CN105188741A - 新型纳米颗粒组合物 - Google Patents

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Abstract

除其他事项之外，本发明提供了包括多个纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物、一种或多种亲水性细胞成分制品和疏水性细胞成分制品。在某些实施方式中，所述亲水性细胞成分制品被包封在所述内腔中，所述疏水性细胞成分制品与所述外表面相关联。本发明还提供了制备和使用公开的纳米颗粒组合物的各种方法。

Description

新型纳米颗粒组合物
背景技术
如果免疫系统可以训练成以期望的方式应答抗原，例如，通过发展抗原耐受(例如，对于过敏性抗原或自身抗原)或通过学习抗原拒绝(例如，对于疾病相关抗原)，那么许多医疗益处可以被实现。身体可以对多种抗原产生反应，不管是外源性抗原(例如，过敏原、传染剂抗原等)还是内源性抗原(例如，自身抗原、某些疾病相关抗原等)。为了应对这一挑战，多种方法已经被应用，包括全身药物治疗、注射抗原、抗体治疗等。但是这些方法仍然需要改进。
发明简述
本发明提供了用于调节(包括诱导、促进或抑制)抗原免疫应答的新型系统。特别地，在某些实施方式中，本发明提供了将某些纳米颗粒系统的特征与微生物成分和/或抗原物质的特征相结合的技术，纳米颗粒系统和微生物成分/抗原物质中的任一个或两者都可以以相对粗的形式(例如，相对粗提取物)使用。另外地或附加地，一种或多种微生物成分和/或抗原物质性质上可以是重组的。
除其他事项之外，本发明提供了这样的观点，即微生物系统的亲水性和疏水性成分对免疫应答有不同的作用和/或有不同影响。在本发明的某些实施方式中，这些成分被彼此分离，并与调节免疫应答组合物中的纳米颗粒实体一起使用。
本发明还提供了这样的观点，即，相对粗的微生物细胞制品，任选地包含主要疏水性或主要亲水性细胞成分，可用于与纳米颗粒实体组合，从而调节免疫应答。具体地，本发明包括这样的观点，即，将这种相对粗的微生物细胞制品与某些纳米颗粒技术结合将开发出有惊人效用的免疫调节纳米颗粒组合物。在某些实施方式中，这些组合物得益于进化发展的微生物细胞材料的特性。本发明包括这种认识，即，这种进化可能使各个成分的组合得以形成，从而共同赋予微生物细胞某些期望的特性，而所述特性很难通过结合各个独立成分定义或重建。此外，本发明意识到，使用相对粗的制品可以简化并降低制造技术相关的费用，还潜在地为创造性组合物提供了意想不到的令人满意的特性。
在某些实施方式中，本发明包括重组微生物成分(例如，CpG)和/或重组抗原物质的用途。在某些实施方式中，使用重组核酸和/或蛋白质是理想的，因为其毒性或其他不良事件的风险较低。在某些实施方式中，使用重组核酸和/或蛋白质的益处可能在于重组生产可以使特定核酸和/或蛋白质的大量生产和使用更容易。
另外地或附加地，在某些实施方式中，本发明提供了纳米颗粒组合物，所述组合物包含聚合物纳米颗粒和相对粗的抗原制品。
更进一步地，在某些实施方式中，本发明提供了制备成适用于粘膜递送的纳米颗粒组合物。
在某些实施方式中，提供的组合物表现出其他有益特性，例如，纳米颗粒中被包封物质的可调节和/可调释放，纳米颗粒内任选地包封抗原，使得抗原躲过相关免疫系统成分，除非并直到它们被释放出来，等等。此外，本发明提供了不同元件的简便组合，从而有利于，例如，纳米颗粒的靶向定位和/或对多种抗原应答的同时调节(例如，对过敏原的过敏性应答的调节、对疾病相关和/或传染性抗原的治疗性应答的调节、和/或对自身过敏原的不适当应答的调节)。
除其他事项外，本发明提供了纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物的给药方法，以及形成所述纳米颗粒组合物的方法。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物包括多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括生物可降解或生物相容性聚合物，所述聚合物排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构，和包封在所述内腔中的亲水性细胞成分制品。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物包括多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括生物可降解或生物相容性聚合物，所述聚合物排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构，和与所述外表面相关联的疏水性细胞成分制品。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物包括多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括生物可降解或生物相容性聚合物，所述聚合物排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构，包封在所述内腔中的亲水性细胞成分制品，和与所述外表面相关联的疏水性细胞成分制品。在某些实施方式中，所述生物可降解或生物相容性聚合物是聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
在某些实施方式中，所述亲水性细胞成分制品是细胞制品的亲水性提取物或包括细胞制品的亲水性提取物。在某些实施方式中，所述亲水性提取物包括所述细胞制品的水性提取物或由所述细胞制品的水性提取物组成。在某些实施方式中，所述疏水性细胞成分制品包括细胞制品的疏水性提取物或由细胞制品的疏水性提取物组成。
在某些实施方式中，所述组合物包括一种或多种抗原。在某些实施方式中，所述抗原是应变性抗原或包括应变性抗原。在某些实施方式中，所述抗原是过敏性抗原或包括过敏性抗原。在某些实施方式中，其中所述抗原是传染性抗原或包括传染性抗原。某些实施方式中，所述传染性抗原具有传染剂的一种或多种附加成分。在某些实施方式中，所述抗原是自身抗原或包括自身抗原。在某些实施方式中，所述抗原是疾病相关抗原或包括疾病相关抗原。在某些实施方式中，所述抗原被部分地或全部包封在所述内腔中。在某些实施方式中，所述抗原部分地或全部与所述外表面相关联。在某些实施方式中，所述抗原与所述纳米颗粒混合，使其均在整个所述组合物中分散。
在某些实施方式中，所述抗原或传染剂选自下组：食物抗原、微生物抗原、病毒抗原、肿瘤抗原和环境抗原。在某些实施方式中，所述组合物包括第一抗原和第二抗原，所述第一抗原被部分地或全部包封在纳米颗粒内腔中，并且所述第二抗原部分地或全部与纳米颗粒的所述外表面相关联。
在某些实施方式中，所述亲水性细胞成分和疏水性细胞成分中的至少一种由微生物细胞制品提供。在某些实施方式中，所述亲水性细胞成分和疏水性细胞成分中的至少一种由肿瘤细胞的细胞制品提供。
附图说明
以下附图描述一起补充说明书附图，仅用于说明目的，不作为限制。
图1：描述了根据某些实施方式的示例流程图，其展示了表面连接疏水性细胞成分的纳米颗粒的生产过程。将细胞裂解，然后分离疏水性和亲水性细胞成分。疏水性细胞成分与聚合物和有机溶剂相结合。疏水性细胞成分+聚合物+有机溶剂混合物加入到水(或水溶液)中，然后蒸发溶剂。纳米颗粒通过离心进行分离。得到的纳米颗粒包括与该纳米颗粒表面相连接的疏水性细胞成分。
图2：描述了根据某些实施方式的示例流程图，其展示了内腔中包封亲水性细胞成分制品的纳米颗粒的生产过程。将细胞裂解，然后分离疏水性和亲水性细胞成分。将亲水性细胞成分加入到水溶液中。将聚合物和有机溶剂单独地结合在一起。将水溶液中的亲水性细胞成分加入聚合物和有机溶剂溶液(W/O乳液)中。将该W/O乳液加入水(或水溶液)(W/O/W乳液)中，然后蒸发溶剂。将得到的纳米颗粒通过离心进行分离，并包括包封的亲水性细胞裂解物。
图3：描述了根据某些实施方式的示例性流程图，其展示了内腔中包封亲水性细胞成分制品和表面连接疏水性细胞成分的纳米颗粒的生产过程。将细胞裂解，然后分离疏水性和亲水性细胞成分。将亲水性细胞成分加入到水溶液中。疏水细胞成分与聚合物和有机溶剂相结合。将水溶液中的亲水性细胞成分加入疏水性细胞成分+聚合物+有机溶剂(W/O乳液)中。将该W/O乳液加入到水(或水溶液)(W/O/W乳液)中，然后蒸发溶剂。将得到的纳米颗粒通过离心进行分离，并且其包括包封的亲水性细胞裂解物和关联到纳米颗粒表面的疏水性细胞裂解物。
图4：描述了根据某些实施方式的示例性流程图，其展示了具有一种或多种抗原提取物并且包封亲水性细胞成分和表面关联疏水性细胞成分的纳米颗粒的生产过程。将细胞裂解，然后分离疏水性和亲水性细胞成分。将亲水性细胞成分加入到水溶液中并与可溶性抗原提取物结合。疏水性细胞成分与PVA水溶液相结合。将聚合物和有机溶剂单独地结合在一起。将水溶液中的亲水性细胞成分加入到聚合物+有机溶剂(W/O乳液；第一乳液)中。W/O乳液与PVA水溶液(第二乳液)中的疏水性细胞成分相结合，然后蒸发溶剂。将得到的纳米颗粒通过离心进行分离，并且其包括包封的抗原提取物、包封的亲水性细胞成分、以及附着在纳米颗粒表面的疏水性细胞成分。
图5：描述了表示在第11周脱敏治疗(治疗前)前一天和在第14、18、22、26和30周每次食物过敏原激发试验(OFC)前一天的花生特异性IgE血清浓度的平均值±均值标准误差(SEM)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图6：描述了表示在第11周致敏作用(治疗前)前一天和在第14、18、22、26和30周OFC前一天的花生特异性IgG2a血清浓度的平均值±SEM的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图7：描述了表示第14周和第18周OFC之后的各个过敏性症状评分及其中值(*＝P<0.05；NC＝未激发)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图8：描述了表示第22周和第26周OFC之后的各个过敏性症状评分及其中值(*＝P<0.05；NC＝未激发)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图9：描述了表示第30周OFC之后的各个过敏性症状评分及其中值(*＝P<0.05；NC＝未激发)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图10：描述了表示第14周和第18周OFC之后的各个和平均体温(*＝P<0.05)。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图11：描述了表示第22周和第26周OFC之后的各个和平均体温(*＝P<0.05)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图12：描述了表示第30周OFC之后的各个和平均体温(*＝P<0.05)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图13：描述了表示第14周和第18周OFC之后的各个和平均血浆组胺水平(*＝P<0.001)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图14：描述了表示第22周和第26周OFC之后的各个和平均血浆组胺水平(*＝P<0.05；**P<0.01)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图15：描述了表示第30周OFC之后的各个和平均血浆组胺水平(*＝P<0.05)的示例结果。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。
图16：描述了表示在OFC之后(第30周)使用花生粗提物培养的脾细胞中细胞因子水平的平均值±SEM(***＝P<0.001，溶媒vs.试剂)。“试剂”表示经包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物处理的小鼠；“溶媒”表示经对照品处理的小鼠；“空白”表示未经任何处理的小鼠。图A显示了表示白细胞介素-4(IL-4)水平的平均值±SEM的示例结果。图B显示了表示白细胞介素-10(IL-10)水平的平均值±SEM的示例结果。图C显示了表示干扰素(IFN)-γ水平的平均值±SEM的示例结果。图D显示了表示白细胞介素-5(IL-5)水平的平均值±SEM的示例结果。图E显示了表示白介素-13(IL-13)水平的平均值±SEM的示例结果。图F显示了表示转化生长因子(TGF)-β水平的平均值±SEM的示例结果。
图17：显示了根据某些实施方式的关于包被了大肠杆菌有机提取物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物-(PLGA-)并且包封了粉尘螨(D.farinae)和/或屋尘螨(D.pteronyssinus)提取物和大肠杆菌水性提取物的纳米颗粒的制备、给药和水解的示例性示意图。
图18：显示了一个示例流程图，用以测试在模拟胃液(SGF)中的模拟胃消化和/或在模拟肠道液(SIF)中的模拟肠道消化对所述纳米颗粒的影响。
图19：显示了包被了有机大肠杆菌提取物(OEE)、包封了大肠杆菌DNA和OVA(也称为“OEE/DNA+OVA”)的纳米颗粒在SGF中消化长达4个小时后的示例性蛋白质免疫印迹图。
图20：显示了所述OEE/DNA+OVA纳米颗粒在SIF中消化长达12小时后的示例性蛋白质免疫印迹图。
图21：显示了所述OEE/DNA+OVA纳米颗粒在SGF中消化4小时后再在SIF中消化长达12小时后的示例性蛋白质免疫印迹图。
图22：显示了示例性图：A)与一种或多种抗原或所述纳米颗粒或纳米颗粒组合物孵育后，抗原特异性CD8+T细胞的增殖；B)与一种或多种抗原或所述纳米颗粒或纳米颗粒组合物孵育后，CD8+T细胞产生的抗原特异性IL-2；和C)与一种或多种抗原或所述纳米颗粒或纳米颗粒组合物孵育后，CD8+T细胞产生的抗原特异性IFNγ。
图23：显示了示例性图：A)与一种或多种抗原或所述纳米颗粒或纳米颗粒组合物孵育后，抗原特异性CD4+T细胞的增殖；B)与一种或多种抗原或所述纳米颗粒或纳米颗粒组合物孵育后，CD4+T细胞产生的抗原特异性IFNγ。
图24：显示了如下的示例性图：A)与卵白蛋白(OVA)、含有大肠杆菌DNA和OVA的纳米颗粒、包被了大肠杆菌培养液的有机提取物(OEE)并且含有大肠杆菌DNA和OVA的纳米颗粒、或含有OVA的死亡大肠杆菌孵育后，树突状细胞产生的IL-10、IL-12、IL-6以及TNFα细胞因子；和B)与卵清蛋白(OVA)、含有大肠杆菌DNA和OVA的纳米颗粒、包被了OEE并且含有大肠杆菌DNA和OVA的纳米颗粒、或含有OVA的死亡大肠杆菌孵育后，CD4+T细胞产生的IL-10、IL-13、IL-5以及INFγ细胞因子。
图25：显示了小鼠树突状细胞(DC)分别摄取可溶性OVA(图A、B和C)或者含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒(图D、E和F)后1、4或8小时的共聚焦显微镜图像。所述纳米颗粒中给予的抗原早在使用1小时后即可在DC内观察到(可溶性OVA组没有观察到)，并且与单独使用可溶性OVA相比，给予所述纳米颗粒8小时后的DC中发现显著性更高水平的抗原。
图26：显示了DC分别摄取可溶性OVA(图A、B和C)或者含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒(图D、E和F)后24小时、72小时或1周的共聚焦显微镜图像。24小时后，两组均具有相似的抗原水平(图A和D)；72小时后，可溶性抗原被清除(图B和E)；1周后，只有所述纳米颗粒中包封的抗原仍然可观察到(图C和F)。
图27：显示了给予以下一种物质后小鼠的颈部、腹股沟和肠系膜淋巴结抗原呈递的示例性图：可溶性OVA、含有OVA的纳米颗粒，或含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒。
图28：显示了暴露在以下一种中的小鼠脾脏中抗原相对量的示例性图：可溶性OVA、含有OVA的纳米颗粒、或含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒，通过标记的OVA的相对荧光量(按器官质量归一化)测定。将OVA包封入所述纳米颗粒中导致脾脏内抗原的显著性累积，由两个值表示：A)相对荧光值，和B)占总荧光值的百分比。*P<0.05，***P<0.01
图29：显示了CD4+T细胞在如下部位的示例性增殖图：经PBS或含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒处理的小鼠的A)脾脏，B)腹股沟淋巴结，C)肠系膜淋巴结，或D)颈部淋巴结。在所有测试的部位，经所述纳米颗粒处理的小鼠显示出显著性更高水平的抗原特异性CD4+T细胞增殖。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
定义
本申请中，除非上下文另有明确指示，否则(i)术语“一个”可以被理解为是指“至少一个”；(ii)术语“或”可被理解为是指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可以被理解为包括所列出的逐项成分或步骤，无论是其独自存在还是与一种或多种附加成分或步骤一起存在；和(iv)术语“约”和“大约”可以被理解为本领域技术人员允许的标准偏差；和(v)当提供的是范围时，包括该范围的端点。
给药：本文使用的术语“给药”是指将组合物给予对象。给药可以通过任何合适的途径进行。例如，在某些实施方式中，给药途径可以是支气管(包括支气管滴注)、颊、肠内、皮肤内、动脉内、经皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、脑室、粘膜、经鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括气管内滴注)、经皮、阴道和玻璃体给药。
变应原：本文使用的术语“变应原”是指能引起过敏反应的抗原。在某些实施方式中，变应原是多肽或包括多肽。在某些实施方式中，变应原是小分子或包括小分子。在某些实施方式中，变应原选自下组：食物变应原、药物变应原、环境变应原、昆虫毒液、动物变应原和乳胶。
变应性反应：本文使用的术语“变应性反应”具有其本领域理解的含义，是指针对抗原的IgE介导的免疫应答。当抗原诱导产生IgE抗体时，IgE抗体将与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE受体结合。随后暴露于抗原触发与这样的表面结合的抗变应原IgEs交联，这将触发细胞中储存的组胺释放。这种组胺释放会触发变应性反应。通常情况下，变应性反应涉及一种或多种皮肤(例如，荨麻疹、血管性水肿和瘙痒)、呼吸(例如，气喘、咳嗽、喉头水肿、流涕和流泪/眼部瘙痒)、胃肠道(例如，呕吐、腹痛和腹泻)和/或心血管(例如，如果发生系统性反应)系统。对于本发明的目的，哮喘反应被认为是过敏反应的一种形式。在某些实施方式中，变应性反应很温和，温和反应的典型症状包括，例如，荨麻疹(尤其在颈部和面部)、瘙痒、鼻充血、皮疹、流泪、眼睛发红以及这些症状的组合。在某些实施方式中，变应性反应是严重的和/或危及生命的；在某些实施方式中，严重的变应性反应(如过敏性反应)的症状选自下组：腹痛、腹式呼吸音(通常高音调)、焦虑、胸部不适或胸闷、咳嗽、腹泻、呼吸困难、吞咽困难、眩晕或头晕、面色潮红或脸红、恶心或呕吐、心悸、面部、眼睛或舌头红肿、神志不清、气喘以及这些症状的组合。在某些实施方式中，变应性反应是过敏性反应。
变应性(allergy)：本文使用的术语“变应性”是指以针对特定抗原的IgE介导的免疫应答为特征的病情。在某些实施方式中，抗原是指在许多或大多数个体中不引起IgE介导的免疫应答的抗原。在某些实施方式中，术语“变应性”被用于指当个体暴露于某一特定抗原时有比个体物种成员相当地暴露于相同抗原所通常观察到的更剧烈的IgE介导的免疫应答。因此，患有或易患“变应性”的个体是当暴露于一种或多种变应原时经历或具有经历变应性反应风险的个体。在某些实施方式中，变应性症状包括，例如，在个体血液或血清中IgE抗体以任选地高于特定阈值的水平存在，并且与个体过敏的变应原反应。在某些实施方式中，变应性症状包括，当将抗原制剂皮下注射到个体的皮肤内时，个体出现的风团/潮红比对照风团/潮红更大。在某些实施方式中，个体可以被认为是易过敏的而无需发生针对特定测试抗原的过敏反应。例如，针对相关变应原(例如，相同来源的变应原或共同的变应性反应很常见)，如果个体已经发生变应性反应，并且特别地，如果个体已经发生过敏反应，那么就可以认为该个体对相关变应原变应(和/或变应性反应或过敏反应)敏感。类似地，如果某个体的家庭成员对特定的变应原有反应，那么就可以认为该个体对相关变应原变应(和/或对变应性反应或过敏反应)敏感。
同种异体抗原：本文使用的术语“同种异体抗原”是指与同种识别和/或移植排斥相关的抗原(例如，免疫排斥反应所针对的抗原)。一般地，同种异体抗原是在特定种族个体(例如，供体个体)的组织中存在，但却不在其他个体(例如，受体个体，例如，遗传学上与供体不同的个体)组织中存在的制剂，因此组织从供体个体转移到受体个体有产生免疫排斥反应的风险和/或导致免疫排斥反应。一般地，抗原可以是或包括任何化学实体，例如，举例而言，小分子、核酸、多肽、碳水化合物或脂质等。在某些实施方式中，同种异体抗原是多肽或包括多肽。本领域已知多种多肽，它们的氨基酸序列在相同物种的各个个体之间不同，使得它们可能是同种异体抗原。
同种识别：本文使用的术语“同种识别”通常是指接受从相同物种的另外一个个体(即，供体，例如，在遗传学上与受体个体不同的个体)移植的组织的个体(即，受体)的免疫系统产生的免疫应答，该免疫应答涉及移植组织上同种异体抗原的识别。通常情况下，同种识别涉及同种异体抗原的T细胞识别。在许多实施方式中，T细胞识别同种异体抗原肽，例如，由多态性基因编码的肽，所述多态性基因的序列在供体和受体个体之间不同。
氨基酸：本文使用的术语“氨基酸”在广义上是指，例如，可通过形成一个或多个肽键而并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在某些实施方式中，氨基酸具有H2N-C(H)(R)-COOH的一般结构。在某些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，氨基酸是合成氨基酸；在某些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在某些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的20种标准L-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，不管它是合成制备的，还是从天然来源获得的。在某些实施方式中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，与上面提到的一般结构相比可以含有结构修饰。例如，在某些实施方式中，与一般结构相比，氨基酸可以发生甲基化、酰胺化、乙酰化和/或取代修饰。在某些实施方式中，与含有其它相同未修饰的氨基酸相比，这样的修饰可以，例如，改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在某些实施方式中，与含有其它相同未修饰的氨基酸相比，这样的修饰并不显著改变包含修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文中清楚可见，在某些实施方式中，术语“氨基酸”是指游离氨基酸；在某些实施方式中，是指多肽的氨基酸残基。
过敏性抗原：本文使用的短语“过敏性抗原”是指在正常条件下，处于天然状态时，使变应性个体具有产生过敏反应风险的抗原(例如，变应原)。例如，由于本发明的目的，花粉和动物皮屑或排泄物(如唾液和尿液)不被认为是过敏性抗原。另一方面，某些食物抗原、昆虫抗原、药物以及橡胶(如乳胶)抗原通常被认为是过敏性抗原。示例性的过敏性抗原包括那些能与之产生严重反应以致有死亡风险的抗原(如坚果、种子和鱼)。
过敏反应：本文使用的短语“过敏反应”(如“过敏症”)是指对变应原产生的严重的、全身变应性反应，其特征是多个靶器官(例如，呼吸道、皮肤消化道和心血管系统)的病理性应答。如上所述，严重变应性反应(例如，过敏反应)的症状通常发展迅速，往往发生在暴露于变应原的几分钟内，并且可以包括，例如，腹痛、腹式呼吸音(通常高音调)、焦虑、胸部不适或胸闷、咳嗽、腹泻、呼吸困难、吞咽困难、眩晕或头晕、面色潮红或脸红、恶心或呕吐、心悸、面部、眼睛或舌头红肿、神志不清、气喘及其组合。过敏反应的特定信号包括，例如，心脏节律异常(心律失常)、肺部有液体(肺水肿)、荨麻疹、低血压、精神错乱、脉率增快、因缺氧造成的皮肤变蓝或苍白(例如，休克引起的)、可能严重到足以阻止呼吸道的咽喉肿胀(血管性水肿)、眼睛和/或面部肿胀、四肢无力和气喘。最严重的过敏反应可导致意识丧失和/或死亡。
动物：本文使用的术语“动物”是指动物界的任何成员。在某些实施方式中，“动物”是指处于任何发展阶段的人类。在某些实施方式中，“动物”是指处于任何发展阶段的非人类动物。在某些实施方式中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在某些实施方式中，动物包括但不限于，哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和/或蠕虫。在某些实施方式中，动物可以是转基因动物，遗传工程改造动物和/或克隆动物。
抗原：本文使用的术语“抗原”是指(i)引起免疫反应的物质；和/或(ii)与T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)或抗体(例如，由B细胞产生)结合的物质。在某些实施方式中，抗原引起体液应答(例如，包括产生抗原特异性的抗体)；在某些实施方式中，引起细胞应答(例如，涉及受体特异性地与所述抗原相互作用的T细胞)。一般地，抗原可以是任何化学实体或包括任何化学实体，例如，小分子、核酸、多肽、碳水化合物和脂质等。在某些实施方式中，抗原是多肽或包括多肽。本领域技术人员可以理解，在一般情况下，抗原可以以分离或纯化的形式提供，或者以粗品形式来提供(例如，在提取物中与其它物质一起提供，例如，细胞提取物或其他含抗原源的相对粗制品)。在某些实施方式中，本发明使用的抗原以粗制品形式提供。在某些实施方式中，抗原是重组抗原。
抗原递呈细胞：本文使用的短语“抗原呈递细胞”或“APC”在本领域的含义是指处理抗原并将抗原呈递给T细胞的细胞。示例性的抗原细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和某些活化的上皮细胞。
约：本文使用的术语“约”和“大约”旨在包括本领域技术人员所能理解的正常的统计变异。在一些实施方式中，术语“约”或“大约”是指落入所述参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的数值范围，除非另有说明或另有明显的上下文(除非这些数字将超过可能值的100％)。
相关：如本文使用的，如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体有关，那么就认为它们彼此“相关”。例如，如果某一特定实体(例如，多肽)的存在、水平和/或形式与某一特定疾病、障碍或病症的发生率和/或易感性有关，那么就认为该特定实体与该疾病、障碍或病症相关。在某些实施方式中，如果两个或更多个实体彼此之间直接或间接地相互作用，以使它们彼此之间保持物理位置接近，则认为它们彼此之间“相关”。
自身抗原：本文使用的术语“自身抗原”是指由个体产生的、并由该个体的免疫系统识别的抗原。在某些实施方式中，个体免疫系统对自身抗原的识别与自身免疫疾病、障碍或病症相关。一般地，自身抗原可以是任何化学实体或包括任何化学实体，例如，小分子、核酸、多肽、碳水化合物和脂质等。在某些实施方式中，自身抗原是多肽或包括多肽。本领域技术人员熟知各种可以作为自身抗原的物质(包括多肽)，特别是那些能被与自身免疫疾病、障碍和/或病症相关的免疫反应识别的物质。
生物相容性的：本文使用的术语“生物相容性的”是指当与活体组织(例如，体内)接触时，不会对活体组织产生严重伤害的材料。在一些实施方式中，如果材料对细胞没有毒性，那么该材料就是生物相容性的。在一些实施方式中，如果将材料加入体外细胞造成少于或等于20％的细胞死亡，和/或它们的体内给药没有引起显著的炎症或其他不良反应，那么该材料就是生物相容性的。
生物可降解的：本文使用的术语“生物可降解的”是指当引入细胞时可以被分解(如通过细胞机制，例如酶降解、水解和/或两者的组合)成若干组分从而细胞可以再利用或处理、并且对细胞无显著性毒副作用的材料。在一些实施方式中，由生物可降解材料的分解所产生的组分是生物相容性的，因此，不会引起显著的炎症和/或其它体内不良反应。在某些实施方式中，生物可降解的聚合物材料分解成其组分单体。在某些实施方式中，生物可降解材料(包括，例如，生物可降解的聚合物材料)的分解涉及酯键水解。另外地或附加地，在某些实施方式中，生物可降解材料(包括，例如，生物可降解的聚合物材料)的分解涉及氨酯键的断裂。示例性的生物可降解的聚合物包括，例如，羟基酸聚合物，如乳酸和乙醇酸，包括但不限于聚羟基酸、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙二醇共聚物、聚酐、聚原酯、聚酯、聚氨酯、聚丁酸、聚戊酸、聚己内酯、聚羟基链烷酸酯、聚丙交酯-共-己内酯及其混合物和共聚物。许多天然存在的聚合物也是生物可降解的，包括，例如，蛋白质，如白蛋白、胶原、明胶和醇溶谷蛋白，例如，玉米蛋白和多糖(如藻酸盐)，纤维素衍生物和聚羟基烷酸酯，例如，聚羟基丁酸酯的混合物及其共聚物。本领域的技术人员能理解或能确定这种聚合物是生物相容性的和/或生物可降解的衍生物(例如，通过基本相同的结构，其不同之处仅在取代或添加如本领域中已知的特定化学基团的相关母体聚合物)。
生物活性：本文使用的短语“生物活性”是指物质在生物系统中(例如，在细胞中(例如，分离的、在培养中、在组织中、在生物体中)、在细胞培养中、在组织中、在生物体中，等等)具有活性。例如，一种物质，当施用于生物体时，在该生物体中具有生物效应，则被认为是具有生物活性的。本领域技术人员可以理解，为了存在所述活性，通常仅需要生物活性物质的一部分或片段；在这样的情况下，该部分或片段被认为是“生物活性”部分或片段。
细胞裂解物：本文使用的术语“细胞裂解物”或“细胞裂解物”是指含有一个或多个破裂细胞(即细胞的细胞膜已被破坏)内容物的液体。在某些实施方式中，细胞裂解物包括亲水性细胞成分和疏水性细胞成分。在某些实施方式中，细胞裂解物是选自下组的一种或多种细胞的裂解物：植物细胞、微生物(如微生物或真菌)细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞)、人类细胞及其组合。在某些实施方式中，细胞裂解物是一种或多种异常细胞(例如癌细胞)的裂解物。在某些实施方式中，细胞裂解物是细胞破坏后进行很少纯化或没有纯化的粗裂解物，其形成“初级”裂解物。在某些实施方式中，对初级裂解物实施一个或多个分离或纯化步骤。然而，术语“裂解物”是指包括多种细胞成分的制品，而不是任何单一成分的纯制品。
特征序列元件：本文使用的短语“特征序列元件”是指在聚合物(例如，多肽或核酸)中发现的、能表示该聚合物的特征部分的序列元件。在某些实施方式中，特征序列元件的存在与聚合物特定活性或性质的存在或水平相关。在某些实施方式中，存在(或不存在)特征序列元件确定了特定的聚合物是(或不是)该聚合物的特定家族或集团的成员。特征序列元件通常包括至少两个单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在某些实施方式中，特征序列元件包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、或更多个单体(例如，连续相连的单体)。在某些实施方式中，特征序列元件包括连续单体的至少第一和第二延展(stretch)，所述第一和第二延展由一个或多个间隔区分开，所述间隔区的长度在具有共同序列元件的聚合物中可能相同或不同。
组合疗法：本文使用的术语“组合疗法”是指对象同时暴露于两种或两种以上的治疗试剂的情况。在某些实施方式中，这些试剂同时给药；在某些实施方式中，这些试剂按顺序先后给药；在某些实施方式中，这些试剂按重叠方案给药。
对应于：本文使用的术语“对应于”通常被用来指定聚合物中残基的位置/标识，例如，多肽的氨基酸残基或核酸的核苷酸残基。本领域技术人员可以理解，为简便起见，这种聚合物的残基通常根据相关参考聚合物使用一个规范编号系统指定，使第一聚合物中“对应于”参考聚合物中第190位残基的残基，例如，不必实际上是第一聚合物中第190位残基，而是对应于参考聚合物中第190位残基；本领域技术人员容易理解如何确定“对应的”氨基酸，包括通过使用专为聚合物序列比对而设计的一种或多种商业上可获得的算法。
衍生物：本文使用的术语“衍生物”是指从具有相似结构的另一种物质由一个或多个步骤产生或形成的结构类似物质。在某些实施方式中，衍生物是指结构上与第一化学物质相关、并且理论上来源于第一化学物质的第二化学物质。纤维素衍生物实例包括但不限于，纤维素酯(例如，有机和无机酯)、纤维素醚(例如，烷基、羟烷基和羧烷基醚)、羧甲基纤维素钠和醋酸纤维素。纤维素有机酯实例包括但不限于，醋酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素和乙酸丁酸纤维素。纤维素无机酯的实例包括但不限于，硝酸纤维素和硫酸纤维素。纤维素烷基醚实例包括但不限于，甲基纤维素、乙基纤维素和乙基甲基纤维素。纤维素羟醚实例包括但不限于，羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和乙基羟乙基纤维素。纤维素羧烷基醚实例包括但不限于羧甲基纤维素。
剂型：本文使用的术语“剂型”是指用于对象给药的治疗试剂的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性剂。在某些实施方式中，当对相关人群给药时，根据已经确定与所期望的或有益的结果相关的给药方案(即，治疗给药方案)，这样的量是适合于给药的单位剂量(或其整个部分)。
给药方案：本文使用的术语“给药方案”是指一组单位剂量(通常超过一个)逐个向对象给药，一般间隔一定的时间段。在某些实施方式中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，这可能涉及一个或多个剂量。在某些实施方式中，给药方案包括多次剂量，每次剂量通过相同长度的时间段彼此间隔开来；在某些实施方式中，给药方案包括多次剂量，并且各次剂量由至少两个不同的时间段间隔开来。在某些实施方式中，当对相关人群给药时，给药方案与所期望的或有益的结果相关(即，是治疗给药方案)。
包封：本文使用的术语“包封”是指物质完全被另外一种材料所包围。
表达：本文使用的核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)(例如，通过转录)从DNA序列产生RNA模板；(2)(如通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3'末端形成)处理RNA转录物；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
功能性：本文使用的术语“功能性”是指表现出一个特定的属性和/或活性的实体的形式或片段。
移植排斥：本文使用的术语“移植排斥”是指从供体个体移植到受体个体的组织排斥。在某些实施方式中，移植排斥是指同种移植排斥，其中供体个体和受体个体是相同物种。通常地，当受体免疫系统对供体组织携带的同种异体抗原产生排斥应答时，则发生同种异体移植排斥。在某些实施方式中，移植排斥是指异种移植排斥，其中供体和受体是不同物种。通常地，当受体物种的免疫系统对供体物种组织携带的异种抗原产生排斥应答时，则发生异种移植排斥。
同源性：本文使用的术语“同源性”是指聚合物分子之间的总体相关性，例如，核酸分子(如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在某些实施方式中，如果聚合物分子的序列之间具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％相同，则可以认为它们彼此是“同源的”。在某些实施方式中，如果聚合物分子的序列之间具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的相似性(例如，在相应位置含有相关化学性质的残基)，则可以认为它们彼此是“同源的”。例如，本领域技术人员已经熟知，某些氨基酸通常根据“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链而归类为彼此相似。一个氨基酸被另一个相同类型的氨基酸替换通常可以被认为是“同源”替换。典型的氨基酸类别总结如下：
丙氨酸 Ala A 非极性 中性 1.8
精氨酸 Arg R 极性 正电荷 -4.5
天冬酰胺 Asn N 极性 中性 -3.5
天冬氨酸 Asp D 极性 负电荷 -3.5
半胱氨酸 Cys C 非极性 中性 2.5
谷氨酸 Glu E 极性 负电荷 -3.5
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性 -3.5
