JP2008512376A - 単離された系統陰性造血幹細胞及びこれを用いた治療方法 - Google Patents

Abstract

単離された、哺乳動物の生体骨髄由来の系統陰性造血幹細胞集団（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）は、網膜血管及び眼におけるニューロンネットワークを救うことができる内皮前駆細胞（ＥＣＰ）を含有する。好ましくは、単離されたＬｉｎＨＳＣにおける細胞の少なくとも約２０％が、細胞表面抗原ＣＤ３１を発現する。単離されたＬｉｎ ＨＳＣ集団は、眼血管疾患の治療及び網膜における錐体細胞変性を改善するのに有用である。好ましい実施形態において、生体哺乳動物から骨髄を抽出し；骨髄から複数の単球を分離し；１以上の系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル個体により単球を標識し；複数の単球から、系統表面抗原に対して陽性の単球を除去し、ＥＰＣを含有するＬｉｎ ＨＳＣ集団を回収することにより、Ｌｉｎ ＨＳＣを単離する。単離されたＬｉｎ ＨＳＣに対して、治療上有用な遺伝子をトランスフェクションすることもできる。レーザーを用いて網膜において活性化した星状細胞の増殖を刺激することにより、治療を促進し得る。

Description

本発明は単離された哺乳動物幹細胞に関する。より具体的には、本発明は、骨髄由来の系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）集団及び、単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を用いて哺乳動物の眼を処置することにより眼変性疾患に罹患している哺乳動物の網膜において錐体細胞を維持する方法に関する。

加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、先進国における視力障害の主要な原因であり、これは、異常な網膜の血管新生の結果として起こる。網膜は明確な、ニューロン、グリア及び血管要素の層から構成されるので、血管増殖又は浮腫において見られるものなどの比較的小さな障害により、顕著な視覚機能障害が起こり得る。網膜色素変性（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性もまた、細動脈狭窄及び血管萎縮などの血管の異常に関連する。殆どの遺伝性ヒト網膜変性は特に桿状光受容器に影響を及ぼすが、ヒトにおける中央の細かい視力に寄与する網膜の領域である黄斑の主要な細胞性成分である錐体細胞も同時に失われる。錐体細胞特異的な生存因子が最近記載されたが（Ｍｏｈａｎｄ−Ｓａｉｄら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８３５７−８３６２）、この因子により網膜変性マウスモデルで錐体細胞の生存が促進され得る。

３５００人に１人が網膜の遺伝性変性に罹患しており、この疾患は進行性の夜盲、視野欠損、視神経萎縮、細動脈弱化、血管透過性の変化及び全盲に進行することが多い中央視野欠損を特徴とする（Ｈｅｃｋｅｎｌｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ．、編者、１９８８；Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ＣＯ．）。これらの疾患の分子遺伝学的分析により、１１０を超える様々な遺伝子における突然変異が同定されたが、これにより説明されるのは既知の罹患個体の比較的少数でしかない（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０４-８０８；Ｆａｒｒａｒら、２００２、ＥＭＢＯ Ｊ．２１：８５７−８６４）。これらの突然変異の多くは、ロドプシン、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、ｒｄｓペリフェリン及びＲＰＥ６５を含む光情報伝達機構の酵素的及び構造的成分に関与する。これらの観察にもかかわらず、これらの網膜変性疾患の進行を遅延させる、又は回復させるための効果的な治療は依然として得られていない。遺伝子治療における最近の進歩により、特異的な突然変異のある動物において光受容体又は網膜色素性上皮（ＲＰＥ）へと野生型トランス遺伝子を送達した場合、マウスにおけるｒｄｓ（Ａｌｉら、２０００、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３０６−３１０）及びｒｄ（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２−７８１６）表現型及びイヌにおけるＲＰＥ６５表現型（Ａｃｌａｎｄら、２００１、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２−９５）の良好な回復が導かれた。

長年にわたり、正常な成体循環及び骨髄において幹細胞の集団が存在することが知られている。これらの細胞の様々なサブ集団は造血系統陽性（Ｌｉｎ＋）又は系統陰性（Ｌｉｎ⁻）に沿って分化し得る。さらに、系統陰性造血幹細胞（ＨＳＣ）集団が、インビトロ及びインビボで血管を形成することができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含有することが最近示された（Ａｓａｈａｒａら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：９６４−７参照。）。これらの細胞は、正常及び病的な出生後の血管形成に関与し得（Ｌｙｄｅｎら、２００１ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７、１１９４−２０１；Ｋａｌｋａら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：３４２２−７；及びＫｏｃｈｅｒら、２００１、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：４３０−６参照。）、また、肝細胞（Ｌａｇａｓｓｅら、２０００、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１２２９−３４参照。）、小膠細胞（Ｐｒｉｌｌｅｒら、２００２ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：１３５６−６１参照。）、心筋細胞（Ｏｒｌｉｃら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１０３４４−９参照。）及び上皮（Ｌｙｄｅｎら、２００１、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：１１９４−１２０１参照。）を含む様々な非内皮細胞タイプに分化し得る。血管形成のいくつかの実験モデルにおいてこれらの細胞が使用されてきたにもかわらず、新生血管系に対するＥＰＣターゲティングの機構は分かっておらず、特定の脈間構造に寄与する細胞数を効率的に増加させるストラテジーは確認されていない。

骨髄からの造血幹細胞は現在、治療応用のために一般に使用される幹細胞タイプのみである。４０年以上にわたり、移植において骨髄ＨＳＣが使用されてきた。現在、白血病、リンパ腫及び遺伝性血液疾患の治療に対する療法を開発するために、精製幹細胞回収の改良法が研究されている。限られた人数のヒト患者において、糖尿病及び進行した腎臓癌の治療に対して、ヒトにおける幹細胞の臨床応用が研究されてきた。

（発明の概要）
本発明は、眼疾患に罹患した哺乳動物の網膜における錐体細胞変性を改善する方法を提供する。本方法は、哺乳動物骨髄由来の単離系統陰性造血幹細胞集団を哺乳動物の網膜に投与する段階を含むが、この細胞集団は、造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含有する。網膜において錐体細胞変性を遅らせるのに十分な量で細胞を投与する。

好ましい方法は、内皮前駆細胞を含む系統陰性造血幹細胞集団を眼疾患に罹患した哺乳動物の骨髄から単離し、続いて、網膜において錐体細胞の変性を改善するのに十分な数で、単離した幹細胞を哺乳動物の眼に硝子体内注入することを含む。

本発明の方法は、哺乳動物骨髄由来の、単離された、哺乳動物系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）集団（つまり、その細胞表面において系細胞表面抗原（Ｌｉｎ）を発現しない造血幹細胞（ＨＳＣ））を利用する。好ましくは、細胞は自家幹細胞である（つまり治療を受ける個別の哺乳動物の骨髄由来。）。単離された、哺乳動物のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含み、眼に硝子体内注入された際に活性化網膜星状細胞を選択的に標的とする、内皮前駆細胞としても知られている。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

好ましい実施形態において、眼疾患に罹患した哺乳動物から骨髄を抽出し；骨髄から複数の単球を分離し；１以上の系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体により単球を標識し、系統表面抗原に対して陽性である単球を除去し、次いでＥＰＣを含有するＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を回収することにより、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を単離する。好ましくは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ、ＴＥＲ−１１９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ６６ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２３５ａ（グリコフォリンＡ）からなる群から選択される１以上の系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体を用いて単球を標識する。好ましくは、本発明の単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞の少なくとも約２０％が表面抗原ＣＤ３１を発現する。次いで、好ましくは眼内注入により、哺乳動物の疾患のある眼に単離細胞を投与する。好ましい実施形態において、単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する（ｃ−ｋｉｔ）。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団中のＥＰＣは、発生中の網膜血管及び網膜のニューロンネットワークに広く組み込まれ、眼の新生血管系及びニューロンネットワークに安定して組み込まれ続ける。正常なマウス網膜は大部分桿体であるが、本発明の方法により処置されたマウスにおいて、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置後の救出細胞は、驚くべきことに殆ど全て錐体であった。

ある好ましい実施形態において、単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞に対して治療上有用な遺伝子をトランスフェクションする。例えば、神経栄養因子又は、新生血管系を選択的に標的とし、細胞を利用した遺伝子治療の形態を介して既に確立された血管に影響を与えずに新しい血管形成を抑制する抗血管形成物質を操作可能にコードするポリヌクレオチドを細胞に対してトランスフェクションし得る。ある実施形態において、本発明の方法において有用な単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、血管形成阻害ペプチドをコードする遺伝子を含む。血管形成阻害Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、ＡＲＭＤ、ＤＲ及び、異常な脈間構造を伴うある種の網膜変性などの疾患において異常な血管成長を調節するのに有用である。別の好ましい実施形態において、本発明の単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、神経栄養ペプチドをコードする遺伝子を含む。神経栄養性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、緑内症、網膜色素変性などの網膜神経変性に関連する眼疾患においてニューロン救出を促進するのに有用である。

本発明の単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団を用いた眼の処置の具体的な長所は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを用いて硝子体内処置された眼において観察される、血管栄養性及び神経栄養性救出効果である。網膜ニューロン及び光受容体、特に錐体が保存され、本発明の単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置した眼において、視覚機能のいくつかの指標が維持され得る。

好ましくは、本発明の方法により治療すべき疾患のある網膜は、活性化星状細胞を含む。関連するグリオーシスがある場合の眼の早期治療により、又は、レーザーを用いて活性化星状細胞の局所的増殖を刺激することにより、これを達成することができる。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
幹細胞は通常、細胞表面の抗原の分布により同定される（詳細な考察については、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，ａ ｒｅｐｏｒｔ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ，Ｊｕｎｅ ２００１，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎａｒｋｅｒｓ（適切な程度まで、参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。）。

本発明は、眼疾患に罹患した哺乳動物の網膜において錐体細胞変性を改善する方法を提供する。造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含む、哺乳動物骨髄由来の単離系統陰性造血幹細胞集団を哺乳動物の網膜に、好ましくは硝子体内注入により、投与する。網膜における錐体細胞変性を改善するのに十分な量で細胞を投与する。

好ましい方法は、治療すべき哺乳動物の骨髄から系統陰性の造血幹細胞集団を単離し、次に網膜において錐体細胞の変性を改善するのに十分な数で、哺乳動物に細胞を投与することを含む。

疾患哺乳動物から、好ましくは眼疾患の初期段階で、細胞を得ることができる。あるいは、例えば網膜色素変性などの眼疾患に対する遺伝性素因を有することが分かっている患者において疾患の発症前に細胞を得ることができる。必要になるまで細胞を保存することができ、次いで疾患発症の徴候が最初に観察されたところで予防的に細胞を注入することができる。好ましくは、疾患のある網膜は活性化星状細胞を含み、幹細胞がこれを標的とするようにする。したがって、関連グリオーシスがある場合の眼の早期治療は有益である。あるいは、自家幹細胞を投与する前に、網膜において活性化星状細胞増殖を局所的に刺激するために、レーザーで網膜を処置することができる。

造血幹細胞は、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、血小板及び赤血球などの様々な血液細胞型に発生できる幹細胞である。系統表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ：ＣＤ１８）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、マウスＬｙ−６Ｇ、マウスＴＥＲ−１１９、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）を含む、成熟血液細胞系列のマーカーである細胞表面タンパク質のグループである。顕著なレベルでこれらの抗原を発現しない造血幹細胞は、一般に、系統陰性（Ｌｉｎ⁻）と呼ばれる。ヒト造血幹細胞は一般に、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）及び／又はＣＤ１３３などの他の表面抗原を発現する。マウス造血幹細胞は一般に、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、Ｔｈｙ−１及び／又はＳｃａ−１などの他の表面抗原を発現する。

本発明は、細胞表面において顕著なレベルで「系統表面抗原」（Ｌｉｎ）を発現しない単離造血幹細胞を提供する。本明細書中でこのような細胞を「系統陰性」又は「Ｌｉｎ⁻」造血幹細胞と呼ぶ。特に、本発明は、発生中の脈間構造及び次いで血管内皮細胞になるための分化に組み込むことができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むＬｉｎ⁻造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）の集団を提供する。好ましくは、単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの培養メディウム中に存在する。

本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、骨髄に関して「成体」という語は、胎仔ではなく、出生後に単離された、つまり幼若及び成体個体由来の骨髄を含む。「成体哺乳動物」という用語は、幼若及び完全に成熟した哺乳動物の両方を指す。

本発明の、単離された哺乳動物の系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）集団は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、好ましくは、細胞の少なくとも約２０％が内皮細胞において一般に存在する表面抗原ＣＤ３１を発現する哺乳動物細胞を含有する。他の実施形態において、細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１を発現し、より好ましくは少なくとも約６５％、最も好ましくは少なくとも約７５％がＣＤ３１を発現する。好ましくは、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞の少なくとも約５０％が、好ましくはインテグリンα６抗原を発現する。

ある好ましいマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の実施形態において、細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１抗原を発現し、細胞の少なくとも約５０％がＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗原を発現する。好ましくは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の少なくとも約７５％、より好ましくは細胞の約８１％が表面抗原ＣＤ３１を発現する。別の好ましいマウスの実施形態において、細胞の少なくとも約６５％、より好ましくは細胞の約７０％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する。本発明の特に好ましい実施形態は、細胞の約５０％から約８５％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、細胞の約７０％から約７５％が表面抗原ＣＤ１１７を発現するマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣの集団である。

別の好ましい実施形態は、細胞がＣＤ１３３陰性であり、細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１表面抗原を発現し、細胞の少なくとも５０％がインテグリンα６抗原を発現する、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団である。さらに別の好ましい実施形態は、細胞がＣＤ１３３陽性であり、細胞の約３０％未満がＣＤ３１表面抗原を発現し、細胞の約３０％未満がインテグリンα６抗原を発現する、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団である。

本発明の単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、細胞を単離した、マウス又はヒトなどの哺乳動物種の眼に硝子体内注入した場合、選択的に星状細胞を標的とし、網膜新生血管に組み込まれる。

本発明の単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、内皮細胞に分化し、網膜中で血管構造を生成させる内皮前駆細胞を含む。とりわけ、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、網膜新生血管及び網膜血管変性疾患の治療に対して、及び網膜血管損傷の修復に対して有用である。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞はまた、網膜においてニューロンの救出を促進し、抗アポトーシス遺伝子の上方制御を促進する。驚くべきことに、本発明の成人ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が、網膜変性に罹患している重度の複合的免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいてでさえ、網膜変性を抑制し得ることが分かった。正常なマウス網膜は主に桿体であるが、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣでの治療処置後、救出された細胞は殆ど全てが錐体である。さらに、酸素誘発性網膜症又は未熟児網膜症に罹患している哺乳動物など、新生仔哺乳動物の眼における網膜の欠陥を処置するために、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団を利用し得る。

