JP2001505043A

JP2001505043A - 遺伝子導入

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Publication number: JP2001505043A
Application number: JP50225698A
Authority: JP
Inventors: 伸子内田; ツカモト・アン; ワイスマン・イルヴィング
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト; システミックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2001-04-17
Also published as: CA2257880A1; IL127416A0; US5928638A; WO1997048815A2; WO1997048815A3; AU3339497A; EP0914461A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子導入に先立ち、該細胞をヒドロキシ尿素と接触させてＧ０にある造血幹細胞（ＨＳＣｓ）を活性細胞周期に誘導することによって、ＨＳＣｓへの遺伝子導入を最適化する方法を提供する。本発明方法は、遺伝子治療によって適切に治療されるか、又は造血細胞が関与する疾患に苦しむ患者の治療に有用である。本発明は又、ヒドロキシ尿素を投与してＨＳＣ収率を増加させて、骨髄移植の効率を増大させる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子導入技術分野本発明は、造血幹細胞遺伝子治療及び骨髄移植に関する。背景技術殆どの成熟血液細胞の寿命は短く、成人の生活を通して連続的に入れ替わらなければならない。成熟血液細胞の一生の間の生産は、主に骨髄に位置する多能性の造血幹細胞（ＨＳＣ）の小集団に負っている。これらの幹細胞は、自己複製が可能である他に、赤芽球、骨髄性細胞、及びリンパ系細胞という主な三種類の子孫細胞（progenitor）の内の一つに不可逆的に係わる子孫細胞を生産することが出来るものである。赤芽球子孫細胞からは赤血球が生じる。骨髄性細胞系列（系統）からは好中球及び単球、並びに血小板、肥満細胞、好酸球及び好塩基球が生じる。リンパ系細胞系列からはＢ及びＴリンパ球及びＮＫ細胞が生じる。幹細胞には実質的な自己複製能及び全ての造血細胞系列に増殖・分化することのできる能力があるので、数々の遺伝子治療方法の標的としてこの幹細胞が選ばれている。遺伝子導入が成功するには、所望遺伝子を発現する修飾細胞及びその子孫細胞を有する個人が再び長期間、生存することができなければならない。造血細胞に影響を与える疾患は数多くあり、それら疾患を軽減したり治療したりする為に、遺伝子治療及び／又は骨髄移植は有用である。このような疾患には、重度複合免疫不全球貧血等がある。血球は限られた生活サイクルを有しているので、Ｔ細胞のようなより成熟した造血細胞への遺伝子導入では、せいぜい、一時的な治療効果しか与えることが出来ない。例えば、ＳＣＩＤ患者には、正常なＡＤＡ遺伝子を該患者のリンパ球内にエキソビボ（生体外）で導入して、こうして遺伝子導入されたリンパ球を再び患者に注射して戻すような治療が施されている(Biotechnology N ews（1993）13:14)。効果的な治療の為には、ＡＤＡを有するリンパ球を六ヶ月毎に注入しなければならない。ＨＳＣ内にＡＤＡ遺伝子を導入することができれば、ＡＤＡを有する幹細胞が骨髄を再び占めて(repopulate)、完全に該疾患を治療することができるので、上記のような複数回の治療をする必要がなくなる。即ち、造血幹細胞の導入及び移植によって、患者の生存期間中、遺伝的に修飾された造血細胞の連続的供給を確保する手段を提供することができるので、遺伝子治療の努力はこの造血幹細胞に集中している。造血幹細胞には、造血システムが何らかの理由により使い果たしたような場合に、血球数を回復する為の最終的な責任がある。ＤＮＡ及びレトロウイルス並びにその他の核酸輸送ビークルが遺伝子治療において遺伝子の導入に使用されて来た。遺伝子治療を行う為の核酸形質導入の媒体として、レトロウイルスベクターは形質導入効率が高い為に、他のベクターよりも好まれてきた。他の利点として、遺伝子の再配列の可能性が低いこと、目的遺伝子の導入コピー数が一つ又は少ないことがある。しかしながら、骨髄には幹細胞は数少なく、主に静止（quiescent）状態にあるので、ＨＳＣｓに形質導入することは困難な作業である。レトロウイルスの組み込み、ＨＳＣｓ及びそれらの子孫への安定的な形質導入の為には、該細胞が活性な細胞周期（サイクル）の状態であることが要求される。幹細胞の大部分は細胞周期のＧＯ期にあり、即ち、それらは活性化されてサイクリングしていない、即ち、周期状態にない(Gordon et al．（1994）Leukemi a 8:1068-1073)。ＨＳＣ形質導入の為の条件を最適にする為の努力は、周期における幹細胞の割合を増加させることに集中されていた。サイトカインが培養幹細胞におけるサイクリングを誘発させる為に使用されてきた。例えば、Reddy et al．（1995）Exp．Hematol．22:813には、ＩＬ−３，ＩＬ−１α，ｂＦＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１及び幹細胞因子から成るサイトカインカクテルに反応して、精製した骨髄幹／子孫細胞がＧＯ／Ｇ１からＳ期にインビトロで同期で進行したことが報告されている。Peters et al．（1995）Exp．Hematol．23:461には、ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＩＬ−１１及びＳＣＦから成るサイトカインカクテルを使用して骨髄をインビトロで４８時間培養することによって、マウス造血子孫細胞を増殖させたことが記載されている。しかしながら、これら又はその他のサイトカインカクテルによる処理では細胞分化を引き起こしてしまい、多能性が喪失してしまう。ＩＬ−７は、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）から単離した白血病細胞を後期Ｇ１に捕捉することによって、該白血病細胞のインビトロにおける増殖を阻止することが見出された。しかし、かかる増殖阻害は細胞の成熟が伴うものであった(Skonsberg et al．（1991） Blood 77::2445-2450)。もう一つの方法では、マウス骨髄細胞をイソロイシン欠如培地で培養することによってＧ１／Ｇ０期で捕捉した(Reddy et al．（1995）Exp．Hematol．23:8 13)。採取した骨髄細胞をサイトカイン中で予め培養（前培養）することは、該細胞を剌激して活性細胞周期に入れることによつてレトロウイルス形質導入効率を増大させる為に日常使用されている。レトロウイルスによる組み込みを増大させる為のこのようなプロトコールの一つは、Kittler et al．（1994）Blood 84:344A に記載されている。この操作では、単離したマウス骨髄細胞をサイトカインカクテルを含有する培地中で４８時間前培養し、その後、更に４８時間同じサイトカイン及び培地中でレトロウイルスプロデューサーセルラインと共に培養し、該細胞を宿主マウスに注射する。しかしながら、この操作法によれば、骨髄内の移植レベルが低く、骨髄又は末梢血内へのレトロウイルスによる形質導入を達成することは出来なかった。もう一つの試みは、骨髄移植の前に、マウスをウイルス生産細胞（プロデューサーセルライン）と共に培養するに先立ち又はその間、５− フルオロウラシル（５−ＦＵ）及び増殖因子（ＩＬ−３，ＩＬ−６又は両方）で前処理することである(Bodine et al．（1991）Exp.Hematol．19:206)。しかしながら、５−ＦＵは毒性薬物である。この毒性は後述する実施例で示す(表３)。サイトカイン又はその他の試薬を用いて幹細胞を細胞周期に入れる契機とする為のこれまでに報告された方法は、殆どがインビトロ又はエキソビボで実施されたものであった。デカペプチド（ｐＥＥＤＣＫ）₂をマウスに注射して、静止状態のコロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）を細胞周期に入れる契機とし、幹細胞集団の増大を誘発した例が一つある (Paukovis et al．（1995）Cancer Research Therapy & Control，4:203-209)。従って、長期間に亘って造血幹細胞の遺伝子治療が成功する為には、効率的なベクターの組み込み及び造血細胞の多能性を維持することの必要性が残されている。多能性を喪失することなく、活性周期にあるＨＳＣｓを増加させ、それに誘導する為の方法を確立することが望まれている。更に、この方法は、治療を受ける患者にとって最小限の毒性でインビボに適用できなければならない。本発明は、これらの要求を満たし、関連する利点も提供できるものである。本発明は、哺乳動物の造血幹細胞（ＨＳＣｓ）への遺伝子導入を増大する方法であって、遺伝子導入前に、該ＨＳＣｓを、活性サイクリング（actively cycli ng）するＨＳＣｓの数を少なくとも１．５倍に増加させる為に有効な量のヒドロキシ尿素（ＨＵ）と接触させること、から成る方法を提供する。この方法は、インビトロ、インビボ、又はエキソビボで遺伝子導入を実施するのに適している。本発明の別の態様として、遺伝子導入によって軽減（緩和）される疾患に苦しむ患者の治療法であって、ＧＯにあるＨＳＣｓを活性細胞周期に入れるのに有効な量のヒドロキシ尿素を該患者に投与するか、又は、後期Ｇ１初期Ｓ期において治療間隔が周期に入った全ての細胞を集め、その後に、該疾患を軽減するのに適したウイルスによる形質導入によって有効量の治療用遺伝子を投与すること、から成る治療法を提供する。更に本発明の態様として、骨髄移植の効率を増大する方法であって、骨髄を採取する前に、ヒドロキシ尿素を骨髄提供者（ドナー）に投与する方法を提供する。骨髄提供者は、該提供者から幹細胞を採取する前に、移植に利用できるＨＳＣｓの数を少な〈とも１．５倍に増加させるのに有効な量のヒドロキシ尿素を投与される。更に、本発明の態様として、サイクリングする造血幹細胞（ＨＳＣｓ）に対する、被験試薬の生物学的効果をスクリーニングする方法であって、以下の工程：ａ）インビトロでＨＳＣｓ集団を活性サイクリングするＨＳＣｓの数を少なくとも１．５倍に増加させるのに有効な量のヒドロキシ尿素で処理し；ｂ）ヒドロキシ尿素で処理されたＨＳＣｓ集団を培養中で該被験試薬と接触させ；ｃ）ＨＳＣｓに対する、ＨＳＣｓの分化、増殖又は自己複製から成る群から選択される該試薬の生物学的効果を決定するのに適した条件下で、工程ｂ）のＨＳＣｓをアッセイする、ことから成る方法。図面の簡単な説明図１は、パネルＡからパネルＧにおいて、サイトカイン及び／又は化学治療剤による可動化（mobilisation）に続く、骨髄及び末梢における活性細胞周期でのＨＳＣｓのパーセンテージを示す。マウスＨＳＣｓは、ｃ−kit⁺Ｔｈｙ−１．１^lo Ｌｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺（ＫＴＬＳ）に対する染色に基づいて選択し、ヒトＨＳＣｓは、ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺ Ｌｉｎ^-を選択した。ＢＭは骨髄、ＭＰＢは可動化末梢骨髄、ＣＴＸＬはシクロスフォスファミドを示す。図２は、パネルＡからパネルＦにおいて、ヒドロキシ尿素による処理が骨髄（ＢＭ）におけるＨＳＣｓのパーセンテージを増加させること(パネルＡ対パネルＢ)、更に、可動化末梢ＨＳＣを分裂周期に誘発及び／又は集積することを示している。図３は、パネルＡからパネルＦにおいて、ＫＴＬＳ幹細胞の単離に先立ち３日間ＨＵ（100mg／kg／day）で処理したマウスから分離した、精製ｃ−kit⁺Ｔｈｙ −１．１^loＬｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺（ＫＴＬＳ）幹細胞の移植による多系列（系統）再構成（multilineage reconstitution）を示す。各マウスにおける移植ＫＴＬＳ細胞から発生したLy−５を有するＭａｃ−１⁺＆Ｇｒ−１⁺，Ｂ２２０⁺又はＣＤ３⁺細胞のパーセンテージを各パネルに示す。上の列は１０ＫＴＬＳ細胞を注射されて第２４週に分析されたマウスを示す。下の列は５０Ｓ／Ｇ２／ＭＲｈ１２３^midＫＴＬＳ細胞を注射されて第１６週に分析されたマウスを示す。図４は、正常、非−ＨＵ処理マウスにおける各Ｔｈｙ−１．１^loＬｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺ＨＳＣｓの生産的生存期間（productive lifespan）の例である。提供者の印がついた幹細胞の長期間及び一時的な再構成は、末梢血におけるＭａｃ− １／Ｇｒ−１細胞の運命を追跡することによって検出される。図５は、ＨＵ処理マウスから単離され、提供者の印がついたＴｈｙ−１．１^lo Ｌｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺（ＫＴＬＳ）ＨＳＣｓのインビボでの生産的生存期間（p roductive lifespan）を示す。グラフは、１０ＨＵ処理されたＫＴＬＳ細胞（Ｌｙ−５．２）＋１０⁵正常骨髄細胞（Ｌｙ−５．