甘氨酸 Gly G 非极性 中性 -0.4
组氨酸 His H 极性 正电荷 -3.2
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性 4.5
亮氨酸 Leu L 非极性 中性 3.8
赖氨酸 Lys K 极性 正电荷 -3.9
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性 1.9
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性 2.8
脯氨酸 Pro P 非极性 中性 -1.6
丝氨酸 Ser S 极性 中性 -0.8
苏氨酸 Thr T 极性 中性 -0.7
色氨酸 Trp W 非极性 中性 -0.9
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性 -1.3
缬氨酸 Val V 非极性 中性 4.2
模糊氨基酸 3字母 1字母
天冬酰胺或天冬氨酸 Asx B
谷氨酰胺或谷氨酸 Glx Z
亮氨酸或异亮氨酸 Xle J
不确定或未知氨基酸 Xaa X
本领域的技术人员可以理解，已有多种算法可以进行序列比对，以确定它们的同源性程度，包括考虑到在不同的序列中残基彼此“对应”时允许一个序列相对于另一个存在指定长度的间隙。两个核酸序列之间同源性百分比的计算，例如，可以通过最佳比对方式进行两个序列的比对(例如，为了实现最佳比对，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两者都引入间隙，并且出于比对目的，可以忽略非对应序列)。在一些实施方式中，用于比较目的的比对序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少为40％、至少为50％、至少为60％、至少为70％、至少为80％、至少为90％、至少为95％、或基本上100％。然后再比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上相同；当第一序列中的一个位置是由第二序列中相应位置一个类似核苷酸占据时，则所述分子在该位置相似。两个序列之间的同源性百分比是所述序列共有的相同和相似位置的数目函数，考虑到间隙数量、每个间隙的长度，为了实现两个序列的最佳比对，需要引入间隙。可用于确定两个核苷酸序列之间的同源性百分比的代表性算法和计算机程序包括，例如，Meyers和Miller算法(CABIOS，1989，4：11-17)，该算法已通过使用PAM120权重残基表、12个间隙长度罚分和4个间隙罚分并入ALIGN程序(2.0版)。两个核苷酸序列之间的同源性百分比可以，可替换地，使用例如在NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包使用GAP程序确定。
人类：在某些实施方式中，人类是胚胎、胎儿、婴儿、儿童、少年、成年或老年人。
亲水性：本文使用的术语“亲水性”和/或“极性”是指能与水混合、或易溶于水的倾向。
疏水性：本文使用的术语“疏水性”和/或“非极性”，是指排斥水、不与水结合、或不易溶于水的倾向。
同一性：本文使用的术语“同一性”是指聚合物分子之间的总体相关性，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在某些实施方式中，如果聚合物分子的序列之间具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％相同，则可以认为它们彼此是“基本上相同”。本领域技术人员可以理解，已有多种算法可以进行序列比对，以确定它们的同源性程度，包括考虑到在不同的序列中残基彼此“对应”时允许一个序列相对于另一个存在指定长度的间隙。两个核酸序列之间同一性百分比的计算，例如，可以通过最佳比对方式进行两个序列的比对(例如，为了实现最佳比对，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两者都引入间隙，并且出于比对目的，可以忽略非对应序列)。在一些实施方式中，用于比较目的的比对序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少为40％、至少为50％、至少为60％、至少为70％、至少为80％、至少为90％、至少为95％、或基本上100％。然后再比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上相同；当第一序列中的一个位置是由第二序列中相应位置一个类似核苷酸占据时，则所述分子在该位置相似。两个序列之间的同源性百分比是所述序列共有的相同和相似位置的数目函数，考虑到间隙数量、每个间隙的长度，为了实现两个序列的最佳比对，需要引入间隙。可用于确定两个核苷酸序列之间的同源性百分比的代表性算法和计算机程序包括，例如，Meyers和Miller算法(CABIOS，1989，4：11-17)，该算法已通过使用PAM120权重残基表、12个间隙长度罚分和4个间隙罚分并入ALIGN程序(2.0版)。两个核苷酸序列之间的同源性百分比可以，可替换地，使用例如在NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包使用GAP程序确定。
感染：本文使用的术语“感染”是指致病生物体侵入宿主生物体内并在宿主体内倍增。感染的症状可能是由于致病生物体产生的毒素作用和/或宿主组织对生物体和/或其产生的毒素的反应。
分离的：本文使用的术语“分离的”是指物质和/或实体已被(1)从至少一些最初产生时与它相关联的成分分开(不论在自然中和/或在实验设置中)，和/或(2)人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以从约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或超过约99％的与它们最初关联的其它成分中分离。在某些实施方式中，分离的试剂约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或超过约99％纯。如本文所使用的，如果物质基本上不含其它成分，则称该物质是“纯”的。在某些实施方式中，本领域的技术人员可以理解，一种物质已结合某些其它成分，例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)，仍然可能被认为是“分离的”甚至是“纯”的；在这样的实施方式中，分离百分比或该物质的纯度计算不包括这样的载体或赋形剂。
纳米乳剂：在本领域中，乳剂传统定义为“...由不混溶液体中分散于乳化剂或不分散于乳化剂的液体组成、通常以比胶体尺寸更大的液滴形式存在的系统”MedlinePlusOnlineMedicalDictionary，MerriamWebster(2005)。本文使用的术语“纳米乳剂”是指至少一些液滴(或颗粒)的直径在纳米尺寸范围内的乳剂。正如本领域普通技术人员应当理解的，纳米乳剂的特征在于其液滴或颗粒比微乳剂的液滴或颗粒小一千倍。
纳米颗粒：本文使用的术语“纳米颗粒”是指直径小于1000纳米(nm)的颗粒。在某些实施方式中，根据美国国家科学基金会的定义，纳米颗粒的直径小于300nm。在某些实施方式中，根据美国国立卫生研究院所的定义，纳米颗粒的直径小于100nm。在某些实施方式中，纳米颗粒是包括封闭隔室的胶束，通过胶束膜从本体溶液中分离出来，胶束通常包括环绕和包围成的空间或隔室(如限定为内腔)的两性实体。在某些实施方式中，胶束膜包括至少一种聚合物，例如，生物相容性的和/或生物可降解的聚合物。
纳米颗粒组合物：本文使用的术语“纳米颗粒组合物”是指含有至少一种纳米颗粒和至少一种其他试剂或成分的组合物。在某些实施方式中，纳米颗粒组合物包含本文所述的纳米颗粒基本均一的集合。
纳米颗粒膜：本文使用的术语“纳米颗粒膜”是指纳米颗粒外表面和周围环境之间的边界或界面。在某些实施方式中，所述纳米颗粒膜是具有外表面和边界内腔的聚合物膜。
核酸：本文使用的术语“核酸”在广义上是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在某些实施方式中，核酸是通过磷酸二酯键并入或可以并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如从上下文中清楚可见，在某些实施方式中，“核酸”是指单个核酸残基(如核苷酸和/或核苷)；在某些实施方式中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在某些实施方式中，“核酸”是RNA或包含RNA；在某些实施方式中，“核酸”是DNA或包含DNA。在某些实施方式中，核酸是一种或多种天然核酸残基、包含一种或多种天然核酸残基、或由一种或多种天然核酸残基组成。在某些实施方式中，核酸是一种或多种核酸类似物、包含一种或多种核酸类似物、或由一种或多种核酸类似物组成。在某些实施方式中，核酸类似物与核酸的不同点在于核酸类似物不使用磷酸二酯骨架。例如，在某些实施方式中，核酸是一种或多种的“肽核酸”、包含一种或多种的“肽核酸”、或由一种或多种的“肽核酸”组成，这是本领域已知的，并且其骨架具有肽键，而不是磷酸二酯键，也被认为在本发明的范围内。另外地或附加地，在某些实施方式中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在某些实施方式中，核酸是一种或多种天然核苷、包含一种或多种天然核苷、或由一种或多种天然核苷组成(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)。在某些实施方式中，核酸是一种或多种核苷类似物、包含一种或多种核苷类似物、或由一种或多种核苷类似物组成(例如，2-氨基腺嘌呤核苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺嘌呤核苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺嘌呤核苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱、插入碱及其组合)。在某些实施方式中，与那些存在于天然核酸的糖相比，核酸包含一种或多种修饰糖(如2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在某些实施方式中，核酸具有编码功能性基因产物(例如，RNA或蛋白)的核苷酸序列。在某些实施方式中，核酸包括一个或多个内含子。在某些实施方式中，由天然来源的一种或多种分离物、通过基于互补模板的聚合作用进行的酶合成(体内或体外)、重组细胞或系统中的繁殖、以及化学合成来制备核酸。在某些实施方式中，核酸至少为3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基长度。
患者：本文使用的术语“患者”或“对象”是指被给予治疗的人或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。在许多实施方式中，患者是人类。在某些实施方式中，患者是由医疗提供者进行疾病、障碍或病症诊断或治疗的人类。在某些实施方式中，患者表现疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特征。在某些实施方式中，患者不表现疾病、障碍或病症的任何症状或特征。在某些实施方式中，患者是对疾病、障碍或病症具有一种或多种易感或风险特征的人。
药学上可接受的：本文使用的术语“药学上可接受的”是指试剂在合理的医学判断范围内适合用于与人类和/或动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相当。
多肽：本文使用的术语“多肽”通常具有本领域公认含义，即，至少三个氨基酸的聚合物。在某些实施方式中，该术语被用来指特定功能种类的多肽，例如，自身抗原多肽、尼古丁乙酰胆碱受体多肽、同种抗原多肽等。对于每一个这样的种类，本说明书中提供了该种类中已知示例多肽的氨基酸序列的若干示例；在某些实施方式中，这些已知的多肽是该种类中的参考多肽。在这些实施方式中，术语“多肽”指的是该种类中与相应的参考多肽具有显著的序列同源性或同一性的任何成员。在许多实施方式中，这样的成员也与参考多肽具有共同的显著活性。例如，在某些实施方式中，一个多肽成员与参考多肽的整体序列同源性或同一性至少有约30-40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或包括至少一个显示出非常高的序列同一性的区域(即保守区，通常包括特征序列元件)，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％、或99％。这种保守区通常包括至少3-4个、并且通常高达20个或更多氨基酸；在某些实施方式中，保守区包括至少一个由至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个连续氨基酸组成的延伸。
蛋白质：本文使用的术语“蛋白质”是指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸组成的链)。蛋白质可包括不是氨基酸的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以以其它方式处理或修饰。本领域技术人员可以理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整的多肽链(有信号序列或无信号序列)，或者也可以是其特征部分。本领域技术人员可以理解，蛋白质有时可包括一个以上的多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式相关联。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸，或两者皆有，并且可以包含任何氨基酸修饰或本领域中已知的类似物。有用的修饰包括，例如，末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在某些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于约20个氨基酸、或小于约10个氨基酸的多肽。在某些实施方式中，蛋白质是抗体、抗体片段、它们的生物活性部分、和/或特征部分。
不应的：本文使用的术语“不应的”是指提供组合物给药后，对象不产生预期的、通常可被临床医务人员观察到的临床功效反应。
小分子：本文使用的术语“小分子”是指可作为酶底物或生物过程调节物的低分子量的有机化合物。在一般情况下，“小分子”是大小小于约5千道尔顿(KD)的分子。在某些实施方式中，所述纳米颗粒进一步包括一种或多种小分子。在某些实施方式中，小分子小于约4kD、3kD、约2kD、或约1kD。在某些实施方式中，小分子小于约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D、或约100D。在某些实施方式中，小分子小于约2000克/摩尔、小于约1500克/摩尔、小于约1000克/摩尔、小于约800克/摩尔、或小于约500克/摩尔。在某些实施方式中，一种或多种小分子包封入纳米颗粒内。在某些实施方式中，小分子是非聚合的。在某些实施方式中，根据本发明，小分子不是蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多糖、糖蛋白、蛋白聚糖等。在某些实施方式中，小分子是治疗性的。在某些实施方式中，小分子是佐剂。在某些实施方式中，小分子是药物。
稳定的：术语“稳定的”，当应用于本发明组合物时，是指在一段时间内组合物保持其一个或多个方面物理结构(如尺寸范围和/或颗粒分布)。在某些实施方式中，稳定的纳米颗粒组合物是平均粒径、最大粒径、颗粒尺寸范围和/或颗粒尺寸分布(即，超过指定尺寸和/或超出指定尺寸范围的颗粒百分比)在特定的条件下在一段时间内保持稳定的纳米颗粒组合物。在某些实施方式中，稳定组合物是生物学相关活性在一段时间内保持稳定的组合物。在某些实施方式中，所述一段时间是至少约一小时；在某些实施方式中，所述一段时间为约5小时、约10小时、约一(1)天、约一(1)周、约两(2)周、约一(1)个月、约两(2)个月、约三(3)个月、约四(4)个月、约五(5)个月、约六(6)个月、约八(8)个月、约十(10)个月、约十二(12)个月、约二十四(24)个月、约三十六(36)个月或更长时间。在某些实施方式中，所述一段时间在约一(1)天至约二十四(24)个月、约两(2)周至约十二(12)个月、约二(2)个月至约五(5)个月等的范围内。例如，如果纳米颗粒群体经过长期贮存、温度变化、和/或pH变化，并且组合物中的大部分纳米颗粒直径保持在规定范围内，则纳米颗粒组合物是稳定的。在某些实施方式中，稳定的组合物在环境条件下是稳定的。在某些实施方式中，稳定的组合物在生物条件(即37℃磷酸盐缓冲盐水)下是稳定的。
对象：本文使用的术语“对象”是指人或任何非人类动物(如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。人类包括产前和产后的形式。在许多实施方式中，对象是人类。对象可以是患者，这是指一个医疗提供者进行疾病诊断或治疗的人。对象可以患有或易患疾病或病症，也可以表现或不表现该疾病或病症的症状。
基本上：本文使用的术语“基本上”指的是表现出全部或接近全部范围或程度的感兴趣的特征或性质。生物学领域技术人员可以理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或继续完整性或实现或避免绝对的结果。因此这里所用的术语“基本上”用于捕捉许多生物和化学现象中对完整本质的潜在缺乏。
患有：个体“患有”疾病、障碍或病症是指已被诊断为和/或表现或已经表现出疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特征。
易患：“易患”疾病、障碍或病症的个体具有发展疾病、障碍或病症的风险。在某些实施方式中，易患疾病、障碍或病症的个体不表现出疾病、障碍或病症的任何症状。在某些实施方式中，易患疾病、障碍或病症的个体还没有被诊断出患有所述疾病、障碍和/或病症。在某些实施方式中，易患疾病、障碍或病症的个体是已暴露于与所述疾病、障碍或病症的发展相关的条件下的个体。在某些实施方式中，发展疾病、障碍和/或病症的风险是基于人群的风险(例如，个体的家庭成员患有过敏症等)。
症状减轻：根据本发明，“症状减轻”是指特定疾病、障碍或病症的一种或多种症状的严重程度(例如，强度、严重程度等)和/或频率减少。为了清楚起见，特定症状的发作延迟被认为是症状频率减少的一种形式。
治疗剂：本文使用的短语“治疗剂”是指当向对象给药时具有治疗效果和/或引起期望的生物学和/或药理学效应的任何试剂。在某些实施方式中，如果将某一试剂施用到相关人群，试剂与所述人群期望的或有益的治疗结果在统计学上相关，则该试剂被认为是治疗剂，不论被给药的特定对象是否经历了期望的或有益的治疗效果。
治疗有效量：本文使用的术语“治疗有效量”是指当按照治疗剂量方案向患有或易患疾病、障碍和/或病症的人群给药时，足以治疗所述疾病、障碍和/或病症(如变应性)的量。在某些实施方式中，治疗有效量是指使疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状的发生率和/或严重程度降低、和/或发作延迟的量。本领域技术人员可以理解，术语“治疗有效量”实际上并不需要使一个特定的个体获得成功治疗。相反，治疗有效量可以是在向需要这种治疗的患者给药时，在显著数量的对象中提供特定的期望的药理学应答的量。需要特别理解的是，特定对象可能实际上是对“治疗有效量”“不应的”。举个例子，不应的对象可能生物利用度低，从而无法获得临床疗效。在某些实施方式中，提到治疗有效量，可以是在一种或多种特定组织(例如，受到疾病、障碍或病症影响的组织)或液体(如血液、唾液、血清、汗液、眼泪、尿液等)中测得的量。本领域技术人员可以理解，在某些实施方式中，治疗有效试剂可被配制成单一剂量和/或以单一剂量给药。在某些实施方式中，治疗有效试剂可被配制成多剂量和/或以多剂量给药，例如，作为给药方案的一部分。
治疗方案：本文使用的术语“治疗方案”是指其在相关人群中的施用与期望的或有益的治疗结果相关联的给药方案。
治疗：本文使用的术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指给予物质能部分或完全缓解、改善、再生、抑制、延迟特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征和/或起因的发作，减轻严重程度和/或降低频率、发病率或严重程度。这种治疗可以是对象不表现出相关疾病、障碍和/或病症的迹象，和/或对象仅表现出所述疾病、障碍和/或病症的早期迹象。另外或者附加地，这样的治疗可以是对象表现出相关疾病、障碍和/或病症的一个或更多个已确定的迹象。在某些实施方式中，治疗可以是对象已被诊断为患有相关疾病、障碍和/或病症。在某些实施方式中，治疗可以是已知对象有一个或多个与相关疾病、障碍和/或病症的发展风险增加相关的易感性因素。
均匀：本文在提及纳米颗粒组合物时使用的术语“均匀”是指纳米颗粒组合物中的各个纳米颗粒的直径在指定范围内。例如，在某些实施方式中，均匀的纳米颗粒组合物的最小直径和最大直径之间的差异不超过约300nm。在某些实施方式中，均匀的纳米颗粒组合物包含直径在约100nm至约300nm范围内的纳米颗粒。在某些实施方式中，均匀的纳米颗粒组合物包含平均粒度小于约500nm的纳米颗粒。在某些实施方式中，均匀的纳米颗粒组合物包含平均粒度在约100nm至约500nm范围内的纳米颗粒。在某些实施方式中，均匀的纳米颗粒组合物是组合物中大多数颗粒的直径低于指定尺寸或在指定范围内。在某些实施方式中，大多数是指超过组合物中颗粒的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多。
具体实施方式
本发明部分基于令人惊讶的见解，即可以通过将一些纳米颗粒的特征和微生物细胞的细胞成分结合在一起来制备所需的免疫调节组合物。本发明提供了特定的见解，即，可以用包含亲水性或疏水性微生物细胞成分或两者皆有的制品来制备这种免疫调节组合物。在一些具体的实施方式中，本发明提供了这样的见解，即可以通过将亲水性微生物细胞成分包封在纳米颗粒内和/或将疏水性微生物细胞成分与所述纳米颗粒外表面相关联来制备所需的免疫调节组合物。
纳米颗粒
本发明使用的纳米颗粒包括这样的纳米颗粒，即，包括装配至胶束的至少一种聚合物，所述胶束形成了内腔并具有外表面。在某些实施方式中，纳米颗粒包括至少一种聚合物，所述聚合物是均聚物、二嵌段聚合物、三嵌段聚合物、多嵌段共聚物、线性聚合物、树枝状聚合物、支链聚合物、无规嵌段聚合物等，或其组合。在某些实施方式中，纳米颗粒包括聚合物的共混物和/或混合物。
在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种生物相容的聚合物和/或一种或多种生物可降解的聚合物。在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种合成聚合物，或它们的衍生物。在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种天然聚合物，或它们的衍生物。在某些实施方式中，纳米颗粒包括合成聚合物和天然聚合物的组合，或它们的衍生物。
在某些实施方式中，纳米颗粒包括选自下组的一种或多种聚合物：聚羟基酸，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸酸-共-乙醇酸、聚乳酸-共-乙醇酸和聚乳酸-共-乙醇酸衍生物、聚乙二醇化聚乳酸-共-乙醇酸、聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酸酐、聚乙二醇化聚酸酐、聚原酸酯、聚原酸酯衍生物、聚乙二醇化聚原酸酯、聚己内酯、聚己内酯衍生物、聚乙二醇化聚己内酯、聚胺(例如，精胺、亚精胺、聚赖氨酸及其衍生物)、聚乙二醇化聚赖氨酸、聚酰胺、聚碳酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚酰胺、聚磷腈、聚氨基酸、聚醚、聚缩醛、聚交酯、聚羟基烷酸酯、聚乙交酯、聚缩酮、聚酯酰胺、聚对二氧杂环己酮、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚碳酸酯、聚原碳酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯、聚苹果酸、聚甲基乙烯基醚、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚马来酸酐、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、聚乙二醇化聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚丙烯酸衍生物、聚乙二醇化聚丙烯酸、聚氨基甲酸乙酯、聚乙二醇化聚氨基甲酸乙酯、聚氨基甲酸乙酯衍生物、聚丙交酯、聚乙交酯、聚羟基酸类、聚酯、聚芳基化物、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、聚环氧烷如聚环氧乙烷、聚亚烷基聚对苯二酸如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物如聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚氨酯及其共聚物、纤维素衍生物如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐(在本文中统称为“合成纤维素”)、丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸或其共聚物或包括酯的衍生物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚对甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯和聚丙烯酸十八酯(在本文中统称为“聚丙烯酸”)、聚丁酸、聚戊酸和聚丙交酯共己内酯和/或它们的衍生物。
在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种丙烯酸聚合物。在一些实施方式中，丙烯酸聚合物包括，例如，丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯和/或它们的组合。
在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种天然聚合物。示例的天然聚合物包括但不限于，蛋白质(例如，白蛋白、胶原、明胶)、醇溶谷蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)、多糖(例如，藻酸盐)、纤维素衍生物(例如，羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素)、聚羟基烷酸酯(例如，聚羟基丁酸酯)和/或它们的组合。在某些实施方式中，天然聚合物可以包括脱乙酰壳多糖或由脱乙酰壳多糖组成。
在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种聚合物，例如，聚丙交酯-共-乙交酯与聚乙二醇(PEG)的共聚物。不希望受任何特定理论的束缚，提出聚乙二醇在纳米颗粒外表面上暴露这种安排会增加血液中纳米颗粒的稳定性，可能至少部分是由于PEG的亲水性。
在一些具体实施方式中，纳米颗粒包括PLGA。
在一些具体实施方式中，本发明中使用的纳米颗粒是美国专利7,534,448、美国专利7,534,449、美国专利7,550,154、US20090239789A1、US20090269397A1、US20100104503A1、US20100151436A1、US20100284965A1、WO2006080951、WO2008115641、WO2008109347、WO2009094273、WO2012167261和WO2013003157中描述的纳米颗粒。
一般而言，纳米颗粒是直径(例如，平均直径)小于1000纳米(nm)的颗粒或包括直径(例如，平均直径)小于1000纳米(nm)的颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒组合物包含纳米颗粒群体。在某些实施方式中，纳米颗粒群体包含尺寸均匀的纳米颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒群体包含不同尺寸的纳米颗粒；在某些实施方式中展示了特定的颗粒尺寸分布。在许多实施方式中，纳米颗粒组合物包括尺寸(例如，平均尺寸)在由下限和上限所限定的范围内的纳米颗粒。在某些实施方式中，所述下限为5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、150nm、200nm或更大。在某些实施方式中，所述上限为1000nm、950nm、900m、850nm、800nm、750nm、700nm、650nm、600nm、550nm、500nm、450nm、400nm、350nm、300nm、250nm或更小。在某些实施方式中，纳米颗粒组合物包括尺寸(例如，平均尺寸)与细菌细胞尺寸相似的纳米颗粒。例如，在某些实施方式中，纳米颗粒组合物包括尺寸(例如，平均尺寸)在100nm至2000nm之间、100nm至1000nm之间、100nm至约500nm之间、100nm至约300nm之间、或100nm至约200nm之间的纳米颗粒。
在某些实施方式中，纳米颗粒组合物基本上不含有大于约2000nm、约1000nm、约900nm、约800nm、约700nm、约600nm、约500nm、约400nm或约300nm的颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒组合物包括不超过约50％、约25％、约10％、约5％、或约1％的颗粒大于约2000nm、约1000nm、约900nm、约800nm、约700nm、约600nm、约500nm、约400nm或约300nm。
纳米颗粒-示例性的制备方法
在另一个方面，本发明提供了制备纳米颗粒的方法。在某些实施方式中，例如，其中纳米颗粒包括一种或多种亲水性细胞成分和疏水性细胞成分的实施方式，纳米颗粒的制备方法包括一种或多种分离、关联、成型、乳化、热熔微囊包封、去除溶剂、喷雾干燥和/或离子凝胶化步骤及其组合。
成型
在某些实施方式中，可以使用本领域任何可用的方法来形成纳米颗粒。在某些实施方式中，可以通过纳米沉淀、使用流体通道的流动聚焦、喷雾干燥、单和双乳剂溶剂蒸发、溶剂提取、相分离、热熔微囊包封、碾磨、微乳化、精密加工、纳米加工、牺牲层、简单和复杂凝聚以及于本领域技术人员所熟知的其它方法来制备纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物。在某些实施方式中，通过水溶剂和有机溶剂合成来制备纳米颗粒组合物(参见，例如，Pellegrinoetal.，2005，Small，1:48；Murrayetal.，2000，Ann.Rev.Mat.Sci.，30:545；和Trindadeetal.，2001，Chem.Mat.，13:3843)。在某些实施方式中，可以通过纳米沉淀或喷雾干燥来制备纳米颗粒组合物。制备颗粒使用的条件可以改变，以产生具有期望的尺寸或性质(例如，疏水性、亲水性、外部形态、“粘性”、形状等)的颗粒。在一般情况下，用于制备纳米颗粒的方法和/或条件(例如，溶剂、温度、浓度、空气流速等)可以依赖于与颗粒和/或聚合物基质的组合物相关联的功能元件(例如，细胞裂解物成分)的确定。
在某些实施方式中，用于递送包封试剂的纳米颗粒的其他制备方法在文献(参见，例如，Doubrow，Ed.，“MicrocapsulesandNanoparticlesinMedicineandPharmacy，”CRCPress，BocaRaton，1992；Mathiowitzetal.，1987，J.Control.Release，5:13；Mathiowitzetal.，1987，ReactivePolymers，6:275；andMathiowitzetal.，1988，J.Appl.PolymerSci.，35:755)中已有描述。
与抗原的制备方法
在某些实施方式中，本发明提供的方法进一步包括将抗原与纳米颗粒相关联的步骤。合适的抗原和/或抗原性提取物可以包括本文描述的那些。在某些实施方式中，抗原是传染剂抗原。在某些实施方式中，传染剂抗原与传染剂的一种或多种附加成分一起提供。在某些实施方式中，抗原是原抗原性或粗抗原性提取物或变应原性提取物(例如，尘螨提取物或原生坚果提取物)的一部分。
在某些实施方式中，本发明提供的方法进一步包括如下步骤：抗原与亲水性和/或疏水性或两者兼有的细胞成分相关联，使一些抗原或全部抗原被包封入内腔。在某些实施方式中，一种或多种抗原与亲水性细胞成分相关联，使一些抗原或全部抗原被/被包封入内腔。在某些实施方式中，一种或多种抗原与疏水性细胞成分相关联，使一些抗原或全部抗原被包封入内腔。
仅作为某些实施方式的更详细的示例，提供了形成纳米颗粒的一些方法，例如，双乳化、热熔包封、去除溶剂、喷雾干燥和离子胶凝方法。用于形成纳米颗粒的示例方法可在Demento等人研究中找到，“TLR9-TargetedBiodegradableNanoparticlesasImmunizationVectorsProtectAgainstWestNileEncephalitis”，2010，J.Immunol.185:2989-2997；也参见Dementoetal.，“Inflammasome-activatingnanoparticlesasmodularsystemsforoptimizingvaccineefficacy”，2009，Vaccine27(23):3013-3021。
乳化
在某些实施方式中，聚合物溶解在挥发性有机溶剂中，例如，二氯甲烷。将有效载荷(可溶性颗粒或分散成微粒)加入该溶液中，并将混合物悬浮在含有表面活性剂(例如，聚乙烯醇)的水溶液中。搅拌所得乳剂直至大部分有机溶剂蒸发，留下固体纳米颗粒。用水洗涤所得纳米颗粒并在冷冻干燥器中干燥过夜。然后将冷冻干燥的纳米颗粒贮存在-20℃以备后用。
在某些实施方式中，可以使用水包油包水(W/O/W)乳剂法来制备纳米颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种亲水性细胞成分。例如，在第一乳剂(W/O)中，将含水细胞成分的磷酸盐生理缓冲液(PBS)加入溶解于二氯甲烷的涡旋PLGA溶液中。然后逐滴将聚合物和含水细胞裂解物的第一乳剂加入第二乳剂(W/O/W)的PVA中。每次乳化后，将样品在冰上超声30秒。然后将第二乳剂迅速加入0.3％的PVA中。然后在恒定室温下剧烈搅拌这一外相3小时以蒸发二氯甲烷，留下固体纳米颗粒。通过离心收集颗粒。得到的纳米颗粒用去离子水洗涤，快速冷冻，冻干，并贮存于-20℃以备后用。
在某些实施方式中，纳米颗粒包括一种或多种疏水性细胞成分。疏水细胞成分先与第二乳剂结合。然后逐滴将聚合物(有或没有含水细胞裂解物和/或抗原)的第一乳剂加入到第二乳剂(W/O/W)中。
在某些实施方式中，纳米颗粒进一步包括一种或多种包封的抗原(例如，变应原提取物，如尘螨或花生)。在第一乳剂(W/O)中，将浓缩抗原的磷酸盐生理缓冲液(PBS)加入溶解于二氯甲烷的涡旋PLGA溶液中。在某些实施方式中，含水细胞裂解物与第一乳剂结合。然后再将聚合物和密封剂逐滴加入到第二乳剂(W/O/W)中。在某些实施方式中，第二乳剂已与一种或多种疏水性细胞成分相结合。每次乳化后，将样品在冰上超声30秒。然后将第二乳剂迅速加入0.3％的PVA中。然后在恒定室温下剧烈搅拌这一外相3小时以蒸发二氯甲烷，留下固体纳米颗粒。通过离心收集颗粒。得到的纳米颗粒用去离子水洗涤，快速冷冻，冻干，并贮存于-20℃以备后用。
热熔微胶囊化
在该方法中，首先将聚合物熔融，然后再与固体颗粒混合。将该混合物悬浮在不混溶的溶剂(如硅油)中，并且，在连续搅拌下加热到一定温度，例如，5℃，高于聚合物的熔点。一旦乳剂稳定，就冷却直至聚合物颗粒凝固。将得到的纳米颗粒用石油醚倾析洗涤，得到自由流动粉末。本方法可以得到尺寸在0.5至1000微米之间的纳米颗粒。这种技术制备的纳米颗粒外表面通常光滑且致密。此过程用于制备聚酯和聚酐制成的纳米颗粒。在某些实施方式中，这样的方法可使用分子量在1,000-50,000之间的聚合物。
去除溶剂法
根据已知方法，该技术主要设计用于聚酐。在某些实施方式中，将待包封的有效荷载(例如，变应原提取物，如尘螨或花生)分散或溶解在选择的聚合物在例如二氯甲烷的挥发性有机溶剂的溶液中。通过搅拌使该混合物悬浮于有机油(例如，硅油)中以形成乳剂。不像溶剂蒸发，此方法可用于从具有高熔点和不同分子量的聚合物制备纳米颗粒。该技术生产的纳米颗粒的外部形态高度依赖于所用聚合物的类型。
喷雾干燥法
在使用该方法的某些实施方式中，聚合物溶解于有机溶剂中。已知量的有效载荷(例如，变应原提取物，如尘螨或花生)悬浮(不溶性提取物)或共溶解(可溶性提取物)在聚合物溶液中。然后溶液或分散体进行喷雾干燥。微型喷雾干燥器(Buchi)的典型工艺参数如下：聚合物浓度＝0.04克/ml，入口温度＝-24℃，出口温度＝13-15℃，吸气器设定＝15，泵设定＝10ml/分钟，喷雾流速＝600Nl/小时，喷嘴直径＝0.5毫米。
