JP2004523202A - 遺伝子修飾t細胞、該細胞の製造方法および該細胞の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、イン・ビボにおける同種異系移植体拒絶を予防するための、イン・ビトロで遺伝的に修飾したT細胞、それらの製造方法、およびそれらの使用に関する。移植体レシピエントのT細胞はイン・ビトロで、移植体ドナーの細胞によるかまたは優性MHC分子を発現する細胞によって刺激され、同時に免疫モジュレーション遺伝子と共に遺伝子導入によって形質導入される。前記遺伝子導入は、レトロウィルス、他のウィルス性ベクター系またはリポソームによって行うことができる。同種異系特異的T細胞を生成させ拡張させる実験に対して選択された条件により、イン・ビボへの適用に従って、T細胞が特異的に前記同種異系移植体内および排液リンパ節内に移動し、そしてその場所で、免疫モジュレーション遺伝子を発現することができることを保証する。本発明は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を予防する効果的な手段を提供し従って、移植医学において同種異系移植体(細胞、組織、器官)の寛容性を誘導及び維持するための効果的な手段を提供する。
Description
【0001】
本発明は、イン・ビボの同種異系移植体拒絶反応を予防するための、イン・ビトロ遺伝子修飾T細胞、その製法およびその使用に関する。移植体レシピエントのT細胞は、イン・ビトロにおいて、移植体ドナーの細胞によるか、または優性MHC分子を発現する細胞によって刺激され、そして同時に、遺伝子導入技術によって免疫モジュレーション遺伝子と共に形質導入される。遺伝子導入の後、形質導入されたT細胞は、免疫モジュレートされた遺伝子の発現を開始する。遺伝子導入は、レトロウィルスまたは他の非ウィルス遺伝子導入技術、例えばリポソーム配合物によって行うことができる。同種異系特異的な[allospezifischen]T細胞を発生させ拡張させる選択された実験条件により、T細胞は、イン・ビボ適用後、特異的に移植体内および排液リンパ節内に移動し、次いでこの場所で、免疫モジュレーション遺伝子を発現することができる。本発明は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を効果的に予防することを可能にし、従って、移植医学において、同種異系移植体(細胞、組織、器官)に対する寛容性を導入しかつ寛容性を維持するための有効手段となる。
【0002】
シクロスポリンA、FK506、グルココルチコイド、またはOKT3(CD3に対するモノクローナル抗体(mAk))による従来の免疫抑制による成功にもかかわらず、移植体拒絶の問題は、未だに満足に解決されていない。生涯にわたる薬剤による免疫抑制は、殆ど常に重大な副作用を招き、慢性的な拒絶反応を完全に予防することができるのはまれである。移植研究の目的は、短時間の治療で異種器官の生涯にわたる受容を達成することである。動物モデルの場合、このような要件にほぼ適ういくつかのアプローチがすでに存在する。このようなアプローチを理解するための基礎は、拒絶された組織または寛容された組織の詳細な分析である。この分析は常に、急性拒絶反応中、顆粒球、単球、およびリンパ球による組織の大規模な浸潤を示す。OKT3によるCD3陽性細胞の消耗が移植体を拒絶から保護するという事実は、Tリンパ球の臨界的な役割を示している(Ode−Hakim他、1996年)。同様に、免疫不全化された(B細胞およびT細胞のない)SCIDマウスは、外来器官を拒絶することができない。T細胞集合内部では、ヘルパーT(Th)細胞が拒絶反応のイニシエータであるように思われる。このことは、それぞれ、CD4もしくはCD8のT細胞消耗させられたマウスにおいて示された。CD8を消耗させられた前記マウスは移植体を拒絶するが、これに対して、CD4を消耗させられた前記マウスの場合には拒絶することができない(Canpos他、1995年)。Th1/Th2の範例(Mosmann他、1989年)に基づく場合には、急性拒絶の早期段階では、主にTh1が関与する。ラットモデルの場合では、半定量的PCRを用いて、移植体内で特徴的なTh−1サイトカイン(IFN−γ,IL−2)の上昇を示すことができた(Siegling他、1994a)。器官から獲得されたCD4−細胞は、イン・ビトロ再刺激後、やはり大量にTh1−サイトカインを生成する。
【0003】
全ての治療プロトコルに共通する目標は、発生及び機能におけるTh1−細胞の潜在的な損傷を阻害することである。従来の方法は、このことをリンパ球の広範囲な消耗または阻害によって試みるのに対し、比較的新しいアプローチは、T細胞活性化プロセスに介入する。CD4−レセプターに対するモノクローナル抗体は、そのシグナルを、TCRシグナルを介して変調する(Lehmann他、1992年;Siegling他、1994b)。CTLA4−Igは、抗原提示細胞(APC)のB7分子と結合し、これにより共同刺激的シグナルをブロックする(Sayegh他、1995年)。このような短期間の処理(約2週間)の終了時には、多くのモデルに安定的な寛容性が生じる(CobboldおよびWaldmann、1998年)。このような寛容性の媒介物質は、おそらく調節CD4−細胞であろう。また、これらの細胞の同系動物間の移植も寛容性を誘導可能なことも示すことができる。この現象は、1993年に初めて「感染寛容性」として記載された(Qin他、1993年)。しかしながら、これらの実験は弱い「拒絶モデル」において成功したに過ぎない。CD4(RIB5/2)に対する非消耗性抗体の補助によって、前記効果を強い拒絶反応モデルにおいても示すことが成功した(Onodera他、1996a)。半定量的PCRを用いることによって、移植された器官(いくつかの転移後も)において、インターロイキン−4(IL−4)mRNAレベルが著しく高められたことを示すことができる。このことは、Th2サイトカイン、特に。−4の重要性を示唆する。
【0004】
IL−4の他に、一連のサイトカインは、Th−1によって媒介される免疫反応をモジュレートすることができる。IL−4が誘導するTh2細胞におけるナイーブなCD4+T細胞の分化は、それらにより発生し、そしてIFN−γの分泌を強く阻害する。こうして、Th1応答の発生が抑制される(Banchereau、1991年)。主に単球/マクロファージとT細胞とによって形成されるIL−10は、多くの抗炎症特性を有している。例えば、(i)IL−10が、単球へのMHCクラスIIの発現を阻害し、(ii)炎症性サイトカイン、例えば、IFN−γ、IL−1およびIL−8、およびTNF−αの生成を阻害し、並びに(iii)同種異系活性化リンパ球(allogen aktivierter lymphozyten)を抑圧することが示された(de Waal Malefyt他、1991a;de Waal Malefyt他、1991b;Ralph他、1992年;Cassatella他、1993年;Qin他、1997年)。Th1細胞に対するT細胞とは無関係の更なる分化因子、すなわちIL−12が記載されている。このサイトカインは、マクロファージおよびB細胞から分泌され、NK細胞、CD4+T細胞、およびCD8+T細胞のIFN−γ生成を高め、そしてナイーブなCD4+T細胞のTh1細胞への分化を誘導する(Hsieh他、1993年;Germann他、1993年;Kennedy他、1994年)。IL−12は、40kDa(p40)および35kDa(p35)のサブユニットから成るヘテロ二量体糖タンパク質である。前記IL−12p40サブユニットは、ヘテロ二量体の効果を特異的に阻害することが可能である。Mattern他(1993年)によれば、マウスのIL−12p40遺伝子を導入された、COS細胞の上清は、イン・ビトロでの種々のIL−12の効果を阻害する。IL−12p40は、PHAおよびIL−12活性化脾臓細胞の増殖を阻害する。
【0005】
同種異系移植体に関する実験的および臨床的な研究において、急性拒絶段階に種々のサイトカインが発現することが判った。サイトカインの細胞起源は、Th1−細胞、Th2−細胞、細胞障害CD8+T細胞にさかのぼることができるだけでなく、非リンパ球細胞(マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞)にもさかのぼることができる(Dallman他、1991年)。Th1−サイトカインが、急性移植体拒絶の発生の上で鍵となる役割を担っていることが示唆されている。このことは、寛容性を有する動物の移植体におけるサイトカイン発現パターンの研究に基づく。このことに関しては、抗CD4モノクローナル抗体を用いた効果的な寛容性誘導のための実験において示すことができる(BenjaminおよびWaldmann、1998年;Takeuchi、1992年;Siegling他、1994a)。このメカニズム、特に、寛容性誘導にCD4+T細胞の消耗が必要でないことは、完全には明らかでない。抗CD4処理による寛容性誘導は、移植体内のTh1サイトカイン発現の顕著な抑制と関連する。その結果得られる推論は、Th1サイトカインが、同種異系移植体拒絶時の重要な役割を担っている、ということである(Siegling他、1994a、Lehmann他、1997年)。
【0006】
