SK18132001A3 - Použitie protilátky proti antigénom - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka použitia protilátok proti exogénnym povrchovým antigénom, ktoré sa nenachádzajú na normálnych ľudských T lymfocytoch, na prípravu prostriedkov na liečbu ochorenia štep verzus hostiteľ u pacientov, ktorí . obdržali T lymfocyty transdukované s takýmito exogénnymi povrchovými antigénmi.

Vynález sa ďalej týka vektorov na transfekciu ľudských T lymfocytov s exogénnymi povrchovými antigénmi a ľudských T lymfocytov transdukovaných exogénnymi povrchovými antigénmi.

Doterajší stav techniky

Problém klinických recidív u pacientov s hematologickými neopláziami (leukémiami a lymfómami) predstavuje stále dôležitejší problém. Mnoho rokov sa presná terapeutická úloha prisudzovala transplantačným postupom s celou kostnou dreňou alebo s cirkulujúcimi purifikovanými prekurzormi (J. O. Armitage, Bone marrow transplantation, New England Journal of Medicíne, 1994, 330, 827-838). Klinická účinnosť takýchto postupov je čiastočne založená na mechanizme imunitného rozoznávania leukemických buniek hostiteľa donorovými T lymfocytmi (GVL = štep verzus leukémia) (M. Sykes, FASEB J., 10, 721-730, 1996). Predsa však sa transplantáty vyznačujú mnohými toxickými účinkami vrátane imunologickej reaktivity samotných donorových lymfocytov proti normálnym tkanivám hostiteľa (GVDH = ochorenie štep verzus hostiteľ). Inými slovami, podávanie T lymfocytov hostiteľovi vykazuje jasné užitočné vlastnosti, ktoré sú spojené s ťažkými rizikami, a nie je možné farmakologicky oddeliť tieto dva aspekty.

Hoci v súčasnosti umožňujú štandardizované imunoselekčné techniky jednoduchú purifikáciu veľkého množstva purifikovaných donorových T lymfocytov na podávanie na indukciu in vivo GVL účinku, nie sú ešte dostupné vhodné techniky na farmakologickú indukciu selektívnej smrti podávaných T lymfocytov v pacientovi, aby sa eliminoval GVHD účinok v momente, v ktorom je to klinicky potrebné.

<* <- r t r r. r r r _r r r r i. r ·· r. r : r ŕ r ~ f r ' <

-2V posledných rokoch sa vyprodukovali mnohé polyklonálne a monoklonálne protilátky proti ľudským povrchovým molekulám. V mnohých prípadoch sa protilátky vyrábali s priamym úmyslom in vivo usmrcovať bunky pozitívne nesúce danú molekulu, aby boli využité v imunoterapeutických protokoloch. Ako príklad, obmedzený na oblasť B lymfómu, boli produkované a charakterizované účinné protilátky proti CD20, CD19, CD40, CD22, CD52, CD38 molekulám a ešte aj iným (P. S. Multani a ďalší, J. Clin. Oncol., 16, 3691-3710, 1998). V niektorých prípadoch vykazovali protilátky nasmerované proti takýmto molekulám in vivo cytotoxicitu, pravdepodobne preto, že sú schopné aktivovať komplementový systém na povrchu cieľovej bunky, ako tomu je v prípade CD20, CD38 a CD52. V iných prípadoch boli protilátky konjugované s rádioaktívnymi molekulami, aby sa indukovala rádiolýza cieľových buniek, ako napríklad v prípade CD20, Lym-1 a iných. Iné protilátky boli s rovnakým cieľom konjugované s toxínmi bakteriálneho alebo rastlinného pôvodu, ako v prípade CD19, CD40 a CD22. Iné protilátky boli chimerizované na umožnenie bišpecificity, aby sa napríklad tesne priblížili dve bunky. Nakoniec, k mnohým z týchto protilátok existujú verzie upravené inžinierskymi technikami a/alebo humanizované verzie, ktoré umožňujú ich podávanie in vivo, a tým znižovanie rizika antigénnosti a zvyšovanie ich účinnosti.

