JP2003501482A - 移植片対宿主疾患の処置のためのｃｄ２０に対する抗体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 正常なヒトＴリンパ球上に存在しない外来表面抗原を形質導入したＴリンパ球を与えている患者における移植片対宿主疾患の処置用の組成物の調製のためのそのような外来表面抗原に対する抗体の使用が記述される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の要約 本発明は、正常ヒトＴリンパ球上に存在しない外来表面抗原を形質導入したＴ
リンパ球を与えられている患者における移植片対宿主疾患の処置用の組成物の調
製のためのそのような外来表面抗原に対する抗体の使用に関する。

【０００２】 本発明はさらに、外来表面抗原でのヒトＴリンパ球のトランスフェクションの
ためのベクター及び外来表面抗原を形質導入したヒトＴリンパ球に関する。背景 血液学腫瘍形成（白血病及びリンパ腫）にかかっている患者における臨床再発
の問題は、ますます重要な問題を提示する。的確な治療の役割は、多年にわたっ
て全骨髄または循環する精製された前駆体での移植法に課されている（J.O.Armi
tage, Bone marrow transplantation, New England Journal of Medicine, 1994
, 330, 827-838）。そのような方法の臨床上の効能は、ドナーのＴリンパ球によ
る宿主の白血病細胞の免疫認識の機構（ＧＶＬ＝移植片対白血病）にある程度基
づく（M.Sykes, FASEB J., 10, 721-730, 1996）。それにもかかわらず、移植片
は、宿主の正常組織に対するドナーのリンパ球自体の免疫学的反応性（ＧＶＤＨ
＝移植片対宿主疾患）を包含する多数の有毒作用を特徴とする。すなわち、宿主
へのＴリンパ球の投与は重大な危険を伴う明らかな利益を示し、そしてこれら２
つの面を薬理学的に分離することは不可能である。

【０００３】 現在、標準化された免疫選択技術により、インビボでＧＶＬ作用を誘導するた
めに投与する大量の精製されたドナーのＴリンパ球を容易に調製することができ
るが、臨床的に必要とされる時にＧＶＨＤ作用を除くために患者において投与し
たＴリンパ球の選択的死を薬理学的に誘導する適切な技術は依然として利用でき
ない。

【０００４】 ここ何年もの間、多数のポリクローナル及びモノクローナル抗体がヒト表面分
子に対して製造されており；多くの場合において、抗体は、免疫療法プロトコル
において利用するためにその分子に関して陽性の細胞をインビボで殺すという直
接の目的で製造されており；例として、Ｂリンパ腫の分野に限定すると、有効な
抗体がＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ３８分子等に
対して製造され、特性化されている（P.S. Multani et al., J. Clin. Oncol.,
16, 3691-3710, 1998）。ある場合には、そのような分子に対して向けられる抗
体は、ＣＤ２０、ＣＤ３８及びＣＤ５２がそうであるが、おそらくそれらは標的
細胞の表面上で補体系を活性化することができるのでインビボ細胞傷害性を示し
ている。ある場合には、抗体は、ＣＤ２０、Ｌｙｍ−１等がそうであるが、標的
放射線溶解を誘導するために放射性分子と連結されている。他の抗体は、ＣＤ１
９、ＣＤ４０及びＣＤ２２がそうであるが、同じ目的で細菌または植物起源の毒
素に連結されている。他の抗体は、例えば、２つの細胞をごく接近させるために
二重特異性を与えるようにキメラ化されている。最後に、これらの抗体の多くに
は、抗原性の危険を減らし且つそれらの効能を上げてそれらをインビボで投与で
きる工学設計した及び／またはヒト化バージョンが存在する。発明の開示 今回、ドナーのＴリンパ球に外来表面抗原を導入し、続いて受け取る患者にそ
のような外来抗原に対して向けられる抗体を投与することを含んでなる方法の使
用により移植片対宿主疾患の問題を効果的に制御することが可能であることが見
出された。

【０００５】 外来抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ２２、ＣＤ５２等のような
Ｂリンパ球の表面上に発現される抗原がそうであるが、正常なＴリンパ球上に存
在しないあらゆる表面抗原を意味する。明らかに、表面抗原は、対応する抗体と
の反応後に、構成的に抗原を発現する細胞集団のレベルで負のまたは好ましくな
い作用を引き起こさないように選択される。

