PT1185299E - Utilização de anticorpos contra cd20 para o tratamento da doença enxerto versus hospedeiro - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA CD20 PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA ENXERTO VERSUS HOSPEDEIRO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de anticorpos contra antigenes de superfície exógenos que não estão presentes em linfócitos T humanos normais para a preparação de composições destinadas ao tratamento da doença enxerto versus hospedeiro em pacientes que receberam linfócitos T transduzidos com esses antigenes de superfície exógenos. A invenção refere-se suplementarmente a vectores para a transfecção de linfócitos T humanos com antigenes de superfície exógenos e linfócitos T humanos transduzidos com antigenes de superfície exógenos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 problema de recidivas clínicas em pacientes com neoplasias hematológicas (leucemia e linfomas) é um problema de importância crescente. Durante muitos anos foi atribuído um papel terapêutico preciso aos procedimentos de transplantação com medula óssea total ou com precursores purificados em circulação (J.O. Armitage, "Bone marrow transplantation" New England Journal of Medicine, 1994, 330, 827-838). A eficácia clínica desses procedimentos baseia-se parcialmente num mecanismo de reconhecimento imunológico das células leucémicas do hospedeiro pelos linfócitos T do dador (GVL = Enxerto Versus Leucemia) (M. Sykes, FASEB J, , 10, 721-730, 1996). Ainda assim, os transplantes são caracterizados por muitos efeitos tóxicos, incluindo a reactividade ímunológica dos próprios linfócitos do dador contra os tecidos normais do hospedeiro (GVDH ~ Doença Enxerto Versus Hospedeiro). Por outras palavras, a administração de linfócitos T ao hospedeiro tem benefícios claros associados a riscos graves, sendo impossível separar farmacologicamente estes dois aspectos.

Apesar de técnicas padronizadas de selecção ímunológica permitirem, hoje em dia, a produção fácil de grandes quantidades de linfócitos T purificados de dadores para administração com a finalidade de induzir ín vivo o efeito GVL, ainda não estão disponíveis técnicas apropriadas para induzir farmacologicamente a morte selectiva dos linfócitos T administrados num paciente com o objectivo de eliminar o efeito GVHD no momento em que é clinicamente necessário.

Nos últimos anos têm sido produzidos muitos anticorpos policlonais e monoclonais contra moléculas humanas de superfície; em muitos casos, têm sido produzidos anticoiqpos com a finalidade directa de matar ín vivo uma célula positiva para essa molécula, de modo a serem utilizados em protocolos de imunoterapia; como exemplo, limitando-nos à área dos linfornas B, têm sido produzidos e caracterizados anticorpos eficazes contra as moléculas CD20, CD19, CD4 0, CD2 2, CD52, CD3 8 e outras (P.S. Multani et al.. , J. Clin. Oncol, , 16, 3691-3710, 1998) .. Nalguns casos, os anticorpos dirigidos contra essas moléculas exibiram citotoxicidade in vivo, provavelmente por serem capazes de activar o sistema do complemento na superfície da célula-alvo, como acontece com CD20, CD38 e CD52. Noutros casos, anticorpos foram conjugados com moléculas radioactivas para induzir a radiólise do alvo, como é o caso de CD20, Lym-1 e outras. Outros anticorpos foram conjugados a toxinas de origem bacteriana ou vegetal com o mesmo objectivo, como acontece com CD19, CD40 e CD22 . Outros anticorpos foram quimerizados para lhes conferir biespecificidade, por exemplo, com a finalidade de aproximar muito duas células. Por fim, para muitos destes anticorpos existem versões manipuladas e/ou humanizadas que permitem a sua administração in vivo, reduzindo o risco de antigenicidade e aumentando a sua eficácia.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

Foi descoberto que é possível controlar eficazmente o problema da doença enxerto versus hospedeiro utilizando um método que compreende a introdução de um antigene de superfície exógeno nos linfócitos T do dador e a administração subsequente ao paciente receptor dos anticorpos dirigidos contra esse antigene exógeno.

Antigene exógeno designa qualquer antigene de superfície que não esteja presente em linfócitos T normais, como acontece com os antigenes expressos na superfície de linfócitos B, tais como CD20, CD19, CD40, CD22, CD52, etc.