１）の競合的再構成アッセイを示す。図６は、競合的再構成アッセイにより分析した、１日当たり約１００mg／kg／ body weightのＨＵで処理したマウスから単離され、提供者の印がついたｃ−kit⁺ Ｔｈｙ−１．１^loＬｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺（ＫＴＬＳ）ＨＳＣｓのインビボでの生産的生存期間を示す。これらの図は、以下に示すような競合的アッセイにおいて、如何に幹細胞クローンが致死的に放射線を浴びたマウスを再構成するかの代表的な二つの例である。長期の多系列再構成（multilineage reconstitution）及び一時的骨髄発生を伴う多系列再構成の両者を示す。長期間の再構成では、骨髄性細胞（Ｍａｃ−１＆Ｇｒ−１）は末梢血に捕捉されているか、又は消滅しない。図７は、ローダミン（Ｒｈｏ１２３）及びヘキスト３３３４２染色で表わされる、ヒドロキシ尿素で処理したマウス骨髄から単離したＫＴＬＳＨＳＣｓの細胞周期状態を示すＦＡＣＳプロットである。図８は、非ＨＵ処理マウスと比較した場合に、ＨＵ処理マウスから単離したＨＳＣｓ（ＫＴＬＳ）におけるＮＧＦＲ遺伝子導入効率が高いことを示す。図９は、Ｔｈｙ−１＋ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＭＰＢ細胞からの後期（６週）ＣＡＦＣ活性の大部分がエキソビボＨＵ暴露の二日後に維持されていることを示す。ソートされたＴｈｙ−１−及びＴｈｙ−１＋細胞をＨＵ（１００μｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ，ＩＬ−６及びＳｙＳ１上の幹細胞因子（steel factor）の存在下で培養した。ＣＡＦＣアッセイはＳｙＳ１ストロマ層を使用してＴＰＯ，ＩＬ−６及び幹細胞因子の存在下で実施した。図１０は、ヒトＴｈｙ−１＋ＨＳＣｓを、無血清及びストロマなしの培養条件における初期Ｓ期で同調させる（synchronise）為のエキソビボでのＨＵ投与の力価を示す。２ｘ１０⁴のＣＤ３４＋Ｔｈｙ＋Ｌｉｎ^-ＭＰＢ細胞をＦＬＫ２Ｌ（３００ｎｇ／ｍｌ），ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ− ３（１０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ），無血清およびストロマなしのエキソビボ培地で培養した。図１１は、エキソビボでのＨＵ投与によって、細胞周期の初期Ｓ期で同調が起こり、ヒトＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＨＳＣｓにおけるＬｙｔ−２導入遺伝子発現が成功したことを示している。図１２は、骨髄におけるＨＳＣｓ（ＫＴＬＳ細胞）の数が、ＰＢＳコントロール又はＣＴＸ処理マウスと比べて、ＨＵ処理したマウスにおいて増加したことを示す。図１３はベクターｐＰＧ８５５を示す。図１４は、インビトロでのＨＵ処理後の、精製マウスＫＴＬＳ細胞の細胞周期分析を示す。ＫＴＬＳ細胞はＢＭから単離され、ａ）サイトカインなし(７２％生存)、ｂ）サイトカイン類ＩＬ−６，ＳＦＬ及びＴＰＯ(９５％生存)、ｃ）ＨＵ（１００μｇ／ｍｌ）及びサイトカイン類(７８％生存)、又はｄ）ＨＵ（１００μｇ／ｍｌ）及びサイトカイン類、と共に２４時間培養し、細胞を洗浄してＨＵを除去し、更にサイトカイン類と共に２４時間培養した(９２％生存)。ＦＡＣＳプロットはヘキスト３３３４２染色対前方散乱（forward scatter）を表示している。Ｇ０−Ｇ１又はＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞のパーセンテージを、各ＦＡＣＳプロットの、それぞれ左又は右側に示してある。培養開始前に、ＫＴＬＳ細胞の約６％がＳ／Ｇ２／ＭＭ期にあった。この試験の間、前方散乱測定のファインゲインセッティング（fine gain setting）は校正ビーズを使用して標準化した。本発明は、形質導入に先立ち、活性細胞周期にあるＨＳＣｓの割合を増加させることによって、遺伝子導入及び遺伝子治療の間の核酸組み込みを増大させる方法を提供するものである。本発明方法は、遺伝子治療の準備として薬剤ヒドロキシ尿素とＨＳＣｓを接触させることを含む。接触はインビトロ、エキソビボ又はインビボで実施される。ＨＵ処理後に、ＨＳＣｓを治療遺伝子と接触させる。本発明では、この接触はインビトロ、エキソビボ又はインビボの如何なる状態で、及び核酸又は遺伝子がＨＳＣｓに組み込まれるような適当な条件下で実施される方法を提供する。インビトロ又はエキソビボでＨＵ処理又はＨＵ処理と遺伝子導入が行われる具体例においては、操作された細胞がレシピエント（患者）に導入される。本発明の目的の為には、ＨＳＣｓはレシピエントにとって同種又は自己のものである。インビボにおいては、本発明は、細胞周期の活性期、即ちＧ１／Ｓ／Ｇ２／Ｍ期にある造血幹細胞（ＨＳＣｓ）を集積させる（accumulate）ことによって、造血幹細胞への遺伝子導入を増大させる方法を提供するものである。これは、対象に薬剤ヒドロキシ尿素を投与して、遺伝子導入に先立ち又はその準備としてインビボでＧ０期にあるＨＳＣｓを活性細胞周期に誘導することによって達成される。本発明方法は、ウイルスが媒介する造血幹細胞への遺伝子導入のあらゆる方法、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づくベクター並びにレトロウイルスに基づくベクターを使用するウイルスの媒介による遺伝子導入、を含むものである。ウイルスの媒介による導入によって組み込み及び維持が提供される。本発明方法は、特に、レトロウイルス媒介による遺伝子導入に適している。レトロウイルス形質導入では、導入配列は標的細胞の染色体ＤＮＡ内に安定的に組み込まれる。安定的なプロウイルス組み込みに適した条件として活性サイクリング細胞をあげることができる。ＨＳＣｓは骨髄における全細胞のたった約０．０１％しか構成せず、非常に少ない数しか存在しない。そしてその大部分は活性サイクリングにはないものである。本発明の一具体例は、インビボでヒドロキシ尿素で処理してＧ０ＨＳＣｓを同調的に活性細胞周期（Ｇ１／Ｓ／Ｇ２／Ｍ期）にスイッチさせることを含む、レトロウイルス媒介による遺伝子導入を増大させる方法である。この処理は、有糸分裂前の細胞周期の初期（early phase）に細胞を集積させることに貢献する。周期において幹細胞を集積させることは多くの用途に役立つものである。そのうち最も重要なのは細胞周期において、レトロウイルス感染及びレトロウイルス構築物からの遺伝子の組み込みに対して細胞が最も感受性になる活性期にあるＨＳＣｓの頻度を増加させることである。細胞周期の様々な段階に対する用語は当該技術分野で共通して使用されており理解される。Ｇ０は細胞周期において休止又は非増殖状態を意味し、Ｇ０細胞はサイクリング（周期）していないと考えられる。細胞をＧ０期を離れて活性周期、即ち、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ期に入るように誘発することができる。培養においては、例えば、培養培地に増殖因子を添加することでこの誘発を行うことが出来、これは又細胞の分化を誘発し、それによって細胞の多能性を喪失させてしまう。ヒドロキシ尿素は哺乳動物細胞のＤＮＡ合成の特異的かつ強力な阻害剤である (Timon(1975)Mut.Res．32:115)。その効果は主にリボヌクレオチドレダクターゼを阻害し、それによって必須ＤＮＡ前駆体の新生（de novo）合成を減少させ、その結果、細胞周期の初期ｓ期に細胞を集積させる(Eriksson et al.(1987)Exp. Cell.Res．168:79-88)。ＨＵ投与によって細胞周期で可逆的Ｇ１／Ｓ阻害が引き起こされる(Morse et al．(1969)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.130:986;Bhuyan et al ．(1973)CancerRes．33:888)。ＨＵの臨床投与は既に認可されており、現在、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療等の、抗がん剤として使用されている。進行した腫瘍（neoplasma）がある成人ＣＭＬ患者が１１日の平均継続期間５０mg／kg／dayの経口投与で治療された(Kennedy(1992)Seminars in Oncology，1 9:21-26)。本発明方法では、患者はＨＵで、はるかに短い期間、例えば、一般的には約３日間だけで処置することが出来る。しかしながら、所望の結果を得る為に必要で効果的な任意の期間、治療を続けることができる。この治療では如何なる毒性の問題も提起されなかった。実際、ヒトの治療に関わる本発明方法でヒドロキシ尿素を使用する主な利点は、その毒性が低いか又は無視できる程度だからである。ＨＵによるインビボでの処理でも骨髄におけるＨＳＣｓを富化させるので、本発明は、幹細胞の採取前に、骨髄提供者に有効量のＨＵを投与することから成る、骨髄移植の為の造血幹細胞収率の増加方法も含む。インビボにおけるＨＵによる処理で細胞をＧ１／Ｓ期に集積させ、全ＨＳＣｓ数を増加させることが出来るということは、ＨＳＣｓの分化、増殖及び自己複製に関与する細胞周期の特異的因子を同定し、単離し、研究することにも役に立つものである。ＨＳＣ周期調節、増殖及び分化をより理解することは、造血細胞の疾患の治療に重要であり、このような知識は、例えば、抗増殖薬剤をがん患者に投与する時期及び条件を最適化することを容易にし、又は、様々なＨＳＣ病態における薬剤治療に対する標的としての新たな細胞周期特異的蛋白質を提供するものである。ＨＵで処理された細胞は、例えば、増殖阻害し、又はＧ１／Ｓに停止した（arrested）細胞周期を逆転させる薬剤のスクリーニングするアッセイに使用することが出来る。従って、本発明のもう一つの態様は、ＨＳＣｓをＨＳＣ増殖を誘発するのに有効な量のＨＵと接触させ、停止した（arre sted）又は増殖する細胞における特異的な因子の存在に関してＨＵ処理細胞を分析することから成る、該細胞特異的因子の同定方法である。ＨＵ処理細胞を非ＨＵ処理コントロール細胞には存在しない変化について分析することも出来る。このような変化は、既存蛋白質のレベルの差、新規な蛋白質の合成、その生物活性を活性化又は抑制するような既存蛋白質の変化、蛋白質の機能的複合体への会合という形態をとることが有り得る。別の態様として、細胞をＨＵで処理し、その後に、ＨＵの効果を阻害又は逆転させる能力に関して被験試薬（試験物質）をスクリーニングすることが出来る。この場合、コントロール細胞は、試験物質の非存在下でＨＵで処理するか、又は、ＨＵの非存在下で試験物質で処理する。例えば、ＨＵ処理の前又は後で提供者からＨＳＣｓの適当な試料を除去する。インビトロでのＨＵ処理は、ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^- （ヒト）又はマウスkit⁺Ｔｈｙ−１．１^loＬｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺（ＫＴＬＳ）幹細胞集団を選択し、インビトロでＨＳＣｓを活性細胞周期に誘導するのに有効な量のＨＵを接触させる。ＨＵ処理細胞をサイクリングＨＳＣｓに対する効果に関して試験する試薬と接触させる。被験試薬との接触は、該試薬及びその目的、即ち、ＨＵ処理の前、同時、又はその後か等に応じた様々な時間間隔で実施することが出来る。ついで、細胞を、増殖、自己複製又は分化を助ける条件の下で培養する。そして、細胞を分析して被験試薬の細胞周期状態に与える生物学的効果を本明細書に記載し具体化されたアッセイを用いて測定する。アッセイすべき特に好適な生物学的効果は増殖の阻害効果である。１．ヒドロキシ尿素処理及び遺伝子導入本発明のＨＳＣｓ及びその子孫の安定的形質導入によって、ヒトに対する改良された方法が提供される。しかしながら、これらの方法は任意の適当な対象、即ち、マウス、犬、猫、馬、サル等の哺乳動物で実施することが出来る。本発明で処理された哺乳動物は、遺伝子導入及び遺伝子治療の研究の為に役立つ動物モデルを提供する。該方法のインビトロでの適用は遺伝子治療の研究及び前臨床応用の為のアッセイ系を提供する。本発明は又、好ましくはＨＵで行う。しかしながら、毒性がなく細胞をＧ０期から活性サイクルに誘導できる試薬は本発明において適切に代わって使用することが出来る。造血細胞は、ＨＳＣｓ、赤血球、好中球、単球、血小板、マスト細胞、好塩基球及び好酸球、Ｂ及びＴリンパ球及びＮＫ細胞並びにそれぞれの系列の子孫細胞（lineage progenitor cells）を含む。本明細書において、「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、全ての定められた血液リンパ系列における子孫を生み出す能力のある原始（primitive）又は多能性造血幹細胞を意味し、限られた数の幹細胞は致死的に放射線を浴びたマウスを完璧に再構成して長期間生存させることが出来なければならない。ヒトにおいては、ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^-造血幹細胞はマウスkit⁺Ｔｈｙ−１．１^loＬｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺（ＫＴＬＳ）造血幹細胞の均等物であり、多系列造血幹細胞の実質的に純粋な集団である。