Ｔ細胞の寛容化に決定的に重要である。もしドナーの造血幹細胞が宿主の胸
腺中で確立し得ず且つ宿主のＴ細胞が再生する前に寛容を誘導できないならば、
抗レシピエントＴ細胞抗体の反復投与量が、この非骨髄芽球養生法中で必要であ
り得る。宿主のＴ細胞の持続的な涸渇は、数週間にわたって必要とされ得る。
貧血を回避するには、レシピエントに脾臓摘出術を施すことも必要であるか又
は望ましい。
第２に、天然抗体をレシピエントの血液から血液灌流により吸着する。前に形
成された天然抗体(ｎＡＢ)は、移植片拒絶の一次抗体である。天然抗体は、異種
個体の内皮細胞に結合する。これらの抗体は、異種個体ドナーの抗原に対する任
意の既知の以前の曝露に無関係である。新たに発生するＢ細胞が寛容化される機
構は、不明である。α１−３ガラクトース結合エピトープ−アフィニティーマト
リクス(例えば、アフィニティーカラム形態、例えばマトリクス結合リニアーＢV
I型炭水化物)は、抗ブタ抗体をレシピエントの血液から除くのに有用である。
非骨髄芽球手順における第三のステップは、ドナー特異的成長因子又はサイト
カインを供給することである。
肝臓は、胎児における造血の主要部位であり、胎児肝は又、造血幹細胞の源と
して骨髄の代わりとして働くことができる。胸腺は、Ｔ細胞成熟の主要部位であ
る。各臓器は、宿主に移植されたそれぞれの未分化幹細胞の分化を支持すること
のできる臓器特異的間質マトリクスを含む。成体の胸腺を用いることもできるが
、妊娠の十分初期に得られた胎児組織が、ＧＶＨＤを引き起こし得る成熟Ｔリン
パ球を有しないので、好適である。胎児組織は又、移植したときに、成体組織よ
りよく生存する傾向がある。ＧＶＨＤに対する追加の用心として、胸腺間質組
織を、移植前に、例えば１０００ラドで、照射することができる。別報として又
は移植の補助として、胎児肝細胞を液体懸濁液として投与することができる。
第四に、ドナーの骨髄細胞(ＢＭＣ)、又は他の造血幹細胞源例えば胎児肝懸濁
液をレシピエントに注射することができる。ドナーのＢＭＣは、レシピエントの
適当な部位に向かい、残りの宿主細胞と共に連続的に成長して増殖し、キメラの
リンパ造血集団を形成する。このプロセスにより、新規に形成されるＢ細胞(及
びそれらが生成する抗体)を、移植物が自己として認識されるようにドナー抗原
にさらす。ドナーに対する寛容は又、造血幹細胞例えばＢＭＣの植え付けが達成
された動物において、Ｔ細胞レベルにおいても認められる。臓器移植片を、骨髄
キメリズムが誘導された数ヶ月後にかかるレシピエント中に置くと、ドナーに対
する天然抗体は消失しており、移植片は、免疫系の体液性及び細胞性の両防護に
より受容される。このアプローチは、造血細胞例えばＢＭＴ例えば胎児肝懸濁液
の移植後に、臓器移植時点で正常の健康及び免疫適格が回復されるだけ十分長期
間臓器移植を行うことを可能にするという追加の利点を有する。異種個体ドナー
の利用は、同じ動物又は遺伝的にマッチした動物に由来する骨髄細胞及び臓器の
利用の可能性を与える。
この分野で議論されている方法の多くは、全身照射を利用して造血空間を造り
、それにより、植え付けを促進する。この照射の必要性は、十分な数のドナー骨
髄細胞を投与することにより、実質的に減じ又は排除することができる。これは
、胸腺空間を誘導する処理例えば胸腺照射と組み合わせるべきである。
最後に、Ｔ細胞特に胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を、更に、レシピエントに、免疫
抑制剤例えばシクロスポリンの短期コースを施与することにより抑制することが
できる。
これらの手順の何れでも移植臓器の生存を助けることができるが、最良の結果
は、すべてのステップを組み合わせて用いるときに達成される。この発明の方法
を用いて、同種異系移植片に寛容を与えることができ(移植片ドナーとレシピエ
ントの両者がヒトの場合)、そして異種移植片に寛容を与えることができる(移植
片ドナーが非ヒト動物例えばブタ例えばミニブタであり、移植片レシピエントが
霊長類例えばヒトである場合)。
異種移植片の場合、移植片のドナー及び、寛容誘導性造血細胞又は灌流すべき