离子凝胶法
在某些实施方式中，例如，包括由凝胶型聚合物(例如，藻朊酸盐)制成的纳米颗粒的实施方式中，可能使用传统离子凝胶法技术。通常情况下，首先将聚合物溶解在水溶液中，与硫酸钡或某些生物活性剂混合，然后通过纳米液滴形成装置喷出，某些情况下采用氮气气流折断挤出的液滴。缓慢搅拌(约100-170RPM)的离子硬化浴位于挤出装置之下，用于接住形成的纳米液滴。纳米颗粒留在浴中孵育二十到三十分钟，以允许有足够的时间发生凝胶化。通过使用各种尺寸的挤出机或变化氮气或聚合物溶液的流速来控制纳米颗粒的尺寸。可以通过将聚合物溶解于酸性溶液中、并将其用三聚磷酸钠交联来制备壳聚糖纳米颗粒。可以通过将聚合物溶解于酸性溶液中来制备羧甲基纤维素(CMC)纳米颗粒，并且用铅离子来沉淀纳米颗粒。在带负电荷聚合物的情况下(例如，藻朊酸盐、CMC)，可以离子附着不同分子量的正电荷配体(例如，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)。
微生物细胞成分
如本文中所述的，本发明包含这样的认识，即，当微生物细胞制品(例如，裂解物)的亲水性和疏水性成分彼此分离使得形成亲水性细胞成分制品和/或疏水性细胞成分制品，并且这两种制品之一或两者都与纳米颗粒结合，产生本发明的纳米颗粒组合物时，具有一定的优点。
在某些实施方式中，微生物的细胞裂解物可以提供一种或多种亲水性细胞成分制品和疏水细胞成分制品。在这些实施方式中，亲水性细胞成分可以称为微生物亲水性细胞成分，疏水性细胞成分可以称为微生物疏水性细胞成分。不希望受任何特定理论的束缚，包括一种或多种微生物亲水性细胞成分和/或微生物疏水性细胞成分的本发明某些实施方式可以开发和/或生产有用的免疫调节纳米颗粒合物，至少部分原因是因为它们利用了微生物细胞的各种进化属性，这些属性与它们调节或逃避人类或动物免疫反应的能力相关。本发明还捕捉到这样的见解，即，将这些进化属性与一些纳米颗粒系统的各种特征(例如，(例如，通过在纳米颗粒的腔中包封)将抗原和/或细胞亲水性成分与免疫系统成分相隔离的能力、可调的降解速率和/或位置、和/或与靶点、佐剂或其他表面实体模块化关联)相结合，可以开发和/或生产特别有用的免疫调节组合物。
本发明认识到提供免疫调节组合物的各种现有技术方法的问题来源。具体地，本发明包括意识到使用纯的成分，特别是纯的佐剂成分，会失去一定的优势，包括某些免疫效果，所述优势可以由成分的集合实现，特别是通过模仿或包含微生物细胞中发现的绝对和/或相对量的集合实现。在某些实施方式中，本发明包括意识到使用分离的单个微生物成分(例如，特定的CpG和/或脂多糖分子)可能不能诱导与包括多种成分的提取物一样广泛或有效的免疫应答，某些实施方式中呈现了多种成分，它们的量与自然界中发现的量大致相等。
在某些实施方式中，本发明提供微生物提取物-例如，在纳米颗粒组合物中使用的微生物细胞的亲水性或疏水性提取物。在某些实施方式中，这样的微生物提取物可以包括具有共同化学特征的微生物成分的集合，从而使它们与其他包含的成分相关联，而不是与提取物制备过程中排除的成分相关联。在某些实施方式中，提取物可以含有至少一些细胞成分，其相对水平与存在于细胞中的相当。本领域技术人员知道各种可用于确定特定成分的存在和/或水平的技术，并将这一确定水平与完整细胞中观察到的水平进行比较。此外，本领域技术人员容易理解合理实验误差和预期实验误差，因此，能够确定成分在提取物中存在的绝对或相对水平或浓度是否与它们在细胞中存在的绝对或相对水平或浓度具有合理的可比性。
一般来说，微生物提取物是由微生物细胞制品制备的。通过将微生物细胞在足以实现细胞生长到所需水平(例如，光密度、浓度、菌落大小、总蛋白、总DNA和菌落形成单位)的条件下培养一段时间来制备微生物细胞制品。在某些实施方式中，微生物细胞制剂含有完整细胞，以及任选地基本上不含裂解的细胞。在某些实施方式中，微生物细胞制剂含有裂解的细胞，以及任选地基本上不含完整细胞。
在某些实施方式中，本发明提供了亲水性微生物提取物，例如通过将微生物细胞制品与亲水性溶剂接触以使得亲水性细胞成分被划分至亲水性溶剂的溶液中来制备的提取物。然后，可以将亲水性溶剂从非溶解成分中分离出来，非溶解成分可以，例如，沉淀、溶解于疏水性溶剂(任选不与亲水性溶剂混溶)，或从亲水性溶剂中分离出来。在某些实施方式中，划分至亲水性溶剂中的亲水性细胞成分包括，例如，在这中溶剂可混溶和/或可溶的成分。
分离
可以使用各种分离方法将亲水性细胞成分从疏水性细胞成分中分离出来。示例性的合适方法包括溶剂提取、洗涤剂提取和相分离。
在亲水性细胞提取物的一些实施方式中发现的示例性的亲水性成分包括但不限于：细胞溶质成分；包括糖在内的碳水化合物；两性分子(例如，糖脂和/或脂蛋白)；盐；可溶性蛋白质(即，极性蛋白质)；核酸(例如，DNA和/或RNA)和/或它们的组合。在某些实施方式中，亲水性细胞提取物包括剪切DNA或RNA。在某些实施方式中，亲水性细胞提取物包括脂多糖(LPS)。在某些实施方式中，亲水性细胞提取物包括一种或多种CpG。在某些实施方式中，亲水性细胞提取物基本上不含有膜脂或膜蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供了疏水性微生物提取物，例如通过将微生物细胞制品与疏水性溶剂接触以使得疏水性细胞成分被划分至疏水性溶剂的溶液中来制备的提取物。然后，可以将疏水性溶剂从非溶解成分中分离出来，非溶解成分可以，例如，沉淀、溶解于亲水性溶剂(任选不与疏水性溶剂混溶)，或从疏水性溶剂中分离出来。在某些实施方式中，划分至疏水性溶剂中的疏水性细胞成分包括，例如，在这中溶剂可混溶和/或可溶的成分；在某些实施方式中，这种疏水性细胞成分包括与水和/或其他水性溶剂基本上不混溶和/或不溶的成分。
在疏水性细胞提取物的一些实施方式中发现的示例性的成分包括但不限于：细胞膜成分；包括某些糖蛋白和/或糖脂在内的某些碳水化合物；包括某些糖蛋白、跨膜蛋白、脂质锚定蛋白(即，非极性蛋白质)在内的某些蛋白质；包括磷脂、糖脂和胆固醇在内的脂类；和/或它们的组合。在某些实施方式中，疏水性细胞提取物包括脂多糖(LPS)。在某些实施方式中，疏水性细胞提取物基本上不含有仅在细胞质中的成分(例如，亲水性蛋白质、DNA和RNA)。
在某些实施方式中，亲水性提取物基本上不含疏水性成分；在某些实施方式中，疏水性提取物基本上不含亲水性成分。然而，如本领域技术人员可以理解的，通过提取物制剂分离的细胞成分通常是不完全的。也就是说，在某些实施方式中，至少一些细胞成分可以基本上等分成亲水性和疏水性提取物；其它成分可以很好地分区但是不会唯一地划分至亲水性和疏水性提取物。给出几个例子，在某些实施方式中，两性物质，例如某些跨膜蛋白、糖脂和/或脂蛋白、脂多糖等以及它们的组合。
可以从任何微生物细胞提取物或它们的组合来制备用于本发明的微生物提取物。在某些实施方式中，可以从细菌、真菌、古细菌和/或原生细胞或它们的组合来制备微生物提取物。
在某些实施方式中，可以从细菌细胞中制备微生物提取物，所述细菌包括但不限于，放线菌属(Actinomyces)、气单胞菌属(Aeromonas)、鱼腥藻属(Anabaena)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类杆菌属(Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、博代氏杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、衣原体属(Chlamydia)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜盐菌属(Halobacterium)、螺杆菌属(Heliobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、流感嗜血杆菌B型(HemophilusinfluenzatypeB，HIB)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳球菌属(Lactococcus)、军团菌属(Legionella)、细螺旋体(Leptspirosis)、李斯特菌属(Listeria)、A、B和C群脑膜炎球菌(MeningococcusA,BandC)、甲烷细菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、摩根氏菌属(Morganella)、分支杆菌属(Myobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、粘球菌属(Myxococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、硝化菌属(Nitrobacter)、颤蓝细菌属(Oscillatoria)、消化球菌属(Peptococcus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、原绿藻(Prochloron)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、螺旋体属(Spirochaeta)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillu)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热原体属(Thermoplasma)、硫杆菌属(Thiobacillus)、和密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)及其组合。在某些实施方式中，可以从大肠杆菌细胞中制备微生物提取物。
在某些实施方式中，可以从酵母细胞中制备微生物提取物，所述酵母细胞包括，例如，异酒香酵母(Brettanomycesanomalus)、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)、克劳森酒香酵母(Brettanomycesclaussenii)、班图特酒香酵母(Brettanomycescustersianus)、朗比克酒香酵母(Brettanomyceslambicus)、naardenensis酒香酵母(Brettanomycesnaardenensis)、纳努斯酒香酵母(Brettanomycesnanus)、白色念珠菌属(Canidaalbicans)、布朗克假丝酵母(Candidablankii)、斯卢菲假丝酵母(Candidaslooffi)、媒介酵母(Dekkeraintermedia)、寒地真菌酵母(Leucosporidiumfrigidum)、深红酵母(Rhodotorularubra)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)、地生酵母(Saccharomycestelluris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、约翰逊锁掷酵母属(Sporidiobolusjohnsonii)、锁掷酵母属(Sporidioboluslongiusculus)、metaroseus锁掷酵母属(Sporidiobolusmetaroseus)、pararoseus锁掷酵母属(Sporidioboluspararoseus)、ruineniae锁掷酵母属(Sporidiobolusruineniae)、鲑色锁掷酵母属(Sporidiobolussalmonicolor)、维罗纳锁掷酵母属(Sporidiobolusveronae)、白吉利丝孢酵母(Trichosporonbeigelii)、皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)及其组合。在某些实施方式中，可以从酿酒酵母细胞中制备微生物提取物。
在某些实施方式中，可以从那些对给予本发明组合物的生物体有致病性的一种或多种微生物细胞类型来制备微生物提取物。在某些实施方式中，可以从那些天然定殖于给予本发明组合物的对象的一种或多种微生物细胞类型来制备微生物提取物。在某些实施方式中，可以从给予本发明组合物的生物体消耗的食物中存在的微生物细胞类型来制备微生物提取物。
不希望受到特定理论束缚，某些实施方式重建对一种或多种物质的自然环境暴露的能力是有益的和/或所期望的。例如，在某些实施方式中，天然存在的微生物提取物成分的混合物可复制对一种或多种毒素、传染剂、抗原和/或变应原的环境暴露。
抗原
在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物进一步包括抗原。抗原可以是任何抗原，包括肽、蛋白质、多糖、糖、脂质、糖脂、核酸、或其组合。所述抗原可以从任何来源获得，包括但不限于，病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物、真菌、组织或转化细胞，诸如癌细胞或白血病细胞，并且可以是完整细胞或其免疫原性成分，例如，细胞壁成分或其分子成分。在某些实施方式中，可使用包括一种或多种抗原的粗提物。
在某些实施方式中，抗原是传染剂抗原。在某些实施方式中，传染剂抗原与传染剂的一种或多种附加成分一并提供。在某些实施方式中，抗原或传染剂选自下组：变应原、传染性抗原、疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原)、自身抗原、或它们的组合。在某些实施方式中，抗原的某些部分或全部抗原被包封在纳米颗粒的内腔中。
在某些实施方式中，合适的抗原是本领域已知的和可从商业政府和科学来源获取的。在某些实施方式中，抗原由全灭活或减毒生物体提供。在某些实施方式中，抗原由传染性生物体，如病毒、寄生虫和细菌提供。在某些实施方式中，抗原由肿瘤细胞提供。在某些实施方式中，抗原可以是来自肿瘤或病毒或细菌来源的纯化或部分纯化的多肽。可以在本领域中找到用于识别和选择有效抗原肽(例如，能够引发免疫应答的最小肽序列)的示例性标准。例如，基于对抗原呈递分子及其与抗原肽和T细胞受体相互作用的理解，Apostolopoulos，etal.(Curr.Opin.Mol.Ther.，2:29-36(2000))讨论了识别最小抗原肽序列抗原的策略。Shastri(Curr.Opin.Immunol.，8:271-7(1996))公开了如何从数千个通常与MHC分子结合的肽中区分用来激活T细胞的稀有肽。抗原可以是异源表达系统中编码多肽抗原的DNA表达的重组多肽。抗原可以是编码全部或部分抗原蛋白的DNA。DNA可以是载体DNA形式，例如质粒DNA。
在某些实施方式中，抗原可以以单个抗原的方式提供，或者可以以结合方式提供。在某些实施方式中，抗原还可以作为多肽或核酸的复杂混合物提供。
在某些实施方式中，抗原以粗提取物(例如，全花生提取物)的形式提供。在某些实施方式中，纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物可包含一种或多种抗原粗提物。在某些实施方式中，粗提取物可以是纳米颗粒组合物中使用的单个抗原的有用、价廉的替代。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物可包括一种或多种病毒抗原。病毒通常由两个或三个部分组成：1)遗传物质，可以是DNA或RNA，依据病毒而定，2)围绕并保护遗传物质的蛋白质外壳，以及在一些病毒中，3)围绕蛋白质外壳的脂质包膜。在某些实施方式中，病毒抗原可以由病毒的任何成分提供。在某些实施方式中，病毒抗原可从任何病毒中分离，包括但不限于来源于以下病毒家族中任何一种的病毒：沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状DNA病毒(Badnavirus)、杆菌状核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、毛状病毒组(Capillovirus)、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、环病毒科(Circoviridae)、线形病毒组(Closterovirus)、豇豆镶嵌病毒科(Comoviridae)、冠状病毒科(Coronavtridae)(例如，冠状病毒(Coronavirus)，如，严重急性呼吸道症候群(SARS)病毒)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、丁肝病毒属(Deltavirus)、香石竹病毒组(Dianthovirus)、碗豆耳突花叶病毒组(Enamovirus)、丝状病毒科(Filoviridae)(例如，马尔堡病毒和埃博拉病毒(例如，扎伊尔、斯顿、象牙海岸、或苏丹株))、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，丙型肝炎病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、登革热病毒3型、登革热病毒4型)、嗜肝病毒种(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，人疱疹病毒1型、3型、4型、5型和6型，巨细胞病毒)、减毒病毒科(Hypoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、微病毒科(Microviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒A型、B型和C型)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，麻疹、腮腺炎和人类呼吸道合胞病毒)、细小病毒科(Parvoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、肝病毒和口蹄疫病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如，牛痘和天花病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，慢病毒，如，人免疫缺陷病毒(HIV)1型和HIV2型)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒、登革热病毒等)和整体病毒科(Totiviridae)。合适的病毒抗原还包括登革蛋白M、登革蛋白E、登革D1NS1、登革D1NS2以及登革D1NS3的全部或一部分。在某些实施方式中，病毒抗原包括一种或多种病毒的片段或由一种或多种病毒的片段组成，如，流感病毒片段。在某些实施方式中，病毒片段由一种或多种1)病毒遗传物质、2)病毒蛋白外壳的一部分、和/或3)病毒脂质包膜的一部分提供。在某些实施方式中，病毒片段由两种或两种以上的1)病毒遗传物质、2)病毒蛋白外壳的一部分、和/或3)病毒脂质包膜的一部分提供。
示例性病毒抗原包括，但不限于以下病毒株，例如，腺病毒、包柔氏螺旋体、锥虫病、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、艾巴氏病毒(EBV)、脑炎病毒(例如，马脑炎病毒和日本脑炎病毒)、汉坦病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、庚型肝炎病毒(HGV)、单纯疱疹病毒(HSV)(即，HSV1和HSV2)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、流感、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、疟疾、麻疹、支原体、乳头状瘤病毒(例如，人乳头状瘤病毒，HPV)、副流感病毒、细小病毒、鼻病毒、裂谷热病毒、轮状病毒、风疹、SARS、弓形体、密螺旋体、水痘带状疱疹(VZV)、西尼罗河病毒(WNV)、黄热病、以及它们的组合。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物包括一种或多种细菌抗原。细菌抗原可来自任何细菌，包括但不限于，放线菌属(Actinomyces)、气单胞菌属(Aeromonas)、鱼腥藻属(Anabaena)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类杆菌属(Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、博代氏杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、衣原体属(Chlamydia)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、嗜盐菌属(Halobacterium)、螺杆菌属(Heliobacter)、流感嗜血杆菌B型(HemophilusinfluenzatypeB，HIB)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳球菌属(Lactococcus)、军团菌属(Legionella)、细螺旋体(Leptspirosis)、李斯特菌属(Listeria)、A、B和C群脑膜炎球菌(MeningococcusA,BandC)、甲烷细菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、摩根氏菌属(Morganella)、支原体属(Mycoplasma)、分支杆菌属(Myobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、硝化菌属(Nitrobacter)、颤蓝细菌属(Oscillatoria)、消化球菌属(Peptococcus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、原绿藻(Prochloron)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、螺旋体属(Spirochaeta)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillu)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热原体属(Thermoplasma)、硫杆菌属(Thiobacillus)、和密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)及其组合。
在某些实施方式中，纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物包含一种或多种寄生虫抗原。寄生虫抗原可以从寄生虫中获得，例如但不限于来源于如下寄生虫的抗原：白色念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydialpsittaci)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、痢疾阿米巴(Entamoebahistolytica)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、镰状疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、立氏立克次体(Rickettsiaricketsii)、伤寒立克次氏体(Rickettsiatyphi)、曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)。这些包括孢子虫抗原、疟原虫抗原，例如，完整的环孢子蛋白、孢子表面蛋白、肝期抗原、顶膜相关蛋白或裂殖子表面蛋白或其中的一部分。
在某些实施方式中，纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物包括一种或多种环境抗原。示例性的环境抗原包括但不限于，由天然产生的变应原衍生的抗原，例如，花粉变应原(树型、草型、和草花粉变应原)、昆虫变应原(吸入、唾液和毒液变应原)、动物毛发和/或皮屑变应原。
在某些实施方式中，抗原可以在某些能够引起变应性反应，特别是个体中过敏性变应性反应的食品、毒液、药物或橡胶中找到。可能会引起过敏反应的示例性变应原包括在食品(花生、牛奶、鸡蛋、小麦)、昆虫毒液(即，蜜蜂、爬行类)、药物和乳胶中发现的几种蛋白质。在某些实施方式中，环境抗原可以是一种或多种毒液。能够注射毒液的生物体叮咬蜇伤，例如昆虫叮咬蜇伤，会在对毒液有变应性的个体中引起过敏反应。在一般情况下，昆虫毒液包括来源于膜翅目的昆虫毒液，例如，蜜蜂、大黄蜂、黄蜂、小黄蜂、丝绒蚁和火蚁。例如，蜂属(Apis)蜜蜂的毒液可引起被叮咬的变应性受害者发生过敏反应(Weberetal.Allergy42:464470)。蜜蜂毒液中含有已被广泛研究和表征的许多化合物(见参考，BanksandShipolini.ChemistryandPharmacologyofHoney-beeVenom.Chapter7ofVenomsoftheHymenoptera.Ed.T.Piek.AcademicPress.London.1986)。蜂毒的两个主要成分是磷脂酶A2和蜂毒肽，在某些实施方式中可以用于治疗和预防蜂毒过敏。在食品中发现的蛋白变应原的非限制性例子包括在坚果(例如，花生、核桃、杏仁、山核桃、腰果、榛子、开心果、松子、巴西坚果)、海鲜(例如，虾、蟹、龙虾、蛤蜊)、水果(例如，李子、桃子、油桃；AnnAllergyAsthmaImmunol7(6):5048(1996)；cherries，Allergy51(10):7567(1996)))、种子(芝麻、罂粟、芥菜)以及大豆和奶制品(例如，蛋、奶)中发现的蛋白质。
在某些实施方式中，可以使用在花粉相关的食物变应性反应中发现的蛋白抗原(例如，与苹果变应性反应相关的桦树花粉)。来源于树、草和草本植物的重要花粉变应原起源于壳斗目(Fagales)、木樨目(Oleales)、松柏目(Pinales)、悬铃木科(platanaceae)、禾本目(Poales)、菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)，所述悬铃木科包括桦木(桦木属(Betula))、桤木(桤木属(Alnus))、榛子(榛属(Corylus))、角树(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄(木樨榄属(Olea))、雪松(柳杉属(Cryptomeria)和刺柏属(Juniperus))、悬铃树(悬铃木属(Platanus))；所述禾本目包括黑麦草属(Lolium)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、绒毛草属(Holcus)、虉草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)和高粱属(Sorghum)的草；所述菊目和荨麻目包括豚草属(Ambrosia)、蒿属(Artemisia)和墙草属(Parietaria)的草本植物。
在某些实施方式中，抗原是来自下组的一种或多种变应原：表皮螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus)的屋尘螨；储存尘螨(例如嗜鳞螨属(Lepidoglyphys)、嗜甜螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus)；蟑螂、蚊和蚤(例如，小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)和栉头蚤属(Ctenocepphalides))；哺乳动物(例如，猫、狗和马)；鸟；毒液变应原，包括来源于针昆虫或咬虫的毒液变应原，所述针昆虫或咬虫包括，例如膜翅目(Hymenoptera)的蜜蜂(蜜蜂总科(Apidae))、黄蜂(胡蜂总科(Vespidea))、蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。可以使用的其他变应性抗原包括来源于真菌的吸入变应原，所述真菌包括，例如，链格孢属(Alternaria)和枝孢属(Cladosporium)。
在某些实施方式中，可能希望系统中的单一化合物(例如，单一蛋白质)是观察到的变应性的原因。在某些实施方式中，抗原包括多种复合变应原和/或粗致敏提取物。因此，可以使用一个以上的抗原集合，使得可以在一个实施方式中调节对多种抗原的免疫应答。
在为了更好地举例说明某些实施方式，可用于某些实施方式中的示例性抗原和/或抗原性提取物(例如一种或多种变应原和/或变应原提取物)包括但不限于，粗脚粉螨(Acarussiro)(螨)脂肪酸结合蛋白(Acas13)；猕猴桃(Actinidiachinensis)(奇异果)半胱氨酸蛋白酶(Actc1)；埃及伊蚊(Aedesaegyptii)(蚊子)抗原(Aeda2)；埃及伊蚊(Aedesaegyptii)(蚊子)抗原(Aeda2)；埃及伊蚊(Aedesaegyptii)(蚊子)三磷酸腺苷双磷酸酶(Aeda1)；埃及伊蚊(Aedesaegyptii)(蚊子)三磷酸腺苷双磷酸酶(Aeda1)；普通赤杨(Alnusglutinosa)(桤木)抗原(Alng1)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)酸核糖体蛋白P1(Alta12)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)醛脱氢酶(Alta10)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)抗原(Alta1)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)抗原(Alta2)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)烯醇化酶(Alta11)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)热休克蛋白(Alta3)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)核糖体蛋白(Alta6)；交链孢(Alternariaalternata)(真菌)YCP4蛋白(Alta7)；豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(短豚草)抗原E(Amba1)；豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(短豚草)抗原K(Amba2)；豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(短豚草)Ra3抗原(Amba3)；豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(短豚草)Ra5抗原(Amba5)；豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(短豚草)Ra6抗原(Amba6)；豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(短豚草)Ra7抗原(Amba7)；三裂叶豚草(Ambrosiatrifida)(巨型豚草)Ra5G抗原(Ambt5)；单纯异尖线虫(Anisakissimplex)(线虫)抗原(Anis1)；单纯异尖线虫(Anisakissimplex)(线虫)副肌球蛋白(Anis2)；意大利蜂(Apismellifera)(蜜蜂)抗原(Apim6)；意大利蜂(Apismellifera)(蜜蜂)透明质酸酶(Apim2)；意大利蜂(Apismellifera)(蜜蜂)蜂毒肽(Apim4)；意大利蜂(Apismellifera)(蜜蜂)磷脂酶A2(Apim1)；芹菜(Apiumgraveolens)(芹菜)抗原(Apig5)；芹菜(Apiumgraveolens)(芹菜)Betv1同系物(Apig1)；芹菜(Apiumgraveolens)(芹菜)抑制蛋白(Apig4)，花生(Arachishypogaea)(花生)(羽扇豆球蛋白Arah2)；花生(Arachishypogaea)(花生)(抑制蛋白Arah5)；花生(Arachishypogaea)(花生)羽扇豆球蛋白同源物(Arah6)；花生(Arachishypogaea)(花生)羽扇豆球蛋白同源物(Arah7)；花生(Arachishypogaea)(花生)大豆球蛋白(Arah3)；花生(Arachishypogaea)(花生)大豆球蛋白(Arah4)；花生(Arachishypogaea)(花生)豌豆球蛋白(Arah1)；艾蒿(Artemisiavulgaris)(艾蒿)抗原(Artv1)；艾蒿(Artemisiavulgaris)(艾蒿)抗原(Artv2)；猪蛔虫(Ascarissuum)(虫)抗原(Ascs1)；黄曲霉菌(Aspergillusflavus)(真菌)碱性丝氨酸蛋白酶(Aspfl13)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)碱性丝氨酸蛋白酶(Aspf13)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf1)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf15)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf16)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf17)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf2)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf4)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf7)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)抗原(Aspf9)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)天冬氨酸蛋白酶(Aspf10)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)热休克蛋白P70(Aspf12)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)金属蛋白酶(Aspf5)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)Mn超氧化物歧化酶(Aspf6)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)肽基-脯氨酰异构酶(Aspf11)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)过氧化物酶体蛋白(Aspf3)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)核糖体蛋白P2(Aspf8)；烟曲霉菌(AspergillusFumigatus)(真菌)液泡丝氨酸(Aspf18)；黑曲霉菌(Aspergillusniger)(真菌)抗原(Aspn18)；黑曲霉菌(Aspergillusniger)(真菌)β-木糖苷酶(Aspn14)；黑曲霉菌(Aspergillusniger)(真菌)液泡丝氨酸蛋白酶；米曲霉(Aspergillusoryzae)(真菌)碱性丝氨酸蛋白酶(Aspo13)；米曲霉(Aspergillusoryzae)(真菌)TAKA淀粉酶A(Aspo2)；巴西坚果(Bertholletiaexcelsa)(巴西坚果)2S白蛋白(Bere1)；疣皮桦(Betulaverrucosa)(桦木)抗原(Betv1)；疣皮桦(Betulaverrucosa)(桦木)抗原(Betv3)；疣皮桦(Betulaverrucosa)(桦木)抗原(Betv4)；疣皮桦(Betulaverrucosa)(桦木)亲环蛋白(Betv7)；疣皮桦(Betulaverrucosa)(桦木)异黄酮还原酶同源物(Betv5)；疣皮桦(Betulaverrucosa)(桦木)抑制蛋白(Betv2)；德国小蠊(Blattellagermanica)(德国蟑螂)天冬氨酸蛋白酶(Blag2)；德国小蠊(Blattellagermanica)(德国蟑螂)Bd90k(Blag1)；德国小蠊(Blattellagermanica)(德国蟑螂)卡里碱(Blag4)；德国小蠊(Blattellagermanica)(德国蟑螂)谷胱甘肽转移酶(Blag5)；德国小蠊(Blattellagermanica)(德国蟑螂)肌钙蛋白C(Blag6)；热带无爪螨(Blomiatropicalis)(螨)抗原(Blot5)；热带无爪螨(Blomiatropicalis)(螨)Bt11a抗原(Blot12)；热带无爪螨(Blomiatropicalis)(螨)Bt6脂肪酸结合蛋白(Blot)；熊蜂(Bombuspennsylvanicus)(大黄蜂)磷脂酶(Bomp1)；熊蜂(Bombuspennsylvanicus)(大黄蜂)(大黄蜂)蛋白酶(Bomp4)；牛科动物黄牛(Bosdomesticus)(奶牛)Ag3，载脂蛋白(Bosd2)；牛科动物黄牛(Bosdomesticus)(奶牛)α-乳白蛋白(Bosd4)；牛科动物黄牛(Bosdomesticus)(奶牛)β-乳白蛋白(Bosd5)；牛科动物黄牛(Bosdomesticus)(奶牛)酪蛋白(Bosd8)；牛科动物黄牛(Bosdomesticus)(奶牛)免疫球蛋白(Bosd7)；牛科动物黄牛(Bosdomesticus)(奶牛)血清白蛋白(Bosd6)；芥菜(Brassicajuncea)(东方芥末)2S白蛋白(Braj1)；芜菁(Brassicarapa)(萝卜)主要橡胶蛋白样蛋白(Barr2)；白色念珠菌(Candidaalbicans)(真菌)抗原(Canda1)；博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)(真菌)抗原(Candb2)；家犬(Canisfamiliaris)(犬)白蛋白(Canf？)