CZ20014450A3

CZ20014450A3 - Farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ20014450A3
Application number: CZ20014450A
Authority: CZ
Inventors: Josee Golay; Martino Introna; Alessandro Rambaldi; Andrea Biondi
Original assignee: Consiglio Nazionale Delle Ricerche
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2002-04-17
Also published as: PT1185299E; KR20020026455A; US20070014785A1; AU5530300A; HUP0201600A3; CN1253208C; ZA200110004B; DK1185299T3; ES2278616T3; BG106193A; EP1185299A1; DE60033030T2; WO2000076542A1; HK1043549A1; NO20016035D0; JP2003501482A; CN1355712A; AU774206B2; NZ515992A; NO20016035L

Description

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká použití protilátek proti exogenním povrchovým antigenům, které se nevyskytují u normálních lidských T-lymfocytů pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, vznikajících reakcí mezi hostitelem a štěpem u nemocných, jimž byly dodány T-lymfocyty s takovým exogenním povrchovým antigenem. Dále se vynález týká vektorů pro transfekci lidských T-lymfocytů exogenním povrchovým antigenem a lidských T-lymfocytů po transdukci exogenních povrchových antigenů.

Dosavadní stav techniky

V poslední době se stále zvýrazňuje problém klinických relapsů u nemocných s hematologickými neoplaziemi, zejména leukémií a lymfomem. Po dlouhou řadu let byla připisována veliká důležitost transplantačním postupům 'kostní dřeně nebo transplantaci čištěných prekursorů z krevního oběhu, jak je popsáno v publikaci J. 0. Armitage, Bone marrow transplantátion, New England Journal of Medicine, 1994, 330, 827-838. Klinická účinnost takových postupů je zčásti založena na mechanismu rozpoznávání leukemických buněk hostitele v případě T-lymfocytů dárce (GVL = Graft Versus Leukaemia, M. Sykes, FASEB J., 10, 721-730, 1996). Transplantáty jsou však charakterizovány řadou toxických účinků včetně imunologické reaktivity lymfocytů dárce proti normální tkáni hostitele (GVDH = Graft Versus Host Diseases).

Jinak vyjádřeno, jde při podání T-lymfocytů hostiteli o zcela jasné příznivé účinky, které však jsou spojeny se závažným rizikem, přičemž farmakologickým způsobem je nemožné tyto dvě součásti léčení od sebe oddělit.

Přestože standardizované imunoselektivní pokusy v současné době dovolují snadno získat velké množství čištěných T-lymfocytů dárce pro podání in vivo pro dosažení účinku GVL, nejsou dosud k dispozici farmakologické postupy pro vyvolání selektivní uhynutí podaných T-lymfocytů tak, aby došlo k vyloučení účinku GVHD v okamžiku, v němž je to z klinického hlediska zapotřebí.

V posledních letech byla vyrobena řada polyklonálních a monoklonálních protilátek proti povrchovým molekulám s účinností antigenů. V řadě případů byly připraveny protilátky s přímým cílem zničit buňku, pozitivní na uvedené molekuly pro použití v imunoterapii. Může například jít o omezení oblasti B-lymfomu, v tomto případě byly připraveny účinné protilátky s charakteristikou proti molekulám CD20, CD19, CD40, CD22, CD52, CD38 a dalším molekulám, jak je popsáno v publikaci P. S. Multani a další, J. Clin. Oncol., 16, 3691-3710, 1998. V některých případech byly protilátky proti takovým molekulám cytotoxické in vivo pravděpodobně z toho důvodu, že měly schopnost aktivovat systém komplementu na povrchu cílových buněk, například v případě CD20, CD38 a CD52. V jiných případech byly protilátky konjugovány s radioaktivními molekulami k dosažení radiolýzy v cílové oblasti, například v případě CD20, Lym-1 a v dalších případech. Jiné protilátky byly konjugovány s toxiny bakteriálního nebo rostlinného původu k dosažení téhož účinku, například v případě CD19, CD40 a CD22. Další i

protilátky byly zpracovány na chimérní molekuly k dosažení bispecifičnosti, například pro bezprostřední přiblížení dvou buněk. Konečně pro řadu těchto protilátek existují geneticky pozměněné a/nebo humanizované protilátky, které dovolují jejich podání in vivo při snížení rizika antigenity za současného zvýšení účinnosti těchto látek.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že je možno účinně zvládnout problém onemocnění mezi hostitelem a štěpem tím způsobem, že se do T-lymfocytů dárce zavede exogenní povrchový antigen a pak se podají nemocnému protilátky proti tomuto exogennímu antigenu.

