BG106193A - Използване на антитела срещу cd20 за лечение на заболявания при трансплантации - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до използването на антитела срещу екзогенни повърхностни антигени, които неприсъстват върху нормални човешки Т-лимфоцити, заполучаването на препарати за лечение на заболявания на отхвърляне на трансплантации от гостоприемника в пациенти, които са получили Т-лимфоцити, преобразувани с такива екзогенни повърхностни антигени. Изобретението се отнася до вектори за трансфекция на човешки Т-лимфоцити с екзогенни повърхностни антигени и човешки Т-лимфоцити, преобразувани с екзогенни повърхностни антигени.

Description

Сега е открито, че е възможно ефективно контролиране на проблема с отхвърлянето на присадка от гостоприемника чрез използването на метод, характеризиращ се с въвеждането на екзогенен повърхностен антиген в Т лимфоцитите на донора и последващото прилагане на приемащия пациент на антителата, насочени срещу този екзогенен антиген.

С понятието екзогенен антиген се има предвид всеки повърхностен антиген, който не присъства върху нормални Т лимфоцити, както е случаят с антигените, експресирани върху повърхността на В лимфоцитите като CD20, CD 19, CD40, CD22, CD52 и др. Очевидно повърхностният антиген ще бъде така подбран, че след реакцията със съответното антитяло да не предизвиква негативни или нежелани ефекти на нивото на клетъчните популации, които непрекъснато експресират антигена.

Особено предпочитан е CD20 повърхностният антиген на човешките В лимфоцити, срещу който има в търговската мрежа хуманизирано моноклонално антитяло (Rituximab®, Roche), което се използва при лечението на В не-Ходжкин лимфоми.

Съгласно изобретението Т лимфоцити на донора се преобразуват чрез подходящи техники с избрания антиген и след това се набогатяват с помощта на имуноафинитетни методи преди да бъдат инжектирани в субекта приемник. В случай, че се развива болест на отхвърляне на присадка от гостоприемника, се дава антитялото срещу антигена, за да се инактивират in vivo Т лимфоцитите чрез използването, например, на опосредствани от добавка цитотоксични механизми.

Антитялото по-специално е моноклонално, още по-специално то ще е хуманизирано моноклонално антитяло. Дозировката и начинът на приемане ще зависят от много фактори, включващи общия здравословен статус, теглото, пола и възрастта на пациента. Най-общо антитялото ще бъде давано по венозен път в дозировка от около 50 до около 500 mg/m от телесната повърхност, един до три пъти на ден до почти пълното изчезване на циркулиращите Т лимфоцити.

Изолирането на Т лимфоцити е описано от Rambaldi et al., Blood, 91, 2189-2196, 1998.

Методите за преобразуване на Т лимфоцитите с желания антиген са добре познати: като референция виж обзора на Verma I.M. и Somia N. в Nature, 389, 239-242, 1997. В частност могат да се използват подходящи вектори, такива като ретровируси, аденовируси, аденосвързани вируси, херпесвируси, лентивируси и др.

Всеки от тези вектори на свой ред включва много различни типове организми: относно ретровирусите примери са амфотропни, екотропни и ксенотропни вектори. Нещо повече, през годините са били използвани много различни опаковащи клетъчни линии за оптимизиране на получаването на подобни рекомбинантни ретровируси и за гарантиране на по-добро манипулиране и безопасност за производителите (I.M. Vetma et al., Nature, 389, 239242, 1997; M.A. Kay et al., Gene Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12744-12746, 1997).

Неотдавна беше въведена и гола ДНК в целеви клетки чрез конюгация с поликатионни или липозомни комплекси, електропорация, преципитация в солеви буфери и други техники.

Много различни клетъчни видове са били мишени на генетичен трансфер: Т и В лимфоцити, незрели хематополетични прекурсори, мускулни клетки, фибробласти, хепатоцити и други типове клетки (I.M. Vetma et al., Nature, 389, 239-242, 1997; M.A. Kay et al., Gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12744-12746, 1997).

