ES2278616T3 - Uso de anticuerpos contra cd20 para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huesped. - Google Patents

Abstract

El uso de anticuerpos contra antígenos expresados en la superficie de linfocitos B y no presentes en los linfocitos T humanos normales, para la preparación de composiciones para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped en pacientes que han recibido linfocitos T transducidos con tales antígenos.

Description

Uso de anticuerpos contra CD20 para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de anticuerpos contra antígenos exógenos de superficie que no están presentes en los linfocitos T humanos normales para la preparación de composiciones para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped en pacientes que han recibido linfocitos T transducidos con tales antígenos exógenos de superficie.

La invención además se refiere a vectores para la transfección de linfocitos T humanos con antígenos exógenos de superficie y linfocitos T humanos transducidos con antígenos exógenos de superficie.

Antecedentes

El problema de las recaídas clínicas en pacientes con neoplasias hematológicas (leucemia y linfomas) representa un problema cada vez más importante. Durante muchos años se ha destinado una función terapéutica precisa a los procedimientos de transplantes con médula ósea total o con precursores purificados de la circulación (J. O. Armitage, Bone marrow transplantation, New England Journal of Medicine, 1994, 330, 827-838). La eficacia clínica de tales procedimientos se basa en parte en un mecanismo de reconocimiento inmune de las células leucémicas del huésped por parte de los linfocitos T del donador (GVL = injerto contra leucemia) (M. Sykes, FASEB J., 10, 721-730, 1996). No obstante, los transplantes se caracterizan por muchos efectos tóxicos que incluyen la reactividad inmunológica de los mismos linfocitos del donador contra los tejidos normales del huésped (GVDH = enfermedad de injerto contra huésped). En otras palabras, la administración de los linfocitos T al huésped muestra claros beneficios relacionados con riesgos serios y es imposible separar farmacológicamente estos dos aspectos.

A pesar de que las técnicas de inmunoselección convencionales permiten actualmente la producción fácil de grandes cantidades de linfocitos T purificados del donador para su administración, con el fin de inducir el efecto GVL in vivo, todavía no están disponibles las técnicas apropiadas para inducir farmacológicamente la muerte selectiva de los linfocitos T administrados en un paciente con el fin de eliminar el efecto GVHD en el momento en que esto se necesita clínicamente.

En los últimos años, se han producido muchos anticuerpos policlonales y monoclonales contra las moléculas humanas de superficie; en muchos casos se han producido anticuerpos con el objetivo directo de matar in vivo una célula positiva para esa molécula, de manera que se utilicen en protocolos de inmunoterapia; por ejemplo, limitando a la zona del linfoma B, se han producido anticuerpos eficaces y se han caracterizado contra las moléculas CD20, CD 19, CD40, CD22, CD52, CD38 y todavía otras (P. S. Multani y col., J. Clin. Oncol., 16, 3691-3710, 1998). En algunos casos, los anticuerpos dirigidos contra tales moléculas han mostrado citotoxicidad in vivo, probablemente porque son capaces de activar el sistema complemento sobre la superficie de la célula diana, como es el caso de CD20, CD38 y CD52. En otros casos, los anticuerpos se han conjugado con moléculas radiactivas para inducir la radiólisis diana, como es el caso de CD20, Lym-1 y otras. Otros anticuerpos se han conjugado a toxinas de origen bacteriano o vegetal con el mismo objetivo, como es el caso de CD19, CD40 y CD22. Otros anticuerpos se han quimerizado para permitir una biespecificidad de tal forma que produzcan dos células en estrecha proximidad, por ejemplo. Finalmente, para muchos de estos anticuerpos existen versiones modificadas por ingeniería genética y/o humanizadas, las cuales permiten administrarlos in vivo reduciendo el riesgo de antigenicidad y aumentando su
eficacia.

Descripción de la invención

En la actualidad se ha descubierto que es posible controlar de manera efectiva el problema de la enfermedad de injerto contra huésped por medio del uso de un procedimiento que comprende la introducción de un antígeno exógeno de superficie en los linfocitos T del donador y la administración subsiguiente al paciente receptor de los anticuerpos dirigidos contra tales antígenos exógenos.