；家犬(Canisfamiliaris)(狗)抗原(Canf1)；家犬(Canisfamiliaris)(犬)抗原(Canf2)；鹅耳枥(Carpinusbetulus)(鹅耳枥)抗原(Carb1)；栗(Castaneasativa)(板栗)Betv1同系物(Cass1)；欧洲板栗(Castaneasativa)(板栗)几丁质酶(Cass5)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(蚊)成分I(Chit2.0101)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分IA(Chit2.0102)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分II-β(Chit3)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分III(Chit1.01)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分IIIA(Chit4)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分IV(Chit1.02)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分IX(Chit6.02)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分VI(Chit5)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分VIIA(Chit6.01)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分VIIB(Chit7)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分VIII(Chit8)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)成分X(Chit9)；摇蚊(Chironomusthummithummi)(摇蚊)血红蛋白(Chit1-9)；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)酸核糖体蛋白P1(Clah12)；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)醛脱氢酶(Clah3)；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)抗原(Clah1)；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)抗原(Clah2)；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)烯醇化酶(Clah6)；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)核糖体蛋白；腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)(真菌)YCP4蛋白(Clah5)；鸡腿菇(Coprinuscomatus)(毛头鬼伞)抗原(Copc1)；鸡腿菇(Coprinuscomatus)(毛头鬼伞)抗原(Copc2)；鸡腿菇(Coprinuscomatus)(毛头鬼伞)抗原(Copc3)；鸡腿菇(Coprinuscomatus)(毛头鬼伞)抗原(Copc5)；鸡腿菇(Coprinuscomatus)(毛头鬼伞)抗原(Copc7)；榛子(榛子)抗原(Cora1)；欧洲榛子(Corylusavellana)(榛子)Betv1同系物(Cora1.0401)；日本柳杉(Cryptomeriajaponica)(日本雪松)抗原(Cryj1)；日本柳杉(Cryptomeriajaponica)(日本雪松)抗原(Cryj2)；栉头蚤(Ctenocephalidesfelisfelis)(猫蚤)抗原(Ctef1)；狗牙根(Cynodondactylon)(百慕达草)抗原(Cynd1)；狗牙根(Cynodondactylon)(百慕达草)抗原(Cynd7)；狗牙根(Cynodondactylon)(百慕达草)抑制蛋白(Cynd12)；鸭茅(Dactylisglomerata)(果园草)AgDg1抗原(Dacg1)；鸭茅(Dactylisglomerata)(果园草)抗原(Dacg2)；鸭茅(Dactylisglomerata)(果园草)抗原(Dacg3)；鸭茅(Dactylisglomerata)(果园草)抗原(Dacg5)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)(螨)抗原(Derf1)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)(螨)抗原(Derf2)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)(螨)抗原(Derf3)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)(螨)Mag3，载脂蛋白(Derf14)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)(螨)副肌球蛋白(Derf11)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)(螨)原肌球蛋白(Derf10)；微角尘螨(Dermatophagoidesmicroceras)(螨)抗原(Derm1)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)淀粉酶(Derp4)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)抗原(Derp2)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)抗原(Derp5)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)抗原(Derp7)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)抗原P1(Derp1)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)P样载脂蛋白(Derp14)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)糜蛋白酶(Derp6)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)胶原溶解丝氨酸PROT(Derp9)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)谷胱甘肽转移酶(Derp8)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)原肌球蛋白(Derp10)；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(螨)胰蛋白酶(Derp3)；黄蜂(Dolichovespulaarenaria)(黄蜂)抗原5(Dola5)；斑点黄蜂(Dolichovespulamaculata)(白斑脸黄蜂)抗原5(Dolm5)；斑点黄蜂(Dolichovespulamaculata)(白斑脸黄蜂)磷脂酶(Dolm1)；斑点黄蜂(Dolichovespulamaculata)(白斑脸黄蜂)透明质酸酶(Dolm2)；家马(Equuscaballus)(马)脂质运载蛋白(Equc1)；家马(Equuscaballus)(马)载脂蛋白(Equc2)；埋内欧尘螨(Euroglyphusmaynei)(螨)载脂蛋白(Eurm14)；家猫(Felisdomesticus)(猫)cat-1抗原(Feld1)；欧洲白蜡树(Fraxinusexcelsior)(白蜡木)抗原(Frae1)；鳕鱼(Gaduscallarias)(鳕鱼)变应原M(Gadc1)；家鸡(Gallusdomesticus)(鸡)伴清蛋白A22(Gald3)；家鸡(Gallusdomesticus)(鸡)溶菌酶(Gald4)；家鸡(Gallusdomesticus)(鸡)卵清蛋白(Gald2)；家鸡(Gallusdomesticus)(鸡)卵类粘蛋白(Gald1)；家鸡(Gallusdomesticus)(鸡)血清白蛋白(Gald5)；大豆(Glycinemax)(黄豆)抗原(Glym2)；大豆Glycinemax)(黄豆)HPS(Glym1.0101)；大豆(Glycinemax)(黄豆)HPS(Glym1.0102)；大豆(Glycinemax)(黄豆)抑制蛋白(Glym3)；鲍鱼(HaliotisMidae)(鲍鱼)抗原(Halm1)；向日葵(Helianthusannuus)(向日葵)抗原(Hela1)；向日葵(Helianthusannuus)(向日葵)抑制蛋白(Hela2)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)1，3-葡聚糖酶(Hevb2)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)抗原(Hevb3)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)抗原(Hevb5)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)微螺旋蛋白复合物成分(Hevb4)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)C末端片段抗原(Hevb6.03)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)延伸因子(Hevb1)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)烯醇化酶(Hevb9)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)hevein(Hevb6.02)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)橡胶蛋白前体(Hevb6.01)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)Mn超氧化歧化物(Hevb10)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)马铃薯糖蛋白同源物(Hevb7)；巴西橡胶(Heveabrasiliensis)(橡胶)抑制蛋白(Hevb8)；绒毛草(Holcuslanatus)(绒草)抗原(Holl1)；智人(Homosapiens)(人类自免疫变应原)抗原(Homs1)；智人(Homosapiens)(人类自免疫变应原)抗原(Homs2)；智人(Homosapiens)(人类自免疫变应原)抗原(Homs3)；智人(Homosapiens)(人类自免疫变应原)抗原(Homs4)；智人(Homosapiens)(人类自免疫变应原)抗原(Homs5)；大麦(Hordeumvulgare)(大麦)BMAI-1(Horv1)；核桃(Juglansregia)(英国胡桃)2S白蛋白(Jugr1)；核桃(Juglansregia)(英国胡桃)豌豆球蛋白(Jugr2)；杉木(Juniperusashei)(山杉)抗原(Juna1)；杉木(Juniperusashei)(山杉)抗原(Juna3)；酸刺柏(Juniperusoxycedrus)(刺杜松)钙调蛋白类抗原(Juno2)；刺柏(Juniperussabinoides)(山杉)抗原(Juns1)；维吉尼亚雪松(Juniperusvirginiana)(铅笔柏)抗原(Junv1)；害嗜鳞螨(Lepidoglyphusdestructor)(贮存螨)抗原(Lepd2.0101)；害嗜鳞螨(Lepidoglyphusdestructor)(贮存螨)抗原(Lepd2.0102)；普通女贞(Ligustrumvulgare)(女贞)抗原(Ligv1)；多年生黑麦草(Loliumperenne)(黑麦草)抗原(LolpIb)；多年生黑麦草(Loliumperenne)(黑麦草)I组抗原(Lolp1)；多年生黑麦草(Loliumperenne)(黑麦草)II组抗原(Lolp2)；多年生黑麦草(Loliumperenne)(黑麦草)III组抗原(Lolp3)；多年生黑麦草(Loliumperenne)(黑麦草)IX组抗原(Lolp5)；多年生黑麦草(Loliumperenne)(黑麦草)胰蛋白酶(Lolp11)；糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(真菌)抗原(Malf1)；糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(真菌)抗原(Malf4)；糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(真菌)抗原(Malf5)；糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(真菌)亲环蛋白同源物(Malf6)；糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(真菌)MF1过氧化物酶体膜蛋白(Malf2)；糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(真菌)MF2过氧化物酶体膜蛋白(Malf3)；苹果(Malusdomestica)(苹果)Betv1同系物(Mald1)；苹果(Malusdomestica)(苹果)脂转移蛋白(Mald3)；一年生山靛(Mercurialisannua)(山木兰)抑制蛋白(Mera1)；刀额新对虾(Metapenaeusensis)(对虾)原肌球蛋白(Mete1)；小鼠(Musmusculus)(小鼠)MUP抗原(Musm1)；斗牛犬蚁(Myrmeciapilosula)(澳大利亚跳蚁)抗原(Myrp1)；斗牛犬蚁(Myrmeciapilosula)(澳大利亚跳蚁)抗原(Myrp2)；洋橄榄(Oleaeuropea)(橄榄)抗原(Olee1)；洋橄榄(Oleaeuropea)(橄榄)抗原(Olee3)；洋橄榄(Oleaeuropea)(橄榄)抗原(Olee4)；洋橄榄(Oleaeuropea)(橄榄)抗原(Olee6)；洋橄榄(Oleaeuropea)(橄榄)抑制蛋白(Olee2)；洋橄榄(Oleaeuropea)(橄榄)超氧化物歧化酶(Olee5)；水稻(Oryzasativa)(大米)抗原(Orys1)；褐对虾(Penaeusaztecus)(对虾)原肌球蛋白(Pena1)；印度对虾(Penaeusindicus)(对虾)原肌球蛋白(Peni1)；短密青霉菌(Penicilliumbrevicompactum)(真菌)碱性丝氨酸蛋白酶(Penb13)；橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)(真菌)碱性丝氨酸蛋白酶(Penc13)；橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)(真菌)热休克蛋白P70(Penc1)；橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)(真菌)过氧化物酶体膜蛋白(Penc3)；点青霉菌(Penicilliumnotatum)(真菌)碱性丝氨酸蛋白酶(Penn13)；点青霉菌(Penicilliumnotatum)(真菌)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Penn1)；点青霉菌(Penicilliumnotatum)(真菌)液泡丝氨酸蛋白酶(Penn18)；草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)(真菌)液泡丝氨酸蛋白酶(Peno18)；美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲大蠊)Cr-PI(Pera3)；美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲大蠊)Cr-PII(Pera1)；美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲大蠊)原肌球蛋白(Pera7)；美洲鳄梨(Perseaamericana)(鳄梨)内切几丁质酶(Persa1)；虉草(Phalarisaquatica)(金丝雀草)抗原(phaa1)；猫尾草(Phleumpratense)(梯牧草)抗原(Phlp1)；猫尾草(Phleumpratense)(梯牧草)抗原(Phlp2)；猫尾草(Phleumpratense)(梯牧草)抗原(Phlp4)；猫尾草(Phleumpratense)(梯牧草)抗原(Phlp6)；猫尾草(Phleumpratense)(梯牧草)抗原Ag25(Phlp5)；猫尾草(Phleumpratense)(梯牧草)聚半乳糖醛酸酶(Phlp13)；猫尾草((Phleumpratense)梯牧草)抑制蛋白(Phlp12)；草地早熟禾(Poapratensis)(肯塔基蓝草)抗原(Poap5)；草地早熟禾(Poapratensis)(肯塔基蓝草)I组抗原(Poap1)；马蜂(Polistesannularies)(黄蜂)抗原5(pola5)；马蜂(Polistesannularies)(黄蜂)透明质酸酶(Pola2)；马蜂(Polistesannularie)(黄蜂)磷脂酶A1(Pola1)；造纸胡蜂(Polistesdominulus)(地中海胡蜂)抗原(Pold1)；造纸胡蜂(Polistesdominulus)(地中海胡蜂)抗原(Pold5)；造纸胡蜂(Polistesdominulus)(地中海胡蜂)丝氨酸蛋白酶(Pold4)；马蜂(Polistesexclamans)(黄蜂)抗原5(Pole5)；马蜂(Polistesexclamans)(黄蜂)磷脂酶A1(Pole1)；纸巢蜂(Polistesfuscatus)(黄蜂)抗原5(Polf5)；长足胡蜂(Polistesmetricus)(黄蜂)抗原5(Polm5)；山杏(Prunusarmeniaca)(杏)Betv1同系物(Pruar1)；山杏(Prunusarmeniaca)(杏)脂转移蛋白(Pruar3)；甜樱桃(Prunusavium)(甜樱桃)Betv1同系物(Pruar1)；甜樱桃(Prunusavium)(甜樱桃)抑制蛋白(Pruav4)；甜樱桃(Prunusavium)(樱桃)索马甜同源物(Pruav2)；桃(Prunuspersica)(桃)脂转移蛋白(Prup3)；古巴裸盖菇(Psilocybecubensis)(真菌)抗原(Psic1)；古巴裸盖菇(Psilocybecubensis)(真菌)亲环蛋白(Psic2)；西洋梨(Pyruscommunis)(梨)Betv1同系物(Pyrc1)；西洋梨(Pyruscommunis)(梨)异黄酮还原酶同系物(Pyrc5)；西洋梨(Pyruscommunis)(梨)抑制蛋白(Pyrc4)；白栎(Quercusalba)(白橡木)抗原(Quea1)；褐家鼠(Rattusnorvegius)(大鼠)抗原(Ratn1)；蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻)2S白蛋白(Ricc1)；安大略鲑(Salmosalar)(大西洋鲑鱼)小清蛋白(Sals1)；白芥(Sinapisalba)(黄芥末)2S清蛋白(Sina1)；马铃薯(Solanumtuberosum)(土豆)马铃薯糖蛋白(Solt1)；红火蚁(Solenopsisgeminata)(热带火蚁)抗原(Solg2)；红火蚁(Solenopsisgeminata)(热带火蚁)抗原(Solg4)；红火蚁(Solenopsisinvicta)(火蚁)抗原(SolI2)；红火蚁(Solenopsisinvicta)(红火蚁)抗原(SolI3)；红火蚁(Solenopsisinvicta)(红火蚁)抗原(Soli4)；红火蚁(Solenopsissaevissima)(巴西火蚁)抗原(Sols2)；假高粱(Sorghumhalepense)(约翰逊草)抗原(Sorh1)；紫丁香(Syringavulgaris)(丁香)抗原(Syrv1)；太平洋褶柔鱼(Todarodespacificus)(鱿鱼)原肌球蛋白(Todp1)；红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)(真菌)抗原(Trir2)；红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)(真菌)丝氨酸蛋白酶(Trir4)；断发毛癣菌(Trichophytontonsurans)(真菌)抗原(Trit1)；断发毛癣菌(Trichophytontonsurans)(真菌)丝氨酸蛋白酶(Trit4)；黄边胡蜂(Vespacrabo)(欧洲黄蜂)抗原5(Vespc5.0101)；黄边胡蜂(Vespacrabo)(欧洲黄蜂)抗原5(Vespc5.0102)；黄边胡蜂(Vespacrabo)(欧洲黄蜂)磷脂酶(Vespc1)；金环胡蜂(Vespamandarina)(大虎头蜂)抗原(Vespm1.01)；金环胡蜂(Vespamandarina)(大虎头蜂)抗原(Vespm1.02)；金环胡蜂(Vespamandarina)(大虎头蜂)抗原(Vespm5)；绒毛黄蜂(Vespulaflavopilosa)(黄蜂)抗原5(Vesf5)；德国黄蜂(Vespulagermanica)(黄蜂)抗原5(Vesg5)；东方黄蜂(Vespulamaculifrons)(黄蜂)抗原5(Vesm5)；东方黄蜂(Vespulamaculifrons)(黄蜂)透明质酸酶(Vesm2)；东方黄蜂(Vespulamaculifrons)(黄蜂)磷脂酶A1(Vesm1)；西方黄蜂(Vespulapennsylvanica)(黄蜂)抗原5(Vesp5)；南方黄蜂(Vespulasquamosa)(黄蜂)抗原5(Vess5)；长黄蜂(Vespulavidua)(黄蜂)抗原(Vesvi5)；普通黄蜂(Vespulavulgaris)(黄蜂)抗原5(Vesv5)；普通黄蜂(Vespulavulgaris)(黄蜂)透明质酸(Vesv2)；普通黄蜂(Vespulavulgaris)(黄蜂)磷脂酶A1(Vesv1)；玉米(Zeamays)(玉米，玉米)脂质转移蛋白(Zeam14)；和/或它们的组合。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物包括癌症/肿瘤抗原。在某些实施方式中，抗原可以是肿瘤抗原，包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原，诸如，但不限于，α-辅肌动蛋白-4，Bcr-Abl融合蛋白，Casp-8，β-联蛋白，cdc27，cdk4，cdkn2a，coa-1，dek-can融合蛋白，EF2，ETV6-AML1融合蛋白，LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白，HLA-A2，HLA-All，hsp70-2，KIAAO205，Mart2，Mum-1，2，和3，neo-PAP，肌球蛋白I类，OS-9，pmlRARa融合蛋白，PTPRK，K-ras，N-ras，磷酸丙糖异构酶，Bage-L，Gage3，4，5，6，7，GnTV，Herv-K-mel，Lage-1，MageAl，2，3，4，6，10，12，Mage-C2，NA-88，NY-Eso-1/Lage-2，SP17，SSX-2，和TRP2-Int2，MelanA(MART-I)，gp1OO(Pmell7)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-L，GAGE-2，P15(58)，CEA，RAGE，NY-ESO(LAGE)，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，P53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EpsteinBarr病毒抗原，EBNA，人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，pl85erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-2523Hl，PSA，TAG-72-4，CA19-9，CA72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，pCatenin，CDK4，Mum-1，pl6，TAGE，PSMA，PSCA，CT7，端粒酶，43-9F，5T4，791Tgp72，甲胎蛋白，13HCG，BCA225，BTAA，CA125，CA15-3(CA27.29\BCAA)，CA195，CA242，CA-50，CAM43，CD68\KP1，C0-029，FGF-5，G250，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-30Ag，MOV18，NB\70K，NY-C0-1，RCASl，SDCCAG16，TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环素C-相关蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP和TPS。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物可以包括表1中所列的一种或多种变应原。示例粗提取物包括但不限于衍生自表1中列出的变应原来源的提取物。
表1：示例抗原
在某些实施方式中，癌症抗原以粗形式提供，例如，细胞裂解物或细胞成分。示例性的细胞裂解物和/或细胞裂解物成分包括但不限于以下来源的癌细胞：急性淋巴细胞性白血病(ALL)；肾上腺皮质癌；艾滋病相关的癌症，包括AIDS-相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；基底细胞癌；胆管癌；膀胱癌；骨癌(例如，骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)；脑干胶质瘤；脑癌；脑肿瘤；乳腺癌；支气管腺瘤/类癌；伯基特淋巴瘤；类癌(例如，儿童肿瘤和胃肠道肿瘤)；癌(包括原发性未知癌(CUP)，其起源或发育谱系未知，但其上皮细胞具有特异性的分子学、细胞学、和组织学特征)；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤；恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性粒细胞性白血病；慢性骨髓增殖性疾病；结肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；结缔组织增生性小圆细胞恶性肿瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤；食道癌；在尤因家族肿瘤中的尤文肉瘤；颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌；眼内黑色素瘤；视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃癌；胃肠道癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞肿瘤；胃类癌；毛细胞白血病；头部和颈部癌症；心脏肿瘤；肝细胞(肝)癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；下丘脑和视觉通路脑胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；软组织肉瘤；子宫肉瘤；肾癌(肾细胞癌)；喉癌；白血病(包括急性成淋巴细胞白血病或急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓或急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性或慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性或慢性髓细胞性白血病)；嘴唇和口腔癌；脂肪肉瘤；肝癌；肺癌(包括非小细胞和小细胞)；淋巴瘤(例如，AIDS相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统)；巨球蛋白血症；髓母细胞瘤；黑色素瘤；默克尔细胞癌；间皮瘤(例如，成人恶性间皮瘤，儿童间皮瘤)；转移性鳞癌颈部肿瘤；口腔癌；多发性内分泌腺瘤综合征；多发性骨髓瘤；蕈样霉菌病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；粒细胞性白血病；髓细胞白血病(例如，成人急性；鼻腔及鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，卵巢癌，卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低度恶性潜能的肿瘤；胰腺癌；鼻窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；松果体星形细胞瘤；松果体生殖细胞癌；成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体腺瘤；胸膜肺母细胞瘤；前列腺癌；直肠癌；肾盂和输尿管和过渡细胞癌；横纹肌肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌(包括黑色素瘤和非黑色素瘤)；皮肤癌；小肠癌，鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；尿道癌；子宫内膜癌；阴道癌；外阴癌；和/或它们的组合。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒包括一种或多种同种异体抗原。如本文所述，同种异体抗原是指与同种识别和/或移植排斥相关的抗原(例如，免疫排斥反应所针对的抗原)。同种异体抗原通常是由与相同物种的另一个体有遗传学差异的个体表达的多肽。术语“同种异体抗原多肽”是指氨基酸序列包括同种异体抗原的至少一种特征性序列的多肽。本领域已知多种同种异体抗原的序列。
在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原是主要组织相容性复合体(MHC)多肽。在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原是I类MHC多肽。在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原是II类MHC多肽。在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原含有MHC多肽胞外结构域的一部分或全部。在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原是次要组织相容性复合物多肽。在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原是共刺激物质(例如，CD28、CD80、和CD86等)。在某些实施方式中，根据本发明使用的同种异体抗原是由移植组织产生的或在移植组织中存在、而不是由宿主产生的或不在宿主中存在的非MHC蛋白。本领域技术人员可认识到，本文中所描述的同种异体抗原是示例性的。与同种识别和/或移植排斥相关的任何多肽都可以被归类为同种异体抗原。
应该理解的是，同种异体抗原多肽可具有完整序列，或者可以是代表这种完整多肽的功能性片段(即，保留至少一种活性和/或一个特征性序列或部分的片段)的多肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，蛋白质序列通常允许一些替换而不破坏活性。因此，本文使用的相关术语“同种异体抗原多肽”包括任何保留活性并与其他同一类的同种异体抗原相比具有至少约30-40％，通常是大于约50％、60％、70％、或80％的整体序列同一性的多肽，并且进一步通常包括至少一个更高同一性的区域，在一个或多个高度保守区域通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％、或99％，通常包含至少3-4个并高达20个或更多个氨基酸。
在某些实施方式中，包括包封一种以上的多肽(例如，自身抗原和/或同种异体抗原多肽)的纳米颗粒可能是理想的。在某些实施方式中，纳米颗粒可包封一种以上的多肽。在某些实施方式中，根据本发明可以使用纳米颗粒混合物，每一个纳米颗粒包封一种或多种多肽。举例而言，至少有三种不同的自身抗原多肽，胰岛β细胞抗原、胰岛素和谷氨酸脱羧酶(GAD)，被认为对胰岛素依赖型糖尿病(例如，I型糖尿病，缩写为IDDM)有影响。列举另一非限制性示例，认为有几种不同的同种异体抗原多肽影响移植排斥，包括主要组织相容性复合物多肽、次要组织相容性多肽和共刺激物质。本发明的组合物可包括包封一种以上或全部自身抗原或同种异体抗原多肽的纳米颗粒混合物。此外，包括与各种不同类型的自身免疫性疾病相关的自身抗原多肽可能是理想的，从而使得多种自身免疫性疾病被同时治疗。
其他试剂
在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物包括一种或多种其它试剂(例如，佐剂)。不希望被特定理论所束缚，某些实施方式可能会模拟微生物(例如，细菌)细胞的一个或多个特性或特征功能。在某些实施方式中，可以由一种或多种细菌来源提供佐剂，包括细菌细胞裂解物和/或细胞裂解物成分。在某些实施方式中，细菌细胞裂解物成分是或包括被称为病原体相关分子模式(“PAMP”)的物质。在某些实施方式中，一种或多种疏水性细菌细胞裂解物成分和/或亲水性细菌细胞溶裂解物成分中包含一种或多种PAMP作为亲水性细胞成分和/或疏水性细胞成分。
在某些实施方式中，PAMP是与细菌细胞相关的物质，由先天免疫系统的细胞识别。在某些实施方式中，PAMP被植物和动物中均存在的Toll样受体(TLR)和其他模式识别受体(PRR)识别。在某些实施方式中，PAMP被C型凝集素受体(CLR)识别。在某些实施方式中，CLR是I型或II型CLR。在某些实施方式中，PAMP是或包括与细菌细胞外表面相关的物质，包括但不限于，膜相关蛋白和/或肽、嵌入细菌膜的受体等。示例性的PAMP包括但不限于，细菌脂多糖(LPS)、细菌鞭毛蛋白、革兰氏阳性细菌的脂磷壁酸、肽聚糖、双链RNA(dsRNA)、非甲基化CpG基序、表2中列出的任意TLR配体及其特征部分，和/或它们的组合。
表2.示例性的TLR和TLR配体
在某些实施方式中，一种或多种其它试剂是或包括一种或多种佐剂。在某些实施方式中，佐剂是粘膜佐剂(即，能引发或增强对粘膜给药抗原的免疫应答的佐剂)。示例性的粘膜抗原包括，但不限于，TLR4配体(例如，脂多糖、MPL)、细胞因子(例如，IL-1α)、c48/80、R848、Pam3CSK4、CpG(ODN1826)、致死因子(LF)、以及霍乱毒素。本领域技术人员可以意识到，特定的粘膜佐剂可诱导不同的免疫应答。本领域技术人员将理解和意识到，用于选择在特定产品中使用的特定佐剂的技术及其变化在本发明范围之内。