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že je možné účinne kontrolovať problém ochorenia štep verzus hostiteľ použitím spôsobu zahŕňajúceho zavádzanie exogénneho povrchového antigénu do donorových T lymfocytov a následným podávaním protilátok nasmerovaných proti takémuto exogénnemu antigénu, recipientnému pacientovi.

Podstatou vynálezu je teda použitie protilátok proti antigénom, exprimovaným na povrchu B-lymfocytov, a neprítomným na normálnych ľudských T lymfocytoch, na prípravu prostriedkov na liečenie ochorenia štep verzus hostiteľ u pacientov, ktorí obdržali T lymfocyty transdukované takýmito antigénmi.

Exogénnym antigénom sa mieni akýkoľvek povrchový antigén, ktorý sa nenachádza na normálnych T lymfocytoch, ako napríklad antigény exprimované na e r o . , r f r .._frr.

-3povrchu B lymfocytov, ako CD20, CD19, CD40, CD22, CD52, atď. Samozrejme, že povrchový antigén sa vyberie tak, aby následne po reakcii so zodpovedajúcou protilátkou, nespôsobil negatívne alebo nežiadúce účinky na úrovni bunkových populácií, ktoré konštitutívne exprimujú daný antigén.

Výnimočne výhodný je CD20 povrchový antigén ľudských B lymfocytov, proti ktorému je komerčne dostupná humanizovaná monoklonálna protilátka (Rituximab®, Roche), ktorá sa používa na liečbu B lymfómov iných ako Hodgkinov lymfóm.

V súlade s vynálezom sa donorové T lymfocyty transdukujú vhodnými technikami s vybraným antigénom a potom sa obohatia prostredníctvom imunoafinitných metód, pred tým, ako sa injektujú do recipientného subjektu. V prípade, že. sa vyvinie ochorenie štep verzus hostiteľ, podajú sa protilátky proti danému antigénu, aby sa in vivo inaktivovali T lymfocyty, napríklad použitím cytotoxických mechanizmov sprostredkovaných komplementom.

Protilátka bude výhodne monoklonálna, výhodnejšie to bude humanizovaná monoklonálna protilátka. Dávky a spôsob podávania bude závisieť na mnohých faktoroch, vrátane celkového zdravotného stavu, hmotnosti, pohlavia a veku pacienta. Vo všeobecnosti sa protilátka bude podávať i.v. spôsobom v dávke v rozsahu od približne 50 do približne 500 mg/m² povrchu tela, jeden až trikrát denne, až kým takmer úplne nezmiznú cirkulujúce T lymfocyty.

Izolácia T lymfocytov bola opísaná v Rambaldi a ďalší, Blood, 91, 2189-2196, 1998.

Metódy na transdukciu T lymfocytov požadovaným antigénom sú dobre známe; pozri zhrnutie vo Verma I. M. a Somia N. v Náture, 389, 239-242, 1997. Použité môžu byť najmä vhodné vektory, ako napríklad retrovírusy, adenovírusy, adeno asociované vírusy, herpesvírusy, lentivírusy, atď. ,

Každý z týchto vektorov je zameraný na veľa odlišných typov organizmov: berúc do úvahy retrovírusy, príkladmi sú amfotropné, ekotropné a xenotropné vektory. Okrem toho bolo v priebehu rokov využívaných mnoho rozličných baliacich bunkových línií, aby sa optimalizovala produkcia takýchto rekombinantných retrovírusov, a aby sa garantovala lepšia manipulácia a bezpečnosť producentov (I. M. Verma a ďalší, Náture, 389, 239-242, 1997; M. A. Kay a ďalší, Gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12744-12746, 1997).

V súčasnosti sa do cieľových buniek zavádza aj nahá DNA, prostredníctvom jej konjugácie s polykatiónovými alebo lipozómovými komplexmi, elektroporáciou, precipitáciou v slaných tlmivých roztokoch a inými technikami.