Exogenním antigenem může být jakýkoliv povrchový antigen, který se nevyskytuje u normálních T-lymfocytů, tak jak je tomu v případě antigenu, exprimovaných na povrchu B-lymfocytů, jako CD20, CD19, CD40, CD22, CD52 a podobně. Je zřejmé, že povrchový antigen se bude volit tak, aby’po reakci s odpovídající protilátkou nevyvolával negativní nebo nežádoucí účinky na úrovni buněčných populací, které konstitutivně exprimují antigen.

Zvláště výhodný je CD20 povrchový antigen lidských B-lymfocytů, proti němuž se běžně dodává humanizovaná monoklonální protilátka (Rituximab^R, Roche), která se užívá při léčení lymfomů B, odlišných od Hodgkinova lymfomu.

Podle vynálezu se uskuteční transdukce vybraného antigenu do T-lymfocytů dárce a tyto lymfocyty se • · ·· imunoafinitními metodami obohatí před vstřiknutím k léčebným účelům. V případě, že se vyvine nepříznivá reakce mezi štěpem a hostitelem, podá se protilátka proti použitému antigenů k inaktivaci T-lymfocytů in vivo například mechanizmem cytotoxicity, zprostředkované přes komplement.

Protilátkou bude s výhodou monoklonální protilátka a zvláště výhodně půjde o humanizovanou monoklonální protilátku. Použité dávky a způsob podání budou záviset na celé řadě faktorů, například na celkovém zdravotním stavu nemocného na jeho hmotnosti, pohlaví a stáří. Obvykle se bude protilátka podávat nitrožilně v rozmezí dávek přibližně 50 až 500 mg/m² tělesného povrchu jednou až 3krát denně tak dlouho, až dojde k téměř úplnému vymizení T-lymfocytů z krevního oběhu.

Izolace T-lymfocytů byla popsána v publikaci Rambaldi a další, Blood, 91, 2189-2196, 1998.

Způsoby transdukce požadovaného antigenů na Tlymfocyty jsou známé. Podrobnosti lze získat například v souhrnné publikaci Verma I. M. a Somia N., Nátuře 389, 239-242. Obvykle se užívají vhodné vektory, jako retroviry, adenoviry, viry, spojené s adenoviry, herpetické viry, lentiviry a podobně.

Každý z uvedených vektorů zahrnuje sám o sobě řadu odlišných typů organismu. Pokud jde o retroviry, je možno jako příklady uvést amphotropní, ecotropní a xenotropni vektory. Mimo to bylo v průběhu let použito velké množství buněčných linií k optimalizaci produkce takových rekombinantních retrovirů a k zajištění větší bezpečnosti • · • · • · · · pro výrobce při zacházení s těmito materiály podle publikací I. M. Verma a další, Nátuře, 389, 239-242,

1997, M. A. Kay a další, Gene therapy, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 12744-12746, 1997.

V poslední době byla do cílových buněk zaváděna také čistá DNA konjugací s polykationtovými nebo liposomálními komplexy, pomocí elektroporace, srážením v pufrech s obsahem solí a jinými postupy.

Cílovými buňkami pro tento genetický přenos mohou být nejrůznější typy buněk. Může jít o lymfocyty T a B, o nezralé prekurzory krevních buněk, svalové buňky, fibroblasty, jaterní buňky a jiné typy buněk, jak je popsáno v publikacích I. M. Verma a další, Nátuře, 389, 239-242, 1997, M. A. Kay a další, Gene therapy, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 12744-12746, 1997.