Th2サイトカインの意味はあまり明らかではない。寛容性を有する動物の場合、単独のTh2応答は移植反発を引き起こさない。動物の移植体内のTh2サイトカインの持続性は、付帯徴候として評価することができ、しかも、Th1応答の阻害にとっては決定的であり、ひいては移植体反応にとって決定的な基準を意味することが可能である。抗原接触直後のT細胞応答の一時的なTh1/Th2サイトカインのアンバランスが、免疫応答を永続的に形成することができるという観察により、この推測が立証される(Scott、1991年)。第1のイン・ビトロ実験は、移植モデルにおいて、移植体浸透細胞の機能にも影響を与えることができることを示している。IFN−γを生成する細胞の頻度は、組み換えられたIL−4の影響下で、50〜70%低下することができる(Merville他、1993年)。このことから、同種異系応答箇所でのIL−4の一時的な過剰発現が、移植体の受容をもたらし得るという仮説を導き出すことができる。組み換えアデノウィルスの使用によってエクス・ビボエクス・ビボ遺伝子導入が行われた後でのIL−4の過剰発現は、未処理の移植体またはリポーターコンストラクトで処理された移植体と比較して、ラットの同種異系腎臓移植モデルにおける移植体受容を著しく延長する(Kato他、1999a)。しかしながら、同種異系移植体に対する寛容性を誘導する上でのIL−4の役割については、論文において対立した意見が論じられている。例えば、それぞれ、アデノウィルス導入移植体またはIL−4遺伝子導入移植体によるIL−4の局部的な過剰生産が、移植受容を延長することが示された(Smith他、1997年;Mueller他、1997年)。他方において、IL−4を生成する遺伝子導入移植体またはシクロスポリンA治療と組み合わせるIL−4体系的な適用が、同種異系移植体の生存時間を延長できることが判っている(Takeuchi他、1997年;Rabinovitch他、1997年)。この場合留意しなければならないことは、使用する方法の記載はかなり頻繁に不十分であり、従って、方法論的な問題が結果に影響を与えるかどうか決定を下すことはできないという点である。
【0007】
IL−4とは異なり、移植体受容を延長することに対するIL−10の意味については、ほとんど異論の余地はない。従って、例えば、TGF−β1およびvIL−10、エプスタイン−バール−ウィルスでコードされた、ヒトまたはマウスIL−10に対するホモログの過剰発現が、種々の同種異系心臓移植体モデルにおいて、移植体受容を延長することが判った(Qin他、1995年;Josien他、1998年)。Kato他は、組換えアデノウィルスによってIL−4およびvIL−10を共適用すると、強拒絶モデルにおける同種異系腎臓移植体の生存時間を著しく延長することを示すことができた(Kato他、1999b)。面白いことに、このようなモデルにおいてIL−4を単独で適用しても、移植体受容の延長には影響を与えなかったことに注意されたい。
【0008】
更に、IL−12p40の過剰発現も、移植体生存時間に対してポジティブな効果を与えるように見える。従って、IL−12p40の局部的な適用は、Th1を媒体とする免疫応答を阻害し、IL−12p40に対応するcDNAと一緒に導入された同種異系筋芽細胞の拒絶を予防することを示すことができた(Kato他、1997年)。同様の結果が、糖尿病マウスの島細胞(inselzell)移植モデルにおいて得られた。この場合、IL−12p40の過剰発現は、Th1媒介自己攻撃を予防した(Rothe他、1997年;Kato他、1998年)。組換えアデノウィルスによるIL−4およびIL−12p40の共適用は、強拒絶モデルにおける同種異系腎臓移植体の生存時間を著しく延長する(Kato他、1999b)。
【0009】
サイトカイン転移上の多くの実験の主要な問題は、今なおサイトカインの適用にある。サイトカインの、体系的な付与は、生理学的な状況に相当する局部的な環境を決して創ることができない。さらに、サイトカインの半減期は血清中では極めて短く、このことは、所望の血清レベルを達成するには、治療用タンパク質を絶え間なく補充しなければならないことを意味する(H.−D. Volk,私的な報告)。
【0010】
ドナー器官のアデノウィルス媒介遺伝子導入によって、移植体内のサイトカイン発現を上昇させることができるが、しかしながら、この発現は大抵の場合、短時間でしかないか、または活性化によっては全く生じない。
【0011】
対照的に、レトロウィルス導入T細胞は安定的かつ永続的にタンパク質を出現させることができる(Blaese他、1995年)。特に活性化されたT細胞は、それらの導入遺伝子の増加した発現を示す(Quinn他、1998年;Hammer他、2000年)。
【0012】
Bromberg他は、「Transplantation,第59巻、6、809〜816、1995年」に、移植体への直接的な、レトロウィルスもしくはアデノウィルス遺伝子導入のための方法を記載している。しかしながら、前記組み換えウィルスにさらすことから患者を保護することはできない。
【0013】
本発明の課題は、公知の手段および方法の欠点が存在せず、同種異系移植体拒絶を予防するための新しい可能性を提供することである。この課題は、治療用遺伝子を発現する、イン・ビトロで遺伝子修飾された同種異系反応性T細胞(alloreaktive T−zellen)を提供することによって解決された。
【0014】
同種異系移植体拒絶を予防するための新しい方法を発見するという課題は、詳細に述べるならば、移植体レシピエントのT細胞をイン・ビトロで、移植体ドナーの細胞によるか、または優性MHC分子を発現する細胞によって刺激し、同時にまたは後から、免疫モジュレーション(治療用の、例えば、EBVまたはCMVなどに由来するウィルス性IL−10、IL−4、IL−12p40)遺伝子を遺伝子形質導入によって遺伝子導入することにより解決された。前記遺伝子導入の後、その形質導入されたT細胞は、免疫モジュレーター遺伝子の発現を開始する。前記遺伝子導入は、レトロウィルスまたは非ウィルス性の方法(リポソーム、遺伝子銃)によって行うことができる。選択された試験条件により、同種異系特異的な、形質導入されたイン・ビトロのT細胞が発生し、拡張する。修飾されたT細胞は、同系異種特性に基づいて、それらのイン・ビボ適用の後、同種異系移植体移植の時点で、同種異系移植体内及び排出リンパ節内にも移動し、そしてその場所で免疫モジュレーション(治療用)遺伝子を発現するという特性を有している。
【0015】
本発明は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を効果的に予防することを可能にする。
つまり本発明による修飾された細胞は、その同種異系特異性に基づいて移植体内に移動する。本発明による細胞の活性化レベルに応じて、IL−4、IL−10、およびIL−12p40を生成することにより、抗体接触箇所に直接的に、それぞれTh2サイトカインまたはTh1アンタゴニストの局部的な環境が提供されることが判った。このことは、IL−4、IL−10、またはIL−12p40を生成する、同種異系反応性のT細胞を、レトロウィルス遺伝子形質導入によりイン・ビトロで発生させることに成功したことを意味する。
【0016】
ここで焦点となるのは、移植された組織自体の導入遺伝子の発現である。従来、このような細胞(発生させられたT細胞)は、主に腫瘍と戦うために使用されてきた。この場合、エクス・ビボで発生させられた腫瘍特異的なT細胞は、炎症前駆性サイトカイン(例えばTNF−α)と共に導入された。このサイトカインは、後にそれらが浸透する時に腫瘍及びその転移と「戦う」。
【0017】
虚血/再灌流、感染、または拒絶発症によってストレスを与えられた移植体は、自己由来のストレスタンパク質をも発現し、免疫応答(例えば熱ショックタンパク質−HSP70、特異的自己反応性T細胞)を起こすことができる。このような細胞も、イン・ビトロで発生させることができ、生物学的「薬物配達」系として利用することができる。また、直接的な同種異系反応性T細胞(ドナーMHC分子に対する)の代わりに、間接的な同種異系反応性T細胞(レシピエントMHCによって提供されるドナーMHCペプチドに対する)を発生させて使用することができる。両アプローチの利点は、直接的な同種異系反応性T細胞と比較して、移植体に対する反応性が少ないことである。本発明により、イン・ビトロ導入された遺伝子修飾T細胞は、いわゆる両種性(amphotrophen)細胞系の細胞培養上清と一緒に培養もしくは一緒にインキュベーションすることによって得られる。これらの細胞系は例えば、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する。本発明によるイン・ビトロで形質導入された遺伝子修飾T細胞の製造手順は、次のステップからなる:
*治療用の導入遺伝子に対応してコード化する、遺伝子導入可能な組換えレトロウィルスを生成する(トランスフェクションにより)、パック(Verpackung)細胞系の製造;
*前記同種異系反応性T細胞のイン・ビトロでの発生;これは、治療用導入遺伝子を有する遺伝子導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系を培養することを意味する。さらに、リンパ球(ドナーT細胞または優性MHC分子を発現する細胞およびレシピエントT細胞)を、全血から分離する。ドナーT細胞もしくは優性MHC分子を発現する細胞系は、これらの細胞の増殖を予防するために、照射されなければならない。次いで、混合されたリンパ球培養物(一次MLC)とレトロウィルス生成パック細胞系との共培養を実施する。レトリウィルス遺伝子導入は、前記リンパ球培養物(ドナーT細胞または優性MHC分子を発現する細胞およびレシピエントT細胞)に加えたパック細胞系のウィルス上清を用いるだけで実施することもでき、これにより、パック細胞系との共培養が不要になる;
*非ウィルス性遺伝子導入法を用いる場合も、混合されたリンパ球培養物(ドナーT細胞または優性MHC分子を発現する細胞およびレシピエントT細胞)とパック細胞系との共培養が不要である。こうして生じるまたは生じた同種異系反応性T細胞は、治療用遺伝子をコードするプラスミドを用いた非ウィルス性遺伝子導入法によってイン・ビトロで直接的に導入される。
【0018】
同種異系反応性T細胞は、治療用遺伝子の「普遍的(universeller)」ベヒクルとして用いることができる。「普遍的」担体には、主に、以下のものが含まれる:
*細胞から分泌され、そして他の細胞、例えば同種異系反応性細胞または移植体浸透性細胞に、免疫調節の影響を与える遺伝子生成物(例えば、サイトカイン(IL−13、IL−10遺伝子とホモログなサイトカイン、例えば、CMV IL−10);
*調節T細胞の細胞表面に発現し、そして他の細胞(同種異系反応性細胞または移植体浸透性細胞)との相互作用によって免疫調節作用を示す遺伝子生成物〔例えば、CTLA−4、またはノッチ−リガンド/レセプターのファミリーに属する遺伝子、例えばhセラト(hSerrate)−1、hデルタ(hDelta)1もしくはノッチ(Notch)1−4〕;