Cieľom genetického prenosu boli mnohé rozličné typy buniek: T a B lymfocyty, nezrelé hematopoetické prekurzory, svalové bunky, fibroblasty, hepatocyty a iné bunkové typy (I. M. Verma a ďalší, Náture, 389, 239-242, 1997; M. A. Kay a ďalší, Gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12744-12746, 1997).

V prípade CD20 antigénu sa použil amfotropný retrovírus, ktorý je odvodený od Moloney hlodavčieho leukemického vírusu a balí sa v embryotických obličkových ľudských bunkách (293 T), ktoré sú skonštruované tak, aby obsahovali retrovírusové štrukturálne elementy na oddelených plazmidoch (Human Gene Therapy, 7, 1405-1413,1996). Predmetom predloženého vynálezu sú takéto vektory, ako aj T lymfocyty transdukované exogénnym antigénom, najmä CD20+ T lymfocyty.

Po genetickom prenose predstavujú bunky, ktoré signifikäntne exprimujú exogénny gén, len menšinu z celkovej populácie. Uskutočňuje sa selekcia, ktorej výsledkom sú transdukované bunky, použitím exogénnych génov, ktoré sú schopné poskytnúť selektívnu výhodu bunke. Transdukované bunky sa môžu selektovať aj alternatívnymi metódami, ako napríklad FACS triedením s protilátkami proti exogénnym antigénom (K. Philips a ďalší, Náture Medicíne, 2, 10, 1154-1155,

1996). Ďalšími metódami sú imunoafinitné kolóny alebo predadsorbované kultivačné platne na panning procedúru a podobne.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Schéma plazmidu LTR CD20 LTR

LTR = dlhé koncové opakovanie; pUC = plazmidový počiatok replikácie; Puro = gén, ktorý poskytuje puromycínovú rezistenciu; PGK1 = promótor fosfoglyceraldehyd kinázy; EBNA1 a OriP = elementy odvodené od EBV vírusu na epizomálnu replikáciu; AmpR = gén ampicilínovej rezistencie.

Obrázok 2: Infekcia CEM bunkovej línie s CD20 a imunoselekcia r r r r r r r c r·. r .. ' r·- r r

-5Horný panel A: CEM bunková línia po vírusovej infekcii analyzovaná na cytofluorimetri s fluorescenčnou kontrolnou lgG1 protilátkou.

Stredný panel B: rovnaká populácia analyzovaná s fluorescenčnou anti CD20 protilátkou.

Spodný panel C: rovnaká populácia po imunoselekcii na afinitných kolónach analyzovaná s fluorescenčnou anti CD20 protilátkou.

Obrázok 3: Infekcia čerstvých ľudských T lymfocytov s CD20 vírusom

Horný panel A: po infekcii sa lymfocyty značia s PE lgG2a a FITC lgG1 kontrolnými protilátkami.

Spodný panel B: rovnaká populácia je označená s CD20 PE a CD3 FITC protilátkami. V znázornenom prípade bolo 23 % buniek dvojito pozitívnych.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Konštrukcia plazmidu LTR CDD20 LTR

913-nukléotidový fragment ľudskej CD20 cDNA obsahujúci celú kódujúcu sekvenciu sa získal prostredníctvom PCR z plazmidu pCMV CC20 (Becker a ďalší, Science, 249, 912-915,1990).

Na amplifikáciu sa 40 ng plazmidu dalo do konečného reakčného objemu 100 μΙ v 10 mM KCI, 10 mM (NH^SCU, 20 mM Tris HCI, pH 8,75, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 100 pg/ml BSA, v prítomnosti 0,8 μΙ roztoku 2,5 mM dNTP, 500 ng primeru sense (CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC), 500 ng primeru antisense (CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT) a 5U Pfu DNA polymerázy od Stratagene (La Jolla, CA, USA). Reakcia sa uskutočňovala v 26 cykloch v cykleri podľa nasledujúcej schémy ľ pri 95 °C, ľ pri 60 °C a 2’ pri 72 °C. Na konci reakcie sa pridalo 100 μΙ roztoku fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu v pomere 25:24:1 a po extrakcii sa DNA precipitovala cez noc pri 20 °C v prítomnosti etanolu. Po centrifugácii sa DNA resuspendovala v 100 μΙ vody a potom sa