【０００６】 Ｂ非ホジキンリンパ腫の処置において使用されるヒト化モノクローナル抗体が
市販されている（Rituximab^R，Roche）ヒトＢリンパ球のＣＤ２０表面抗原が特
に好ましい。

【０００７】 本発明によれば、ドナーＴリンパ球に選択した抗原を適当な技術により形質導
入し、次に受け取る被験体に注入する前に免疫アフィニティー法によって濃縮す
る。移植片対宿主疾患が発症する場合には、例えば補体によりもたらされる細胞
傷害性機構の使用によりＴリンパ球をインビボで不活性化するために該抗原に対
する抗体を投与する。

【０００８】 抗体は好ましくはモノクローナルであり、より好ましくはヒト化モノクローナ
ル抗体である。投与量及び投与経路は、患者の全般的な健康状態、体重、性別及
び年齢を包含する多数の因子により決まる。一般に、抗体は、循環するＴリンパ
球のほとんど完全な消失までｉｖ経路により約５０〜約５００ｍｇ／ｍ²体表面
の投与量範囲で1日に１〜３回投与する。

【０００９】 Ｔリンパ球の単離は、Rambaldi et al., Blood, 91, 2189-2196, 1998により
記述されている。

【００１０】 所望の抗原をTリンパ球に形質導入する方法は周知であり：参考文献としてVer
ma I.M.及びSomiaによるN. Nature, 389, 239-242, 1997の総説を参照のこと。
特に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイル
ス、レンチウイルス等のような適当なベクターを用いることができる。

【００１１】 これらのベクターの各々には、今度は多数の異なるタイプの生物体が包含され
：レトロウイルスを考えると、例には両種指向性、同種指向性及び他種指向性ベ
クターがある。さらに、多数の異なるパッケージング細胞系が、そのような組換
えレトロウイルスの生産を最適にするため及び生産体のより優れた操作及び安全
性を保証するために長年にわたって利用されている（I.M. Verma et al., Natur
e, 389, 239-242, 1997; M.A. Kay et al., Gene therapy, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 94, 12744-12746, 1997）。

【００１２】 最近、裸のＤＮＡもまた、ポリカチオンまたはリポソーム複合体での抱合、電
気穿孔、塩バッファーにおける沈殿及び他の技術により標的細胞中に導入されて
いる。

【００１３】 多数の異なる細胞タイプが遺伝子導入で標的とされている：Ｔ及びＢリンパ球
、未成熟造血前駆体、筋肉細胞、繊維芽細胞、肝細胞及び他の細胞タイプ（I.M.
Verma et al., Nature, 389, 239-242, 1997; M.A. Kay et al., Gene therapy
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12744-12746, 1997）。

【００１４】 ＣＤ２０抗原の場合には、モロニーマウス白血病ウイルスに由来し、そして別
個のプラスミド上にレトロウイルス構造成分を含有するように工学設計された胚
腎臓ヒト細胞（２９３Ｔ）においてパッケージングされる両種指向性レトロウイ
ルスを使用している（Human Gene Therapy, 7, 1405-1413, 1996）。そのような
ベクター並びに外来抗原を形質導入したＴリンパ球、特にＣＤ２０＋ Ｔリンパ
球は本発明の目的である。

【００１５】 遺伝子導入後に、外来遺伝子を顕著に発現する細胞は全集団のほんのわずかを
構成する。形質導入した細胞の選択方法は、細胞に選択利益を与えることができ
る外来遺伝子の使用により行う。形質導入した細胞また、外来抗原に対する抗体
でのＦＡＣＳソーティングのような別の方法によっても選択することができる（
K. Phillips, et al., Nature Medicine, 2, 10, 1154-1155, 1996）。他の方法
は、免疫アフィニティーカラムまたはパンニング方法のための事前に吸着した培
養プレート等である。

【００１６】 以下の実施例は本発明をより詳細に例示する。

【００１７】 実施例１ プラスミドＬＴＲ ＣＤ２０ ＬＴＲの構築 全コーディング配列を含有するヒト
ＣＤ２０ ｃＤＮＡからの９１３ｎｔフラグメントは、プラスミドｐＣＭＶ ＣＤ
２０からＰＣＲにより得られている（Becker et al., Science, 249, 912-915,
1990）。