肝臓の何れかを供給する個体は、同じ個体であるべきであり、又はできるだけ密
接な関係であるべきである。例えば、高度に同系交配したドナーのコロニーから
移植組織を取り出すのが好ましい。詳細なプロトコール
カニクイザルにミニブタドナーからの腎臓を受けさせるための準備をする下記
のプロトコールにおいて、ゼロ時間を、レシピエントの動脈及び静脈カニューレ
を灌流すべき肝臓に接続する瞬間として定義する。
−１日に、ウマ抗ヒト抗胸腺グロブリン(ＡＴＧ)の市販品(Upjohn)を、レシピ
エントに注射する。ＡＴＧは、排除しないと寛容を誘導するのに用いる骨髄の拒
絶を引き起こすであろう成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。レシ
ピエントを麻酔し、IVカテーテルをそのレシピエントに挿入して、６ｍｌのヘパ
リン化全血液を注入前に取り出す。次いで、ＡＴＧ製剤を、静脈注射する(５０
ｍｇ／ｋｇ)。ヘパリン化全血液の６ｍｌの試料を、３０分、２４時間及び４８
時間の時点で試験用に吸い出す。血液試料を、抗体処理のナチュラルキラー細胞
活性に対する効果について分析し(Ｋ５６２標的にて試験)、ＣＤ４，ＣＤ８，Ｃ
Ｄ３,ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１６を含むリンパ球サブポピュレーションについてＦ
ＡＣＳ分析により分析する。両アッセイからの予備的データは、両グループの細
胞がＡＴＧの投与により排除されることを示している。もし、成熟Ｔ細胞及びＮ
Ｋ細胞が排除されなければ、ＡＴＧを、この手順のもっと遅い時点(臓器移植の
前及び後の両方)で再投与することができる。
多くの技術方法において施与される準致死的照射は、投与する幹細胞数を増す
こと及び７００ラドの胸腺照射を施与することにより省かれる。胸腺照射は、０
日目に送達する。
天然抗体は、臓器拒絶の主要な原因である。天然抗体を、移植前に、レシピエ
ントの循環から除去するために、０日目に、天然抗体(ｎＡＢ)の機能的吸着を、
下記のようにミニブタの肝臓を用いて行う。−９０分に、ブタドナーを麻酔し、
そして標準的操作手順により肝臓を取り出す準備をする。−６０分に、レシピエ
ントのサルを麻酔する。末梢IVカテーテルを挿入し、６ｍｌの全血試料を吸い出
す。中線切開により、腹大動脈及び大静脈を引き出す。血液サンプリング用サイ
ドポートを有するシラスティックカニューレをこれらの血管に挿入する。
−３０分に、肝臓を、イン・シトゥーで、それが白くなるまで灌流し、次いで
、ブタドナーから取り出して冷リンゲルラクテート中に置く。この肝臓を、サル
における灌流の直前まで冷やしておく。肝臓バイオプシーを行う。−１０分に、
この肝臓を、暖めたアルブミン溶液で、肝臓が暖まる(３７度)まで、灌流する。
０時間において、レシピエントの動脈及び静脈カニューレをドナーの肝臓の門
脈及び大静脈に接続して、灌流を開始する。肝臓バイオプシーを、３０分と６０
分に、それぞれ、行う。レシピエントの血液の試料をも、血清用に、３０分と６
０分に、それぞれ、吸い出す。６０分に、この肝臓をカニューレから分離して、
レシピエントの大血管を修復する。このレシピエントのサルから有害な天然抗体
を吸着する機能を果たした肝臓を捨てる。血清用の更なる血液試料を、レシピエ
ントから、２，２４及び４８時間目に吸い出す。Ｔ細胞及びＢ細胞媒介の寛容に
よる移植臓器の長期間の生存を促進するために、ドナー骨髄細胞をレシピエント
に投与してキメラ骨髄を形成する。骨髄中のドナー抗原の存在は、新たに発生す
るＢ細胞及び新たに感作されたＴ細胞がドナーの抗原を自己として認識すること
を可能にし、それにより、ドナーからの移植臓器に対する寛容を誘導する。ドナ
ーＢＭＣを安定化するために、ドナー組織(胎児肝、胸腺及び／又は胎児脾臓の
組織スライスの形態)をレシピエントの腎臓カプセル下に移植する。間質組織を
、好ましくは、造血幹細胞例えばＢＭＣ又は胎児肝細胞懸濁液の投与と同時に又
は該投与の前に移植する。十分な幹細胞を投与して、調製用の又は造血空間を造
るための照射の必要性を排除する。
キメリズムの後に、２色のフローサイトメトリーを利用することができる。こ