-6subklonovala do pMOS vektora (Amersham Italia, srl, Taliansko) v súlade s inštrukciami výrobcu nachádzajúcimi sa v kite pMOS blunt ended cloning kit. Výsledný rekombinantný plazmid sa amplifikoval a sekvenoval a potom sa poštiepil s BamHI, ktorej rozoznávacie miesto (G/GATCC) sa nachádza v koncoch oboch primerov. Preto sa fragment subklonoval do BamHI miesta retrovírusového vektora PINCO VUOTO. Retrovírusový vektor PINCO VUOTO sa predtým získal po vyrezaní 144 bp fragmentu, obsahujúceho CMV promótor (cytomegalovírusový) a EGFP (zosilnený zelený fluorescenčný proteín) gén, s EcoRI a Notl z plazmidu PINCO (F. Grignani a ďalší, Cancer Res., 58, 14-19, 1998). Po vyrezaní EcoRI-Notl fragmentu sa plazmid uzavrel po zatupení koncov s Klenowovým fragmentom a označil sa PINCO VUOTO. Takýto retrovírusový vektor má teraz dĺžku 11448 bp.

Rekombinant medzi PINCO VUOTO a CD20 cDNA sa označil LTR-CD20LTR a osekvenoval sa, aby sa skontrolovalo klonovanie a integrita CD20 cDNA, ako aj absencia stop kodónov pred prvým ATG (obrázok 1).

LTR-CD20-LTR konštrukt sa teda skladá z retrovírusovej časti, LTR odvodeného z Moloney hlodavčieho leukemického vírusu (MoMLV), ďalších retrovírusových sekvencii odvodených od Moloney vírusu, CD20 cDNA v BamHI mieste a z druhého LTR, ako je podrobne znázornené na priloženom obrázku 1. Zvyšok plazmidu je rovnaký ako PINCO plazmid (F. Grignani a ďalší, Cancer Res., 58, 14-19, 1998), ktorý obsahuje, ako je znázornené na obrázku, EBNA-1 a OriP elementy z Epstein Barrovej vírusu, počiatok replikácie (pUC) a gén ampicilínovej rezistencie, ako aj gén puromycínovej rezistencie riadený PGK-1 promótorom.

Príklad 2

Transfekcia LTR-CD20-LTR plazmidu v baliacich bunkách

Aby sa produkovali retrovírusy, transfekovali sa baliace bunky PhoenixAmpho s LTR-CD20-LTR plazmidom.

Phoenix-Ampho bunky sú odvodené od ľudskej embryotickej obličkovej 293 bunkovej línii po niekoľkých modifikáciách. Na začiatku sa transfekovali s E1A génom z adenovírusu a potom sa transfekovali dvoma separátnymi plazmidmi kódujúcimi štrukturálne gény gag a pol z Moloney MLV pod kontrolou Rous

-7Γ r P r e r C r r r r c f r e r r f r <- <

r - ' r r sarkómového vírusového promótora a env gén z Moloney MLV pod kontrolou cytomegalovírusového promótora.

V deň -1 sa 1,5 x 10⁶ buniek vysialo na Petriho misku s priemerom 10 cm v 10 ml DMEM média (Gibco, Seromed, Berlín, Nemecko), do ktorého bol pridaný 10% FCS (Hiclone Laboratories, Steril Systém, Logan, UK) a udržiavali sa v 5% CO₂ inkubátore pri 37 °C. V deň 0 sa pridalo 16 μΙ chlorochínu (zásobný roztok 25 mM v PBS) a po 10’ sa pridal 1 ml roztoku 10 pg plazmidovej DNA. Na získanie takéhoto DNA roztoku sa do 15ml kónickej skúmavky pridalo 500 μΙ roztoku 2 x HBS (50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM KCI, 12 mM dextróza, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄ (FW 141,96)). Následne sa v druhej 15ml skúmavke pripravilo 500 μΙ roztoku s 10 pg DNA, 61 μΙ 2M CaCI₂ a sterilnou vodou. Potom sa DNA zmes po kvapkách pridala do prvej skúmavky a získaný precipitát sa potom pridal ku bunkám.