【００１８】 増幅には、４０ｎｇのプラスミドを、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５００ｎｇのプ
ライマー「センス」（ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＡ
ＡＡＴＴＣ）、５００ｎｇのプライマー「アンチセンス」（ＣＧＧＧＡＴＣＣＴ
ＴＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴ）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの５Ｕ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの０．
８μｌの溶液の存在下で、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８．７５、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ中で１００μｌの最終反応容量に入れ
た。反応は、このスキーム：９５℃で１’、６０℃で１’そして７２℃で２’に
従ってサイクラーにおいて２６サイクルを行った。反応が終わると１００μｌの
２５：２４：１ フェノール クロロホルム及びイソアミルアルコール溶液を加え
、そして抽出後に、ＤＮＡをエタノールの存在下で２０℃で一晩沈殿させた。遠
心分離後、ＤＮＡを１００μｌの水に再懸濁し、次いでｐＭＯＳベクター（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｔａｌｉａ，ｓｒｌ，Ｉｔａｌｙ）にキット「ｐＭＯＳ平滑末
端化クローニングキット」に含まれる製造業者の説明書に従ってサブクローン化
した。得られた組換えプラスミドを増幅し、塩基配列を決定し、次いで認識部位
（Ｇ／ＧＡＴＣＣ）が両方のＰＣＲプライマーの末端に存在するＢａｍＨＩで消
化した。従って、フラグメントをレトロウイルスベクターＰＩＮＣＯ ＶＵＯＴ
ＯのＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した。レトロウイルスベクターＰＩＮＣＯ
ＶＵＯＴＯは、以前にプラスミドＰＩＮＣＯ（Ｆ．Ｇｒｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，１４−１９，１９９８）からＣＭＶプロ
モーター（サイトメガロウイルス）及びＥＧＦＰ（高められたグリーン蛍光タン
パク質）遺伝子を含有する１４４１ｂｐフラグメントのＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ
での切り出し後に得られていた。ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントの切り出し
後に、プラスミドをクレノウフラグメントで末端平滑化してから閉じ、ＰＩＮＣ
Ｏ ＶＵＯＴＯと称した。そのようなレトロウイルスベクターは現在１１４４８
ｂｐの長さのものである。

【００１９】 ＰＩＮＣＯ ＶＵＯＴＯとＣＤ２０ ｃＤＮＡ間の組換え体をＬＴＲ−ＣＤ２０
−ＬＴＲと称し、ＣＤ２０ ｃＤＮＡのクローニング及び完全な状態並びに最初
のＡＴＧの上流に終止コドンがないことを調べるために塩基配列を決定した（図
１）。

【００２０】 従って、構築物ＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲは、添付の図１に詳述するようにレ
トロウイルス部分は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来する
ＬＴＲ、モロニーウイルスに由来する他のレトロウイルス配列、ＢａｍＨＩ部位
中のＣＤ２０ ｃＤＮＡ及び第二のＬＴＲで作られている。プラスミドの残りは
ＰＩＮＣＯプラスミド（Ｆ．Ｇｒｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．，５８，１４−１９，１９９８）と同一であり、これは、図に示すように
、エプスタインバーウイルスからのＥＢＮＡ−１及びＯｒｉＰ要素、複製起点（
ｐＵＣ）及びアンピシリン耐性の遺伝子並びにＰＧＫ−１プロモーターの制御下
のピューロマイシン耐性の遺伝子を含有する。

【００２１】 実施例２ パッケージング細胞におけるＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲプラスミドのトランス
フェクション レトロウイルスを製造するために、パッケージング細胞Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍ
ｐｈｏをＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲプラスミドでトランスフェクションした。

【００２２】 Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞は、ヒト胚腎臓２９３細胞系からいくつかの
改変後に得られ；最初にそれらをアデノウイルスからのＥ１Ａ遺伝子でトランス
フェクションし、次いでラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下のモロニーＭ
ＬＶからの構造遺伝子ｇａｇ及びｐｏｌ並びにサイトメガロウイルスプロモータ
ーの制御下のモロニーＭＬＶからのｅｎｖ遺伝子をコードする２つの別個のプラ
スミドでトランスフェクションした。