初期の研究によって、ＣＤ３４⁺細胞は多能性造血幹細胞に富んでいることが示唆された(U.S.Patent No.5,035,994)。ツカモト他の米国特許第5,061,620ではＢ細胞及び骨髄性細胞子孫がＣＤ３４⁺細胞集団の８０−９０％を占めることが述べられている。Terstappen et al.（1992）Blood 79:666-677は、ＣＤ３４抗原密度が造血細胞の成熟と共に減少し、ＣＤ３８細胞集団が増加することを示唆している。更なる研究によって、ＣＤ３４発現は多能性幹細胞に限られたものではないことが示された。ＣＤ３４発現がＴｈｙ−１に対する選択と組み合わされて、系列に関与する細胞を５％以下しか含まないような組成物が単離された(U.S ．PaLtent No.5,061,620，columns4-5)。Ｌｉｎ^-は、系列陰性である細胞、即ち、Ｔ細胞と関連するマーカー(例えば、ＣＤ２，３，４及び８)、Ｂ細胞と関連するマーカー(例えば、ＣＤ１９，１９及び２０)、骨髄性細胞と関連するマーカー(例えば、ＣＤ１４，１５，１６及び３３)、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と関連するマーカー(例えば、ＣＤ２，１６及び５６)、ＲＢＣと関連するマーカー(例えば、グリコフォリンＡ)、並ぶに巨核球(ＣＤ１４)、マスト細胞、好酸球又は好塩基球と関連するマーカー、のようなマーカーを欠いた細胞を意味する。かかる陰性選択は当該技術分野で公知である。このような系列特異的マーカーの欠如又は低発現は、所謂「陰性（負）選択」において有用である細胞特異的マーカーに特異的な抗体の結合がないことにより同定される。系列特異的マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、好ましくは、少なくともＣＤ２，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ３８，ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７１の一つがあり、より好ましくは、少なくともＣＤ１４及びＣＤ１５である。本明細書において、Ｌｉｎ^-は、少なくとも一つの系列特異的マーカーの欠如に基づき選択された細胞集団を意味する。細胞特異的マーカーに特異的な抗体は、例えば、Becton Dickinson，Caltag，AMAC及びATCC等から市販されている。細胞表面マーカーの有無を決定する方法は当業界で公知である。典型的には、該マーカーに特異的に反応する標識抗体を用いて細胞集団を同定する。抗体を、例えば、これらに限られるものではないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光物質、金属化合物、放射活性化合物又は薬剤等の他の物質に結合することが出来る。抗体に結合することが可能な酵素には、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペーオキシダーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が含まれる。抗体に結合することが可能な蛍光物質には、例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テトラメチレンローダミン‐イソチオシアネートフィコエリスリン、アロフィコシアニン、及びテキサスレッド(Texas Red )が含まれる。抗体に結合することが可能なその他の蛍光物質に関しては、Haugl and,R.P.,Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Ch emicals(1992-1994)を参照されたい。抗体に結合することが可能な金属には、例えば、フェリチン、コロイド金、及び特に、コロイド超常磁性ビーズがある。抗体に結合することが可能なハプテンには、例えば、ビオチン、ジゴキシジェニン、オキサザロン、及びニトロフェノールがある。抗体に結合すること、又はその中に取り込むことが可能な放射活性化合物には、例えば、テクネチウム９９ｍ(⁹ ⁹ Ｔｃ)，¹²⁵Ｉ及び、例えば、¹⁴Ｃ,³Ｈ及び³⁵Ｓのような任意の核種を含むアミノ酸がある。エキソビボ及びインビトロ細胞集団には、例えば、骨髄、成人及び胎児の両方、可動化抹消血（mobilized peripheral blood:MPB）及び臍帯血から得た細胞集団がある。臍帯血の使用に関しては、例えば、lssaragrishi et al.(1995)N.Eng l.J.Med.332:367-369で議論されている。まず最初に、例えば、回腸（例えば、腸骨稜を経た腰骨から）、頚骨、大腿骨、脊椎、又はその他の骨腔のような骨髄源から骨髄を採取する。幹細胞のその他の取得源としては、例えば、胚卵黄嚢、胎児肝臓、胎児脾臓等がある。その他の幹細胞特異的マーカーに対する陽性選択による、幹細胞の単離の為の更なる富化又は精製操作又は手段を講じても良い。本発明をインビトロ又はエキソビボで実施するときには、遺伝子導入及び／又はＨＵ処理に先立ち、ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^-細胞を富化させるようにすることが望ましい。好ましくは、細胞集団をまず負選択技術にかけ、系列特異的マーカーを発現している細胞を除去し、系列陰性（ネガティブ：Ｌｉｎ^-）を維持する。決められた系列の細胞を最初に除去することによって細胞を単離する為に、様々な技術を用いることが可能である。特定の細胞系列及び／又は分化段階に関連したマーカーを同定する為には、モノクローナル抗体が特に有用である。抗体を固体支持体に付着させて粗単離を行うことが出来る。用いる単離技術は、回収する画分の生存期間を最大限にするようなものでなければならない。効率の異なる様々な技術を使用して「比較的粗い」単離を行うことが出来る。このような単離では、マーカーを有していない全細胞の１０％以下、通常約５％以下、好ましくは約１％以下が、保持されるべき細胞集団と共に残ることがある。使用すべき特定の技術は、単離効率、関連毒性、安全性、及び操作の安全及び速度、装置及び／又は技術が優れていることへの要求度に依存している。単離操作として、例えば、物理的単離、磁気単離、抗体標識磁気ビーズ、アフィニティクロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した、又はそれと一緒に使用する、例えば、補体及びサイトトキシンのような細胞毒性物質、及び、例えば、板のような固体マトリックス上に付着した抗体によるパニング（panning ）並びに懸濁単離又は分離洗浄（elutriation）又はその他の便利な技術のようながある。物理的単離技術を使用するのであれば、例えば、物理的(密度勾配遠心単離及び向流遠心単離洗浄)、細胞表面(レシチン及び抗体親和性)、及び生存染色性（ミトコンドリア結合色素rho 123及びＤＮＡ−結合色素Hoechst 33342）の差異に基づくものを挙げることが出来る。これらの操作は当業者には良く知られている。正確な単離が可能な好適技術には、例えば、複数のカラーチャンネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル等で様々な程度に複雑化・精巧化することの出来る、フローサイトメトリーがある。光散乱特性に基づいたフローサイトメトリーで細胞を選択することもでき、このような場合、幹細胞は低い側面散乱及び低い又は中程度の前方散乱プロフィールに基づいて選択される。サイトスピン（Cytospin）調製によって、濃縮された幹細胞は成熟リンパ系細胞から成熟顆粒球までの大きさを有することが示された。説明の為に、第一単離において、典型的には最初に約１ｘ１０^8-9、好ましくは５ｘ１０^8-9の細胞を第一蛍光色素で染色し、一方、様々な決定された系列に対する抗体に第一蛍光色素とは異なり区別可能なスペクトル特性を有する蛍光色素を結合させる。各系列は二以上の単離工程で単離されるが、望ましくは、幹細胞マーカーであるＣＤ３４⁺及びＴｈｙ−１⁺に対して正の選択がなされるのと同時に系列は単離される。死亡細胞に結合する色素（例えば、よう化プロピジウム(ＰＩ)）を用いて、死亡細胞から（生存）細胞を選択・単離する。好ましくは、２％ＦＣＳ含有培地に細胞を回収する。これらの技術は公知であり、様々な文献に記載されている(例えば、米国特許５，０６１，６２０、米国特許５，４０９，８１３、国際公開ＷＯ９５／０５８４３、Yau,et al．(1990)Exp.Hematol. 18:219-222;Takaue（1986）Am.J.Hematol.(1986)23:241-262)。本発明方法のインビトロ及びエキソビボでの適用において、細胞を骨髄単離物から回収する。説明の為、適当な溶液を用いて骨髄を洗浄する。この溶液には、例えば、一般的には約５−２５ｍＭの低濃度の許容可能な緩衝剤と共に牛胎児血清（ＦＣＳ）又は他の天然因子が便宜に添加された、塩溶液がある。便宜な緩衝剤には、例えば、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝及び乳酸緩衝剤がある。又は、従来の方法によって、骨髄を骨から吸引する。細胞分離（cell sorting）として以下のプロトコールを例示する。新鮮なＭＰＢ（可動化抹消血）試料をSanderson chamber（Beckman，Palo Alto，CA）を備えたJE5.0 Beckman向流洗浄器（elutriator）で洗浄する。細胞を０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）添加の洗浄液（Biowhittaker,Walkersville,MD）ｐＨ７．２に再懸濁させる。ロータ回転速度を２０００prmにセットし、細胞を入れ、最初の画分を流速９．６ml／分で回収する。画分２及び３を、それぞれ流速１４ml／分及び１６ml／分で回収する。チャンバーに残った大きな細胞はロータを止めた後に回収する。細胞を，５％ＨＳＡ，１０Tg／ml ＤＮａｓｅｌ及びペニシリン（５０U／ml）／ストレプトマイシン（５０Tg／ml）添加のＲＰＭＩに再懸濁させる。画分２及び３を集め、１mg／ml熱不活性化ヒトγ―グロブリンとインキュベートして非特異的Ｆｃ結合を阻止する。ＣＤ１５結合磁気ビーズ（Dyna l M450，Oslo,Norway）とインキュベートした後、磁気選択することで、顆粒球を更に除去する。抗ＣＤ３４抗体、例えば、Ｔｕｋ３（ＩｇＧ３）、又はＩｇＧ３イソタイプのコントロールを、抗Ｔｈｙ−１抗体、例えば、ＧＭ２０１，と共に５Tg ／mldで、氷上の染色緩衝液（HBSS,２％FCS,１０mM HEPES）中の細胞に２０分間で添加する。細胞をＦＣＳアンダーレイ(under lay）で洗浄し、Texas Red結合ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体及びフィコエリスリン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体と共に、２０分間氷上でインキュベートする。ブロッキングＩｇＧ１を１０分間添加する。ブロッキングした後に、ＦＩＴＣ結合系列抗体パネルを添加し、更に２０分間、氷上でインキュベートする。最終洗浄の後に、細胞をよう化プロピジウム（Ｐｌ）含有染色緩衝液中に再懸濁させる。細胞を二重アルゴンイオンレーザーを備えたＦＡＣＳＴＡＲＰｌｕｓセルソーターで単離する。第一のレーザーは、４８８ｎｍで照射され、色素レーザー（ Rhodamine ６Ｇ）は６００ｎｍで照射される(Coherentlnnova 90，Santa Cruz, ＣＡ)。残存赤血球、細胞分解物及び死亡細胞は光散乱ゲーティング及びＦＬ３（Ｐｌ）低ゲートによって除外する。ＦＡＣＳによる細胞集団の単離に続いて、試料をＨＢＳＳ中で１：１に希釈し、ペレッティングし、血球計数計による計測の為にＨＢＳＳ中に再懸濁させる。ＣＤ３４⁺細胞は成人骨髄（ＡＢＭ）から、ビオチン化抗ＣＤ３４抗体（Ｋ６．１）、及びビオチン競合遊離を用いて正に選択される(ＰＣＴ公開第Ｗ０９４／０２０１６)。幹細胞を抹消血に可動化させる方法は、当業界で公知であり、化学治療剤、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ又はＩＬ−３）又はそれらの組み合わせによる処理が一般的である。典型的には、全白血球の数が５００−２０００細胞／ＴＩに達し、血小板の数が５０，０００細胞／ＴＩに達すると、全白血球の消失（apheresis）が始まる。ＨＵ処理後に、治療遺伝子を細胞に形質導入する。好ましくは、形質導入はレトロベクターのようなベクターを介してなされる。形質導入がエキソビボで行われる場合には、形質導入された細胞はその後にレシピエントに投与される。このように、本発明は、本明細書に記載した方法によってエキソビボ又はインビボで遺伝子を投与することから成る、ＨＳＣｓ内への遺伝子導入によって治療し得る疾患の治療方法を包含する。例えば、Ｉ−サラセミア、鎌状赤血球貧血病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、リコンビナーゼ欠損症、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損症等を治療遺伝子を導入することで直すことが出来る。