KR101432191B1 - 이식편대숙주 질환의 검출 또는 치료 방법 - Google Patents

이식편대숙주 질환의 검출 또는 치료 방법 Download PDF

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훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠
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Abstract

개체로부터 수득된 시료에서 이식편대숙주 질환의 진단 또는 경과의 지표로서 CCL8 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 이식편대숙주 질환을 진단하는 방법이 개시된다. 또한, 항-CCL8 항체를 포함하는, 이식편대숙주 질환용 진단 시약이 개시된다. 본 발명의 방법은 이식편대숙주 질환의 발병의 진단 및 그 진행의 모니터링을 가능하게 하고, 특히, 이식편대숙주 질환과 감염성 질환 간의 감별 진단(differential diagnosis)을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 항-CCL8 항체를 이용하여 이식편대숙주 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

이식편대숙주 질환의 검출 또는 치료 방법{Method for detection or treatment of graft versus host disease}
관련 출원의 교차 인용
본 발명은 참조에 의해 그 내용이 전체로 본 명세서에 포함된, 일본 특허출원 제2007-165547호(2007년 6월 22일 출원)에 기초한 우선권을 주장한다.
본 발명은 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease)을 진단하는 방법 및 시약, 및 이식편대숙주 질환을 치료하는 방법 및 이를 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조혈 줄기 세포 이식(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)은 다른 개체로부터의 조혈 줄기 세포가 조혈 및 면역 기능을 회복시키기 위해 환자에게 이식되는 치료법이고, 조혈 줄기 세포 이식은 광범위한 혈액, 종양, 대사, 및 면역 질환에서 치료의 양식으로 확립되었다. 이식-후 면역억제(post-tranplantation immunosuppression) 치료법이 지난 20년간 상당히 발전되었으나, 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease, GVHD)은 여전히 주요한, 생명을 위협하는 이식-후 합병증이 되고 있다. 면역억제제를 이용한 예방적 치료법에도 불구하고, GVHD는 HSCT 수용자(recipient)(환자)의 30 내지 80%에서 발생한다. 따라서, GVHD의 조기 진단, 치료의 조기 개시 및 치료적 효능의 객관적 모니터링이 요구된다. 또한, 현재의 치료 방법이 항상 치료를 가져오는 것은 아니며, 새로운 치료 방법의 개발이 요구된다. GVHD의 발생률, 진단 및 치료에 대한 정보에 관해, Sullivan 등에 의한 보고서(Sullivan KM. Graft vs. host disease. In: Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR, eds. Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden, MA: Blackwell Publishing; 2004:635-664)를 참조한다.
그러나, 현재, GVHD의 진단은 피부 발진, 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 설사 등과 같은 임상적 소견에 기반하여 수행되고, GVHD를 다른 유사한 합병증(정맥 폐쇄, 바이러스 재활성화(viral reactivation), 치료 요법-관련 독성(treatment regimen-related toxicity) 등)과 구별할 수 있는 결정적 바이오마커는 존재하지 않는다. 따라서, 간 생검과 같은 침습적 방법이 GVHD의 감별 진단(differential diagnosis)을 위해 요구된다. 그러나, 생검은 침습적이고 주관적인 진단 방법이므로, 생검에 대한 의존 없이, GVHD의 조기의 정확하고 객관적인 정량적 진단을 촉진하여, GVHD의 적합한 치료법 및 HSCT의 결과의 개선을 가져올 수 있는 새로운 방법을 개발하는 것이 요구된다.
프로테오믹스의 최근 진보는 생물학적 유체(biological fluid) 중의 전체 단백질 발현(global protein expression)을 조사하고 GVHD 또는 병리적 상태에 대한 새로운 마커를 확인하기 위한 여러 방법을 제공했다. 하나의 그와 같은 방법은 SELD-TOF MS(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)이다. 이는 혈장과 같은 복잡한 조성을 갖는 체액으로부터 단백질을 분리하여 비교 단백질 프로파일(comparative protein profile)을 생성하기 위한 고효율(high-througput), 고민감성 프로테옴 방법이다. Petricoin 등(Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002; 359:572-577)은 SELDI를 이용한 프로테옴 분석에 기반한 난소암을 위한 바이오마커를 보고했다. SELDI에서, 생물학적 시료로부터 수득된 단백질은 ProteinChip (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA) 상의 화학적으로 변형된 친화도 표면에 선택적으로 결합할 수 있고, 비특이적으로 결합된 불순물은 세척에 의해 제거된다. 그 후, 포획된 단백질이 TOF-MS에 의해 분석되어 각 단백질의 분자 질량(m/z) 및 상대적 농도(강도)의 스펙트럼이 수득된다. 최근의 연구를 통해, 이 종류의 기술이 암 및 기타 질환의 진단에 성공적으로 적용되었다.
최근의 보고는 GVHD 환자로부터 유래된 체액의 프로테옴 분석을 기재했다. 그러나, 사람의 임상 시료를 이용한 테스트에서, 유전적 배경 및 환경과 관련된 인위적 결과(artifact)가 불가피하고, 이는 새로운 바이오마커의 발견을 어렵게 하고 있다. 이는 특히, 광범위한 기존 질병을 가지며, 다양한 조건화 요법(conditioning regimen) 및 GVHD 예방법을 받는 HSCT-후 환자들에 특히 적용된다. 프로테옴 분석을 포함한 생화학적 방법에 기반한 유용한 마커의 발견에 대한 보고는 없었다. 예를 들면, Kaiser 등(Kaiser T, Kamal H, Rank A, et al. Proteomics applied to the clinical follow-up of patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004; 104:340-349)은 소변을 시료로 이용한 프로테옴 분석에 의한 GVHD 마커의 연구에 관해 보고했다. 두 개의 단백질(류코트리엔(leukotriene), 즉, 염증 매개체(inflammation mediator), 및 혈청 알부민, 즉, 혈청 중에 가장 빈도가 높은 단백질)이 확인되었으나, GVHD-특이적 단백질은 발견되지 않았다.