*細胞内で発現し、そして細胞保護作用のために調節T細胞に延長された生存時間を与える遺伝子生成物(例えば、抗細胞消滅遺伝子、例えばbcl−2、bcl−xl、bag−1);
*細胞保護遺伝子(例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子)。
【0019】
治療用遺伝子(導入遺伝子)として好ましいのは、IL−4、IL−10、vIL−10、およびIL−2p40である。ヘムオキシゲナーゼ−1も使用することができる。
導入された遺伝子修飾T細胞は、種々の用法〔静脈投与(iv),腹腔内投与(ip)〕、これらの種々の組み合わせ、および/または、種々の用量で、種々の時点で使用することができる。
【0020】
本発明によるイン・ビトロで形質導入された遺伝子修飾T細胞は、イン・ビボの同種異系移植体拒絶を予防するのに適しており、同種異系の細胞、組織、および器官の移植に使用することができる。わずかな例としては、幹細胞、骨髄、皮膚、腎臓、心臓、肝臓、肺、中枢神経系細胞、又はランゲルハンス島を挙げることができる。この場合、移植体レシピエントのT細胞は、移植体ドナーの細胞または優性MHC分子を発現する細胞によって刺激され、同時に遺伝子導入によって形質導入される。遺伝子導入の際には、免疫モジュレーション遺伝子が導入される。その結果、同種異系移植体に対して寛容性を誘発もしくは維持することができるT細胞が発生する。
【0021】
本発明の本質は、公知のもの、すなわち、両種性細胞系、レトロウィルス性ベクター、混合されたリンパ球培養物、および新しいエレメント、すなわち、混合されたリンパ球培養物(一次MLC)と治療用レトロウィルスを生成する細胞系とからなる共培養物の組み合わせにある。これにより、遺伝子修飾T細胞が生じる。この細胞は、治療用遺伝子を発現することができ、また、同種異系特異性に基づき、同種異系移植体内および排出リンパ節内に移動することができる。この方法は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を効果的に予防するので成功であり、従って移植医学に有効な方法を提供する。
【0022】
治療用T細胞の本発明による主な使用は、同種同系移植体拒絶の予防である。本発明による(イン・ビトロ)導入された遺伝子修飾T細胞は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)に対する寛容性を導入し、寛容性を維持し、移植体レシピエントのT細胞を刺激するための手段として使用することができる。
本発明を実施例により、より詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0023】
【実施例】
《実施例1:治療用T細胞系の製造》
〈細胞系の発生〉
先ず、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する細胞系を製造する。複製不能感染性レトロウィルスを生成するための出発点として、NIH/3T3から誘導された細胞系PT67(Retropack(商標、Clontech)を使用する。PT67は、モロニーマウス白血病ウィルス(MoMuLV)の遺伝子gag、pol、およびenv(10A1−ステム)を含有する。前記細胞を、DMED10%FCS、4mM L−グルタミン、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン中、37℃、5%CO2雰囲気中で培養する。前記遺伝子ではなく治療用遺伝子及びパックシグナルを含むレトロウィルス性ベクターによるこれらの細胞系のトランスフェクションにより、複製不能レトロウィルス(すなわち、前記ウィルスは、標的細胞に感染することができるが、複製して別の細胞に感染することができない)の生成が可能になる(Coffoin他、1996年;Ausubel他、1996年)。PT67−細胞のトランスフェクションは、標準的プロトコル(Maniatis)に従って、燐酸カルシウム−トランスフェクションによって実施する。G418(0.5mg/mL)による選択により、複製不能レトロウィルスおよび前記治療用遺伝子を生成するクローン及び細胞系を確立する。IL−4およびIL−10ELISA試験を用いて前記治療用遺伝子の生成が最も高い細胞系を発見することができるの場合には、これらの細胞系を別の全ての実験に使用することができる。IL−12p40の場合には、ELISA試験を用いることができない。この場合には、バイオアッセイ(活性化脾臓細胞によるIFN−γ生成の阻止)で生物学的活性を直接的に検出する。
【0024】
《実施例2:イン・ビトロにおける同種異系反応性T細胞の生成》
混合されたリンパ球培養(レシピエントT細胞と一緒に培養した照射されたドナーT細胞)を開始する前の1〜2日間、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する細胞系を培養する(DMEM+10%FCS+最終濃度0.5mg/mLの選択抗生物質G418)。
【0025】
一日目には、混合されたリンパ球培養物(一次MCL)とレトロウィルス生成細胞系とからなる共培養を開始する:このために、前記細胞系の細胞をトリプシン化し、1,200rpmで5分間遠心分離し、そしてFCSを有さないT細胞培地(TCM)中に入れる。次いで、細胞をカウントし、96穴プレート播く(ウェル当たり2x105〜2x106)。次いで、前記細胞を、CO2インキュベータ内で37℃(5%CO2)で3〜4時間成長させ、その後、T細胞を加えた。
【0026】
移植体レシピエントのT細胞は予め末梢血液から、フィコール勾配(Fikollgradienten)によって標準的プロトコルに従って分離した。抗原提示用に、移植体ドナーの細胞(T細胞)も標準的プロトコルに従って分離する。優性MHCエピトープを発現する細胞系を使用する場合には、これらを1〜2日前に解凍し、使用までCO2インキュベータ内で培養する。
抗原提示のために(移植体レシピエントのT細胞のための刺激細胞として)使用する細胞は、混合されたリンパ球培養物に加えられる前に、30gyで10分間照射して、望ましくない増殖を阻止しなければならない。
【0027】
抗原提示細胞の照射後、これらの細胞を遠心分離し、FCSを含まない20mL−TCM中に再懸濁させる。次いで、細胞数を測定し、3%自己血清および4μg/mLポリブレン中を加えた後に、移植体レシピエント細胞及び抗原提示細胞をそれぞれ3.5x105〜4x105個ずつ有するTCM50μLを、96穴丸底プレート中に入れ(総容積100μL)、そして37℃で、CO2インキュベータ内で完全静止状態でインキュベートする。
【0028】
〈四日目〉
五日目に、前記MLCを、前記丸底プレートから平底プレートに移す。培養物の上清の最初の約50μLをピペットによって取り出し(廃棄し)、次いでT細胞を、気泡なしで2〜3回再懸濁させて、96穴平底プレート中に移す。さらに、100μLの培地(+hrIL−2,25U/mL)(新たに調製されたものであることが好ましい)を加える。次いで、その細胞を、37℃、CO2雰囲気(5%)下でさらに48時間、で培養する。
【0029】
〈六日目〉
六日目に、G418選択を実施する。すなわち、レトロウィルス遺伝子導入の間に導入されなかった全ての細胞が、G418選択の間に死滅する。逆に、レトロウィルスによって導入された細胞だけがG418選択を生き延びる。この段階から、細胞は常にG418下で培養されなければならない(G418の最終濃度0.4mg/mL)。次いで、前記培地中で、細胞をさらに48時間培養する。
【0030】
〈八日目:再刺激2“〉
第1の刺激の八日後に、細胞の再刺激を実施する。このために、第1の刺激に関して既に説明したように、移植体ドナーのPBMCまたは優性MHCエピトープを発現する細胞系使用する。細胞を、再び照射し(10分間、30Gy)、次いで遠心分離し(1,200rpm、5分間)、次いでFCSを含まないTCM20mL中に加え、そして細胞数を計数する。再刺激用に、MLC細胞を含有する96穴マイクロタイタープレートから100μLを取り出し、次いで刺激細胞6x105個を加える。さらに、3%自己血清およびG418濃度0.4mg/mLの環境を確立する。次いで、細胞をさらに2日間培養する。
【0031】
〈十日目〉
十日目には、新鮮なTCM培地(+hrIL−2,25U/mL)を添加する〔100μLを取り出し、次いで100mLのTCM培地(+hrIL−2,25U/mL)+G418,0.4mg/mLを添加する〕。次いで、細胞をさらに2日間培養する。
【0032】
〈十二日目〉
細胞培養プレートには、さらなる再刺激ステップによって増加させて臨床において適用するのに十分な数の細胞を収集することができる、増殖細胞(ブラスト)が存在するはずである。十四日目にも、生成したブラストを特別なフィコール勾配(フィコール3000)を用いて、清浄及び分離することができる。前記勾配後24時間、次の再刺激(3“)を実施する。
前記刺激には、移植体ドナーのPBMC細胞、または優性MHC分子を発現する細胞系、またはこれらの分子に対する遺伝子を導入されて遺伝子を構成的に発現する細胞系(K. Wood)を使用することができる。
【0033】
《実施例3:共培養のための別の実施例》
T細胞の導入のために、両種性細胞系との共培養の代わりに、レトロウィルスを含有する両種性細胞系の細胞培養上清だけを利用することになる。
【0034】
《実施例4:バイオアッセイ》
前記上清中の治療用遺伝子の存在は、次のものによってわかる:
IL−4、ELISA、脾臓細胞におけるMHC−IIアップレギュレーションvIL−10、ELISA、マクロファージによるTNF−α生成の阻害、単球におけるMHC−II発現の減少
IL−12p40、ELISAなし、脾臓細胞の刺激後におけるIFN−γ生成の阻害
【0035】
《実施例5:同種異系特異的なTvIL−10リンパ球の免疫調節ポテンシャル》