遺伝子治療の他の適用として、正常幹細胞に薬剤耐性遺伝子を導入して、化学治療に際して優位性を与え、及び選択圧の対象にすることである。適当な薬剤耐性遺伝子には、例えば、多薬剤耐性（ＭＤＲ）蛋白質をコードする遺伝子がある。これらの造血細胞に関連する疾患以外の病気もまた、該病気が、例えば、ホルモン、酵素、インターフェロン、増殖因子等の特定の分泌生産物の欠損に関連するものであれば、遺伝子修飾によって治療することができる。適当な調節開始領域を使用することによって、欠損蛋白質の生産を誘発することが出来、該生産は通常かかる蛋白質を生産する細胞とは異なる細胞型で行われるものの、該蛋白質生産は自然の生産に匹敵するものとなる。リボザイム、アンチセンス、又は、特定遺伝子生産物又は病気、特に造血リンパ指向性の病気に対する感受性を阻害する為の他の情報（メッセージ）を挿入することも可能である。ヒドロキシ尿素はＨＳＣ遺伝子治療を受けている個人に投与される。ＨＵ処理を受けている個人は遺伝子治療を受けている患者である必要はなく、遺伝子治療によって軽減されるような疾患に苦しむ患者、例えば、ＨＳＣ欠損若しくは欠失患者、又は直接ＨＵ処理を受けることが不可能な患者に対する健康な骨髄提供者もＨＵ処理を受ける個人となり得る。ＨＵ処理し骨髄への遺伝子導入が成功したら、形質導入されたＨＳＣｓをドナー（提供者）から単離し、遺伝子治療を必要としている患者に移植する。別の方法として、ＨＳＣｓを取り出し、エキソビボでＨＵと接触させて形質導入する。ＨＵ処理によって多能性幹細胞が富化されるので、幹細胞の採取及びレシピエントへの移植前にＨＵを受けた骨髄提供者は、移植用に富化されたＨＳＣｓ集団を提供する。本発明はこの治療方法も同様に包含するものである。ヒドロキシ尿素（ＨＵ，ＣＨ₄Ｎ₂Ｏ₂）はＨｙｄｒｅａとしてBristol−Myers Squibb（Evansville，IN）から市販されている。ＨＵは結晶性の粉末であり水に容易に溶解し、アルコールには僅かに溶ける。本発明の目的には、HUは、例えば、プロドラッグのような、全ての薬学的上活性な誘導体（例えば、該化合物のＮ −置換及びＯ−置換アナログ）を包含する。本明細書において、「ヒドロキシ尿素(ＨＵ)」という用語は、全ての薬学上活性なアナログ、誘導体及びプロドラッグを包含する。ＨＵによるＤＮＡ合成阻害は用量依存的である。該薬剤の半減期は約５時間である。ＨＵは様々なガン治療及び鎌状赤血球貧血病の臨床治療に使用されている。成人ＣＭＬ患者は５０mg/kg/dの経口役与で平均１１日間の治療を受けている(Kennedy（1992）Seminars in Oncology,19:21-26)。鎌状赤血球貧血は、初期投与１５mg／kg体重／日、１２週毎に５mg／kg体重／日増加させて、２年間迄の治療期間によって効果的に治療することが出来る。投与は経口錠剤によって行う(Charche et al．（1995）N.Eng.J.Med．332:1311-1322)。ＨＵの静脈注射は、週３回で４８時間かけて４８グラム迄は、安全であることが示された(Vea le et al．（1988）Chemother.Pharmacol.21:53-56)。本発明において、細胞周期のＧＯにあるＨＳＣｓをＧ１／Ｇ２／Ｍ期に入らせるのに有効な量でＨＵを対象者に投与する。この量は、当業者にはなじみの方法で容易に決定することが出来る。例えば、ＨＵ投与量の滴定をヒトボランティアに投与して、細胞周期のＧ１／Ｇ２／Ｍ期にあるＨＳＣｓの数に対する各投与量の効果を求める。適当なコントロールとして、ＨＵ処理前及び／又はプラセーボ処理された、サイクリングＨＳＣｓの数の数も求められる。逆効果又は毒性なしに、活性サイクリングするＨＳＣｓの数が平均して最高になるような用量が最適（至適）用量であり、通常、治療で使用される用量である。最適用量は治療対象（年齢、一般的健康状態、性別等）及び投与経路に応じて変化するものと理解されたい。これらの変数は効果的及び最適用量を決定する際に考慮される。有効用量を決定する際には、異なる薬剤投与経路で試験する必要がある。例えば、同時に行われている他の医療行為との適合性がない等の様々な理由から、特定の患者に対して最適用量よりも低い値のＨＵが使用される例がある。しかしながら、Ｇ１／Ｇ２／Ｍ期にあるＨＳＣｓの数を、非ＨＵ治療状況に比べて、少なくとも１．５倍、好ましくは２倍又はそれ以上に増加するのに有効な如何なるＨＵ用量も、遺伝子導入効率を増大させる。従って、本発明の目的の為に、「増大（増加）」という用語は、非ＨＵ処理対象又はコントロールに対して少なくとも１．５倍の増大を意味する。ＨＵの有効量は一般的に１０−２００mg／kg体重／日であり、該薬剤は連続約２日、一般的には２〜１４日間投与される。ある特定例では、細胞周期のＧ１／Ｇ２／Ｍ期にあるＨＳＣｓを少なくとも１０−２０％増加させるに有効な量のＨＵが投与される。ＨＵ処理期間が長くなるにつれてサイクリングＨＳＣｓのパーセンテージが増大する。薬剤投与の変更が要求される毒性は、好中球の絶対数が２．５× １０⁹以下、血小板数が１００，０００／ｍｍ³以下、及びＨｂ濃度減少が２０％以上と定義される(Vichinsky and Lubin（1994）Blood 83(4):1124-1128)。インビトロＨＵ処理の為には、用量は０．１から１００μｇ/mlエキソビボ媒体である。特に好適なＨＵ濃度は約１０μｇ/mlエキソビボ媒体である。ＨＵ処理の直前に骨髄細胞の試料を採り、対象ＨＳＣｓの細胞数及び細胞周期状態に対するベースラインを提供することが望まれる。特定のＨＳＣｓがいる細胞周期の期は当該技術分野で公知の標準操作で決めることが出来る。Ｇ１を特異的にアッセイしてＧ１とＧＯとを区別するのは困難である場合があるので、Ｓ，Ｇ２及びＭ期にあるＨＳＣｓの定量が通常細胞周期へのＨＵの効果の指標として用いられる。Ｓ，Ｇ２及びＭ期にあるＨＳＣｓはヘキスト色素、３^HＵＴＰ又はよう化プロピジウム（Ｐｌ）等で測定することが出来る。上記及び後述の実施例に記載したように、骨髄細胞試料を取得し染色する。ヒトにあっては、ＣＤ３４⁺ Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^-に対して染色される細胞を単離し、ローダミン染色し、次にヘキスト色素で染色して、フローサイトメトリーを使用して後述の実施例に記載したように、ローダミン蛍光強度について分析する。本発明方法においては、ＨＵは、例えば、経口、静脈注射、ドリップ、腹腔又は皮下経由による連続注入等の様々な経路で投与される。便宜的には、例えば、調整放出剤形のような様々な製剤でＨＵは経口投与される。ＨＵはＧＩ管によって容易に吸収される。研究によれば、経口投与されたＨＵは肝臓で分解されて呼吸二酸化炭素として排出され、尿中に尿素及び元のままで排出される。ＨＵは投与方法によって様々な単位用量形態で投与される。例えば、経口投与に適した単位用量形態には、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及び糖衣錠がある。静脈投与には、薬学上許容し得るキャリア、好ましくは水系キャリアにＨＵが溶解又は懸濁した溶液がある。徐放性製剤又は徐放性運搬ビークルは連続的投与に望ましい。遺伝子治療において、各個人は約１０−２００mg／kg体重（b.w.）／日であり、好ましくは、約５０mg／kg体重（b.w.）／日、より好ましくは、約１００mg／ kg体重（b.w.）／のＨＵによる予処理を受ける。この処理期間は連続約２−１４日、好ましくは、連続約２−７日、より好ましくは、３日間である。一つの態様として、ＨＵは、一日に等量で数回、合計５０−１５０mg／kg体重（b.w.）／日を経口投与される。例えば、約１２時間の間隔で一日２回５０mg／kg体重（b.w. ）の経口投与を受ける。別の方法として、患者は一日２〜３回の規則的な間隔でＨＵを注射される。ＨＵは、上記のVichinksy及びLubin（1994）に記載されたような良く知られた方法で、連続的に、即ち、滴下（ドリップ）によって投与することも出来る。好適例においては、個人は、遺伝子治療又はＨＳＣ採取に先立ち、連続２〜７日間１００mg／kg体重（b.w.）／日のＨＵを経口投与される。形質導入はＨＵ治療の間又はその後に実施される。一具体例において、ＨＵは薬学上許容し得るキャリア内で投与される。本明細書中で、「薬学上のキャリア」又は「薬学上の希釈剤」とは、それ自体はＨＵに係わる活性を有しておらず、単一の固体又は液体物質、又は何種類かの固体、液体又はその両方の物質から構成されている。ＨＵに対する薬学上のキャリアとして使用できる物質の例としては、ゼラチンカプセル；乳糖及びショ糖のような砂糖類；コーンスターチ及びポテトスターチのような澱粉類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロース、及びセルロースアセテートフタレートのようなセルロース誘導体；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；ピーナッツオイル、ココナッツオイル、ゴマ油、オリーブオイル、コーンオイル、及びココアバターのような植物油；ポリピレングリコール；グリセリン；ソルビトール；ポリエチレングリコール；水；アガー；アルギン酸；等張性塩溶液；及びリン酸緩衝溶液、更に、着色剤、芳香剤、保存剤等の、薬剤に使用されるその他の非毒性で適合性のある物質を挙げることが出来る。薬学上許容し得るキャリアは、例えば、Merck Index，Merck & Co.， Rahway，New Jerseyに記載されている。ＨＵ処理に続いて、この処理を受けた個人のＨＳＣｓは、適当な任意のベクター、好ましくは適当な治療遺伝子を有するウイルスベクターによるウイルス感染／形質導入を利用する遺伝子導入に処される。適宜、ＨＵ処理の後で遺伝子治療の前に、全ＨＳＣｓ数及びサイクリングＨＳＣｓ数を定量することが望ましい。この定量は、上記操作によって行うことが出来る。遺伝子導入用ベクター本明細書中で使用する「ウイルスベクター」は、in vivo，ex vivoもしくはin vitroのいずれかで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されたウイルスまたはウイルス粒子であると定義される。遺伝子導入がレトロウイルスによって仲介されるという態様において、ベクター構築物とはレトロウイルスゲノム又はその一部と治療遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。本明細書中で使用する「レトロウイルス仲介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は同じ意味を有し、宿主細胞に入ってそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組込むウイルスによって遺伝子もしくは核酸配列が安定に宿主細胞に移入される工程を指す。そのようなウイルスはその通常の感染機構を介して宿主細胞に入ってもよいし、あるいはウイルスが異なる宿主細胞表面レセプターに結合して該細胞に入るように改変されてもよい。本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、ウイルスもしくはウイルス様移入機構により外因性核酸を細胞内に導入することが可能であるウイルス粒子を意味する。レトロウイルスはRNAの形態で遺伝情報を保有しているが、一旦ウイルスが細胞に感染するとRNAはDNA形態に逆転写され、そのDNAが感染された細胞ノゲノムD NAに組込まれる。組込まれたDNA形態はプロウイルスと呼ばれる。本発明の方法で有用なレトロウイルスベクターは本分野ですでに教示されている手法によって組換え的に産生される。たとえば国際公開WO94/29438には、レトロウイルスパッケージングプラスミドおよびパッケージング細胞系の構築が記載されている。当業者には明らかであるように、本発明の方法で有用なレトロウイルスベクターはHSCに感染可能である。ベクターを構築したり細胞をトランスフェクトおよび感染したりするために使用される技術は当業界で広く実施されている。レトロウイルスベクターの具体例はマウス、トリ、霊長類レトロウイルスに由来のものである。モロニー（Mo）マウス白血病ウイルス（MuLV）に基づくレトロウイルスベクターは、ヒト細胞に効率的に感染するレトロウイルス変異体を容易に入手可能であるという理由のためにもっとも一般的に使用されている。他の適するベクターにはギボン・アペ白血病ウイルス（GALV）またはHTVに基づくベクターが含まれる。モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）に由来のレトロウイルスベクター構築物の製造においては、多くの場合、ウイルスのgag、polおよびenv配列をウイルスから除去して外来DNA配列を挿入するための部屋がつくられる。外来DNAによってコードされる遺伝子は通常、LTR中の強いウイルスプロモーターの調節下に発現される。そのような構築物は、gag、polおよびenv機能がパケージング細胞系によってトランスに付与される場合に、効率的にウイルス粒子にパックされる。すなわち、ベクター構築物がパケージング細胞系に導入される際には、細胞によって産生されるgag-polおよびenvタンパク質がベクターRNAとともに集合して感染性ビリオンを形成し培養培地中に分泌される。このように生成したウイルスは感染して標的細胞のDNAに組込まれるが、しかし必須のパッケージング配列を欠くため感染性ウイルス粒子を産生しない。