Obviamente, o antigene de superfície será seleccionado de modo a não causar, após a reacção com o anticorpo correspondente, efeitos negativos ou indesejados ao nível das populações celulares que expressam o antigene de forma constitutiva. É particularmente preferido o antigene de superfície CD20 dos linfócitos B humanos, contra o qual está comercialmente disponível um anticorpo monoclonal humanizado (Rituximab®, Roche) que é utilizado no tratamento de linfomas não Hodgkin B,

De acordo com a invenção, linfócitos T de dadores dadores são transduzidos, por técnicas adequadas, com o antigene seleccionado e depois são enriquecidos, por métodos de imunoafínidade, antes de serem injectados no sujeito receptor. No caso de se desenvolver a doença enxerto versus hospedeiro, administra-se o anticorpo dirigido contra o antigene de modo a inactivar in vivo os linfócitos T utilizando, por exemplo, mecanismos citotóxicos mediados pelo complemento. 0 anticorpo será preferivelmente monoclonal, mais preferivelmente será um anticorpo monoclonal humanizado.. As dosagens e via de administração dependerão de muitos factores, incluindo o estado geral de saúde, peso, sexo e idade do paciente. Em geral, o anticorpo será administrado por via i.v. numa gama de dosagens desde aproximadamente 50 até aproximadamente 500 mg/m2 de superfície do corpo, uma até três vezes por dia, até ao desaparecimento quase completo dos linfócitos T em circulação.. 0 isolamento de linfócitos T foi descrito por Rambaldi et ai., Blood, 91, 2189-2196, 1998,,

Os métodos de transdução dos linfócitos T com o antigene desejado são bem conhecidos: como referência, ver o artigo de revisão de Verma I,M. e Sornía N. , em Nature, 389, 239-242, 1997, Em particular, podem utilizar-se vectores adequados, como retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, vírus herpes, lentivírus, etc.

Por sua vez, cada um destes vectores inclui muitos tipos diferentes de organismos: considerando os retrovírus, exemplos são vectores anfotrópicos, ecotrópicos e xenotrópicos. Suplementarmente, têm sido utilizadas ao longo dos anos muitas linhas diferentes de células de empacotamento para optimizar a produção desses retrovírus recombinantes e para garantir uma melhor manipulação e segurança para os produtores {I.M. Verma et al., Nature, 389, 239-242, 1997,· M.A. Kay et al., "Gene therapy" Proc. Natl, Acad, Sei. USA, 94, 12744-12746, 1997)..

Recentemente, também foi introduzido DNA nu em células-alvo por conjugação com complexos policatiónicos ou lipossómicos, electroporação, precipitação em tampões salinos e outras técnicas.

Muitos tipos diferentes de células têm sido abordados selectivamente por transferência genética: linfócitos T e B, precursores hematopoiéticos imaturos, células musculares, fibroblastos, hepatócitos e outros 6 tipos de células (I.M. Verma et al., Nafcure, 389, 239-242, 1997; M,A. Kay et al, , "Gene therapy11 Proc. Natl. Acad, Scí . USA, 94, 12744-12746, 1997).

No caso do antigene CD20 foi utilizado um retrovírus anfotrópico que deriva do vírus da leucemia murina de Moloney e que é empacotado em células humanas de rim embrionário (293 T) manipuladas de modo a conterem os elementos estruturais retrovirais em plasmídeos separados (Human Gene Therapy, 7, 1405-1413, 1996). Esses vectores, bem como os linfõcitos T transduzidos com o antigene exógeno, em particular os linfõcitos T CD20+, constituem um objectivo da presente invenção.

Após a transferência genética, as células que expressam significativamente o gene exógeno constituem apenas uma minoria da população total. Realizam-se procedimentos de selecção das células transduzidas utilizando genes exógenos que sejam capazes de conferir à célula uma vantagem selectiva, As células transduzidas também podem ser seleccionadas de acordo com métodos alternativos, como triagem por FACS com anticorpos dirigidos contra os antigenes exógenos (K. Phillips et al., Nalure Medicine, 2, 10, 1154-1155, 1996). Outros métodos consistem em colunas de imunoafínidade ou placas de cultura pré-adsorvidas para o procedimento de aderência sobre plástico ("panning") e afins.