본 명세서에서 인용된 참조문헌들이 하기에 열거된다. 이 문헌들의 내용은 이에 의해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 그러나, 이 문헌들 중 어느 것도 본 발명의 선행 기술로 인정되지 않는다. 비-특허 문헌(Non-patent document) 1: Sullivan KM. Graft vs. host disease. In: Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR, eds. Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden, MA: Blackwell Publishing; 2004:635-664 비-특허 문헌 2: Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002; 359:572-577 비-특허 문헌 3: Kaiser T, Kamal H, Rank A, et al. Proteomics applied to the clinical follow-up of patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004; 104:340-349
본 발명의 목적은 GVHD의 진단을 위한 방법 및 시약, 및 GVHD 치료를 위한 방법 및 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 GVHD 모델 동물과 대조군 동물에서 상이하게 발현되는 다양한 단백질을 조사하고, CCL8의 발현 수준이 GVHD에서 훨씬 더 높다는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 CCL8의 발현 수준과 임상적 징후의 소견(manifestation) 및 경과(course) 간에 상관관계가 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인간 개체 또는 동물 개체로부터 수득된 시료에서 이식편대숙주 질환(GVHD)의 진단 또는 경과(course)의 지표로서 CCL8 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 이식편대숙주 질환을 검사하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, GVHD의 진단은 임상적 징후의 발현 전에 수행된다.
본 발명의 방법에서, 바람직하게는 CCL8 단백질의 수준은 항-CCL8 항체를 이용하여 측정된다. 또한, 바람직하게는, CCL8 단백질의 수준은 질량 분광측정법(mass spectrometry), HPLC(high-performance liquid chromatography), 및 이차원 전기영동으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 측정된다.
본 발명은 또한 항-CCL8 항체를 포함한, GVHD를 위한 진단 시약을 제공한다.
본 발명은 또한 GVHD 치료제를 위한 후보 물질을 선택하는 방법을 제공한다. 이 방법은 GVHD 모델 동물에 테스트 물질을 투여하는 단계;
상기 모델 동물로부터 수득된 시료에서 CCL8 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 CCL8 단백질 발현 수준이 상기 테스트 물질의 투여가 없는 경우의 수준보다 더 낮은 경우, 상기 테스트 물질을 GVHD 치료제를 위한 후보 물질로 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 항-CCL8 항체를 활성성분으로 포함하는, GVHD 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이식편대숙주 질환을 앓는 개체에게 항-CCL8 항체를 투여하는 단계를 포함하는, GVHD 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, GVHD의 발병 및 경과가 신뢰성 높은 방법으로 진단되어, 객관적(통상적 방법의 경우, 주관적임)이고, 정량적이며 보다 정확한 GVHD의 진단을 가져온다. 또한, 본 발명은 특히, 기존의 치료 방법에 내성을 갖는 환자에서 GVHD 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 구체예
본 발명은 개체로부터의 혈액과 같은 테스트 시료에서 CCL8의 발현 수준을 측정하는 것에 의해 GVHD를 진단하고 GVHD의 경과를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 하기의 실시예에서 구체적으로 예시되는 바와 같이, 골수 이식 또는 제대혈 이식을 받은 환자들 중에서, GVHD를 발병하는 환자들은 CCL8의 훨씬 더 높은 발현 수준을 보이고, GVHD의 임상적 징후의 소견과 CCL8의 발현 수준 간의 상관관계가 확인되었다.
CCL8은 MCP-2 (GenBank Accession No. NP_005614)로도 불리는, 케모카인(chemokine) 패밀리에 속하는 염기성, 헤파린-결합 분비 단백질이다. 이 단백질은 단핵세포, 섬유모세포, 상피 세포 등에 의해 생성되며 수용체 CCR2, CCR3, CCR5 및 CCR11에 결합하는 것으로 알려져 있다. CCL8은 CD4-양성 T 세포, CD8-양성 T 세포, 단핵세포, NK 세포, 호산구, 호염기구 등을 표적화하는 것으로 확인되었다. GVHD는 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 후 3 단계를 통해 발병하는 것으로 사료된다. 제1 단계는 숙주(환자)를 HSCT를 위해 준비시키기 위한 방사선조사에 대한 노출을 포함하는, 조건화(conditioning)이고, 제2 단계는 이식된 T 세포의 활성화, 증식, 및 분화이며, 제3 단계는 세포-매개 또는 염증 효능자(inflammatory effector)의 출현이다(메카니즘에 관해, 하기의 두 개의 검토를 참조한다: Reddy P. Pathophysiology of acute graft-versus-host disease. Hematol Oncol. 2003; 21:149-161., Ferrara JL, Reddy P. Pathophysiology of graft-versus-host disease. Semin Hematol. 2006; 43:3-10). 제2 단계에서, 가지세포(dendrocyte)에 의한 항원 제시(antigen presentation)가 이식된 T 세포의 활성화를 위해 필요하다. CCL8을 포함한 케모카인은 이 가지세포의 분화, 증식, 및 활성화에서 중요한 역할을 수행한다(제2 단계에서 케모카인의 중요성에 대해, Wysocki CA, Panoskaltsis-Mortari A, Blazar BR, Serody JS. Leukocyte migration and graft-versus-host disease. Blood. 2005; 105:4191-4199를 참조한다). 그러나, 신체 내에서 CCL8의 역할 및 면역계의 조절에서의 그 중요성은 완전히 규명되지 않았다. 따라서, 본 발명에서 발견된 CCL8의 발현과 GVHD 간의 상관관계의 기저 메카니즘(underlying mechanism)은 여전히 알려져 있지 않다.
CCL8 단백질의 수준에 대해 측정될 테스트 시료는 예를 들면, 인간 개체 또는 동물 개체로부터 유래된 체액, 혈액, 혈청, 및 혈장을 포함한다. 개체로부터 수집된 조직 및 세포도 테스트 시료로 이용될 수 있다.
개체로부터 수득된 테스트 시료 중의 CCL8 단백질의 양은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 면역학적 분석 방법에서 항-CCL8 항체를 이용하여 측정될 수 있다. 항-CCL8 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 다양한 종류의 항-CCL8 다중클론 항체 및 단일클론 항체가 상업적으로 이용가능하고, 이 항체들은 본 발명에서 이용될 수 있다.