Por antígeno exógeno, se denomina cualquier antígeno de superficie no presente sobre los linfocitos T normales, como es el caso de los antígenos expresados sobre la superficie de linfocitos B tales como CD20, CD 19, CD40, CD22, CD52, etc. Obviamente, el antígeno de superficie se seleccionará de tal forma que no produzca, después de la reacción con el anticuerpo correspondiente, efectos negativos o no deseados al nivel de las poblaciones celulares que expresan el antígeno constitutivamente.

Particularmente se prefiere el antígeno de superficie CD20 de los linfocitos B humanos contra el cual está disponible en el mercado un anticuerpo monoclonal humanizado (Rituximab ®, Roche) que se usa en el tratamiento de linfomas B no Hodgkin.

De acuerdo con la invención, los linfocitos T del donador se transducen por medio de técnicas adecuadas con el antígeno seleccionado y después se enriquecen a través de procedimientos de inmunoafinidad antes de inyectarse al sujeto receptor. En caso de que se desarrolle la enfermedad de injerto contra huésped, el anticuerpo contra el antígeno se administra con el fin de inactivar in vivo los linfocitos T mediante el uso, por ejemplo de mecanismos citotóxicos mediados por el complemento.

Preferiblemente, el anticuerpo será monoclonal, más preferiblemente será un anticuerpo monoclonal humanizado. La vía de administración y dosificación dependerán de muchos factores que incluyen, en conjunto, el estado de salud, peso, sexo y edad del paciente. En general, el anticuerpo se administrará por vía iv en un intervalo de dosificación de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg/m^{2} de superficie corporal, de una a tres veces al día hasta casi la completa desaparición de los linfocitos T de circulación.

Rambaldi y col., Blood, 91, 2189-2196, 1998, han descrito el aislamiento de linfocitos T.

Los procedimientos para transducir los linfocitos T con el antígeno deseado se conocen bien: como referencia, véase la revisión de Verma I. M. y Somia N. en Nature, 389, 239-242, 1997. En particular, se pueden usar vectores adecuados, tales como los retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, herpesvirus, lentivirus, etc.

Cada uno de estos vectores incluye, a su vez, muchos tipos diferentes de organismos: con respecto a los retrovirus, los ejemplos son los vectores anfotrópicos, ecotrópicos y xenotrópicos. Además, durante años se han utilizado muchas líneas celulares empaquetadas diferentes para optimizar la producción de tales retrovirus recombinantes y para garantizar la manipulación y seguridad mejores para los fabricantes (I. M. Verma y col., Nature, 389, 239-242, 1997; M. A. Kay y col., Gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 94, 12744-12746, 1997).

Recientemente, también se ha introducido ADN desnudo en células diana a través de la conjugación con complejos policatiónicos o liposomales, electroporación, precipitación en tampones de sal y otras técnicas.

Se han fijado como diana muchos tipos diferentes de células con transferencia genética: linfocitos T y B, precursores hematopoyéticos inmaduros, células musculares, fibroblastos, hepatocitos y otros tipos de células (I. M. Verma y col., Nature, 389, 239-242, 1997; M. A. Kay y col., Gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 94, 12744-12746, 1997).

En el caso del antígeno CD20, se ha usado un retrovirus anfotrófico que deriva del virus de la leucemia murina de Moloney y se empaqueta en las células embrionarias de riñones humanos (293T) modificadas por ingeniería genética para contener los elementos estructurales retrovirales en plásmidos distintos (Human Gene Therapy, 7, 1405-1413, 1996). Tales vectores, así como los linfocitos T transducidos con el antígeno exógeno, en particular los linfocitos T CD20+, son un objeto de la presente invención.

Después de la transferencia genética, las células que expresan significativamente el gen exógeno constituyen solamente una minoría de la población total. Los procedimientos de selección de las células transducidas se llevan a cabo por medio del uso de genes exógenos que son capaces de proporcionar una ventaja selectiva a la célula. Las células transducidas también se pueden seleccionar de acuerdo con procedimientos alternativos tales como aislamiento en FACS con anticuerpos contra los antígenos exógenos (K. Phillips, y col., Nature Medicine, 2, 10, 1154-1155, 1996). Otros procedimientos son las columnas de inmunoafinidad o placas de cultivos preabsorbidos para el procedimiento de panning, y los similares.