本领域技术人员将认识到，可以用纳米颗粒按照本发明的方法同时和/或依次递送多种抗原分子。出于非限制目的，可以递送一种抗原蛋白的不同抗原分子。也可以递送来源于不同抗原蛋白的不同抗原分子。此外，根据本发明可以递送多种抗原多肽和蛋白质。人们还可认识到，可以用本发明的纳米颗粒将一种或多种抗原多肽和一种或多种细胞因子递送至个体。例如，但非限制性地，可使用本发明的方法通过纳米颗粒递送本发明中的变应性抗原和免疫调节分子，例如，白介素。
本发明包括这样的认识，即，一个特定对象可能从暴露于抗原组合(例如，多种变应原)中获益。在某些实施方式中，需要提供纳米颗粒组合物，其包括与特定对象和/或对象群体相关的多种抗原。例如，在某些实施方式中，特定的提供的组合物包括变应原组合，从而解决特定对象的一些或全部变应性反应，和/或解决人群中通常出现的一些或全部变应性反应。例如，如果一个特定对象对花生和尘螨有变应性反应，那么可设计和制造解决这两种变应性反应的纳米颗粒组合物。或者或另外，在某些实施方式中，可能需要制备包括来源于以下多种变应原的抗原的纳米颗粒组合物：(i)特定团体的成员(例如，由于地理位置)通常暴露于其中的变应原；(ii)对象由一个共同途径(例如，吸入、注射、接触等)暴露于其中的变应原；(iii)使相关人群(例如，地理种群、年龄种群、少数民族等)中变应性反应的发生率高于指定阈值的变应原；(iv)对一种变应原有变应性反应的对象也倾向于对这种变应原有变应性反应，例如，对坚果有变应性反应的对象通常也对山核桃、核桃和开心果有变应性反应；对甲壳类动物(例如，龙虾、蟹、对虾、或小龙虾)或软体动物(例如，蛤蜊、贻贝、牡蛎或扇贝)有变应性反应的对象对各类变应原都有变应性反应，并不仅仅是对一种单一的甲壳类动物或软体动物有变应性反应。
在某些实施方式中，特定的提供的组合物含有除变应原之外的其他抗原的组合。例如，在某些实施方式中，特定的提供的组合物可以含有与特定疾病、障碍或病症(例如，特定的癌症、特定的传染性疾病、特定的移植物宿主或宿主移植综合征等)相关的抗原组合。
本领域技术人员将认识抗原组合物各种各样的潜在应用；每种均在本发明的考虑范围之内。
根据各种实施方式，包含抗原或其他蛋白质剂的组合物可以任何形式包含所述抗原或其他蛋白质剂。示例性形式包括但不限于，RNA、DNA、蛋白质以及它们的组合。在某些实施方式中，所述抗原或蛋白质剂可以是细胞、组织的一部分或其提取物。
纳米颗粒组合物
本发明提供了多种新的和/或改进的纳米颗粒组合物。本发明包含这样的认识，即，通过与一种或多种微生物细胞提取物和/或一种或多种抗原粗制品一起使用，一些已知的纳米颗粒组合物(比如，已在以下一个或多个专利/专利申请中描述的纳米颗粒组合物：美国专利号7,534,448、美国专利号7,534,449、美国专利号7,550,154、US20090239789A1、US20090269397A1、US20100104503A1、US20100151436A1、US20100284965A1、WO2006080951、WO2008115641、WO2008109347、WO2009094273、WO2012167261、和WO2013003157，均并入本文作为参考)的多种优点可以得到充分利用和改进。根据本发明，在某些实施方式中，纳米颗粒与包含多种微生物细胞成分(任选地与一种或多种抗原和/或一种或多种其它试剂)的微生物细胞提取物的组合提供了体现出微生物细胞某些免疫相关特性的改善的纳米颗粒。
本发明进一步包括这样的认识，即，已知的纳米颗粒组合物(比如，已在以下一个或多个专利/专利申请中描述的纳米颗粒组合物：美国专利号7,534,448、美国专利号7,534,449、美国专利号7,550,154、US20090239789A1、US20090269397A1、US20100104503A1、US20100151436A1、US20100284965A1、WO2006080951、WO2008115641、WO2008109347、WO2009094273、WO2012167261和WO2013003157，均并入本文作为参考)可以被充分用于治疗和/或预防变应性反应。在某些实施方式中，本发明提供了包括纳米颗粒与一种或多种变应原的纳米颗粒组合物。在某些这类的实施方式中，本发明提供了包括纳米颗粒与一种或多种相对粗的变应原制品的纳米颗粒组合物。
本发明进一步包括这样的认识，即，已知的纳米颗粒组合物(比如，已在以下一个或多个专利/专利申请中描述的纳米颗粒组合物：美国专利号7,534,448、美国专利号7,534,449、美国专利号7,550,154、US20090239789A1、US20090269397A1、US20100104503A1、US20100151436A1、US20100284965A1、WO2006080951、WO2008115641、WO2008109347、WO2009094273、WO2012167261、和WO2013003157，均并入本文作为参考)，在多种情况下，可以通过与本文所述的一种或多种抗原制品和/或一种或多种微生物细胞提取物和/或一种或多种其它试剂组合，得到合意地利用和/或改进。
在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物包括与一种或多种细胞提取物、一种或多种抗原制品和/或一种或多种其它试剂组合的纳米颗粒，使得某些组合元件被包封在所述纳米颗粒的内腔中。在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物包括与一种或多种细胞提取物、一种或多种抗原制品、和/或一种或多种其它试剂组合的纳米颗粒，使得某些组合元件与纳米颗粒的外表面相关联。在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物包括与一种或多种细胞提取物、一种或多种抗原制品、和/或一种或多种其它试剂组合的纳米颗粒，使得某些组合元件存在于与纳米颗粒内和纳米颗粒上。在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物包括与一种或多种细胞提取物、一种或多种抗原制品、和/或一种或多种其它试剂组合的纳米颗粒，使得某些组合元件与纳米颗粒相混合，但没有特异性地与纳米颗粒内或纳米颗粒上的任何部位相关联。
在一些具体实施方式中，本发明提供了亲水性细胞提取物成分位于纳米颗粒内腔的纳米颗粒组合物；在某些这样的实施方式中，亲水性细胞提取物的所有成分均优先地位于纳米颗粒内腔中；在某些这样的实施方式中，亲水性细胞提取物的所有成分均基本上排他性地位于纳米颗粒内腔中。
在一些具体实施方式中，本发明提供了疏水性细胞提取物成分位于纳米颗粒外表面的纳米颗粒组合物；在某些这样的实施方式中，疏水性细胞提取物的所有成分均优先地位于纳米颗粒外表面上；在某些这样的实施方式中，疏水性细胞提取物的所有成分均基本上排他性地位于纳米颗粒外表面上。
在一些具体实施方式中，本发明提供了亲水性细胞提取物成分(例如，优先地或基本上排他性地)位于纳米颗粒内腔、并且疏水性细胞提取物成分(例如，优先地或基本上排他性地)位于纳米颗粒外表面的纳米颗粒组合物。
在某些实施方式中，例如，当向敏感个体施用过敏性变应原时，需要的是一种或多种微生物成分、一种或多种抗原制品、和/或一种或多种其它试剂全部或基本上全部被包封在提供的组合物的纳米颗粒内腔中。在某些实施方式中，需要的是一种或多种微生物成分、抗原制品、和/或其它试剂定位于纳米颗粒内腔以及纳米颗粒外表面。
关联
根据各种实施方式，可以使用任何一种方法将一种或多种细胞制剂、细胞提取物、一种或多种抗原制品、和/或一种或多种其它试剂与生物可降解和/或生物相容的聚合物相关联。相关联的示例性方法包括但不限于：在高于大气压的压力下混合、掺合或结合，在低于大气压的压力下(例如，真空)混合、掺合或结合。
在某些实施方式中，一种或多种提取物、制品和/或试剂与纳米颗粒表面共价关联。在某些实施方式中，一种或多种提取物、制品和/或试剂与纳米颗粒表面非共价关联。在某些实施方式中，非共价关联涉及将一种或多种成分整合至所述纳米颗粒膜中。在某些实施方式中，非共价关联涉及与纳米颗粒膜或整合至其中的元件的特异性结合。在某些特定的实施方式中，提取物、制品、或试剂的一种或多种特定成分可以与和纳米颗粒膜上的靶点特异性结合的配体相结合。在某些实施方式中，在这种实施方式中使用的配体-靶点组合可以是，例如，生物素-亲和素、抗体-抗原，GST-谷胱甘肽、甘露糖结合蛋白-甘露糖、蛋白A-IgG和/或S-标签。
在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物可包括多组具有一个或多个共同结构和/或功能特性的纳米颗粒。例如，在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物包含多组纳米颗粒，其中每一组均包含将该组成员定位于特定靶点位置的靶向剂(参见美国专利号7,534,448和7,534,449，其整体并入，用于示例性的靶向剂和将靶向剂整合至纳米颗粒的方法)。或者或另外地，在某些实施方式中，提供的纳米颗粒组合物包含多组纳米颗粒，其中每一组均被设计成具有和/或特征在于(例如，在相关组织或感兴趣的器官)具有不同的半衰期、(例如，在内腔或与外表面相关联、不同的抗原群体等)不同的成分。
药物组合物
在某些实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包含提供的纳米颗粒组合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，提供的药物组合物可以通过任何目前已知的或以后药理学领域开发的适当方法制备。一般地，这样的制备方法包括将提供的纳米颗粒组合物成与一种或多种药学可接受的赋形剂相关联的步骤，然后，如有必要和/或需要，将所述产品成形和/或包装成用于给药的适当形式，例如，单一剂量单位或多剂量单位。
在某些实施方式中，组合物可以作为单一单位剂量和/或多个单一单位剂量制备、包装和/或批发出售。本文使用的“单位剂量”是指药物组合物的离散量，其包含预定量的所述纳米颗粒组合物。所述纳米颗粒组合物的量一般等于给对象施用的纳米颗粒的剂量，和/或这种剂量的一部分，例如，这种剂量的二分之一或三分之一。
在许多实施方式中，所述药物组合物特别地制备成用于粘膜递送(例如，口腔、鼻、直肠或舌下递送)。
在某些实施方式中，用于所述药物组合物的适当赋形剂适用于所需的特定剂型，可以包括，例如，一种或多种药学上可接受的溶剂、分散介质、造粒介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂和/或乳化剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂等。可替代地或附加地，可以使用药学上可接受的赋形剂(例如，可可脂和/或栓剂用蜡)、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。Remington的TheScienceandPracticeofPharmacy，21stEdition，A.R.Gennaro(Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2005；通过引用并入本文)公开了用于制备药物组合物的多种赋形剂及其已知的制备技术。
在某些实施方式中，合适的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在某些实施方式中，赋形剂由美国食品和药品管理局批准。在某些实施方式中，赋形剂是药用级的。在某些实施方式中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或其他国际药典的标准。
在某些实施方式中，液体剂型(例如，用于口服和/或肠胃外给药)包括但不限于乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除了所述纳米颗粒组合物外，液体剂型还包含本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脂肪酸酯山梨糖醇，以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于非肠道给药的一些实施方式中，组合物与增溶剂混合，所述增溶剂包括例如醇类、油类、改性油类、乙二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的组合。
在某些实施方式中，可以根据已知的方法使用合适的分散剂、润湿剂、和/或助悬剂来配制注射制剂，例如，无菌的水性或油性悬浮液。无菌液体制剂可以是，例如，溶于在肠胃外可接受的无毒的稀释剂和/或溶剂中的溶液、悬浮液，和/或乳剂，如在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的媒介物和溶剂为，例如，水、林格氏溶液、USP和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，任何温和的不挥发油均可使用，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸(例如，油酸)可以在液体制剂的制备中使用。
液体制剂可以这样进行灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，和/或以无菌固体组合物的形式加入灭菌剂，所述灭菌剂可以在使用前溶解于或分散于无菌水或其他无菌注射介质中。
在某些实施方式中，可以使用一个或多个策略来延长和/或延迟递送纳米颗粒组合物之后的功效。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以配制成栓剂，用于例如直肠或阴道递送。在某些实施方式中，可以通过混合合适的无刺激性赋形剂来制备栓剂制剂，所述无刺激性赋形剂包括，例如，可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡，它们在环境温度下为固体，但在体温下为液体，因此可在体内(例如，在直肠或阴道中)融化并释放所述纳米颗粒组合物。
在某些实施方式中，固体剂型(例如，用于口服给药)包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂、和/或颗粒。在这类固体剂型中，所述纳米颗粒组合物可与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或填充剂或填充剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸酸)、粘合剂(例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如，甘油)、崩解剂(例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠)、溶液阻滞剂(例如，石蜡)、吸收促进剂(例如，季铵化合物)、润湿剂(例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯)、吸收剂(例如，高岭土和膨润土)、润滑剂(例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)以及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可包含缓冲剂。
在某些实施方式中，使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等，类似类型的固体组合物可以用作软和/或硬填充明胶胶囊中的填充剂。可以用包衣和壳，如肠溶衣和药物制剂领域中熟知的其它包衣来制备片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂等固体剂型。
示例性的肠溶衣包括但不限于一种或多种下列物质：邻苯二甲酸乙酸纤维素；丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物；琥珀酸乙酸纤维素；邻苯二甲酸羟基丙基甲基纤维素；乙酸琥珀酸羟基丙基甲基纤维素(醋酸琥珀羟丙甲纤维素)；HP55；聚醋酸乙烯苯二甲酸酯(PVAP)；甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物；甲基丙烯酸共聚物；醋酸纤维素(及其琥珀酸酯和邻苯二甲酸酯版本)；苯乙烯马来酸共聚合物；聚甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物；邻苯二甲酸羟乙基乙基纤维素；乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；四氢邻苯二甲酸醋酸纤维素；丙烯酸树脂；虫胶，以及它们的组合。
在某些实施方式中，固体剂型可任选地包含遮光剂，并且它们以延迟的方式仅在或优先在肠道的某一部分释放所述纳米颗粒组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等，类似类型的固体组合物可以用作软和/或硬填充明胶胶囊中的填充剂。
在某些实施方式中，本发明提供了用于局部和/或透皮递送的组合物，例如，乳剂、搽剂、油膏、油、泡沫、喷雾剂、洗剂、液体、粉末、增稠洗剂或凝胶。特定示例性的这种制剂可以制备成例如产品，所述产品包括，例如，皮肤软化剂、营养洗剂型乳剂、清洁洗剂、清洁霜、皮肤乳剂、润肤洗剂、按摩霜、润肤霜、化妆基、唇膏、面部套装或面部凝胶、清洁制剂如香波、冲洗液、身体清洁剂、头发滋补剂、或肥皂，或皮肤病学组合物如洗剂、软膏、凝胶、霜剂、搽剂、贴剂、除臭剂、或喷雾剂。
在某些实施方式中，佐剂与所述纳米颗粒组合物在同一制剂中一起提供，使得基本上同时向所述个体递送佐剂和所述纳米颗粒组合物。在某些实施方式中，佐剂以单独制剂的形式提供。单独佐剂可在所述纳米颗粒组合物给予之前、之后或同时给予。
在某些实施方式中，所述组合物在一段时间内是稳定的，例如1周、2周、1个月、2个月、6个月、1年、2年、3年、或更长时间。在某些实施方式中，所述组合物容易运输，甚至可以通过传统的快递或其它包裹递送服务发送。因此，某些实施方式在疾病爆发的情况下是有用的，如流行病，或者生物剂(例如，炭疽、天花、病毒性出血热、鼠疫及其他)攻击，至少部分是因为它们能够贮存较长的时间，运送快速、方便、安全。这些属性可以允许所述组合物在所需群体中迅速分布。
在某些实施方式中，在对象的胃肠道的不同位置释放被包封的试剂(例如，抗原)可能是有利的。在某些实施方式中，在对象的口或对象的胃肠道的一个或多个位置释放被包封的试剂(例如，抗原)可能是有利的。因此，在某些实施方式中，多个所述组合物(例如两种或两种以上)可以被施用于单一对象，以促进被包封的试剂在多个位置释放。在某些实施方式中，所述多个组合物均具有不同的释放曲线，例如通过各种肠溶衣提供。在某些实施方式中，所述多个组合物均具有相似的释放曲线。在某些实施方式中，多个组合物包括一种或多种抗原。在某些实施方式中，多个施用的组合物均包括不同的抗原。在某些实施方式中，所述多个组合物均包括相同的抗原。
在某些实施方式中，可包含一种或多种试剂，这些试剂可影响试剂(例如，抗原)从纳米颗粒中的释放速率和/或程度。在某些实施方式中，这样的试剂会通过泄漏或其它不希望的释放(例如，在非靶点的位置和/或非期望的时间释放)而影响释放的速率和/或程度。不希望受任何特定理论的束缚，在某些实施方式中，这种试剂可包被或阻断纳米颗粒表面上的释放位点。在某些实施方式中，这样的试剂可以是单宁酸或包括单宁酸。
给药途径
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可以配制成适用于任何适当的递送途径。在某些实施方式中，所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物可以配制成适用于任何适当的给药途径，包括但不限于，支气管灌注和/或吸入；口腔、肠内、皮内、动脉内(IA)、真皮内、胃内(IG)、髓内、肌肉内(IM)、鼻内、腹膜内(IP)、鞘内、气管内灌注；静脉内(IV)、心室内、粘膜、鼻喷雾和/或气雾剂；口服(PO)，作为口腔喷雾；直肠(PR)、皮下(SQ)、舌下；局部和/或透皮(如通过洗剂、霜剂、搽剂、软膏、粉剂、凝胶剂、滴剂等)、经皮、阴道、玻璃体内、和/或通过门静脉导管；和/或它们的组合。在某些实施方式中，本发明提供了所述纳米颗粒组合物通过粘膜给药的方法。在某些实施方式中，本发明提供了所述纳米颗粒组合物通过口服给药的方法。在某些实施方式中，本发明提供了所述纳米颗粒组合物通过舌下给药的方法。
治疗方法
除其他事项外，本发明提供了向需要的对象给予纳米颗粒组合物的给药方法，所述纳米颗粒组合物包括多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物，至少一种亲水性细胞成分制品包封在所述内腔中，和/或至少一种疏水性细胞成分制品与所述纳米颗粒的外表面相关联。
在某些实施方式中，本发明提供了治疗各种疾病、障碍和/或病症的方法。在某些实施方式中，所述组合物可以施用于对象，用于治疗和/或预防变应性反应、感染、癌症及它们的组合。合适的示例性组合物包括本文中所描述的那些。
变应性反应
除其他事项外，本发明提供了可用于治疗和/或预防变应性反应的方法和组合物。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用作疫苗来预防和/或延缓变应性反应的发生。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物用作疫苗，以减少未来变应性反应的严重性和/或持续时间。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用作治疗剂，以减轻和/或阻止正在进行的变应性反应。在某些实施方式中，有需要的对象正在患有本文所述的变应性疾病，包括但不限于，过敏性鼻炎、哮喘、特应性湿疹、过敏性反应、昆虫毒液、药物过敏、食物过敏、和/或它们的组合。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防与过敏性变应原相关的变应性反应，例如，食物变应原、昆虫变应原和橡胶过敏原(例如，来自胶乳)。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防与食物相关的变应性反应。食物变应性是通过IgE与食物中含有的特异性蛋白间的相互作用介导的。常见的食物变应原实例包括坚果(例如，花生、核桃、杏仁、山核桃、腰果、榛子、开心果、松子、巴西坚果)、乳制品(例如，鸡蛋、牛奶)、种子(例如，芝麻、罂粟、芥菜)、大豆、小麦和鱼(例如，虾、蟹、龙虾、蛤蜊、贻贝、牡蛎、扇贝、小龙虾)中的蛋白质。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防与昆虫变应原相关的变应性反应。常见的昆虫变应原实例包括但不限于来自昆虫中的蛋白，如来自蚤、蜱、蚂蚁、蟑螂和蜜蜂。
在某些实施方式中，当摄入、吸入和/或注射变应原时，变应原引发反应。变应原也可以仅仅基于与皮肤接触而引发反应。胶乳是一个众所周知的例子。乳胶制品是从橡胶树(巴西橡胶树(Heveabrasiliensis))中得到的乳白色液体及其他化学品加工制造的。胶乳中的多种蛋白质可引发一系列的变应性反应。许多产品含有乳胶，如医疗用品和个人防护装备。乳胶敏感人群可以发生两种类型的反应：局部过敏性皮炎和即时系统性过敏(或过敏症)。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防与局部过敏性皮炎相关的变应性反应。局部过敏性皮炎可在接触乳胶后很短的时间内发展，症状一般包括风团或荨麻疹。该反应被认为是变应性反应，通过直接接触触发，而不是通过吸入(Sussmanetal.，1991，JAMA，265:2844；以引用的方式并入本文中)。即时系统性过敏的症状从皮肤和呼吸系统的问题(例如，风团、荨麻疹、结膜炎、口唇、眼睑和喉咙肿胀、气喘和咳嗽)到可能发展为低血压和休克的过敏反应各不相同。这样的反应可通过吸入或皮肤暴露于变应原而触发。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可起到抑制和/或降低对象的TH2型应答和/或增强和/或提高对象的TH1型应答的作用。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可以起到增强和/或提高对象的TH2型应答和/或抑制和/或降低对象的TH1型应答。在某些实施方式中，通过将CpG寡核苷酸(例如，DEC205)靶向细胞表面受体来增强对象的TH2型应答。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物有效地治疗和/或防止对象落入某一特定种类的变应性反应的所有变应性反应。在某些实施方式中，变应性反应的示例性“种类”包括但不限于，过敏性变应性反应和非过敏性变应性反应。在某些实施方式中，变应性反应的示例性“种类”包括但不限于，食物变应性反应、昆虫变应性反应、宠物皮屑变应性反应、花粉变应性反应、草变应性反应、橡胶变应性反应等等。因此，在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗对象的所有食物变应性反应。在某些实施方式中，变应性反应的示例性“种类”包括但不限于，含有多种变应原的特定个别食物。例如，已知至少有十一种花生变应原蛋白。因此，在某些实施方式中，变应性反应的“种类”是“花生”变应性反应，所述纳米颗粒组合物可用于治疗对象所有与全部七种不同的花生变应原蛋白相关的变应性反应。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防单一的变应性反应，即使不包括变应特异性抗原。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防多种不同的变应性反应。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防对象的基本上所有的变应性反应。例如，患有和/或易患变应性反应的对象通常对多于一个变应原有变应性反应，例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个，或更多种不同的变应原。因此，在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防单个患者中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种，或更多种不同的变应性反应。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物施用于患有和/或易患多种不同的变应性反应的对象，例如，至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种，或更多种不同的变应性反应，使得对象的症状减轻和/或改善。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物施用于患有和/或易患多种不同的变应性反应的对象，例如，至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种，或更多种不同的变应性反应，使得对象的症状发生延迟。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可作为口服疫苗来治疗变应性反应。口服疫苗的主要优点之一是能够产生粘膜和系统免疫。虽然以前已经开发了口服疫苗，但它们几乎完全针对传染病的预防，并已经取得了广泛的不同程度的成功。例如，已经开发出了用于炭疽、霍乱、肠胃炎、婴儿腹泻、疟疾、麻疹和肺结核等等的口服疫苗(参见Azizetal.，OralVaccines:NewNeeds，NewPossibilities，2007，BioEssays29.6:591-604；也参见Silinetal.，OralVaccination:Wherearewe？，Exp.Opin.DrugDeliv.，2007，4(4):323-340，其整体通过引用并入本文)。对这种不可预知的结果的原因之一是肠粘膜的复杂性。简单地说，肠道上的粘膜基底分布有肠道或粘膜相关淋巴组织，固有层下面富含上皮内淋巴细胞(有时称为弥漫性淋巴组织)。肠粘膜的大部分T细胞是αβ型或γδ型。在肠粘膜上有CD4和CD8细胞，也有B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和其他免疫细胞。事实上，已知肠道具有人体内～90％的免疫活性细胞，循环淋巴细胞仅包括总淋巴细胞的～2％(参见Silinetal.)。此外，已知肠道容纳～80％的免疫球蛋白或免疫球蛋白产生细胞，并释放循环IgG总产量2至3倍的分泌型IgA(参见Silinetal.)。因此，暴露于肠道环境的任何治疗均有可能产生多种应答，并受到多种免疫细胞或其他细胞的影响。
为了获得治疗变应性反应的有效口服疫苗，需要在抗原呈递细胞(APC)上呈现一种或多种抗原。虽然M-细胞和派尔集合淋巴结是口服疗法的常见靶点，但是也还有其他靶点，包括但不限于，肠细胞、肠系膜淋巴结和肠上皮细胞。可以通过各种实施方式来靶向每个APC。众所周知，口服免疫产生大量的分泌型IgA(sIgA)，已知sIgA对抗病原体的粘膜防御起主要作用。然而，当考虑到非粘膜病原体或情况时，sIgA的价值是有待商榷的。多种实施方式认识到这一点，并且不会引发大量的分泌型IgA释放，而是实质上产生Th2应答。
提供有效口服疫苗的主要已知障碍包括肠道内抗原的蛋白质降解、肠内适当释放方案的协调、以及以合理剂量递送足够抗原的问题。另外，在开发口服疫苗过程中的一个主要关注点是对抗原的口服耐受性。口服耐受性是这样一种现象，即，口服抗原暴露会导致免疫耐受，并对随后的激发产生系统免疫应答抑制。口服耐受性的发展不是口服抗原暴露的自动特征，而是取决于几个因素，包括但不限于，对象的年龄、MHC限制、递送位置、抗原的性质、大小和剂量、抗原摄取的程度、以及抗原施用的处理工艺和频率。口服耐受性被认为是由几个免疫机制介导的，包括：能够下调特异性细胞因子(包括IL-4、IL-10和TGF-β)的调节性T细胞(抑制子)的诱导、效应细胞克隆清除的官能化、以及抗体介导的抑制(参见Silinetal.)。
在某些实施方式中，所述组合物是能够将抗原呈递给APC而不会诱导口服耐受性。不希望被特定理论束缚，与已知的传统口服免疫方法相比，某些实施方式可能可以向免疫系统呈递更多的抗原。据推测，表现出口服耐受性的至少部分可能原因是由于被呈递给APC的非常少量的抗原(参见Silinetal.，Overcomingimmunetoleranceduringoralvaccinationagainstactinobacilluspleuropneumoniae，2002，JVet.Med.49:169-175)。在某些实施方式中，所述组合物将抗原呈递给APC的方式会促进免疫耐受。不希望受特定理论的束缚，在某些临床情况下促进免疫耐受可能是有利的，例如，在全身型过敏性反应、自身免疫性疾病、或某些传染性疾病(包括但不限于，登革热和RSV)的情况下。
感染
在某些实施方式中，有需要的对象患有由，包括但不限于，病毒、朊病毒、细菌、类病毒、大型寄生虫、真菌和/或它们的组合引起的感染。在某些实施方式中，对象患有初次感染。在某些实施方式中，对象患有继发感染。在某些实施方式中，对象患有活跃的症状性感染。在某些实施方式中，对象患有活跃的无症状感染(即，感染是活跃的，但不会产生明显的症状；例如，沉默或亚临床感染)。在某些实施方式中，对象患有潜伏性感染(即，不活跃的或休眠性感染)。
可通过某些实施方式得到治疗的示例性感染包括但不限于，放线菌病、非洲昏睡病、艾滋病、炭疽、出血热、细菌性肺炎、念珠菌病、蜂窝组织炎、南美锥虫病、水痘、霍乱、艰难梭菌感染、雅克二氏病、登革热、白喉、埃博拉、肠球菌感染、食物中毒、坏疽、淋病、链球菌感染、甲型到戊型肝炎、疱疹、钩虫、单核细胞增多症、利什曼病、麻风病、莱姆病、疟疾、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、结膜炎、百日咳、狂犬病、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、风疹、传染性非典型肺炎、疥疮、败血症、带状疱疹、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核病、土拉菌病、病毒性肺炎、西尼罗河热和黄热病。
不希望受到特定理论的束缚，可以预期某些实施方式能维持在其他免疫妥协对象中的抗菌免疫监视。例如，患有病毒感染或其他免疫妥协病症的对象通常可以表现出细菌耐药性降低，但是，给予所述组合物可以减少或消除对象表现出来的细菌耐药性降低的程度。在某些实施方式中，所述组合物以规律间隔给药，以维持抗菌免疫监视。在某些实施方式中，所述组合物施用于患有或易患非细菌免疫激发的对象。在某些实施方式中，所述组合物施用于近期已经患有非细菌免疫激发的对象。
癌症
在某些实施方式中，有需要的对象患有癌症，包括但不限于，急性淋巴细胞白血病(ALL)；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症(包括AIDS-相关淋巴瘤)；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；基底细胞癌；胆管癌；膀胱癌；骨癌(例如，骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)；脑干胶质瘤；脑癌；脑部肿瘤；乳腺癌；支气管腺瘤/类癌；伯基特淋巴瘤；类癌(例如儿童和胃肠道肿瘤)；癌症(包括原发性未知癌(CUP)，其起源或发育谱系未知，但其上皮细胞具有特异性的分子学、细胞学、和组织学特征)；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤；恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性粒细胞性白血病；慢性骨髓增殖性疾病；结肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；结缔组织增生性小圆细胞恶性肿瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤；食道癌；尤因肿瘤家族的尤文肉瘤；颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌；眼内黑色素瘤；视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃癌；胃肠道癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞肿瘤；胃类癌；毛细胞白血病；头部和颈部癌症；心脏肿瘤；肝细胞(肝)癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；下丘脑和视觉通路脑胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；软组织肉瘤；子宫肉瘤；肾癌(肾细胞癌)；喉癌；白血病(包括急性淋巴细胞白血病或急性淋巴细胞性白血病，急性骨髓性或急性骨髓性白血病，慢性淋巴细胞性或慢性淋巴细胞性白血病，慢性骨髓性或慢性髓细胞性白血病)；嘴唇和口腔癌；脂肪肉瘤；肝癌；肺癌(包括非小细胞和小细胞)；淋巴瘤(如AIDS相关，伯基特，皮肤T细胞，霍奇金，非霍奇金，原发性中枢神经系统)；巨球蛋白血症；髓母细胞瘤；黑色素瘤；默克尔细胞癌；间皮瘤(如成人恶性间皮瘤，儿童间皮瘤)；颈部转移性鳞状上皮癌；口腔癌；多发性内分泌腺瘤综合征；多发性骨髓瘤；蕈样霉菌病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；粒细胞性白血病；髓细胞白血病；(如成人急性；鼻腔及鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，卵巢癌，卵巢上皮癌(上表皮-间质瘤)；卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低度恶性潜伏性肿瘤，胰腺癌；鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体星形细胞瘤，松果体生殖细胞瘤；成松果体细胞瘤和始神经外胚叶肿瘤；垂体腺瘤；胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，直肠癌；肾盂和输尿管和过渡细胞癌，横纹肌肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌(包括黑色素瘤和非黑色素瘤)；皮肤癌；小肠癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；尿道癌；子宫内膜癌；阴道癌；外阴癌；和/或它们的组合。
给药方案
在某些实施方式中，所述药物组合物可根据足够实现期望的免疫反应的给药方案给药。例如，在某些实施方式中，如果施用于一个相关的患者群体，可显示出与所期望免疫反应的达成具有统计上显著的相关性，则认为给药方案足够达到所期望的免疫反应。
在某些实施方式中，期望的免疫反应是指变应性反应症状的程度和/或患病率减少至少约20％、约25％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或更多。