Po 8 hodinách sa médium nahradilo 10 ml čerstvého DMEM.

Na deň +1 sa médium nahradilo 5 ml čerstvého RPMI 1640 média, do ktorého sa pridal 10% FCS.

Na deň +2 sa uskutočnila infekcia odobratím 5 ml média obsahujúceho retrovírusy vylučované v priebehu kultivácie.

Príklad 3

Infekcia CEM bunkovej línie s LTR-CD20-LTR retrovírusom x 10⁶ Ľudských T lymfoblastoidných CEM buniek rastúcich v suspenzii v RPMI 1640 médiu doplnenom 10% FCS a glutamínom sa peletovalo centrifugovaním pri 1200 ot./min. 8’ v 24-jamkovej platni s plochým dnom (Falcon, Becton Dickinson and Company, NY). Po odstránení supernatantu sa pridal 1 ml vírusového supernatantu prefiltrovaním cez 0,45μηη filtre (Millipore Corporation Bedford, MA) v prítomnosti 1 μΙ Polybrénu (zásobný roztok 4 mg/ml v PBS).

Platňa sa potom centrifugovala 45’ pri 1800 ot./min. pri laboratórnej teplote a potom sa odstránil supernatant a nahradil sa 1 ml čerstvého RPMI 1640 s prídavkom 10% FCS a následne sa inkubovala ďalších 6 hodín.

r r f ŕ ŕ .-8Na konci inkubovania sa zopakovala infekčná procedúra druhýkrát použitím odlišnej Petriho misky predtým pripravených baliacich buniek.

Príklad 4

FACS analýza CD20+ CEM

CEM bunky po retrovírusovej infekcii s LTR-CD20-LTR sa udržiavali v inkubátore a normálne rástli v RPMI 1640 médiu s prídavkom 10% FCS. Po dvoch dňoch už mohli byť CEM bunky testované imunofluorescenčnou analýzou na prítomnosť CD20 markera na povrchu.

0,1 x 10⁶ Buniek sa prenieslo do 1,5ml Eppendorfovej skúmavky, scentrifugovalo sa pri 4000 ot./min. počas 3’, resuspendovalo sa v 50 μΙ roztoku fluorescenčnej anti CD20 1F5 protilátky (Becton Dickinson) a udržiavalo sa 30’ pri 4 °C. Nakoniec sa pridalo 500 μΙ roztoku 0,9% NaCl, 5% FCS, 0,02% Na azidu a bunky sa centrifugovali pri 4000 ot./min. v priebehu 5’. Potom sa vzorka rozsuspendovala v 100 μΙ PBS roztoku obsahujúcom formaldehyd a potom sa udržiavala pri 4 °C až do odčítavania na fluorocytometri.

V mnohých experimentoch viedla táto infekčná procedúra vždy k CEM CD20+ bunkám v rôznom percentuálnom zastúpení od 30 do 60 %, zatiaľ čo neinfikovaná bunková línia bola úplne negatívna z hľadiska expresie CD20 (ako príklad pozri obrázok 2, stredný panel znázorňujúci CEM populáciu, ktorá je na 40 % CD20+).

Príklad 5

Imunoafinitná separácia

CEM bunky infikované s LTR-CD20-LTR vírusom mohli byť po dvoch dňoch obohacované o CD20+ populáciu prostredníctvom imunoafinitných kolón. Za týmto účelom sa bunky najprv inkubovali 30’ pri 4 °C s CD20 protilátkovou kolónou 1F54, potom sa trikrát premývali s PBS a 2,5% ľudským sérovým albumínom a nakoniec r e C r r e r r r f i r r ' r V <·

-9sa inkubovali ďalších 30’ pri 4 °C s roztokom mikroguľôčok potiahnutých kozou anti myšou IgG protilátkou (Milteny Biotech, Bergish-Gladbach, Nemecko).