現在使用されるほとんどのパッケージング細胞系は、各々が必要なコーディング配列の１つを含む別個のプラスミド類によつてトランスフェクトされており、それで複製コンピテントウイルスが生成され得る前に複数の組換え事象が必要である。あるいは、パッケージング細胞系は組込まれたプロウイルスを保有するが、このプロウイルスは、感染性ウイルスを組立てるのに必要なタンパク質の全てを産生するがそれ自身のRNAはウイルスにパッケージされ得ないように無力にされている。その代わり、組換えウイルスから産生されるRNAがパッケージされる。このように、パッケージング細胞から放出されるウイルスストックは組換えウイルスだけを含む。レトロウイルスもしくはレトロウイルスベクターによって感染され得る宿主細胞の範囲はウイルスエンベロープタンパク質によって決まる。組換えウイルスを用いて、パッケージング細胞が提供するenvタンパク質によって認識される実質的に全ての他の細胞型に感染させることができ、それにより、形質導入された細胞中へのウイルスゲノムの組込みと外来遺伝子産物の安定な生成が生じる。一般に、MoMLVのマウス同種指向性（ecotropic）envはげっ歯類細胞の感染を可能にするが、両種指向性（amphotropic）envはげっ歯類、トリ、およびヒトを含むいくつかの霊長類細胞の感染を可能にする。MoMLV系で使用される両種指向性パケージング細胞系は当分野で公知であり市販されており、以下のものに限定されないがPA12およびPA317を含む。Millerら(1985)Mol．Cell.Biol．5:431-437;Mille rら（1986）Mol．Cell．Biol．6:2895-2902;およぴDanosら（1988）Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85:6460-6464。ヒト細胞の感染も可能である異種指向性ベクター系もある。レトロウイルスベクターの宿主範囲は、基体ウイルスのenvタンパク質を第二ウイルスのenvタンパク質と置換することによって変えられてきた。その結果得られた「擬似型の」ウイルスは、エンベロープタンパク質を提供しパッケージング細胞系によって発現されるウイルスの宿主範囲をもつ。最近、MoMLV envタンパク質に代えて水庖性口炎ウイルス(VSVG)由来のG-糖タンパク質が置換された。 Burnsら(1993)Proc Natl.Acad．Sci．USA 90:8033-8037およびPCT特許出願W092/ 14829。感染は特異的レセプターに依存しないため、VSV-G擬似型ベクターは広い宿主範囲をもっている。通常、ベクターは少なくとも２つの異種遺伝子もしくは遺伝子配列、すなわち（i）導入されるべき治療遺伝子および(ii)被感染細胞の探索を可能にするマーカー遺伝子を含む。本明細書中で使用する「治療遺伝子」は完全な遺伝子であってもよいし、あるいは欠陥のある内因性遺伝子に起因する患者における欠損を補うことが可能な機能的に活性な前記遺伝子の断片だけであってもよい。治療遺伝子はまた、アンチセンス抑制に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは遺伝子、ならびにリボザイム仲介療法用のリボザイムも包含する。有力な阻害性オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする治療遺伝子ならびに調節タンパク質およびオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子も本発明に包含される。一般に遺伝子治療は単一治療遺伝子の導入を含むが、特定の疾患の治療では２つ以上の遺伝子が必要となることもある。一実施態様において、治療遺伝子は欠陥遺伝子の正常すなわち野生型コピーか、あるいは機能的相同体である。別の実施態様では、治療遺伝子は野生型の有力な阻害性変異体である。ベクターあたり２つ以上の遺伝子を投与することが可能であるし、あるいは数個の適合性ベクターを用いて２つ以上の遺伝子を送達することもできる。遺伝子欠陥に応じて、治療遺伝子は調節配列と非翻訳配列を含むことができる。ヒト患者の遺伝子治療のための治療遺伝子は一般にヒト起源のものであるが、遺伝子産物がレシピエント体内で有害な免疫反応を誘発しない場合には、ヒトにおいて高い相同性と生物学的に同一もしくは等価な機能を示す他の近縁種由来の遺伝子を使用してもよい。たとえば、その遺伝子産物がヒトにおいてグルコースをグリコーゲンに変換することが可能である霊長類インスリン遺伝子はヒト遺伝子の機能性等価物であると考えられるだろう。治療への使用に適する治療遺伝子は疾患によって変わる。たとえば、鎌状赤血球貧血 SCIDの治療に適する遺伝子は正常ADA遺伝子である。治療遺伝子のヌクレオチド配列は当分野で一般的に知られるだろうし、あるいはGenBankのような種々の配列データベースから得ることができる。治療遺伝子自体は一般的に入手可能になるだろうし、あるいはポリメラーゼ連鎖反応PCR（P erkin-Elmer）や他の標準組換え技術を用いて単離およびクローン化できる。いかなる治療遺伝子も適合性制限断片として切り出して造血細胞内で治療遺伝子を適正に発現することを可能にするような方法でベクター中に配置することができる。 DNA構築物が組込まれていない細胞に対するDNAが組込まれた細胞の選択とうまくいった形質導入の監視のために、マーカー遺伝子をベクター中に含ませることができる。マーカー遺伝子の多くがG418もしくはハイグロマイシンに対する耐性のような抗生物質耐性マーカーを含むが、これらに限定されない。あまり便利ではないが陰性選択を使用することが可能であり、マーカーは、以下のものに限定されないが、細胞をアシクロビルやガンシクロビルのような薬剤に感受性にする HSK-ｔｋ遺伝子である。あるいは、安定な細胞表面マーカーを用いてFACS細胞選別によってトランスジーンを発現する幹細胞を選択することができる。NeoR（ネオマイシン/G 418耐性）遺伝子が通常使用されるが、元々レシピエント細胞にその配列が存在しない好都合のマーカー遺伝子を用いることができる。ウイルスベクターを改変して、キメラエンベロープタンパク質もしくは非ウイルス性膜タンパク質をレトロウイルス粒子中に導入して粒子の安定性を改善したり宿主範囲を拡大すること、あるいは感染中に細胞型特異的ターゲッティングを可能にすることができる。宿主範囲を変えたレトロウイルスベクターの作製はたとえば国際公開WO92/14829およびWO93/14188に教示されている。in vivoで特異的細胞型にターゲットできるレトロウイルスベクターも、たとえばKasaharaら（ 1994）Science266:1373-1376に教示されている。Kasaharaらはウイルスエンベロープタンパク質と融合されたヒトエリスロポエチン（EPO）からなるキメラエンベロープタンパク質を有するモロニー白血病ウイルス（MoMLV）の構築を記載している。このハイブリッドウイルスはEPOレセプターをもつヒト赤血球前駆細胞に対し組織向性（tissue tropism）を示し、したがって鎌状細胞貧血およびサラセミアの遺伝子治療に有用である。HSCの感染を特異的にターゲットすることができるレトロウイルスベクターがin vivo遺伝子治療にとって好ましい。種々の慣用的方法でウイルス構築物を作製することができる。所望の性質たとえば長末端反復、マーカー遺伝子及び制限部位を提供するとともに、当分野で公知の技術でさらに改変することが可能である非常に多くのベクターが入手できる。構築物は、細胞表面をコードする遺伝子または分泌タンパク質が適正に翻訳後プロセシングされて、適切には細胞表面上で発現されることを保証するシグナルペプチド配列をコードしていてもよい。外来遺伝子は細胞特異的プロモーターの調節下にあるのが好ましい。導入された遺伝子の発現は遺伝子導入及び所望の効果に応じて種々の方法で調節することができる。すなわち、特定の生理学的条件下でのみ、あるいは特定の細胞型において遺伝子を構成的に発現させるプロモーターの調節下にトランスジーンをおくことができる。レトロウイルスLTR（長末端反復）はin vivoで大部分の造血細胞で活性であり、一般に挿入配列の転写およびそれら配列の構成的発現に関わるだろう(Ohashi ら(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．89:11332；Correllら(1992)Blood80:331)。他の適当なプロモーターとして、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）即時型初期プロモーター、ならびにモロニーマウス肉腫ウイルス(MMSV)、ラウス肉腫ウイルス（RSV）または牌臓細胞増殖巣形成ウイルス（SFFV;Spleen Focus Forming Virus ）のU3領域プロモーターが含まれる。特定細胞型中で導入配列を発現させるために使用され得るプロモーターの具体例として、T細胞およびNK細胞での発現用のグランザイム（Granzyme）A、幹細胞および前駆体細胞中での発現用のCD34プロモーター、細胞毒性T細胞での発現用のCD8プロモーター、ならびに骨髄性細胞での発現用のCD11bプロモーターが含まれる。特定の生理学的条件下での遺伝子発現のために、誘導性プロモーターを用いることもできる。たとえば親電子物質反応要素を用いて親電子性分子との反応で化学抵抗遺伝子（chemoresistance gene）の発現を誘導することができる。治療上の利益はさらに、適当な局在性配列を結合することによって遺伝子産物を適当な細胞位置たとえば核にターゲットすることで増大させ得る。ベクター構築物は感染性ビリオンを作り出すパッケージング細胞系中に導入される。高力価の複製欠陥組換えウイルスを産生できるパッケージング細胞系は当分野で知られている。たとえば国際公開WO94/29438を参照のこと。in vivo感染のために、トランスフェクション後48時間の上清のろ過によるなどの当分野で公知の方法を使用して細胞上清からウイルス粒子を採集し精製する。ウイルスカ価は、（レトロウイルスに応じた）一定数の適当な細胞を滴定量のウイルス上清で感染することによって決定される。形質導入効率はFACSとサザンブロッティングとによって48時間後にアッセイできる。ウイルス形質導入後、形質導入された幹細胞またはそれらの子孫中のウイルスベクターの存在がPCRなどによって証明できる。PCRを実施してマーカー遺伝子、またはウイルスにより形質導入された他の配列、を検出することが可能である。一般に、定期的に血液サンプルを採取し、たとえばNeoR遺伝子をマーカーとして使用する場合にはNeoRプローブを用いてPCRを行うのが便利である。骨髄細胞もしくは成熟造血細胞中におけるウイルスにより形質導入された配列の存在は、形質導入されたHSCによるうまくいった再構成の証拠である。PCR技術および試薬は当分野で周知（一般に、PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications ．Innis，Gelfand，Sninsky & White，eds．(Academic Press,Inc.，San Diego ，1990を参照のこと)されているし、また市販（Perkin-Elmer）されている。本発明の方法の別の実施態様において、遺伝子導入はex vivoで行われる。HU 処理の前かあるいはその処理後にドナーの骨髄または末梢血からHSCを採集し、適する治療遺伝子を保有するレトロウイルスベクターに感染させる。形質導入の前および、いくつかの態様では形質導入中に、有効なレトロウイルス感染およびHSCへの組込みを可能とする量ならびに適する条件下でHUを形質導入培地に加えることができる。HSC 遺伝子治療の応用単一遺伝子中の損傷を起因とする多数のヒト遺伝病は遺伝子治療の主要な候補である。本明細書中で使用する「遺伝子治療」または「遺伝子導入」は、治療力のある療法を目的とした細胞への遺伝子挿入と定義される。特に幹細胞遺伝子挿入による遺伝子治療には多くの応用があり、それらの応用は周知されかつ広く論評されている。 HSCを使用する遺伝子治療は、一般に欠陥タンパク質の産生あるいはその遺伝子の異常レベルの発現を生じさせるリンパ性細胞および骨髄性細胞中の遺伝子異常を治療するために有用である。これらの疾患のいくつかについては、欠陥遺伝子の正常コピーもしくは機能性相同体の導入ならびに喪失遺伝子産物の少量産生でさえ有益な効果がある。同時に、遺伝子産物の過剰発現が有害な作用を及ぼすとも思われない。HSCへの遺伝子導入が潜在的に有用である非網羅的な疾患リストを以下に記載する。一般にこれらの疾患は骨髄障害、赤血球細胞欠陥、代謝障害などを細胞貧血、ならびにグロビン遺伝子または凝固因子遺伝子に欠陥がある血友病ＡおよびＢのような血液細胞の遺伝子障害の治療のために有益である。別のよい具体例はバブルボーイ(bubble boy)症候群としても知られる重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）の治療であり、この疾患では患者はＴおよびＢリンパ球に対し毒性である特定の副産物の排除を助けるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を欠損し、感染に対して患者を無防備にさせる。そのような患者は、過去にそうされたように患者のリンパ球の代わりにＡＤＡ遺伝子を彼らのＨＳＣに導入することによって遺伝子治療を受ける理想的候補者である。