Descripción de las figuras

Figura 1

Esquema del plásmido LTR CD20 LTR

LTR = repetición terminal larga; pUC = origen de replicación del plásmido; Puro: gen que proporciona resistencia a la puromicina;

PGK1 = promotor de la fosfogliceraldehído quinasa; EBNA1 y OriP = elementos derivados del virus EBV para la replicación episomal; AmpR = gen para la resistencia a la ampicilina.

Figura 2

Infección de la línea celular CEM con CD20 e inmunoselección

Panel izquierdo A: línea celular CEM después de la infección del virus, analizada en el citofluorímetro con un anticuerpo de control fluorescente lgG1.

Panel central B: la misma población analizada con un anticuerpo anti CD20 fluorescente.

Panel derecho C: la misma población después de la inmunoselección en columnas de afinidad, analizada con un anticuerpo anti CD20 fluorescente.

\newpage

Figura 3

Infección de linfocitos T humanos nuevos con el virus CD20

Panel izquierdo A: después de la infección los linfocitos se marcan con los anticuerpos de control PE lgG2a y FITC lgG1.

Panel derecho B: la misma población se marca con anticuerpos anti CD20 PE y anti CD3 FITC. En el caso mostrado, el 23% de las células son doble positivas.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención en gran detalle.

Ejemplo 1

Construcción del plásmido LTR CD20 LTR

Un fragmento 913 nt del ADNc de CD20 humano que contiene la totalidad de la secuencia codificadora se ha obtenido por PCR a partir del plásmido pCMV CD20 (Becker y col., Science, 249, 912-915, 1990).

Para la amplificación, 40 ng de plásmido se llevaron a un volumen de reacción final de 100 \mul en KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris HCl 20 mM, pH 8,75, MgSO_{4} 2 mM, Triton X-100 al 0,1%, BSA 100 \mug/ml, en presencia de 0,8 \mul de una solución de dNTP 2,5 mM, 500 mg de "sentido" cebador (CGGATCCAAAATGACAACACCCA
GAAATTC) 500 mg de "antisentido" cebador (CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT) y Pfu ADN Polimerasa 5U de Stratagene (La Jolla, CA, EE. UU.). La reacción se llevó a cabo durante 26 ciclos en el ciclador siguiendo este esquema: 1' a 95ºC, 1' a 60ºC y 2' a 72ºC. Al final de la reacción se añadieron 100 \mul de una solución de fenol cloroformo y alcohol isoamílico 25:24:1 y después de la extracción, se precipitó el ADN durante toda una noche a 20ºC en presencia de etanol. Después de la centrifugación, el ADN se volvió a suspender en 100 \mul de agua y después se subclonó en el vector pMOS (Amersham Italia, srl, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante contenidas en el kit "pMOS blunt ended cloning kit". El plásmido recombinante resultante se amplificó y se secuenció, después se digirió con BamHI, cuyo sitio de reconocimiento (G/GATCC) estaba presente en ambos extremos de los cebadores PCR. Por tanto, el fragmento se subclonó en el sitio de BamHI del vector retroviral
PINCO VUOTO. El vector retroviral PINCO VUOTO se había obtenido previamente después de la excisión con EcoRI y NotI de un fragmento de 1.441 pares de bases que contiene el promotor CMV (Citomegalovirus) y el gen EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) a partir del plásmido PINCO (F. Grignani y col., Cancer Res., 58, 14-19, 1998). Después de la escisión del fragmento EcoRI-NotI, el plásmido se cerró después de hacer el extremo romo con el fragmento Klenow y se denominó PINCO VUOTO. Tal vector retroviral es ahora de 11.448 pares de bases de
longitud.

El recombinante entre PINCO VUOTO y el ADNc de CD20 se denominó LTR-CD20-LTR y se secuenció para comprobar la clonación y la integridad del ADNc de CD20 así como la ausencia de codones de parada cadena arriba del primer ATG (Fig. 1).