В случая c антигена CD20 е бил използван амфотропен ретровирус, който се получава от вируса на Молони миша левкемия и е пакетиран в ембрионални бъбречни човешки клетки (293 Т), конструирани така, че на отделни плазмиди да съдържат ретровирусните структурни елементи (Human Gene Therapy, 7, 14051413, 1996). Такива вектори, както и Т лимфоцитите, преобразувани с екзогенния антиген, особено CD20+ Т лимфоцитите, са обект на настоящото изобретение.

След генетичния пренос клетките, които значително експресират екзогенния антиген, съставляват само малка част от общата популация. Провеждат се селективни процедури при преобразуваните клетки с помощта на екзогенни гени, които са в състояние да придадат на клетката селективно предимство. Преобразуваните клетки могат да бъдат селектирани и по алтернативни методи, такива като FACS сортиране с антитела срещу екзогенните антигени (K.Phillips, et al., Nature Medicine, 2, 10, 11541155, 1996). Други- методи са имуноафинитетни колони или предварително адсорбирани плаки за култивиране за процедурата по промиване и подобни.

Описание на фигурите

Фигура 1: Схема на плазмида LTR CD20 LTR;

LTR = дълъг терминален повтор; pUC = плазмидно начало на репликация; Puro = ген, който обуславя устойчивост на пуромицин; PGK1 = промотор на фосфоглицералдехид киназата; EBNA1 и OriP = елементи, получени от EBV вируса за епизомалната репликация; AmpR = ген за устойчивост на ампицилин.

Фигура 2: Инфектиране на клетъчна линия СЕМ с CD20 и имунселекция

Ляв панел А: клетъчна линия СЕМ след вирусна инфекция, анализирана чрез цитофлуориметър с флуоресцентна контрола антитяло IgGl.

Централен панел Б: същата популация, анализирана с флуоресцентно анти CD20 антитяло.

Десен панел В: същата популация след имуноселекция на афинитетни колони, анализирана с флуоресцентно анти CD20 антитяло.

Фигура 3: Инфектиране на човешки свежи Т лимфоцити с CD20 вирус

Ляв панел А: след инфектирането лимфоцитите са белязани с РЕ IgG2a и FITC IgGl контролни антитела.

Десен панел Б: същата популация е белязана с анти CD20 РЕ и анти CD3 FITC антитела. При показания случай 23 % от клетките са двойно положителни.

Следващите примери илюстрират изобретението в по-големи подробности. Пример 1

Конструиране на плазмида LTR CD20 LTR

Фрагмент от 913 нуклеотида от човешка кДНК за CD20, съдържащ цялата кодираща последователност, е получен чрез PCR от плазмида pCMV CD20 (Becker et al., Science, 249, 912-915, 1990).

За амплифицирането, 40 ng от плазмида бяха доведени до краен реакционен обем от 100 μΐ в 10 mM КС1, 10 mM (NH^SC^, 20 тМ Tris HCI, pH 8.75, 2 mM MgSO₄, 0.1 % Triton Х-100, 100 pg/ml BSA, в присъствие на 0.8 μΐ от разтвор на 2.5 mM dNTP, 500 ng от “прав” праймер (CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC), 500 ng от “обратен” праймер (CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTCT) и 5U Pfu ДНК полимераза от Stratagene (La Jolla, СА, USA). Реакцията беше проведена в 26 цикъла в PCR апарат по схемата: 1 min при 95°С, 1 min при 60°С и 2 min при 72°С. В края на реакцията бяха добавяни 100 μΐ от разтвор на 25:24:1 фенол - хлороформ изоамилов алкохол и след екстрахирането ДНК беше преципитирана за една нощ при 20°С в присъствие на етанол. След центрофугиране ДНК беше суспендирана в 100 μΐ вода и след това субклонирана във вектор pMOS (Amersham Italia srl, Italy) според инструкциите на производителя, съдържащи се в кита “pMOS Blunt ended cloning kit”. Полученият рекомбинантен плазмид беше амплифициран и секвениран и след това срязан с ВатШ, който разпознава място за срязване G/GATCC, намиращо се в краищата и на двата праймера. Затова фрагментът беше субклониран в мястото BamHI на ретровирусния вектор PINCO VUOTO. Ретровирусният вектор PINCO VUOTO беше получен преди това чрез изрязване с EcoRI и Notl на 1441 Ьр фрагмент, съдържащ промотора на CMV (Цитомегаловирус) и гена EGFP (белтък с усилена зелена флуоресценция) от плазмида PINCO (F. Grignani et al., Cancer Res., 58, 14-19,1998). След изрязване на фрагмента EcoRI-Notl, плазмидът беше затворен след получаване на тъпи краища с помощта на Кленов фрагмент и беше наречен PINCO VUOTO. Такъв ретровирусен вектор е с дължина 11448 Ьр.