대안적으로, 항체는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. CCL8에 결합하는 다중클론 항체는 CCL8 또는 그의 펩티드 단편을 감작용 항원(sensitizing antigen)으로 이용하여 동물을 면역화시키는 단계, 상기 면역화된 동물로부터 항체를 포함하는 항혈청을 분리하는 단계, 및 ELISA 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 방사선면역분석법(radioimmunoassay) 등에 의해 원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다.
CCL8에 결합하는 단일클론 항체는 CCL8 또는 그의 펩티드 단편을 감작용 항원으로 이용하여 동물을 면역화시키는 단계, 결과적으로 수득된 면역 세포를 수집하는 단계 및 그들을 골수종 세포와 융합시키는 단계, 항체를 생성하는 하이브리도마(hybridoma)를 선택하는 단계, 및 상기 하이브리도마를 배양하는 단계를 포함하는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 수득될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 항-CCL8 단일클론 항체는 하이브리도마에 의해 제조된 항체, 및 항체 유전자를 갖는 발현 벡터에 의해 형질감염된 형질전환체에 의해 생성된 재조합 항체를 포함한다. 재조합 항체는 항체-생성 하이브리도마로부터의 CCL8에 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 cDNA를 클로닝하는 단계, 상기 cDNA를 발현 벡터에 삽입하는 단계, 동물 세포 또는 식물 세포를 상기 벡터에 의해 형질전환시키는 단계, 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 형질전환 동물에서 생성되는 항-CCL8 항체를 수득하기 위해, 항-CCL8 항체를 코딩하는 유전자가 형질전환 동물에 도입될 수 있다.
인간 환자의 치료에서의 용도를 위해, 본 발명의 항-CCL8 항체가 인간 키메라 항체 또는 인간화 항체(humanized antibody)인 것이 바람직하다. 인간 키메라 항체는 인간이 아닌 동물(nonhuman animal)의 항체 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역, 및 인간 개체의 중쇄 불변 영역과 경쇄 가변 영역으로부터 제조된 항체이다. 인간화 항체는 인간이 아닌 동물에서 기원한 항체 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 및 인간 항체에서 기원한 프레임워크 영역(FR) 및 C 영역으로부터 제조된다. 인간 키메라 항체 및 인간화 항체는 인체에서 감소된 항원성을 가지며, 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물의 활성 성분으로서 유용하다. 인간 키메라 항체 및 인간화 항체를 수득하기 위한 통상적인 유전자 재조합 기법, 및 이 항체들의 결합 활성을 평가하는 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 대안적으로, 항-CCL8 인간 항체는 CCL8을 인간 항체 유전자의 완전한 레퍼토리(repertoire)를 갖는 형질전환 동물에 도입하는 것에 의해 수득될 수 있다.
또한, 항체 단편도 본 발명에서 이용될 수 있다. 항체 단편은 전체 항-CCL8 항체의 일부가 결여되나 여전히 CCL8 결합 능력을 갖는 펩티드를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 등을 포함한다. 항체 단편은 단편을 생성하기 위해 항체의 효소 처리에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 항체 단편은 또한 항체 단편 및 항-CCL8 항체의 VL 사슬과 VH 사슬을 링커에 의해 연결하는 것에 의해 제조된 그의 이량체(dimer)를 포함한다. 예는 ScFv, 디아바디(diabody), sc(Fv)2, 등을 포함한다.
인간 개체 또는 동물 개체로부터 수득된 테스트 시료 중의 CCL8 단백질은 이 방식으로 수득된 항체를 이용하여 면역학적 방법에 의해 분석된다. 상기 분석법은 정성적 또는 정량적일 수 있다. 개체로부터 수득된 시료에서 CCL8의 발현에 대한 면역분석법이 방사선면역분석법, ELISA, 면역침전법, 면역응집법(immunoagglutination), 웨스턴 블롯팅 등을 이용하여 수행될 수 있다.
전형적인 예로서, 샌드위치 ELISA가 하기 방식으로 수행될 수 있다. 개체로부터 말초 혈액을 수집하고, 혈장을 준비한 후, 항-CCL8 항체가 고정화된 플레이트 또는 칩에 첨가하고, 적합한 시간 동안 인큐베이션시킨다. 결합되지 않은 성분들을 제거하기 위해 상기 플레이트 또는 칩을 세척한 후, 또 다른 항-CCL8 항체를 첨가한다. 상기 항체는 효소, 형광 염료, 화학발광 물질, 비오틴, 방사성활성 화합물 등으로 검출가능하게 표지화될 수 있다. 적절한 시간 동안 인큐베이션 후, 상기 플레이트 또는 칩을 세척하고, 상기 표지를 형광, 발광, 방사성활성 등에 의해 검출한다. 선택적으로, 항-CCL8 항체가 상기 단백질에 결합된 후, 신호를 증폭시키기 위해 제2 항체(예를 들면, 염소 항-마우스 항체)를 첨가할 수 있다. 상기 제2 항체는 효소, 형광 염료, 화학발광 물질, 비오틴, 방사성활성 화합물 등으로 검출가능하게 표지화될 수 있다. 개체로부터 수득된 혈장 중의 CCL8 단백질의 양이 이 방식으로 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 응집 반응을 포함하는 검출 방법을 이용하여 CCL8 단백질이 검출될 수 있다. 이 방법에서, CCL8이 담체, 예를 들면, 항-CCL8 항체를 갖는 라텍스 입자를 이용하여 검출될 수 있다. 상기 항-CCL8 항체를 갖는 라텍스 입자를 테스트 시료와 혼합하고 소정의(predetermined) 시간 동안 인큐베이션하면, CCL8이 시료 중에 포함된 경우, 상기 입자들은 응집될 것이다. 시료 중의 CCL8은 육안으로 응집의 정도를 관찰하거나 또는 분광분석계를 이용하여 정량하는 것에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 양태에서, CCL8 단백질은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 현상을 이용한 바이오센서를 이용하여 검출될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명 현상에 기반한 바이오센서는 표면 플라즈몬 공명 신호로 단백질-단백질 상호작용을 모니터링할 수 있게 한다. 예를 들면, CCL8 단백질과 항-CCL8 항체 간의 결합은 BIAcore (Pharmacia)와 같은 바이오센서를 이용하여 검출될 수 있다. 보다 구체적으로, 테스트 시료가 항-CCL8 항체를 갖는 센서 칩과 접촉되고, 상기 항-CCL8 항체에 결합된 CCL8 단백질이 공명 신호의 변화로서 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 테스트 시료가 금속 킬레이트제 및 헤파린과 같은 친화도 지지체(affinity support)를 이용하여 부분적으로 정제(농축)되고, CCL8 단백질은 실시예 2에서 확인된 바와 같이, MS에 의해 검출되고 정량될 수 있다. 또한, CCL8 단백질은 실시예 3에서 확인된 바와 같이 HPLC에 의해 검출되고 정량될 수 있거나, 또는 이차원 전기영동 및 실버 염색에 의해 검출되고 정량될 수 있다.