Por tanto, la construcción LTR-CD20-LTR está hecha, para la parte retroviral, del LTR derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), otras secuencias retrovirales derivadas del virus de Moloney, el ADNc de CD20 en el sitio BamHI y el segundo LTR como se detalla en la Figura 1 anexa. El resto del plásmido es idéntico al plásmido PINCO (F. Grignani y col., Cancer Res., 58, 14-19, 1998) que contiene, como se muestra en la figura, elementos EBNA-1 y OriP del virus de Epstein Barr, el origen de la replicación (pUC) y el gen para la resistencia a la ampicilina, así como un gen para la resistencia a la puromicina bajo el control del promotor PGK-1.

Ejemplo 2

Transfección del plásmido LTR-CD20-LTR en las células empaquetadas

Con el fin de producir los retrovirus, la célula empaquetada Phoenix-Ampho se transfectó con el plásmido LTR-CD20-LTR.

Las células Phoenix-Ampho se derivan de la línea celular 293 de riñón embrionario humano después de varias modificaciones; inicialmente se transfectaron con el gen E1A del adenovirus y después se transfectaron con dos plásmidos distintos que codifican los genes estructurarles gal y pol de Moloney MLV bajo el control del promotor del virus del sarcoma de Rous y el gen env de Moloney MLV bajo el control del promotor del citomegalovirus.

Las células de 1,5 x 10^{6} se sembraron en placas el día 1 en una placa de Petri de 10 cm de diámetro en un medio de DMEM 10 ml (Gibco, Seromed, Berlín, Alemania) y se les añadió FCS al 10% (Hiclone Laboratories, Steril System, Logan, Reino Unido) y se mantuvieron en un incubador de CO_{2} al 5% a 37ºC. El día 0 se añadió cloroquina 16 \mul (solución madre 25 mM en PBS) y después de 10 minutos se añadió 1 ml de solución de 10 \mug de ADN del plásmido. Para obtener tal solución de ADN, se añadieron 500 \mul de una solución de 2X HBS (HEPES 50 mM, pH 7,05, KCl 10 mM, Dextrosa 12 mM, NaCl 280 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM (FW 141,96)) en un tubo cónico de 15 ml. Subsiguientemente, en un segundo tubo de 15 ml, se prepararon 500 \mul de una solución con ADN 10 \mug, CaCl 2M
61 \mul y agua estéril. Después de eso, la mezcla de ADN se añadió gota a gota en el primer tubo y el precipitado obtenido se añadió después a las células.

Después de 8 horas el medio se reemplazó por 10 ml de DMEM nuevo.

El día +1 el medio se reemplazó por un medio RPMI 1640 nuevo de 5 ml añadido con FCS al 10%.

El día +2 la infección se llevó a cabo retirando los 5 ml de medio que contiene los retrovirus liberados durante el cultivo.

Ejemplo 3

Infección de la línea celular CEM con el retrovirus LTR-CD20-LTR

Las células CEM linfoblastoides T humanas de 1 x 10^{6} que se cultivan en suspensión en un medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10% y glutamina, se sedimentaron por giro a 1.200 rpm durante 8 minutos en un pocillo de fondo liso de una placa de 24 pocillos (Falcon, Becton Dickinson and Company, NY). Después de la eliminación del sobrenadante, se añadió 1 ml del sobrenadante viral por filtración a través de filtros de 0,45 \mum (Millipore corporation Bedford, MA) en presencia de Polybrene 1 \mul (solución madre 4 mg/ml en PBS).

Después se centrifugó la placa durante 45 minutos a 1.800 rpm a temperatura ambiente y después se eliminó el sobrenadante y se reemplazó por 1 ml de RPMI 1640 nuevo añadido con FCS al 10% y subsiguientemente se incubó durante 6 horas más.

Al final de la incubación el procedimiento de infección se repitió una segunda vez usando una placa Petri diferente de células empaquetadas previamente preparadas.