のアッセイは、モノクローナル抗体を用いて、ドナークラスＩ主要組織適合性抗
原と、レシピエントクラスＩ主要組織適合性抗原に対する白血球共通抗原との間
を区別する。ＢＭＣを、更に、臓器移植と同時かまたはそれに先んじて注射する
ことができる。骨髄を、以前に記載されたように(Pennington等、1988,Transpla
ntation 45:21-26)収穫して、静脈注射する。寛容が誘導される前に天然抗体が
再発することが見出され、これらの抗体が移植片にダメージを生じるならば、こ
の
プロトコールを改変して、ＢＭＴ後に体液性寛容が確立されるのに十分な時間を
与えてから臓器を移植する。
これらの上記のアプローチを、移植拒絶の問題を共同的に予防するようにデザ
インする。
この発明の方法は、上記のように組み合わせて用いてもよいし、部分的に用い
てもよい。
骨髄細胞を導入する方法は、特に、(１)造血幹細胞の注射と移植片の移植との
時間間隔を増大させること；(２)注射する造血幹細胞の量を増すこと；(３)造血
幹細胞の注射回数を変えること；(４)造血幹細胞の送達方法を変えること；(５)
造血幹細胞の組織源を変えること(例えば、胎児肝細胞懸濁液を用いることがで
きる)；又は(６)造血幹細胞のドナー源を変えることにより変更することができ
る。移植片ドナー由来の造血幹細胞が好適であっても、造血幹細胞は、他の個体
若しくは種から、又は遺伝子工学処理した同系交配ドナー株から、又はイン・ビ
トロ細胞培養から得ることができる。
レシピエントに造血幹細胞の移植の用意をする方法は、変化し得る。例えば、
レシピエントは、脾臓摘出術を受けてよい。後者は、好ましくは、非骨髄芽球養
生法前に(例えば、−１４日目に)施与する。
天然抗体の血液灌流は、(１)他の脈管系臓器例えば肝臓、腎臓、腸を利用する
ことができ；(２)複数の順次的な臓器又はアフィニティーマトリクスを利用する
ことができ；(３)各臓器又はアフィニティーマトリクスを灌流する時間の長さを
変えることができ；(４)灌流する臓器のドナーを変えることができる。造血細胞
移植前に導入する抗体は、(１)Ｔ細胞サブセット又はＮＫ細胞に対するモノクロ
なる抗体(例えば、Hercend等の米国特許第４，７７２，５５２号に記載された抗
ＮＫＨ１A、参考として本明細書中に援用する)を用いることにより；(２)抗ヒト
ＡＴＧを他の哺乳動物宿主(例えば、サル、ブタ、ウサギ、イヌ)中で調製するこ
とにより；又は(３)上記の宿主の何れかにおいて調製した抗サルＡＴＧを用いる
ことにより変えることができる。
この発明の方法は、他の哺乳動物レシピエント(例えば、アカゲザル)に採用す
ることができ、他の哺乳動物ドナー(例えば、霊長類、ヒツジ、又はイヌ)を用い
ることができる。
血液灌流の別法又は補助として、宿主抗体を、過剰の造血細胞の投与により涸渇
させることができる。
造血細胞移植(例えば、ＢＭＴ)前に導入する間質組織は、(１)胎児の肝及び胸
腺組織を細胞懸濁液として投与すること；(２)胎児肝若しくは胸腺間質組織を投
与する(但し、両方ではない)こと；(３)間質移植組織を他のカプセル封入された
十分血管形成された部位に置くこと、又は(４)間質組織源として成体胸腺若しく
は胎児脾臓を用いることによって変え得る。
他の具体例
同種異系抗原又は同種異系移植片に対する寛容を誘導し又はこれらの受容を促
進するためのここに記載の方法は、ドナーとレシピエント間で、移植片拒絶に影
響を有するＭＨＣ遺伝子座又は他の遺伝子座に任意の程度のミスマッチがある場
合において用いることができる。好ましくは、少なくとも１つのＭＨＣ遺伝子座
において、又は認識及び拒絶を媒介する少なくとも１つの他の遺伝子座例えばマ
イナー抗原遺伝子座においてミスマッチが存在する。クラスＩ及びクラスIIＭＨ
Ｃ遺伝子座に関して、ドナー及びレシピエントは、クラスＩでマッチし且つクラ
スIIでミスマッチであってよく；クラスＩでミスマッチで且つクラスIIでマッチ
してよく；クラスＩでミスマッチで且つクラスIIでミスマッチであってよく；ク
ラスＩでマッチし、クラスIIでマッチしてよい。これらの組合せの何れかにおい
て、認識及び拒絶を制御する他の遺伝子座例えばマイナー抗原遺伝子座は、マッ