vIL−10に関して遺伝子導入したリンパ球によるナイーブなT細胞の増殖の阻害は、イン・ビトロで、混合されたリンパ球培養物(MLC)中で最初に検出することができた。このようなイン・ビトロ系は、同種異系器官移植後のT細胞反応性の状態を模倣しようとする。このために、ナイーブなレシピエント細胞(この細胞により移植体レシピエント細胞に相当させようとしている)を、0日目に膜染料SNARF(商標)で着色した。この染料は、同じ部分に細胞分裂するときに均等に両方の細胞に引き渡されるので、蛍光強度が減少するという特性を有している。次いで、着色されたレシピエント細胞は、照射された刺激細胞(この細胞により、移植体特異的な細胞を模造しようとしている)と共に、1:1の比(それぞれ3.5x105個の細胞)で、96穴平底プレートに播く。これらを1.20(5%)の比で添加物に供給して、ナイーブなリンパ球の抗原誘導増殖に対する治療用TvIL−10T細胞の影響を調べる。対照添加物としては、同系対照を使用し、さらに、同種異系特異的なTEGFPリンパ球(いわゆる治療用遺伝子とは無関連の対照遺伝子、増強緑色蛍光タンパク質を有する)を同じ比で使用した。蛍光強度およびその減少の測定は、蛍光流量細胞測定法(FACS)によって、一日目〜四日目に行った。治療用T細胞を含まない同種異系対照に比べて、TvIL−10リンパ球を有する添加物中で検出できた増殖阻害は、三日目および四日目で約70〜80%でることを示すことができた(図1および図2)。
【0036】
《実施例6:TvIL−10細胞による、ナイーブなTリンパ球中のインターフェロン−γ生成の阻害》
ナイーブなTリンパ球中のインターフェロン−γの生成をTvIL−10細胞によって阻止することを、MLC中においても検出した。同一の実験法が使用した。今回は、流量細胞測定器に蛍光通路1内で照射する他の膜染料(CFSE)を使用した。。IFN−γの検出は、PEマーキングされたIFN−γに対するモノクローナル細胞内抗体によって、FACS内で四日目に実施した。同種異系特異的なTvIL−10リンパ球との培養後の、ナイーブなTリンパ球中におけるIFN−γ生産の減衰は四日目で50%である(図3)。
【0037】
遺伝子導入TvIL−10細胞を、TEGFP細胞および同種異系特異的な非遺伝子導入リンパ球と、タンパク質およびRNAレベルで比較することにより、治療用細胞のサイトカイン発現パターン(rIL−2、rIFN−γ、rIL−10等)が他の細胞と異なるか否かがわかる。さらに、活性化マーカー(rCD25)、細胞消滅(FasL)、および抗細胞消滅(Bag−1)遺伝子発現パターンも分析する。このような実験は、治療用細胞を一義的に特徴付け、このようなリンパ球の可能な作用モードを分析することに貢献する。
【0038】
《実施例7:非ウィルス法による、同種異系反応性T細胞への遺伝子導入》
ウィルス性遺伝子導入のほかに、同種異系反応性の遺伝子修飾T細胞を生成させるための非ウィルス性遺伝子導入も実験することになろう。この目的に際しては、混合されたリンパ球培養物で製造された同種異系特異的T細胞を、例えば治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有する或るリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で処理する。この実験法には、ウィルス生成パック細胞系との共培養は不要である。
【0039】
《実施例8:他のウィルス性ベクター系による、同種異系反応性T細胞における遺伝子導入》
マウスのモロニー白血病ウィルス(MoMuLV)をベースとするレトロウィルス性遺伝子導入の他に、同種異系反応性の遺伝子修飾T細胞の製造も、他のウィルス性ベクター系によって保護するであろう。このことには、レンチウィルス性コンストラクト(これはヒト免疫不全ウィルス(HIV)系レトロウィルスを意味する)、アデノ関連ウィルスウィルス(AAV)系コンストラクト、およびサイトメガロウィルス(CMV)系コンストラクトによる遺伝子導入が含まれる。
【0040】
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【0044】
Ritter, T., Risch, K., Schroeder, G., Kolls, J., Siegling, A., Graser, E., Reinke P., Brock, J., Lehmann, M., Volk, H.D. Intragraft overexpression of IL−4 neither sufficient nor essential for tolerance induction to cardiac allografts in high−reponder strain combinations. Transplantation 1999, 15: 1427−1430.
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【0045】
Siegling, A, M. Lehmann, C. Platzer, F. Emmrich, H.−D. Volk A novel mutispecific competitor fragment for quanitative PCR analysis of cytokine gene expression in rats. 1994b. J. Immunol. Meth. 177: 23−28.
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【0046】
《略語一覧》
AAV アデノ伴生ウィルス
Ag 抗原
Ak 抗体
APC 抗原提示細胞
B細胞 B細胞
B7−分子 APCへの表面マーカー、Tセルの活性化に重要
bag−1 Bcl−2伴生アタノ遺伝子、抗細胞消滅遺伝子、Bcl−2と相互作用する。
bcl−2 B細胞ロイケミア−2、抗細胞消滅遺伝子
bcl−xl Bcl−2相同物、抗細胞消滅遺伝子
cDNA 相補的DNA、コピーDNA
CD 分化クラスター(cluster of differentiation、表面分子のための専門語)
CD4 特異的表面マーカーおよびTヘルパー細胞
CMV サイトメガロウィルス
(RIB5/2) CD4−分子に方向付けされたモノクローナル抗体に対応する符号
CD8 T− 細胞障害性T細胞における特異的な表面マーカー
CMV IL−10 サイトメガロウィルスIL−10、ヒトIL−10もしくはvIL−10とホモログ
CTLA−4 細胞毒性T細胞後期抗体
CTLA4−Ig 融合蛋白、CTLA−4(細胞障害性T細胞後期抗体)と、IgG抗体のFc部分とから成る
DMEM ダルベッコ改変イーグル培地
DNA デオキシリボ核酸
EBV エプスタイン−バールウィルス
EGFP 増強増強緑色蛍光タンパク質、緑色発光レポーター遺伝子
ELIZA 酵素結合イムノソルベントアッセイ
gy Gray(Gy)
hDelta1 ホモサピエンスデルタ(ショウジョウバエ)−1状(ノッチリガンド[Notch−ligand]のファミリーに由来)
hSerrate−1 ホモサピエンスセラト1(ノッチリガンドのファミリーに由来)
FCS 牛胎児血清
IFN インターフェロン
Ig 免疫グロブリン
IL インターロイキン
kDa キロ・ダルトン
mab モノクローナル抗体
MHC 主要組織適合性複合体
MLC 混合されたリンパ球培養物
mRNA メッセンジャーリボ核酸
NIH/3T3 マウス繊維芽細胞
NK細胞 ナチュラルキラー細胞
Notch(ノッチ)1−4 ホモサピエンスノッチ(ショウジョウバエ)ホモログ1−4(ノッチレセプター)
OKT3 CD3に対するmab
PBMC 末梢血液単核細胞
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PHA フィトヘマグルチニン
SCID−マウス BおよびT細胞を有していない免疫不全マウス
TCM T細胞培地
TCRシグナル T細胞レセプター
TGF トランスフォーミング成長因子
Tリンパ球 胸腺に関連または由来するリンパ球
T細胞 胸腺に由来するTリンパ球
Th1−細胞 Tヘルパー1表現型を有するT細胞
Th2 Tヘルパー2表現型を有するT細胞
TNF 腫瘍壊死因子
vIL−10 ウィルス性インターロイキン10、エプスタイン−バールウィルスに由来し、ヒトIL−10に対して高い相同性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】
三日目の増殖阻止率を示す棒グラフである。(実施例5)
【図2】
四日目の増殖阻止率を示す棒グラフである。(実施例5)
【図3】
四日目のIFN−γ生産を示す棒グラフである。(実施例6)
本発明は、イン・ビボの同種異系移植体拒絶反応を予防するための、イン・ビトロ遺伝子修飾T細胞、その製法およびその使用に関する。移植体レシピエントのT細胞は、イン・ビトロにおいて、移植体ドナーの細胞によるか、または優性MHC分子を発現する細胞によって刺激され、そして同時に、遺伝子導入技術によって免疫モジュレーション遺伝子と共に形質導入される。遺伝子導入の後、形質導入されたT細胞は、免疫モジュレートされた遺伝子の発現を開始する。遺伝子導入は、レトロウィルスまたは他の非ウィルス遺伝子導入技術、例えばリポソーム配合物によって行うことができる。同種異系特異的な[allospezifischen]T細胞を発生させ拡張させる選択された実験条件により、T細胞は、イン・ビボ適用後、特異的に移植体内および排液リンパ節内に移動し、次いでこの場所で、免疫モジュレーション遺伝子を発現することができる。本発明は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を効果的に予防することを可能にし、従って、移植医学において、同種異系移植体(細胞、組織、器官)に対する寛容性を導入しかつ寛容性を維持するための有効手段となる。
【0002】