Ejemplo 4

Análisis FACS de CEM con CD20+

Las células CEM después de la infección retroviral con LTR-CD20-LTR se mantuvieron en el incubador y se cultivaron normalmente en un medio RPMI 1640 añadido con FCS al 10%. Después de 2 días las células CEM ya se podían analizar por análisis de inmunofluorescencia para detectar la presencia del marcador CD20 sobre la superficie.

Las células de 0,1 x 10^{6} se transfirieron en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se hicieron girar a 4.000 rpm durante 3 minutos, se volvieron a suspender en 50 \mul de una solución de anticuerpo anti CD20 1F5 fluorescente (Becton Dickinson) y se mantuvieron durante 30 minutos a 4ºC. Al final, se añadieron 500 \mul de una solución en NaCl al 0,9%, FCS al 5%, Na Azide al 0,02% y se hicieron girar las células a 4.000 rpm durante 5 minutos. Después de eso, la muestra se volvió a suspender en 100 \mul de solución en PBS que contiene formaldehído al 1% y después se mantuvo a 4ºC hasta la lectura en el fluorocitómetro.

En muchos experimentos este procedimiento de infección siempre proporcionó células CEM con CD20+ en porcentajes que variaban del 30% al 60%, mientras que la línea celular no infectada era completamente negativa para la expresión CD20 (véase como ejemplo la Fig. 2, panel central, que muestra una población de CEM que se volvió CD20+ en un 40%).

Ejemplo 5

Separación por inmunoafinidad

Las células CEM infectadas con el virus LTR-CD20-LTR después de dos días de cultivo podrían enriquecerse en la población de CD20+ por columnas de inmunoafinidad. A tal efecto, primero se incubaron las células durante 30 minutos a 4ºC con el clon del anticuerpo anti CD20 1F54, después se lavaron tres veces con PBS y albúmina de suero humano al 2,5%, finalmente se incubaron durante 30 minutos más a 4ºC con una solución de microperlas revestidas con un anticuerpo de cabra anti-ratón lgG (Milteny Biotech, Bergish-Gladbach, Alemania).

Finalmente las células se volvieron a suspender en un medio RPMI 1640 y se seleccionaron a través del pasaje sobre la columna XS+ en el sistema SuperMACS (Milteny Biotech). Después la columna se hizo eluir con solución fisiológica añadida con albúmina al 2,5% y la columna se retiró del SuperMACS y se lavó con el fin de recuperar la fracción positiva.

La fracción positiva se analizó después en el citofluorímetro después del marcaje de las células de acuerdo con el procedimiento de inmunofluorescencia directa anteriormente descrito.

El porcentaje de células CD20+ al final de este procedimiento siempre ha sido superior al 90%. Como ejemplo, véase la Fig. 2, panel derecho, en el que se muestra una población de CEM después del enriquecimiento por inmunoafinidad que es CD20+ positivo en el 98%.

Al final, la población CEM con CD20+ se cultivó en suspensión y se expandió en el medio RPMI 1640 añadido con FCS al 10% en el incubador. En intervalos regulares esta población se estudió para detectar la expresión del marcador CD20 sobre la superficie, mostrando así la estabilidad del marcador durante más de dos meses y la positividad en más del 90% de las células seleccionadas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Infección con el virus LTR-CD20-LTR de linfocitos T nuevos periféricos

La sangre total heparinizada se estratificó sobre Ficoll y se centrifugó durante 30 minutos a 1.500 rpm a temperatura ambiente. Las células recogidas en la interfaz se lavaron con PBS y se hicieron girar a 1.500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, después dos veces más a 1.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y finalmente se volvieron a suspender en el RPMI 1640 con FCS al 10% a 1 x 10^{6}/ml en placas de 24 pocillos con fondos lisos, separando en alícuotas 2 ml de suspensión celular por pocillo en presencia de PHA (Murex) a 1 \mug/ml a 37ºC y CO_{2} al 5% durante una noche.

El segundo día, se añadió IL- recombinante humano (Proleukin, Chiron Italia, Milan, Italia) en la concentración final de 100 U/ml.