チしてもミスマッチであってもよい。上記のように、少なくとも１遺伝子座にお
いて、ミスマッチがあることが好ましい。ＭＨＣクラスＩにおいてミスマッチで
あるとは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ遺伝子座に関してミスマッチである
ことを意味する(例えば、ヒトの場合、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＬＨＡ−Ｃ
の少なくとも１つにおいてミスマッチであり、ブタの場合であれば、少なくとも
１つのＳＬＡクラスＩ遺伝子座例えばブタＡ又はＢ遺伝子座においてミスマッチ
である)。ＭＨＣクラスIIでミスマッチであるとは、少なくとも１つのＭＨＣク
ラスII遺伝子座においてミスマッチであることを意味する(例えば、ヒトの場合
、
ＤＰα、ＤＰβ、ＤＱα、ＤＱβ、ＤＲα又はＤＲβの少なくとも１つにおいて
ミスマッチであり、ブタの場合には、少なくとも１つのＳＬＡクラスII遺伝子座
例えばＤＱα若しくはβ又はＤＲα若しくはβにおいてミスマッチである)。
同種異系抗原又は同種異系移植片に対する寛容を誘導するためのここに記載の
方法は、ドナーとレシピエント間で、混合リンパ球アッセイにおいて任意の程度
の反応性がある場合において、たとえば、中間体がないか低い又は高い混合リン
パ球反応性(ドナーとレシピエント間)がある場合において用いることができる。
好適具体例において、混合リンパ球反応性を用いて、クラスIIについてのミスマ
ッチを規定し、この発明は、混合リンパ球アッセイにより規定されるクラスIIの
ミスマッチを有する個体間での同種異系移植を行うための方法を含む。血清学的
試験を用いて、クラスＩ又はII遺伝子座におけるミスマッチを測定することがで
き、この発明は、血清学的方法により測定してクラスＩ又はIIに任意の程度のミ
スマッチを有する個体間の同種異系移植を行うための方法を含む。好適具体例に
おいて、この発明は、血清学的及び又は混合リンパ球アッセイにより測定してク
ラスＩ及びクラスIIの両方にミスマッチを有する個体間の同種異系移植を行うた
めの方法を特徴とする。
この発明の方法は、新生物疾患特に普通の治療例えば化学療法又は放射線療法
に耐性の疾患に苦しめられている組織又は臓器を置き換えるのに特に有用である
。この発明の方法を用いて、移植片例えば同種異系移植片例えば少なくとも１つ
のクラスＩ遺伝子座で、少なくとも１つのクラスII遺伝予座で、又は少なくとも
１つのクラスＩ及びクラスIIの各遺伝子座でミスマッチであるドナー由来の同種
異系移植片に対する寛容を誘導することができる。好適具体例において、移植片
は、消化管又は腸からの組織、例えば胃からの組織、又は腸組織(例えば、小腸
、大腸若しくは結腸)を含み；移植片は、レシピエントの消化系の一部を、例え
ば消化管又は腸、例えば胃、腸(例えば、小腸、大腸若しくは結腸)の全部又は一
部を置き替える。
この発明の方法は、調製用ＷＢ照射の必要性を最小化し又は排除する。しかし
ながら、照射を施与する場合、照射腺量を分割することにより、即ち照射を２回
以上の露出又は持続時間にて送達することにより、一層低い照射毒性で混合キメ
リズムを誘導することが可能である。従って、異種移植片又は同種移植片のレシ
ピエント例えば霊長類例えばレシピエントの照射を要求するこの発明の如何なる
方法においても、その照射は、単一露出にて送達してもよいし又は、一層好まし
くは、２回以上の露出若しくは持続時間に分けてもよい。これらの分割した線量
の総計は、好ましくは、ラド又はＧｙにて、単一露出にて与えた場合に混合キメ
リズムを生じ得る照射線量と等しい。これらの分割照射は、好ましくは、ほぼ等
しい線量とする。照射線量の過剰分割も又、この発明の方法において用いること
ができる。これらの分割照射は、同じ日に送達することもできるし又は、１、２
、３、４、５日以上の間隔にて分けることもできる。全身照射、胸腺照射、又は
これらの両方を分けることができる。
胸腺照射も又、分割することができる。例えば、７００ラドの単一線量は、３
５０ラドずつの２分割照射に置き替えることができ、又は１００ラドずつの７回
の分割照射に置き替えることができる。