본 발명은 또한 항-CCL8항체를 포함하는 GVHD를 위한 진단 시약을 제공한다. 본 발명의 GVHD용 진단 시약은 테스트 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 테스트 키트는 CCL8을 검출하는 시약, 예를 들면, 항-CCL8 항체를 활성 성분으로 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 완충 용액, 희석제, 반응 중단용 용액(reaction stopping solution), 세척액, 대조군 시료, 등과 같은 분석법을 위해 필요한 적합한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 이 방식으로 측정된 CCL8 단백질의 수준은 GVHD의 진단을 위해 지표로 이용될 수 있다. 본 발명에 따르면, GVHD는 육안 관찰 및 설사량과 같은 관찰에 의존하지 않고, CCL8 단백질을 마커로 이용하는 것에 의해 객관적으로 진단될 수 있고, 따라서, GVHD의 발병 및 경과가 모니터링될 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 예를 들면, GVHD의 소견 전 진단(조기 진단), GVHD의 발병의 확정 진단(definitive diagnosis), 그 중증도의 평가(scoring), 그의 경과의 모니터링, 치료 효능과 예후의 평가를 위해 유용하다. 특히, 도 14에 도시된 바와 같이, CCL8의 발현 수준은 TLR(Toll-like receptor)에 의해 매개되는 경로를 통해 증가되지 않고, 이는 CCL8 단백질을 마커로 이용한 GVHD와 세균성 또는 바이러스성 감염 간의 감별 진단을 가능하게 한다.
하기의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 환자의 CCL8 발현 수준은 GVHD의 발병 전보다 GVHD의 발현 후에 훨씬 더 높다. 실시예 8은 골수 이식 모델 마우스에서, CCL8 발현량은 GVHD의 임상적 징후가 인식되기 2일 전에 증가되기 시작했다는 것을 보여주었다. 또한, 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 인간 환자에서 GVHD의 임상적 징후가 관찰되기 전에 CCL8 발현량이 증가되기 시작하며, 이는 본 발명의 방법이 GVHD의 조기 검진을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명의 방법은 치료적 효능을 평가하기 위해 유용하다. 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, GVHD의 임상적 징후가 치료를 통해 개선되면서, CCL8 발현 수준의 감소가 관찰되었다. 치료-내성 GVHD에서, 통상적인 메틸프레드니솔론 치료법은 효과적이지 않고, 보다 공격적인 치료법이 요구된다. 그와 같은 치료는 종종 유해한 부작용을 수반하기 때문에, 적절하게 본 발명의 방법에 의한 치료적 효능을 모니터링하면서, 투여량을 조정하고 치료법을 조절하는 것이 유용하다.
또한, 도 11에 도시된 바와 같이, CCL8 발현 수준은 GVHD의 중증도 및 예후와 상관관계를 가지며, 따라서, 본 발명의 방법은 중증 상태를 갖는 환자의 보다 조기의 확인 및 적합한 치료의 실현을 가능하게 한다.
또한, 본 발명의 방법은 GVHD를 위한 치료 방식의 개발 및 개선을 위해 유용하다. 도 11에 도시된 바와 같이, CCL8 발현 수준을 측정하는 것에 의해 치료-내성 GVHD를 갖는 환자가 확인될 수 있다. 그와 같은 환자에 대한 확립된 치료 방식은 없다. 환자에서 CCL8 수준을 모니터링하면서, 다수의 작용제에 의한 조합 치료법의 효능을 연구하는 것에 의해 적합한 치료 방식이 개발될 수 있다.
또한, 현재, GVHD에 대한 묘약(magic drug)은 존재하지 않기 때문에, 본 발명은 또한 지표인 CCL8 발현 수준에 근거하여 GVHD의 치료를 위한 강력한 약물일 후보 물질을 스크리닝하기 위해 유용하다. 스크리닝은 GVHD 모델 동물에 테스트 물질을 투여하고, 상기 모델 동물로부터 수득된 테스트 시료에서 CCL8 단백질의 양을 특정하는 것에 의해 수행된다. 예를 들면, 항-CCL8 항체가 테스트 물질로 이용될 수 있다. 또한, 테스트 물질은 다양한 합성 물질 또는 천연 물질의 라이브러리, 조합 라이브러리(combinational library), 올리고뉴클레오티드 라이브러리, 펩티드 라이브러리 등과 같은 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 테스트 물질은 또한 천연 물질의 추출물 또는 세균, 진균류, 조류(algae), 식물, 동물 등에서 기인된 부분적으로 정제된 생성물을 포함할 수 있다. CCL8 단백질의 수준이 테스트 물질을 투여받은 동물에서 더 낮은 경우, 상기 테스트 물질은 GVHD의 치료제를 위한 후부 물질로 선택될 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 진단 방법은 GVHD를 위한 새로운 치료 방식의 개발을 위한 플랫폼을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 활성 성분으로서 항-CCL8 항체를 포함하는, GVHD 치료용 약제학적 조성물, 및 항-CCL8 항체를 투여하는 단계를 포함하는, GVHD의 치료 방법을 제공한다. 하기의 실시예 9에 도시된 바와 같이, 항-CCL8 항체가 GVHD 모델 동물에 투여되고 병리적 상태가 측정되었을 때, 피부의 진표피 접합부(dermoepidermal junction)로의 염증 세포 침윤의 감소 및 모낭 및 피지선에 대한 손상의 개선이 관찰되었고, 이는 항-CCL8항체의 투여가 GVHD의 치료에서 효과적이라는 것을 입증했다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 제제화될 수 있다. 예를 들면, 멸균수 및 생리적 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 향료, 충진제, 비히클, 보존제, 결합제 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 적절하게 조합하고, 그들을 일반적으로 인정되는 약물 제조를 위해 요구되는 단위 투여량의 제형으로 제조하는 것에 의해 조성물을 제제화할 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것에 의해 정제, 환제, 당제(dragee), 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화될 수 있다.