在某些实施方式中，所述药物组合物根据足以使给药患者人群中特定百分比的患者的变应性反应症状程度和/或发病率降低的给药方案进行给药。在某些实施方式中，给药患者群体中特定百分比的患者为至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或更多。
举少量例子进行说明，在某些实施方式中，根据给药方案给予至少一种所述药物组合物足以使给药患者群体中至少约50％的患者的变应性反应程度和/或发病率降低至少约20％。在某些实施方式中，根据给药方案给予至少一种所述药物组合物足以使给药患者群体中至少约50％的患者的变应性反应程度和/或发病率降低至少约30％。
在某些实施方式中，至少一种所述药物组合物根据足以实现变应性反应的症状发作延迟的给药方案进行给药。在某些实施方式中，至少一种所述药物组合物根据足以防止一种或多种变应性反应的症状发作的给药方案进行给药。
在某些实施方式中，所述给药方案包括单一剂量或由单一剂量组成。在某些实施方式中，所述给药方案包含多次剂量或者由多次剂量组成，每次剂量通过可能有变化或可能没有变化的时间间隔彼此分离。在某些实施方式中，所述给药方案包括以下方案或由以下方案组成：每20年一次、每10年一次、每5年一次、每4年一次、每3年一次、每2年一次、每年一次、每年两次、每年3次、每年4次、每年5次、每年6次、每年7次、每年8次、每年9次、每年10次、每年11次、每月一次、每月两次、每月三次、每周一次、每周两次、每周三次、每周4次、每周5次、每周6次、每天一次、每天两次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次、每天7次、每天8次、每天9次、每天10次、每天11次、每天12次、或每小时一次。
在某些实施方式中，所述给药方案包括起始剂量和一个或多个加强剂量，或者由起始剂量和一个或多个加强剂量组成。在某些实施方式中，一个或多个加强剂量在初始剂量之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、1个月、2个月、6个月、1年、2年、5年、10年、或者超过10年施用。在某些实施方式中，初始剂量包括一段时间内给予的一系列剂量。例如，在某些实施方式中，初始剂量包括以规律的间隔给予一系列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多次剂量，所述规律的间隔，例如，在时间上彼此接近的间隔，例如5分钟间隔、10分钟间隔、15分钟间隔、20分钟间隔、25分钟间隔、30分钟间隔、45分钟间隔、一小时间隔、2小时间隔等。
在某些实施方式中，初始剂量和加强剂量包含相同量的所述纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物。在某些实施方式中，初始剂量和加强剂量包含不同量的所述纳米颗粒组合物。在某些实施例中，所述纳米颗粒组合物的剂量水平足以每天递送按照对象体重计约0.001mg/kg至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约50mg/kg，优选地约0.1mg/kg至约40mg/kg，约0.5mg/kg至约30mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，或约1mg/kg至约25mg/kg，每天一次或多次。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物被配制成单位剂量。在某些实施方式中，单位剂量是约10mg、约25mg、约50mg、约100mg、约250mg、约500mg、约1g、约5g、约10g、约25g、约50g、约100g、或大于约100g。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物在特定单位剂量中的量取决于被给予该组合物的对象。举几个例子，在某些实施方式中，适合小鼠的单位剂量小于适合大鼠的单位剂量，而适合大鼠的单位剂量小于适合狗的单位剂量，适合狗的单位剂量小于适合人的单位剂量。
在某些实施方式中，所述给药方案包括在对象完整生命周期内给予多剂量，或者由在对象完整生命周期内给予多剂量组成。在某些实施方式中，所述给药方案包括在几年的过程中(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100年)给予多剂量。在某些实施方式中，所述给药方案包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月的时间段里给予多剂量。
在某些实施方式中，当所述组合物用于治疗变应性反应时，在第一次给药之前，通过一种或多种方法来确定对象的变应性反应基线，所述方法包括但不限于，(1)对对象的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或大于20种变应原进行点刺皮肤试验(PST)，并测定对PST的风团和潮红应答；(2)测定血清IgE水平；(3)在对象暴露于他的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或大于20种变应原中的一种或多种时，记录对象自己对典型症状的描述(例如，症状的性质、严重性和/或持续时间)；(4)将对象暴露于一定剂量的他的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或大于20种变应原中的一种或多种(例如，仅仅有很小的或者不存在的过敏反应风险)；(5)测定一种或多种分子标记物的表达(例如，水平、空间分布、时间分布等等)，所述分子标记物包括但不限于，T细胞标记物CD4+和/或CD8+；(6)进行嗜碱性组胺释放测定；和/或它们的组合。在某些实施方式中，在整个治疗方案过程中和/或治疗方案完成后，例如，以规律的间隔，使用例如如上所述的方法(1)至(6)的任意组合来监控对象的变应性应答。在某些实施方式中，每天、每周、每两周、每月、每年6次、每年4次、每年3次、每年2次、每年一次、每2年、每5年、和/或每10年等监控变应性应答。
在某些实施方式中，用单一变应原和/或多种变应原激发对象，所述变应原是，例如，对象的变应原(例如，已知会引起对象变应性反应的变应原)的子集，和/或对象所有的变应原(例如，已知会引起对象变应性反应的变应原)。在某些实施方式中，变应性反应激发在开始治疗后1周、2周、1个月、2个月、6个月、和1年进行。
在某些实施方式中，所述组合物可以通过任何医学上可接受的途径给药。例如，在某些实施方式中，所述组合物可以通过静脉内给药、皮内给药、经皮给药、口服给药、皮下给药、粘膜给药、和/或它们的组合。在某些实施方式中，经粘膜给药的示例性途径包括但不限于口腔给药、鼻腔给药、支气管管理、阴道给药、直肠给药、舌下给药、和/或它们的组合。
组合治疗
在某些实施方式中，所述药物组合物与一种或多种其他治疗剂或疗法组合施用于对象，从而使对象同时暴露于两种治疗，例如，所述其他治疗剂或疗法可用于治疗一种或多种可由相关药物组合物治疗的疾病、障碍或病症。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物用于一种药物制剂，所述药物制剂独立于且不同于含有其它治疗剂的药物制剂。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物与包含其它治疗剂的组合物混合。换言之，在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物是单独生产的，并且所述纳米颗粒组合物与包含其他治疗剂的另一种组合物简单混合。
组合方案中使用的治疗(物质和/或程序)的特定组合会考虑所需的物质和/或程序的兼容性和所希望实现的治疗效果。在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物可与一种或多种其它治疗剂(例如，所需的已知变应性反应治疗剂)同时给药、之前给药或之后给药。
应该理解的是，采用的治疗对同一障碍可以达到所需的效果(例如，用于治疗变应性反应的纳米颗粒组合物可以与也可用于治疗变应性反应的已知变应性反应治疗剂同时给药)，或者它们可以达到不同的效果(例如，用于治疗变应性反应的纳米颗粒组合物可以与用于减轻不良副作用(例如，炎症，恶心等)的治疗剂同时给药)。在某些实施方式中，根据本发明的纳米颗粒组合物与经过美国食品和药品管理局(FDA)批准的第二治疗剂一起给药。
本文使用的术语“与……组合”和“与......一起”是指所述纳米颗粒组合物可与一种或多种其他所需治疗剂同时给药、在一种或多种其他所需治疗剂之前或者之后给药。在一般情况下，每种物质将以该试剂确定的剂量和/或时间表给药。
例如，在某些实施方式中，用于治疗变应性反应的所述药物组合物在某些实施方式中与例如一种或多种抗组胺药(即，组胺拮抗剂)、皮质类固醇(包括糖皮质激素)、肾上腺素、茶碱(二甲黄嘌呤)、色甘酸钠、抗白三烯、抗胆碱能药、减充血剂、肥大细胞稳定剂、免疫疗法(逐渐增大剂量的特定变应原)、抗IgE单克隆抗体(例如，奥马珠单抗)、和/或它们的组合一起给药。
示例性的抗组胺剂包括但不局限于，氮卓斯汀；溴苯那敏；布克利嗪；溴苯海拉明；卡比沙明；西替利嗪；赛克利；扑尔敏；氯苯海拉明；氯马斯汀；赛庚啶；氯雷他定；右溴苯那敏；右旋氯苯那敏；右旋氯苯吡胺；二甲茚；苯海拉明(苯海拉明)；多西拉敏；依巴斯汀；恩布拉敏；非索非那定；左西替利；氯雷他定；奥洛他定(帕坦洛)；苯茚胺(Nolahist和瑟福林)；非尼拉敏(艾薇儿(Avil))；苯托沙敏；异丙嗪；比拉明；卢帕他定；吡苄明；曲普利啶；和/或它们的组合。
示例性的皮质类固醇和糖皮质激素包括但不限于，二丙酸倍氯米松和倍氯米松(宝丽亚、Qvar、BeconaseAQ、Alanase、Vancenase)；布地奈德(雷诺考、Rhinosol、普米克、Budicort、信必、Noex)；环索奈德(Alvesco、Omnaris、Omniair)；氟尼缩松(Aerobid)；氟替卡松(Veramyst)；氟替卡松(丙酸氟替卡松)；莫米松和糠酸莫米松(内舒拿)；曲安奈德(NasacortAQ)；强的松；甲基强的松龙(Depo-Medrol)；曲安奈德(曲安缩松)；和/或它们的组合。
色甘酸钠的示例性形式包括但不限于，瑞纳咳乐(Rynacrom)、那萨咳乐(Nasalcrom)、普瑞瓦林(Prevalin)、因泰尔(Intal)、奥普托咳乐(Optocrom)、爱滴氏(Optrex)、盖斯托咳乐(Gastrocrom)、因特咳乐(Intercron)和/或它们的组合。
示例性的抗白三烯和白三烯抑制剂(或改性剂)包括但不限于，孟鲁司特(顺尔宁、蒙特罗-10(Montelo-10)、蒙特福(Monteflo))、扎鲁司特(安可来、安可雷特(Accoleit)、万特可(Vanticon))、普鲁司特、齐留通(Zyflo、ZyfloCR)、和/或它们的组合。
示例性的抗胆碱能药包括但不限于，溴化异丙托品(定喘乐爱普温特(Apovent)、艾普如扎(Ipraxa)、艾温特(Aervoent))；可比特(异丙托溴铵和沙丁胺醇)；苯扎托品(Cogentin)；氧托(氧凡特)；噻托溴铵(思力华)；格隆溴铵(胃长宁)；奥昔布宁(尿多灵(Ditropan)、Driptane，LyrinelXL)；托特罗定(布迈定(Detrol)、得妥)；氯苯那敏(氯屈米通)；苯海拉明(苯那君，Sominex，艾德威尔等)；晕海宁(捉迷明)；安非他酮(载班，威博隽)；六甲铵；筒箭毒碱；右美沙芬；美加明；多撒库铵；和/或它们的组合。
示例性的减充血剂包括但不限于，麻黄碱、左旋甲基苯丙胺、萘甲唑啉、羟甲唑啉、苯肾上腺素、苯丙醇胺、六氢脱氧麻黄碱、辛弗林、四氢唑啉、和/或它们的组合。
示例性的肥大细胞稳定剂包括但不限于，色甘酸、酮替芬和富马酸酮替芬(再得特(Zaditor)、再得坦(Zaditen)、奥威(Alaway)、仙特明痒眼药水、开瑞坦)、甲基黄嘌呤、和/或它们的组合。
在某些实施方式中，可与本发明所述的纳米颗粒组合物组合给药的示例性已知变应性反应治疗剂包括但不限于，美国专利号5558869、5973121、6835824、6486311和/或7485708，和/或美国专利公开号2003/0035810，2003/0202980，2004/0208894，2004/0234548，2007/0213507，2010/0166802和/或2011/0027298中描述的任何治疗剂，所有这些都以引用方式并入本文。
作为一个附加的例子，在某些实施方式中，用于治疗传染病的药物组合物可以与抗生素联合给药，例如，抗菌剂、抗病毒剂、和/或抗真菌剂。在某些实施方式中，药物组合物可以与疫苗联合给药。
示例性的抗菌剂包括但不限于：磺胺；叶酸类似物；β-内酰胺类，例如，青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类；氨基糖苷类，例如，链霉素、卡那霉素、新霉素和庆大霉素；四环素类，例如，金霉素、土霉素、强力霉素；大环内酯类；林可酰胺类；链阳性菌素；氟喹诺酮类，利福平，莫匹罗星，环丝氨酸，氨基环醇，糖肽，恶唑烷酮，及其衍生物/类似物和/或它们的组合。
示例性的抗病毒剂包括但不限于，阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚胺、安普那韦、安普利近、阿比朵尔、阿扎那韦、立普妥、波西普韦、西多福韦、可比韦、地瑞那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、廿二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、进入抑制剂、泛昔洛韦、福米韦生、膦沙那韦、膦甲酸、膦乙醇(Fosfonet)、伊缪洛韦(Imunovir)、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、索拉菲尼(Nexavir)、核苷类似物、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普拉康纳利、鬼臼毒素、雷特格韦、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、嘧啶、沙奎那韦、司他夫定、茶树油、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦、替拉那韦、三氟尿苷、阿巴卡韦、醋胺金刚烷、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、维科韦洛韦(Vicriviroc)、阿糖腺苷、韦拉米啶、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定，及其衍生物/类似物和/或它们的组合。
示例性的抗真菌剂包括但不限于，多烯剂，例如，两性霉素、杀念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、游霉素、制霉菌素和龟裂霉素；咪唑、三唑和噻唑剂，例如，联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、埃博康唑(alboconazole)、氟康唑、艾沙康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑和阿巴芬净；烯丙胺，例如，阿莫罗芬、布替萘芬、那福他芬(naftafine)和特比萘芬；以及棘球白素，例如，阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净，及其衍生物/类似物和/或它们的组合。
作为附加示例，在某些实施方式中，用于治疗癌症的所述药物组合物可以与例如烷基化剂、抗代谢剂、和/或其他抗癌药物联合给药。
示例性的烷基化剂包括但不限于，多官能烷基化剂，例如，环磷酰胺(癌得星)、双氯乙基甲胺、迈尔芬(melphan)(爱克兰)、苯丁酸氮芥(瘤可宁)、三亚乙基硫代磷酰胺(thiopeta)(塞替派(Thioplex))和白消安(马利兰)；丙卡巴肼，达卡巴嗪，六甲蜜胺，顺铂，及其衍生物/类似物和/或它们的组合。
示例性的抗代谢剂包括但不限于：甲氨蝶呤；嘌呤拮抗剂，例如，巯基嘌呤(6-MP)、硫鸟嘌呤(6-TG)、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、和喷司他丁；嘧啶拮抗剂，例如，氟尿嘧啶、阿糖胞苷、和阿扎胞苷；植物生物碱，例如，长春花碱(Velban)、长春新碱(长春新碱)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(Vimon)、托泊替康(Hycamtin)、伊立替康(CAMPTOSAR)、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(泰素帝)及其衍生物/类似物和/或它们的组合。
示例性的其它抗癌剂包括但不限于，安吖啶；羟基脲(Hydrea)；天冬酰胺酶(El-spar)；米托蒽醌(诺肖林)；米托坦；视黄酸，骨髓生长因子，氨磷汀，及其衍生物/类似物和/或它们的组合。
试剂盒
本发明提供包含疫苗和/或治疗组合物的试剂盒，所述治疗组合物包括所述纳米颗粒。在某些实施方式中，试剂盒可包括(i)至少一种所述纳米颗粒组合物；和(ii)至少一种药学上可接受的赋形剂；和，任选地，(iii)使用说明书。
在某些实施方式中，试剂盒包含多剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多)的所述纳米颗粒组合物。在某些实施方式中，试剂盒包含多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多)具有不同功能元件(例如，微生物模仿实体)的所述纳米颗粒群体。在某些实施方式中，所述纳米颗粒的多个群体在所述试剂盒中彼此分离包装。在某些实施方式中，所述试剂盒包括所述组合物和与所述组合物一起施用的一种或多种其他治疗剂。
在某些实施方式中，本发明提供了包括用于本发明所述的治疗方法的纳米颗粒组合物的药物包装或试剂盒。在某些实施方式中，药物包装或试剂盒包括制剂或药物组合物，其包括在一个或多个容器中的纳米颗粒组合物，所述容器任选地装有本发明所述的药物组合物的一种或多种额外成分。在某些实施方式中，药物包装或试剂盒包括额外的经批准可与本发明所描述的治疗联合使用的治疗剂。可选地，与这些容器相关联的可以是监管药品制造、使用或销售的政府部门规定形式的通知书，该通知书反映了该政府部门批准可制造、使用或销售用于人类给药。
在某些实施方式中，提供了包括所述纳米颗粒组合物和使用说明书的试剂盒。因此，可以在试剂盒中提供药学剂量或使用说明书，用于向患有和/或易患变应性反应的个体给药。
具体实施例
实施例1：大肠杆菌水性提取物的制备
本实施例描述了用于本发明的微生物细胞(这里指大肠杆菌)水性提取物的制备，所述提取物含有细胞的亲水性成分。
本实施例描述了使用标准可用程序制备大肠杆菌水性提取物(即大肠杆菌细胞培养物的水性提取物；“AEE”)。生产菌株可以是大肠杆菌的常见非致病性菌株。在临床生产之前，可以建立生产菌株的主细胞库和工作细胞库。
从高细胞密度发酵液中获取细胞，然后将介质换成磷酸盐生理缓冲液(PBS)，其含有5mM乙二胺四乙酸(EDTA)作为蛋白酶抑制剂。将悬浮在PBS-EDTA中的细胞进行匀浆(例如，使用弗氏压碎器)，然后澄清以除去细胞碎片。将澄清的提取物进行处理(例如，使用微热处理)以灭活剩余的酶。如果有必要的话，将得到的提取物再次澄清，在用于纳米颗粒生产工艺之前冷冻贮存。除了包括细菌蛋白质和DNA之外，预计AEE还包括LPS。在某些实施方式中，以某种方式处理AEE的一种或多种成分，例如，剪切DNA以便将大片段拆散成更适合纳米包封的小片段，从而促进纳米包封。
表3中列出了AEE的示例性说明。鉴于蛋白质和LPS均在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析中呈现出带型，预计SDS-PAGE图谱会太复杂而不能提供条带之间有意义的比较。酮基-脱氧辛酮糖酸(KDO)是仅在细菌LPS中发现的碳水化合物，可用于提取物中LPS含量测定的替代试验。
表3：大肠杆菌水性提取物的说明
BCA＝二喹啉甲酸；CFU＝菌落形成单位；DNA＝脱氧核糖核酸；KDO＝酮基-脱氧辛酮糖酸；LAL＝鲎变形细胞溶解物；LPS＝脂多糖；NMT＝不超过；TBD＝待定；USP＝美国药典
实施例2：大肠杆菌疏水性提取物的制备
本实施例描述了用于本发明的微生物细胞有机提取物的制备，所述提取物含有细胞的疏水性成分。
本实施例描述了使用标准可用程序制备大肠杆菌疏水性(有机)提取物(即，大肠杆菌细胞培养物的有机提取物，“OEE”)。用于制备AEE的相同生产菌株可以用于制备OEE。与AEE一样，生产菌株可以是大肠杆菌的常见非致病性菌株。在临床生产之前，可以建立生产菌株的主细胞库和工作细胞库。
简单地说，使用公知的苯酚-氯仿-石油醚方法制备提取物，不同之处在于使用己烷代替石油醚，因为石油醚是药学上不可接受的溶剂。将干燥的细菌细胞悬浮于苯酚-氯仿-己烷(PCH)混合物中约30分钟。然后将浆料离心以去除剩余的细胞。然后再将剩余的细胞用PCH处理两次。将合并的有机提取物蒸发以去除挥发性有机溶剂。将水滴加至苯酚浓缩液以沉淀LPS和脂质。然后用95％的苯酚洗涤沉淀的OEE，接着用丙酮洗涤，使之悬浮在水中，冷冻干燥，在用于纳米颗粒生产工艺之前冷冻贮存。预期OEE主要包括细菌LPS和脂质。
表4中列出了OEE的示例性说明。可以预期，基本上没有蛋白质或核酸被提取到OEE中。
表4：大肠杆菌有机提取物的说明
CFU＝菌落形成单位；KDO＝酮基-脱氧辛酮糖酸；LAL＝鲎变形细胞溶解物；LC/MS＝液相色谱/质谱；LPS＝脂多糖；NMT＝不超过；TBD＝待定；USP＝美国药典
实施例3：制备纳米颗粒组合物，其包括包封的大肠杆菌亲水性成分和与表面相关联的大肠杆菌疏水性成分
本实施例描述了使用双乳化(水包油包水)过程制备E-纳米颗粒(即，含有大肠杆菌亲水性和/或疏水性提取物制品的纳米颗粒)的示例性方法。简言之，蛋白质浓度约为60mg/ml的AEE用于重新组成浓度也为60mg/ml的变应原提取物(例如，尘螨或花生)。也可以使用更高或更低浓度的AEE和/或变应原提取物。AEE-变应原提取物溶液以0.20mL:28mL的水-有机比例在PLGA的二氯甲烷(约35.7mg/ml)溶液中匀浆。将此混合物指定为第一乳剂，它包含或基本上由OEE中的AEE纳米液滴(在本实施例中包括抗原、DNA和LPS)组成。
在某些实施方式中，例如，当希望增加与表面相关联的疏水性成分(例如，LPS)的水平时，可以将如上述实施例2中所述的OEE溶解在总LPS浓度约为2.2mg/mL的5％PVA水溶液中。也可以使用更高或更低浓度OEE的PVA溶液。将一半第一乳剂(14mL)加入OEE-PVP溶液(14mL)中并匀浆。将此混合物指定为第二乳剂，此混合物与上述第一乳剂(即在OEE中的AEE纳米液滴)具有若干结构相似性。
将第一或第二乳剂(28ml)(如果产生的话)加入935mL0.33％PVA水溶液中，并搅拌约4小时使二氯甲烷蒸发。将纳米颗粒悬浮液浓缩，并通过离心分离纳米颗粒。去除上清液后，将纳米颗粒用水洗涤2～3次，再悬浮于水中，并通过冷冻干燥分离。在本实施例中，DNA、LPS和抗原分布在整个纳米颗粒中，LPS和脂质包被在表面上。本实施例中的纳米颗粒直径约为450nm+/-150nm。
实施例4：经口服给药的包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒的体内脱敏研究
本实施例描述了评价经口服给药的纳米颗粒组合物的体内脱敏效应的示例性研究，所述纳米颗粒组合物包括包被了CpG的PLGA纳米颗粒中相对较粗的抗原(特别地，花生提取物)，还进一步通过评价花生致敏动物中的过敏可能性评估了所述纳米颗粒的安全性。
除其他事项外，本实施例描述了给予示例性的纳米颗粒组合物，当所述纳米颗粒组合物经口服给予花生致敏小鼠时，与溶媒对照小鼠相比，导致对随后的口服花生激发脱敏。
材料和方法
包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒
除其他事项外，本实施例描述了包含包封的花生(Arachishypogaea)变应性提取物的纳米颗粒。简而言之，将市售带壳烤花生(WhiteRoseBrand,NJ)脱壳，在磷酸盐生理缓冲液(PBS，pH7.4)中匀浆，然后进行丙酮提取。通过二喹啉甲酸(BCA)测定法确定PBS中花生蛋白的终浓度为13.2mg/mL。
在制备纳米颗粒之前，用AmiconUltra-4离心过滤装置和Ultracel-3膜(3kDa截留；Millipore，产品目录编号UFC8-003)浓缩13.2mg蛋白质/ml花生提取液。通过BCA测定法确定蛋白质的终浓度为27.3mg/mL。
使用双乳化法制备包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒。为了使最终产品中的内毒素最小化，所有玻璃器皿均在250℃下烘烤2小时，塑料仪器使用Pyro-Clean(AlerChek,Inc.，产品目录编号I30103)去污30分钟，随后用超纯水(Millipore，产品目录编号H20CC1006)洗涤。
共计0.7mL浓缩花生提取物的PBS(19mg花生蛋白)溶液被逐滴加入14mL25mg/mLPLGA的二氯甲烷溶液中(ThermoFisherScientific，产品目录编号D65100)，分装为4管。用于NP-401制备的PLGA为具有酯末端基团的50:50聚DL-丙交酯共乙交酯，特性粘度为0.95-1.2dL/g(Durect，产品编号B6010-4)。将得到的悬浮液进行简单地涡旋震荡，然后用具有CV26超声波仪(38％振幅)的Tekmar超声分配器超声处理30秒，每10秒间隔一次，并在每次超声处理之间冰冻30秒。
对于第二乳剂，与第一乳剂合并并逐滴加入到14mL1.25％的聚乙烯醇(w/v)(PVA,SigmaAldrich,产品目录编号P8136)、1％脱氧胆酸钠(w/v)、1.25mg/mL亲和素蛋白-棕榈酸酯，分装成四管。将得到的悬浮液进行简单地涡旋震荡，然后用具有CV26超声波仪(38％振幅)的Tekmar超声分配器冰上超声处理30秒。
纳米颗粒制备中使用的亲和素蛋白-棕榈酸酯通过以下方法制备：将5mg/mL的亲和素蛋白(EMDMillipore，产品目录编号189725)在2％脱氧胆酸钠(Sigma-Aldrich，产品目录编号D6750)与15倍摩尔过量的棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich，产品目录编号P1162)在37℃下共同孵育3小时。过量的棕榈酸通过在37℃下、在2％脱氧胆酸钠浴中透析24小时去除。
将第二乳剂混合并立即加入烧杯中350mL室温(RT)的0.3％PVA(w/v)中。通过搅拌棒搅拌3小时，在室温下蒸发二氯甲烷。通过4℃下18,500g离心15分钟收集纳米颗粒。将沉淀重悬浮于10mL超纯水中，在4℃下18,500g离心15分钟，然后将上清液轻轻倒出。此洗涤步骤总共重复3次。然后将得到的纳米颗粒快速冷冻，干燥，并贮存在-20℃下。
在使用前立即将纳米颗粒用CpG-生物素进行标记。合成具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡脱氧核苷酸1826(5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'SEQIDNO：1)，并将其偶联到生物素上(5'端)。为了进行标记，将包封了PLGA的花生提取物纳米颗粒和CpG-生物素悬浮于pH值为7.4的无菌PBS中，纳米颗粒量分别为7.34mg纳米颗粒/mL和3.67μg/mL(0.5μg/mg纳米颗粒)，涡旋，然后室温孵育15分钟。标记材料不进行进一步处理，立即用于研究。包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒的表征
通过液相斯托克斯扩散颗粒跟踪系统(NanoSight；Wiltshire,U.K.)测量颗粒尺寸。包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(以下可互换称为“包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒”和/或“试剂”)平均颗粒直径为214±39nm。
通过将纳米颗粒室温下过夜溶解在0.2N的氢氧化钠中，使用微BCA蛋白测定法(Pierce，产品目录编号23235)测定总蛋白。使用以下两种蛋白质标准品：在PBS、0.2NNaOH中的花生提取物和在PBS、0.2NNaOH中的牛血清白蛋白(BSA；在BCA试剂盒中提供)。对照纳米颗粒包括包封花生提取物而不含亲和素的PLGA纳米颗粒、空白亲和素-棕榈酸酯纳米颗粒、以及无亲和素的空白纳米颗粒。将上述对照纳米颗粒溶解在相同的缓冲液中，用于校正来自亲和素和PLGA的测定背景信号。包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒装载有54.53μg蛋白质/mg纳米颗粒。
对完整的纳米颗粒进行微BCA测定来测量总亲和素，从而量化表面蛋白。包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒含有25.28±0.31μg亲和素/mg纳米颗粒。在本研究使用的CpG-生物素标记条件下(如上所述)，预期加入的所有CpG-生物素均被连接到纳米颗粒上，溶液中没有游离的CpG。因此，预期包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒包被有0.5μg/mgCpG-生物素/mg纳米颗粒。
剂量制备及分析
最终包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒在每个给药日新鲜配制。简言之，包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒和CpG-生物素悬浮于pH7.4的无菌PBS中，然后在室温下孵育15分钟以便进行标记(如上所述)。CpG-生物素标记的包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒保持在室温直至给药完成，并且制备后30分钟内使用。本研究没有进行制剂分析。
研究设计和实验程序(A-H)
本研究中使用的小鼠是来自JacksonLaboratory,BarHarbor,ME的雌性C3H/HeJ。在致敏开始时小鼠为6周龄，约15克，设4-6只/笼(JAG75笼，AllentownCagingEquipment,Allentown,NJ)。食物和水无限量提供。在用于研究前，让小鼠适应新环境6天。表5总结了本研究设计，并详述如下。
表5：研究设计的总结
a在研究第0、1、2、3、4、5、6、和8周。
b最后一次致敏给药之后18天。
c纳米颗粒的给药浓度。花生蛋白和CpG-生物素的相应浓度分别是400μg/ml和3.67μg/ml。
d纳米颗粒剂量。花生蛋白和CpG-生物素的相应剂量分别是200μg/只小鼠和1.835μg/只小鼠。
e最后一次脱敏之后5天。
A.致敏(第0、1、2、3、4、5、6、和8周)
本研究使用三组(第1-3组)6周龄C3H/HeJ雌性小鼠，每只称重约15克。第1组有8只小鼠，第2组有12只小鼠，第3组有10只小鼠。第1组和第2组用花生和霍乱毒素致敏8周，而第3组(空白对照)不进行致敏处理。
简言之，所有小鼠(包括第3组)禁食2小时。禁食2小时后，每只待致敏的小鼠(第1-2组)口服饲喂0.5mlPBS溶液，该PBS溶液含有10mg新鲜研磨的完整花生(即，花生仁和花生衣，无壳)、20μg霍乱毒素、16.5μl酒精和1.5％的碳酸氢钠(w/v)。连续3天重复上述操作。继初次致敏(第0实验周)之后，每周重复同样的过程，持续5周(第1-5实验周)；但是，每周只进行一次致敏处理(而不是像第0实验周那样每周连续3天)。一周和三周之后(即，分别是第6实验周和第8实验周)，再按照如上操作对小鼠进行致敏处理(即每周一次)，所不同的是新鲜磨碎的完整花生的量增加至每只小鼠50mg。
B.脱敏(第11、12、13、和14周)
最后一次致敏增量之后18天(第11实验周)，除了空白小鼠(第3组)之外的其他所有小鼠开始接受脱敏处理方案。通过口服饲喂给予小鼠0(溶媒；第1组)或3.67mg/只小鼠的包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒(第2组)，一周一次，连续四周。3.67mg/只小鼠的纳米颗粒剂量相当于200μg花生蛋白和1.835μgCpG-生物素。每个脱敏处理的剂量体积为0.5mL/只小鼠。所有小鼠(包括第3组的小鼠)在脱敏处理之前禁食2小时。
C.经口食物激发(第14、18、22、26、30周)
在第14(最后一次脱敏处理之后5天)、18、22、26、和30实验周，用新鲜磨碎的完整烤花生经口激发接受脱敏处理的小鼠(第1组和第2组)。空白小鼠(第3组)只在第30周进行激发。简要地说，所有小鼠(包括第3组的小鼠)均禁食过夜。第二天早晨，第1-2组中的每只小鼠均经口饲喂0.5mlPBS溶液，该PBS溶液含有100mg新鲜磨碎的完整花生、10μg霍乱毒素、8.25μl酒精和1.5％的碳酸氢钠(w/v)。三十分钟后，小鼠再经口饲喂0.5ml的上述溶液(即，每只小鼠共饲喂200mg磨碎的完整花生)。
每次经口食物激发(OFC)后24小时，第1-2组中的小鼠口服饲喂0.5mlPBS溶液，该PBS溶液含有10mg新鲜磨碎的完整花生、20μg霍乱毒素、16.5μl酒精和1.5％的碳酸氢钠(w/v)。这样做是为了在长时间的持续研究中小鼠一直保持反应性。
D.过敏症状评分
观察小鼠在每次脱敏处理(第11、12、13、和14周)之后1小时内和每次OFC(第14、18、22、26、和30周)之后30分钟内的过敏症状。用以下的评分系统来评估过敏症状：0为无症状；1为在鼻子和头部周围的刮痕和摩擦；2为眼睛和口鼻部周围浮肿、腹泻、竖毛(pilarerecti)、活动减少、和/或活动活动减少并且呼吸率增加；3为气喘、呼吸吃力、嘴和尾巴周围紫绀；4为轻微针刺后无反应或震颤和抽搐；5为死亡。
E.体温
每次OFC(第14、18、22、26、和30周)之后三十分钟，用直肠温度计对小鼠进行体温评价。在第14、18、22、26周没有接受激发的第3组小鼠具有与第1组和第2组小鼠在相同的时间点记录的温度。
F.血浆组胺水平
每次OFC(第14、18、22、26、和30周)之后测定血浆组胺水平。简言之，OFC实施之后30分钟，收集血液，分离血浆，并将血浆贮存在-80℃下直至测定。用市售组胺酶联免疫测定(ELISA)试剂盒(Immunotech,Marseille,France)测定血浆组胺水平，通过与所提供的标准曲线比较，计算出组胺的浓度。
G.花生特异性IgE和IgG2a的血清水平
在第11周第一次脱敏之前一天和每次OFC(第14、18、22、26、和30周)之前一天测定花生特异性IgE和IgG2a的血清水平。在上述指定的时间点采集血液，分离血清，并将血清贮存在-80℃直至测定。
按照如下方法测定花生特异性IgE：用花生粗提取物(500μg/ml脱脂花生制品)或者大鼠抗小鼠IgE(2μg/ml，BDBiosciences，SanDiego，CA)包被96孔Immulon4HB板(ThermoScientific,Milford,MA)。在4℃过夜孵育后，将板洗涤三次，然后用2％BSA(Sigma,St.Louis,MO)的PBS在37℃封闭3小时。将板洗涤三次，然后将1:50稀释的测试血清样品加入到花生粗提取物包被的孔中，将十倍系列梯度稀释(1：2，从1000ng/mL开始)的纯化小鼠IgE(BDBiosciences,SanDiego,CA)加入到大鼠抗小鼠IgE包被的孔中，生成参考曲线。所有的稀释液均用2％BSA的PBS制成。过夜孵育后，将板洗涤三次，然后加入生物素标记的大鼠抗小鼠IgE(1μg/ml，BDBiosciences,SanDiego,CA)，在室温下孵育1小时。将板洗涤6次，然后用1：4000稀释的链霉抗辣根过氧化物酶(1mg/ml，Sigma,St.Louis,MO)孵育15分钟。将板洗涤6次，然后用过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg,MD)显色30分钟。用酶标仪测定在405nm处的吸光度。
按照如下方法测定花生特异性IgG2a：用花生粗提取物(2μg/ml)或者二硝基苯基(DNP,2μg/ml,Sigma,St.Louis,MO)包被96孔Immulon4HB板。在4℃过夜孵育后，将板洗涤三次，然后用含1％人血清白蛋白(Sigma,St.Louis,MO)和0.5％吐温20(Sigma,St.Louis,MO)的PBS在37℃封闭3小时。将板洗涤三次，然后将测试血清样品(IgG2a方法中为1：1,000)稀释液加入到花生粗提取物包被的孔中，将十倍系列梯度稀释(1：3，从2000ng/mL开始)的小鼠抗DNPIgG2a(Accurate,NY)加入到DNP包被的孔中，生成参考曲线。所有的稀释液均用含1％人血清白蛋白和0.5％吐温20的PBS制成。过夜孵育后，将板洗涤三次，然后加入生物素标记的大鼠IgG2a(0.25μg/ml,BDBiosciences,SanDiego,CA)，在室温下孵育1小时。将板洗涤6次，然后用1:4000稀释的链霉抗辣根过氧化物酶(1mg/ml,Sigma,St.Louis,MO)孵育15分钟。将板洗涤6次，然后用过氧化物酶底物显色30分钟，用酶标仪测定在405nm处的吸光度。
H.脾细胞因子水平