Nakoniec sa bunky rozsuspendovali v médiu RPMI 1640 a selektovali sa prostredníctvom pasážovania na XS+ kolóne v SuperMACS systéme (Milteny Biotech). Potom sa kolóna eluovala s fyziologickým roztokom s prídavkom 2,5% albumínu a kolóna sa vybrala zo SuperMACS a premyla sa, aby sa izolovali pozitívne frakcie.

Pozitívna frakcia sa ďalej analyzovala na cytofluorimetri, pričom predtým sa bunky značili podľa priameho imunofluorescenčného postupu, ktorý bol opísaný vyššie.

Percento CD20+ populácie bolo na konci tohto postupu vždy vyššie ako 90 %. Ako príklad pozri obrázok 2, spodný panel, na ktorom je znázornená CEM populácia po obohacovaní imunoafinitou, ktorá je CD20+ pozitívna na 98 %.

Nakonieč sa CEMCD20+ populácia pestovala v suspenzii a expandovala v médiu RPMI s prídavkom 10% FCS v inkubátore. V pravidelných intervaloch sa táto populácia študovala z hľadiska expresie CD20 markera na povrchu a tak sa ukázala stabilita markera v priebehu viac ako dvoch mesiacov a pozitivita vybraných buniek prevyšujúca 90 %.

Príklad 6

Infekcia periférnych čerstvých T lymfocytov s LTR-CD20-LTR vírusom

Heparinizovaná celková krv sa stratifikovala na Ficcole a centrifugovala sa 30’ pri 1500 ot./min. pri laboratórnej teplote. Bunky zhromaždené na rozhraní sa premyli s PBS a scentrifugovali sa pri 1500 ot./min. 10’ pri laboratórnej teplote, potom sa ešte dvakrát scentrifugovali pri 1000 ot./min. 10’ pri laboratórnej teplote a nakoniec sa znova rozsuspendovali v RPMI 1640 s 10% FCS v koncentrácii 1 x 10⁶/ml v 24-jamkových platniach s plochým dnom, pričom sa do každej jamky dávali 2 ml bunkovej suspenzie v prítomnosti PHA (Murex) a v koncentrácii 1 pg/ml pri 37 °C a 5% CO2 na jednu noc.

Na druhý deň sa pridal ľudský rekombinantný IL-2 (Proleukin, Chiron Italia,

Miláno, Taliansko) do končenej koncentrácie 100 U/ml.

-10Na tretí deň sa po premytí a spočítaní buniek infikovalo 1 x 10⁶ buniek v 1 ml média v jednej jamke v 24-jamkovej platni. Po scentrifugovaní pri 1200 ot./min. 10’ sa supernatant odstránil a nahradil 1 ml filtrovaného vírusu v prítomnosti polybrénu a nasledovala centrifugácia počas 45’ pri 1800 ot./min. pri laboratórnej teplote, ako vo vyššie uvedenom protokole.

Nakoniec sa vírusový supernatant odstránil a nahradil kompletným médiom na 6 hodinovú inkubáciu a potom sa opakovala centrifugačná infekčná procedúra. Potom sa bunky znova rozsuspendovali v kompletnom médiu v prítomnosti IL-2 a nechali sa stáť v inkubátore cez noc.

Celý postup sa opakoval nasledujúce dva dni a nakoniec sa bunky udržiavali ďalšie dva dni v kultúre v inkubátore.

Potom sa bunky označili, rovnakým postupom ako bolo opísané 'vyššie, s monoklonálnymi protilátkami CD20 FITC, anti CD3 PE, anti CD4 PE a anti CD8 FITC (Becton Dickinson) a potom sa analyzovali na cytofluorimetri.