本発明はまた、哺乳動物の骨髄細胞から内皮前駆細胞を含む系統陰性造血幹細胞集団を単離し、疾患を阻むのに十分な数で哺乳動物の眼に単離幹細胞を硝子体内に注入することを含む、哺乳動物において眼疾患を処置する方法も提供する。新生仔、幼若又は完全に成熟した哺乳動物における、網膜変性疾患、網膜血管変性疾患、虚血性網膜症、血管出血、血管漏出及び脈絡膜症などの眼疾患を処置するために本方法を利用することができる。このような疾患の例としては、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、推定眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、鎌状赤血球貧血及び網膜色素変性ならびに網膜損傷が挙げられる。

眼に注入される幹細胞の数は、眼の疾患状態を阻むのに十分である。例えば、細胞数は、眼の網膜損傷を修復し、網膜新生血管を安定化し、網膜新生血管を成熟させ、血管漏出及び血管出血を防ぐ又は修復するために有効であり得る。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞に対して、眼の、細胞を利用した遺伝子治療における使用に対して、抗血管形成タンパク質をコードする遺伝子及び、ニューロン救出効果を促進するための神経栄養因子をコードする遺伝子などの治療上有用な遺伝子をトランスフェクションし得る。

トランスフェクションされた細胞は、網膜疾患の処置に対して治療上有用な何らかの遺伝子を含み得る。ある好ましい実施形態において、本発明のトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、ＴｒｐＲＳ又はその抗血管形成断片（例えばＴｒｐＲＳのＴ１及びＴ２断片）（これらは、共同所有、同時係属米国特許出願第１０／０８０，８３９号（参照により本明細書中に組み込む。）で詳細に述べられている。）などの、タンパク質又はタンパク質断片を含む抗血管形成ペプチドを操作可能にコードする遺伝子を含む。本発明の抗血管形成ペプチドをコードするトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、糖尿病性網膜症などの疾患といった異常な血管発生を含む網膜疾患の処置に有用である。好ましくは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣはヒト細胞である。

別の好ましい実施形態において、本発明のトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素性上皮由来神経栄養因子、インスリン様増殖因子、グリア細胞系列由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子などの神経栄養因子を操作可能にコードする遺伝子を含む。このような神経栄養性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、緑内症及び網膜色素変性などの網膜ニューロン変性疾患において、網膜神経などに対する損傷の処置において、ニューロンの救出を促進するのに有用である。網膜色素変性の治療に対して毛様体神経栄養因子の移植が有用であるとして報告されている（Ｋｉｒｂｙら、２００１、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３（２）：２４１−８；Ｆａｒｒａｒら、２００２、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２１：８５７−８６４を参照。）。脳由来神経栄養因子は、報告によると、損傷のある網膜神経節において増殖関連遺伝子を調節する（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４７：５６１−５７２を参照。）。グリア細胞系列由来神経栄養因子は、報告によると、網膜色素変性において光受容体変性を遅らせる（ＭｃＧｅｅら、２００１、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｆ．４（６）：６２２−９を参照。）。

本発明はまた、哺乳動物の骨髄から内皮前駆細胞を含有する系統陰性造血幹細胞を単離する方法を提供する。本方法は、（ａ）生体哺乳動物から骨髄を抽出し；（ｂ）骨髄から複数の単球を分離し；（ｃ）１以上の系統表面抗原、好ましくは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ（マウス）、ＴＥＲ−１１９（マウス）、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）からなる群から選択される系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体で単球を標識し、（ｄ）複数の単球から前記１以上の系統表面抗原に対して陽性の単球を除去し、好ましくは細胞の少なくとも約２０％がＣＤ３１を発現する、内皮前駆細胞を含有する系統陰性造血幹細胞の集団を回収する段階を含む。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが成人ヒト骨髄から単離される場合、好ましくは、系統表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７.２）及びＣＤ２３５ａに対するビオチン結合系統パネル抗体で単球を標識する。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが成体マウス骨髄から単離される場合、好ましくは、系統表面抗原ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で単球を標識する。

好ましい方法において、成人ヒト骨髄から細胞を単離し、ＣＤ１３３系統によりさらに分離する。ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを単離するある好ましい方法には、ビオチン結合ＣＤ１３３抗体で単球を標識し、ＣＤ１３３陽性のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を回収するさらなる段階が含まれる。通常、このような細胞の約３０％未満がＣＤ３１を発現し、このような細胞の約３０％未満がインテグリンα６を発現する。本発明のヒトＣｄ１３３陽性のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、血管形成が起こっていない眼に注入した場合、周辺の虚血により起こる血管新生の部位を標的とすることができる。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを単離する別の好ましい方法には、ビオチン結合ＣＤ１３３抗体で単球を標識し、ＣＤ１３３陽性細胞を除去し、ＣＤ１３３陰性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団を回収するさらなる段階が含まれる。通常、このような細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１を発現し、このような細胞の少なくとも約５０％がインテグリンα６を発現する。本発明のヒトＣＤ１３３陰性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、血管形成が起こっている眼に注入した場合、発生中の脈間構造に組み込まれ得る。

本発明はまた、眼への細胞の硝子体内注入によって本発明のトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を投与することにより、眼の血管形成性疾患を治療するための方法を提供する。このようなトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は、抗血管形成又は神経栄養性遺伝子産物をコードする遺伝子などの治療上有用な遺伝子でトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣを含む。好ましくは、トランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞はヒト細胞である。

好ましくは、硝子体内注入により、網膜変性疾患に罹患している哺乳動物の眼に、少なくとも約１ｘ１０^５個のＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞又はトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を投与する。注入すべき細胞数は、網膜変性の重症度、哺乳動物の齢及び網膜疾患を治療する当業者にとって容易に明らかとなろうその他の因子に依存し得る。治療担当の臨床家により決定されるように、単回投与又は一定期間にわたる複数回投与によりＬｉｎ⁻ＨＳＣを投与し得る。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣは、網膜損傷及び、網膜脈間構造供給の障害もしくは網膜脈間構造の劣化もしくは網膜ニューロン変性を含む網膜の欠陥の治療に有用である。網膜脈間構造の、再生又は回復治療での使用のために、ならびに網膜ニューロン変性の、治療又は改善のために、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを使用して、遺伝的に同一の細胞の系列、つまりクローンを生成させることもできる。

（実施例）

細胞単離及び濃縮；マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団Ａ及びＢの調製
全般的手段。インビボ評価は全て、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従い行い、評価手段は全て、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＴＳＲＩ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６、Ｔｉｅ−２ＧＦＰ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ、ＦＶＢ／ＮＪ（ｒｄ／ｒｄマウス）又はＢａｌｂ／ｃＢＹＪ成体マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＥ）から骨髄細胞を抽出した。

次に、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ^（Ｒ）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度勾配分離により単球を分離し、マウスでのＬｉｎ⁻選択のためにビオチン結合系統パネル抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１、ＴＥＲ−１１９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。系統陽性（Ｌｉｎ^＋）細胞を分離し、磁気分離装置（ＡＵＴＯＭＡＣＳ^ＴＭソーター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてＬｉｎ⁻ＨＳＣから除去した。ＦＡＣＳ^ＴＭＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて、次の抗体を用い、内皮前駆細胞を含有する得られたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の特徴をさらに調べた：ＰＥ−結合−Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ及びＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。Ｔｉｅ−２の特徴を調べるために、Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ骨髄細胞を使用した。

成体マウス内皮細胞を回収するために、ＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから腸間膜組織を手術により取り出し、組織を消化するためにコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）中に入れ、次いで４５μｍフィルターを用いてろ過した。フロースルーを回収し、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ（内皮増殖培地）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともにインキュベートした。ＣＤ３１ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色して形態的な敷石状所見を観察することにより、内皮の特徴を確認し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ^ＴＭマトリックス（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において管状構造の形成について培養物を調べた。

マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団Ａ。上述の全般的手段により、ＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから骨髄細胞を抽出した。ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−Ｉ及びＴｉｅ−２細胞表面抗原マーカーに対して、ＦＡＣＳフローサイトメトリーにより、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の特徴を調べた。図１（ｃ）において結果を示す。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約８１％がＣＤ３１マーカーを示し、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約７０．５％がｃ−ｋｉｔマーカーを示し、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約４％がＳｃａ−１マーカーを示し、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約２．２％がＦｌｋ−１マーカーを示し、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約０．９１％がＴｉｅ−２マーカーを示した。一方、これらの骨髄細胞から単離したＬｉｎ^＋ＨＳＣは、顕著に異なる細胞マーカープロファイルを有した（つまり、ＣＤ３１：３７．４％；ｃ−ｋｉｔ：２０％；Ｓｃａ−１：２．８％；Ｆｌｋ−：０．０５％）。

マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団Ｂ。上述の全般的手段により、Ｂａｌｂ／ｃ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ及びＣ３Ｈマウスから骨髄細胞を抽出した。細胞表面マーカー（Ｓｃａ−１、ＫＤＲ、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ３４、ＣＤ３１及び様々なインテグリン：α１、α２、α３、α４、α５、α６、α_Ｍ、α_Ｖ、α_Ｘ、α_ＩＩｂ、β_１、β_４、β_３、β_４、β_５及びβ_７）の存在について、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を分析した。結果を表１に示す。

マウスモデルにおける細胞の硝子体内投与
鋭利な刃を用いてマウス眼瞼において眼瞼裂溝を作り、Ｐ２からＰ６の眼球を露出した。次に、３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）針付きシリンジを用いて、本発明の系統陰性ＨＳＣ集団Ａ（細胞培養液約０．５μＬから約１μＬ中およそ１０^５細胞）を硝子体内に注入した。

ＥＰＣトランスフェクション
製造者のプロトコールに従い、ＦｕＧＥＮＥ^ＴＭ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、Ｈｉｓ_６タグも含むＴｒｐＲＳのＴ２断片をコードするＤＮＡ（配列番号１、図７）をマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ（集団Ａ）にトランスフェクションした。幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含有するｏｐｔｉ−ＭＥＭ^（Ｒ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞（約１０^６細胞／ｍＬ）を懸濁した。次に、ＤＮＡ（約１μｇ）及びＦｕＧＥＮＥ試薬（約３μＬ）混合液を添加し、混合液を約３７℃で約１８時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗浄し、回収した。この系のトランスフェクション率は、ＦＡＣＳ分析により確認したところ、およそ１７％であった。ウェスタンブロッティングによりＴ２産生を確認した。Ｈｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列を配列番号２、図８として示す。

免疫組織化学及び共焦点分析
様々な時間点でマウス網膜を回収し、ホールマウント又は凍結切片の何れかに対して標本作製を行った。ホールマウントの場合、４％パラホルムアルデヒドで網膜を固定し、５０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２０％正常ヤギ血清中で周囲室温にて１時間ブロッキングした。一次抗体で網膜を処理し、二次抗体で検出した。使用した一次抗体は、抗コラゲナーゼＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ、抗β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、抗α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であった。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８又は５９４蛍光マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の何れかに結合したものであった。ＭＲＣ１０２４共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像を撮影した。ＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ^（Ｒ）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて三次元画像を作製し、ホールマウント網膜において、血管発生の、異なる３層を調べた。共焦点顕微鏡により区別される強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マウスとＧＦＡＰ／ｗｔＧＦＰマウスとの間のＧＦＰピクセル強度の違いを利用して、３次元画像を作製した。

マウスにおけるインビボ網膜血管形成定量アッセイ
Ｔ２−ＴｒｐＲＳ分析に対して、マウス網膜の三次元画像から一次及び深部叢を再構成した。一次叢を２つのカテゴリー、正常発生又は血管発達停止に分けた。深部血管発生の抑制のカテゴリーは、次の基準を含む血管新生抑制のパーセンテージに基づき解釈した：深部叢形成の完全抑制を「完全」とし、正常な血管発生（２５％未満の抑制を含む。）を「正常」とし、残りを「部分的」とした。ｒｄ／ｒｄマウス救出データに対して、１０ｘレンズを用いて各ホールマウント網膜における深部叢の４箇所の別個の領域を捕捉した。各画像に対して脈間構造の全長を計算し、まとめ、群間で比較した。正確な情報を得るために、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを一方の眼に注入し、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣを同じマウスの他方の眼に注入した。同腹のマウスから非注入対照網膜を取った。

成体網膜損傷マウスモデル
ダイオードレーザー（１５０ｍＷ、１秒、５０ｍｍ）を用いるか又は２７ゲージ針でマウス網膜に孔を開けることによる機械的な方法の何れかで、レーザー及び瘢痕モデルを作製した。損傷から５日後、硝子体内注入法により細胞を注入した。５日後にマウスから眼を回収した。

網膜変性の神経栄養救出
成体マウス骨髄由来系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）は、網膜変性のマウスモデルにおいて血管栄養性及び神経栄養救出効果を有する。１０日齢マウスの右眼に対して、本発明の約１０^５個のＬｉｎ⁻ＨＳＣを含有する約０．５マイクロリットルを硝子体内注入し、網膜脈間構造の存在及びニューロン層核数について２カ月後に評価した。同じマウスの左眼に対して、対照としておよそ同数のＬｉｎ^＋ＨＳＣを注入し、同様に評価した。図９で示されるように、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置した眼において、網膜脈間構造はほぼ正常と思われ、内顆粒層はほぼ正常であり、外顆粒層（ＯＮＬ）は核の約３から約４層を有した。一方、逆側のＬｉｎ^＋ＨＳＣ処置した眼では、中間網膜血管層が顕著に萎縮し、外側の網膜血管層は完全に萎縮し、内顆粒層は顕著に萎縮し、外顆粒層は完全になくなっていた。これは、マウス３及びマウス５においてはっきりと示された。マウス１において、救出効果はなく、これは注入マウスのおよそ１５％に対して当てはまった。