この発明の方法は、レシピエントの脾臓摘出を含むことができる。
ここで論じるように、血液灌流（例えば、ドナー臓器を用いる血液灌流）を用
いて、宿主の天然抗体を涸渇させることができる。他の天然抗体を涸渇させ或は
不活性化させるための方法を、ここに記載の任意の方法と共に用いることができ
る。例えば、天然抗体を涸渇させ又は不活性化させる薬物例えばデオキシスパガ
リン（ＤＳＧ）(Bristol)又は抗ＩｇＭ抗体を、同種移植片又は異種移植片のレ
シピエントに投与することができる。ＤＳＧ(又は、同様の薬物)、抗ＩｇＭ及び
血液灌流の内の一つ又は幾つかを用いて、この発明の方法において、レシピエン
トの天然抗体を涸渇させ或は不活性化させることができる。６ｍｇ／ｋｇ／日の
濃度のＤＳＧ（静脈注射）が、ブタにおけるカニクイザル腎臓移植片に対する天
然抗体機能を抑制するのに有用であることが見出された。
ここに記載の方法の何れか特に霊長類の又は臨床的方法においては、レシピエ
ントの幹細胞をドナー細胞で完全に置き換えるのではなくて混合キメリズムを形
成するのが好ましい。
胸腺Ｔ細胞の不活性化のための別法も又、この発明の具体例に含まれる。ここ
に記載の方法の幾つかは、胸腺照射を施して宿主の胸腺Ｔ細胞を不活性化させる
か或はドナー抗原に対する宿主の胸腺Ｔ細胞媒介の応答を減じることを含む。こ
の発明の同種又は異種移植法において要求される胸腺照射は、宿主の胸腺Ｔ細胞
媒介の応答を減じる他の処理によって(例えば、胸腺Ｔ細胞を涸渇させること及
び／又は１種以上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＣＤ４コレセプター若しくは
ＣＤ８コレセプターを下方制御することにより)補われ又は置き替えられ得るこ
とが発見された。例えば、胸腺照射を、宿主の胸腺Ｔ細胞媒介の応答を減じるだ
け十分な回数、十分な量で、十分な期間投与された抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗Ｃ
Ｄ４及び／又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体）により、補い又は置き替えること
ができる。
最良の結果のためには、抗Ｔ細胞抗体を、繰り返し投与すべきである。例えば
、抗Ｔ細胞抗体を、ドナー骨髄移植の前に、１、２、３回以上投与することがで
きる。典型的には、骨髄移植前の抗体投与量は、骨髄移植の約５日前に患者に与
えられる。骨髄移植の６、７又は８日前に更なる一層早い投与量を与えることも
できる。最初の処理を施し、次いで、患者が血清中の過剰の抗体及び末梢Ｔ細胞
の疫９９％涸渇を示すまで骨髄前投与を１〜５日間毎日繰り返し、次いで、骨髄
移植を実施するのが望ましい。抗Ｔ細胞抗体は又、ドナー骨髄移植後も、１、２
、３回以上投与することができる。典型的には、骨髄移植後処理は、骨髄移植後
２〜１４日に与える。この骨髄移植後施与は、必要な回数悔い返すことができる
。２回以上の施与を与える場合は、約１週間間隔でよい。もし患者が、早い又は
望ましくないＴ細胞回復を受けるようならば、更なる投与量を与えることができ
る。好ましくは、抗Ｔ細胞抗体を、ドナー骨髄移植の前に、少なくとも１回（好
ましくは、２、３回以上）投与し、且つドナー骨髄移植後に、少なくとも１回（
このましくは、２、３回以上）投与する。
ここに記載の方法の幾つかは、造血幹細胞のレシピエントへの投与を含む。そ
れらの方法の多くにおいて、造血幹細胞は、移植片（同種又は異種移植片）の移
植前又は移植の時点に投与され、この造血幹細胞の投与の主な目的は移植片に対
する寛容を誘導することである。本発明者は、その後の１回以上の造血幹細胞の
投与（例えば、第２、３、４、５又はそれ以上の投与）が寛容の生成及び／又は
維持に望ましいことを見出した。従って、この発明は又、ここで言及される
方法の何れかの部分として造血幹細胞を以前に投与されたレシピエント例えば霊
長類例えばヒトに、造血幹細胞を投与する方法をも含む。
理論に拘束されることは望まないが、本発明者は、反復幹細胞投与は、移植片
レシピエントにおけるキメリズム及び恐らくは長期欠失性寛容を促進することが