シクロスポリンA、FK506、グルココルチコイド、またはOKT3(CD3に対するモノクローナル抗体(mAk))による従来の免疫抑制による成功にもかかわらず、移植体拒絶の問題は、未だに満足に解決されていない。生涯にわたる薬剤による免疫抑制は、殆ど常に重大な副作用を招き、慢性的な拒絶反応を完全に予防することができるのはまれである。移植研究の目的は、短時間の治療で異種器官の生涯にわたる受容を達成することである。動物モデルの場合、このような要件にほぼ適ういくつかのアプローチがすでに存在する。このようなアプローチを理解するための基礎は、拒絶された組織または寛容された組織の詳細な分析である。この分析は常に、急性拒絶反応中、顆粒球、単球、およびリンパ球による組織の大規模な浸潤を示す。OKT3によるCD3陽性細胞の消耗が移植体を拒絶から保護するという事実は、Tリンパ球の臨界的な役割を示している(Ode−Hakim他、1996年)。同様に、免疫不全化された(B細胞およびT細胞のない)SCIDマウスは、外来器官を拒絶することができない。T細胞集合内部では、ヘルパーT(Th)細胞が拒絶反応のイニシエータであるように思われる。このことは、それぞれ、CD4もしくはCD8のT細胞消耗させられたマウスにおいて示された。CD8を消耗させられた前記マウスは移植体を拒絶するが、これに対して、CD4を消耗させられた前記マウスの場合には拒絶することができない(Canpos他、1995年)。Th1/Th2の範例(Mosmann他、1989年)に基づく場合には、急性拒絶の早期段階では、主にTh1が関与する。ラットモデルの場合では、半定量的PCRを用いて、移植体内で特徴的なTh−1サイトカイン(IFN−γ,IL−2)の上昇を示すことができた(Siegling他、1994a)。器官から獲得されたCD4−細胞は、イン・ビトロ再刺激後、やはり大量にTh1−サイトカインを生成する。
【0003】
全ての治療プロトコルに共通する目標は、発生及び機能におけるTh1−細胞の潜在的な損傷を阻害することである。従来の方法は、このことをリンパ球の広範囲な消耗または阻害によって試みるのに対し、比較的新しいアプローチは、T細胞活性化プロセスに介入する。CD4−レセプターに対するモノクローナル抗体は、そのシグナルを、TCRシグナルを介して変調する(Lehmann他、1992年;Siegling他、1994b)。CTLA4−Igは、抗原提示細胞(APC)のB7分子と結合し、これにより共同刺激的シグナルをブロックする(Sayegh他、1995年)。このような短期間の処理(約2週間)の終了時には、多くのモデルに安定的な寛容性が生じる(CobboldおよびWaldmann、1998年)。このような寛容性の媒介物質は、おそらく調節CD4−細胞であろう。また、これらの細胞の同系動物間の移植も寛容性を誘導可能なことも示すことができる。この現象は、1993年に初めて「感染寛容性」として記載された(Qin他、1993年)。しかしながら、これらの実験は弱い「拒絶モデル」において成功したに過ぎない。CD4(RIB5/2)に対する非消耗性抗体の補助によって、前記効果を強い拒絶反応モデルにおいても示すことが成功した(Onodera他、1996a)。半定量的PCRを用いることによって、移植された器官(いくつかの転移後も)において、インターロイキン−4(IL−4)mRNAレベルが著しく高められたことを示すことができる。このことは、Th2サイトカイン、特に。−4の重要性を示唆する。
【0004】
IL−4の他に、一連のサイトカインは、Th−1によって媒介される免疫反応をモジュレートすることができる。IL−4が誘導するTh2細胞におけるナイーブなCD4+T細胞の分化は、それらにより発生し、そしてIFN−γの分泌を強く阻害する。こうして、Th1応答の発生が抑制される(Banchereau、1991年)。主に単球/マクロファージとT細胞とによって形成されるIL−10は、多くの抗炎症特性を有している。例えば、(i)IL−10が、単球へのMHCクラスIIの発現を阻害し、(ii)炎症性サイトカイン、例えば、IFN−γ、IL−1およびIL−8、およびTNF−αの生成を阻害し、並びに(iii)同種異系活性化リンパ球(allogen aktivierter lymphozyten)を抑圧することが示された(de Waal Malefyt他、1991a;de Waal Malefyt他、1991b;Ralph他、1992年;Cassatella他、1993年;Qin他、1997年)。Th1細胞に対するT細胞とは無関係の更なる分化因子、すなわちIL−12が記載されている。このサイトカインは、マクロファージおよびB細胞から分泌され、NK細胞、CD4+T細胞、およびCD8+T細胞のIFN−γ生成を高め、そしてナイーブなCD4+T細胞のTh1細胞への分化を誘導する(Hsieh他、1993年;Germann他、1993年;Kennedy他、1994年)。IL−12は、40kDa(p40)および35kDa(p35)のサブユニットから成るヘテロ二量体糖タンパク質である。前記IL−12p40サブユニットは、ヘテロ二量体の効果を特異的に阻害することが可能である。Mattern他(1993年)によれば、マウスのIL−12p40遺伝子を導入された、COS細胞の上清は、イン・ビトロでの種々のIL−12の効果を阻害する。IL−12p40は、PHAおよびIL−12活性化脾臓細胞の増殖を阻害する。
【0005】
同種異系移植体に関する実験的および臨床的な研究において、急性拒絶段階に種々のサイトカインが発現することが判った。サイトカインの細胞起源は、Th1−細胞、Th2−細胞、細胞障害CD8+T細胞にさかのぼることができるだけでなく、非リンパ球細胞(マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞)にもさかのぼることができる(Dallman他、1991年)。Th1−サイトカインが、急性移植体拒絶の発生の上で鍵となる役割を担っていることが示唆されている。このことは、寛容性を有する動物の移植体におけるサイトカイン発現パターンの研究に基づく。このことに関しては、抗CD4モノクローナル抗体を用いた効果的な寛容性誘導のための実験において示すことができる(BenjaminおよびWaldmann、1998年;Takeuchi、1992年;Siegling他、1994a)。このメカニズム、特に、寛容性誘導にCD4+T細胞の消耗が必要でないことは、完全には明らかでない。抗CD4処理による寛容性誘導は、移植体内のTh1サイトカイン発現の顕著な抑制と関連する。その結果得られる推論は、Th1サイトカインが、同種異系移植体拒絶時の重要な役割を担っている、ということである(Siegling他、1994a、Lehmann他、1997年)。
【0006】
Th2サイトカインの意味はあまり明らかではない。寛容性を有する動物の場合、単独のTh2応答は移植反発を引き起こさない。動物の移植体内のTh2サイトカインの持続性は、付帯徴候として評価することができ、しかも、Th1応答の阻害にとっては決定的であり、ひいては移植体反応にとって決定的な基準を意味することが可能である。抗原接触直後のT細胞応答の一時的なTh1/Th2サイトカインのアンバランスが、免疫応答を永続的に形成することができるという観察により、この推測が立証される(Scott、1991年)。第1のイン・ビトロ実験は、移植モデルにおいて、移植体浸透細胞の機能にも影響を与えることができることを示している。IFN−γを生成する細胞の頻度は、組み換えられたIL−4の影響下で、50〜70%低下することができる(Merville他、1993年)。このことから、同種異系応答箇所でのIL−4の一時的な過剰発現が、移植体の受容をもたらし得るという仮説を導き出すことができる。組み換えアデノウィルスの使用によってエクス・ビボエクス・ビボ遺伝子導入が行われた後でのIL−4の過剰発現は、未処理の移植体またはリポーターコンストラクトで処理された移植体と比較して、ラットの同種異系腎臓移植モデルにおける移植体受容を著しく延長する(Kato他、1999a)。しかしながら、同種異系移植体に対する寛容性を誘導する上でのIL−4の役割については、論文において対立した意見が論じられている。例えば、それぞれ、アデノウィルス導入移植体またはIL−4遺伝子導入移植体によるIL−4の局部的な過剰生産が、移植受容を延長することが示された(Smith他、1997年;Mueller他、1997年)。他方において、IL−4を生成する遺伝子導入移植体またはシクロスポリンA治療と組み合わせるIL−4体系的な適用が、同種異系移植体の生存時間を延長できることが判っている(Takeuchi他、1997年;Rabinovitch他、1997年)。この場合留意しなければならないことは、使用する方法の記載はかなり頻繁に不十分であり、従って、方法論的な問題が結果に影響を与えるかどうか決定を下すことはできないという点である。
【0007】
IL−4とは異なり、移植体受容を延長することに対するIL−10の意味については、ほとんど異論の余地はない。従って、例えば、TGF−β1およびvIL−10、エプスタイン−バール−ウィルスでコードされた、ヒトまたはマウスIL−10に対するホモログの過剰発現が、種々の同種異系心臓移植体モデルにおいて、移植体受容を延長することが判った(Qin他、1995年;Josien他、1998年)。Kato他は、組換えアデノウィルスによってIL−4およびvIL−10を共適用すると、強拒絶モデルにおける同種異系腎臓移植体の生存時間を著しく延長することを示すことができた(Kato他、1999b)。面白いことに、このようなモデルにおいてIL−4を単独で適用しても、移植体受容の延長には影響を与えなかったことに注意されたい。
【0008】
更に、IL−12p40の過剰発現も、移植体生存時間に対してポジティブな効果を与えるように見える。従って、IL−12p40の局部的な適用は、Th1を媒体とする免疫応答を阻害し、IL−12p40に対応するcDNAと一緒に導入された同種異系筋芽細胞の拒絶を予防することを示すことができた(Kato他、1997年)。同様の結果が、糖尿病マウスの島細胞(inselzell)移植モデルにおいて得られた。この場合、IL−12p40の過剰発現は、Th1媒介自己攻撃を予防した(Rothe他、1997年;Kato他、1998年)。組換えアデノウィルスによるIL−4およびIL−12p40の共適用は、強拒絶モデルにおける同種異系腎臓移植体の生存時間を著しく延長する(Kato他、1999b)。
【0009】
サイトカイン転移上の多くの実験の主要な問題は、今なおサイトカインの適用にある。サイトカインの、体系的な付与は、生理学的な状況に相当する局部的な環境を決して創ることができない。さらに、サイトカインの半減期は血清中では極めて短く、このことは、所望の血清レベルを達成するには、治療用タンパク質を絶え間なく補充しなければならないことを意味する(H.−D. Volk,私的な報告)。