Descrição das figuras

Figura 1: esquema do plasmídeo LTR CD20 LTR. 7 LTR = repetição terminal longa; pUC = origem da replicação do plasmídeo; Puro = gene que confere resistência ã puromicina; PGK1 = promotor da fosfogliceraldeído quinase; EBNA1 e OriP = elementos derivados do vírus EBV para a replicação epissomal; AmpR = gene de resistência â ampicilina..

Figura 2: infecção da linha de células CEM com CD20 e selecção imunológica.

Painel da esquerda A: linha de células CEM após a infecção com vírus, analisada no citofluorímetro com um anticorpo IgGl de controlo fluorescente,

Painel central B: a mesma população analisada com um anticorpo anti-CD20 fluorescente.

Painel da direita C: a mesma população após selecção imunológica em colunas de afinidade, analisada com um anticorpo anti-CD20 fluorescente.,

Figura 3: infecção de linfócitos T frescos humanos com o vírus com CD20,

Painel da esquerda A: após a infecção, os linfócitos são etiquetados com anticorpos de controlo PE IgG2a e FITC IgGl.

Painel da direita B: a mesma população é etiquetada com anticorpos anti-CD20 PE e anti-CD3 FITC, No caso apresentado, 23% das células são duplamente positivas.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção mais pormenorizadamente.

Exemplo 1

Construção do plasmídeo LTR CD20 LTR.

Um fragmento de 913 nucleótidos do cDNA de CD20 humano contendo a sequência codificadora completa foi obtido por PCR do plasmídeo pCMV CD20 (Becker et al,, Science, 249, 912-915, 1990}.

Para a amplificação, 40 ng do plasmídeo foiçam ajustados para um volume reaccional final de 100 μΐ em KC1 10 mM, 10 mM, Tris HCl 20 mM, pH 8,75, MgSCf, 2 mM, Triton X-100 0,1%, 100 pg/ml de BSA, na presença de 0,8 μΐ de uma solução de dNTP 2,5 mM, 500 ng do "primer" "sentido" (CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC), 500 ng do "primer" "anti-sentido" (CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT) e 5U Pfu de DNA Polimerase da Stratagene (La Jolla, CA, E.U.A.). A reacção foi conduzida durante 26 ciclos, no aparato de aplicação de ciclos, seguindo este esquema: 1' a 95°C, l·1 a 60 °C e 2' a 72°C. No final da reacção adicionaram-se 100 μΐ de uma solução 25:24:1 de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico e, após a extracção, o DNA foi precipitado durante a noite a 20°C na presença de etanol. Após a centrifugação, o DNA foi novamente suspenso em 100 μΐ de 9 água e depois foi subclonado no vector pMOS (Amersham Italia, srl, Itália), de acordo com as instruções do fabricante contidas no estojo "estojo de clonagem de extremidades planas com pMOS" ("pMOS blunt ended cloning kit"). 0 plasmídeo recombinante resultante foi amplificado e sequenciado e depois foi digerido com BamHI, cujo sítio de reconhecimento (G/GATCC) estava presente nas extremidades dos dois "primers" de PCR. Em consequência, o fragmento foi subclonado no sítio BamHI do vector retrovíral PINCO VUGTG. 0 vector retroviral PINCO VUQTO tinha sido previamente obtido apôs excisão, com EcoRI e Notl, de um fragmento de 1441 pares de bases contendo o promotor do CMV (Cítomegalovírus) e o gene da EGFP (proteína verde fluorescente realçada) do plasmídeo PINCO (F. Grignani et al., Câncer Re$., 58, 14-19, 1998). Depois da excisão do fragmento EcoRI-Notl, o plasmídeo foi fechado após tratamento das extremidades planas com o fragmento Klenow e foi denominado PINCO VUOTO. Esse vector retroviral tem agora um comprimento de 11448 pares de bases. 0 produto recombinante entre PINCO VUOTO e o cDNA de CD20 foi denominado LTR-CD20-LTR e foi sequenciado para verificar a clonagem e a integridade do cDNA de CD2 0, bem como a ausência de codões de terminação a montante do primeiro ATG (Fig. 1).