網膜電図（ＥＲＧ）を用いて視覚機能を評価した場合、血管及びニューロン救出の両方が観察された場合（マウス３及び５）、陽性のＥＲＧの回復が観察された。血管又はニューロン救出がなかった場合（マウス１）、陽性のＥＲＧは観察されなかった。図１０で示される回帰分析プロットにより、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣによるｒｄ／ｒｄマウス眼の血管と神経栄養性救出との間のこの相関が示される。中間脈間構造型（ｒ＝０．４５）及び深部脈間構造型（ｒ＝０．６７）に対して、ニューロン（ｙ軸）と血管（ｘ軸）回復との間の相関が観察された。

図１１は、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣによる血管とニューロン救出との間に統計的に有意な相関が何らないことを示す。血管救出を定量し、データを図１２で示す。図１２で示される、注入後１カ月（１Ｍ）、２カ月（２Ｍ）及び６カ月（６Ｍ）でのマウスに対するデータから、特に注入後１カ月及び２カ月において、同じマウスからの非処置眼（淡色のバー）における血管長と比較して、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置した眼（濃色のバー）において血管長が有意に長くなったことが分かる。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はＬｉｎ^＋ＨＳＣの注入後約２カ月の内及び外顆粒層において核を数えることにより、神経栄養性救出効果を定量した。結果を図１３及び１４に示す。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団
上述の全般的手段により、健常成人ヒトボランティアから骨髄細胞を抽出した。次に、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ^（Ｒ）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度勾配分離により、単球を分離した。ヒト骨髄単核細胞からＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を単離するために、磁気分離系（ＡＵＴＯＭＡＣＳ^ＴＭソーター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とともに次のビオチン結合系統パネル抗体を使用した：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ２３５ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。

ＣＤ１３３発現に基づき、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団を２つのサブ集団にさらに分離した。ビオチン結合ＣＤ１３３抗体で細胞を標識し、ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性サブ集団に分離した。

網膜変性のマウスモデルにおけるヒト及びマウス細胞の硝子体内投与
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤ及びｒｄ１０マウス系統を網膜変性モデルとして使用した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ及びＣ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍａｉｎｅ）は、Ｒｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ１（ｒｄ１）突然変異に対してホモ接合型であった（この突然変異は早期から発症する重篤な網膜変性を引き起こす。）。突然変異は、桿体光受容体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットをコードするＰｄｅ６ｂ遺伝子のエクソン７に位置する。この遺伝子における突然変異は、常染色体劣性網膜色素変性（ＲＰ）ヒト患者において見出されている。Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウスはまた、重症複合型免疫不全自然突然変異（Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤ）に対してホモ接合型であり、ヒト細胞移入実験に使用した。ｒｄ１０マウスにおける網膜変性は、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子のエクソン１３での突然変異により引き起こされる。これはまた、遅発型及びｒｄ１／ｒｄ１よりも軽度の網膜変性と臨床的に関連のあるＲＰモデルでもある。ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従い全ての評価を行い、評価手段は全て、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。

鋭利な刃を用いてマウス眼瞼において眼瞼裂溝を作り、Ｐ２からＰ６の眼球を露出した。次に、３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）針付きシリンジを用いて、本発明のＬｉｎｅａｇｅ陰性ＨＳＣ集団Ａ又はヒト集団Ｃ（細胞培養液約０．５μＬからto約１μＬ中およそ１０^５細胞）を硝子体内に注入した。注入したヒト細胞を視覚化するために、注入前に色素で細胞を標識した（Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。

様々な時点で網膜を回収し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及びメタノールで固定した後、５０％ＦＢＳ／２０％ＮＧＳ中で室温にて１時間ブロッキングした。網膜脈間構造を染色するために、網膜を抗ＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗コラゲナーゼＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体とインキュベートし、次いでＡｌｅｘａ４８８又は５９４結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）とインキュベートした。弛緩させるように４箇所に放射状に減張切開した網膜を平らに置いて、ホールマウント標本を得た。Ｒａｄｉａｎｃｅ ＭＰ２１００共焦点顕微鏡及びＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ^（Ｒ）ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、中間又は深部網膜血管叢における脈間構造の画像（Ｄｏｒｒｅｌｌら、２００２ Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：３５００-３５１０）を得た。脈間構造を定量するために、中間又は深部血管層の中央部分から４箇所の個別の視野（９００μｍ ｘ ９００μｍ）を無作為に選択し、ＬＡＳＥＲＰＩＸ^（Ｒ）解析ソフトウェア（Ｂｉｉｏｒａｄ）を用いて脈間構造の全長を測定した。同じ叢におけるこれらの４箇所の視野の全長をさらなる分析に用いた。

凍結切片用に、平らに置いた網膜を再び包埋した。４％ＰＦＡ中に一晩網膜を入れ、その後、２０％スクロースとともにインキュベートした。最適薄切温度コンパウンド（ＯＣＴ：Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ ＦｉｎｅＴｅｃｈ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中で網膜を包埋した。核色素ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有するＰＢＳ中で凍結切片（１０μｍ）を再水和した。視神経乳頭及び周辺部網膜全体を含有した１つの切片中の３箇所の異なる領域のＤＡＰＩ標識された核の画像（２８０μｍ幅、無作為サンプリング）を共焦点顕微鏡により撮影した。１つの切片中の３箇所の独立した視野のＯＮＬにある核数を数え、解析のために合計した。深部叢の脈間構造の長さとＯＮＬの細胞核数との間の関係を調べるために、単純線形回帰分析を行った。

一晩暗順応させた後、１５μｇ／ｇｍケタミン及び７μｇ／ｇｍキシラジンの腹腔内注入によりマウスを麻酔した。瞳孔拡張（１％硫酸アトロピン）後、マウスリファレンス（ｍｏｕｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）及び尾部接地電極とともに金ループ角膜電極を用いて、各眼の角膜表面から網膜電図（ＥＲＧ）を記録した。反射率が高いＧａｎｚｆｅｌｄドームの外側に固定したＧｒａｓｓ Ｐｈｏｔｉｃ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＰＳ３３ Ｐｌｕｓ、Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）を用いて刺激を起こした。光刺激装置により可能な最大強度（０．６６８ｃｄ−ｓ／ｍ^２）以下の強度範囲に及ぶ短波長（Ｗｒａｔｔｅｎ ４７Ａ；λｍａｘ＝４７０ｎｍ）の光のフラッシュに対して桿体の反応を記録した。反応シグナルを増幅し（ＣＰ５１１ ＡＣ増幅器 Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、デジタル化し（ＰＣＩ−１２００、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、コンピュータ解析した。処置及び非処置眼の両方から記録したＥＲＧとともに、各マウスをそれ自身の内部対照として用いた。最も弱いシグナルに対して１００スイープ以下を平均した。非処置眼からの平均反応を処置眼からの反応からデジタル処理により差し引き、シグナルにおけるこの差を機能的救出の指標とするために使用した。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが標的とする網膜遺伝子発現の評価のために、マイクロアレイ分析を使用した。Ｐ６ ｒｄ／ｒｄマウスにＬｉｎ⁻又はＣＤ３１⁻ＨＳＣの何れかを注入した。注入から４０日後、ＲＮａｓｅフリー培地中でこれらのマウスの網膜を切開した（注入後のこの時点で網膜脈間構造及び光受容体層の救出は明らかである。）。各網膜からの４分の１をホールマウントにより分析し、正常なＨＳＣ標的化ならびに脈間構造及び神経保護が達成されていることを確認した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及びフェノール／クロロホルムＲＮＡ単離プロトコールを用いて、成功裡に注入された網膜からのＲＮＡを精製した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｕ７４Ａｖ２チップにＲＮＡをハイブリダイズさせ、ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ^（Ｒ）ソフトウェア（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて遺伝子発現を分析した。精製したヒト又はマウスＨＳＣをＰ６マウスに硝子体内注入した。ＲＮＡの精製及びヒト特異的Ｕ１３３Ａ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップへのハイブリダイゼーションのために、Ｐ４５において網膜を切開し、１）ヒトＨＳＣを注入した、救出マウス網膜、２）ヒトＨＳＣを注入した、非救出マウス網膜、３）マウスＨＳＣを注入した、救出マウス網膜の分画へとプールした。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ^（Ｒ）ソフトウェアを用いて、バックグラウンドを上回って発現され、ヒトＨＳＣ救出網膜においてより高く発現される遺伝子を同定した。次に、これらの遺伝子のそれぞれに対するプローブペア発現プロファイルを個々に分析し、ｄＣｈｉｐを用いて正常ヒトＵ１３３Ａマイクロアレイ実験のモデルと比較して、ヒト種特異的ハイブリダイゼーションを調べ、種間ハイブリダイゼーションによる偽陽性を除外した。

図２１は、ＣＤ１３３陽性（ＤＣ１３３^＋）及び本発明のＣＤ１３３陰性（ＣＤ１３３⁻）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団におけるＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の発現を比較する、フローサイトメトリーデータを示す。左パネルは、フローサイトメトリー分散プロットを示す。中央及び右パネルは、細胞集団における特異的抗体発現のレベルを示すヒストグラムである。Ｙ軸は事象数を表し、Ｘ軸はシグナルの強度を示す。外枠を付したヒストグラムは、非特異的バックグラウンド染色のレベルを示すアイソタイプＩｇＧ対照抗体である。黒のヒストグラムは、細胞集団における特異的抗体発現のレベルを示す。外枠（対照）ヒストグラムの右にシフトした黒のヒストグラムは、蛍光シグナル及び抗体の発現がバックグラウンドレベルを上回り向上したことを表す。２種類の細胞集団間で黒ヒストグラムの位置を比較することにより、細胞におけるタンパク質の相違が示される。例えば、本発明のＣＤ１３３^＋及びＣＤ１３３⁻細胞の両方においてバックグラウンドを上回ってＣＤ３１が発現されるが、しかし、ＣＤ１３３^＋細胞集団において、ＣＤ１３３⁻細胞集団おいてよりも、ＣＤ３１の発現レベルが低い細胞が多く存在する。このデータから、２種類の集団間でＣＤ３１発現が異なり、α６インテグリン発現がＬｉｎ⁻細胞集団中の細胞に大きく制限され、これを血管及び神経栄養救出機能を有する細胞のマーカーとして使用し得ることが明らかである。

ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣサブ集団を新生仔ＳＣＩＤマウスの眼に硝子体内注入した場合、ＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の両方を発現するＣＤ１３３陰性サブ集団に対して発生脈間構造への組み込みが最大になることが観察された（図２１、下参照。）。ＣＤ３１又はインテグリンα６を発現しないＣＤ１３３陽性サブ集団（図２１、上）は、周辺部虚血により起こる血管新生の部位を標的とすると思われるが、血管形成が起こっている眼に注入した場合はそうではない。

桿体又は錐体オプシンに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学により救出及び非救出網膜を分析した。図１７で示すＥＲＧ記録に対して使用した同じ眼を桿体又は錐体オプシンに対して分析した。野生型マウス網膜において、錐体は存在する光受容体の５％未満であり（Ｓｏｕｃｙら、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ ２１：４８１−４９３）、図２５（Ａ）で示されるような赤／緑錐体オプシン又は図２５（Ｂ）で示されるような桿体ロドプシンで観察される免疫組織化学染色パターンは、この錐体細胞の割合と一致した。桿体ロドプシンに特異的な抗体（ｒｈｏ４Ｄ２）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ ＣｏｌｕｍｂｉａのＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｌｄａｙにより提供され、既に述べられているように使用した（Ｈｉｃｋｓら、１９８６、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．４２：５５−７１）。錐体赤／緑オプシンに対して特異的なウサギ抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ＡＢ５４０５）より購入し、製造者の説明書に従い使用した。

酸素誘発性網膜変性に対するマウスモデルにおけるマウス細胞の硝子体内投与
酸素誘発性網膜変性（ＯＩＲ）モデルにおいて、出生後Ｐ７からＰ１２の間、新生仔野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスを酸素過剰状態（７５％酸素）に曝露した。図２２は、Ｐ０からＰ３０までの、Ｃ５７Ｂ１６マウスにおける正常な出生後血管発生を示す。Ｐ０において、視神経円板周辺で、生え始めた表面血管のみが観察できる。次の数日にわたり、一次表面ネットワークが周辺部へと拡大し、Ｐ１０日までに離れた周縁部に到達する。Ｐ７からＰ１２の間、二次（深部）叢が発生する。Ｐ１７までに、表面において血管が広範囲に広がり、血管の深部ネットワークが存在するようになる（図２２、差込図）。その後数日間、成体構造がおよそＰ２１に完成するまで、血管の三次（中間）層の発生に伴い再構築が起こる。

一方、ＯＩＲモデルにおいて、Ｐ７からＰ１２に７５％酸素に曝露した後、正常な一連の事象が著しく妨害される（図２３）。Ｐ３に、その後にＯＩＲを行なったマウスの眼において、本発明の成体マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を硝子体内注入し、もう一方の眼にＰＢＳ又はＣＤ３１陰性細胞を対照として注入した。図２４は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団が発生中のマウス網膜において高酸素レベルの変性的影響を阻み得ることを示す。処置した眼において、Ｐ１７に、完全に発生した表面及び深部網膜脈間構造が観察され、一方、対照の眼において、広い血管領域において実質的に深部血管がないことが分かった（図２４）。ＯＩＲモデルにおけるおよそ１００個のマウスの眼を観察した。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団で処置した眼の５８％において正常な血管形成が観察され、一方、ＣＤ３１⁻細胞で処置した対照眼では１２％、ＰＢＳで処置した対照眼では３％で観察された。

結果及び考察
マウス網膜血管発生；眼の血管形成に対するモデル
マウス眼は、ヒト網膜血管発生などの哺乳動物網膜血管発生の研究に対する認識されたモデルを与える。マウス網膜脈間構造の発生の間、虚血により起こる網膜血管は、星状細胞と密接に関連して発生する。これらのグリア要素は、視神経円板から神経節細胞層に沿って第三期ヒト胎児又は新生仔げっ歯類網膜に移動し、放射状に広がる。マウス網膜脈間構造が発生する際、内皮細胞は、この既に確立された星状細胞鋳型を利用して、網膜血管パターンを決定する（図１（ａ及びｂ）参照。）。図１（ａ及びｂ）は、発生中のマウス網膜の概略図を示す。パネル（ａ）は、星状細胞鋳型（淡色の線）上に重なる一次叢（図の左上の濃色の線）の発生を示し、一方（ｂ）は、網膜血管形成の二次相を示す。図１において、ＧＣＬは神経節細胞層を表し；ＩＰＬは内網状層を表し；ＩＮＬは内顆粒層を表し；ＯＰＬは外網状層を表し；ＯＮＬは外顆粒層を表し；ＲＰＥは網膜色素上皮を表し；ＯＮは視神経を表し；Ｐは周辺部を表す。出生時、網膜脈間構造は実質的にない。出生後１４日（Ｐ１４）までに、網膜は、視覚の開始と一致して、網膜血管の複雑な一次（表面）及び二次（深部）層を発達させる。最初、周辺へと既存の星状ネットワーク上にスポーク様周辺部血管が放射状に成長し、毛管網形成により徐々に相互に連結されるようになる。これらの血管は、Ｐ１０まで神経繊維内で単層として成長する（図１（ａ））。Ｐ７からＰ８の間に、側副枝がこの一次叢から発芽し、二次又は深部網膜叢を形成する外網状層へと網膜に浸透する。Ｐ２１までに、全体のネットワークで大規模な再構築及び内顆粒層の内面で三次又は中間叢形成が起こる。（図１（ｂ））。