【0010】
ドナー器官のアデノウィルス媒介遺伝子導入によって、移植体内のサイトカイン発現を上昇させることができるが、しかしながら、この発現は大抵の場合、短時間でしかないか、または活性化によっては全く生じない。
【0011】
対照的に、レトロウィルス導入T細胞は安定的かつ永続的にタンパク質を出現させることができる(Blaese他、1995年)。特に活性化されたT細胞は、それらの導入遺伝子の増加した発現を示す(Quinn他、1998年;Hammer他、2000年)。
【0012】
Bromberg他は、「Transplantation,第59巻、6、809〜816、1995年」に、移植体への直接的な、レトロウィルスもしくはアデノウィルス遺伝子導入のための方法を記載している。しかしながら、前記組み換えウィルスにさらすことから患者を保護することはできない。
【0013】
本発明の課題は、公知の手段および方法の欠点が存在せず、同種異系移植体拒絶を予防するための新しい可能性を提供することである。この課題は、治療用遺伝子を発現する、イン・ビトロで遺伝子修飾された同種異系反応性T細胞(alloreaktive T−zellen)を提供することによって解決された。
【0014】
同種異系移植体拒絶を予防するための新しい方法を発見するという課題は、詳細に述べるならば、移植体レシピエントのT細胞をイン・ビトロで、移植体ドナーの細胞によるか、または優性MHC分子を発現する細胞によって刺激し、同時にまたは後から、免疫モジュレーション(治療用の、例えば、EBVまたはCMVなどに由来するウィルス性IL−10、IL−4、IL−12p40)遺伝子を遺伝子形質導入によって遺伝子導入することにより解決された。前記遺伝子導入の後、その形質導入されたT細胞は、免疫モジュレーター遺伝子の発現を開始する。前記遺伝子導入は、レトロウィルスまたは非ウィルス性の方法(リポソーム、遺伝子銃)によって行うことができる。選択された試験条件により、同種異系特異的な、形質導入されたイン・ビトロのT細胞が発生し、拡張する。修飾されたT細胞は、同系異種特性に基づいて、それらのイン・ビボ適用の後、同種異系移植体移植の時点で、同種異系移植体内及び排出リンパ節内にも移動し、そしてその場所で免疫モジュレーション(治療用)遺伝子を発現するという特性を有している。
【0015】
本発明は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を効果的に予防することを可能にする。
つまり本発明による修飾された細胞は、その同種異系特異性に基づいて移植体内に移動する。本発明による細胞の活性化レベルに応じて、IL−4、IL−10、およびIL−12p40を生成することにより、抗体接触箇所に直接的に、それぞれTh2サイトカインまたはTh1アンタゴニストの局部的な環境が提供されることが判った。このことは、IL−4、IL−10、またはIL−12p40を生成する、同種異系反応性のT細胞を、レトロウィルス遺伝子形質導入によりイン・ビトロで発生させることに成功したことを意味する。
【0016】
ここで焦点となるのは、移植された組織自体の導入遺伝子の発現である。従来、このような細胞(発生させられたT細胞)は、主に腫瘍と戦うために使用されてきた。この場合、エクス・ビボで発生させられた腫瘍特異的なT細胞は、炎症前駆性サイトカイン(例えばTNF−α)と共に導入された。このサイトカインは、後にそれらが浸透する時に腫瘍及びその転移と「戦う」。
【0017】
虚血/再灌流、感染、または拒絶発症によってストレスを与えられた移植体は、自己由来のストレスタンパク質をも発現し、免疫応答(例えば熱ショックタンパク質−HSP70、特異的自己反応性T細胞)を起こすことができる。このような細胞も、イン・ビトロで発生させることができ、生物学的「薬物配達」系として利用することができる。また、直接的な同種異系反応性T細胞(ドナーMHC分子に対する)の代わりに、間接的な同種異系反応性T細胞(レシピエントMHCによって提供されるドナーMHCペプチドに対する)を発生させて使用することができる。両アプローチの利点は、直接的な同種異系反応性T細胞と比較して、移植体に対する反応性が少ないことである。本発明により、イン・ビトロ導入された遺伝子修飾T細胞は、いわゆる両種性(amphotrophen)細胞系の細胞培養上清と一緒に培養もしくは一緒にインキュベーションすることによって得られる。これらの細胞系は例えば、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する。本発明によるイン・ビトロで形質導入された遺伝子修飾T細胞の製造手順は、次のステップからなる:
*治療用の導入遺伝子に対応してコード化する、遺伝子導入可能な組換えレトロウィルスを生成する(トランスフェクションにより)、パック(Verpackung)細胞系の製造;
*前記同種異系反応性T細胞のイン・ビトロでの発生;これは、治療用導入遺伝子を有する遺伝子導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系を培養することを意味する。さらに、リンパ球(ドナーT細胞または優性MHC分子を発現する細胞およびレシピエントT細胞)を、全血から分離する。ドナーT細胞もしくは優性MHC分子を発現する細胞系は、これらの細胞の増殖を予防するために、照射されなければならない。次いで、混合されたリンパ球培養物(一次MLC)とレトロウィルス生成パック細胞系との共培養を実施する。レトリウィルス遺伝子導入は、前記リンパ球培養物(ドナーT細胞または優性MHC分子を発現する細胞およびレシピエントT細胞)に加えたパック細胞系のウィルス上清を用いるだけで実施することもでき、これにより、パック細胞系との共培養が不要になる;
*非ウィルス性遺伝子導入法を用いる場合も、混合されたリンパ球培養物(ドナーT細胞または優性MHC分子を発現する細胞およびレシピエントT細胞)とパック細胞系との共培養が不要である。こうして生じるまたは生じた同種異系反応性T細胞は、治療用遺伝子をコードするプラスミドを用いた非ウィルス性遺伝子導入法によってイン・ビトロで直接的に導入される。
【0018】
同種異系反応性T細胞は、治療用遺伝子の「普遍的(universeller)」ベヒクルとして用いることができる。「普遍的」担体には、主に、以下のものが含まれる:
*細胞から分泌され、そして他の細胞、例えば同種異系反応性細胞または移植体浸透性細胞に、免疫調節の影響を与える遺伝子生成物(例えば、サイトカイン(IL−13、IL−10遺伝子とホモログなサイトカイン、例えば、CMV IL−10);
*調節T細胞の細胞表面に発現し、そして他の細胞(同種異系反応性細胞または移植体浸透性細胞)との相互作用によって免疫調節作用を示す遺伝子生成物〔例えば、CTLA−4、またはノッチ−リガンド/レセプターのファミリーに属する遺伝子、例えばhセラト(hSerrate)−1、hデルタ(hDelta)1もしくはノッチ(Notch)1−4〕;
*細胞内で発現し、そして細胞保護作用のために調節T細胞に延長された生存時間を与える遺伝子生成物(例えば、抗細胞消滅遺伝子、例えばbcl−2、bcl−xl、bag−1);
*細胞保護遺伝子(例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子)。
【0019】
治療用遺伝子(導入遺伝子)として好ましいのは、IL−4、IL−10、vIL−10、およびIL−2p40である。ヘムオキシゲナーゼ−1も使用することができる。
導入された遺伝子修飾T細胞は、種々の用法〔静脈投与(iv),腹腔内投与(ip)〕、これらの種々の組み合わせ、および/または、種々の用量で、種々の時点で使用することができる。
【0020】
本発明によるイン・ビトロで形質導入された遺伝子修飾T細胞は、イン・ビボの同種異系移植体拒絶を予防するのに適しており、同種異系の細胞、組織、および器官の移植に使用することができる。わずかな例としては、幹細胞、骨髄、皮膚、腎臓、心臓、肝臓、肺、中枢神経系細胞、又はランゲルハンス島を挙げることができる。この場合、移植体レシピエントのT細胞は、移植体ドナーの細胞または優性MHC分子を発現する細胞によって刺激され、同時に遺伝子導入によって形質導入される。遺伝子導入の際には、免疫モジュレーション遺伝子が導入される。その結果、同種異系移植体に対して寛容性を誘発もしくは維持することができるT細胞が発生する。
【0021】
本発明の本質は、公知のもの、すなわち、両種性細胞系、レトロウィルス性ベクター、混合されたリンパ球培養物、および新しいエレメント、すなわち、混合されたリンパ球培養物(一次MLC)と治療用レトロウィルスを生成する細胞系とからなる共培養物の組み合わせにある。これにより、遺伝子修飾T細胞が生じる。この細胞は、治療用遺伝子を発現することができ、また、同種異系特異性に基づき、同種異系移植体内および排出リンパ節内に移動することができる。この方法は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)の拒絶を効果的に予防するので成功であり、従って移植医学に有効な方法を提供する。
【0022】
治療用T細胞の本発明による主な使用は、同種同系移植体拒絶の予防である。本発明による(イン・ビトロ)導入された遺伝子修飾T細胞は、同種異系移植体(細胞、組織、器官)に対する寛容性を導入し、寛容性を維持し、移植体レシピエントのT細胞を刺激するための手段として使用することができる。
本発明を実施例により、より詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0023】
【実施例】
《実施例1:治療用T細胞系の製造》
〈細胞系の発生〉