Assim, para a porção retroviral, a construção LTR-CD20-LTR é constituída pela LTR derivada do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), outras sequências retrovirais derivadas do vírus de Moloney, o cDNA de CD2Q no sítio BamHI e a segunda LTR, como pormenorizado na Fig. 1 adjunta. 0 resto do plasmídeo é idêntico ao plasmídeo PINCO (F, Grígnani et al , Câncer Res. , 5_8, 14-19, 1998) que contém, como mostrado na figura, elementos EBNA-1 e OriP do vírus de Epstein Barr, a origem da replicação (pUC) e o gene da resistência a ampicilina, bem como um gene da resistência à puromicina sob o controlo do promotor PGK-1.

Exemplo 2

Transfecção do plasmídeo LTR-CD20-LTR nas células de empacotamento.

Para produzir retrovírus, a célula de empacotamento Phoenix-Ampho foi transfectada com o plasmídeo LTR-CD20-LTR.

As células Phoenix-Ampho são derivadas da linha de células 293 de rim embrionário humano após várias modificações; inicialmente foram transfectadas com o gene EIA de adenovírus e depois foram transfectadas com dois plasmídeos separados, que codificam para os genes estruturais gag e pol do MLV de Moloney sob o controlo do promotor do vírus do sarcoma de Rous, e para o gene env do MLV de Moloney sob o controlo do promotor do citomegalovírus.

No dia -1, 1,5 x 106 células foram plaqueadas numa placa de Petri com 10 cm de diâmetro em 10 ml de meio DMEM (Gibco, Seromed, Berlim, Alemanha) ao qual se tinha adicionado FCS 10% {Híclone Laboratories, Steril System, Logan, R.U.) e o sistema foi mantido num incubador com 5% de CCn a 37°C. No dia 0 adicionaram-se 16 μΐ de cloroquina (solução-mãe 25 mM em PBS) e, após 1', adicionou-se 1 ml de solução de 10 ^ig de DNA plasmídico. Para obter essa solução de DNA adicionai'am-se, a um tubo cónico de 15 ml, 500 μΐ de uma solução 2X HBS (HEPES 50 mM, pH 7,05, KCl 10 mM, Dextrose 12 mM, NaCl 280 mM, Na2HPC>4 1,5 mM (Peso da Fórmula Química 141,96)). Subsequentemente, num segundo tubo de 15 ml, prepararam-se 500 μΐ de uma solução com 10 pg de DNA, 61 μΐ de CaCl2 2 M e agua esterilizada. Em seguida, a mistura de DNA foi adicionada gota-a-gota ao primeiro tubo e o precipitado obtido foi então adicionado âs células.

Passadas 8 horas, o meio foi substituído por 10 ml de DMEM fresco.

No dia +1, o meio foi substituído por 5 ml de meio RPMI 1640 fresco ao qual se tinha adicionado FCS 10%.

No dia +2 procedeu-se à infecção removendo os 5 ml de meio contendo os retrovírus libertados durante a cultura.

Exemplo 3

Infecção da linha de células CEM com o retrovírus LTR-CD20-LTR. A quantidade de 1 x 10G células CEM linfoblastóides T humanas, crescendo em suspensão em meio RPMI 1640 suplementado com FCS 10% e glutamina, foi transformada em grânulos por rotação a 1200 rpm durante 8' numa cavidade de fundo plano de uma placa de 24 cavidades (Falcon, Becton Dickinson and Company, N.I.). Após remoção do sobrenadante, adicionou-se 1 ml do sobrenadante virai por filtração em filtros de 0,45 pm (Millipore Corporation Bedford, MA) na presença de 1 μΐ de Polibreno (solução-mãe 4 mg/ml em PBS).

Em seguida, a placa foi centrifugada durante 45’ a 1800 rpm à temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e substituído por 1 ml de RPMI 1640 fresco, ao qual tinha sido adicionado FCS 10%, e o sistema foi subsequentemente incubado durante 6 horas adicionais.

No final da incubação repetiu-se uma segunda vez o procedimento de infecção utilizando uma placa de Petri diferente de células de empacotamento previamente preparada.