新生マウス網膜血管形成モデルは、いくつかの理由から、眼の血管形成中のＨＳＣの役割の研究に対して有用である。この生理的関連モデルにおいて、内因性血管が現れる前に、大きな星状細胞鋳型が存在し、これにより、血管新生プロセス中の細胞−細胞標的化に対する役割を評価することができる。らに、この新生期の網膜血管の一貫した再現性のある新生仔網膜血管プロセスは低酸素により起こることが知られており、この点で、虚血が関与することが知られる多くの網膜疾患と類似点がある。

骨髄からの内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の濃縮
ＨＳＣの調製で見られるＥＰＣ集団において細胞表面マーカー発現が広く評価されているにもかかわらず、ＥＰＣをユニークに同定するマーカーは未だはっきりと定義されていない。ＥＰＣに対して濃縮を行うために、造血系統マーカー陽性細胞（Ｌｉｎ^＋）、つまりＢリンパ球（ＣＤ４５）、Ｔリンパ球（ＣＤ３）、顆粒球（Ｌｙ−６Ｇ）、単球（ＣＤ１１）及び赤血球（ＴＥＲ−１１９）をマウスの骨髄単核球細胞から除去した。Ｓｃａ−１抗原を使用して、ＥＰＣに対してさらに濃縮した。同数のＬｉｎ^＋Ｓｃａ−１細胞又はＬｉｎ⁻Ｓｃａ−１細胞の何れかの硝子体内注入後に得られた結果を比較した場合、２群間で差は検出されなかった。実際、Ｌｉｎ⁻Ｓｃａ−１細胞のみを注入した場合、発生中の血管への組み込みが非常に大きかったことが観察された。

機能アッセイに基づき、ＥＰＣを用いて本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を濃縮する。さらに、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ集団の挙動は機能的にＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団とは非常に異なる。各分画に対してＥＰＣを同定するために一般に使用されるエピトープ（既に報告されているインビトロの特徴を調べる研究に基づき）もまた評価した。これらのマーカーの中で、Ｌｉｎ⁻分画と独占的に関連するものがない一方、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ分画と比較して、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣにおいて全てが約７０から約１８００％上昇した（図１（ｃ））。図１、パネル（ｃ）は、骨髄由来Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ及びＬｉｎ⁻ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーの特徴を示す。パネル（ｃ）の上段は、非抗体標識細胞の造血幹細胞ドットプロット分布を示す。Ｒ１は、陽性ＰＥ染色の定量可能なゲート領域を定義し；Ｒ２はＧＦＰ陽性を指す。中段においてＬｉｎ⁻ＨＳＣのドットプロットを示し、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣのドットプロットは下段で示す。Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ結合抗体でＣ５７Ｂ／６細胞を標識した。Ｔｉｅ−２−ＧＦＰマウスからＴｉｅ−２データを得た。ドットプロットに関する％は、総Ｌｉｎ⁻又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ集団からの陽性標識％を指す。興味深いことに、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２及びＳｃａ−１のような許容されているＥＰＣマーカーの発現は乏しく、したがって、さらなる分画化に使用しなかった。.
硝子体内注入したＨＳＣ Ｌｉｎ⁻細胞は、星状細胞を標的とし発生中の網膜脈間構造に組み込まれるＥＰＣを含有する。星状細胞鋳型を利用し、網膜の血管形成に関与する、硝子体内注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣが網膜の特異的な細胞型を標的化し得るか否かを調べるために、成体（ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニック）マウスの骨髄から単離した、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からのおよそ１０^５個の細胞又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（対照、約１０^５個細胞）を出生後２日（Ｐ２）のマウスの眼に注入した。注入から４日後（Ｐ６）、ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニックマウス由来の本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からの多くの細胞が網膜に接着し、内皮細胞の特徴的な細長い外観を有していた（図２（ａ））。図２は、発生中のマウス網膜へのＬｉｎ⁻細胞の移植を示す。図２、パネル（ａ）で示されるように、注入４日後（Ｐ６）に、硝子体内注入したｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが網膜において接着し、分化する。

網膜の多くの領域において、ＧＦＰ発現細胞は、その下にある星状細胞に適合し、血管に類似したパターンに配置された。れらの蛍光細胞は、内因性の発生する血管ネットワークの先端で観察された（図２（ｂ））。逆に、網膜表面に接着するのは、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（図２（ｃ））又は成体マウス腸間膜内皮細胞（図２（ｄ））のうち少数のみであった。注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団からの細胞も既に確立された血管とともに網膜に接着することができるか否かを調べるために、発明者らはＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を成体の眼に注入した。興味深いことに、網膜に接着する又は確立された正常網膜血管に組み込まれる細胞は観察されなかった（図２（ｅ））。これは、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が正常に発生した脈間構造を妨害せず、正常に発生した網膜において異常な血管形成を開始させないことを示す。

本発明の注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物と網膜星状細胞との間の関係を調べるために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状細胞のマーカー）及びプロモーターにより駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスからのＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入したこれらのＧＦＡＰ-ＧＦＰトランスジェニックマウス網膜の実験から、注入されたｅＧＦＰ ＥＰＣ及び存在する星状細胞の共局在が示された（図２（ｆ−ｈ）、矢印）。ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが内在する星状細胞ネットワークに適合するためのプロセスを観察した（矢印、図２（ｇ））。これらの眼の試験から、注入された標識細胞のみが星状細胞に接着し；Ｐ６マウス網膜で（網膜周囲が内因性血管をまだ持たない。）、これらのまだ血管形成されていない領域において、注入細胞が星状細胞に付着するのが観察された。驚くべきことに、正常な網膜血管が後に発生するであろう正確な位置で、網膜のより深部の層において注入標識細胞が観察された（図２（ｉ）、矢印）。

本発明の注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが安定して発生中の網膜脈間構造に組み込まれるか否かを調べるために、後期のいくつかの時点で網膜血管を調べた。Ｐ９という早い時期（注入から７日後）に、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣがＣＤ３１^＋構造に組み込まれた（図２（ｊ））。Ｐ１６（注入から１４日後）までに、網膜血管様構造に細胞が広範囲に既に取り込まれた（図２（ｋ））。動物を屠殺する前にローダミン−デキストランを血管内注入した場合（機能的網膜血管を同定するために。）、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの大部分が開存血管に沿って並んでいた（図２（ｌ））。標識した細胞分布の２つのパターンを観察した：（１）１つのパターンにおいて、非標識内皮細胞間で血管に沿って細胞が散在し；及び（２）もう一方のパターンは、血管が完全に標識細胞からなることを示した。注入された細胞はまた、深部血管叢の血管にも組み込まれた（図２（ｍ））。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ−由来ＥＰＣが新生血管系へ散発的に組み込みまれることは既に報告されているが、一方、これらの細胞から血管ネットワークが完全に構成されるということについてはこれが最初の報告である。これは、硝子体内に注入される本発明の骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの集団からの細胞が、形成中の網膜血管叢の層何れにも効率的に組み込まれ得ることを示す。

非網膜組織の組織学的試験（例えば、脳、肝臓、心臓、肺、骨髄）から、硝子体内注入後５又は１０日以下で試験した場合、ＧＦＰ陽性細胞の存在は示されなかった。これは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ分画内の細胞のサブ集団が選択的に網膜星状細胞を標的とし、発生中の網膜脈間構造に安定的に組み込まれることを示唆する。これらの細胞は内皮細胞の多くの特徴を有するので（網膜星状細胞との関連、細長い形態、開存血管への安定な組み込み及び血管外の位置に存在しないこと）、これらの細胞は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団中に存在するＥＰＣを表す。標的とされた星状細胞は、多くの低酸素網膜症で観察される同じタイプのものである。グリア細胞が、ＤＲ及び網膜損傷の他の形態で観察される新生血管葉の主要な成分であることは周知である。ヒトを含む多くの哺乳動物種で新生仔網膜血管鋳型形成中に観察されるのと同様に、グリオーシス及び虚血により誘発される血管新生の状態下で、活性化星状細胞の増殖によりサイトカインが産生されＧＦＡＰが上方制御される。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、新生仔の眼で起こるように、成体マウスの眼において活性化星状細胞を標的とし、網膜に光凝固（図３（ａ））又は注射針による（図３（ｂ））損傷がある成体の眼にＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が注入された。両モデルにおいて、ＧＦＡＰの顕著な染色がある細胞の集団は損傷部位の周囲のみで観察された（図３（ａ及びｂ））。注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からの細胞は損傷部位に局在し、ＧＦＡＰ−陽性星状細胞と特異的に結合したままであった（図３（ａ及びｂ））。これらの部位で、深部網膜脈間構造の新生仔での形成の際に観察されるレベルと同様のレベルでＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が網膜のより深い層に移動することもまた観察された。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を含有しない網膜の非損傷部分は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを正常な非損傷成体網膜に注入した場合に観察されるものと同一であった（図２（ｅ））。これらのデータから、グリオーシスに罹患した損傷成体網膜ならびに血管形成が行われている新生仔網膜において、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が選択的に活性化グリア細胞を標的とすることが示される。

硝子体内注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、変性脈間構造を救出及び安定化することができる。

硝子体内注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物は星状細胞を標的とし、正常網膜脈間構造に組み込まれるので、これらの細胞はまた、グリオーシス及び血管変性が関与する、虚血性もしくは変性網膜疾患において、変性脈間構造を安定化する。ｒｄ／ｒｄマウスは、生後１カ月までに光受容体及び網膜血管層の完全な変性を示す網膜変性に対するモデルである。これらのマウスにおける網膜脈間構造は、より深部の血管叢が退行するＰ１６まで正常に発生する；殆どのマウスにおいて、深部及び中間叢がＰ３０までに完全に変性した。

ＨＳＣが退行血管を救出できるか否かを調べるために、Ｌｉｎ^＋又はＬｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｃマウスより）をＰ６でｒｄ／ｒｄマウス硝子体内に注入した。Ｌｉｎ^＋細胞注入後、Ｐ３３までに、最深部網膜層の血管がほぼ完全に消失した（図４（Ａ及びＢ））。一方、Ｐ３３までの殆どのＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜の網膜脈間構造はほぼ正常であり、３層の平行な、よく形成された血管層があった（図４（ａ及びｄ））。この効果を定量したところ、Ｌｉｎ⁻注入ｒｄ／ｒｄ眼の深部血管叢の平均血管長が、非処置又はＬｉｎ^＋細胞で処置した眼よりもほぼ３倍長かった（図４（ｅ））。驚くべきことに、ｒｄ／ｒｄ成体マウス（ＦＶＢ／Ｎ）骨髄由来のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物の注入によってもまた、変性ｒｄ／ｒｄ新生仔マウス網膜脈間構造が救出される（図４（ｆ））。ｒｄ／ｒｄマウスの眼における脈間構造の変性は、生後２−３週という早期に観察される。Ｐ１５という遅いＬｉｎ⁻ＨＳＣの注入によってもまた、少なくとも１カ月間、ｒｄ／ｒｄマウスにおける変性血管が部分的に安定化された（図４（ｇ及びｈ））。

より幼若な（例えばＰ２）ｒｄ／ｒｄマウスに注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物もまた、発生中の表面脈間構造に組み込まれた。Ｐ１１までに、これらの細胞が深部血管叢のレベルに移動し、野生型の網膜外側の血管層で観察されるものと同一のパターンを形成することが観察された（図５（ａ））。注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からの細胞がｒｄ／ｒｄマウスにおいて変性網膜脈間構造に取り込まれ、安定化する様式をより明らかに説明するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物をＴｉｅ−２−ＧＦＰ ＦＶＢマウスの眼に注入した。ＦＶＢマウスはｒｄ／ｒｄ遺伝子型を有し、これらは融合タンパク質Ｔｉｅ−２−ＧＦＰを発現するので、内因性血管は全て蛍光を発する。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からの非標識細胞を新生仔Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ ＦＶＢ眼に注入し、それが続いて発生中の脈間構造に取り込まれる場合、注入され、組み込まれた非標識Ｌｉｎ⁻ＨＳＣに対応する内因性のＴｉｅ−２−ＧＦＰ標識血管において非標識の間隙があるはずである。次いで、別の血管マーカー（例えばＣＤ−３１）を用いたその後の染色で血管全体の輪郭を描くことにより、非内因性内皮細胞が脈間構造の一部であるか否かについて調べることができる。注入から２カ月後、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を注入した眼の網膜においてＣＤ３１−陽性のＴｉｅ−２−ＧＦＰ陰性血管を観察した（図５（ｂ））。興味深いことに、救出された血管の大部分がＴｉｅ−２−ＧＦＰ陽性細胞を含有していた（図５（ｃ））。平滑筋アクチンに対する染色により調べたところ、血管救出の有無にかかわらず、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入によって周皮細胞の分布は変化しなかった（図５（ｄ））。これらのデータから、本発明の硝子体内注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が網膜に移動し、正常網膜血管の形成に寄与し、遺伝的欠陥のあるマウスにおいて内因性の変性脈間構造を安定化させることがはっきりと示される。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣからのトランスフェクション細胞による網膜血管形成の抑制
網膜血管疾患の殆どは、変性よりむしろ異常な血管増殖を伴う。星状細胞を標的とするトランスジェニック細胞を使用して、抗血管形成タンパク質を送達し、血管形成を抑制することができる。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からの細胞に対してＴ２−トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼをトランスフェクションした（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）。Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、網膜血管形成を強く抑制するＴｒｐＲＳの４３ｋＤ断片である。（図６（ａ））。Ｐ１２において、対照プラスミドをトランスフェクションしたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ遺伝子なし）をＰ２に注入された眼の網膜は、正常な一次（図６（ｃ））及び二次（図６（ｄ））網膜血管叢を有した。Ｔ２−ＴｒｐＲＳをトランスフェクションされた本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物をＰ２の眼に注入し、１０日後に評価した場合、一次ネットワークは顕著に異常性を示し（図６（ｅ））、深部網膜脈間構造の形成がほぼ完全に抑制された（図６（ｆ））。これらの眼で観察された数個の血管は、血管間に大きな間隙を伴い顕著に減衰していた。Ｔ２−ＴｒｐＲＳ分泌Ｌｉｎ⁻ＨＳＣによる抑制の程度を表２で詳細に記す。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物における細胞によりインビトロでＴ２−ＴｒｐＲＳが産生及び分泌されるが、これらのトランスフェクション細胞を硝子体へ注入した後、網膜においてＴ２−ＴｒｐＲＳの３０ｋＤ断片（図６（ｂ））が観察された。この３０ｋＤ断片は、トランスフェクションされた本発明のＬｉｎ−ＨＳＣを注入された網膜においてのみ特異的に観察され、組み換え又はインビトロ合成タンパク質と比較して見かけの分子量が低下していることは、インビボでのＴ２−ＴｒｐＲＳのプロセシング又は分解によるものであり得る。これらのデータから、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を使用して、活性化星状細胞を標的とすることによって血管新生抑制分子を発現する遺伝子などの機能的活性遺伝子を網膜脈間構造に送達することができることが示される。観察される血管新生抑制効果が細胞を介した活性によるものである可能性がある一方、同一であるがＴ２のトランスフェクションが行われていないＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物によって処置した眼が正常な網膜脈間構造を有していることから、この可能性は非常に低い。