先ず、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する細胞系を製造する。複製不能感染性レトロウィルスを生成するための出発点として、NIH/3T3から誘導された細胞系PT67(Retropack(商標、Clontech)を使用する。PT67は、モロニーマウス白血病ウィルス(MoMuLV)の遺伝子gag、pol、およびenv(10A1−ステム)を含有する。前記細胞を、DMED10%FCS、4mM L−グルタミン、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン中、37℃、5%CO2雰囲気中で培養する。前記遺伝子ではなく治療用遺伝子及びパックシグナルを含むレトロウィルス性ベクターによるこれらの細胞系のトランスフェクションにより、複製不能レトロウィルス(すなわち、前記ウィルスは、標的細胞に感染することができるが、複製して別の細胞に感染することができない)の生成が可能になる(Coffoin他、1996年;Ausubel他、1996年)。PT67−細胞のトランスフェクションは、標準的プロトコル(Maniatis)に従って、燐酸カルシウム−トランスフェクションによって実施する。G418(0.5mg/mL)による選択により、複製不能レトロウィルスおよび前記治療用遺伝子を生成するクローン及び細胞系を確立する。IL−4およびIL−10ELISA試験を用いて前記治療用遺伝子の生成が最も高い細胞系を発見することができるの場合には、これらの細胞系を別の全ての実験に使用することができる。IL−12p40の場合には、ELISA試験を用いることができない。この場合には、バイオアッセイ(活性化脾臓細胞によるIFN−γ生成の阻止)で生物学的活性を直接的に検出する。
【0024】
《実施例2:イン・ビトロにおける同種異系反応性T細胞の生成》
混合されたリンパ球培養(レシピエントT細胞と一緒に培養した照射されたドナーT細胞)を開始する前の1〜2日間、治療用導入遺伝子を有する組換えレトロウィルスを生成する細胞系を培養する(DMEM+10%FCS+最終濃度0.5mg/mLの選択抗生物質G418)。
【0025】
一日目には、混合されたリンパ球培養物(一次MCL)とレトロウィルス生成細胞系とからなる共培養を開始する:このために、前記細胞系の細胞をトリプシン化し、1,200rpmで5分間遠心分離し、そしてFCSを有さないT細胞培地(TCM)中に入れる。次いで、細胞をカウントし、96穴プレート播く(ウェル当たり2x105〜2x106)。次いで、前記細胞を、CO2インキュベータ内で37℃(5%CO2)で3〜4時間成長させ、その後、T細胞を加えた。
【0026】
移植体レシピエントのT細胞は予め末梢血液から、フィコール勾配(Fikollgradienten)によって標準的プロトコルに従って分離した。抗原提示用に、移植体ドナーの細胞(T細胞)も標準的プロトコルに従って分離する。優性MHCエピトープを発現する細胞系を使用する場合には、これらを1〜2日前に解凍し、使用までCO2インキュベータ内で培養する。
抗原提示のために(移植体レシピエントのT細胞のための刺激細胞として)使用する細胞は、混合されたリンパ球培養物に加えられる前に、30gyで10分間照射して、望ましくない増殖を阻止しなければならない。
【0027】
抗原提示細胞の照射後、これらの細胞を遠心分離し、FCSを含まない20mL−TCM中に再懸濁させる。次いで、細胞数を測定し、3%自己血清および4μg/mLポリブレン中を加えた後に、移植体レシピエント細胞及び抗原提示細胞をそれぞれ3.5x105〜4x105個ずつ有するTCM50μLを、96穴丸底プレート中に入れ(総容積100μL)、そして37℃で、CO2インキュベータ内で完全静止状態でインキュベートする。
【0028】
〈四日目〉
五日目に、前記MLCを、前記丸底プレートから平底プレートに移す。培養物の上清の最初の約50μLをピペットによって取り出し(廃棄し)、次いでT細胞を、気泡なしで2〜3回再懸濁させて、96穴平底プレート中に移す。さらに、100μLの培地(+hrIL−2,25U/mL)(新たに調製されたものであることが好ましい)を加える。次いで、その細胞を、37℃、CO2雰囲気(5%)下でさらに48時間、で培養する。
【0029】
〈六日目〉
六日目に、G418選択を実施する。すなわち、レトロウィルス遺伝子導入の間に導入されなかった全ての細胞が、G418選択の間に死滅する。逆に、レトロウィルスによって導入された細胞だけがG418選択を生き延びる。この段階から、細胞は常にG418下で培養されなければならない(G418の最終濃度0.4mg/mL)。次いで、前記培地中で、細胞をさらに48時間培養する。
【0030】
〈八日目:再刺激2“〉
第1の刺激の八日後に、細胞の再刺激を実施する。このために、第1の刺激に関して既に説明したように、移植体ドナーのPBMCまたは優性MHCエピトープを発現する細胞系使用する。細胞を、再び照射し(10分間、30Gy)、次いで遠心分離し(1,200rpm、5分間)、次いでFCSを含まないTCM20mL中に加え、そして細胞数を計数する。再刺激用に、MLC細胞を含有する96穴マイクロタイタープレートから100μLを取り出し、次いで刺激細胞6x105個を加える。さらに、3%自己血清およびG418濃度0.4mg/mLの環境を確立する。次いで、細胞をさらに2日間培養する。
【0031】
〈十日目〉
十日目には、新鮮なTCM培地(+hrIL−2,25U/mL)を添加する〔100μLを取り出し、次いで100mLのTCM培地(+hrIL−2,25U/mL)+G418,0.4mg/mLを添加する〕。次いで、細胞をさらに2日間培養する。
【0032】
〈十二日目〉
細胞培養プレートには、さらなる再刺激ステップによって増加させて臨床において適用するのに十分な数の細胞を収集することができる、増殖細胞(ブラスト)が存在するはずである。十四日目にも、生成したブラストを特別なフィコール勾配(フィコール3000)を用いて、清浄及び分離することができる。前記勾配後24時間、次の再刺激(3“)を実施する。
前記刺激には、移植体ドナーのPBMC細胞、または優性MHC分子を発現する細胞系、またはこれらの分子に対する遺伝子を導入されて遺伝子を構成的に発現する細胞系(K. Wood)を使用することができる。
【0033】
《実施例3:共培養のための別の実施例》
T細胞の導入のために、両種性細胞系との共培養の代わりに、レトロウィルスを含有する両種性細胞系の細胞培養上清だけを利用することになる。
【0034】
《実施例4:バイオアッセイ》
前記上清中の治療用遺伝子の存在は、次のものによってわかる:
IL−4、ELISA、脾臓細胞におけるMHC−IIアップレギュレーションvIL−10、ELISA、マクロファージによるTNF−α生成の阻害、単球におけるMHC−II発現の減少
IL−12p40、ELISAなし、脾臓細胞の刺激後におけるIFN−γ生成の阻害
【0035】
《実施例5:同種異系特異的なTvIL−10リンパ球の免疫調節ポテンシャル》
vIL−10に関して遺伝子導入したリンパ球によるナイーブなT細胞の増殖の阻害は、イン・ビトロで、混合されたリンパ球培養物(MLC)中で最初に検出することができた。このようなイン・ビトロ系は、同種異系器官移植後のT細胞反応性の状態を模倣しようとする。このために、ナイーブなレシピエント細胞(この細胞により移植体レシピエント細胞に相当させようとしている)を、0日目に膜染料SNARF(商標)で着色した。この染料は、同じ部分に細胞分裂するときに均等に両方の細胞に引き渡されるので、蛍光強度が減少するという特性を有している。次いで、着色されたレシピエント細胞は、照射された刺激細胞(この細胞により、移植体特異的な細胞を模造しようとしている)と共に、1:1の比(それぞれ3.5x105個の細胞)で、96穴平底プレートに播く。これらを1.20(5%)の比で添加物に供給して、ナイーブなリンパ球の抗原誘導増殖に対する治療用TvIL−10T細胞の影響を調べる。対照添加物としては、同系対照を使用し、さらに、同種異系特異的なTEGFPリンパ球(いわゆる治療用遺伝子とは無関連の対照遺伝子、増強緑色蛍光タンパク質を有する)を同じ比で使用した。蛍光強度およびその減少の測定は、蛍光流量細胞測定法(FACS)によって、一日目〜四日目に行った。治療用T細胞を含まない同種異系対照に比べて、TvIL−10リンパ球を有する添加物中で検出できた増殖阻害は、三日目および四日目で約70〜80%でることを示すことができた(図1および図2)。
【0036】
《実施例6:TvIL−10細胞による、ナイーブなTリンパ球中のインターフェロン−γ生成の阻害》
ナイーブなTリンパ球中のインターフェロン−γの生成をTvIL−10細胞によって阻止することを、MLC中においても検出した。同一の実験法が使用した。今回は、流量細胞測定器に蛍光通路1内で照射する他の膜染料(CFSE)を使用した。。IFN−γの検出は、PEマーキングされたIFN−γに対するモノクローナル細胞内抗体によって、FACS内で四日目に実施した。同種異系特異的なTvIL−10リンパ球との培養後の、ナイーブなTリンパ球中におけるIFN−γ生産の減衰は四日目で50%である(図3)。
【0037】
遺伝子導入TvIL−10細胞を、TEGFP細胞および同種異系特異的な非遺伝子導入リンパ球と、タンパク質およびRNAレベルで比較することにより、治療用細胞のサイトカイン発現パターン(rIL−2、rIFN−γ、rIL−10等)が他の細胞と異なるか否かがわかる。さらに、活性化マーカー(rCD25)、細胞消滅(FasL)、および抗細胞消滅(Bag−1)遺伝子発現パターンも分析する。このような実験は、治療用細胞を一義的に特徴付け、このようなリンパ球の可能な作用モードを分析することに貢献する。
【0038】
《実施例7:非ウィルス法による、同種異系反応性T細胞への遺伝子導入》
ウィルス性遺伝子導入のほかに、同種異系反応性の遺伝子修飾T細胞を生成させるための非ウィルス性遺伝子導入も実験することになろう。この目的に際しては、混合されたリンパ球培養物で製造された同種異系特異的T細胞を、例えば治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有する或るリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で処理する。この実験法には、ウィルス生成パック細胞系との共培養は不要である。
【0039】
《実施例8:他のウィルス性ベクター系による、同種異系反応性T細胞における遺伝子導入》