V případě antigenu CD20 byl použit amphotropní retrovirus, odvozený od viru myší leukemie Moloney a pomnožený v embryonálních buňkách lidských ledvin (293T), geneticky zpracovaných tak, aby na oddělených plasmidech obsahovaly strukturní prvky retrovirů podle publikace Human Gene Therapy, 7, 1405-1413, 1996. Předmětem vynálezu právě takové vektory a také T-lymfocyty po transdukci exogenního antigenu, zvláště CD20+ T lymfocyty.

Po genetickém přenosu tvoří buňky, exprimující v podstatnější míře exogenní gen pouze malou část celé populace. Z tohoto důvodu se provádí selekce buněk po transdukci při použití exogenního genu, jehož přítomnost může zajistit selektivní výhody pro buňky. Buňky po

transdukci je možno podrobit selekci také jinými postupy, například při použití FACS. Při tomto postupu se užívá protilátek proti exogenním antigenům podle publikace K. Phillips a další, Nátuře Medicine, 2, 10, 1154-1155,

1996. Dalším použitelným postupem jsou imunoafinitní sloupce nebo použití ploten s předem adsorbovanými materiály a podobně.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněn plasmid LTR CD20 LTR. LTR = dlouhá opakující se koncová část, pUC = počátek replikace v plasmidů, Puro = gen pro odolnost proti puromycinu, PGK1 = promotor fosfoglyceraldehydkinázy, EBNAl a OriP = prvky, odvozené od viru EBV pro episomální replikaci, AmpR = gen pro odolnost proti ampicilinu.

Na obr. 2 je znázorněna infekce buněčné linie CEM pomocí CD20 a imunoselekce.

Horní křivka A: buněčná linie CEM po infekci virem, analýza cytofluorimetrem s fluorescenční kontrolou protilátky IgGl.

Střední křivka B: Tatáž buněčná populace, analýza byla provedena pomocí fluorescenční protilátky proti CD20 .

• · ·

Dolní křivka C: Tatáž buněčná populace po imunoselekci na afinitních sloupcích, analýza byla provedena pomocí fluorescenční protilátky proti CD20.

Obr. 3 znázorňuje infekci čerstvých lidských Tlymfocytů virem CD20.

Horní křivka A: Po infeci byly lymfocyty značeny pomocí PE IgG2a a FITC IgGl jako kontrolními protilátkami.

Dolní křivka B: Tatáž populace buněk byla značena protilátkami proti CD20 PE a proti CD3 FITC. Ve znázorněném případě má 23 % buněk dvojnásobnou pozitivní reakci.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce plasmidu LTR CD20 LTR

Fragment 913 nT z lidské cDNA CD20, obsahující celou kódovou sekvenci, byl získán pomocí PCR z plasmidu pCMV CD20 podle publikace Becker a další, science 249,

912-915, 1990.

Pro amplifikaci bylo 40 ng plasmidu uloženo do konečného reakčního objemu 100 μΐ s obsahem 10 mM KC1, mM (NH₄)2SO₄, 20 mM Tris HCl, pH 8,75, 2 mM MgSO₄, ····

0,1% Triton X-100, 100 μς/ml BSA v přítomnosti 0,8 μΐ roztoku 2,5 mM dNTP, 500 ng primeru negativního řetězce DNA, (CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC) , 500 ng antimediátorového primeru (CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT) a 5 U Pfu DNA polymerázy (Stratagene La Jolla, CA, USA). Reakce byla uskutečněna ve 26 cyklech v zařízení pro cyklické změny teploty podle následujícího schématu:

minuta při 95 °C, 1 minuta při 60 °C a 2 minuty při 72 °C. Na konci reakce bylo přidáno 100 μΐ roztoku fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 25:24:1 a po extrakci byla DNA srážena přes noc při teplotě 20 °C v přítomnosti ethanolu. Po odstředění byla DNA znovu uvedena do suspenze ve 100 μΐ vody a pak subklonována ve vektoru pMOS (Amersham Italia, srl, Itálie) podle instrukcí výrobce, obsažených v balíčku s názvem „pMOS blunt ended cloning kit. Výsledný rekombinantní plasmid byl amplifikován a byla analyzována jeho sekvence, načež byl plasmid rozštěpen pomocí BamHI, pro tento enzym bylo rozpoznávací místo G/GATCC obsaženo na obou koncích PCR primeru. Fragment byl z tohoto důvodu subklonován v místě působení.BamHI retrovirového vektoru PINCO VUOTO. Tento retrovirový vektor byl získán tak, že byl pomocí enzymů EcoRI a Notl vyjmut fragment o 1441 bp s obsahem promotoru CMV (Cytomegalovirus) a genu pro EGFP (zesílený, zeleně fluoreskující protein) z plasmidu PINCO (F. Grignani a další, Cancer Res., 58, 14-19, 1998). Po vyjmutí fragmentu EcoRI-Notl byl plasmid uzavřen po vyplnění konců Klenowovým fragmentem a byl pojmenován PINCO VUOTO. Tento retrovirový vektor má nyní délku 11448 bp.

Rekombinantní vektor mezi PINCO VUOTO a CD20 cDNA byl pojmenován LTR-CD20-LTR a byla analyzována jeho ·· ·· • · · · • ♦ · • · · • · · ·· ···· • · ·♦ • ♦ ♦ • · · · · • · · • ♦ · ·· ··

sekvence k ověření klonování a integrity CD20 cDNA a také nepřítomnost stop kodonů proti směru exprese prvního kodonu ATG, jak je znázorněno na obr. 1.

Konstrukce LTR-CD20-LTR je tedy v retrovirové části vytvořena z LTR, odvozeného od viru myší leukemie Moloney (MoMLV), z dalších retrovirových sekvencí, odvozených od viru Moloney, z CD20 cDNA v místě štěpení BamHI a druhého LTR, jak je podrobně znázorněno na obr. 1. Zbytek plasmidu je totožný s plasmidem PINCO (F. Grignani a další, Cancer Res., 58, 14-19, 1998). Tento plasmid obsahuje, jak je na obr. 1 znázorněno, EBNA-1 a OriP jako prvky viru Epstein Barr, počátek replikace pUC a gen pro odolnost proti ampicilinu a také gen pro odolnosti proti puromycinu pod řízením promotoru PGK-1.

Příklad 2

Transfekce LTR-CD20-LTR do buněk

Aby bylo možno produkovat retroviry, byla provedena transfekce buněk Phoenix-Ampho plasmidem LTR-CD20-LTR.

Buňky Phoenix-Ampho jsou odvozeny od buněčné linie lidských embryonální ledvinových buněk 293 s několika modifikacemi. Na počátku byly buňky podrobeny transfekci genem ElA z adenoviru a pak transfekci dvěma odlišnými plasmidy s kodovou sekvencí pro strukturní geny gag a pol z Moloney MLV pod řízením promotoru viru Rousova sarkomu a gen env z Moloney MLV pod řízením promotoru z cytomegaloviru.

Ve dni -1 bylo naočkováno 1,5 x 10⁶ buněk do Petriho misky s průměrem 10 cm a s obsahem 10 ml prostředí DMEM

99

9 9 9

9 · • · * • · 9

9999 (Gibco, Seromed, Berlin, SRN) s přídavkem 10 % FCS (Hiclone Laboratories, Steril System, Logan, UK) , materiál byl uchováván při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře, obsahující 5 % oxidu uhličitého. Ve dni 0 bylo přidáno 16 μΐ chlorochinu (zásobní roztok 25 mM v PBS) a po 10 minutách 1 ml roztoku s obsahem 10 μρ plasmidové DNA. K získání takového roztoku DNA bylo do konické zkumavky s objemem 15 ml vloženo 500 μΐ roztoku 2xHBS (50 mM HEPES, pH 7,05, 10 mM KC1, 12 mM Dextrózy, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄ (FW 141/96)). Pak bylo ve druhé zkumavce s objemem 15 ml připraveno 500 μΐ roztoku s obsahem 10 pg DNA, 61 μΐ 2M CaCl₂ ve sterilní vodě. Pak byla směs s obsahem s DNA po kapkách přidána do první zkumavky, a vzniklá sraženina byla přidána k buňkám.