Рекомбинантът, получен между PINCO VUOTO и кДНК за CD20, беше наречен LTR-CD20-LTR и секвениран, за да се провери клонирането и интегрирането на кДНК за CD20, както и липсата на стоп кодони в посока нагоре от първия ATG (Фиг.1).

Конструктът LTR-CD20-LTR е изграден от, за ретровирусната част - LTR, произхождаща от Вируса на миша левкемия Молони (MoMLV), друга ретровирусна последователност, получена от вируса Молони, кДНК за CD20 в BamHI мястото за срязване и втората LTR, както е показано в детайли в приложената Фиг. 1.

Останалата част от плазмида е идентична на плазмида PINCO (F. Grignani et al., Cancer Res., 58, 14-19, 1998), който съдържа, както е показано на фигурата, EBNA-1 и ОпР елементи от вируса ЕпщайнБар, началото на репликация (pUC) и гена за устойчивост на ампицилин, както и гена за устойчивост на пуромицин под контрола на промотора PGK-1.

Пример 2

Трансфекция на плазмид LTR-CD20-LTR в пакетиращи клетки

За да се произведат ретровируси, пакетиращите клетки PhoenixAmpho бяха трансфектирани с плазмида LTR-CD20-LTR.

Клетките Phoenix-Ampho бяха получени от клетъчна линия 293 от човешки ембрионален бъбрек с помощта на няколко модификации; първоначално те бяха инфектирани с Е1А ген от аденовирус и след това трансфектирани с два отделни плазмида, кодиращи структурните гени gag и pol от Молони MLV под контрола на промотор от Раус саркома вирус и гена env от Молони MLV под контрола на промотор от цитомегаловирус.

1.5 х 10⁶ клетки бяха инокулирани на ден -1 в петриева паничка с диаметър 10 cm в 10 ml среда DMEM (Gibco, Seromed, Berlin, Germany), към която беше добавен 10 % FCS (Hiclone Laboratories, Steril System, Logan, UK) и поставени в инкубатор с 5 % СО₂ при 37°С. На ден 0 бяха добавени 16 μΐ хлороквин (концентриран разтвор 25 тМ в PBS) и след 10 min беше добавен 1 ml разтвор на 10 pg плазмидна ДНК. За да се получи такъв разтвор на ДНК 500 pl от разтвор 2Х HBS (50 mM HEPES, pH 7.05, 10 тМ КС1, 12 тМ глюкоза, 280 тМ NaCl, 1.5 тМ Na₂HPO4 (FW 141.96)) бяха добавени в конична епруветка от 15 ml. След това, във втора епруветка от 15 ml, беше приготвен 500 pl разтвор от 10 pg ДНК, 61 pl CaCl 2М и стерилна вода. След това ДНК сместа беше добавяна на капки към първата епруветка и полученият преципитат беше след това добавян към клетките.