マウスのモロニー白血病ウィルス(MoMuLV)をベースとするレトロウィルス性遺伝子導入の他に、同種異系反応性の遺伝子修飾T細胞の製造も、他のウィルス性ベクター系によって保護するであろう。このことには、レンチウィルス性コンストラクト(これはヒト免疫不全ウィルス(HIV)系レトロウィルスを意味する)、アデノ関連ウィルスウィルス(AAV)系コンストラクト、およびサイトメガロウィルス(CMV)系コンストラクトによる遺伝子導入が含まれる。
【0040】
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【0046】
《略語一覧》
AAV アデノ伴生ウィルス
Ag 抗原
Ak 抗体
APC 抗原提示細胞
B細胞 B細胞
B7−分子 APCへの表面マーカー、Tセルの活性化に重要
bag−1 Bcl−2伴生アタノ遺伝子、抗細胞消滅遺伝子、Bcl−2と相互作用する。
bcl−2 B細胞ロイケミア−2、抗細胞消滅遺伝子
bcl−xl Bcl−2相同物、抗細胞消滅遺伝子
cDNA 相補的DNA、コピーDNA
CD 分化クラスター(cluster of differentiation、表面分子のための専門語)
CD4 特異的表面マーカーおよびTヘルパー細胞
CMV サイトメガロウィルス
(RIB5/2) CD4−分子に方向付けされたモノクローナル抗体に対応する符号
CD8 T− 細胞障害性T細胞における特異的な表面マーカー
CMV IL−10 サイトメガロウィルスIL−10、ヒトIL−10もしくはvIL−10とホモログ
CTLA−4 細胞毒性T細胞後期抗体
CTLA4−Ig 融合蛋白、CTLA−4(細胞障害性T細胞後期抗体)と、IgG抗体のFc部分とから成る
DMEM ダルベッコ改変イーグル培地
DNA デオキシリボ核酸
EBV エプスタイン−バールウィルス
EGFP 増強増強緑色蛍光タンパク質、緑色発光レポーター遺伝子
ELIZA 酵素結合イムノソルベントアッセイ
gy Gray(Gy)
hDelta1 ホモサピエンスデルタ(ショウジョウバエ)−1状(ノッチリガンド[Notch−ligand]のファミリーに由来)
hSerrate−1 ホモサピエンスセラト1(ノッチリガンドのファミリーに由来)
FCS 牛胎児血清
IFN インターフェロン
Ig 免疫グロブリン
IL インターロイキン
kDa キロ・ダルトン
mab モノクローナル抗体
MHC 主要組織適合性複合体
MLC 混合されたリンパ球培養物
mRNA メッセンジャーリボ核酸
NIH/3T3 マウス繊維芽細胞
NK細胞 ナチュラルキラー細胞
Notch(ノッチ)1−4 ホモサピエンスノッチ(ショウジョウバエ)ホモログ1−4(ノッチレセプター)
OKT3 CD3に対するmab
PBMC 末梢血液単核細胞
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PHA フィトヘマグルチニン
SCID−マウス BおよびT細胞を有していない免疫不全マウス
TCM T細胞培地
TCRシグナル T細胞レセプター
TGF トランスフォーミング成長因子
Tリンパ球 胸腺に関連または由来するリンパ球
T細胞 胸腺に由来するTリンパ球
Th1−細胞 Tヘルパー1表現型を有するT細胞
Th2 Tヘルパー2表現型を有するT細胞
TNF 腫瘍壊死因子
vIL−10 ウィルス性インターロイキン10、エプスタイン−バールウィルスに由来し、ヒトIL−10に対して高い相同性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】
三日目の増殖阻止率を示す棒グラフである。(実施例5)
【図2】
四日目の増殖阻止率を示す棒グラフである。(実施例5)
【図3】
四日目のIFN−γ生産を示す棒グラフである。(実施例6)
Claims (18)
- (イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞であって、移植体レシピエントのT細胞を移植体ドナーの細胞または優性MHC分子を発現する細胞によってイン・ビトロで刺激し、そして同時にまたは後から、遺伝子形質導入によって免疫モジュレーション治療用遺伝子を導入することにより得られることを特徴とする、前記遺伝子修飾T細胞。
- 同種異系反応性T細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞。
- (a)治療用遺伝子を備えた遺伝子形質導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系(パック細胞系)を培養し、
(b)全血もしくは脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離し(照射されたドナーT細胞または優性MHC分子を発現する照射された細胞、およびレシピエントT細胞)、そして
(c)混合されたリンパ球培養物(一次MLC)と前記パック細胞系とからなる共培養物、またはパック細胞系との共培養を省略できるように、専らレトロウィルスを含む細胞培養上清を用いての形質導入を実施する
ことにより得られる、請求項1または2に記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞。 - レトロウィルスとして、モロニーマウス白血病ウィルスまたはレンチウィルスを用いることを特徴とする、請求項3に記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞。
- 全血もしくは脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離し(照射されたドナーT細胞または優性MHC分子を発現する照射された細胞、および、レシピエントT細胞)、この混合されたリンパ球培養物によって製造された同種異系特異的なT細胞を、治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有するリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で撃つ、請求項1または2記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞。
- 前記治療用遺伝子が、
(a)サイトカイン、
(b)インターロイキン、
(c)ノッチ−リガンド/レセプター
(d)細胞保護遺伝子(例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子)
であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞。 - 治療用遺伝子が、
(a)IL−4または、
(b)IL−10もしくはウィルス性IL−10(例えば、EBVまたはCMVに由来する)
(c)IL−12p40または、
(d)IL−13または、
(e)ヘムオキシゲナーゼ−1、
(f)CTLA−4または、
(g)hセラト−1または、
(h)hデルタ−1または、
(i)ノッチ1−4または、
(j)bcl−2または、
(k)bcl−xlまたは、
(l)bag−1
であることを特徴とする、請求項6に記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞。 - 遺伝子修飾T細胞を製造する方法であって、移植体レシピエントのT細胞を、移植体ドナーの細胞または優性MHC分子を発現する細胞によってイン・ビトロで刺激し、同時にまたは後から、遺伝子導入によって免疫モジュレーション治療用遺伝子を形質導入することを特徴とする、遺伝子修飾T細胞の製造方法。
- 前記細胞が同種異系反応性T細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- (a)治療用遺伝子を備えた遺伝子形質導入可能なレトロウィルスを生成する細胞系(パック細胞系)を培養し、
(b)全血からリンパ球を分離し(照射されたドナーT細胞または優性MHC分子を発現する照射された細胞、および、レシピエントT細胞)、
(c)混合されたリンパ球培養物(一次MLC)と前記パック細胞系とからなる共培養物、またはパック細胞系との共培養を省略できるように、専らレトロウィルスを含む細胞培養上清を用いて形質導入を実施する
ことを特徴とする、請求項8または9に記載の方法。 - レトロウィルスとして、モロニーマウス白血病ウィルスまたはレンチウィルスを使用することを特徴とする、請求項10記載の方法。
- 全血もしくは脾臓またはリンパ節からリンパ球を分離し(照射されたドナーT細胞または優性MHC分子を発現する照射された細胞、および、レシピエントT細胞)、この混合されたリンパ球培養物によって製造された同種異系特異的なT細胞を、治療用遺伝子を備えたプラスミドを含有するリポソーム配合物と共にインキュベートするか、または遺伝子銃で撃つことを特徴とする、請求項8または9に記載の方法。
- 前記治療用遺伝子が、
(a)サイトカイン、
(b)インターロイキン、
(c)ノッチ−リガンド/レセプター
(d)細胞保護遺伝子(例えば、抗細胞消滅遺伝子、熱ショック遺伝子)
であることを特徴とする、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記治療用遺伝子が、
(a)IL−4または、
(b)IL−10もしくはウィルス性IL−10(例えば、EBVまたはCMVに由来する)
(c)IL−12p40または、
(d)IL−13または、
(e)ヘムオキシゲナーゼ−1、
(f)CTLA−4または、
(g)hセラト−1または、
(h)hデルタ−1または、
(i)ノッチ1−4または、
(j)bcl−2または、
(k)bcl−xlまたは、
(l)bag−1
であることを特徴とする、請求項13記載の方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞を移植医学において使用する、(イン・ビトロ)遺伝子修飾T細胞の使用。
- イン・ビボでの同種異系移植体の拒絶反応の予防への、請求項15に記載の使用。
- 同種異系移植体(細胞、組織、器官)に対する寛容性を誘導し、寛容性を維持するための手段としての、請求項15または16に記載の使用。
- 移植体レシピエントのT細胞を刺激するための、請求項15〜17のいずれか一項に記載の使用。
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