網膜星状細胞に局在する硝子体内注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は血管に取り込まれ、多くの網膜疾患を治療するのに有用であり得る。注入されたＨＳＣ組成物からの殆どの細胞が星状細胞鋳型に接着する一方、少数は網膜の深部へと移動し、深部血管ネットワークが後に発生するであろう領域に行く。出生後４２日前にはこの領域でＧＦＡＰ−陽性星状細胞が観察されなかったとしても、ＧＦＡＰ陰性グリア細胞が既に存在し、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ局在に対するシグナルを与える可能性がないわけではない。以前の研究から、多くの疾患が反応性グリオーシスに関与することが示されている。ＤＲにおいて、特に、グリア細胞及びそれらの細胞外マトリックスが病的な血管形成に関与する。

注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物からの細胞はＧＦＡＰ発現グリア細胞に特異的に付着するので、損傷の種類にかかわらず、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を用いて、網膜における血管形成前の障害を標的とすることができる。例えば、糖尿病などの虚血性網膜症において、血管新生は低酸素に対する応答である。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を病的な血管新生の部位に向けることにより、発生中の新生血管系を安定化して、出血又は浮腫などの新生血管系の異常（ＤＲに伴う視覚喪失の原因）を防ぎ、元来血管新生を刺激していた低酸素が緩和される可能性がある。異常な血管を正常な状態に回復させることができる。さらに、トランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物及びレーザーにより誘発される星状細胞の活性化により、病的血管形成の部位にＴ２−ＴｒｐＲＳなどの血管新生抑制タンパク質を送達することができる。レーザー光凝固は眼科の臨床で一般に使用されているので、このアプローチは、多くの網膜疾患に対して応用性がある。このような細胞を利用したアプローチが癌の治療において探索されてきたが、眼内注入により多数の細胞を直接疾患部位に送達することができるようになるため、眼の疾患に対するそれらの使用はより有用性が高い。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣによる神経栄養及び血管栄養性救出
ＭＡＣＳを使用して、上述のように、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、Ｃ３Ｈ（ｒｄ／ｒｄ）、ＦＶＢ（ｒｄ／ｒｄ）マウスの骨髄からＬｉｎ⁻ＨＳＣを分離した。これらのマウスからのＥＰＣを含有するＬｉｎ⁻ＨＳＣをＰ６ Ｃ３Ｈ又はＦＶＢマウス眼に硝子体内注入した。注入後、様々な時点で網膜を回収した（１カ月、２カ月及び６カ月）。ＣＤ３１に対する抗体により染色した後、走査型レーザー共焦点顕微鏡により、脈間構造を分析し、ＤＡＰＩによる核染色後網膜の組織学を行った。様々な時点における網膜からのｍＲＮＡのマイクロアレイ遺伝子発現分析を使用して、また、この影響に関与する可能性のある遺伝子を同定した。

ｒｄ／ｒｄマウスの眼は、Ｐ２１までに、感覚神経網膜及び網膜脈間構造の両方が深刻に変性する。Ｐ６にＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼は、６カ月もの長い間正常な網膜脈間構造を維持し；全ての時点（１Ｍ、２Ｍ及び６Ｍ）において、対照と比較して、深部及び中間層の両方が顕著に改善した（図１２参照。）。さらに、発明者らは、対照としてＬｉｎ^＋ＨＳＣで処置した眼と比較して、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処置した網膜はまた厚く（１Ｍ；１．２倍、２Ｍ；１．３倍、６Ｍ；１．４倍）、外顆粒層にはより多くの細胞が存在する（１Ｍ；２．２倍、２Ｍ；３．７倍、６Ｍ；５．７倍）ことを観察した。対照（非処置又は非Ｌｉｎ⁻処置）ｒｄ／ｒｄ網膜と比較した「救出された」（例えばＬｉｎ⁻ＨＳＣ）ｒｄ／ｒｄ網膜の大規模ゲノム解析により、ｓＨＳＰ（小分子熱ショックタンパク質）及び、図２０のパネルＡ及びＢに挙げるタンパク質をコードする遺伝子を含む、血管及び神経救出と相関した特異的な成長因子をコードする遺伝子が顕著に上方制御されることが分かった。

本発明の骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、顕著かつ再現性を持って、正常な脈間構造の維持を誘導し、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて光受容体及びその他の神経細胞層を顕著に増加させた。この神経栄養救出効果は、小分子熱ショックタンパク質及び成長因子の顕著な上方制御と相関し、現在治療できない網膜変性疾患に対する治療的アプローチへの手がかりを与える。

ｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜は、激しい血管及びニュ―ロン変性を示す。

マウスにおける正常出生後網膜血管及びニューロン発生はよく分かっており、第三期ヒト胎児で観察される変化と同様である（Ｄｏｒｒｅｌｌら、２００２、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｏｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｌ．４３：３５００−３５１０）。ｒｄ１遺伝子に対するマウスホモ接合体はヒト網膜変性と共通する多くの特徴があり（Ｆｒａｓｓｏｎら、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１１８３−１１８７）、ＰＲ ｃＧＭＰホスホジエステラーゼをコードする遺伝子における突然変異の結果として、重篤な血管萎縮に伴う急速な光受容体（ＰＲ）損失を示す（Ｂｏｗｅｓら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４７：６７７−６８０）。網膜発生中の脈間構造及びその後の変性を調べるために、コラゲナーゼＩＶ（ＣＩＶ）、成熟脈間構造の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質及びＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）に対する抗体（内皮細胞に対するマーカー）を使用した（図１５）。ｒｄ１／ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）の網膜は、光受容体含有外顆粒層（ＯＮＬ）の変性が始まる出生後およそ（Ｐ）８まで正常に発生した。ＯＮＬは急速に変性し、細胞はアポトーシスにより死に、Ｐ２０までに１層の核が残るのみとなった。ホールマウント網膜をＣＩＶ及びＣＤ３１の両方に対する抗体で二重染色することにより、その他の研究者により述べられているものと同様にｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける血管変性の詳細が明らかとなった（Ｂｌａｎｋｓら、１９８６、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５４：５４３−５５３）。一次及び深部網膜血管層は、Ｐ１２まで正常に発生し、その後、ＣＤ３１染色がないことにより分かるによう、内皮細胞の急速な損失が起こると思われた。Ｐ１２まで、正常な分布においてＣＤ３１陽性内皮細胞が存在したが、その後急速に消失した。興味深いことに、ＣＩＶ陽性染色は試験した全時点で存在し続け、このことから、血管及び関連するＥＣＭが正常に形成されることが示唆されるが、ＣＤ３１陽性細胞が観察されなくなるＰ１３後はマトリックスのみが残る（図１５、中央パネル）。中間血管叢もまた、Ｐ２１後に変性するが、進行は深部叢で観察されるものよりも遅い（図１５、上パネル）。ｒｄ１／ｒｄ１マウスと比較するために、正常マウスの網膜血管及び神経細胞層を示す（右パネル、図１５）。

ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの神経保護効果
硝子体内注入Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、３種類の血管叢全てにおいて内因性網膜脈間構造に取り込まれ、血管が変性するのを防ぐ。興味深いことに、注入された細胞は実際に外顆粒層で観察されない。これらの細胞は、形成中の網膜血管に組み込まれるか、又はこれらの血管の近接近で観察されるかのいずれかである。マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪより。）を、変性の開始直前、Ｐ６でＣ３Ｈ／ＨｅＪ（ｒｄ１／ｒｄ１）マウス眼に硝子体内注入した。Ｐ３０までに、対照細胞（ＣＤ３１⁻）注入した眼は典型的なｒｄ１／ｒｄ１表現型を示し、つまり、試験した網膜全てにおいて、深部血管叢及びＯＮＬのほぼ完全な変性が観察された。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼は、正常な外観の中間及び深部血管叢を維持した。驚くべきことに、対照細胞を注入した眼においてよりも、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入眼の細胞核間層（ＩＮＬ）及びＯＮＬにおいて、顕著により多くの細胞が観察された（図１６（Ａ））。２カ月において（図１６（Ｂ））、及び注入後６カ月の間（図１６（Ｃ））、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのこの救出効果を観察することができた。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入した眼の中間及び深部叢の脈間構造ならびにニューロン細胞含有ＩＮＬ及びＯＮＬの差は、救出及び非救出眼を比較した場合、全ての時点で有意であった（図１６（Ｂ及びＣ））。脈間構造の全長を測定し（図１６（Ｄ））、ＯＮＬにおいて観察されたＤＡＰＩ陽性細胞核の数を数える（図１６（Ｅ））ことにより、この影響を定量した。全時点で単純線形回帰分析をデータに適用した。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入眼（図１６（Ｆ））において、Ｐ３０（ｐ＜０．０２４）及びＰ６０（ｐ＜０．０３４）で、血管救出とニューロン（例えばＯＮＬの厚さ）救出との間で、統計的に有意な相関が観察された。対照細胞注入網膜とＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜を比較した場合、Ｐ１８０において統計学的に有意ではないが（ｐ＜０．１４）、相関性は高いままであった（図１６（Ｆ））。一方、対照細胞注入網膜は、何れの時点でも脈間構造とＯＮＬとの保存の間で有意な相関関係を示さなかった（図１６（Ｆ））。これらのデータから、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜において、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの硝子体内注入の結果、付随する網膜血管及びニューロン救出が起こることが示された。ＯＮＬ又は網膜血管内もしくはその近接近以外の場所では注入細胞は観察されなかった。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入ｒｄ／ｒｄ網膜の機能的救出
対照細胞又はマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣの注入から２カ月後、マウスにおいて網膜電図（ＥＲＧ）を行った（図１７）。ＥＲＧ記録後各眼を用いて免疫組織化学的分析及び顕微鏡分析を行い、血管及びニューロン救出が起こったことを確認した。処置、救出及び対照、非救出の眼からの代表的なＥＲＧ記録から、救出された眼において、デジタル処理で差し引かれたシグナル（処置−非処置の眼）が、８−１０マイクロボルトのオーダーの振幅で明らかに検出可能なシグナルを生じたことが示された（図１７）。明らかに、両方の眼からのシグナルは非常に異常である。しかし、一致し、かつ検出可能なＥＲＧがＬｉｎ⁻ＨＳＣ処置した眼から記録可能であった。全ての場合において、対照眼からのＥＲＧは検出可能でなかった。救出された眼におけるシグナルの振幅が正常より著しく低かった一方、組織学的救出があり、それがその他の遺伝子を利用した救出実験により報告されているものの大きさであった場合は必ず、シグナルは一貫して観察された。全体的なこれらの結果は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置された眼においてある程度の機能的救出があることの証明である。

救出されたｒｄ／ｒｄ網膜細胞タイプは主に錐体である。桿体及び錐体オプシンに対して特異的な抗体を用いて、救出された、及び非救出の網膜を免疫組織化学的に分析した。桿体及び錐体オプシンに対して、図１７で示されるＥＲＧ記録に使用した同じ眼を分析した。野生型マウス網膜において、存在する光受容体の約５％未満が錐体であり（Ｓｏｕｃｙら １９９８、Ｎｅｕｒｏｎ ２１：４８１−４９３）、図２５（Ａ）において示されるような赤／緑錐体オプシン又は図２５（Ｂ）において示されるような桿体ロドプシンを用いて観察される免疫組織化学染色パターンは、錐体細胞のこの割合と一致した。野生型網膜を免疫前ＩｇＧで染色した場合、血管の自己蛍光以外は感覚神経網膜のどこでも染色は観察されなかった（図２５（Ｃ））。出生から２カ月後、非注入ｒｄ／ｒｄマウスの網膜の外顆粒層は、基本的に萎縮性であり、赤緑錐体オプシン（図２５（ｄ））又はロドプシン（図２５（Ｇ））に対する抗体で全く染色が示されなかった。対照、ＣＤ３１−ＨＳＣを注入した眼も、錐体（図２５（Ｅ））又は桿体（図２５（Ｈ））オプシンの存在に対して陽性染色されなかった。一方、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入された逆側の眼は、保存された外顆粒層において約３から約８列の核があった；これらの細胞の殆どが錐体オプシンに対して陽性であり（図２５（Ｆ））、桿体オプシンに対しておよそ１−３％陽性であった（図２５（Ｉ））。顕著に、これは、桿体が主体である正常なマウス網膜で普通観察されるものの殆ど逆である。これらのデータから、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの注入により、普通は変性する長期間にわたり、錐体が保存されることが示される。

ヒト骨髄（ｈＢＭ）由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣもまた変性網膜を救出する。

ヒト骨髄から単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣと同様の挙動を示す。ヒトドナーから骨髄を回収し、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣを除去し、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｈＬｉｎ⁻ＨＳＣ）集団を得た。蛍光色素を用いてこれらの細胞をエクスビボで標識し、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウスの眼に注入した。注入されたｈＬｉｎ⁻ＨＳＣは、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した場合に観察されるのと同一の様式で網膜血管形成部位に移動し、これを標的とした（図１８（Ａ））。血管標的化に加えて、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣはまた、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの血管及び神経細胞層の両方で強力な救出効果を与えた（図１８（Ｂ及びＣ））。この観察から、ヒト骨髄において、網膜脈間構造を標的とし網膜変性を防ぐことができる細胞の存在が確認される。