След 8 часа средата беше заменена с 10 ml свежа DMEM.

На ден +1 средата беше заменена с 5 ml свежа среда RPMI 1640, към която бе добавен 10 % FCS.

На ден +2 беше проведено инфектирането чрез отстраняване на 5 ml от средата, съдържаща ретровирусите, освободени по време на култивирането.

Пример 3

Инфектиране на клетъчна линия СЕМ с ретровирус LTR-CD20LTR χ 10⁶ човешки Т лимфобластоидни СЕМ клетки, растящи в суспензия в среда RPMI 1640, към която са добавени 10 % FCS и глутамин, бяха утаени чрез центрофугиране при 1200 об¹ за 8 min в плоскодънна плака с 24 гнезда (Falcon, Becton Dickinson and Company, NY). След отстраняване на супернатантата 1 ml от вирусната супернатанта беше добавен чрез филтруване през 0.45 pm филтри (Millipore Corporation Bedford, МА) в присъствие на 1 pl Полибрен (концентриран разтвор 4 pg/pl в PBS).

Плаката след това беше центрофугирана за 45 min при 1800 об'¹ при стайна температура и след това супернатантата беше отстранена и заменена с 1 ml свежа RPMI 1640 с 10 % FCS и след това инкубирана за допълнителни 6 часа.

В края на инкубацията, процедурата на инфектиране беше повторена още веднъж, използвайки различна, предварително приготвена петриева паничка с пакетиращи клетки.

Пример 4

FACS анализ на CD20+ СЕМ

Клетки СЕМ, след ретровирусна инфекция с LTR-CD20-LTR, бяха поддържани в инкубатор и обикновено култивирани в среда RPMI 1640 с 10 % FCS. След 2 дни СЕМ клетките вече можеха да бъдат изследвани чрез имунофлуоресцентен анализ за присъствие на маркер CD20 на повърхността.

0.1 х 10⁶ клетки бяха прехвърляни в 1.5 ml епруветка Епердорф, центрофугирани при 4000 об'¹ за 3 min, ресуспендзирани в 50 μΐ от разтвор на флуоресцентно анти CD20 1F5 антитяло (Becton Dickinson) и инкубирани за 30 min при 4°С. В края на инкубацията бяха добавени 500 μΐ от разтвор на 0.9 % NaCl, 5 % FCS, 0.02 % Na азид и клетките бяха центрофугирани при 4000 об'¹ за 5 min. След това пробата беше ресуспендирана в 100 μΐ разтвор на PBS, съдържащ. 1% формалдехид и след това поддържана при 4°С до отчитането й на флуороцитометър.

В много експерименти тази процедура на инфектиране винаги даваше СЕМ CD20+ клетки в различни проценти: от 30 до 60 %, докато неинфектираната клетъчна линия беше напълно отрицателна по отношение на CD20 експресията (като пример виж Фиг. 2, централен панел, показваща популация СЕМ, която става 40 % CD20+.).

Пример 5

Имуноафинитетно разделяне

Клетки СЕМ, инфектирани с вирус LTR-CD20-LTR, след два дни култивиране могат да бъдат набогатени на CD20+ популация чрез имуноафинитетни колони. За тази цел клетките първоначално се инкубират за 30 min при 4°С с анти CD20 антитяло, клон 1F54 и

след това се промиват трикратно с PBS и 2.5 % човешки серумен албумин, и най-накрая се инкубират за още 30 min при 4°С с разтвор на микроперли, покрити с анти миши IgG антитяло (Milteny Biotech,

Bergish-Gladbach, Germany).

Най-накрая клетките бяха ресуспендирани в среда RPMI 1640 и селекционирани чрез прехвърляне върху XS+ колона в система SuperMACS (Milteny Biotech). След това колоната беше елуирана с физиологичен разтвор с добавен 2.5 % албумин и след това колоната беше отстранена от системата SuperMACS и промита с цел да се изолира положителната фракция.