他の疾患としては、好中球が欠陥のあるシトクロムｂを発現する慢性肉芽腫症、ならびにマクロファージ中の異常なグルコセレブロシダーゼ遺伝子産物に起因するゴーシェ病が含まれる。種々の形態の癌を治療するための戦略にも遺伝子治療が含まれる。レトロウイルスベクターは癌細胞を特異的に死滅させるのに有効なたとえばトキシンもしくはアポトーシス誘導物質をコードする遺伝子を保有することができる。腫瘍細胞の特異的死滅は、腫瘍細胞だけが自殺遺伝子を発現する条件下でその自殺遺伝子を癌性造血細胞に導入することによっても達成可能である。自殺遺伝子産物は通常では無毒性の薬剤を毒性誘導体に変換することによって細胞に致命的な感受性を付与する。たとえばシトシンデアミナーゼ酵素は無毒性物質である５’−フルオロシトシンを毒性誘導体である５−フルオロウラシルに変換する(Mullenら（1 992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:33-37)。腫瘍特異的リンパ球を遺伝子的に改変してたとえば抗腫瘍活性をもつ遺伝子産物を腫瘍部位に限局的に送達し、これらの遺伝子産物の全身的送達と結び付いた毒性を包囲する。遺伝子治療法はまた化学療法の毒性作用に対して骨髄細胞を耐性にさせるためにも適用できる。また遺伝子治療を用いてたとえばＨＩＶおよびＨＩＶ−１感染のようなウイルス感染を予防または撲滅することができる。たとえばＨＳＣをＨＩＶによる感染に対して耐性となるように遺伝子的に改変することができる。１つのアプローチはアンチセンスＲＮＡを使用するか、あるいは存在するウイルス制御経路を壊すことによつてウイルス遺伝子発現を特異的に阻害することである。レトロウイルスＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡはいくつかのレトロウイルスの複製を阻害することが示されている(Toら（1 986）Mol．Cell．Biol．6:4758-4762;HopperとCoffin（1988）GluzmanおよびHug hes編，Current Communications in Biology,Viral Vectors. Cold Spring Harb or Laboratory，Cold Spring Harbor,NY,pp.139-145)。このレトロウイルスにはＨＩＶ（RhodesとJames（1991）AIDS5:145-151）およびＨＴＬＶ−１（von Reud enら（1991）J.Virol．63:677-682）が含まれている。ＨＳＣにおける遺伝子治療の使用を見出すことができる別の領域は自己免疫疾患を軽減することにある。その治療遺伝子は、たとえば自己反応性細胞の死および排除を生じさせる正常なアポトーシスシグナルを再構成することが可能なＢもしくはＴ細胞シグナル伝達分子をコードすることができる。 II．骨髄移植本発明はまた、移植前にＨＳＣ収量を増加するのに有効な量でヒドロキシ尿素を骨髄ドナーに投与することによって骨髄移植の効能を高める方法を提供する。本発明の好適実施態様において、ドナーから幹細胞を採集する前に移植のために入手し得るＨＳＣの数を少なくとも1.5倍まで増加させるのに有効な量でＨＵを投与する。ＨＵは上述のとおり投与することができるが、経口または静脈内投与が好ましい。ＨＵ処理後、骨髄細胞を採集し、骨髄移植の当分野で周知の慣用手順の後でレシピエントに骨髄細胞を移植する。遺伝子療法は移植前に投与できる。ＨＵ処理で認められた意外でかつ予期せぬ知見は活性周期にあるＨＳＣ数の増加とHSC総数の増加である(表１Ａおよび１Ｂ参照)。これらの細胞は、実験例で実証されかつ下記の図３に示されるように、移植された宿主動物での全ての造血系統の再構成によって明らかにされるような多能性（plurip otent）を保持している。このＨＳＣの富化は下記の種々の症状を治療するための骨髄移植に活用できる。本発明の方法により、移植前に、ＨＳＣ数を増加させるのに有効な量のＨＵで骨髄ドナーを処理する。この目的は、有害な副作用と毒性を生じさせることなく、サイクリング（cycling）幹細胞数をＨＵ処理を行わないで得られるものより多くすることである。好ましくは、骨髄ドナーのＨＳＣ数はヒドロキシ尿素投与後少なくとも１．５倍まで増加する。骨髄ドナーへのＨＵの投与は遺伝子導入を高める方法について上記したことと実質的に同じである。最適用量は、上で定義した付随の毒性を伴わずに最高数のＨＳＣを提供する用量であろう。ＨＳＣ数を増加するのに有効なＨＵ量はたとえば１日あたり１０^〜200mg/kg体重の範囲でＨＵの用量を変えて処理の前後のＨＳＣ数を測定することによって容易に決定できる。ＨＵは変化する時間長たとえば1^〜7日の間投与することができる。ＨＳＣ数を測定するために、ＨＵ処理の前後に骨髄サンプルを単離し、ＨＳＣの指標であるCD34⁺Thy−1⁺Lin^-表面マーカーについて骨髄細胞を染色する。これらの細胞単離と染色手順は当分野で標準的であり下記の実験例で詳細に説明される。骨髄単位容量あたりの存在するCD34⁺Thy−1⁺Lin^-染色細胞数が、HSC数を増加するのに有効なHU量を決定するために比較される。最適用量は一般に１日あたり50mg/kg〜150mg/kg体重の範囲内であり、また処理は約２〜4日の連続した日数の期間にわたるだろう。好ましくは、ヒドロキシ尿素は静脈内注入または経口的に投与される。副作用は当分野の薬理学の平均的熟練者に馴染み深いパラメータを用いて監視される。骨髄移植レシピエントにその後再導入するために、HU処理したドナーからHSC を採集する。多くの癌患者が彼らの腫瘍細胞を根絶するために集中的な化学療法および/または放射線療法を受ける。これは数コースの（異なるクラスに属する）化学剤治療または照射からなる。これらのコースは患者の骨髄細胞上に重い負担をかける。すなわち、サイクリング（cycling）骨髄前駆体は損傷を受ける可能性があるし、造血幹細胞はそれらの最終的枯渇の危険性を伴う高い区別的ストレスを経験するだろう。したがって、保護規準が、患者の骨髄を救済するために、および/ または、化学療法もしくは放射線療法を強化するために正当化される。精製造血幹細胞の骨髄の同種組織移植（autologous transplantation）は、特定の急性白血病、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ならびに選択された固形腫瘍において集中的な化学/放射線療法から患者を救済する重要な役割を果たす。本発明により提供される方法はHSCでの遺伝子導入のための従来のプロトコルのうち少なくとも３つの欠点を克服する。すなわち、in vivoでのHU投与は、サイトカイン治療で認められる付随する分化あるいは他の薬剤で認められるヒト毒性を伴うことなく、レトロウイルス感染および核酸の組込みにとって重要なサイクリングHSCを活性生成するとともに、遺伝子導入または移植用の入手可能なHSC 数を増加させる。一般に、以後使用する命名法ならびに下記の細胞培養および組換え技術の実験室手順は当分野で周知されかつ通常使用されている。このような技術や手順は一般に、当分野の慣用方法および本明細書全体にわたって提供される種々の一般的参考文献にしたがって実施される。本明細書中の手順は当分野で周知されていると考えられるし、また読み手に便利なように提供されている。以下の実施例は本明細書に記載される本発明を説明することを意図したものであり、発明を制限する意図はない。以下の実施例は、HUでのマウスのin vivo処理、その結果としてのS/G2/M期でのHSCのパーセンテージの増加、ならびにHSC総数の増加を記載する。これらの実施例はまた、HU処理されたHSCの、長期の造血再構成を生じさせるための能力を示す。マウス株実施例では、以下のマウス株が使用された。すなわち、本実験で使用したC57B L/6-Ly-5.2-Pep3b(Thy-1.2,Ly-5.2)，C57BL/Ka-Thy-1.1(Thy-1.1，Ly-5.2)，C57 BL/Ka-Ly-5.1(Thy-1.2，Ly-5.1)，およびC57BL/6-Ly-5.1-Pep3b-Thy-1.1(Thy-1. 1,Ly-5.1)マウス株（MorseIIIら(1987)Immunogenetics 25:71-78の基づいて規定した。）を繁殖し、SyStemixのマウス施設に維持した。ヒドロキシ尿素処理の開始マウスに対し連続的ヒドロキシ尿素処理を開始するために、マウスに１０〜１００mg/kg体重（b.w.）のヒドロキシ尿素を腹腔内注射した。これらのHU処理マウスをその後塩酸ケタミン（50mg/kg）と塩酸ジラジン（25mg/kg）の混合物を用いて麻酔し、ヒドロキシ尿素(10〜100mg/kg/日)もしくは１％ヒト血清アルブミン含有PBS（コントロール）を含有する７日または１４日浸透圧ミニポンプ（Alz a，Palo Alto，CA）を移植した。１日、３日および５日後に、マウスを犠牲にし幹細胞を単離するために長骨（マウスあたり２本の大腿骨と２本の脛骨）を得た。c-kit⁺Thy-1.1^loLin^-loSca-1⁺ 細胞の精製 c-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺染色細胞はHSCを規定する。ヒドロキシ尿素処理の開始後１〜５日に脛骨と大腿骨に水をどっと流して骨髄細胞を得た。Thy-1. 1^loLin^-/loSca-1⁺細胞を染色し、先にSpangrudeら（1988）Science 241:58-62に記載されたものに以下の変更を加えて骨髄から該細胞を単離した。次の細胞系統マーカー抗体すなわち、B系統マーカーB２２０に対してRAE-6B2，T細胞マーカーに対してRM.-5(CD2),GK.1.5(CD4)，53-7.3(CD5)および53.6.72(CD8)、骨髄単球マーカーに対してRB6-8C5(GR-1)およびM1/70.15.11.5(Mac-1)、ならびに赤血球に対してTER−119を用いた。細胞系統染色は通常フィコエリトリン結合ポリクローナル抗ラット抗体（Caltag，South San Francisco，CA）を用いて示現化された。ある場合には、フィコエリトリン結合１４５―２C１１（CD３）mAbもまた添加された。細胞をビオチニル化Sca-1で染色しMACS磁気ビーズシステム（Milteny l Biotec，Auburn，CA）を使用してSca―１⁺細胞について陽性選択した。陽性選択された細胞はさらにフルオレセイン結合１９XE５（Thy−1.1）およびアロフィコシアニン結合2Ｂ8（c-kit）およびステプタビジン−テキサスレッド（steptav idin-Texas Red）で染色した。各段階につき氷上で20分間細胞をインキュベートした。最終洗浄の後，１ Tg/mlヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ中に細胞を再懸濁した。標識された細胞を複式レーザーＦＡＣＳ（登録商標；Becton Dickins on Immunocytometory Systems,Mountain View，CA）を使用して分析、選別した。死細胞はそれらのヨウ化プロピジウム染色特性によって分析から排除された。細胞選別後、c-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺細胞の純度をＦＡＣＳ（登録商標）による再分析によりチェックした。ローダミン123およびヘキスト33342染色ローダミン123(Ｒｈ123)の染色手順は以下のとおりである。Ｒｈ123（Molecul ar Probes，Eugene，OR）の1mg/mlストック溶液を使用直前にエタノール中で調製し−20℃暗所で保存した。c-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺の保存細胞を10⁶/ml 以下で２％牛胎仔血清（ＦＣＳ）含有ＢＳＳ緩衝液中に再懸濁し、0.2Tg/mlのＲｈ123染料と一緒に37℃30分インキュベートした。細胞を洗浄し，遠心分離し,10 TM Hoechst33342(Molecular Probes，Eugene，OR)と一緒に３７℃で４０〜６０分間インキュベートしてHoechst染料のDNA標識化とRh123染料の流出を同時に可能にした。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）チャンネルとフィコエリトリン（PE）チャンネル間で補正設定した後、FITCチャンネル中フローサイトメトリーによってRh123の蛍光強度を分析した。細胞周期の染色分析の結果については図７を参照のこと。長期再構成分析このアッセイはレシピエントにおける再構成活性をもつ細胞を直接測定する。レシピエントマウスを３時間間隔で２つの離れた放射線量で合計レベル1.1Grey まで致死的に照射した。選別した骨髄サブセット細胞を、麻酔したマウスの眼か後方そう（retro-orbital plexus）に静脈内注射（100Tl/マウス）した。競合再構成アッセイ用の細胞を調製するために、未照射の宿主コンジェニック系統からのBM細胞を採集し、９６ウエルプレート中120Tl細胞、10⁶細胞/ml濃度で平板培養した。これらの細胞のc-kit⁺Thy-1.1^lo Lin^-/loSca-1⁺細胞/またはこれらの細胞のサブセットを選別し、宿主コンジェニックBM細胞を含むこれらの９６ウエルプレート中に自動細胞付着ユニット（ACDU ）によって１〜120細胞/ウエルで付着させた。