Po osmi hodinách bylo prostředí nahrazeno 10 ml čerstvého prostředí DMEM.

Ve dni +1 bylo živné prostředí nahrazeno 5 ml čerstvého prostředí RPMI 1640 s přídavkem 10 % FCS.

Ve dni +2 byla provedena infekce odebráním 5 ml prostředí s obsahem retrovirů, uvolněných v průběhu pěstování.

Příklad 3

Infekce buněčné linie CEM pomocí LTR-CD20-LTR retrovirů χ 10⁶ lidských T-lymfoblastoidních buněk CEM, pěstovaných v suspenzi v prostředí RPMI 1640, doplněném 10 % FCS a glutaminem, bylo odstředěno při 1200 otáčkách za minutu celkem 8 minut ve vyhloubení s plochým dnem v ·4 • ♦ · • 4 4 44 • · 4 4 · • 4 · 4 • 4 4 4

44 • 4 4 4

4 4

4 4 4

4 4

4444 ·· 44 > · * · ·

4 4

4>4 ·· 4444 plotně s 24 vyhloubeními (Falcon, Becton Dickinson and Company, NY). Po odstranění supernatantu byl 1 ml virového supernatantu přidán pomocí filtrace přes filtr s otvory 0,45 jxm (Millipore Corporation Bedford, MA) v přítomnosti 1 μΐ Polybrene (zásobní roztok 4 mg/ml v PBS) .

Plotna pak byla odstředěna po dobu 45 minut při 1800 otáčkách za minutu při teplotě místnosti, supernatant byl odebrán a nahrazen 1 ml čerstvého prostředí RPMI 1640 s přídavkem 10 % FCS, pak byla plotna inkubována dalších 6 hodin.

Na konci inkubace byla infekce opakována ještě jednou při použití předem připravené jiné Petriho misky s obsahem příslušných buněk.

Příklad 4

FACS analýza CD20 + CEM

Buňky CEM byly po infekci retroviry při použití LTRCD20-LTR udržovány v inkubátoru a běžným způsobem pěstovány v prostředí RPMI 1640 s přídavkem 10 % FCS. Po dvou dnech bylo možno buňky CEM podrobit imunofluorescenční analýze na přítomnost označení CD20 na jejich povrchu.

0,1 χ 10⁶ buněk bylo přeneseno do Eppendorfovy zkumavky s objemem 1,5 ml, materiál byl 3 minuty odstředěn při 4000 otáček za minutu, znovu uveden do suspenze v 50 μΐ roztoku fluorescenční protilátky 1F5 proti CD20 (Becton Dickinson) a 30 minut uložen při teplotě 4 °C. Na konci této doby bylo přidáno 500 μΐ

9

9 99

9 9 • · 9

9999 roztoku s obsahem 0,9 % NaCl, 5 % FCS, 0,02 % azidu sodíku a buněčný materiál byl odstředěn 5 minut při 4000 otáček za minutu. Pak byl vzorek znovu uveden do suspenze ve 10 μΐ roztoku PBS s obsahem 1 % formaldehydu a pak byl udržován na teplotě 4 °C až do odečtení výsledků na fluorocytometru.

V řadě pokusů bylo možno získat při tomto způsobu infekce vždy buňky CEM CD20+ v různém množství 30 až 60 %, kdežto u neinfikovaných buněčných linií nikdy nedocházelo k expresi CD20, jak je také zřejmé ze střední křivky na obr. 2, kde je znázorněna populace CEM, která se po infekci stala ze 40 % CD20+.

Příklad 5

Imunoafinitní dělení

Buňky CEM, infikované virem pomocí LTR-CD20-LTR byly po dvou dnech pěstování v kultuře obohaceny o populaci CD20+ při použití imunoafinitních sloupců. K tomuto účelu byl buněčný materiál nejprve inkubován 30 minut při teplotě 4 °C spolu s klonem 1F54 protilátky proti CD20, pak byl 3krát promýt PBS a 2,5% lidským sérovým albuminem a nakonec byl inkubován ještě 30 minut při teplotě 4 °C soplu s roztokem míkrokuliček, opatřených povlakem kozí protilátky proti myšímu IgG (Milteny Biotech, BergishGladbach, SRN).