Положителната фракция беше след това анализирана с цитофлуориметър след маркиране на клетките съгласно процедурата за пряка имунофлуорисценция, описана по-горе.

Процентът на CD20+ клетките в края на тази процедура винаги беше над 90 %. Като пример виж Фиг. 2, десен панел, където е показана СЕМ популация след обогатяване чрез имуноафинитетност, което е CD20+ положително при 98 %.

На края СЕМ CD20+ популацията беше култивирана в суспензия в среда RPMI 1640 с 10 % FCS в термостат. През определени интервали от време, тази популация беше анализирана за експресията на CD20 маркер на повърхността и беше установена стабилност на маркера за повече от два месеца и положителност на селекционираните клетки повече от 90 %.

Пример 6

Инфектиране на периферни Т лимфоцити с LTR-CD20-LTR вирус

Хепаризинирана пълноценна кръв беше нанесена върху Ficoll и центрофугирана на стайна температура за 30 min при 1 500 об'¹.

Събраните на повърхността клетки бяха промити с PBS и центрофугирани на стайна температура при 1500 об’¹ за 10 min, след това допълнително двукратно центрофугирани на стайна температура при 1000 об'¹ за 10 min и след това ресуспендирани в RPMI 1640 с 10 % FCS при концентрация 1 х 10⁶ клетки / ml, след това 2 ml клетъчна суспензия беше поставена в присъствието на РНА (Мигех) с концентрация 1 pg/ml в плака с 24 гнезда с плоско дъно и инкубирани при 5 % СО₂ за една нощ.

На втория ден, бяха добавени човешки рекомбинантен IL-2 (Proleukin, Chiron Италия, Милано, Италия) до крайна концентрация 100 U/ml.

На третия ден след промивка и преброяване на клетките, 1 х 10⁶ клетки бяха инфектирани в 1 ml среда в едно гнездо с плоско дъно в плака с 24 гнезда. След центрофугиране при 1200 об'¹ за 10 min, супернатантата беше отстранена и заместена с 1 ml филтруван вирус в присъствието на полибрен и последващо центрофугиране на стайна температура при 1800 об’¹ за 45 min, както е описано в протокола по-горе.

Накрая, вирусната супернатанта беше отстранена и заместена с пълноценна среда, пробите бяха инкубирани 6 часа и след това процедурата по центрофугиране беше повторена. След това клетките бяха ресуспендирани в пълноценна среда в присъствието на IL-2 и оставени да престоят в инкубатор за една нощ.

Пълната процедура беше двукратно повторена през следващите два дни и накрая клетките бяха съхранени в култура в инкубатор за два допълнителни дни.

След това клетките бяха белязани с моноклонални антитела:

анти CD20 FITC, анти CD3 РЕ, анти CD4 РЕ, и анти CD8 FITC (Becton Dikinson), следвайки същата процедура, описана по-горе и след това анализирани с цитофлуориметър.

Много експерименти с нормални донори показват, че вариране на процента от 5 % до 25 % CD3+ Т лимфоцити изисква CD20 маркер при анализ с двойна флуоресценция. Един такъв експеримент е показан на Фиг. 3, в този специфичен случай беше постигната 23 % наличието на двойна CD3/CD20 положителна реакция.

Пример 7

Изследване на лизиса, индуциран от антитяло и добавка в популация на неконсервирани човешки Т лимфоцити след трансдукция с CD20 ген х 10⁵ подложени на трасдукция лимфоцити бяха поставени в 10 ml обло дънни епруветки в 500 μΐ RPMI 1640 среда с добавени 10 % термично инактивиран ембрионален говежди серум. След това се добавя антитяло Rituximab до крайна концентрация 350 g/ml и замразена заешка Pel добавка до крайна концентрация 10 %.