【００２３】 １．５ｘ１０⁶細胞を−１日に１０％ ＦＣＳ（Ｈｉｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔｅｒｉｌ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｏｇａｎ，ＵＫ）を加えた１０
ｍｌのＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｓｅｒｏｍｅｄ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）中で１０ｃｍの直径のペトリ皿において平板培養し、３７℃で５％ ＣＯ₂ インキュベーター中で維持した。０日に１６μｌのクロロキンを加え（ストック
溶液ＰＢＳ中２５ｍＭ）、１０’後に１０μｇプラスミドＤＮＡの１ｍｌ溶液を
加えた。そのようなＤＮＡ溶液を得るために、５００μｌの溶液２Ｘ ＨＢＳ（
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．０５、１０ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭデキストロ
ース、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ＦＷ １４１．９６）
）を１５ｍｌ円錐チューブに加えた。続いて、別の１５ｍｌチューブに、１０μ
ｇ ＤＮＡ、６１μｌ ＣａＣｌ ２Ｍ及び滅菌水を含む５００μｌの溶液を調製
した。この後、ＤＮＡ混合物を最初のチューブに滴下して加え、得られた沈殿し
たものを次に細胞に加えた。

【００２４】 8時間後に培地を１０ｍｌの新しいＤＭＥＭで置換した。 ＋１日に、１０％ ＦＣＳを加えた５ｍｌの新しいＲＰＭＩ １６４０倍地で培地
を置換した。

【００２５】 ＋２日に、培養中に放出されたレトロウイルスを含有する５ｍｌの培地を取り
除くことにより感染を実施した。

【００２６】 実施例３ ＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲレトロウイルスでのＣＥＭ細胞系の感染 １０％ ＦＣＳ及びグルタミンを補足したＲＰＭＩ １６４０培地中で懸濁して増
やした１ｘ１０⁶のヒトＴリンパ芽球ＣＥＭ細胞を２４穴プレート（Falcon, Bec
ton Dickinson and Company, NY）の平底ウェルにおいて１２００ｒｐｍで８’
間回転することによりペレットにした。上清を除いた後、１ｍｌのウイルス上清
を１μｌポリブレン（Polybrene）（ストック溶液ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌ）の存
在下で０．４５μｍフィルター（Millipore Corporation Bedford, MA）を通し
た濾過により加えた。

【００２７】 次にプレートを室温で１８００ｒｐｍで４５’間遠心分離し、次いで上清を除
き、１０％ ＦＣＳを加えた１ｍｌの新しいＲＰＭＩ １６４０で置換し、続いて
さらに６時間インキュベーションした。

【００２８】 インキュベーションが終わると以前に調製したパッケージング細胞の異なるペ
トリ皿を用いて感染方法をもう一回繰り返した。

【００２９】 実施例４ ＣＤ２０＋ ＣＥＭのＦＡＣＳ分析 ＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲでのレトロウ
イルス感染後のＣＥＭ細胞をインキュベーター中で維持し、通常は１０％ FCSを
加えたＲＰＭＩ １６４０培地中で増やした。２日後にCEM細胞はすでに表面上の
ＣＤ２０マーカーの存在に関して免疫蛍光分析によりアッセイすることができた
。

【００３０】 ０．１ｘ１０⁶細胞を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４，０００
ｒｐｍで３’間回転し、蛍光抗ＣＤ２０ １Ｆ５抗体（Becton Dickinson）の５
０μｌの溶液に再懸濁し、４℃で３０’間保った。最後に、５００μｌの溶液０
．９％ ＮａＣｌ、５％ ＦＣＳ、０．０２％アジ化Ｎａを加え、細胞を４，００
０ｒｐｍで５’間回転した。この後、１％ホルムアルデヒドを含有する１００μ
ｌのＰＢＳ溶液にサンプルを再懸濁し、次に蛍光血球計算器で読み取るまで４℃
で保った。

【００３１】 多くの実験においてこの感染方法はいつも３０〜６０％の様々な割合のＣＥＭ
ＣＤ２０＋細胞を与え、一方、感染していない細胞系はＣＤ２０発現に関して
完全に陰性であった（例として、４０％でＣＤ２０＋なったＣＥＭ集団を示す図
２、中央のパネルを参照）。

【００３２】 実施例５ 免疫アフィニティー分離 ２日の培養後にＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲウイルスを感染させたＣＥＭ細胞は
、免疫アフィニティーカラムによりＣＤ２０＋集団を濃縮することができた。こ
の目的のために、細胞を最初に抗ＣＤ２０抗体クローン１Ｆ５４と４℃で３０’
間インキュベーションし、次にＰＢＳ及び２．５％ヒト血清アルブミンで３回洗
浄し、最後にヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Milteny Biotech, Bergish-Gladbach, G
ermany）を被覆したミクロビーズの溶液と４℃でさらに３０’間インキュベーシ
ョンした。