비경구 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 약제학적으로 허용가능한 비히클을 이용하여 주사제, 에어로졸 스프레이, 피부 투여용 제품, 등으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여가 바람직하다. 투여 경로의 예는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복막내 주사, 피하 주사, 직장내 투여, 경비(transnasal) 투여, 경폐(transpulmonary) 투여, 경피 투여 등을 포함한다. 투여량은 단일 투여에 대해 체중 kg 당 0.0001 mg 내지 1000 mg의 범위로부터 선택될 수 있다. 투여 경로 및 투여량은 필요에 따라, 환자의 연령, 증상의 중증도, 동시투여되는 약물, 등을 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다.
본 명세서에서 구체적으로 인용된 모든 특허 및 문헌의 내용은 이에 의해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 하기의 실시예를 통해 보다 상세하게 설명되나, 하기 실시예에 의해 한정되지 않는다.
본 발명은 GVHD의 진단, 진행 모니터링 및 치료를 위해 유용하다.
도 1은 GVHD 모델 마우스에서 임상적 징후의 시간적 경과(time course) 및 병리학적 점수(pathology score)를 보여준다;
도 2는 GVHD 모델 마우스로부터 수득된 시료로부터의 전형적인 SELDI 스펙트럼 및 각 시점의 시료에서 8972 Da 피크의 평균 정규화된 강도를 보여준다;
도 3은 사이클로스포린-A (CsA)를 투여받은 모델 마우스로부터 수득된 시료로부터의 대표적인 SELDI 스펙트럼, 및 각 시점의 시료에서 8972 Da 피크의 평균 정규화된(normalized) 강도를 보여준다;
도 4는 동계 이식 모델 마우스(syngeneic transplant model mouse)로부터 수득된 시료로부터의 대표적인 SELDI 스펙트럼, 및 각 시점의 시료에서 8972 Da 피크의 평균 정규화된 강도를 보여준다;
도 5는 8972 Da 단백질을 포함하는 HPLC 분획의 SELDI 스펙트럼 및 이차원 전기영동의 결과를 보여준다;
도 6은 8972 Da 단백질로부터 유래된 펩티드의 대표적인 MS/MS 스펙트럼 및 확인된 아미노산 서열을 보여준다;
도 7은 면역분석법에 의한 CCL8 단백질의 검출을 보여준다;
도 8은 인간의 임상적 시료에서 CCL8 단백질 수준의 시간적 경과를 보여준다;
도 9는 인간의 임상적 시료에서 CCL8 단백질 수준의 시간적 경과를 보여준다;
도 10은 인간의 임상적 시료에서 CCL8 단백질의 검출을 보여준다;
도 11은 복수 개의 인간의 임상적 시료에서 CCL8 단백질의 검출을 보여준다;
도 12는 인간의 임상적 시료에서 CCL8 단백질 수준의 시간적 경과를 보여준다;
도 13은 인간의 임상적 시료에서 CCL8 단백질 수준의 시간적 경과를 보여준다;
도 14는 TLR 리간드를 투여받은 마우스 및 GVHD 모델 마우스에서 CCL8 단백질 수준의 시간적 경과를 보여준다;
도 15는 GVHD 모델 마우스에서 임상적 징후 및 CCL8 단백질 수준의 시간적 경과를 보여준다;
도 16은 항-CCL8 항체를 투여받은 GVHD 모델 마우스의 조직화학적 염색을 보여준다; 및
도 17은 GVHD 모델 마우스에서 항-CCL8 항체의 치료적 효능의 병리학적 평가를 보여준다.
실시예 1
골수 이식( BMT )
동종이형 골수 이식(allogeneic bone marrow transplantation)을 통해 마우스에서 급성 GVHD를 유도하였다. BALB/c (H-2d) 마우스를 수용체(recipent)로 이용하고, C57BL/6 (H-2b) 마우스를 동종이형 BMT 공여체로 이용하였고, BALB/c (H-2d) 마우스를 동계 BMT 공여체로 이용하였다. 모든 마우스들은 7주 내지 12주령이었다(Sankyo Labo Service Corporation, Japan).
BMT 시술 당일에, 공여체 마우스를 경추 탈구(cervical dislocaiton)에 의해 희생시켰다. 대퇴골 및 경골의 줄기(shaft)를 수세(flush)하는 것에 의해 공여체 골수 세포를 수집하였다. 세포들을 2% 우태혈청(fetal calf serum)/1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 변형된 Eagle 배지(modified Eagle's medium)에 배치하고 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 세포들을 RPMI 1640 배지로 세정하고 동일한 배지에 재현탁시켰다. 골수 세포 접종물은 동종이형 BMT의 경우 2x107개의 골수 세포/200 ㎕를 포함하고, 동계 BMT의 경우 1x106개의 골수 세포/100 ㎕를 포함하도록 제조하였다.
수용체 BALB/c 마우스를 치사적 방사선 조사량의 투여 후 패혈증을 예방하기 위해 BMT 전 7일 이상 동안 산성 수(acidic water)로 사육하였다. 수용체 마우스에 0.34 Gy/분의 속도로 총 8.5 Gy의 전신 선량을 조사하고, 조사 후 3시간 이내에 공여체 골수 세포를 미정맥(caudal vein)을 통해 정맥내로 주사하였다.
GVHD 의 모니터링
GVHD의 임상적 징후, 즉, 체중 감소, 구부린 자세(hunched posture), 피부 발적, 탈모증, 및 설사에 대해 매일 수용체 마우스를 관찰하였다. 동종이형 BMT 마우스에서, 급성 GVHD의 임상적 징후, 예를 들면, 설사 및 주름진 털(ruffled fur)이 이식 후 7일 이내에 관찰되었고, 이식 후 21일 이내에 피부 발적 및 탈모가 관찰되었다. 이식 후 14일차 및 21일차에 일부 동물의 사망이 확인되었다.