Nakonec byly buňky znovu uvedeny do suspenze v prostředí RPMI 1640 a podrobeny selekci průchodem sloupcem XS+ v systému SuperMACS (Milteny Biotech). Sloupec byl vymíván fyziologickým roztokem s přídavkem

• 9 • · 9 99 o 9 9 ♦ 9 9 ··

2,5 % albuminu, pak byl vyjmut ze systému SuperMACS a promyt k izolaci pozitivní frakce.

Pozitivní frakce byla dále analyzována pomocí cytofluorimetru po značení buněk přímou imunofluorescencí tak, jak bylo svrchu popsáno.

Množství buněk CD20 + na konci tohoto postupu bylo vždy vyšší než 90 %. Jako příklad je možno uvést obr. 2, křivku C, na níž je znázorněna populace CEM po obohacení imunoafinitním způsobem, tato populace je z 98 % pozitivní CD20+.

Na konci pokusu byla populace CEM CD20+ pěstována v suspenzi v prostředí RPMI 1640 s přídavkem 10 % FCS v inkubátoru, V pravidelných intervalech byla sledována exprese CD20 jako značení na povrchu buněk, čímž bylo možno prokázat stálost značení po dobu více než 2 měsíců a pozitivitu na více než 90 % buněk po selekci.

Příklad 6

Infekce virem pomocí LTR-CD20-LTR na čerstvých periferních T-lymfocytech

Plná heparinizovaná krev byla nanesena na prostředek Ficoll a odstředěna 30 minut při 1500 otáčkách za minutu při teplotě místnosti. Buňky, shromážděné na rozhraní byly promyty pomocí PBS a odstředěny 10 minut při 1500 otáčkách za minutu a při teplotě místnosti a pak ještě dvakrát, pokaždé 10 minut při 1000 otáčkách za minutu a při teplotě místnosti, nakonec byl buněčný materiál uveden do suspenze v prostředí RPMI 1640, obohaceném 10 % FCS a suspenze s obsahem 1 x 10⁶ buněk/ml byla uložena do • 4

• 44 • *

4 • 4 ·· 4

4

4»

4 •

4444

44

4 4 4

4 4

4444 ploten s 24 vyhloubeními s plochým dnem po podílech 2 ml buněčné suspenze na vyhloubení v přítomnosti PHA (Murex) v množství 1 gg/ml při teplotě 37 °C přes noc v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého.

Druhého dne byl přidán lidský rekombinantní IL-2 (Proleukin, Chiron Italia, Milan, Itálie) do konečné koncentrace 100 U/ml.

Třetího dne po promytí a spočítání buněk bylo lxlO⁶buněk infikováno v 1 ml živného prostředí ve vyhloubení s plochým dnem na plotně s 24 vyhloubeními-. Po odstředění 10 minut při 1200 otáčkách za minutu byl supernatant odstraněn a nahrazen 1 ml filtrovaného viru v přítomnosti polybrenu, načež byl materiál odstředěn 45 minut při 1800 otáčkách za minutu při teplotě místnosti stejně jako svrchu.

Po odstředění byl supernatant s obsahem viru odstraněn a nahrazen na 6 hodin úplným živným prostředím, načež bylo opakováno odstředění a infekce buněk. Pak byly buňky znovu uvedeny do suspenze v úplném živném prostředí v přítomnosti 11-2 a byly ponechány přes noc v inkubátoru.

V následujících dvou dnech byl celý postup opakován a nakonec byly buňky v živném prostředí uloženy v inkubátoru na 2 další dny.

Pak byly buňky značeny monoklonálními protilátkami proti CD20 FITC, proti CD3 PE, proti CD4 PE a proti CD8 FITC (Becton Dickinson) stejným způsobem jako svrchu, načež byly analyzovány pomocí cytofluorimetru.

* «· «·* · · ·· ·· ·*·· ·»· · · · _ ·· »» »· »»·· ·· ····

Řada pokusů na normálních dárcích prokázala, že různý procentuální podíl 5 až 25 % T-lymfocytů CD3+ má při zkoušce fluorescencí na svém povrchu značení CD20. Jeden z takových pokusů je znázorněn na obr. 3. V tomto specifickém případě bylo dosaženo ve 23 % dvojité pozitivity CD3/CD20.