できるものと考える。従って、ここで言及される造血幹細胞の投与を含む任意の
方法は、更に、幹細胞の複数の投与を含むことができる。公的具体例において、
幹細胞の第１及び第２の投与を、移植片の移植の前に与え；幹細胞の第１の投与
を移植片の移植前に与え且つ幹細胞の第２の投与を移植片の移植時点に与える。
他の好適具体例において、幹細胞の第１の投与を、移植片の移植の前又は移植の
時点に与え、幹細胞の第２の投与を、移植片の移植の後に与える。造血幹細胞の
投与を、幹細胞の前の投与の少なくとも２日後、１週間後、１月後又は６月後に
与え；移植片の移植の少なくとも２日後、１週間後、１月後又は６月後に与える
。
この方法は、更に、レシピエントが例えば移植された臓器の機能低下により、
宿主のドナお特異的抗体応答の変化により又はドナー抗原に対する宿主リンパ球
応答の変化により示される拒絶の徴候を示し始めるとき；キメリズムのレベルが
低下するとき；キメリズムのレベルが予め決めた値より低下したとき；キメリズ
ムのレベルが、ドナーＰＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での染色がＰ
ＢＭＣに結合しない同位体対照での染色以下であるレベルに達し又はそれより低
下したとき(例えば、ドナー特異的モノクローナルが、これらの細胞の１〜２％
未満を染色するとき)；又は、一般に、寛容を維持し若しくは移植片の受容を延
長させることが必要なときには、造血幹細胞の第２の又はその後の投与量を施与
するステップを含むことができる。従って、この発明の方法を、造血幹細胞の１
回以上の投与を受けた患者が造血幹細胞のその後の投与を必要としているかどう
かを測定し、もし必要であるならば、その患者に造血幹細胞のその後の投与量を
施与する更なるステップを含むように改変することができる。
ここで言及される任意の方法は、レシピエントにおける抗体の産生、レベル又
は活性を阻止する薬剤例えば１５−デオキシスパガリン、ミコフェノレートモフ
ェチル(mofetil)、ブレクィナ（brequinar）ナトリウム、又は類似の
薬剤の投与を含むことができる。これらの薬剤の一種以上を、ドナー組織の移植
前（例えばドナー組織の移植の１、２若しくは３日前又は１、２若しくは３週間
前）に；ドナー組織の移植の時点に；又は、ドナー組織の移植後（例えば、移植
片の移植の１、２若しくは３日後又は１、２若しくは３週間後）に投与すること
ができる。
この薬剤の投与は、レシピエントが、例えば、移植された臓器の機能低下によ
り、宿主のドナー特異的抗体応答の変化により若しくはドナー抗原に対する宿主
リンパ球応答の変化により示される拒絶の徴候を示し始めるとき；キメリズムの
レベルが減少するとき；キメリズムのレベルが予め決めた値より添加するとき；
キメリズムのレベルが、ドナーＰＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での
染色がＰＢＭＣに結合しない同位体対照での染色以下であるレベルに達し若しく
はそれより低下するとき（例えば、ドナー特異的なモノクローナルが、これらの
細胞の１〜２％未満を染色するとき）；又は、一般に、寛容を維持し若しくは移
植片の受容を延長することが必要であるときに開始することができる。
薬剤を投与する期間（又は、患者において臨床的に有効なレベルが維持される
期間）は、長期間例えば６月以上又は１年以上でも、短期間例えば１年未満（一
層好ましくは、６月以下、一層好ましくは１月以下、更に好ましくは２週間以下
）であってもよい。この期間は、一般に、少なくとも約１週間、好ましくは少な
くとも約２週間持続する。好適具体例において、この期間は、２週間又は３週間
の長さである。
好適具体例は、移植片移植の日に開始して約２週間にわたる１５−デオキシス
パガリン（６ｍｇ／ｋｇ／日）の投与を含む。
ここで言及される方法の幾つかは、造血幹細胞のレシピエントへの投与を含む
。本発明者は、一種以上のサイトカイン（好ましくは、これらの幹細胞を取り出
した種由来のサイトカイン）の投与が植付け、混合キメリズム及び寛容を促進し
或は移植片の受容を延長することを見出した。かかるサイトカインの利用は、全