Al tercer día, después de lavar y recuento de células, se infectaron células 1 x 10^{6} en 1 ml de medio en un pocillo de fondo liso en una placa de 24 pocillos. Después de girar a 1.200 rpm durante 10', se retiró el sobrenadante y se reemplazó por 1 ml de virus filtrado en presencia de Polybrene y giro subsiguiente durante 45 minutos a 1.800 rpm a temperatura ambiente como el protocolo anteriormente referido.

Al final, el sobrenadante viral se retiró y se reemplazó por el medio completo durante 6 horas de incubación y después se repitió el procedimiento de infección por giro. Después de eso, las células se volvieron a suspender en el medio completo en presencia de II-2 y se dejaron permanecer en el incubador toda la noche.

El procedimiento completo se repitió durante los siguientes dos días y finalmente las células se mantuvieron en cultivo durante dos días más en el incubador.

Después las células se marcaron con anti CD20 FITC, anti CD3 PE, anti CD4 PE, y anti CD8 FITC (Becton Dickinson) de anticuerpos monoclonales con el mismo procedimiento descrito antes y después se analizaron en el citofluorímetro.

Muchos experimentos en donadores normales muestran que un porcentaje de linfocitos T CD3+ que varía entre el 5% y el 25% adquiere el marcador CD20 en el análisis de fluorescencia doble. En la Fig. 3 se muestra un experimento como tal, consiguiéndose en este caso específico la positividad doble de CD3/CD20 al 23%.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Estudio de la lisis inducida por anticuerpo y complemento en poblaciones de linfocitos T humanos nuevos después de la transducción genética de CD20

Los linfocitos transducidos 2 x 105 se separaron en alícuotas en tubos de fondo redondo de 10 ml en 500 \mul de medio RPMI 1640 añadido con suero fetal bovino inactivado por calor al 10%. Después se añadió el anticuerpo Rituximab a la concentración final de 350 g/ml y complemento de congelación de Pel de conejo al 10% final.

De forma alternativa, se puede añadir el suero AB humano en la concentración final del 30% como una fuente de complemento. Las células se dejaron durante una hora a 37ºC en un baño de agua termostatizada con agitación continua. A la suspensión celular se añadió un volumen igual de solución 1X de naranja de acridina en PBS (solución madre 100 X que está compuesta por 30 mg en 100 ml de agua destilada) y la suspensión celular se evaluó en el citofuorímetro: las células vivas emiten fluorescencia verde y se contaron como porcentaje sobre la población total analizada. Con este procedimiento rápido, se pudo evaluar la eficiencia de matanza de Rituximab® sobre las células CD20+, en comparación con los porcentajes de las células CD3/CD20 doble positivas en las diferentes poblaciones estudiadas y los porcentajes de células muertas después de la adición de Rituximab®. Como se muestra en la Tabla, las poblaciones de control eran las mismas células expuestas al anticuerpo solo o al complemento solo. La información mostrada en la tabla muestra que una hora de exposición a Rituximab® induce casi el 90% de la muerte de las células CD3/CD20+.

TABLA Citotoxicidad dependiente del complemento de linfocitos T humanos nuevos transducidos por CD20 % lisis específica

	% linfocitos	Rituximab®	Complemento	Rituximab® más
	CD3/CD20+	solo	solo	Complemento
Donador 1	30	0	14	33
Donador 2	23	0	11	35
Donador 3	15	0	5	18

El porcentaje de lisis se determinó en el FACS después de manchado con acridina.

Claims (5)

1. El uso de anticuerpos contra antígenos expresados en la superficie de linfocitos B y no presentes en los linfocitos T humanos normales, para la preparación de composiciones para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped en pacientes que han recibido linfocitos T transducidos con tales antígenos.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se usan anticuerpos contra el antígeno CD20 de superficie y linfocitos transducidos con el antígeno CD20.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo anti CD20 es un anticuerpo monoclonal humanizado.

4. Linfocitos T humanos transducidos con antígenos expresados sobre la superficie de linfocitos B y no presentes sobre los linfocitos T humanos normales.

5. Linfocitos T de acuerdo con la reivindicación 4 transducidos con el antígeno CD20 humano.