조직병리학적 분석
수용체 마우스를 이식 후 7일차, 14일차, 21일차 및 28일차에 희생시켰다. 피부, 간, 및 소장을 제거하고 10% 완충 포르말린(buffered formalin)에서 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀에 포매시키고, 절편을 준비하고 헤마톡실린/에오신으로 염색하고, 광학 현미경 하에 관찰하였다. 전형적인 기관에서 GVHD에 해당하는 것으로 생각되는 조직학적 징후는 하기와 같았다: 피부(단핵세포의 진표피 접합부로의 침윤, 및 모낭 또는 피지선에 대한 손상); 간(문맥주위 단핵세포 침윤(periportal mononuclear infiltration) 및 간세포 괴사(hepatocellular necrosis)); 및 소장(장샘 세포의 아폽토시스 및 융모의 확장 또는 편평화(flattening)).
기관에서 이 변화들 각각에 대해, 평점 시스템은 음성 발견에 대해서는 0점을 부여하고 양성 발견에 대해 1점을 부여했다(각 마우스당 가능한 최대 평점은 6점이었음). 도 1은 관찰된 임상적 징후와 함께 각 시점에서 평균 병리학적 점수를 보여준다. 이 결과들은 5개의 독립적 연구에서 전형적이었다. 수용체 마우스는 모든 이식-후 시점에 GVHD의 병리적 징후를 가졌고, 병리학적 점수는 14일차에 가장 높았다. 병리학적 점수는 각 시점에서 GVHD에 대한 임상적 소견과 일치했다.
혈장 시료
BMT 전 및 BMT 후 7일차, 14일차, 21일차, 및 28일차에 혈액 시료를 채취하였다. 살아있는 마우스의 미정맥으로부터 헤파린-코팅된 모세관 튜브를 이용하여 혈액 시료를 수집하고, 혈장을 준비하기 위해 채취 후 30분 이내에 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 혈장 시료를 분석 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 2
SELDI 단백질 칩 어레이 분석
각 혈장 시료 10 ㎕에 Tris-HCl (pH 7.4) 중에 9 mol/L 우레아 및 10 g/L CHAPS를 포함하는 용액 20 ㎕를 첨가하였다. 상기 혼합물을 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 4℃에서 15분 동안 혼합하고, Tris-HCl로 1:40으로 희석하였다. 8-스팟 고정화 금속 친화도 포획 어레이(eight-spot immobilized metal affinity capture array)(IMAC-30)를 50 mmol/L CuSo4로 활성화시켰다. 희석된 시료(50 ㎕)를 단백질 칩 어레이의 각 스팟에 적용하고, 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 동일한 Tris-HCl로 세척한 후, 상기 칩을 물로 조심스럽게 세정하고, 0.5 ㎕의 포화된 시나핀산(saturated sinapinic acid, SPA)을 각 스팟에 2회 적용하고, 자연건조시켰다. Ciphergen Protein Biology System II Time-Of-Flight 질량 분광분석계(PBS II, Ciphergen Biosystems, Inc.)를 이용하여 킬레이팅된 금속에 결합된 단백질의 질량/전하(m/z) 스펙트럼을 측정하였다. 200의 레이저 강도 및 8의 검출기 민감도에서 수득된 65개의 레이저 스팟을 평균하는 것에 의해 데이터를 계산하였다.
SELDI - TOF MS 의 통계적 분석
모든 스펙트럼을 컴파일링하고 Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0을 이용하여 데이터를 예비로 분석하였다. 혈장 시료에 대해, GVHD 군(이식 후 7일차, 14일차, 21일차 및 28일차)으로부터의 50개의 시료 및 대조군(BMT 전)으로부터의 28개의 시료를 채취하여 총 78개의 시료를 이용하였다. 상이한 것으로 보이는 총 169개의 피크를 m/z = 2 k 내지 200 k의 범위에서 검출하였다. Biomarker Pattern's Software를 이용하여 두 그룹 간의 비교를 수행하여 강도의 차이가 5배 이상이고 p<0.05의 유의성 수준을 갖는 피크를 추출한 경우, GVHD 그룹 중에, 대조군에서보다 더 높은 10개의 피크 및 대조군에서보다 더 낮은 9개의 피크가 있었다.
SELDI - TOF MS 에 의한 단백질 프로파일링
2.0 내지 200 kDa의 전술된 질량 범위에 있는 169개의 피크를 피크 강도 값을 이용하여 더 분석하였다. 교차 변이 방법(cross variation procedure)에 의해 169개의 피크 모두를 이용하여 Biomarker Pattern's Software (BPS, Ciphergen Biosystems, Inc.)에 의해 분류 트리(classification tree)를 작성하였다. 간단히 말하면, 분류 트리에서, 데이터를 문제 형태로 한번에 하나의 규칙(rule)을 이용하여 두 개의 노드(node)로 분리하였다. 본 연구에서, 분리 결정(splitting decision)은 SELDI 단백질 발현 프로파일로부터 확인된 피크 또는 클러스터의 정규화된 강도 수준에 기초했다. 바꾸어 말하면, SELDI 프로파일로부터 확인된 각 피크 또는 클러스터가 분류 방법에서 변수가 된다. 말단 노드(terminal node)에 도달하고, 추가적인 분리가 데이터 분류의 증가를 초래하지 않을 때까지 분리 과정을 지속했다.
이 과정을 이용하여 복수 개의 분류 트리를 생성하고, 분류 트리 분석에 근거하여 최고 성능 트리(best performing tree)를 선택하였다. 결과로, 8972 Da의 피크가 대조군 대비 GVHD군에서 훨씬 더 높은 하나의 피크로 선택되었다. 상기 8972 Da 피크가 민감도 및 특이성 모두에 대해 100%에서 GVHD 군과 대조군의 구별을 제공했다.