Příklad 7

Rozrušení buněk, vyvolané protilátkou a komplementem v populaci čerstvých lidských T-lymfocytů po transdukci genu CD20.

x 105 lymfocytů po transdukci bylo rozděleno do zkumavek s okrouhlým dnem a s objemem 10 ml s obsahem 500 μΐ v prostředí RPMI 1640 s přídavkem 10 % fetálního telecího séra, inaktivovaného působením tepla. Pak byla přidána protilátka Rituximab do konečné koncentrace 350 g/ml a králičí komplement Pel freeze do konečné koncentrace 10 %.

Jako zdroj komplementu je také možno přidat lidské sérum AB do konečné koncentrace 30 %. Buněčný materiál se nechá 1 hodinu stát při teplotě 37 °C na vodní lázni, udržované na této teplotě při stálém protřepávání.

Buněčná suspenze se přidá do stejného objemu lx roztoku akrídinové oranži v PBS (zásobní lOOx roztok obsahuje 30 mg ve 100 ml destilované vody) a buněčná suspenze byla vyhodnocena pomocí cytofluorimetru. Živé buňky vysílají zelenou fluorescenci a jejich počet je možno stanovit jako procentuální podíl celkové analyzované populace. Tímto rychlým postupem je možno stanovit účinnost protilátky Rituximab^R na usmrcení buněk CD20+ tak, že se • Λ Φ

Φ ΦΦΦ·

Φ Φ Φ ·

Φ Φ Φ Φ

Φ • ♦ * Φ Φ · ΦΦΦ «Φ ΦΦΦΦ

Φ Φ φφ ΦΦΦΦ srovnává procentuální množství dvojitě pozitivních buněk CD3/CD20 v různých sledovaných buněčných populacích a procentuální podíl uhynulých buněk po přidání protilátky Rituximab^R. Jak je uvedeno v následující tabulce, byly kontrolní populace tvořeny stejnými buňkami, které byly vystaveny pouze působení protilátky nebo pouze působení komplementu. Údaje z tabulky prokazují, že po jedné hodině expozice protilátce Rituximab dochází k uhynutí téměř 90 % buněk CD3/CD20+.

Tabulka: Cytotoxicita po transdukci CD20, závislá na komplementu pro čerstvé lidské T-lymfocyty.

		Specifické rozrušení	ouněk (%)
	% lymfocytů CD3/CD20+	Pouze Rituximab^R	Pouze komplement	Rituximab + komplement
Dárce 1	30	0	14	33
Dárce 2	23	0	11	35
Dárce 3	15	0	5	18

Procentuální podíl rozrušených buněk byl stanoven pomocí FACS po barvení akridinem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použiti protilátek proti antigenu, k jehož expresi dochází na povrchu B-lymfocytů a který se nevyskytuje u normálních lidských T-lymfocytů pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, spočívajícího v reakci štěpu proti hostiteli u nemocných, jimž byly aplikovány T-lymfocyty po transdukci takového antigenu.
2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že se užijí protilátky proti povrchovému antigenu CD20 a užijí se lymfocyty po transdukci antigenu CD20.
3. Použití podle nároku 2, při němž se jako protilátka proti CD20 použije humanizovaná monoklonální protilátka.
4'. Vektor pro transfekci lidských T-lymfocytů antigeny, k jejichž expresi dochází na povrchu B-lymfocytů a které nejsou přítomny na normálních lidských T-lymfocytech.
5. Vektory podle nároku 4, obsahující kódující gen pro lidský antigen CD20.
6. Lidské T-lymfocyty, vyznačující se tím, že jde o lymfocyty po transdukci antigenu, exprimovaného na povrchu B-lymfocytů, který není přítomen na normálních lidských T-lymfocyteoh.
7. T-lymfocyty podle nároku 6, vyznačuj ící se t i m, že jde o lymfocyty po transdukci lidského antigenu CD20.