【００３３】 最後に、細胞を培地ＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、SuperMACSシステム（Milt
eny Biotech）のＸＳ＋カラム上に通すことによって選択した。次に２．５％ア
ルブミンを加えた生理溶液でカラムを溶出し、ＳｕｐｅｒＭＡＣＳからカラムを
取り除き、陽性画分を回収するために洗浄した。

【００３４】 陽性画分は、以前に記述された直接免疫蛍光法に従って細胞標識後に細胞蛍光
計でさらに分析した。

【００３５】 この方法の最後でＣＤ２０＋細胞の割合はいつも９０％より上であった。例と
して、免疫アフィニティーによる濃縮後に９８％でＣＤ２０＋陽性であるCＥＭ
集団を示す、図２、右のパネルを参照。

【００３６】 最後にＣＥＭ ＣＤ２０＋集団を懸濁して増やし、インキュベーターにおいて
１０％ ＦＣＳを加えた培地ＲＰＭＩ １６４０中で増やした。一定間隔でこの集
団を表面上のＣＤ２０マーカーの発現に関して調べ、このようにして、２ヶ月以
上にわたるマーカーの安定性及び選択した細胞の９０％以上での陽性を示した。

【００３７】 実施例６ 新しい末梢Ｔリンパ球のＬＴＲ−ＣＤ２０−ＬＴＲウイルスでの感染 ヘパリンを加えた全血をフィコール上に層にし、室温で１，５００ｒｐｍで３０
’間遠心分離した。界面で集めた細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で１，５００ｒｐ
ｍで１０’間、次いでさらに２回室温で１，０００ｒｐｍで１０’間回転し、最
後に平底を有する２４穴プレートにおいて１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４
０に１ｘ１０⁶／ｍｌで再懸濁し、３７℃及び５％ ＣＯ₂で一晩１μｇ／ｍｌの
ＰＨＡ（Murex）の存在下でウェル当たり２ｍｌの細胞懸濁液を等分した。

【００３８】 第二日にヒト組換えIＬ−２（Proleukin, Chiron Italia, Milan, Italy）を
１００U/mlの最終濃度で加えた。

【００３９】 第三日に、洗浄及び細胞計数後、１ｘ１０⁶細胞を２４穴プレートの1個の平底
ウェルにおいて１ｍｌの培地中で感染させた。１，２００ｒｐｍで１０’間回転
した後、上記プロトコルからのように、上清を除き、ポリブレンの存在下で１ｍ
ｌの濾過したウイルスで置換し、続いて室温で１，８００ｒｐｍで４５’間回転
した。

【００４０】 最後に、ウイルス上清を除き、６時間インキュベーションの間完全培地で置換
し、次いで回転感染方法を繰り返した。この後、細胞をＩＬ−２の存在下で完全
培地に再懸濁し、インキュベーター中で一晩静置した。

【００４１】 全方法を次の２日間にわたって繰り返し、最後に細胞をインキュベーター中で
さらに２日間培養して保った。

【００４２】 次に細胞を上記の同じ方法でモノクローナル抗体抗ＣＤ２０ ＦＩＴＣ、抗Ｃ
Ｄ３ ＰＥ、抗ＣＤ４ ＰＥ及び抗ＣＤ８ ＦＩＴＣ（Becton Dickinson）で標識
し、次に細胞蛍光計で分析した。

【００４３】 正常なドナーに対する多くの実験により、二重蛍光分析において５％〜２５％
の様々な割合のＣＤ３＋ Ｔリンパ球がＣＤ２０マーカーを獲得することが示さ
れる。一つのそのような実験が図３に示され、この特定の事例では２３％のＣＤ
３／ＣＤ２０二重陽性が達成されている。

【００４４】 実施例７ ＣＤ２０遺伝子形質導入後に新しいヒトＴリンパ球の集団において抗体及び補体
により誘導される溶解の研究 １０％熱不活性化ウシ胎仔血清を加えた５００μｌのＲＰＭＩ １６４０倍地
中で２ｘ１０⁵の形質導入したリンパ球を１０ｍｌ丸底チューブに等分した。次
にＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体を３５０ｇ／ｍｌの最終濃度に、そしてウサギＰｅｌ
凍結補体を最終１０％で加えた。