Veľa experimentov na normálnych darcoch ukázalo, že rôzne percento, v rozsahu od 5 % do 25 %, CD3+ T lymfocytov získalo CD20 marker pri dvojitej fluorescenčnej analýze. Jeden takýto experiment je znázornený na obrázku 3. V tomto konkrétnom prípade sa získala 23% CD3/CD20 dvojitá pozitivita.

Príklad 7

Štúdium lýzy indukovanej protilátkou a komplementom v populáciách čerstvých ľudských T lymfocytov po CD20 génovej transdukcii x 10⁵ transdukovaných lymfocytov sa po alikvotách rozdelilo do 10ml skúmaviek s okrúhlym dnom v 500 μί RPMI 1640 média s prídavkom 10% teplom inaktivovaného fetálneho teľacieho séra. Potom sa pridala Rituximab protilátka do konečnej koncentrácie 350 g/ml a králičí Pel zmrazený komplement v končenej koncentrácii 10 %.

Alternatívne sa ako zdroj komplementu môže pridať ľudské AB sérum do konečnej koncentrácie 30 %. Bunky sa nechali jednu hodinu pri 37 °C vo vodnom kúpeli s udržiavanou teplotou za stáleho pretrepávania. Pridala sa bunková suspenzia s rovnakým objemom 1x roztoku akridínovej oranže v PBS (zásobný e © r r ·· ^r t r e r r e r t- r © r e r r r í» © e r r e <·.

f f n ŕ r r <-· r - .· r r

- 11 100x roztok pozostáva z 30 mg v 100 ml destilovanej vody) a bunková suspenzia sa hodnotila na cytofluorimetri. Živé bunky emitujú zelenú fluorescenciu a počítali sa ako percento celkovej analyzovanej populácie. Touto rýchlou metódou mohla byť stanovená smrtiaca účinnosť Rituximab®u na CD20+ bunky, v porovnaním s percentami dvojito pozitívnych CD3/CD20 buniek v odlišných študovaných populáciách a percentami usmrtených buniek po pridaní Rituximab®. Ako je uvedené v tabuľke, kontrolnými populáciami boli rovnaké bunky, ktoré boli vystavené buď len protilátke, alebo len komplementu. Údaje uvedené v tabuľke dokazujú, že hodinová expozícia Rituximab®u indukuje takmer 90% smrť CD3/CD20+ buniek.

Tabuľka,

Na komplemente závislá cytotoxicita čerstvých ľudských T lymfocytov transdukovaných s CD20

	% špec. lýzy
% CD3/CD20+ lymfocytov	len Rituximab®	len komplement	Rituximab® plus komplement
Donor 1	30	0	14	33
Donor 2	23	0	11	35
Donor 3	15	0	5	18

Percento lýzy bolo stanovené na FACS po farbení s akridínom.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie protilátok proti antigénom, exprimovaným na povrchu Blymfocytov, a neprítomným na normálnych ľudských T lymfocytoch, na prípravu prostriedkov na liečenie ochorenia štep verzus hostiteľ u pacientov, ktorí obdržali T lymfocyty transdukované takýmito antigénmi.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde sa používajú protilátky proti CD20 povrchovému antigénu a lymfocyty transdukované CD20 antigénom.
3. 3. Použitie podľa nároku 2, kde CD20 protilátkou je humanizovaná monoklonálna protilátka.
4. 4. Vektory na transfekciu ľudských T lymfocytov s antigénmi exprimovanými na povrchu B-lymfocytov, a neprítomnými na normálnych ľudských T lymfocytoch.
5. 5. Vektory podľa nároku 4, ktoré zahŕňajú gén kódujúci ľudský CD20 antigén.
6. 6. Ľudské T lymfocyty transdukované antigénmi exprimovanými na povrchu B-lymfocytov, a neprítomnými na normálnych ľudských T lymfocytoch.
7. 7. T lymfocyty podľa nároku 6, transdukované ľudským CD20 antigénom.