第五次OFC之后三十到四十分钟，处死所有小鼠，取出脾脏，分离脾细胞，在存在或不存在花生粗提取物的情况下测定所得到的脾细胞培养物中的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ和TGF-β)。为每个动物设置独立培养物。脾细胞在补充有10％胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)和1％青霉素/链霉素(MPBiomedicals,Solon,OH)的RPMI1640(Mediatech,Herndon,VA)中悬浮培养，并接种于含有或不含有花生粗提取物的24孔板中。72小时后，收集培养上清液，用市售ELISA试剂盒测定细胞因子的水平。用OptEIAELISA试剂盒(BDBiosciences,SanDiego,CA)测定除TGF-β和IL-13之外的所有细胞因子，TGF-β和IL-13这两种细胞因子使用R&D系统(Minneapolis,MN)的duo-set试剂盒测定。
结果
1花生特异性IgE的血清水平
图5显示了在第11周(预治疗)第一次脱敏前一天和在第14、18、22、26、和30周的OFC前一天的示例性的花生特异性IgE血清浓度平均值±平均值标准误(SEM)。未接受任何类型处理(空白对照)的小鼠在整个研究中检测不到花生特异性IgE水平。接受致敏处理的两组小鼠在第11周到第30周均显示存在花生特异性IgE。未观察到溶媒处理组和试剂处理组在第11周(脱敏前一天，溶媒对照：6,844±1,411ng/mL，试剂组：6,525±729ng/mL)平均花生特异性IgE水平的统计学差异。
脱敏处理完成四天后(第14周，第一次OFC的前一天)，接受试剂处理的小鼠(4,980±732ng/mL)与接受溶媒处理的小鼠(6,662±861ng/mL,P<0.07)相比，显示出花生特异性IgE水平减少的趋势。在余下的研究中，接受试剂处理的小鼠的平均花生特异性IgE水平均显著低于接受溶媒处理的小鼠(P<0.05-0.001)。
2.花生特异性IgG2a水平
图6显示了在第11周(预治疗)第一次脱敏前一天和在第14、18、22、26、和30周的OFC前一天的示例性的花生特异性IgG2a血清浓度平均值±SEM。未接受任何类型处理(空白对照)的小鼠在整个研究中检测不到花生特异性IgG2a水平。接受致敏处理的两组小鼠在第11周至第30周均显示存在花生特异性IgG2a水平。未观察到溶媒处理组和试剂处理组第11周(脱敏前一天，溶媒对照：318,286±32,586ng/mL，试剂组：339,592±51,494ng/mL)平均花生特异性IgG2a水平的统计学差异。
脱敏处理完成四天后(第14周，第一次OFC的前一天)，试剂处理组的小鼠显示出平均花生特异性IgG2a水平的增加(444,426±60,288ng/mL)，而溶媒处理组小鼠却表现出平均花生特异性IgG2a水平的降低(207,741±53,494ng/mL,P<0.05)。第14周后，溶媒处理组小鼠和试剂处理组的小鼠均显示出平均花生特异性IgG2a水平的降低；然而，第11周后的所有时间点上，接受试剂处理的小鼠中平均花生特异性IgG2a水平均显著性地高于在溶媒处理组的小鼠中观察到的平均花生特异性IgG2a水平(P<0.05-0.001)。
3.脱敏期间的过敏性症状评分
接受溶媒对照处理的小鼠或接受3.67ml/只小鼠的试剂(200μg花生蛋白与1.835μgCpG-生物素)处理的小鼠在每次脱敏处理后1小时观察期内没有表现出过敏症状。所有小鼠的过敏性症状评分为0(0＝没有症状)。
4.OFC后的过敏性症状评分
图7、图8和图9中分别显示了第14和18周、第22和26周、以及第30周的OFC后示例性的各个个体过敏性症状评分及其中值。没有接受任何类型致敏处理的小鼠(即，空白对照)在第30周OFC后没有表现出过敏症状(即，所有小鼠的过敏性症状评分为0)。空白对照小鼠在第14、18、22和26周没有受到激发。
施用溶媒对照的致敏小鼠在第14周OFC后表现出过敏反应。具体地，一只小鼠评分为3(气喘、呼吸吃力、嘴和尾巴周围紫绀)，4只小鼠评分为2(眼睛和口鼻部周围浮肿、腹泻、竖毛(pilarerecti)、活动减少、和/或活动减少并且呼吸频率增加)，一只小鼠评分为1(在鼻子和头部周围的刮痕和摩擦)。两只老鼠没有表现出症状(0分)。继续激发至第26周，这些小鼠的过敏症状加重，一只小鼠评分为4(轻微针刺后无反应或震颤和抽搐)，其余7只评分为3。在第30周，一只在第26周评分为3的小鼠症状减轻(评分为2)。
花生致敏小鼠口服给予3.67mg/只小鼠剂量的试剂(200μg花生蛋白质和1.835μgCpG-生物素)，每周一次，连续四周，在所有五次OFC中均产生了过敏性症状评分在统计学上的显著下降(P<0.05)。十二只小鼠中的九只(75％)在第一次激发后完全没有过敏性症状(0分)，其余三只的症状评分分别为1、2和3。到了第二次激发，在第一次激发评分为1的小鼠目前评分为0，使受到完全保护的小鼠总数为10(83％)。在第四次激发时(即，脱敏处理停止3个月后)情况相同。脱敏处理停止四个月后，曾在第26周受到完全保护的10只小鼠中有2只出现了症状增加(评分为2)。
5.OFC后的体温
图10、图11和图12分别显示了在第14和18周、第22和26周、以及第30周的OFC后示例性的各个个体的体温及其平均值。在第14、18、22和26周没有受到激发的第3组小鼠的体温与它们在与第1组和第2组的小鼠相同的时间点记录的体温一样。每次OFC后，溶媒对照组小鼠的平均体温始终比空白对照小鼠的平均体温低。花生致敏小鼠口服给予3.67mg/只小鼠剂量的试剂(200μg花生蛋白质和1.835μgCpG-生物素)，每周一次，连续四周，相比于溶媒对照组动物，所有五个OFC中的平均体温均有增加，除了第一次激发外，其他的体温增加均有统计学上的显著性(在第二、第三、和第四激发P<0.05，在第5次激发P<0.001)。
6.OFC后的血浆组胺水平
图13、图14和图15分别显示了第14和18周、第22和26周、以及第30周的OFC后示例性的各个个体的血浆组胺水平及其平均值。在第14、18、22和26周没有受到激发的第3组小鼠的血浆组胺水平与它们在与第1组和第2组的小鼠相同的时间点记录的血浆组胺水平一样。溶媒对照组每次OFC后30分钟的平均血浆组胺水平比阴性对照组高。花生致敏小鼠口服给予3.67mg/只小鼠剂量的试剂(200μg花生蛋白质和1.835μgCpG-生物素)，每周一次，连续四周，相比于溶媒对照组动物，所有五个OFC中的平均血浆组胺水平均有统计学上的显著降低(P<0.05-0.001)。
7.用花生粗提取物孵育培养的OFC后(第30周)脾细胞培养物中的细胞因子水平
图16显示了示例性的用花生粗提取物孵育培养的OFC后(第30周)脾细胞培养物中的细胞因子水平的平均值±SEM。图16A显示了表明IL-4细胞因子水平的平均值±SEM的示例性结果。图16B显示了IL-10细胞因子水平的平均值±SEM的示例性结果。图16C显示了IFN-γ细胞因子水平的平均值±SEM的示例性结果。图16D显示了IL-5细胞因子水平的平均值±SEM的示例性结果。图16E显示了IL-13细胞因子水平的平均值±SEM的示例性结果。图16F显示了TGF-β细胞因子水平的平均值±SEM的示例性结果。
溶媒对照组中在花生粗提取物存在的情况下，脾细胞产生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ和TGF-β的平均量比空白对照组高。花生致敏小鼠口服给予3.67mg/只小鼠剂量的试剂(200μg花生蛋白质和1.835μgCpG-生物素)，每周一次，连续四周，脾细胞产生IL-4(p<0.001)、IL-5(P<0.001)和IL-13(P<0.001)的平均量相对于溶媒对照组显示出统计学显著性下降，并且脾细胞产生IFN-γ的平均量相对于溶媒对照组显示出统计学显著性增加(P<0.001)。没有观察到溶媒对照组和试剂处理组中IL-10和TGF-β的显著差异。
结论
花生致敏小鼠口服给予3.67mg/只小鼠剂量的试剂(200μg花生蛋白质和1.835μgCpG-生物素；即包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒)，每周一次，连续四周，在脱敏期间没有显示任何过敏症状，这表明包被了CpG、包封了PLGA的花生提取物的纳米颗粒在花生致敏小鼠内没有致敏潜力。
此外，花生致敏小鼠口服给予3.67mg/只小鼠剂量的试剂，每周一次，连续四周，导致小鼠对随后的经口花生激发产生相对于溶媒对照小鼠的脱敏效果，这通过以下内容得到了证明：与接受溶媒处理的小鼠相比，平均过敏性症状评分较低、平均体温较高(基本上与空白小鼠相似)、平均血浆组胺水平较低、平均血清花生特异性IgE水平降低、平均血清花生特异性IgG2a水平增加、脾细胞产生IL-4、IL-5和IL-13的平均量降低、以及脾细胞产生IFN-γ的平均量增加。在试剂处理停止4个月后脱敏效果仍然明显，表明某些动物可能已经实现耐受。
实施例5：花生(Arachishypogaea)变应原提取物的制备
本实施例描述了用于本发明的花生(Arachishypogaea)变应原提取物(即，花生粗提取物)的制备。
本实施例描述了用于本发明的花生变应原提取物的制备，该提取物含有Arah1、Arah2和Arah3抗原及其他。
本实施例还描述了用于本发明的重组修饰花生蛋白(mArah1、mArah2和mArah3，其中m代表修饰)的制备。
花生(Arachishypogaea)(即，花生粗提取物)变应原提取物可按如下方法制备。将市售带壳炒花生(WhiteRoseBrand,NJ)去壳，在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH值为7.4)中匀浆，然后进行丙酮提取。通过二喹啉甲酸(BCA)测定法测定花生蛋白在PBS中的终浓度。然后按照，例如实施例3制备花生变应原提取物，并与大肠杆菌水性提取物(AEE)结合。
重组花生蛋白按如下方法制备。三种重组修饰花生蛋白(mArah1、mArah2和mArah3)分别在大肠杆菌菌株BLR(DE3)中表达，然后通过加热和苯酚使大肠杆菌死亡。表达的蛋白质仍然包封在死亡的大肠杆菌中，形成称为EMP-1、EMP2和EMP-3的三种全细胞悬浮液(即包封的mArah1、mArah2和mArah3)。然后，如实施例1所述，每种全细胞悬浮液都用于制备包括在水相中表达的重组花生蛋白的大肠杆菌水性提取物(AEE)，用于基本上如实施例3中所述的制备纳米颗粒组合物。
实施例6：纳米颗粒组合物在变应性患者外周血单核细胞(PBMC)中的体外细胞因子研究
本实施例描述了示例性的患者外周血单核细胞(PBMC)的体外刺激来评估根据本发明所述的纳米颗粒组合物(即，包含亲水性和/或疏水性大肠杆菌提取物制品的纳米颗粒)的免疫原性。
本实施例描述了示例性的患者外周血单核细胞(PBMC)的体外刺激来评估根据本发明所述的纳米颗粒组合物的免疫原性，所述纳米颗粒组合物包含一种或多种抗原，包括变应性粗提取物(例如，花生(Arachishypogaea)、粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)或屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus))。
本实施例描述了示例性体外细胞因子的研究，以评估包被了大肠杆菌有机提取物(“OEE”)、包封了聚丙交酯共乙交酯(“PLGA”)的粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)提取物及大肠杆菌水性提取物(AEE)纳米颗粒(下称“试剂”)的免疫原性。
在某些实施方式中，如本文中的研究所述的，包括变应性患者PBMC的刺激，也可以用于评估本发明的某些实施方式的免疫学特性或效果。
在某些实施方式中，所述组合物可以调节对象的免疫功能。在某些实施方式中，这种调节可以包括脱敏。在某些实施方式中，这样的调制不包括脱敏。在某些实施方式中，免疫学特性或者效果包括尘螨变应性患者的以变应原特异性Th2为主的表型向Th1/Th0样表型转变。
该体外研究的目的是为了评估试剂改变尘螨变应性患者的外周血单核细胞(PBMC)中以变应原特异性Th2为主的表型向Th1/Th0样表型转变的能力。该模型系统包括在单一培养基中的多克隆T细胞和B细胞抗原呈递细胞(APC)。
本实施例中的试剂包括两种常见屋尘螨，即，粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)，的标准变应性提取物，按变应性单位1:1混合。尘螨提取物与经FDA批准用于皮下免疫治疗(SCIT)的市售标准化尘螨提取物相同。尘螨提取物包封在PLGA纳米颗粒中，其中尘螨提取物和AEE的细菌蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)和脂多糖(LPS)被包封在纳米颗粒的内部，OEE的细菌LPS和脂质是包被在纳米颗粒的外部。
不希望受到特定理论束缚，将尘螨提取物包封在纳米颗粒组合物中的药理学原理是促进舌下粘膜的APC摄取、激活先天免疫系统，因此潜在地提高单独使用提取物的舌下免疫治疗(SLIT)的疗效。具体地，将试剂设计成使已知toll样受体(TLR)激动剂、细菌LPS和CpGDNA基序、以及任何可能存在于细菌细胞中的潜在未确定的激动剂的整合最大化，从而增强试剂药品的潜在药效。
本研究评估在接受试剂处理、包封在缺乏大肠杆菌成分的纳米颗粒中的尘螨提取物(不含佐剂的试剂)处理、没有尘螨提取物的半合成细菌细胞(不含尘螨提取物的试剂)处理、以及空纳米颗粒(不含佐剂和尘螨提取物的试剂)处理之后的尘螨变应性患者PBMC中IFN-γ、IL-10、IL-5、和IL-4的体外水平。
本实施例(总结如下)的方法基本上基于Bohle等人(Bohleetal.,J.Immunology,2004；172:6642-6648)公开的用于桦树花粉变阴性反应研究的方法。该方法可以根据需要修改，以改进研究设计。特别是，本领域技术人员将会认识到，某些参数，包括但不限于，每孔细胞的数量、培养的持续时间、培养条件以及试剂和刺激物剂量可能需要针对特定抗原和患者群体进行优化。
通过静脉穿刺收集十名尘螨变应性患者的外周血至肝素化注射器。所有患者在采血前必须有至少一年的常年性变应性鼻炎史，并且在采血时的阳性点刺皮肤试验(PST)中显示出对粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)的敏感性。PST定义为风团平均直径比由阴性对照组(盐水)在15-20分钟引起的风团直径大3毫米。患者必须在开始收集血液的6个月前未接受过变应性免疫治疗，收集血液的3个月前未接受过免疫调节治疗。患者必须没有由于暴露于另一个变应原(即其他尘螨)而引起的显著症状性常年性变应性鼻炎和/或哮喘的临床病史。
通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Pharmacia)从尘螨变应性患者的外周血中分离PBMC。应在收集全血后尽快将其加工为PBMC，理想时间为8-12小时内。在测定之前通常不冷冻PBMC。
在96孔板(Nunclone；Nunc)中补充有2mML-谷氨酰胺、2×10-5M2-巯基乙醇以及研究药物/对照物的无血清超纯培养基(BioWhittaker,Walkersville,MD)中培养PMBC。对每种如下研究药物/对照物、每名尘螨变应性患者的PBMC设置1×106/200μL的三复孔和2x105/200μL的三复孔：
1.低剂量试剂[剂量表示为纳米颗粒在培养基中的最终浓度(mg/ml)]；
2.中剂量试剂；
3.高剂量试剂；
4.不含佐剂的试剂(与#3剂量相同)；
5.不含尘螨提取物的试剂(与#3剂量相同)；
6.不含佐剂和尘螨提取物的试剂(与#3剂量相同)；
7.仅作为对照物的介质。
如上所述，三复孔设置为1x106/200μl，并用于密切关注Th1相关的细胞因子。用研究药物/对照物培养48小时后，收集上清液，并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)与匹配的抗体对(Endogen,Woburn,MA)根据生产商的说明书分析IFN-γ和IL-10的含量。
另外地，三复孔设置为2x105/200μL，并用于密切关注Th2细胞相关的细胞因子。用研究药物/对照物培养6天后，洗涤细胞，计数，并以1x106/200μl用佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA，10ng/ml)加离子霉素(1μM)再刺激处理24小时。再刺激24小时后，收集上清液并用ELISA与匹配Ab对(Endogen,Woburn,MA)分析IL-5和IL-4的含量。
实施例7：向患有常年变应性鼻炎并对粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)敏感的成年受试者舌下给予尘螨变应性疫苗的I期随机双盲安慰剂对照的安全性、药效学和初步有效性研究
本实施例描述了向患有常年变应性鼻炎并对粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)敏感的成年受试者舌下给予本发明的纳米颗粒组合物(在本实施例中，含有亲水性和/或疏水性大肠杆菌提取物制品的纳米颗粒)的示例性的I期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照、安全性、药效学以及初步有效性研究。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物是包被了大肠杆菌有机提取物(“OEE”)、包封了聚乳酸-羟基乙酸共聚物(“PLGA”)的粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)提取物，以及大肠杆菌水性提取物(AEE)的纳米颗粒(以下称为“试剂”和/或“尘螨变应性疫苗”)。
本实施例描述了用于评价本发明所述纳米颗粒组合物(在本实施例中，含有亲水性和/或疏水性大肠杆菌提取物制品的纳米颗粒)的药效学和初步有效性的示例性临床试验设计。
本实施例描述了用于评价本发明所述的某些含有粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)或屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)提取物(即抗原)和细菌成分的纳米颗粒组合物舌下给药的药效学和初步有效性的示例性方案概要。
化学名称和结构
本实施例中尘螨变应性疫苗的原料药是两种常见的屋尘螨，即，粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)，按照变应性单位(AU)1:1混合的标准化变应性提取物。因此，尘螨变应性疫苗的原料药没有传统的化学名称或结构。
尘螨变应性疫苗中的尘螨提取物与市售的经食品与药品管理局(FDA)批准的用于皮下免疫治疗(SCIT)的标准化尘螨提取物相同[标准化的螨提取物(粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae))和标准化的螨提取物(屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus))，Greer，Lenoir，NC]。
使用双乳化的方法将尘螨提取物包封入PLGA纳米颗粒中。在第一次乳化中，粉尘螨提取物和包含细菌脱氧核糖核酸(DNA)的AEE与PLGA在有机溶剂中混合。将得到的乳剂进行微流体化或均匀化，以产生颗粒内包封尘螨提取物和AEE的纳米颗粒。然后加入主要含有细菌脂质和LPS的OEE的5％聚乙烯醇溶液，将得到的第二乳剂微流体化/均匀化以包被在第一次乳化过程中产生的纳米颗粒。
因此，最终的PLGA纳米颗粒被设计为模拟细菌以便促进胃肠道中抗原呈递细胞(APC)的摄取，增强先天免疫系统的激活，从而潜在地改善单独使用裸尘螨提取物的传统SLIT的效果。尘螨变应性疫苗的批量纳米颗粒包括加入AEE，第二次乳化会使用OEE而非仅仅是LPS。换句话说，这些PLGA纳米颗粒被设计为“半合成的细菌细胞”，其中AEE中的尘螨提取物和细菌蛋白质、DNA和LPS包封在纳米颗粒内部，并且OEE中的细菌LPS和脂质包被在纳米颗粒的外部。以同样的方式产生安慰剂，唯一区别是没有尘螨提取物。
推荐的适应症
正在研制用于SLIT的尘螨变应性疫苗来治疗患者的常年性变应性鼻炎，已通过阳性点刺皮肤试验(PST)证实所述患者对粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)敏感。
剂型、给药途径以及给药方案
尘螨变应性疫苗的最终剂型是适于舌下给药的固体口服剂型。制剂开发方法包括纳米颗粒与水溶性赋形剂的干混物，所述水溶性赋形剂为例如包装在塑料细管或直接压缩的速溶片剂的乳糖一水合物。给药将采取剂量递增的形式，最大剂量高达1400AU。所有对象均给予尘螨变应性疫苗，每周一次，持续六周。在此期间，剂量将每周增加，开始在三倍增量达到最大剂量1400AU，然后降低到1.5倍增量。如果观察到变应性症状或剂量遗漏，则需要修改方案规定的剂量。最初6周剂量递增后，耐受尘螨变应性疫苗的患者随后将连用五个月(维持剂量期)的额外剂量，每天一次。维持剂量期间的剂量是在对象剂量递增阶段确定的最大耐受剂量(MTD)。
尘螨变应性疫苗的给药途径是舌下给药，用作舌下免疫治疗(SLIT)。
用于治疗对粉尘螨或屋尘螨敏感患者的常年性变应性鼻烟而使用的建议剂量方案是基于以前口服免疫治疗(OIT)和SLIT的临床试验。用于治疗常年性变应性鼻炎的OIT和SLIT的剂量方案通常为每天一次(QD)，根据延长的计量时间长期使用。
附加信息及可能机制
本实施例的尘螨变应性疫苗被设计为充当“变应性疫苗”，当用作SLIT来治疗对粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)敏感的患者的常年性变应性鼻炎时，可以诱导对尘螨的耐受性。在试剂所使用的尘螨变应原与市售经食品与药品管理局(FDA)批准的用于皮下免疫(SCIT)的标准化尘螨提取物相同[标准化尘螨提取物(粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae))和标准化尘螨提取物(屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)),Greer,Lenoir,NC]。在葛莱(Greer)产品的提取物和该试剂之间的一个区别是，葛莱产品被配制为在甘油中的液体，而该试剂使用冻干提取物以掺入到含有细菌成分的PLGA纳米颗粒中，所述细菌成分旨在促进APC识别和摄取颗粒，并提高与脱敏和提高对尘螨的免疫耐受性相关的Th1/Th0样免疫应答。
传统的变应原原注射疫苗用于控制变应性疾病已使用了许多年。粉尘螨和屋尘螨的标准化提取物，无论是单独还是混合的，都是市售的尘螨变应性SCIT。据报道，SCIT能够改变疾病的自然史(即鼻炎患者的哮喘发作)，并在停药后有持久的影响。然而，由于担心由变应原注射引起的不良反应，并且需要在医务室进行为期3到5年的常规皮下注射而造成不便，SCIT的广泛使用受到限制。SLIT舌下给药似乎是变应原提取物更加可行的替代给药途径。
尘螨变应性疫苗产品被设计成将尘螨提取物和细菌DNA包封在PLGA纳米颗粒中，其表面上包被细菌LPS和脂质(参见图17的示意图)。药理学原理如下。
尘螨变应性疫苗应避免暴露于引起变应性反应的主要尘螨蛋白中以实现功效。粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)是最常见的尘螨种属，众多的变应原已确定。因此，试剂包括来自这两个物种的标准化提取物作为抗原。
递送包封在模仿细菌细胞的PLGA纳米颗粒中的尘螨抗原可增强先天免疫系统的活化，并因此潜在地提高单独使用尘螨提取物进行SLIT的功效。具体而言，细菌LPS和CpGDNA基序以及在所述纳米颗粒内部的任何潜在不明的细菌部分可提高试剂的潜在功效，以产生与脱敏和提高对尘螨的免疫耐受性相关的Th1/Th0样免疫应答。
此外，包封在模仿细菌细胞的PLGA纳米颗粒中的尘螨抗原可以促进舌下粘膜的APC摄取，从而潜在地改善单独使用尘螨提取物的SLIT的功效。具体地说，通过纳米颗粒外表面展示和将已知的toll样受体(TLR)激动剂整合进入纳米颗粒，将试剂设计成使APC最大化地识别和内化被包封的尘螨蛋白。
另外，将尘螨抗原包封在完整的输送系统(即PLGA纳米颗粒)中可以在给予蛋白时通过将所述蛋白避开肥大细胞而降低变应性反应的可能性。因此，药剂中的尘螨蛋白包封在模仿细菌细胞的PLGA纳米颗粒内。
如图17中所示，本实施例中试剂的成分之间没有共价键。在水的存在下，纳米颗粒会通过水解持续侵蚀，包封的尘螨提取物蛋白和细菌蛋白质、DNA和LPS，以及细菌LPS和脂质的包衣会持续释放。PLGA聚合物水解产生无毒的乳酸(LA)和乙醇酸(GA)单体。PLGA水解速率取决于LA与GA的比率，并且选择用于试剂的PLGA聚合物以使得它基于体外药物释放试验在48至72小时之内释放包封的尘螨提取物蛋白。
舌下给药后，没有被APC摄取和处理的纳米颗粒将被吞下。在这两种情况下，水的存在使PLGA水解成LA和GA(在低pH值下更快)，释放尘螨提取物(即，抗原)和细菌成分。释放后，提取物蛋白和细菌成分将会以尘螨蛋白或细菌成分在日常生活或食物中相同的方式消化。
临床试验设计和方法
临床试验设计是在对粉尘螨和屋尘螨敏感的患有常年性过敏性鼻炎(有或没有哮喘)的成年对象中进行的所述试剂的I期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照的安全性、药效学和初步有效性研究。
十二名对象按1：2被随机分配为接受安慰剂或试剂。安慰剂和活跃群体包括对粉尘螨和屋尘螨敏感的对象和只对两个物种中的一个敏感的对象，以便允许监测新致敏。
所有对象舌下给予研究药物(安慰剂或活性剂)，每周一次，连续六周。在此期间，剂量每周增加，以3倍增量最终增至1400AU的剂量，然后逐渐减小到1.5倍增量。如果没有发生剂量限制性毒性[DLT；定义为严重程度大于中度的任何不良事件(AE)并且与研究药物至少可能有关系]，那么对象会再接受最大耐受剂量，每天一次(qd)，连续六个月。
A.筛选访视：
在研究药物首次给药(第1天)之前的14天内，向每个对象提供描述本研究的书面资料(知情同意书)，并解答任何提问的问题。书面同意参加该研究的对象接受资格评估，包括完整的医疗史、全面体检、身高、体重、生命体征(血压、脉搏速率、呼吸速率及口腔体温)、12导联心电图(心电图)、肺活量测定[1秒内用力呼气量(FEV1)、用力肺活量(FVC)和峰值呼气流速(PEF)]、示差全血细胞计数(CBC)、血清化学、尿液分析、为有生育能力的妇女(WCBP)进行的尿液人体绒毛膜促性腺激素(HCG)妊娠试验、为检测粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)特异性IgE和IgG4水平进行的采血、为检测粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)刺激的PBMCT淋巴细胞表型进行的采血、标准化粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus)提取物的皮肤点刺试验(PST)和终点滴定皮肤试验，以及记录在筛选访视之前30天内服用的药物。
B.研究第1天：
在筛选访视中满足所有资格要求的对象将按1：2随机分配接受安慰剂或试剂，并在第1天早上返回到医疗机构进行以下基线程序：更新病史、有针对性的体检、体重、生命体征、PEF、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液HCG妊娠试验，并记录筛选访视以来服用的药物。
向基线评估后继续满足要求的对象给予单剂量舌下含服研究药物(安慰剂或活性剂)。研究药物的给药在有治疗严重变应性反应经验的医疗机构进行。具体地讲，该医疗机构应当具有急救手推车，并有治疗过敏反应的医务人员和医师。
在研究药物给药后立即开始监测AE，并在整个研究过程中继续监测。给药后，对象继续留在医疗机构观察4小时。在给药后5、10、15和30分钟监测生命体征。
给每个对象一本日记簿，记录每次访视之间发生的任何AE或使用的药物，还给对象表格来评估鼻炎症状的严重程度(直观类比量表)和整个实验过程中每天使用急救药物的情况。还给对象24小时紧急电话号码，以便在发生不良反应时拨打。
C.研究第2天：
对象在第2天和第7天早上返回医疗机构，进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF，为WCBP进行的尿液HCG妊娠试验、审阅AE和伴随用药日志、和审阅用来评估鼻炎症状严重程度和急救药物使用的日常表格。
D.剂量递增期间的每周访视：
在剂量递增期间，对象每周返回医疗机构一次以便进行评价以及给予研究药物。在第8、15、22、29和第36天早上进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF、为WCBP进行的尿液HCG妊娠试验、审阅AE和伴随用药日志、和审阅用来评估鼻炎症状严重程度和急救药物使用的日常表格。确定没有安全性问题后，向对象给予单一舌下含服剂量的研究药物(安慰剂或活性剂)。给药后，对象留在医疗机构继续观察4小时。在给药后5、10、15和30分钟监测生命体征。
E.维持治疗期间的每月访视：
对象在剂量递增期结束1周后(第43天的早上)返回医疗机构，此后在维持剂量期间每月返回一次医疗机构，连续返回5个月，并进行以下程序：针对性的体检、生命体征、PEF、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液HCG妊娠试验、审阅AE和伴随用药日志、和审阅用来评估鼻炎症状严重程度和急救药物使用的日常表格。
在第一次、第三次和第五次的每月访视(即，研究药物治疗后2.5、4.5和6.5个月)时进行以下附加程序：为检测粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)特异性IgE和IgG4水平进行的采血、为检测粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)刺激的PBMCT淋巴细胞表型进行的采血、标准化粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus)提取物的终点滴定PST、以及非尘螨提取物(在筛选访视时选择的)的终点滴定PST。此外，在第五次每周访视(研究药物治疗后6.5个月)时，使用标准粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)提取物作为变应原进行支气管激发。
根据每月评估确定没有安全性问题后，向对象给予足够四周给药的研究药物和记录研究药物在家给药细节的日记薄。指示对象在家用药每日一次，并返回医疗机构进行每月评估。每次访视时，审查研究药物日记，收集研究药物容器和任何未使用的研究药物以监测顺从性。第五次每月访视后(即治疗6.5个月后)，不再给予研究药物。
F.最后研究访视
所有对象在他们最后一次研究药物给药之后四周返回，做为他们的最后研究访视。在最后一次访视中进行以下程序：完整的体检、体重、生命体征、PEF、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液HCG妊娠试验、为检测粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)特异性IgE和IgG4水平进行的采血、为检测粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)刺激的PBMCT淋巴细胞表型进行的采血、标准化粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus)提取物的终点滴定PST、以及非尘螨提取物(在筛选访视时选择的)的终点滴定PST、审阅AE和伴随用药日志、和审阅用来评估鼻炎症状严重程度和急救药物使用的日常表格。
诊断及主要入选标准：
选取18至50岁、在筛选访视之前有至少一年常年性变应性鼻炎史、并在筛选访视时通过阳性PST证明对粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus)敏感[在15-20分钟的风团平均直径比阴性对照(盐水)引起的风团大3mm]的对象。
对象可以有或可以没有哮喘。对于患有哮喘的对象，在筛选访视之前必须被诊断患有至少一年的间歇性哮喘或轻度持续性哮喘，其定义参见国家心肺和血液研究所(NHLBI)指南。对于所有对象，FEV1必须大于预测的80％，筛选时FEV1/FVC必须正常。
男性和WCBP均同意在研究中(从筛选访视到最后研究访视)使用适当的避孕方法；
适当的避孕方法包括具有低失败率的避孕方法，即，持续和正确使用时每年失败概率不超过1％的避孕方法，例如，完全禁欲、一些双屏障避孕法(避孕套与杀精剂)与伴侣使用IUD、隔膜杀精剂、口服避孕药、节育环或阴道环、使用口服或注射或植入避孕药相结合。
满足以下任一条件的对象将从试验中排除：需要使用机械通气或静脉血管升压药(即，对象出现心肺呼吸骤停)的严重过敏性事件史；危及生命的需要气管插管或机械通气的急性哮喘发作或筛选前两年内导致缺氧发作；筛选前6个月内需要口服类固醇的哮喘；因对象经常性暴露于其他变应原(即，除尘螨以外)而引发的显著症状性常年性过敏性鼻炎和/或哮喘临床病史；对象在研究过程中暴露出来的显著症状性季节性过敏性鼻炎和/或哮喘病史；不稳定型心绞痛、显著的心律失常、未控制的高血压、慢性鼻窦炎或在研究者看来可能会干扰研究或对对象产生额外风险的其它慢性或免疫性疾病；临床显著性的神经、心脏、肺、肝或肾病病史证据、体检和/或实验室研究；在筛选30天内的病毒性上呼吸道感染；在筛选30天内需要使用抗生素的急性感染；在筛选之前的180天内使用过变应原免疫治疗；在筛选之前的90天内使用过奥马珠单抗或免疫调节治疗(不包括皮质类固醇激素)；在筛选30天内使用过静脉注射抗组胺药或皮质类固醇；筛选30天内使用过另一种研究药物；筛选14天内使用过三环类抗抑郁药或β受体阻滞剂药物；筛选14天内使用过单胺氧化产物(MAO)抑制剂或已知会干扰过敏反应治疗的任何药物；筛选14天内使用过任何处方药(除上述方法提到的抢救药物之外)；筛选14天内使用过任何直接购买的非处方制剂(包括维生素、矿物质、植物治疗/草药/植物来源的制剂；除上述方法提到的急救药物之外)；皮肤试验之前无法暂时停止抗组胺药(抗组胺药的5个半衰期)；怀孕或哺乳期(如果是女性)；筛选前6个月内使用过任何含烟草或尼古丁的产品(包括香烟、烟斗、雪茄、嚼烟、尼古丁贴片或尼古丁口香糖)；在研究者看来会影响对象理解和在研究方案中合作能力的行为、认知或精神疾病；在研究者看来会干扰研究的药物滥用或酒精滥用史；已知对研究药物中的非活性成分产生变应性；不能进行肺活量测定。
产品、剂量和给药方式：
药剂的最终剂型为适于舌下给药的固体口服剂型。制剂开发方法包括纳米颗粒与水溶性赋形剂的干混物，所述水溶性赋形剂为例如包装在塑料细管或直接压缩的速溶片剂的乳糖一水合物。如上所述，本实施例中的研究采取剂量递增的形式，最大剂量高达1400AU。
安慰剂为不含有包封的尘螨提取物(抗原)、包封了AEE、包被了OEE的PLGA纳米颗粒。安慰剂与活性固体口服剂型肉眼无法区分。
向所有对象舌下给予研究药物(安慰剂或试剂)，每周一次，持续六周(剂量递增)。在此期间，该剂量将每周递增，开始用3倍增量，然后逐步降低至1.5倍增量。如果观察到变应性症状或剂量遗漏，则需要修改方案规定的剂量。
最初6周(剂量递增)之后，耐受研究药物(安慰剂或ENDM-500)的对象连用研究药物五个月(维持剂量期)，每天一次。维持治疗阶段的剂量为对象在剂量递增阶段建立的MTD。如果观察到变应性症状或剂量遗漏，则需要修改方案规定的剂量。
研究药物采用舌下给药。指示对象保持舌下药物2分钟，并且在给药后15分钟内不喝水不进食。在早晨吃早餐前(即，空腹)施用每次剂量的研究药物。第1天给药在医疗机构进行，剩余所有剂量均在家进行自我给药。
剂量递增期间(第一个为期六周的给药)，研究药物在医疗机构进行给药。剩余所有的剂量(维持剂量期)均将在家进行自我给药。
实施例8：成年对象舌下给予花生变应性疫苗的I期、随机、双盲、安慰剂-对照的安全性、药效学以及初步有效性研究
作为所述组合物和方法如何用于治疗变应性的进一步实施例，该实施例概述了提供一种实施方式的研究，所述实施方式含有花生变应原以评估在成年对象中的安全性和初步有效性。
在本实施例中，与上述实施例7相似，描述了示例性的在成年对象中施用所述纳米颗粒组合物(在本实施例中，包含亲水性和/或疏水性大肠杆菌提取物制品的纳米颗粒)的I期、单中心、随机、双盲、安慰剂-对照、安全性、药效学和初步有效性研究。在本实施例中，对象并不患有常年性变应性鼻炎(有或没有哮喘)和对粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)敏感，在本实施例的对象对花生有变应性反应。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒组合物是有机大肠杆菌提取液(“OEE”)包被的、聚乳酸共乙醇酸-(“PLGA-”)包封的花生提取物和水性大肠杆菌提取物(AEE)纳米颗粒(以下简称为“试剂”和/或“花生变应性疫苗”)。
本实施例描述了用于评价根据本发明的所述纳米颗粒组合物(在本实施例中，含有亲水性和/或疏水性大肠杆菌提取物制品的纳米颗粒)的药效学和初步有效性的示例性临床试验设计。
化学名称和结构
本实施例的花生变应性疫苗中的药物是常见的花生(Arachishypogaea)变应原提取物。因此，花生变应性疫苗的原料药没有传统的化学名称或结构。