レシピエントマウスに100Tlの１〜100c-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺細胞/またはサブセットを、９６ウエルプレートから採集した10⁵個の宿主コンジェニック骨髄とともに静脈内注射した。長期再構成用の末梢血分析眼か後方洞(retro-orbital sinus)から４週間毎に１回末梢血を得，赤血球細胞をmAb染色前に溶解した。Spangrudeら(1988)Science241:58-622に記載のようにして蛍光免疫染色およびFACS（登録商標）分析を行った。４色蛍光免疫染色を、B細胞の系統マーカーに特異的なモノクロナール抗体(抗Ｂ220)、骨髄性細胞の系統マーカーに特異的なモノクロナール抗体(抗Gr-1および抗Mac-1)、Ｔ細胞の系統マーカーに特異的なモノクロナール抗体（抗CD3、抗体2C1l)、ならびにドナー造血細胞に特異的な対立形質マーカー（抗Ly-5.2、抗体ALI-4A2もしくは抗Ly5 .1、抗A20.1）を用いて実施した。結果細胞周期のS/G2/M期でのＨＳＣの通常のパーセンテージは約６〜25％である；所謂「長期ＨＳＣ」のうち、すなわち持続した多系統等価物や排他的ＨＳＣ自己再生に主として関わるサブセットのS/G2/Mでのパーセンテージは僅か１〜５％以下である。実施例１図１は、サイトカインＧ−ＣＳＦおよび/または化学治療剤による可動化後の骨髄（ＢＭ）中および末梢中の活性細胞周期でのＨＳＣのパーセンテージを示す。ヒトにおいて、可動化は6g/m²CTXおよび250mg/m²GM-CSFを用いて行った。マウスでの可動化は200mg/kgCTXおよび190μg/kgGM-CSFを用いて行った。サイトカイン処理では、正常ＢＭ（マウスＢＭ，図１パネルＡ；ヒトＢＭ，図１パネルＢ）と対照的に末梢血での周期のＨＳＣは実質的に皆無であり(マウスＭＰＢ，図１パネルＣとＥ;ヒトＭＰＢ，図１パネルＤとＦ)、サイクリング（cycling）細胞のパーセンテージはすでに低い。実施例２実施例１でと同様に可動化を行った。図２は、ヒドロキシ尿素のような細胞周期遮断剤で処理することによってＢＭ中のＨＳＣのパーセンテージを高めることができることを示している(図２，パネルＡ対パネルＢ)。さらに、ＨＵ処理も有糸分裂周期中に可動化末梢ＨＳＣを誘導および/または蓄積する(図２，パネルＣ対パネルＤ)。実施例３この実施例では、ＨＵのin vivo投与が骨髄中で活性サイクリングするKTLS細胞の数を増加させることが示される。PBS処理コントロールとHU処理マウスのBM から単離されたKTLS細胞をHoechst33342で染色する。表１Aと１Bに、HU(10，50 もしくは100mg/kg/日)を１，３および５日間（表１B）ならびに３および５日間（表IA）注入したマウスからのKTLS細胞の数またはパーセントおよび活性サイクリングする(actively cycling)KTLS細胞のパーセンテージをまとめて示す。インビボ（in vivo）HU処理： HUの連続注入を開始するために、HU（10〜100mg/kg体重）をマウスに腹腔内注射した。次いで、これらのHU処理マウスを塩酸ケタミン（50mg/kg）と塩酸ジラジン(25mg/kg)の混合物で麻酔し、HUかPBSのいずれかを含む浸透圧ミニポンプ（ Alza，Palo Alto，CA）を移植する。表１A: 表1Aの結果は、３または５日間PBS（コントロール）またはヒドロキシ尿素で処理されたマウスの長骨中のHSCの総数および活性サイクリングしている(すなわちS/G2/M)HSCのパーセンテージを要約している。表１Aから明らかなように、３および５日間のHUでのin vivo処理の結果、骨髄中のHSCの数および有意にはHSC のパーセンテージ、ならびにS/G2/M期のHSCのパーセンテージがPBS処理コントロールよりも増加する。表１B: １日ヒドロキシ尿素処理、10mg/kg/日対100mg/kg/日：BM細胞数についてP>0.3 7、BM中のKTLSの％についてP>0.50、KTLS数についてP>0.83およびS/G2/Mにおける％KTLSについてP>0.45。３日ヒドロキシ尿素処理、コントロール対100mg/kg/日：BM細胞数についてＰ< 0.001(統計的有意差、SS)、BM中のKTLSの％についてP<0.0001(SS)、KTLS数についてP<0.005(SS)およびS/G2/Mにおける％KTLSについてP<0.0001(SS)。５日HU処理、コントロール対100mg/kg/日：BM細胞数についてP>0.07、KTLS頻度についてP<0.05(SS)、KTLS数についてP<0.005(SS)およびS/G2/Mにおける％KTL SについてP>0.60。３日100mg/kg/日HU処理対５日100mg/kg/日HU処理：BM細胞数についてP>0.17、BM中のKTLSの％についてP>0.09、KTLS数についてP>0.84およびS/G2 /Mにおける％KTLSについてP<0.001(SS)。１５％以下のマウスBMを示す４本の長骨（脛骨と大腿骨）中のKTLS細胞の総数を測定する。１日目には周期中のKTLS細胞数に有意の変化はない(すなわちS/G2/ M期の細胞、表1Bの説明参照のこと)。マウスを３日間処理したときには、BM細胞の総数は100mg/kg/日の用量でコントロールレベルの〜59％まで減少する。逆に、50mgおよび特に100mg用量での３日および５日の処理後、KTLS細胞数は約３倍増加し、また細胞周期のS/G2/M期のKTLSのパーセンテージは100mg用量で7 .3％（PBS処理群）から22.2％に増加する(表１B)。さらに、マウスを３日間HUで処理するときには、１日もしくは５日の処理期間と比べてS/G2/M期のKTLS細胞がより多い。100mg/kg/日のHU用量で３日後にＳ期に最も高い割合のKTLSが蓄積し、またS/G2/M期において約８倍のKTLS細胞数(1.3×10⁴KTLS細胞）の増加がコントロール群(1.8×10³KTLS細胞)と比較して観察される。比較のために、別の組のマウスにシクロフォスファミド(CTX)を単回注射で200 mg/kgを注射する。図１２は骨髄（BM）中のHSC（KTLS細胞）数がHU処理マウスにおいてPBSコントロールまたはCTX処理マウスと比べて増加することを示している。上述のHSCの富化は骨髄移植で活用可能である。実施例４図３は、KTLS幹細胞の単離前の３日間100mg/kg/日のHUで処理したマウスから単離した精製c-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺（KTLS）細胞を移植することに由来する多系統再構成を示す。致死的照射を受けた１群のレシピエントマウスにLy-5マーカーをもつ10個のKTLS細胞を１×10⁵宿主型BM 細胞とともに注射することによって移植した。上側の３つのパネルは24週目に分析された代表マウスからのデータを示す。第２群のマウスには50個のS/G2/M期Rh 123^midKTLSを注射した。下側のパネルは16週目に分析された代表マウスからのデータを示す。照射と移植の後、指示されるとおりに末梢血細胞を分析した。代表マウス中の移植KTLS細胞に由来するLy-5マーカーをもつMac-1⁺Gr-1⁺,B220⁺またはCD3⁺細胞のパーセンテージは各パネルに示されている。実施例５図４は正常のHU未処理のマウスにおける個々のThy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺HSCの生産力寿命を例示する。アッセイはUchida，N.,“Characterization of mouse h ematopoietic stem cells（マウス造血幹細胞の特徴付け）”，博士論文，Stanf ord大学，1992に記載のように行った。図４は、ドナー特徴をもつ（donor marke d）幹細胞の長期および一時的再構成を末梢血中のMac-1/Gr-1細胞の運命に従って検出できることを示している。実施例６図５は、ドナー特徴をもつKTLS HSCのin vivoでの生産力寿命を示す。このHS CはHU処理マウスから単離される。上記のとおりマウスをHUで処理する。個々のマウスでの長期および一時的多系統再構成をそれぞれパネルＡおよびＢに示す。代表マウス8457E-3からのパネルＡはB(B220)、T(CD3)および単球顆粒球系統（Ma c-1&Gr-1）の長期再構成を示す。8459B-2代表マウスはMac-1およびGr-1細胞表面マーカーに対する染色によって分析される単球および顆粒球系統の一時的再構成を示す。その図からわかるように、長期再構成についての綿密な分析には、通常Ｂ細胞（B220 ）およびＴ細胞（CD3）が長期再構成を示すであろうという理由で単球および顆粒球系統の分析を包含すべきである。実施例７図６は、競合再構成アッセイによって分析される、１日あたり約100mg/kg/体重のHUで処理されたマウスから単離されたドナー特徴をもつc-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/lo Sca-1⁺（KTLS）HSCのin vivoでの生産力寿命を示す。10個のHU処理KTLS細胞（Ly-5.2）を10⁵個の正常BM細胞に移植したレシピエントマウスを24週まで分析した。分析した23匹の動物のうち10/23が骨髄（myeloid）の一時的多系統を示し，7/23が持続的(24週まで）多系統再構成を示した。図４との比較からわかるように、Hu処理HSCの再構成プロフィールは正常非HU処理マウスからの幹細胞による再構成プロフィールと比較的類似している。実施例８ HSCの細胞周期状態を、ローダミン(Rhl23)染色およびHoechst 33342を用いるD NA含量についての染色によって決定することができる。図７に示されるように、 Rh123^lowest(Rh^lo)KTLS細胞はG0/G1期にありがちである(G0/G1，Rh123^lo参照)。 S/G2/M期にある細胞のなかにはRho¹²³染料を流出する能力をもつものがある(S/G 2/MRh123^mid参照)。実施例９表３はヒドロキシ尿素がマウス細胞に対して無毒性であるが、シクロフォスファミドおよび５−ＦＵは有毒であることを示している。化学療法薬であるシクロフォスファミド（ＣＴＸ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、in vivo投与後マウスＨＳＣに対するそれらの影響について検討された。マウスにＰ８Ｓ（コントロール）、50mg/kgの５−ＦＵ、または200 mg/kgのＣＴＸを腹腔内注射する。ＣＴＸもしくは５−ＦＵの単回注射の３日後に、ＫＴＬＳ細胞を単離するために骨髄(BM)細胞を採集する。表３は、これらの異なる処理がＢＭ細胞充実性(４つの長骨における)、ＢＭ中のＫＴＬＳ細胞の評価数、細胞周期のS/G2/M期における％ＫＴＬＳ，ならびに細胞周期のS/G2/M期におけるＫＴＬＳ細胞の評価数に対する影響を示している。ＣＴＸもしくは５−ＦＵの単回注射の３日後、ＫＴＬＳの評価数は劇的に低下するが、このことは、ＣＴＸおよび５−ＦＵがともに所与の用量でマウスＨＳＣに有毒であることを示している。マウスに対する５−ＦＵ投与の標準用量は150mg/kgであるが、ここでは毒性を低減するために50mg/kgの５−ＦＵのみが使用される。生存ＫＴＬＳ細胞は細胞周期の有糸分裂期にあるが、ＣＴＸおよび５−ＦＵ処理後のS/G2/M期でのＫＴＬＳ細胞数はＨＵ処理マウスからのものと比べて10分の１である。実施例１０ＮＧＦＲ導入遺伝子（トランスジーン）形質導入のより高い効率がＨＵ処理マウスから単離したＨＳＣを用いることによって達成できる。ＨＵ処理マウス（100mg/kg/日で３日間処理）からＫＴＬＳ細胞を（上記のように）単離し、神経細胞成長因子レセプター（ＮＧＲＦ）をコードするｃＤＮＡを含むレトロウイルスPP-A.52.855(下記段落参照）を形質導入する。HU処理マウスおよび未処理マウスから単離したKTLSをポリブレンの存在下で３時間（Journal of Virological Methods，60，2,1996， pp171-178，175頁，S．Forestell）に記載の方法に従って）レトロウイルスを用いるスピノキュレーシヨン（spinoculation）によって形質導入する。その後、細胞をSteel因子、TPOおよびIL-6の存在下で７日間培養した。細胞を収穫し、mA b8211抗ヒトNGFR（BoehringerMannheim;Indianapolis，Indiana）を用いて染色することによってトランスジーン発現について調べた。図８において、実験１と実験２の各パネルの上半分はNGFRトランスジーンの発現に関する。図８に示されるように，ベクターなしにスピノキュレーションされる細胞中でのNGFRトランスジーンの発現はほとんどないかから全くないかである。これに対して、HU処理マウスから単離した細胞の高い割合がNGFRを発現する。さらに、非HU処理細胞に由来のKTLS細胞ではトランスジーン発現は非常に僅かしか認められない。以下のプロトコルに従ってPP-A.52.855を得る。初めにプラスミドpPG855をLxS n（Miller A.D．とRosmanG.J．（1989）Bio Techniques 7,980-990:Improved re troviral vectors for gene transfer and expression(遺伝子導入と発現用に改良されたレトロウイルスベクター)）から誘導する。