도 2는 8972 Da 피크의 예를 보여준다. 도 2A는 6000 내지 10,000 Da 범위에 있는, 동일한 개체로부터 수득된 GVHD 시료(이식 후 7일차, 14일차, 21일차 및 28일차) 및 정상 대조군 시료(BMT-전, 이식 전)로부터의 대표적인 SELDI 스펙트럼을 보여준다. 선에 의해 둘러싸인 부분은 8972 Da의 평균 질량을 갖는 피크를 보여준다. 이 피크는 정상 혈장에 비해 GVHD 혈장에서 과장되며, 7일차 이후의 피크 강도는 대조군에서보다 훨씬 더 높았다. 28일차에 조직 점수 및 피크 강도가 감소되었다. 도 2B는 다양한 시점(각 시점의 n=9)의 시료에서 8972 Da 피크의 평균 정규화된 강도 값을 보여준다. GVHD 시료에서 피크의 평균 표현은 대조군 시료(BMT-전, 이식-전)의 평균 표현보다 훨씬 더 높았다.
CsA 치료 모델
GVHD의 치료제인 사이클로스포린-A (CsA) (Novartis Pharma)를 0.9% NaCl 용액 중에 1.67 mg/mL까지 희석시켰다. 이식 후 8일차부터 13일차까지 매일 CsA를 20 mg/kg의 투여량으로 복막내로 투여하였다. 도 3은 CsA로 치료된 동일한 개체에서 8972 Da 피크의 변화, 및 각 시점(각 점당 n=4)에서 시료의 8972 Da 피크의 평균 정규화 강도 값을 보여준다. CsA로 치료된 GVHD 마우스에서, 8972 Da 피크 강도는 7일차에 높았고, CsA의 투여 후 저하되었다.
동계 이식 모델( Syngeneic Transplantation Model )
BALB/c 마우스로부터 이식된 골수 이식물을 갖는 BALB/c 마우스를 이용한 동계 이식 모델에서, GVHD는 유도되지 않았고, 이식-전과 이식 후 시료 간에 평균 피크 표현의 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다(도 4A 및 4B).
실시예 3
단백질의 분리
면역고갈 크로마토그래피(immunodepletion chromatography)(Multiple Affinity Removal Column MS-3, 4.6 mm IDx50 mm; Agilent)에 의해 합쳐진 혈장(pooled plasma)으로부터 3개의 가장 풍부한 단백질(알부민, IgG, 트랜스페린)을 제거하였다. Buffer A (Agilent) 중 50 ㎕의 혈장의 5배 희석액을 준비하고 면역고갈 컬럼(immunodepletion column)에 주입하였다. 컬럼 통과(flow-through) 분획을 수집하고 HPLC(high-performance liquid chromatography)에 의해 더 분리하였다. HPLC에서 사용된 분리 컬럼은 Inertsil™ Ph column (5 ㎛, 4.6 mm IDx150 mm; GL Sciences, Japan)이었다. 용리 구배 프로파일(elution gradient profile)은 하기와 같았다: (1) 용리 용매 A: 2% ACN/0.1% TFA, 용매 B: 80% ACN/0.1% TFA; (2) 선형 구배: 50분 동안 용매 B에 대해 0부터 100%; 유속 1.0 mL/분.
분획은 30초 간격으로 수집하였고, 각 분획 2 ㎕를 Au 칩(Cipheragen)에 적용하고, SPA 매트릭스로 처리하고, 각 분획의 조성을 SELDI-TOF MS에 의해 모니터링하였다. SELDI-TOF MS 모니터링에 근거하여 31.0분 내지 31.5분의 HPLC 분획(약 38% 아세토니트릴)을 수집하였다. 다량의 8972 Da 단백질이 GVHD 시료에 포함되었으나, 대조군 시료에는 거의 존재하지 않았다(도 5A). 이 분획을 동결건조시키고 200 ㎕의 용해화(solubilization) 완충액(7M 우레아, 2M 티오우레아, 50 mM DTT, 2% 암폴린, 3% CHAPS, 1% Triton X-100)에 용해시켰다.
그 후, 상기 방식으로 농축된 시료를 이차원 전기영동에 의해 분리분리하였다. 초음파 처리(sonication) 후, 시료 용액을 IPG 겔 스트립(pH 3-11, NL, 11 cm long, Amersham Bioscience) 상에 적재하고, 상기 스트립을 30 V에서 10시간 동안 재수화시켰다. 등전점 포커싱(isoelectric focusing, IEF)에 의한 일차원 분리를 20℃에서 IPGphor 시스템(Amersham Bioscience)을 이용하여 총 12 kV/시 동안 수행하였다. IEF 후에, 상기 IPG 스트립을 6 M 우레아, 2% SDS, 30% 글리세롤, 0.002% 브로모페놀 블루, 및 1% 디티오트레이톨을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 8.8) 중에서 15분 동안 평형화시켰다. 그 후, 상기 스트립을 2.5% 요오도아세트아미드로 디티오트레이톨을 대체한 것을 제외하고는 동일한 완충액에서 15분 동안 평형화시켰다. 이차원 분리를 위해, 40 mA/겔의 일정한 전류 하에 8 내지 20% 구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 이차원 전기영동 후에, 질산염 염색에 의해 단백질을 관찰하였다. GVHD 시료와 대조군 시료로부터의 두 개의 겔의 이미지를 비교하여, GVDH 시료에서 높게 발현된, 6,500 Da 내지 12,300 Da에 위치한 스팟을 확인하였다(도 5B 및 5C).
단백질 확인
8972 Da 후보 단백질의 스팟을 겔 중에서 소화시켰다. 요약하면, 상기 겔 스팟을 절단하고, 100% ACN 및 100 mM NH4HCO3로 세척하고, 진공 건조시키고, 37℃에서 5 ㎕의 트립신 용액(50 mM NH4HCO3 및 5 mM CaCl2중 12.5 ng/㎕)에서 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 결과물인 펩티드를 20 ㎕의 20 mM NH4HCO3로 1회 추출하고 50% ACN 중의 5% 포름산 20 mL로 3회 추출하였다. 수집된 추출물을 약 40 ㎕까지 진공 건조시키고 나노유동(nanoflow) HPLC-ESI-MS/MS에 의해 분석하였다. HPLC를 위해, DiNa 시스템(KYA Technology)을 이용하고, 트립신-처리 시료를 HIQsil™ C18 컬럼 (75 ㎛ IDx50 mm; KYA Technology) 상에서 분리하였다. 분리 조건은 하기와 같았다: 용리 용매 A: 0.1% 포름산, 용매 B: 70% ACN 중의 0.1% 포름산; 구배: 용매 B에 대해 40분 동안 0부터 100%; 유속: 200 nL/분. 분리된 펩티드의 특성은 QSTAR XL Q-TOF 질량 분광분석계(Applied Biosystems)를 이용하여 결정하였다. 수득된 질량 스펙트럼 데이터를 이용하여 MASCOT 소프트웨어(Matrix Science Inc.)로 NCBI 단백질 데이터베이스의 검색을 수행하였다.