身照射の必要性を減じ又は排除することができる。従って、この発明は又、レシ
ピエントに一種以上のサイトカイン（例えば、ドナー種のサイトカイン）を投与
する方法をも含む。
理論に拘束されることは望まないが、本発明者は、これらのサイトカイン（特
に、ドナー種サイトカイン）は、ドナー幹細胞又はそれらの子孫の細胞の植付け
及び／又は機能を促進するものと考える。従って、造血幹細胞の投与を含むここ
で言及される任意の方法は、更に、サイトカイン例えばＳＣＦ、ＩＬ−３又はＧ
Ｍ−ＣＳＦの投与を含むことができる。好適具体例において、このサイトカイン
は、標的細胞との相互作用において種特異的であるものである。
サイトカインの投与は、移植片の移植又は幹細胞の移植の前又は後に開始する
ことができる。
この方法は、更に、レシピエントが、例えば移植された臓器の機能低下により
、宿主のドナー特異的抗体応答の変化により若しくはドナー抗原に対する宿主リ
ンパ球応答の変化により示される拒絶の徴候を示し始めたとき；キメリズムのレ
ベルが低下したとき；キメリズムのレベルが予め決めた値より低下したとき；キ
メリズムのレベルが、ドナーのＰＢＭＣ抗原に特異的なモノクローナル抗体での
染色がＰＢＭＣに結合しない同位体対照での染色以下であるレベルに達し若しく
はそれより低下したとき(例えば、ドナー特異的モノクローナルがこれらの細胞
の１〜２％未満を染色するとき)；又は、一般に、寛容を維持し或は移植片の受
容を延長することが必要であるときに、サイトカインの第１の又はその後の投与
量をそのレシピエントに投与するステップを含むことができる。従って、この発
明の方法を、患者がサイトカイン治療を必要としているか否かを決定し、もし必
要としているならばサイトカインを投与する更なるステップを含むように改変す
ることができる。
サイトカインを投与する期間（又は、臨床的に有効なレベルが患者において維
持される期間）は、長期間例えば６月以上若しくは１年以上であっても、又は短
期間例えば１年以下、一層好ましくは６月以下、一層好ましくは１月以下、更に
好ましくは２週間以下であってもよい。この期間は、一般に、少なくとも約１週
間、好ましくは少なくとも約２週間維持する。
好適具体例において、レシピエントは、霊長類例えばヒトであり、ドナーは、
異なる種からのものであり、例えばドナーはブタであり、ブタＳＣＦを投与し；
ブタＩＬ−３を投与し；ブタＳＣＦとブタＩＬ−３の組合せを投与し；ブタ特異
的な造血促進因子例えばブタＧＭ−ＳＣＦを、例えば幹細胞の移植後に（例えば
、幹細胞の移植の約１月後に）投与する。
特に好適な具体例は、シクロスポリン又は類似の薬剤の短期コース(例えば、
約１月)、１５−デオキシスパガリン又は類似の薬剤の短期コース(例えば、約２
週間)及びドナー特異的なサイトカイン例えばＳＣＦ及びＩＬ−３の短期コース
（例えば、約２週間）を組合せる。ブタの移植片及びブタの幹細胞を受けたカニ
クイザルにおいて、シクロスポリン(１５ｍｇ／ｋｇ／日で２８日間)、１５−デ
オキシスパガリン（６ｍｇ／ｋｇ／日で２週間）及び組換えブタサイトカイン（
ＳＣＦ及びＩＬ−３、各々１０μｇ／ｋｇ／日（静脈注射）で２週間）を含む処
理が有用であることが見出された。投与を、移植片の移植の時点に開始した。(
これらのサルは又、−６及び−５日目の３×１００ｃＧｙの全身照射及び幹細胞
投与直前のブタ肝臓を用いる血液灌流よりなる調製用養生法も受けた)。
抗ＣＤ２抗体（好ましくは、モノクローナル例えばＢＴＩ−３２２又は類似の
若しくは重複するエピトープに対するモノクローナル）を、ここで言及される任
意の方法における任意の抗Ｔ細胞抗体（例えば、ＡＴＧ）に加えて又はそれに代
えて用いることができる。
他の具体例は、後記の請求の範囲内にある。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｅ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ
，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，
ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ
Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ
，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １.第１の種のレシピエント哺乳動物における第２の種のドナー哺乳動物から得 た移植片に対する寛容を促進する方法であって、該方法は： 該レシピエント哺乳動物に、該第２の種の造血幹細胞を導入し； 該レシピエント中に胸腺空間を造り；そして 該移植片を該レシピエントに導入する ことをふくみ、ここに、投与するドナーの幹細胞の数が、造血空間を造るための 照射なしで混合キメリズムを形成し得るだけ十分なものである、上記の方法。 ２．前記の混合キメリズムが、全身照射により造られる造血空間なしで形成され る、請求項１に記載の方法。 ３．前記のレシピエントがヒトである、請求項１に記載の方法。 ４．前記のレシピエントがヒトであり且つ前記の移植片がブタ由来である、請求 項１に記載の方法。 ５．前記のブタがミニブタである、請求項４に記載の方法。 ６．前記の胸腺空間を、胸腺照射、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナ ー又は免疫抑制性化学物質若しくは薬物をレシピエントに投与することの少なく とも１つにより造る、請求項１に記載の方法。 ７．前記の胸腺空間を、胸腺照射を前記のレシピエントに施与することにより造 る、請求項１に記載の方法。 ８．前記の胸腺空間を、免疫抑制性化学物質又は薬物を前記のレシピエントに投 与することにより造る、請求項１に記載の方法。 ９．前記の胸腺空間を、シクロスポリンの短期コースを前記のレシピエントに施 与することにより造る、請求項１に記載の方法。 １０.多数回の造血幹細胞投与を前記のレシピエントに与える、請求項１に記載 の方法。 １１．前記のレシピエント哺乳動物のドナー反応性Ｔ細胞の不活性化を更に含む 、請求項１に記載の方法。 １２.前記のレシピエント哺乳動物のドナー反応性ＮＫ細胞の不活性化を更に含 む、請求項１に記載の方法。 １３．前記の移植片が腎臓を含む、請求項１に記載の方法。 １４．前記の移植片が肝臓を含む、請求項１に記載の方法。 １５.レシピエント哺乳動物における同じ種のドナー哺乳動物から得た移植片に 対する寛容を促進する方法であって、該方法は： 該レシピエント咄乳動物に、該ドナーの造血幹細胞を導入し； 該レシピエント中に胸腺空間を造り；そして 該移植片を該レシピエントに移植する ことをふくみ、ここに、投与するドナーの幹細胞の数が、造血空間を造るための 照射なしで混合キメリズムを形成し得るだけ十分なものである、上記の方法。 １６．前記の混合キメリズムが、全身照射により造られる造血空間なしで形成さ れる、請求項１５に記載の方法。 １７．前記のレシピエントがヒトである、請求項１５に記載の方法。 １８．前記の胸腺空間を、胸腺照射、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキ ナー又は免疫抑制性化学物質若しくは薬物をレシピエントに投与することの少な くとも１つにより造る、請求項１５に記載の方法。 １９．前記の胸腺空間を、胸腺照射を前記のレシピエントに施与することにより 造る、請求項１５に記載の方法。 ２０．前記の胸腺空間を、免疫抑制性化学物質又は薬物を前記のレシピエントに 投与することにより造る、請求項１５に記載の方法。 ２１．前記の胸腺空間を、シクロスポリンの短期コースを前記のレシピエントに 施与することにより造る、請求項１５に記載の方法。 ２２．多数回の造血幹細胞投与を前記のレシピエントに与える、請求項１５に記 載の方法。 ２３．前記のレシピエント哺乳動物のドナー反応性Ｔ細胞の不活性化を更に含む 、請求項１５に記載の方法。 ２４.前記のレシピエント哺乳動物のドナー反応性ＮＫ細胞の不活性化を更に含 む、請求項１５に記載の方法。 ２５．前記の移植片が腎臓を含む、請求項１５に記載の方法。 ２６．前記の移植片が肝臓を含む、請求項１５に記載の方法。
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