Exemplo 4

Analise por FACS de CEM CD20+

Após a infecção retroviral com LTR-CD2Q-LTR, as células CEM foram mantidas no incubador e cresceram normalmente em meio RPMI 1640 ao qual tinha sido adicionado FCS 10%. Passados 2 dias foi logo possível avaliar as células CEM, por análise de imunofluorescência, quanto à presença do marcador CD20 na superfície. A quantidade de 0,1 x 10'J células foi transferida para um tubo Eppendorf de 1,5 ml, foi submetida a rotação a 4 000 rpm durante 3', foi novamente suspensa em 50 μΐ de uma solução de anticorpo anti-CD20 2F5 fluorescente (Becton Dickinson) e mantida durante 30' a 4°C. No final adicionaram-se 500 μΐ de uma solução a 0,9% de NaCl, FCS 5%, Azida Na 0,02% e as células foram submetidas a rotação a 4 000 rpm durante 5', Depois disso, a amostra foi novamente suspensa em 100 μΐ de solução de PBS contendo formaldeído 1% e depois foi mantida a 4°C até ser lida no fluorocitómetro,

Em muitas experiências, este procedimento de infecção originou sempre células CEM CD20+ em percentagens variáveis desde 30 até 60%, ao passo que a linha celular não infectada foi completamente negativa quanto â expressão de CD20 (como exemplo ver Fig. 2, painel central, que mostra uma população de CEM que se tornou CD20+ em 40%).

Exemplo 5

Separação por imunoafinidade Células CEM infectadas com o vírus LTR-CD20-LTR após dois dias de cultura foram enriquecidas na população CD20+ por colunas de imunoafinidade, Para esta finalidade, as células foram primeiramente incubadas durante 30' a 4°C com o clone 1F54 do anticorpo antí-CD20, depois foram lavadas três vezes com PBS e albumina de soro humano 2,5% e, por fim, foram incubadas durante 30' adicionais a 4°C com uma solução de microesférulas revestidas com um anticorpo IgG de cabra anti-ratinho (Milteny Biotech, Bergish-Gladbach, Alemanha).

Por fim, as células foram novamente suspensas em meio RPMI 1640 e foram seleccionadas por passagem numa coluna XS+ do sistema SuperMACS (Milteny Biotech) , Em seguida, a coluna foi eluída com solução fisiológica à qual se tinha adicionado albumina 2,5%, a coluna foi removida do sistema SuperMACS e foi lavada, para recuperar a fracção positiva, A fracção positiva foi suplementarmente analisada no citofluorímetro após etiquetagem das células de acordo com o procedimento de imunofluorescência directa previamente descrito. A percentagem de células CD20+ no final deste procedimento foi sempre superior a 90%. Como exemplo ver a Fig. 2, painel da direita, onde se mostra uma população de CEM, após enriquecimento por imunoafinidade, que é positiva para CD20+ em 98%.

No final, a população de CEM CD20+ cresceu em suspensão e foi expandida em meio RPMI 1640, ao qual tinha sido adicionado FCS 10%, num incubador. Estudou-se esta população em intervalos regulares quanto â expressão do marcador CD20 na superfície, demonstrando assim a estabilidade do marcador durante mais de dois meses e a posítívidade em mais de 90% das células seleccionadas.

Exemplo 6 5

Infecção de linfócícos T periféricos frescos com o vírus LTR-CD2Q-LTR

Sangue total heparinizado foi estratificado em Fícoll e centrifugado durante 30' a 1 500 rpm à temperatura ambiente, As células recolhidas na interface foram lavadas com PBS e submetidas a rotação a 1 500 rpm durante 10' à temperatura ambiente, depois mais duas vezes a 1 000 rpm durante 10' à temperatura ambiente e, por fim, foram novamente suspensas em RPMI 1640 com FCS 10%, a l χ 106 / ml, em placas de 24 cavidades de fundo plano, aliquotando 2 ml de suspensão de células por cavidade na presença de PHA (Murex) a 1 ^ig/ml, a 37°C e 5% de C02 durante uma noite.