【００４５】 あるいはまた、最終３０％濃度のヒトＡＢ血清を補体源して加えることができ
る。細胞を絶えず振盪しながら恒温水浴中で３７℃で１時間放置した。細胞懸濁
液に等容量のPBS中のアクリジンオレンジの１Ｘ溶液（１００ｍｌの蒸留水中３
０ｍｇからなるストック１００X溶液）を加え、細胞懸濁液を細胞蛍光計で評価
し：生存細胞は緑色の蛍光を発し、分析した全集団に対する割合として計数した
。この迅速な方法を用いて、異なる研究集団における二重陽性ＣＤ３／ＣＤ２０
細胞の割合及びＲｉｔｕｘｉｍａｂ^R添加後の死細胞の割合を比較して、ＣＤ２
０＋細胞に対するＲｉｔｕｘｉｍａｂ^Rの致死効率を評価することができた。表
に示すように、コントロール集団は抗体のみまたは補体のみにさらした同じ細胞
であった。表に示すデータは、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ^Rに1時間さらすことによりＣ
Ｄ３／ＣＤ２０＋細胞のほとんど９０％の死が誘導されることを証明する。

【００４６】

【表１】

【００４７】 溶解割合は、アクリジンでの染色後にＦＡＣＳで決定した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドＬＴＲ ＣＤ２０ ＬＴＲのスキーム； ＬＴＲ＝長い末端反復配列；ｐＵＣ＝プラスミド複製起点；Ｐｕｒｏ＝ピューロ
マイシン耐性を与える遺伝子；ＰＧＫ１＝ホスホグリセルアルデヒドキナーゼの
プロモーター；ＥＢＮＡ１及びＯｒｉＰ＝エピソーマル複製のためのＥＢＶウイ
ルスに由来する要素；ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性の遺伝子。

【図２】 ＣＤ２０でのＣＥＭ細胞系の感染及び免疫選択。 左のパネルＡ：蛍光コントロールＩｇＧ１抗体を用いて細胞蛍光計で分析した、
ウイルス感染後のＣＥＭ細胞系。 中央のパネルＢ：蛍光抗ＣＤ２０抗体で分析した同じ集団。 右のパネルＣ：蛍光抗ＣＤ２０抗体で分析した、アフィニティーカラム上での免
疫選択後の同じ集団。

【図３】 ＣＤ２０ウイルスでの新しいヒトＴリンパ球の感染。 左のパネルＡ：感染後にリンパ球をＰＥ ＩｇＧ２ａ及びＦＩＴＣ ＩｇＧ１コン
トロール抗体で標識する。 右のパネルＢ：同じ集団を抗ＣＤ２０ ＰＥ及び抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ抗体で標識
する。示す事例では２３％の細胞が二重陽性である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月２４日（２００１．７．２４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項６

【補正方法】変更

【補正の内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 イントロナ，マルテイノ イタリア・アイ−20157ミラノ・ビアエリ トレア62・インステイテユトリシエルシユ フアルマコロジシエマリオネグリ・ラボラ トリオデイイミユノエマトロジアモレコラ レ (72)発明者 ランバルデイ，アレツサンドロ イタリア・アイ−24128ベルガモ・ラルゴ バロツツイ１・オスペダリリウニテイ・デ イビジオネデイエマトロジア (72)発明者 ビオンデイ，アンドレア イタリア・アイ−20052モンツア・ビアド ニゼツテイ106・クリニカペデイアトリカ ウニベルシタデイミラノ−ビコツカ・セン トロリシエルシユテタマンテイ Ｆターム(参考） 4C085 AA13 AA14 BB01 DD62 DD63 DD88 GG02

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト正常Ｔリンパ球上に存在しない外来表面抗原を形質導入
   したＴリンパ球を与えられている患者における移植片対宿主疾患の処置用の組成
   物の調製のためのそのような外来表面抗原に対する抗体の使用。
2. 【請求項２】 ＣＤ２０表面抗原に対する抗体及びＣＤ２０抗原を形質導入
   したリンパ球を使用する請求項１に記載の使用。
3. 【請求項３】 抗ＣＤ２０抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項２
   に記載の使用。
4. 【請求項４】 外来表面抗原でのヒトＴリンパ球のトランスフェクションの
   ためのベクター。
5. 【請求項５】 ヒトＣＤ２０抗原をコードする遺伝子を含む請求項４に記載
   のベクター。
6. 【請求項６】 外来表面抗原を形質導入したヒトＴリンパ球。
7. 【請求項７】 ヒトＣＤ２０抗原を形質導入した請求項６に記載のＴリンパ
   球。