ｒｄ１０／ｒｄ１０マウスにおいて、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、血管及び神経栄養効果を有する。ｒｄ１／ｒｄ１マウスが最も広く使用され、網膜変性に対して特徴が最もよく知られたモデルである一方（Ｃｈａｎｇら、２００２、Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．４２：５１７−５２５）、変性は非常に急速であり、この点でヒト疾患で観察される通常のより遅いタイムコースとは異なる。この系統において、光受容体細胞変性はＰ８前後で開始するが、これは網膜脈間構造がまだ急速に広がっている時期である（図１５）。中間叢がまだ形成中である間も、深部網膜脈間構造の続発性の変性が起こり、したがって、この疾患の殆どのヒトで観察されるものとは異なり、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜は完全に発生することはない。変性のタイムコースがより遅く、ヒト網膜変性状態により類似するｒｄ１０マウスモデルを使用して、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが介在する血管救出を調べた。ｒｄ１０マウスにおいて、光受容体細胞変性はＰ２１前後で始まり、血管変性はその少し後に始まる。

正常な感覚神経網膜発生はＰ２１までにほぼ完成され、網膜が完全に分化した後に変性が始まることが観察され、このように、ｒｄ１／ｒｄ１マウスモデルよりもヒト網膜変性に類似している。ｒｄ１０マウスからのＬｉｎ⁻ＨＳＣ又は対照細胞をＰ６の眼に注入し、様々な時点で網膜を評価した。Ｐ２１において、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ及び対照細胞注入の眼の両方からの網膜は全血管層が完全に発生し、ＩＮＬ及びＯＮＬが正常に発生しており、正常と思われた。（図１８（Ｄ及びＨ））。Ｐ２１前後において、網膜変性が始まり、齢とともに進行した。Ｐ３０までに、対照細胞注入網膜は重度の血管及びニューロン変性を示し（図１８（Ｉ））、一方でＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜は、ほぼ正常な血管層及び光受容体細胞を維持した（図１８（Ｅ））。救出された眼と非救出の眼との間の差は、後期の時点であるほどより顕著であった（図１８（Ｆ及びＧ）と１８（Ｊ及びＫ）を比較。）。対照処置した眼において、ＣＤ３１及びコラゲナーゼＩＶに対する免疫組織化学染色により、血管変性の進行が非常に明らかに観察された（図１８（Ｉ−Ｋ））。対照処置した眼は、ＣＤ３１に対してほぼ完全に陰性であり、一方、コラーゲンＩＶ陽性血管「痕跡」は依然として明らかであり、このことから、不完全な血管形成というよりむしろ血管退行が起こったことが示唆された。一方、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置した眼は、正常の野生型の眼と非常に類似して見える、ＣＤ３１及びコラーゲンＩＶ陽性血管の両方があった（図１８（Ｆ及びＩ）を比較）。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置後のｒｄ／ｒｄマウス網膜の遺伝子発現分析
大規模ゲノミクス（マイクロアレイ分析）を使用して、神経栄養性救出の推定されるメディエーターを同定するために、救出及び非救出網膜を分析した。非注入網膜ならびに対照細胞（ＣＤ３１⁻）を注入した網膜と、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置したｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜における遺伝子発現を比較した。トリプリケートでこれらの比較それぞれを行った。存在を考慮すると、３回のトリプリケート実験の全てにおいてバックグラウンドレベルよりも少なくとも２倍高い発現レベルを遺伝子が有することが必要である。対照細胞注入及び非注入ｒｄ／ｒｄマウス網膜と比較してＬｉｎ⁻ＨＳＣ保護網膜において３倍上方制御された遺伝子を図２０、パネルＡ及びＢで示す。各ｃＲＮＡレプリケートの平均発現レベルで標準偏差を割ることにより、発現された遺伝子に対して変動係数（ＣＯＶ）レベルを計算した。さらに、平均及び標準偏差（ＳＤ）を相互に関係付けることにより、発現レベルと雑音分散との間の相関関係を計算した。各遺伝子に対する遺伝子発現レベルと標準偏差との間の相関関係を得て、これにより、バックグラウンドレベル及び信頼性のある発現レベル閾値を決定できる。総じて、データは許容可能な限界内によく収まった（Ｔｕら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４０３１−１４０３６）。以下で個々に考察される遺伝子は、これらの臨界的な発現レベルを上回る発現レベルを示した。考察される遺伝子に対する対応のある「ｔ検定」の値も表１で与える。各場合において、ｐ値は相応なものであり（０．０５付近又は以下）、このことから、異なる試験群間でのレプリケートと可能性のある有意差との間に類似性があることが示される。ＭＡＤ及びＹｉｎｇ Ｙａｎｇ−１（ＹＹ−１）（Ａｕｓｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２４：１２３−１３０）を含む顕著に上方制御される遺伝子の多くは、アポトーシスからの細胞の保護と関連する機能を有するタンパク質をコードする。ストレスから細胞を保護することに関与する公知の熱ショックタンパク質に対して配列ホモロジー及び類似の機能を有する多くのクリスタリン遺伝子もまた、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置により上方制御された。免疫組織化学分析によると、α−クリスタリンの発現はＯＮＬに局在していた（図１９）。図１９は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置後、救出された外顆粒層細胞においてクリスタリンαＡが上方制御されるが、対照細胞で処置した逆側の眼では上方制御されないことを示す。左パネルは、救出された網膜におけるＩｇＧ染色（対照）を示す。中央のパネルは、救出された網膜におけるクリスタリンαＡを示す。右パネルは、非救出網膜におけるクリスタリンαＡを示す。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣにより救出されたｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜からのメッセンジャーＲＮＡをヒト特異的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａマイクロアレイチップにハイブリダイズさせた。ストリンジェントな分析後、ｍＲＮＡ発現がヒト特異的であり、バックグラウンドを上回り、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ救出網膜において、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ救出網膜及びヒト対照細胞注入非救出網膜と比較して顕著に高い、多くの遺伝子が見出された（図２０、パネルＣ）。幼若及び新しく分化したＣＤ３４^＋造血幹細胞の表面で発現される細胞接着分子であるＣＤ６及び、造血幹細胞により発現される別の遺伝子であるインターフェロンα１３の両方が、マイクロアレイバイオインフォマティクス技術により見出され、評価プロトコールの正当性が確認された。さらに、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ救出マウス網膜試料により、バックグラウンドを上回り、いくつかの成長因子及び神経栄養因子が発現された（図２０、パネルＤ）。

系統が決まっている造血細胞に対するマーカーを使用して、ＥＰＣを含有する骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの集団をネガティブ選択した。ＥＰＣとして機能し得る骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのサブ集団の特徴が、一般に使用される細胞表面マーカーによって分からない一方、発生中又は損傷のある網膜脈間構造におけるこれらの細胞の挙動は、Ｌｉｎ^＋又は成体内皮細胞集団に対して観察されるものと完全に異なっている。これらの細胞は選択的に、網膜血管形成の部位を標的とし、開存血管の形成に寄与する。

遺伝性網膜変性疾患には網膜脈間構造の喪失が伴うことが多い。このような疾患の効果的な治療には、機能の回復ならびに複雑な組織構造の維持が必要である。いくつかの最近の研究により細胞を利用した栄養因子の送達又は幹細胞そのものの使用が探索されてきた一方で、両者のある組み合わせが必要であり得る。例えば、網膜変性疾患を治療するための成長因子療法の使用の結果、制御されない血管の過剰成長が起こり、その結果、正常網膜組織構造の重大な破壊が起こる。網膜変性疾患を治療するために神経又は網膜幹細胞を使用することによりニューロン機能が再構成され得るが、機能的な脈間構造にはまた、網膜機能の完全性を維持することも必要とされる。ｒｄ／ｒｄマウスの網膜血管への本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣからの細胞の組み込みにより、網膜構造を破壊することなく変性脈間構造が安定化された。この救出効果はまた、Ｐ１５のｒｄ／ｒｄマウスに細胞を注入した場合にも観察された。ｒｄ／ｒｄマウスにおいて血管変性がＰ１６から始まるので、この観察により効果的なＬｉｎ⁻ＨＳＣ治療に対する治療域が広がる。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼において、網膜ニューロン及び光受容体が保存され、視覚機能が維持される。成体骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、網膜変性疾患のマウスに硝子体内注入された場合、著しい血管及び神経栄養効果を発揮する。この救出効果は、処置後６カ月まで持続し、完全な網膜変性前（通常、出生後３０日までに完全な網膜変性を示すマウスにおいて出生後１６日まで）にＬｉｎ⁻ＨＳＣが注入された場合に最も効果的である。この救出は網膜変性の２種類のマウスモデルにおいて観察され、注目すべきことに、レシピエントが網膜変性のある免疫不全げっ歯類（例えばＳＣＩＤマウス）である場合、及びドナーが網膜変性のあるマウスである場合、成人ヒト骨髄由来ＨＳＣを用いて遂行することができる。いくつかの最近の報告が、ウイルスを利用した野生型遺伝子による遺伝子救出後の、網膜変性のあるマウス又はイヌにおける表現型救出を記載している一方（Ａｌｉら、２０００、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５：３０６-３１０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２−７８１６；Ａｃｌａｎｄら２００１、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２−９５）、本発明は、血管救出により達成される、包括的な細胞を利用した最初の治療効果である。したがって、１００を超える公知の関連突然変異を伴う疾患群（例えば網膜色素変性）の治療におけるこのようなアプローチの潜在的有用性は、各公知の突然変異を処置するために個々の遺伝子治療を作るよりも実際的である。

神経栄養救出効果の正確な分子的機序は分かっていないが、この効果は同時に血管安定化／救出があるときのみ観察される。注入幹細胞の存在それ自身は神経栄養救出を行うのに十分ではなく、外顆粒層において幹細胞由来ニューロンがないことが明確であることから、注入細胞が光受容体に形質転換される可能性は除外される。マイクロアレイ遺伝子発現分析により得られるデータから、抗アポトーシス効果を有することが知られている遺伝子が顕著に上方制御されることが示された。網膜変性において観察される殆どのニューロン死がアポトーシスによるものであるため、このような保護は光受容体及びこれらの疾患における視覚機能に重要なその他のニューロンの寿命を延長するのに治療上非常に有用であり得る。ｃ−ｍｙｃは、様々な下流アポトーシス誘発因子を上方制御することによりアポトーシスに寄与する転写因子である。野生型を上回り、ｒｄ／ｒｄマウスにおいてＣ−ｍｙｃ発現が４．５倍増加したが、このことから、ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおいて観察される光受容体変性へ関与する可能性があることが示唆される。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ保護網膜において劇的に上方制御される２種類の遺伝子、Ｍａｄ１及びＹＹ−１（図２０、パネルＡ）は、ｃ−ｍｙｃの活性を抑制することが知られており、従って、ｃ−ｍｙｃ誘発性アポトーシスを抑制する。Ｍａｄ１の過剰発現が、アポトーシス経路の別の重要な成分であるカスパーゼ−８のＦａｓ誘発性活性化を抑制することも示されている。これらの２種類の分子の上方制御は、通常ｒｄ／ｒｄマウスにおいて変性に導くアポトーシスの開始を防ぐことにより、血管及び神経変性から網膜を保護することに寄与し得る。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ保護網膜において大きく上方制御された別の一連の遺伝子としては、クリスタリンファミリーのメンバーが挙げられる（図２０、パネルＢ）。熱ショック及びその他のストレス誘発性タンパク質と同様に、クリスタリンは、網膜のストレスにより活性化され得、アポトーシスに対する保護効果を与え得る。αＡ−クリスタリンの発現が異常に低いことは、網膜萎縮のラットモデルにおける光受容体損失と相関があり、ｒｄ／ｒｄマウスにおける網膜の最近のプロテオミクス分析から、網膜変性に反応してクリスタリンの上方制御が誘発されることが示された。ＥＰＣ救出ｒｄ／ｒｄマウス網膜の、発明者らのマイクロアレイデータに基づき、クリスタリンの上方制御は、ＥＰＣ介在性網膜神経保護において重要な役割を果たすと思われる。

ｃ−ｍｙｃ、Ｍａｄ１、Ｙｘ−１及びクリスタリンなどの遺伝子は、ニューロン救出の下流メディエーターであると思われる。神経栄養因子は、抗アポトーシス遺伝子発現を制御することができるが、マウス幹細胞により救出された網膜の、発明者らのマイクロアレイ分析から、公知の神経栄養因子のレベル向上の誘発は示されなかった。一方、ヒト特異的チップを用いたヒト骨髄由来幹細胞介在性救出の分析から、複数の成長因子遺伝子の発現が低いながらも顕著に向上することが示された。上方制御される遺伝子としては、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのいくつかのメンバー及びオトフェリンが挙げられる。オトフェリン遺伝子における突然変異は、聴力ニューロパチーによる難聴に結びつく遺伝的疾患と関連がある。注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣによるオトフェリン産生は、網膜ニューロパチーの予防にも寄与する可能性がある。組織学的に、網膜変性のある患者及び動物で観察される血管変化は、光受容体の死の際に代謝要求が低下することに続く二次的なものであると長い間推定されてきた。今回のデータから、少なくとも遺伝性網膜変性のマウスに対して、正常な血管の保持は、同様に外顆粒層の成分の維持を促進し得ることが示される。文献における最近の報告は、組織特異的脈間構造が、単純に血管「栄養」を与えることから予想されるものを超える栄養作用を有するという概念を支持する。例えば、肝臓内皮細胞は、肝臓損傷に直面して、ＶＥＧＦＲ１活性化後に、肝細胞再生及び維持に重要な成長因子を産生するように誘導され得る（ＬｅＣｏｕｔｅｒら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：８９０−８９３）。

血管内皮細胞と、隣接する肝実質細胞との間の同様の指標となる相互作用は、報告によれば、機能的血管の形成よりかなり前に肝臓の器官形成に関与する。網膜変性のある個体における内因性網膜脈間構造は、それ程劇的には救出を促進しないと思われるが、この脈間構造が骨髄造血幹細胞集団由来の内皮前駆体により強化される場合、これらは変性に対する脈間構造の耐性をより強化し得、同時に、網膜ニューロンならびに血管の生存を促進し得る。網膜変性のあるヒトにおいて、完全な網膜変性の発症を遅延させることにより、視覚を保持する年月を延長させることができる。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置した動物はＥＲＧを顕著に保持し、それは視覚をサポートするのに十分であり得る。