Алтернативно, като източник на добавка може да бъде добавен човешки АВ серум до крайна концентрация 30 %. Клетките се оставят за един час при температура 37°С в термостатирана водна баня с непрекъснато разбъркване. Към клетъчната суспензия беше добавен еквивалентен обем IX разтвор на акридиноранж в PBS (изходен разтвор 100 X разтвор, съдържащ 30 mg в 100 ml дестилирана вода) и клетъчната суспензия беше оценена с цитофлуориметър: живите клетки излъчват зелена флуоресценция и бяха отчетени като процент от цялата анализирана популация. С този бърз метод, убиващата ефикасност на Rituximab® върху CD20+ клетки може да бъде оценена, сравнявайки процента на двойно положителни CD3/CD20 клетки в различни изследвани популации и процента на мъртвите клетки след добавянето на Rituximab®. Както е показано в Таблицата, контролните популации бяха същите клетки, експозирани само на антитялото или само на добавката. Данните посочени в тази таблица показват, че един час експозиране на Rituximab® индуцира почти 90 % смърт на CD3/CD20+ клетки.

Таблица: Комплементарно зависима цитотоксичност на подложени на трансдукция CD20 неконсервирани човешки Т лимфоцити.

% специфичен лизис

	% CD3/CD20+ лимфоцити	Rituximab® самостоятелно	Добавка самостоятелно	Rituximab® плюс добавка
Донор 1	30	0	14	33
Донор 2	23	0	11	35
Донор 3	15	0	5	18

Claims (7)

1. Използване на антитела срещу екзогенни повърхностни антигени, неприсъстващи върху човешки нормални Т лимфоцити, за получаването на препарати за лечение на заболявания при отхвърляне на присаждания при пациенти, които са получили Т лимфоцити, подложени на трансдукция с такива екзогенни повърхностни антигени.

2. Употреба съгласно патентна претенция 1, характеризираща се с това, че се използват антитела срещу CD20 повърхностен антиген и лимфоцити, подложени на трансдукция с CD20 антиген.

3. Употреба съгласно патентна претенция 2, характеризираща се с това, че анти CD20 антитялото е хуманизирано моноклонално антитяло.

4. Вектори за трансфекция на човешки Т лимфоцити с екзогенни повърхностни антигени.

5. Вектори съгласно патентна претенция 4, характеризиращи се с това, че включват ген, кодиращ CD20 човешки антиген.

6. Човешки Т лимфоцити, подложени на трансдукция с екзогенни повърхностни антигени.

7. Т лимфоцити съгласно патентна претенция 6, характеризиращи се с това, че са подложени на трансдукция с човешки CD20 антиген.

ПРОМЕНЕНИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ, ДЕПОЗИРАНИ В

МБ НА 24.07.2001 г.

1. Използване на антитела срещу антигени, експресирани върху повърхността на В лимфоцити и неприсъстващи върху човешки нормални Т лимфоцити, за получаването на препарати за лечение на заболявания при отхвърляне на присаждания при пациенти, които са получили Т лимфоцити, подложени на трансдукция с такива антигени.

2. Употреба съгласно патентна претенция 1, характеризираща се с това, че се използват антитела срещу CD20 повърхностен антиген и лимфоцити, подложени на трансдукция с CD20 антиген.

3. Употреба съгласно патентна претенция 2, характеризираща се с това, че анти CD20 антитялото е хуманизирано моноклонално антитяло.

4. Вектори за трансфекция на човешки Т лимфоцити с антигени, експресирани върху повърхността на В лимфоцити и неприсъстващи върху човешки нормални Т лимфоцити.

5. Вектори съгласно патентна претенция 4, характеризиращи се с това, че включват ген, кодиращ CD20 човешки антиген.

6. Човешки Т лимфоцити, подложени на трансдукция с антигени, експресирани върху повърхността на В лимфоцити и неприсъстващи върху човешки нормални Т лимфоцити.

7. Т лимфоцити съгласно патентна претенция 6, характеризиращи се с това, че са подложени на трансдукция с човешки CD20 антиген.