No segundo dia adicionou-se IL-2 humana recombinante (Proleukin, Chiron Italia, Milão, Itália) numa concentração final de 100 U/ml,

No terceiro dia, após lavagem e contagens das células, 1 χ 106 células foram infectadas em 1 ml de meio numa cavidade de fundo plano de uma placa de 24 cavidades. Após rotação a 1 200 rpm durante 10', o sobrenadante foi removido e substituído por 1 ml de vírus filtrado na presença de polibreno e rotação subsequente durante 45' a 1 800 rpm a temperatura ambiente, tal como no protocolo referido acima.

No final, o sobrenadante virai foi removido e substituído por meio completo para uma incubação durante 6 horas e depois repetiu-'se o procedimento de infecção com 16 rotação. Em seguida, as células foram novamente suspensas em meio completo na presença de IL-2 e deixadas repousar no incubador durante a noite.

Repetiu-se todo o procedimento durante os dois dias seguintes e, por fim, as células foram mantidas em cultura num incubador durante dois dias adicionais.

As células foram etiquetadas com anticorpos monoclonais anti-CD2Q FITC, anti-CD3 PE, anti~CD4 PE e anti-CD8 FITC (Becton Dickinson) pelo mesmo procedimento descrito acima e depois foram analisadas no citofluorímetro.

Muitas experiências em dadores normais mostram que uma percentagem variável desde 5% até 25% de linfõcitos T CD3+ adquire o marcador CD20, em análise de fluorescência dupla. Mostra-se na Fig. 3 uma dessas experiências, tendo-se obtido, neste caso específico, 23% de positividade dupla para CD3/CD20.

Exemplo 7

Estudo da lise induzida por anticorpo e complemento em populações de linfõcitos T humanos frescos após transdução com o gene CD20. A quantidade de 2 x 105 linfõcitos transduzidos foi colocada em alíquotas, em tubos de fundo redondo de 10 ml, em 500 μΐ de meio RPMI 1640 ao qual tinha sido adicionado soro fetal de vitelo 10% inactivado pelo calor. Em seguida 17 adicionou-se o anticorpo Rituximab para uma concentração final de 350 g/ml e complemento de coelho Pel-Freeze para 10% no final.

Alternativamente, soro AB humano, na concentração final de 3 0%, pode ser adicionado como fonte do complemento. As células permaneceram durante uma hora a 37 5c num banho de água termostatizado com agitação contínua. À suspensão de células adicíonou-se um volume igual de solução IX de laranja de acridina em PBS (solução-mãe 10 X consistindo em 30 mg em 100 ml de água destilada), e a suspensão de células foi avaliada no citofluorímetro: as células vivas emitem fluorescência verde, e foram contadas como percentagem da população total analisada. Com este método rápido foi possível avaliar a eficiência do Rituximab® na morte das células CD20+, comparando as percentagens de células duplamente positivas para CD3/CD20 nas diferentes populações estudadas e as percentagens de células mortas após a adição do Rituximab®. Como mostrado na Tabela, as populações de controlo consistiram nas mesmas células expostas ao anticorpo isolado ou ao complemento isolado. Os dados apresentados na tabela demonstram que uma hora de exposição ao Rituximab® induz quase 90% de morte das células CD3/CD20+.

Tabela: Citotoxicidade dependente do complemento de linfócitos T humanos frescos transduzidos com CD20. % lise específica % linfócitos CD3/CD20+; Rituximab® Isolado; Complemento isolado; Rituximab® Mais Complemento

Dador 1 Dador 2 Dador 3 A percentagem de lise foi determinada na análise de FACS após coloração com acridina.

Lisboa 20/03/2007

Claims (5)

1. I REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de anticorpos contra antigenes expressos na superfície de linfócitos B e que não estão presentes em linfócitos T normais humanos para a preparação de composições destinadas ao tratamento da doença enxerto versus hospedeiro em pacientes que receberam linfócitos T transduzidos com esses antigenes,
2. 2, Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que se utilizam anticorpos dirigidos contra o antigene de superfície CD20 e linfócitos transduzidos com o antigene CD2 0 ..
3. 3, Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo anti-CD2Q é um anticorpo monoclonal humanizado,
4. 4, Linfócitos T humanos transduzidos com antigenes expressos na superfície de linfócitos B e que não estão presentes em linfócitos T normais humanos,
5. 5, Linfócitos T de acordo com a reivindicação 4 transduzidos com o antigene CD20 humano. Lisboa, 20/03/2007