臨床的に、機能的視覚を保持しながら、光受容体及びその他のニューロンを実質的に喪失することがあり得ることが広く認識されている。ある時点で、限界となる閾値を超え、視覚が失われる。ヒトの遺伝性網膜変性のほぼ全てが早発型であるがゆっくりとしたものであるため、網膜変性のある個体を同定し、本発明の自家骨髄幹細胞の移植物を用いて硝子体内処置して、網膜変性及び付随する視覚喪失を遅らせることができる。本発明の幹細胞の標的化及び組み込みを促進するために、活性化星状細胞の存在が望ましい（Ｏｔａｎｉら、２００２、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１００４−１０１０）；関連するグリオーシスがある場合の早期治療により、又は活性化星状細胞の局所的増殖を刺激するためにレーザーを使用することにより、これを遂行することができる。場合によっては、眼内注入前に１以上の神経栄養物質を伴う幹細胞のエクスビボトランスフェクションを使用し、救出効果を促進することができる。網膜神経節細胞変性がある、緑内症などのその他の視覚ニューロン変性疾患の治療に対してこのアプローチを適用することができる。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、反応性星状細胞を標的とすることにより血管形成を促進することができ、網膜構造を破壊することなく、確立された鋳型に取り込まれ得るＥＰＣの集団を含有する。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣはまた、網膜変性に罹患した眼において驚くべき長期間の神経栄養救出効果も与える。さらに、ＥＰＣを含有する、遺伝子改変した自家Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を虚血性又は異常に血管形成が起こっている眼に移植することができ、新しい血管及びニューロン層に安定に取り込まれ得、長期間にわたり、局所的に治療用分子を連続して送達することができる。生理的に意味のある用量で薬理学的物質を発現する遺伝子のこのような局所送達により、現在治療できない眼疾患を治療するための新しいパラダイムが示される。

正常マウス網膜における光受容体は、例えば、殆ど桿体であるが、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣによる救出後に観察される外顆粒層は、主に錐体を含有していた。殆どの遺伝性ヒト網膜変性は、初期の桿体特異的欠損の結果として起こり、錐体の喪失は、桿体機能不全に続いて起こるものと考えられており、これは、桿体により発現されるいくつかの栄養因子の喪失に関連すると思われる。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣにより促進される、桿体／網膜変性に直面した錐体の生存を誘発する本方法により、網膜色素変性などの疾患において錐体が多数を占めるヒト黄斑をよりよく保持するための方法が得られる。

本発明の新規の特性の精神及び範囲から逸脱することなく、上述の実施形態の多数の変形及び修飾が為され得る。本明細書中で説明される具体的な実施形態は非限定的なものとし、又は、そのように解釈されるべきである。

図１は発生中のマウス網膜の概略図を示し、（ａ）一次叢の発生、（ｂ）網膜血管形成の第二相である。ＧＣＬ、神経細胞層；ＩＰＬ、内網状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外網状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、辺縁部。パネル（ｃ）は、骨髄由来Ｌｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ⁻ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーの特徴を示す。上段：非抗体標識細胞のドットプロット分布、ここで、Ｒ１は陽性ＰＥ染色の定量可能なゲートエリアを定義し；Ｒ２はＧＦＰ−陽性を示す；中段：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）；下段：Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ結合抗体により標識した各細胞系列。Ｔｉｅ−２−ＧＦＰマウスからＴｉｅ−２データを得た。％は、総Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団からの、陽性標識細胞の％を示す。 図１は発生中のマウス網膜の概略図を示し、（ａ）一次叢の発生、（ｂ）網膜血管形成の第二相である。ＧＣＬ、神経細胞層；ＩＰＬ、内網状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外網状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、辺縁部。パネル（ｃ）は、骨髄由来Ｌｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ⁻ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーの特徴を示す。上段：非抗体標識細胞のドットプロット分布、ここで、Ｒ１は陽性ＰＥ染色の定量可能なゲートエリアを定義し；Ｒ２はＧＦＰ−陽性を示す；中段：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）；下段：Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ結合抗体により標識した各細胞系列。Ｔｉｅ−２−ＧＦＰマウスからＴｉｅ−２データを得た。％は、総Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団からの、陽性標識細胞の％を示す。 図２は、発生中のマウス網膜へのＬｉｎ⁻ＨＳＣの移植を示す。（ａ）注入から４日後（Ｐ６）、硝子体内注入されたｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が網膜に接着し、分化する。（ｂ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（β−ｇａｌ抗体で染色した、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａマウス）は、コラーゲンＩＶ抗体で染色される脈間構造の先端でそれら自身を確立する（星印は脈間構造の先端を示す）。（ｃ）注入４日後（Ｐ６）のＬｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ^＋）の殆どが分化できなかった。（ｄ）注入４日後（Ｐ６）の腸間膜ｅＧＦＰ^＋マウスＥＣ。（ｅ）成体マウス眼に注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ^＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいて、既に存在する星状細胞鋳型へ行き、それに沿って分化するｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（矢印）の低倍率。（ｇ）Ｌｉｎ⁻細胞（ｅＧＦＰ）と下層の星状細胞（矢印）との間の関係の高倍率。（ｈ）非注入ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック対照。（ｉ）注入４日後（Ｐ６）、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが将来の深部叢の領域に移動し、分化する。左図は、ホールマウントの網膜でのＬｉｎ⁻ＨＳＣ活性を捕らえ；右図は、網膜におけるＬｉｎ⁻細胞（矢印）の位置を示す（上は硝子体側、下は強膜側）。（ｊ）α−ＣＤ３１−ＰＥ及びα−ＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重染色。注入７日後、注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ）、赤）が脈間構造に組み込まれた（ＣＤ３１）。矢印は、組み込まれた領域を示す。（ｋ）注入後１４日（Ｐ１７）に、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内投与から、血管がインタクトであり、一次（ｌ）及び深部（ｍ）叢の両方で機能的であることが示される。 図２は、発生中のマウス網膜へのＬｉｎ⁻ＨＳＣの移植を示す。（ａ）注入から４日後（Ｐ６）、硝子体内注入されたｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が網膜に接着し、分化する。（ｂ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（β−ｇａｌ抗体で染色した、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａマウス）は、コラーゲンＩＶ抗体で染色される脈間構造の先端でそれら自身を確立する（星印は脈間構造の先端を示す）。（ｃ）注入４日後（Ｐ６）のＬｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ^＋）の殆どが分化できなかった。（ｄ）注入４日後（Ｐ６）の腸間膜ｅＧＦＰ^＋マウスＥＣ。（ｅ）成体マウス眼に注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ^＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいて、既に存在する星状細胞鋳型へ行き、それに沿って分化するｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（矢印）の低倍率。（ｇ）Ｌｉｎ⁻細胞（ｅＧＦＰ）と下層の星状細胞（矢印）との間の関係の高倍率。（ｈ）非注入ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック対照。（ｉ）注入４日後（Ｐ６）、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが将来の深部叢の領域に移動し、分化する。左図は、ホールマウントの網膜でのＬｉｎ⁻ＨＳＣ活性を捕らえ；右図は、網膜におけるＬｉｎ⁻細胞（矢印）の位置を示す（上は硝子体側、下は強膜側）。（ｊ）α−ＣＤ３１−ＰＥ及びα−ＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重染色。注入７日後、注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ）、赤）が脈間構造に組み込まれた（ＣＤ３１）。矢印は、組み込まれた領域を示す。（ｋ）注入後１４日（Ｐ１７）に、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内投与から、血管がインタクトであり、一次（ｌ）及び深部（ｍ）叢の両方で機能的であることが示される。 図３は、成体網膜において、レーザー（ａ）及び機械的なもの（ｂ）の両方により誘発された損傷で、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞がグリオーシスに行くこと（ＧＦＡＰ発現星状細胞により示される。一番左側の画像）を示す（星印は損傷部位を示す。）。一番右側の画像は、高倍率のものであり、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣと星状細胞との密接な関係を表す。較正バー＝２０μＭ。 図４は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が、網膜変性マウスの脈間構造を救出することを示す。（ａ−ｄ）コラーゲンＩＶ染色を行った、注入２７日後（Ｐ３３）の網膜；（ａ）及び（ｂ）、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）を注入した網膜は、正常ＦＶＢマウスとの脈間構造の差を示さなかった；（ｃ）及び（ｄ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣs（Ｂａｌｂ／ｃ）を注入した網膜は、野生型マウスと同様、豊富な血管ネットワークを示した；（ａ）及び（ｃ）、ＤＡＰＩ染色を行った網膜全体の凍結切片（上は硝子体側、下は強膜側）；（ｂ）及び（ｄ）、網膜ホールマウントの深部叢；（ｅ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞注入網膜において形成される深部血管叢の脈間構造の増加を説明する棒グラフ（ｎ＝６）。各画像内の血管の全長を計算することにより、深部網膜血管形成の程度を定量した。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ又は対照の網膜に対する血管／高倍率視野の平均全長（ミクロン）を比較した。（ｆ）ｒｄ／ｒｄマウスからの、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｒ、右眼）又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｌ、左眼）細胞注入後の深部血管叢の長さの比較。６匹の別個のマウスの結果を示す（各色は各マウスを表す。）。（ｇ）及び（ｈ）Ｐ１５の眼に注入した場合、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞もまた（Ｂａｌｂ／ｃ）ｒｄ／ｒｄ脈間構造を救出した。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｇ）又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｈ）細胞注入網膜の中間及び深部血管叢を示す（注入から１カ月後）。 図５は、マウス網膜組織の顕微鏡写真を示す：（ａ）網膜ホールマウントの深部層（ｒｄ／ｒｄマウス）、可視化した（灰色）ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入５日後（Ｐ１１）、（ｂ）及び（ｃ）Ｐ６で注入した、Ｂａｌｂ／ｃＬｉｎ⁻細胞（ｂ）又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（ｃ）を受けたＴｉｅ−２−ＧＦＰ（ｒｄ／ｒｄ）マウスのＰ６０網膜脈間構造。（ｂ）及び（ｃ）の左パネルにおいて内因性の内皮細胞（ＧＦＰ染色）のみが見える。（ｂ）及び（ｃ）の中央のパネルはＣＤ３１抗体で染色されている；矢印は、ＣＤ３１により染色されているが、ＧＦＰで染色されていない血管を示し、（ｂ）及び（ｃ）の右パネルはＧＦＰ及びＣＤ３１両方で染色されているものを示す。（ｄ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜（左パネル）及び対照網膜（右パネル）のα−ＳＭＡ染色。 図６は、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ−トランスフェクションＬｉｎ⁻ＨＳＣがマウス網膜の脈間構造の発生を抑制することを示す。（ａ）アミノ末端にＩｇｋシグナル配列を有するヒトＴｒｐＲＳ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ及びＴ２−ＴｒｐＲＳの略図。（ｂ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳトランスフェクションＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜がＴ２−ＴｒｐＲＳタンパク質をインビボで発現する。（１）Ｅ．コリで産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（２）Ｅ．コリで産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（３）Ｅ．コリで産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（４）対照網膜；（５）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ＋ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（ベクターのみ）注入網膜；（６）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ＋ｐＫＬｅ１３５（ｐＳｅｃＴａｇにおけるＩｇｋ−Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）注入網膜。（ａ）内因性ＴｒｐＲＳ。（ｂ）組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜のＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ−ｆ）注入網膜の代表的な一次（表面）及び二次（深部）叢、注入から７日後；（ｃ）及び（ｄ）空のプラスミドをトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼は正常に発生した；（ｅ）及び（ｆ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳトランスフェクションＬｉｎ−ＨＳＣ注入した眼の多くが深部叢の抑制を示した；（ｃ）及び（ｅ）一次（表面）叢；（ｄ）及び（ｆ）二次（深部）叢。（ｆ）で観察される血管の淡い線は、（ｅ）で示される一次ネットワーク血管の「滲み出し（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」画像である。 図７はＨｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す。 図７はＨｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す。 図８はＨｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列、配列番号２を示す。 図９は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ及びＬｉｎ^＋ＨＳＣ（対照）を眼に注入されたマウスからの網膜の顕微鏡写真及び網膜電図（ＥＲＧ）を示す。 図１０は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼の、中間（Ｉｎｔ．）及び深部血管層の両方に対する、ニューロン救出（ｙ軸）と血管救出（ｘ軸）との間の相関を示す統計プロットを示す。 図１１は、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼に対して、ニューロン救出（ｙ軸）と血管救出（ｘ軸）との間で相関がないことを示す統計プロットを示す。 図１２は、注入から１カ月（１Ｍ）、２カ月（２Ｍ）及び６カ月（６Ｍ）後の時点での、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼（濃色の棒）及び非処置のｒｄ／ｒｄマウスの眼（淡色の棒）に対する、任意の相対単位での血管長（ｙ軸）の棒グラフである。 図１３は、注入から１カ月（１Ｍ）、２カ月（２Ｍ）及び６カ月（６Ｍ）後の、ｒｄ／ｒｄマウスの外顆粒層（ＯＮＲ）での核数の３個の棒グラフを含み、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣで処置した対照の眼（淡色の棒）と比較した、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処置した眼（濃色の棒）に対する核数の有意な増加を示す。 図１４は、１カ月（１Ｍ）、２カ月（２Ｍ）及び６カ月（６Ｍ）（注入後）の時点での、左眼（Ｌ、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ処置した対照眼）に対して右眼（Ｒ、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置）を比較した、個々のｒｄ／ｒｄマウスに対する、外顆粒層における核数のプロットを示し；所定プロットの各線は、個々のマウスの眼を比較する。 図１５は、ｒｄ１／ｒｄ１（ＣＨ３／ＨｅＪ、左パネル）又は野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、右パネル）における、網膜脈間構造及び神経細胞の変化を示す。ホールマウント網膜における、中間（上パネル）又は深部（中央パネル）血管叢の網膜脈間構造（赤：コラーゲンＩＶ、緑：ＣＤ３１）及び同じ網膜の切片（赤：ＤＡＰＩ、緑：ＣＤ３１、下パネル）を示す（Ｐ：出生後日数）。（ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層）。 図１６は、ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける神経細胞の変性をＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入が救出することを示す。（Ａ、Ｂ及びＣ）、Ｐ３０（Ａ）、Ｐ６０（Ｂ）及びＰ１８０（Ｃ）での、中間（Ｉｎｔ．）又は深部叢の網膜脈間構造及びＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼の切片（右パネル）及び逆側の対照細胞（ＣＤ３１⁻）を注入した眼（左パネル）。（Ｄ）、Ｐ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中央、ｎ＝１０）及びＰ１８０（右、ｎ＝６）での、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入又は対照細胞（ＣＤ３１⁻）注入網膜における脈間構造の平均全長（平均の＋又は−標準誤差）。中間（Ｉｎｔ．）及び深部血管叢のデータを別々に示す（Ｙ軸：脈間構造の相対長）。（Ｅ）、対照細胞（ＣＤ３１⁻）又はＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜のＰ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中央、ｎ＝１０）及びＰ１８０（右、ｎ＝６）での、ＯＮＬにおける細胞核の平均数（Ｙ軸：ＯＮＬにおける細胞核の相対数）。（Ｆ）、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又は対照細胞注入網膜の、Ｐ３０（左）、Ｐ６０（中央）及びＰ１８０（右）での、脈間構造の長さ（Ｘ軸）とＯＮＬにおける細胞核数（Ｙ軸）との間の線形相関。 図１７は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入により網膜機能が救出されることを示す。網膜電図（ＥＲＧ）記録を用いて、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又は対照細胞（ＣＤ３１⁻）注入網膜の機能を測定した（Ａ及びＢ）。注入２カ月後の、救出された、及び救出されなかった網膜の代表的なケース。同じ動物の、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入の右眼（ａ）及びＣＤ３１⁻対照細胞注入左眼（ｂ）の網膜切片を示す（緑：ＣＤ３１染色脈間構造、赤：ＤＡＰＩ染色核）。（Ｃ）、同じ動物からのＥＲＧの結果を（Ａ及びＢ）で示す。 図１８は、ヒト骨髄細胞がｒｄ１マウスにおいて変性網膜を救出できることを示す（Ａ−Ｃ）。網膜変性の別のモデル、ｒｄ１０においても救出がまた観察される（Ｄ−Ｋ）。Ａ、緑色色素で標識したヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｈＬｉｎ⁻ＨＳＣ）は、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウスへの硝子体内注入後に網膜血管細胞に分化することができる。（Ｂ及びＣ）、注入１．５カ月後の、ｈＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼（ｂ）又は逆側の対照の眼（Ｃ）における網膜脈間構造（左パネル；上：中間叢、下：深部叢）及び神経細胞（右パネル）。（Ｄ−Ｋ）、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｐ６で注入）によるｒｄ１０マウスの救出。Ｐ２１（Ｄ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｈ：対照細胞）、Ｐ３０（Ｅ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｉ：対照細胞）、Ｐ６０（Ｆ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｊ：対照細胞）及びＰ１０５（Ｇ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｋ：対照細胞）における代表的な網膜を示す（各時点の、処置眼及び対照眼は、同じ動物由来である。）。網膜脈間構造（各パネルの上の画像は中間叢であり；各パネルの中央の画像は深部叢である。）をＣＤ３１（緑）及びコラゲナーゼＩＶ（赤）で染色した。各パネルの下の画像は、同じ網膜から作製した横断面を示す（赤：ＤＡＰＩ、緑：ＣＤ３１）。 図１９は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣによる処置後、救出された外顆粒層細胞において、クリスタリンαＡが上方制御されるが、対照細胞で処置した逆側の眼で上方制御されないことを示す。左パネル；救出された網膜におけるＩｇＧ対照、中央パネル；救出された網膜におけるクリスタリンαＡ、右パネル；非救出網膜におけるクリスタリンαＡ。 図２０は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において上方制御される遺伝子の表を含む。（Ａ）マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において発現が３倍上昇する遺伝子。（Ｂ）マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において上方制御されるクリスタリン遺伝子。（Ｃ）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において発現が２倍上昇する遺伝子。（Ｄ）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において発現が上方制御される神経栄養因子又は成長因子に対する遺伝子。 図２０は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において上方制御される遺伝子の表を含む。（Ａ）マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において発現が３倍上昇する遺伝子。（Ｂ）マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において上方制御されるクリスタリン遺伝子。（Ｃ）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において発現が２倍上昇する遺伝子。（Ｄ）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを用いて処置したマウス網膜において発現が上方制御される神経栄養因子又は成長因子に対する遺伝子。 図２１は、本発明の、ＣＤ１３３陽性（ＤＣ１３３^＋）及びＣＤ１３３陰性（ＣＤ１３３⁻）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団における、ＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の分布を示す。左パネルは、フローサイトメトリーの散布図を示す。中央及び右パネルは、細胞集団における特異的な抗体発現のレベルを示すヒストグラムである。Ｙ軸は、事象数を表し、Ｘ軸はシグナル強度を示す。参照（対照）ヒストグラムの右へのシフトのある黒柱は、蛍光シグナルの向上及びバックグラウンドレベルを上回る抗体の発現を示す。 図２２は、出生後Ｐ０からＰ３０の、通常酸素レベル（通常酸素、ｎｏｒｍｏｘｉａ）で飼育された野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける出生後網膜発生を示す。 図２３は、Ｐ７からＰ１２に高酸素レベルで飼育し、次いでＰ１２からＰ１７に通常酸素レベルで飼育した、Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける酸素誘発網膜症モデルを示す（酸素過剰；７５％酸素）。 図２４は、酸素誘発網膜症モデルにおける、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を用いた処置による血管救出を示す。 図２５は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの硝子体内注入後のｒｄ１マウス外顆粒層（ＯＮＬ）において救出された光受容体が主に錐体であることを示す。赤／緑錐体オプシンの発現により明らかとなるように、野生型マウス網膜（上パネル）における光受容体のうち数％が錐体であり（Ａ）、一方、ＯＮＬの殆どの細胞が桿体特異的ロドプシンに対して陽性であった（Ｂ）。網膜脈間構造は、免疫前血清により自己蛍光を発したが（Ｃ）、桿体又は錐体特異的オプシンでの染色に対して、顆粒層は完全に陰性であった。ｒｄ／ｒｄマウス網膜（下パネル）では、内顆粒層が消失し、ＯＮＬがほぼ完全に萎縮性となり、これらの両方が桿体（ｄ）又は錐体（パネルＧ）特異的オプシンに対して陰性であった。対照、ＣＤ３１−ＨＳＣ処置した眼は非注入ｒｄ／ｒｄ網膜と同一であり、桿体（Ｅ）又は錐体（Ｈ）オプシンに対して染色されなかった。錐体赤／緑オプシンに対する陽性免疫活性により明らかなように、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置した逆側の眼は、顕著な減少を示したが、明らかに、主に錐体からなるＯＮＬが存在した（Ｆ）。桿体数％もまた観察された（Ｉ）。