花生变应性疫苗中的花生提取物与市售的经食品与药物管理局(FDA)批准的用于诊断的花生提取物[花生(Arachishypogaea)提取物，Greer,Lenoir,NC]相同。
使用双乳化的方法将花生提取物包封入PLGA纳米颗粒中。在第一次乳化中，花生提取物和包含细菌脱氧核糖核酸(DNA)的AEE与PLGA在有机溶剂中混合。将得到的乳剂进行微流体化或均匀化，以产生颗粒内包封花生提取物和AEE的纳米颗粒。然后加入主要含有细菌脂质和LPS的OEE的5％聚乙烯醇溶液，将得到的第二乳剂微流体化/均匀化以包被在第一次乳化过程中产生的纳米颗粒。
因此，最终的PLGA纳米颗粒被设计为模拟细菌以便促进胃肠道中抗原呈递细胞(APC)的摄取，增强先天免疫系统的激活，从而潜在地改善单独使用裸花生提取物的传统SLIT的效果。花生变应性疫苗的批量纳米颗粒包括加入AEE，第二次乳化会使用OEE而非仅仅是LPS。换句话说，这些PLGA纳米颗粒被设计为“半合成的细菌细胞”，其中AEE中的花生提取物和细菌DNA包封在纳米颗粒内部，并且OEE中的细菌LPS和脂质包被在纳米颗粒的外部。以同样的方式产生安慰剂，唯一区别是没有花生提取物。
剂型、给药途径以及给药方案
花生变应性疫苗的最终剂型是适于舌下给药的固体口服剂型。制剂开发方法包括纳米颗粒与水溶性赋形剂的干混物，所述水溶性赋形剂为例如包装在塑料细管或直接压缩的速溶片剂的乳糖一水合物。给药将采取剂量递增的形式，最大剂量高达2000mg花生蛋白。所有对象均给予花生变应性疫苗，每周一次，持续18周。在此期间，剂量将每周增加，直至最大剂量2000mg花生蛋白。如果观察到变应性症状或剂量遗漏，则需要修改方案规定的剂量。最初18周剂量递增后，耐受花生变应性疫苗的患者随后将连用12周(维持剂量期)的额外剂量，每天一次。维持剂量期间的剂量是在对象剂量递增阶段确定的最大耐受剂量(MTD)。
花生变应性疫苗的给药途径为舌下给药，用于舌下免疫治疗(SLIT)。
用于治疗花生变应性反应而使用的花生变应性疫苗的建议剂量方案是基于以前口服免疫治疗(OIT)和SLIT的临床试验。用于治疗花生变应性反应的OIT和SLIT的剂量方案通常为每天一次(QD)，根据延长的计量时间长期使用。
临床试验设计和方法
本实施例的研究是在12名患有花生变应性反应的成年对象中进行的I期、单中心、开放性、单组、剂量递增研究，来评价花生变应性疫苗的安全性、耐受性和初步有效性研究。所有对象将连续18周(剂量递增)舌下给予花生变应性疫苗。
花生变应性疫苗的剂量在18周剂量递增中每两周可以增加约2倍。如果观察到变应性症状或剂量遗漏，则需要修改方案规定的剂量。
在最初18周(剂量递增)后，花生变应性疫苗耐受的对象将给予额外的12周疗程(维持治疗；固定剂量，每天一次)。维持治疗阶段的剂量为对象在剂量递增阶段所建立的最大耐受剂量。
A.筛选访视
在研究药物首次给药(第1天)之前的14天内，向每个对象提供描述本研究的书面资料(知情同意书)，并解答任何提问的问题。书面同意参加该研究的对象接受资格评估，包括完整的医疗史、全面体检、身高、体重、生命体征(血压、脉搏速率、呼吸速率及口腔体温)、12导联心电图(心电图)、肺活量测定[1秒内用力呼气量(FEV1)、用力肺活量(FVC)和峰值呼气流速(PEF)]、示差全血细胞计数(CBC)、血清化学、尿液分析、为有生育能力的妇女(WCBP)进行的尿液人体绒毛膜促性腺激素(HCG)妊娠试验、为检测花生特异性IgE和IgG4水平进行的采血、对一组抗原(包括花生)的PST、对花生提取物的终点滴定PST、对花生的DBPCFC。
B.研究第1天
在筛选访视中满足所有资格要求的对象在第1天早上返回到医疗机构进行以下基线程序：更新病史、有针对性的体检、体重、生命体征、PEF、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液HCG妊娠试验，并记录筛选访视以来服用的药物。
向基线评估后继续满足要求的对象给予单剂量舌下含服研究药物。研究药物的给药在总临床研究中心(GCRC)或者有治疗严重变应性反应经验的相当的临床监测站点进行。具体地讲，该医疗机构应当具有急救手推车，并有治疗过敏反应的医务人员和医师。
在研究药物给药后立即开始监测治疗中出现的AE，并在整个研究过程中继续监测。给药后，对象继续留在医疗机构观察4小时。在给药后0.25、0.5、1和2小时监测生命体征。给对象日记薄来记录访视之间发生的任何AE或伴随用药。
C.研究第2天
对象在第2天早上返回医疗机构，并进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF、审阅AE以及伴随用药日志。对研究药物首次剂量耐受的对象将给予第二次剂量的研究药物，并在给药后继续在医疗机构观察4小时。在给药后0.25、0.5、1和2小时监测生命体征。
在确定没有安全性问题后，向对象提供足量的研究药物在家完成第一周给药，同时给他们记录研究药物详细情况的日记簿。指示对象如何进行研究药物的舌下给药，并且指示对象基本上要在每天的同一时间服用研究药物。向所有对象提供肾上腺素，并指示将其用于研究访视期间严重的变应性反应。还给对象24小时紧急电话号码，以便在访视之间发生不良反应时立即给研究中心打电话。
D.剂量递增期间的每周访视
在剂量递增期间，对象每周返回医疗机构一次以便进行评价，以及给予研究药物(每周的首次剂量)和在家施用的额外的研究药物。在使用研究药物前的每次每周访视时，进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF、审阅AE和伴随用药日志、和审阅研究药物给药日志，并且归还研究药物容器和任何未使用的研究药物(用来监控顺从性)。
研究药物给药后，对象留在医疗机构观察4小时。在给药后0.25、0.5、1和2小时监测生命体征。在确定没有安全性问题后，向对象提供足量的研究药物以便在家完成另外一周的给药。第二天进行电话会谈以评估任何AE。
E.18周的剂量递增完成后的访视
对象在剂量递增期的最后一次给药之后的一天返回医疗机构，进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液妊娠试验、审阅AE和伴随用药日志、审阅研究药物给药日志、并归还研究药物容器和任何未使用的研究药物(用于监测顺从性)、用于检测花生特异性IgE和IgG4水平的采血、向花生提取物和非花生提取物(筛选时选择的)中进行终点滴定PST。对象于6天后返回进行针对花生的DBPCFC。
F.可选的12周维持治疗期间的访视
耐受花生变应性疫苗的患者接受为期12周的花生变应性疫苗维持治疗。继18周的剂量递增评估(包括针对花生的DBPCFC)完成后，向这些对象提供足够在家给药2周剂量的研究药物，以及记录研究药物给药详细情况的日记簿。指示对象在每天大约相同时间服用研究药物，每天一次，并于2周后返回医疗机构。
在可选的维持治疗期间的双周访视中，对象会进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF、审阅AE和伴随用药日志、审阅研究药物日志、审阅研究药物给药日志、以及归还研究药物容器和任何未使用的花生变应性疫苗(用于监测顺应性)。在确定没有安全性问题后，向对象提供足够剂量的研究药物以便在家完成另外两周给药。
对象将在其维持治疗期的最后一次给药翌日返回医疗机构，进行以下程序：有针对性的体检、生命体征、PEF、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液妊娠试验、审阅AE和伴随用药日志、审阅研究药物给药日志、并归还研究药物容器和任何未使用的花生变应性疫苗(用于监测顺应性)，用于检测花生特异性IgE和IgG4水平的采血以及花生提取物和非花生提取物(筛选时选择的)的终点滴定PST。对象于6天后返回进行针对花生的DBPCFC。
在18周剂量递增中不耐受花生变应性疫苗的对象不适合参与额外的为期12周的花生变应性疫苗维持治疗，他们在研究药物最后一次给药完成4周后返回医疗机构进行最后临床访视。
G.最后研究访视
所有对象在研究药物最后一次给药完成4周后返回医疗机构进行最后研究访视。进行以下程序：审阅AE和伴随用药日志、完整的体检、体重、PEF、生命体征、示差CBC、血清化学、尿液分析、为WCBP进行的尿液妊娠试验、为检测花生特异性IgE和IgG4水平的采血和对花生提取物和非花生提取物(在筛选时选择的)进行的终点滴定PST。
如果对象在研究早期退出，可行的话，进行在最后研究访视中描述的所有评估。在最后研究访视中，对发生可能与研究药物相关的AE的任何对象进行追踪，直到事件解决或稳定。
所有花生变应性对象在研究过程中可以继续使用他们通常使用的药物，包括用于治疗哮喘、变应性性鼻炎和特应性皮炎的药物(除了在排除标准中列出的药物)。对象必须能够在皮肤测试和DBPCFC前暂停抗组织胺剂(抗组胺剂的5个半衰期)。在皮肤测试时允许定期使用局部类固醇。如果在本试验过程中大量口服类固醇来治疗变应性反应，那么无法给予DBPCFC，直到口服类固醇治疗完成后至少两周。
如果出现任何与花生变应性疫苗给药相关的死亡，本研究将终止。如果与花生变应性疫苗给药相关的严重过敏反应(紫绀或Sp02在任何阶段<92％、低血压、精神错乱、虚脱、意识丧失或大小便失禁)发生超过1次，那么停止研究招募和已入选本试验的对象进一步给药，直到数据安全监测委员会(DSMB)召集并确认该试验可安全进行。
诊断及主要入选标准：
18至50岁、有确定花生变应性反应史并满足以下三项主要纳入标准的对象将被纳入本研究：1)筛选访视中针对花生的阳性PST[在15-20分钟的风团平均直径比阴性对照(盐水)引起的风团大3mm]，2)筛选访视时血清花生特异性IgE水平大于或等于0.35kUA/L(UniCAP)，和3)筛选访视时针对花生的阳性DBPCFC累积剂量小于1g花生蛋白，符合一项或多项排除标准的患者被排除。
符合任何排除标准的对象将被排除在研究外。排除标准包括需要机械通气和静脉血管升压药的严重过敏事件史(即对象心肺呼吸骤停)；根据NHLBI分类超过轻度的持续性哮喘，在筛选时预计1秒用力呼气容积(FEV1)<80％，特应性皮炎不受控制或持续激活，过去一年因哮喘住院或过去6个月内因哮喘进行急诊，嗜酸性胃肠炎，筛选30天内使用过口服或IV皮质类固醇，皮肤测试和DBPCFC时无法停止抗组胺药，筛选1年内使用过奥马珠单抗或其他非传统形式的变应原免疫治疗或免疫调节疗法(不包括皮质类固醇)或生物治疗，筛选一年内进行过任何其他变应原免疫治疗，筛选30天内使用过免疫抑制药物，使用β-受体阻滞剂(口服)，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，血管紧张素受体阻断剂(ARB)或钙通道阻滞剂，临床显著的免疫抑制、神经、心脏、肺、肝、风湿病、自身免疫疾病、或肾脏疾病病史，体检和/或实验室研究，包括尿液分析，妊娠或哺乳期(如果是女性)；在研究者看来会影响对象理解和研究方案合作的行为、认知或精神疾病，已知对研究药物无活性成分有变应性，已知对燕麦粉(DBPCFC的安慰剂)有变应性，以及/或筛选30天内参与另一个研究性疫苗或药物试验。
实施例9：制造含有包封的一种或多种流感病毒颗粒片段的纳米颗粒
本实施例描述了示例性的用双乳化(水包油包水)方法制备含有一种或多种流感病毒颗粒片段的纳米颗粒。在某些实施方式中，期望包封“流感片段”来治疗或预防流感感染后的恶化，比如，通过口服免疫。简言之，用蛋白浓度约为60mg/mL的AEE来重建含有一种或多种流感病毒颗粒片段的抗原粗提物，其浓度也为60mg/mL。也可以使用更高或更低浓度的AEE和/或粗提取物。AEE-粗提取物溶液用PLGA的二氯甲烷溶液(约35.7mg/mL)匀浆化，使水和有机比例达到0.20mL：28mL。此混合物为第一乳剂。
在某些实施方式中，如果期望增加表面相关疏水性成分比例(诸如LPS)，那么将如实施例2所述的OEE溶解在含有5％的水性PVA中，总LPS的浓度为约2.2mg/mL。也可以使用更高或更低浓度的OEEPVA溶液。将一半第一乳剂(14mL)加入OEE-PVP溶液(14mL)中并均质化。此混合物为第二乳剂。
将第一或第二乳剂(28毫升)(如果产生)加入到935mL的0.33％水性PVA中，并搅拌约4小时，使二氯甲烷蒸发。浓缩纳米颗粒悬浮液，并通过离心将纳米颗粒分离。除去上清液后，用水将纳米颗粒洗涤2至3次，再重新悬浮于水中，并通过冷冻干燥分离。
实施例10：纳米颗粒组合物的模拟消化
在某些实施方式中，如本文别处所讨论的，所述纳米颗粒可以通过任何医学上适当的途径给药，例如，通过口服给药。本实施例证实，所述纳米颗粒组合物可稳定的暴露于模拟胃液中长达四个小时，和/或在模拟肠液中长达12个小时，并且模拟消化之后，没有检测到抗原(这里指OVA)的显著泄漏。
在本实施例中，将包被了大肠杆菌有机提取物(OEE)的纳米颗粒、包封了大肠杆菌DNA和OVA的纳米颗粒(也称为“OEE/DNA+OVA”)暴露于模拟胃液(SGF)长达四个小时和/或暴露于模拟肠液(SIF)长达12个小时。暴露后，通过离心的方法，将被破坏的纳米颗粒膜和任何完整的纳米颗粒从上清液中分离，该上清液中含有可能从部分被消化的纳米颗粒中“泄露”的材料。随后用蛋白免疫印迹和抗OVA血清检测每个样品。该过程的流程图如图18所示。
图19显示了纳米颗粒在SGF中消化长达四个小时后，分别分析上清液(“sup”)和沉淀的蛋白免疫印迹结果。此外，完整的OEE/DNA+OVA纳米颗粒(未消化的)作为阳性对照。如图19中所示，在试验样品的上清液中没有检测到OVA，而大量的OVA仍然留在沉淀纳米颗粒中。这一结果表明，纳米颗粒在SGF中可稳定长达四个小时。
图20显示了纳米颗粒在SIF中消化长达12个小时后，分别分析上清液(“sup”)和沉淀的蛋白免疫印迹结果。此外，完整的OEE/DNA+OVA纳米颗粒(未消化的)作为阳性对照。如图20所示，在试验样品的上清液中没有检测到OVA，而大量的OVA仍然留在沉淀纳米颗粒中。这一结果表明，所述纳米颗粒在SIF中可稳定长达12个小时。
图21显示了纳米颗粒在SGF中消化四个小时，再用SIF消化长达12个小时后，分别分析上清液(“sup”)和沉淀的蛋白免疫印迹结果。此外，完整的OEE/DNA+OVA纳米颗粒(未消化的)作为阳性对照，只部分消化(仅仅是SGF)的OEE/DNA+OVA样品也作为对照。如图21所示，在试验样品的上清液中没有检测到OVA，而大量的OVA仍然留在沉淀纳米颗粒中。这一结果表明，所述纳米颗粒可在SGF消化四个小时又在SIF消化十二个小时后保持稳定。不像图19和图20那样，图21还包含一个OVA对照泳道。在测试条件下，上清液中缺乏可检测水平的OVA，这表明所述纳米颗粒能够在足以防止OVA逃逸的条件下抵抗模拟消化。
本实施例证实，在某些实施方式中，所述纳米颗粒能够在模拟胃液和/或肠环境中稳定存在生物学相关时间段。该数据还证实，根据各种实施方式，所述纳米颗粒口服给药是适当的。
实施例11：体外刺激CD8+或CD4+T细胞活性
本实施例证实了所述纳米颗粒能够刺激CD8+和/或CD4+活性。如下表6所描述的制备纳米颗粒：
表6：实验组设计
在本实施例中，来自C57/BL6小鼠的骨髓来源的树突状细胞(BMDC)与表6中的一种纳米颗粒或对照共同孵育24小时。随后，暴露的树突状细胞(DC)与OVA特异性CD8+T细胞共孵育3天，测定CD8+T细胞的增殖以及IL-2和IFNγ的产生。
图22A显示了OVA特异性CD8+T细胞暴露于经所述纳米颗粒或对照处理的DC24小时后的增殖倍数。如图22A所示，OEE/DNA+OVA处理导致抗原特异性CD8+T细胞的增殖量最高，显著大于任何其他处理组或对照组。未包被的DNA+OVA纳米颗粒、OEE包被的空纳米颗粒、包封了OVA的未包被纳米颗粒、或含有OVA并包被了CpG的纳米颗粒处理也显示了增殖增加，虽然与OEE/DNA+OVA相比，其程度较小。
图22B显示了经如上所述处理的抗原特异性CD8+T细胞产生的IL-2的量。有趣的是，暴露于含有大肠杆菌DNA和OVA并且未包被的纳米颗粒、以及仅含有OVA并且包被了OEE的纳米颗粒的DC产生了最大量的IL-2，而暴露于含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒的DC显示了相对少的IL-2应答。
图23C显示了经如上所述处理的抗原特异性CD8+T细胞产生的IFNγ的量。如图23C所示，经含有OVA并且包被了OEE的纳米颗粒处理的DC产生了最大量的IFNγ，而经如下纳米颗粒之一处理的DC也显示了IFNγ产生水平的增加：含有OVA和CpG并且未包被的纳米颗粒、含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒、或者含有大肠杆菌DNA和OVA并且未包被的纳米颗粒。
虽然所述纳米颗粒给药产生的IL-2小于大肠杆菌给药产生的IL-2，但所述纳米颗粒给药导致CD8+T细胞的增殖更多，表明所述纳米颗粒，在某些实施方式中，能够呈递MHCI类抗原。
使用与上述的研究中相同的设计分析T细胞增殖和IFNγ的产生，只检查CD4+T细胞，而不是CD8+T细胞。图23A显示了CD4+T细胞增殖的结果，其中含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒或仅含有OVA并且包被了OEE的纳米颗粒都能显著增强CD4+T细胞增殖。此外，用仅含有OVA或者含有OVA+大肠杆菌DNA的未包被纳米颗粒也引发显著增加的CD4+T细胞增殖。在每一种情况下观察到的增殖水平的增加与仅暴露于死亡大肠杆菌或含有OVA的死亡大肠杆菌的组中观察到的增殖水平增加相似。
图23B显示了经上述处理后CD4+T细胞产生的IFNγ的量。在这种情况下，含有大肠杆菌DNA和OVA并且包被了OEE的纳米颗粒导致IFNγ产生量增加最强，增加超过两倍。
实施例12：大肠杆菌有机提取物(OEE)诱导树突状细胞和CD4+T细胞产生细胞因子
如本文中多种实施例所述，对象中的免疫应答可以根据具体实施方式或给药实施方式而不同。为了部分地表征用OEE包被纳米颗粒的重要性，在OEE/DNA+OVA纳米颗粒或含有大肠杆菌DNA和OVA并且未包被的纳米颗粒给药后，检测树突状细胞和CD4+T细胞产生的细胞因子，与对照组之一进行比较，对照组设置如下述：含有OVA并且未包被的纳米颗粒(阴性对照)，或含有OVA的死亡大肠杆菌(阳性对照)。
图24A显示了暴露于一种上述试剂后，白细胞介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白细胞介素-6(IL-6)、或肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生量。如图24A所示，每种类型的纳米颗粒给药均导致TNFα和IL-6(OEE/DNA+OVA也导致一些IL-10产生)的产生，而含有OVA的死亡大肠杆菌给药导致DC群体中观察到IL-10、TNFα和最大量IL-6的表达。
图24B显示了暴露于上述处理之一后产生的IL-10、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素-5(IL-5)、或IFNγ的量。如图24B所示，每个试验条件下均产生IFNγ，含有大肠杆菌DNA和OVA并且未包被的纳米颗粒导致IFNγ的产生水平最高。有趣的是，OEE/DNA+OVA纳米颗粒和含有OVA的死亡大肠杆菌均比其他组显示出更多的IL-10的产量，OEE/DNA+OVA纳米颗粒还导致产生IL-13和IL-5。
如图24A和B所示，OEE/DNA+OVA比含有DNA+OVA并且未包被的纳米颗粒诱导产生明显更少的IL-13，不希望被特定理论束缚，在某些实施方式中，诱导更少的IL-13产生可能是有利的。此外，与未包被的DNA+OVA纳米颗粒相比，OEE/DNA+OVA诱导更高的IL-10产生。再次重申，不希望被特定理论束缚，在某些实施方式中，诱导更多的IL-10产生可能认为是有利的。
实施例13：抗原递送至树突状细胞的评估
在本实施例中，比较OEE/DNA+OVA纳米颗粒中的OVA抗原的摄取和单独可溶性OVA的摄取。简而言之，将纳米颗粒同C57/Bl6小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)一起孵育1小时、4小时、8小时、24小时、72小时、或1周。在本实施例中，如图25A-F和26A-F所示，所述纳米颗粒用德克萨斯红染色，BMDC用F-肌动蛋白鬼笔环肽-AF488染色，在图25和26中，细胞核染成蓝色。
图25A-F显示了示例性的分别暴露于可溶性OVA(图A、B和C)或OEE/DNA+OVA纳米颗粒(图D、E和F)1、4、或8小时的树突状细胞的共聚焦显微镜照片。明亮的线条显示细胞骨架，核被显示为深蓝色，内化的抗原显示为亮红色点状(示例抗原用箭头表示)。如图25D所示，在给药1小时后，在暴露于OEE/DNA+OVA纳米颗粒的树突状细胞内部就检测到了抗原，在4小时和8小时后，树突状细胞中抗原的数量增加。与此相反，暴露于可溶性OVA的树突状细胞甚至在给药8小时后只显示出几乎检测不到的抗原负载水平。
除了检查在1小时、4小时或8小时孵育之后所述纳米颗粒对树突状细胞的影响之外，还检查了24小时、72小时、和1周等更长的时间点。图26A-F显示了通过与上述相同的方法产生的示例性共焦显微镜图像，除非另有规定。图A、B和C分别显示了暴露于可溶性OVA24小时、72小时、或1周的树突状细胞。图D、E和F分别显示了暴露于OEE/DNA+OVA24小时、72小时、或1周的树突状细胞。如图A和D所示，每个处理组均在24小时后观察到了相等水平的OVA，到第72小时时，图B和E表明可溶性抗原已被清除。重要的是，1周后，图F示出包封在所述纳米颗粒的OVA仍然存在于树突状细胞中，而可溶性OVA不再能检测到。
本实施例表明，与可溶性抗原的单独施用相比，抗原在所述纳米颗粒中包封导致抗原摄取更快，在树突状细胞中的停留时间更长。
实施例14：所述纳米颗粒在淋巴结和脾脏中的累积
本实施例证实了所述纳米颗粒能够累积在特定的组织中，如淋巴结和脾脏。具体地讲，比较了含有OVA并且未包被的纳米颗粒、单独可溶性OVA、和OEE/DNA+OVA纳米颗粒在淋巴结和/或脾中的累积能力。
简言之，C57/Bl6小鼠经口强饲喂食下列处理之一：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、德克萨斯红染色的可溶性OVA、含德克萨斯红标记的OVA的未包被的纳米颗粒、或含有大肠杆菌DNA和德克萨斯红标记的OVA并包被了大肠杆菌有机提取物(OEE)的纳米颗粒(在该实施例中也被称为“OEE/DNA+OVA”)。给药后约24小时，处死小鼠，从每只动物中收集淋巴结和脾脏，淋巴结按照类型合并。然后读取荧光值并除以细胞数，减去磷酸盐缓冲盐水(PBS)的荧光值，小鼠淋巴结的荧光为背景荧光值。
图27显示了C57/Bl6小鼠在所述纳米颗粒或相关对照给药后24小时颈椎、腹股沟、和肠系膜淋巴结的荧光值/细胞数图。如图27所示，每个处理组均显示出颈部淋巴结的累积，未包被的纳米颗粒显示出最大累积量。只有未包被的纳米颗粒显示出在腹股沟淋巴结的明显累积。有趣的是，只有OEE/DNA+OVA纳米颗粒表现出在肠系膜淋巴结的累积。
除淋巴结外，还分析了在脾脏的累积。简单地说，获取脾脏，通过器官质量归一化，并按上述进行荧光测定。图28显示了每个测试组的荧光值/脾脏质量。图28A显示了在脾脏的平均OVA累积，OEE/DNA+OVA组比其他两个测试组在24小时后显示出了脾脏中显著更多的OVA累积。图28B显示了每个处理组中OVA在脾脏的百分比，其经总荧光数进行归一化。如图28B所示，OEE/DNA+OVA组中2.5％的给药OVA进入脾脏。
实施例15：抗原特异性CD4+T细胞应答的体内刺激
本实施例证实了述纳米颗粒组合物可以口服给药，在体内对免疫系统发挥显著抗原特异性效应。在本实施例中，所述组合物对体内CD4+T细胞的作用在口服给予所述组合物后得到了证实。
具体而言，在本实施例中，分离Thy1.1-OT-IICD4+T细胞，并用CellTraceViolet染色。接着，C57/Bl6小鼠静脉内注射染色CD4+细胞。约24小时后，通过口腔喂食法给予小鼠PBS(作为对照)或包被了大肠杆菌细胞培养液的有机提取物(OEE)并且包封了大肠杆菌DNA和卵白蛋白(OVA)的纳米颗粒。每种剂量或所述纳米颗粒大致包括如下：4mg纳米颗粒、69μgOVA、14μg大肠杆菌DNA、以及3.18-11AU内毒素。本实施例所述的纳米颗粒为了方便起见被称为“OEE/DNA+OVA”。三天后，处死小鼠，从脾脏、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、和颈淋巴结中分离组织，并且用荧光激活细胞分选系统(FACS)染色。该实验设计如下所示：
根据说明书进行CellTraceViolet分析。简而言之，浸渍的OT-II细胞被新鲜染色，显示最大荧光值。当OT-II细胞分裂，如对抗原介导刺激的应答，染料在子细胞之间分布。其结果是，下降荧光值的每一个峰代表新一代细胞。可预计，分裂越多，存在的总抗原特异性细胞数越高。不希望被特定理论束缚，可以预期分裂细胞百分比的增加表明所述纳米颗粒能耐受消化并在小鼠中向APC呈递抗原。
如图29A-D所示，每个分析组织中均观察到OVA特异性T细胞群的统计学显著性增加。图29A显示了脾脏中CD4+OVA特异性T细胞的数量增加，而图29B、C和D分别显示出在腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、和颈部淋巴结有类似增加。
本实施例证实，所述纳米颗粒组合物可以口服给药，并对患者体内T细胞表现出显著的抗原特异性效果。
等同
本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验确定与本发明所述的具体实施方式的许多等同方式。本发明的范围并不旨在局限于上述描述，而是局限于下述权利要求。

Claims (60)

1.纳米颗粒组合物，其包括：
多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物；和
包封在所述内腔中的亲水性细胞成分制品。
2.纳米颗粒组合物，其包括：
多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物；和
与所述外表面相关联的疏水性细胞成分制品。
3.纳米颗粒组合物，其包括：
多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物；
包封在所述内腔中的亲水性细胞成分制品；和
与所述外表面相关联的疏水性细胞成分制品。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述亲水性细胞成分制品包括细胞制品的亲水性提取物。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述疏水性细胞成分制品包括细胞制品的疏水性提取物或由细胞制品的疏水性提取物组成。
6.根据权利要求4所述的纳米颗粒组合物，其中所述亲水性提取物包括所述细胞制品的水性提取物或由所述细胞制品的水性提取物组成。
7.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，所述组合物包括抗原。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原是变应性抗原或包括变应性抗原。
9.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原是过敏性抗原或包括过敏性抗原。
10.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原是传染性抗原或包括传染性抗原。
11.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原是自身抗原或包括自身抗原。
12.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原是疾病相关抗原或包括疾病相关抗原。
13.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原被部分地或全部包封在所述内腔中。
14.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原部分地或全部与外表面相关联。
15.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原与所述纳米颗粒混合，使其均在整个所述组合物中分散。
16.根据权利要求7所述的纳米颗粒组合物，所述组合物包括第一抗原和第二抗原，所述第一抗原被部分地或全部包封在纳米颗粒的内腔中，所述第二抗原部分地或全部与纳米颗粒的外表面相关联。
17.根据权利要求10所述的纳米颗粒组合物，其中所述传染性抗原具有传染剂的一种或多种附加成分。
18.根据权利要求7-12中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗原或传染剂选自下组：食物抗原、微生物抗原、病毒抗原、肿瘤抗原和环境抗原。
19.根据权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述亲水性细胞成分和疏水性细胞成分中的至少一种由微生物细胞制品提供。
20.根据权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述亲水性细胞成分和疏水性细胞成分中的至少一种由肿瘤细胞的细胞制品提供。
21.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述生物可降解或生物相容性聚合物是聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
22.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物。
23.包括给予需要的对象纳米颗粒组合物的方法，所述纳米颗粒组合物包括：
多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物；和
包封在所述内腔中的亲水性细胞成分制品。
24.包括给予需要的对象纳米颗粒组合物的方法，所述纳米颗粒组合物包括：
多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物；和
与所述外表面相关联的疏水性细胞成分制品。
25.包括给予需要的对象纳米颗粒组合物的方法，所述纳米颗粒组合物包括：
多个纳米颗粒，其中每一个纳米颗粒均包括排列成形成内腔和外表面的纳米颗粒结构的生物可降解或生物相容性聚合物；
包封在所述内腔中的亲水性细胞成分制品；和
与所述外表面相关联的疏水性细胞成分制品。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述亲水性细胞成分制品包括细胞制品的亲水性提取物。
27.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述疏水性细胞成分制品包括细胞制品的疏水性提取物或由细胞制品的疏水性提取物组成。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述亲水性提取物包括所述细胞制品的水性提取物或由所述细胞制品的水性提取物组成。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物包括抗原。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原是变应性抗原或包括变应性抗原。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原是过敏性抗原或包括过敏性抗原。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原是传染性抗原或包括传染性抗原。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原是自身抗原或包括自身抗原。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原是疾病相关抗原或包括疾病相关抗原。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原被部分地或全部包封在所述内腔中。
36.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原部分地或全部与所述外表面相关联。
37.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原与所述纳米颗粒混合，使其均在整个所述组合物中分散。
38.根据权利要求29所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物包括第一抗原和第二抗原，所述第一抗原被部分地或全部包封在纳米颗粒内腔中，所述第二抗原部分地或全部与纳米颗粒的所述外表面相关联。
39.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述对象患有变应性反应、传染和癌症中的至少一种。
40.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒经由静脉内、皮内、经皮、口服、皮下和/或粘膜给药。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述粘膜给药是经由口腔、鼻腔、支气管、阴道、直肠和/或舌下给药。
42.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原选自下组：食物抗原、微生物抗原、病毒抗原、肿瘤抗原和环境抗原。
42.权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述亲水性细胞成分和疏水性细胞成分中的至少一种由微生物细胞制品提供。
43.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述亲水性细胞制品和疏水性细胞制品中的至少一种由肿瘤细胞的细胞制品提供。
44.根据权利要求23-43中所述任一项的方法，其中所述生物可降解或生物相容性聚合物是聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
45.形成纳米颗粒组合物的方法，其包括：
提供一种或多种亲水性细胞成分制品；
提供生物可降解或生物相容性聚合物；
将所述亲水性细胞成分制品和所述生物可降解或生物相容性聚合物相关联；和
形成纳米颗粒结构，其中所述生物可降解或生物相容性聚合物形成内腔和外表面；
其中所述亲水性细胞成分被包封在所述内腔中。
46.形成纳米颗粒组合物的方法，其包括：
提供一种或多种疏水性细胞成分制品；
提供生物可降解或生物相容性聚合物；
将所述疏水性细胞成分和所述生物可降解或生物相容性聚合物相关联；和
形成纳米颗粒结构，其中所述生物可降解或生物相容性聚合物形成内腔和外表面；
其中所述疏水性细胞成分与所述外表面相关联。
47.形成纳米颗粒组合物的方法，其包括：
提供细胞制品；
将所述细胞制品分离成亲水性细胞成分制品和疏水性细胞成分制品；
提供生物可降解或生物相容性聚合物；
将所述亲水性细胞成分制品和所述生物可降解或生物相容性聚合物相关联；
将所述疏水性细胞成分制品和所述生物可降解或生物相容性聚合物相关联；和
形成纳米颗粒结构，其中所述生物可降解或生物相容性聚合物形成内腔和外表面；
其中所述亲水性细胞成分被包封在所述内腔中，所述疏水性细胞成分与所述外表面相关联。
48.根据权利要求45或47所述的方法，其中所述亲水性细胞成分制品包括细胞制品的亲水性提取物。
49.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述疏水性细胞成分制品包括细胞制品的疏水性提取物。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述亲水性提取物包括所述细胞制品的水性提取物。
51.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物进一步包括抗原。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原是变应性抗原或包括变应性抗原。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原是过敏性抗原或包括过敏性抗原。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原是传染性抗原或包括传染性抗原。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原是自身抗原或包括自身抗原。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原是疾病相关抗原或包括疾病相关抗原。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原被部分地或全部包封在所述内腔中。
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗原部分地或全部与所述外表面相关联。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物包括第一抗原和第二抗原，所述第一抗原被部分地或全部包封在所述内腔中，所述第二抗原部分地或全部与所述外表面关联。
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