LxSNベクターの3'LTRの一部とSV2-Neo耐性マーカ-遺伝子に及ぶXhol-XbaDNA断片を、LMSPLベクター(Plavec Ｉら（1997）Gene Therapy 7:128-139，High trans-dominant RevM10 proteinle vels are require to inhibit HIV-1 replication in cell lines and primary T cells:Implication for gene therapy of AIDS(高トランス優性RevM10タンパク質レベルは細胞系および一次Ｔ細胞でのHIV-1複製を阻害するのに必要である：AIDSの遺伝子治療の意味)）由来のSV２−Puro耐性マーカー遺伝子と置き換える。次に全長ヒト神経成長因子レセプターNGFr cDNA(Johnson Dら(1986)Cell 47:545-554，Expression and str ucture of the human NGF receptor(ヒトNGFレセプターの発現と構造）)を含む1 .5kbのSacI断片を単一のHpaIクローニング部位にクローン化してpPG855ベクターを生成する(図13参照)。その後、pPG855をProPak-A系（Rigg，（1996）Virology ，218，1:290-295）に導入する。ウイルスベクターPP-A.52.855を含有する上清をその後調製して集める。実施例１１HU はマウスHSCを可動化することができる CTXやエトポシドのようないくつかの化学療法薬はよく用いられて癌患者からの末梢血中にHSCを可動化する。実施した実験はKTL細胞がHUでの処理(例えば、３日間HU処理のみ（100mg/kg/日）または３日間HU処理（100mg/kg/日）ののち７日間G-CSF処理（250μg/日）)によって可動化され得ることを示した。実施例１２ヒトでのex vivo処置は後期CAFC頻度を低下しないヒトHSCに対するHUのex vivo使用実験を開始するために、G-CSF可動化ドナーからThy-1⁺およびThy-1^-CD34⁺Lin^-細胞を単離し、Steel因子、IL-6およびTPOならびに100μg/mlのHUの存在下、44〜48時間SyS-1(1997年１月28日に寄託されたA TCC CRL-12278)上で培養した。その後，生存するThy-1⁺およびThy-1^-細胞を、玉石領域形成細胞(CAFC;cobblestone area forming cells）アッセイのため、Stee l因子、IL-6およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）の存在下SyS-1上に再びプレーティングする。２つの独立した実験において、Thy-1⁺細胞はＨＵ露呈前に頻度1/8および1/7で後期CAFC(6週目)を生ずる(図9)。HU露呈の44時間後、Thy-1⁺細胞で初期（３から４週目）CAFC活性のいくらかの低下があるが、後期CAFC活性は 1/12および1/11の頻度で維持される。Thy-1^-サブセット中のCAFC活性はHU露呈をしてもしなくても非常に低い。すなわち、後期CAFC活性によって測定される未発達のヒトMPBThy-1⁺HSCは48時間のex vivo HU露呈に対し耐性である。BAX15156およびMDA15490は特異的組織サンプルである。実施例１３低用量のex vivo HU処理は無血清および無間質条件中での遺伝子導入に使用できる HUをex vivoで遺伝子形質導入に使用するために、ヒトThy-1⁺細胞の生存のための無血清および無間質培養（stromal free culture）条件に関しHU用量を再び最適にする必要がある。もし標的細胞が遺伝子形質導入時に細胞周期の後期G1期または初期Ｓ期にあるなら、HU用量は理想的である。精製CD34⁺Thy-1⁺Lin^-MPB細胞を48時間，種々の濃度(0.1μg/ml〜100μg/ml)のHUで処理した後、HUの不在下でさらに72時間培養した(図10)。細胞を100μg/mlのHUで処理したときには，実質的に全ての細胞が細胞周期のG1期に残留した。生存細胞の53％がThy-1を発現するが、Thy-1⁺細胞はこの実験の終了時点でほとんど回収されない。一方、Thy- 1⁺細胞のなかには、それらが低用量のHUで処理されるとき細胞周期のＳ期に進むことができるものもある。大部分のThy-1⁺細胞は、細胞が10μg/mlのHUに最初の 48時間露呈されるときに回収される；追加の培養期間である72時間後の生存細胞の46％がThy-1⁺である。実施例１４ex vivo HU投与の結果、細胞周期の初期Ｓ期における細胞の同調（synchronisa tion）とヒトCD34⁺Thy-1⁺HSCにおける上首尾のLyt-2トランスジーン発現が生じる無血清条件下でのHUの滴定前に、Sys-1培養系に100μg/mlのHUを用いて細胞がＳ期に入るのを阻止する(図1)。ヒトCD34⁺Thy-1⁺Lin^-によって可動化された末梢血MPB細胞を低用量のHU(10μg/ml)およびサイトカイン類（例えばFLK2/TPO/IL3/ IL6またはTPO/FLK2/IL6/Steel)の存在下SyS-1(1997年１月28日に寄託されたATCC CRL-12278)上に培養するとき、高い割合のThy-1⁺細胞が細胞周期の初期Ｓ期に同調する(図11)。２つの独立の実験により、30〜50％のThy-1⁺細胞がSyS-1共培養の２日後に初期Ｓ期に進むことが示される。実験１では上記のスピノキュレーション法によって、これらの細胞にPPA.6 Lmilyベクターが形質導入される。さらに４日間細胞を培養しLyt-2トランスジーン発現についてテストする。約25％の細胞が依然としてThy-1⁺であり，細胞の20％がLyt-2トランスジーンを発現する。興昧深いことに、Thy-1⁺細胞の約16％(生存細胞の４％を示す)がLyt-2トランスジーンを発現する。実験２では、形質導入後細胞をさらに３日間培養し、Ly t-2トランスジーン発現についてテストする。最も高い効率のLyt-2トランスジーン発現は、Thy-1⁺細胞を10μg/mlのHUの存在下、はじめの２日間培養する場合に達成される。約13％の細胞が依然としてThy-1⁺細胞であり、細胞の32％がLyt− ２トランスジーンを発現する。この条件でThy-1+細胞の３０％(生存細胞の４％を示す)がLyt-2トランスジーンを発現する。はじめの２日間HUの不在下で、わずかに６％の細胞がThy-1⁺であり、細胞の19％がLyt-2 トランスジーンを発現する。低レベルのLyt-2トランスジーン発現がThy-1⁺細胞中で検出される。この実験では約17％のThy-1⁺細胞（生存細胞の１％を示す）が Lyt-2である。実施例１５精製KTLS細胞に及ぼすHUのex vivo処理の影響を調べる KTLS細胞を正常マウスのBMから単離し、HUの存在または不在下に培養し、生体染料HOECHST 33342で染色して、それらの細胞周期状態を評価する。培養の24時間後、サイトカインの不在下では未処理のKTLS細胞は小さいままであり細胞周期のＳ期に進まないが，一方、SLF、IL-6およびTPOの存在下では大部分のKTLS細胞は大きくなりS/G2/M期に進む(図14b)。同じサイトカインの組合せ中でHUと一緒にインキュベートされた実質的に全てのKTLS細胞は大きくなったが、このことは恐らくG0→G1移行がＳ期に入ることを阻止することを意味している(図14ｃ)。その阻害作用は可逆的である。すなわち、細胞を洗浄して培養培地からHUを除去すると、大部分の細胞は細胞周期のS/G2/M期に進む(図14d)。このように、HUがin vitroでKTLS細胞に対してもつ作用は可逆的であるように思われる。表１A 連続注入によって連続PBSポンプまたはヒドロキシ尿素（HU）でマウスを処理した後に回収されたHSC数およびS/G2/M期における％HSC BM細胞は、各マウスの４つの長骨から採集された。各実験において、１群あたり約３〜10匹のマウスをプールし上記のデータを得た。HSCはc-kit⁺Thy-1.1^loLi n^-/loSca-1⁺と定義された。N/Aは入手不可を示す。表１B KTLS細胞に及ぼすin vivoでのヒドロキシ尿素処理の影響マウスを、１、３または５日間、10,50,100mg/kg/日のヒドロキシ尿素（HU）で連続的に処理する。各マウスの４つの長骨からBM細胞を採集する。表１Bにおいて、各群につき約3.5匹のマウスを使用し、１７の独立した実験から結果を集める。そのような各実験で、BM細胞数、BM中のKTLSの％、BM中のKTLS数または細胞周期のS/G2/M期における％KTLSを決定する。平均士SDVを表すデータを示す。コントロール群のマウスはPBSだけで処理する。＊データは１つの実験に基づいており、これらの結果は従来の報告（Uchidaら，Blood 1997）と一致している。表２ヒドロキシ尿素処理マウス由来のマーカー付きc-kit⁺Thy-1.1^loLin^-/loSca-1⁺ （KTLS）のG0/G1 Rh123^loおよびS/G2/M Rh123^midサブセットの、血液細胞産生に対する寄与競合再構成アッセイ(上記)における血液細胞産生に寄与するドナーKTLSサブセットの頻度は、SASプログラムによって線形回帰分析に基づいて計算された。＊ PLTMR=長期多系統再構成 ** CI=信頼区間(下界95％〜上界95％) 本明細書中で引用した全ての刊行物および特許文献は、あたかも各個々の刊行物または特許文献が特定的にかつ個別に参考としてとり込まれることが指示されているかのように、それらの全体を参考としてとり入れるものとする。上述の特定の実施態様は例示として提供されるものであって本発明の範囲を制限するものと解釈されることを意味していない。本発明の思想または必須構成から逸脱することなく本発明に対し多くの変更をすることが可能であることは、当業者には明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ツカモト・アンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94028，ポルトーラ・バレー，ラ・メサ・ドライブ，888番 (72)発明者ワイスマン・イルヴィングアメリカ合衆国カリフォルニア州 94062，レッドウッド・シティ，ジェファーソン・アヴェニュ 4147番

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の造血幹細胞（ＨＳＣｓ）への遺伝子導入を増大する方法であって、ウイルスが媒介する遺伝子導入前に、該ＨＳＣｓを、活性サイクリング（ac tively cycling）するＨＳＣｓの数を少なくとも１．５倍に増加させるのに有効な量のヒドロキシ尿素（ＨＵ）と接触させること、から成る方法。２．接触が、インビボ、又はエキソビボである、請求項１の方法。３．接触がインビボであり、遺伝子導入前に、哺乳動物対象へ、一日当たり約５０mgから約１５０mg／kg体重の用量範囲で有効量を投与する、請求項２の方法。４．ＨＵ処理ＨＳＣｓに治療遺伝子を形質導入する段階を更に含む、請求項１に方法。５．細胞を治療遺伝子を含有するレトロウイスルベクターで形質導入する段階により、ＨＵ処理ＨＳＣｓに治療遺伝子を導入する、請求項４の方法。６．ＨＳＣｓに治療遺伝子をエキソビボで形質導入する、請求項４の方法。７．エキソビボでの治療遺伝子の組み込みの後に、ＨＳＣｓを対象に投与する段階を更に含む、請求項６の方法。８．ＨＳＣｓが対象にとって同種である、請求項７の方法。９．ＨＳＣｓの接触が、インビトロである、請求項１の方法。１０．サイクリングする造血幹細胞（ＨＳＣｓ）に対する、被験試薬の生物学的効果をスクリーニングする方法であって、以下の工程：ａ）インビトロでＨＳＣｓ集団を活性サイクリングするＨＳＣｓの数を少なくとも１．５倍に増加させるのに有効な量のヒドロキシ尿素で処理し；ｂ）ヒドロキシ尿素で処理されたＨＳＣｓ集団を培養中で該被験試薬と接触させ；ｃ）ＨＳＣｓに対する、ＨＳＣｓの分化、増殖又は自己複製から成る群から選択される該試薬の生物学的効果を決定するのに適した条件下で、工程ｂ）のＨＳＣｓをアッセイする、ことから成る前記方法。１１．遺伝子導入によって軽減（緩和）される疾患に苦しむ患者の治療法であって、以下の工程：ａ）２〜１４日間一日当たり１０−２００mg／kg体重の用量範囲でヒドロキシ尿素を患者に投与し、ｂ）ウイルスによる形質導入で有効量の治療遺伝子を投与する、ことから成る前記方法。１２．ヒドロキシ尿素を経口又は静注で投与する、請求項１１の方法。１３．一日当たり約５０mgから約１５０mg／kg体重の用量範囲で有効量のヒドロキシ尿素を患者に投与する、請求項１１の方法。１４．骨髄移植の効率を増大する方法であって、骨髄提供者（ドナー）から骨髄を採取する前に、移植に利用できるＨＳＣｓの数を少なくとも１．５倍に増加させるのに有効な量のヒドロキシ尿素を該骨髄提供者に投与することから成る、骨髄移植の増大方法。１５．ヒドロキシ尿素を経口又は静注で対象に投与する、請求項３の方法。１６．連続３〜７日間、ヒドロキシ尿素を対象に投与する、請求項３の方法。１７．ヒドロキシ尿素を経口又は静注で骨髄提供者に投与する、請求項１４の方法。１８．一日当たり約５０mgから約１５０mg／kg体重の用量範囲のヒドロキシ尿素を連続２〜１４日間投与する、請求項１４の方法。１９．ＨＳＣｓのアッセイ段階が、被験試薬で処理されたＨＳＣｓを、被験試薬で処理されないコントロールＨＳＣｓには存在しない変化について分析することを含む、請求項１０の方法。２０．生物学的効果が増殖の阻害である、請求項１０に方法。