Claims (49)

1. 哺乳動物の網膜において錐体細胞変性を改善する方法であり、網膜における錐体細胞変性を遅延させるのに十分量で、造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含有する、哺乳動物骨髄由来の単離された系統陰性造血幹細胞集団を眼疾患に罹患している哺乳動物の網膜に投与する段階を含む、前記方法。
2. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約２０％が表面抗原ＣＤ３１を発現する、請求項１に記載の方法。
3. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ３１を発現する、請求項１に記載の方法。
4. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約７５％が表面抗原ＣＤ３１を発現する、請求項１に記載の方法。
5. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％がインテグリンα６に対する表面抗原を発現する、請求項１に記載の方法。
6. 単離された系統陰性造血幹細胞集団が成体骨髄から得られる、請求項１に記載の方法。
7. 単離された系統陰性造血幹細胞集団がマウス細胞を含有する、請求項１に記載の方法。
8. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、ならびに細胞の少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する、請求項７に記載の方法。
9. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約６５％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する、請求項７に記載の方法。
10. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞の少なくとも約８０％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、ならびに細胞の少なくとも約７０％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する、請求項７に記載の方法。
11. 単離された系統陰性造血幹細胞集団が、ヒト細胞を含有する、請求項１に記載の方法。
12. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞がＣＤ１３３陰性であり、細胞の少なくとも約５０％がインテグリンα６に対する表面抗原を発現し、ならびに細胞の少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ３１を発現する、請求項１１に記載の方法。
13. 単離された系統陰性造血幹細胞集団中の細胞がＣＤ１３３陽性であり、細胞の約３０％未満がインテグリンα６に対する表面抗原を発現し、ならびに細胞の約３０％未満が表面抗原ＣＤ３１を発現する、請求項１１に記載の方法。
14. 網膜への細胞投与前に、眼疾患に罹患している哺乳動物から造血幹細胞集団を単離するさらなる段階を含む、請求項１に記載の方法。
15. 系統陰性造血幹細胞集団が、
    （ａ）処置すべき哺乳動物から骨髄を抽出し；
    （ｂ）骨髄から複数の単球を分離し；
    （ｃ）ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ、ＴＥＲ−１１９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ６６ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２３５からなる群から選択される１以上の系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体を用いて単球を標識し；及び
    （ｄ）複数の単球から前記１以上の系統表面抗原に対して陽性である単球を除去し、ならびに内皮前駆細胞を含有する系統陰性造血幹細胞の集団を回収する
    ことにより単離される、請求項１４に記載の方法。
16. 哺乳動物がマウスである、請求項１５に記載の方法。
17. 哺乳動物がマウスであり、ならびにＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体により単球が段階（ｃ）において標識される、請求項１５に記載の方法。
18. 哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の方法。
19. 哺乳動物がヒトであり、ならびにＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６及びＣＤ２３５ａに対するビオチン結合系統パネル抗体により単球が段階（ｃ）で標識される、請求項１５に記載の方法。
20. 哺乳動物がヒトであり、ならびにビオチン結合ＣＤ１３３抗体を用いて単球を標識し、及びＣＤ１３３陽性の系統陰性造血幹細胞の集団を回収するさらなる段階を含む、請求項１８に記載の方法。
21. 哺乳動物がヒトであり、ならびにビオチン結合ＣＤ１３３抗体で単球を標識し、ＣＤ１３３陽性細胞を除去し、及びＣＤ１３３陰性の系統陰性造血幹細胞の集団を回収するさらなる段階を含む、請求項１８に記載の方法。
22. 単離された系統陰性造血幹細胞集団が眼内注入により投与される、請求項１に記載の方法。
23. 疾患が網膜変性疾患である、請求項２２に記載の方法。
24. 疾患が虚血性網膜症である、請求項２２に記載の方法。
25. 疾患が血管出血である、請求項２２に記載の方法。
26. 疾患が血管漏出である、請求項２２に記載の方法。
27. 疾患が脈絡膜症である、請求項２２に記載の方法。
28. 疾患が加齢性黄斑変性症である、請求項２２に記載の方法。
29. 疾患が糖尿病性網膜症である、請求項２２に記載の方法。
30. 疾患が推定眼ヒストプラスマ症である、請求項２２に記載の方法。
31. 哺乳動物が新生仔哺乳動物である、請求項２２に記載の方法。
32. 疾患が未熟児網膜症である、請求項３１に記載の方法。
33. 疾患が鎌状赤血球貧血である、請求項２２に記載の方法。
34. 疾患が網膜色素変性である、請求項２２に記載の方法。
35. 哺乳動物の網膜への幹細胞投与前に、治療上有用なペプチドを操作可能にコードする遺伝子を用いて単離された系統陰性造血幹細胞集団がトランスフェクションされる、請求項１に記載の方法。
36. 治療上有用なペプチドが抗血管形成ペプチドである、請求項３５に記載の方法。
37. 抗血管形成ペプチドがタンパク質断片である、請求項３５に記載の方法。
38. タンパク質断片がＴｒｐＲＳの抗血管形成断片である、請求項３７に記載の方法。
39. ＴｒｐＲＳの断片がＴ２−ＴｒｐＲＳである、請求項３８に記載の方法。
40. 治療上有用なペプチドが神経栄養因子である、請求項３５に記載の方法。
41. 神経栄養因子が、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素性上皮由来神経栄養因子、インスリン様増殖因子、グリア細胞系列由来神経栄養因子及び脳由来神経栄養因子からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
42. トランスフェクションが行われた系統陰性造血幹細胞集団が、
    （ａ）成体哺乳動物から骨髄を抽出し；
    （ｂ）骨髄から複数の単球を分離し；
    （ｃ）ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ、ＴＥＲ−１１９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ６６ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２３５ａに対するビオチン結合系統パネル抗体により複数の単球を標識し；
    （ｄ）複数の単球から前記１以上の系統表面抗原に対して陽性である単球を分離し、及び内皮前駆細胞を含有する系統陰性造血幹細胞の集団を回収し；及び
    （ｅ）治療上有用なペプチドを操作可能にコードするポリヌクレオチドを用いて段階（ｄ）で回収した系統陰性造血幹細胞に対してトランスフェクションを行う
    ことにより調製される、請求項３５に記載の方法。
43. 哺乳動物の骨髄から内皮前駆細胞を含む系統陰性造血幹細胞集団を単離し、ならびに続いて、単離した幹細胞を網膜における錐体細胞変性を改善するのに十分な数で哺乳動物の眼に硝子体内注入することを含む、眼疾患に罹患している哺乳動物の網膜において錐体細胞を維持する方法。
44. 幹細胞の数が、哺乳動物の眼の網膜損傷を修復するのに有効である、請求４３に記載の方法。
45. 幹細胞の数が、哺乳動物の眼の網膜新生血管系を安定化するのに有効である、請求４３に記載の方法。
46. 幹細胞の数が、哺乳動物の眼の網膜新生血管系を成熟させるのに有効である、請求４３に記載の方法。
47. 疾患が網膜変性疾患である、請求４３に記載の方法。
48. 哺乳動物網膜への幹細胞の投与前に、単離された系統陰性造血幹細胞集団が、治療上有用なペプチドを操作可能にコードする遺伝子によりトランスフェクションされる、請求４３に記載の方法。
49. 哺乳動物の骨髄から内皮前駆細胞を含む系統陰性造血幹細胞集団を単離し、網膜における活性化星状細胞の局所的増殖を刺激するためにレーザーを用いて網膜を処置し、ならびに続いて、網膜の錐体細胞変性を改善するのに十分な数で単離された幹細胞を哺乳動物の眼に硝子体内注入することを含む、眼疾患に罹患している哺乳動物の網膜において錐体細胞を維持する方法。

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