검색 결과는 8972 Da 단백질의 부분적 아미노산 서열이 CCL8 전구체의 서열과 일치한다는 것을 보여주었다. 도 6은 8972 Da 단백질로부터 분리된 펩티드의 전형적인 MS/MS 스펙트럼을 보여준다. 이 펩티드는 나노 LC-MS/MS에 의해 CCL8 펩티드 68-79 (QGMSLCVDPTQK)로 확인되었다. 마찬가지로, 이론적 질량과 일치되는 11개의 펩티드를 확인하였다. 이 펩티드 서열들을 통합한 경우, CCL8 전구체의 아미노산 서열의 52%를 차지했다(밑줄).
1 MKIYAVLLCL LLIAVPVSPE KLTGPDKAPV TCCFHVLKLK IPLRVLKSYE
51 RINNIQCPME AVVFQTKQGM SLCVDPTQKW VSEYMEILDQ KSQILQP (서열번호 1)
CCL8 전구체의 예상되는 질량은 11,017 Da이고, 예상되는 pI는 8.64이다. CCL8 전구체는 19개의 아미노산으로 구성된 신호 펩티드(signal peptide) 및 뒤이은 78개의 아미노산 잔기들로 구성된 성숙(mature) CCL8 서열을 포함한다. 성숙 CCL8의 예상되는 질량은 8972 Da이고, 예상되는 pI는 8.45이다. 이 수치들은 SELDI-TOF MS 및 이차원 전기영동(2D-PAGE)에 의해 수득된 데이터와 일치한다.
실시예 4
면역분석법에 의한 CCL8 발현의 확인
8972 Da 마커가 CCL8이라는 사실은 특이적 항-마우스 CCL8 토끼 항체를 이용한 SELDI 면역 분석법에 의해 확인되었다. PS20 (preactivated surface) ProteinChip (Ciphergen Biosystems) 상의 각 스팟에 0.1 ㎍의 항-마우스 CCL8 항체를 첨가하고, 상기 칩을 가습 챔버(humidified chamber)에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 잔류 활성 부위들을 5 ㎕의 1M 에탄올아민(pH 8.0)으로 30분 동안 블록킹한 후, 상기 스팟을 PBS 중의 0.5% Triton X-100으로 3회 세척하고 PBS로 2회 세척하였다. 혈장 시료를 PBS로 1:75로 희석하고, PS20 칩 상의 항체-고정화 스팟에 적용하고, 바이오프로세서(bioprocessor)를 이용하여 실온에서 약한 혼합(gentle mixing)과 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 스팟을 PBS 중의 0.5% Triton X-100으로 2회 세척하고 PBS로 2회 세척하였다. 5 mM HEPES에 의한 짧은 세척 후에, SPA 매트릭스를 첨가하고, PBS II ProteinChip 판독기를 이용하여 MS 분석을 수행하였다. GVHD 혈장 시료에서 CCL8을 검출하였으나, 대조군 시료에서는 간신히 검출되었다(도 7).
실시예 5
인간 임상 시료 중 CCL8 발현
골수 이식을 받은 환자로부터 수득된 혈장을 PBS로 1:25로 희석하고 인간 임상 시료로 이용하였다. 실시예 4에서와 같이, SELDI 면역분석법에 의해 인간 환자에서 CCL8의 발현을 조사하기 위해 항-인간 CCL8 항체와 함께 PS20 ProteinChip을 이용하였다.
환자 1 (도 8)
5세 남아
진단: 판코니 빈혈(Fanconi anemia)
치료: 비혈연관계 공여자(unrelated donor)로부터의 제대혈 줄기 세포 이식(CBSCT (UR))
예방: CsA + MMF
경과: GVHD는 이식후 13일차에 최초로 피부 발적으로 발병하였고, 같은 날에 메틸프레드니솔론(mPSL) 치료법을 개시하였다. GVHD의 임상적 소견 전에 이식 후 10일차에 CCL8을 검출하였다. 이 치료에 의해 CCL8의 수준은 일시적으로 감소되었다. 그러나, CCL8 발현량은 GVHD 재발과 함께 다시 상승하였다. 환자는 처음에는 상기 치료에 반응하였으나, 궁극적으로 치료-내성 GVHD로 사망하였다. CCL8 발현량은 GVHD 발병 및 치료적 효능과 상관관계를 가졌다. 치료법에 대한 내성이 생긴 후에, CCL8의 수준은 더 이상 저하되지 않았다.
환자 2 (도 9)
10세 남아
진단: 만성 골수성 백혈병 (CML)
치료: 비혈연관계 공여자로부터의 골수 이식(BMT (UR))
예방: FK + MTX
경과: GVHD는 이식후 19일차에 최초로 피부 발적으로 발병하였고, 같은 날에 메틸프레드니솔론(mPSL) 치료법을 개시하였다. 그 날에 CCL8의 수준은 명확한 증가를 보였다. GVHD는 일시적으로 단계 2로부터 단계 3으로 진행되었으나, 치료법에 의해 개선되었고, 그 이후, CCL8 발현의 높은 수준은 발견되지 않았다.
환자 3(도 10)
3세 여아
진단: 급성 림프모세포성 백혈병(ALL)
치료: 일치된 동기로부터의 골수 이식(BMT (matched-sib.))
예방: MTX
경과: GVHD는 발병하지 않았다. 경과 동안 CCL8 발현의 증가는 관찰되지 않았다.
환자 4 (도 12)
11세 여아
진단: 급성 림프모세포성 백혈병(ALL)
치료: 일치된 동기 공여자로부터의 골수 이식 (MSD-BMT)
예방: 단기 MTX
경과: 이식 후 11일차에 GVHD를 발병했다. CCL8 발현의 수준은 증가를 보였다. 같은 날에 연속적인 정맥내 주입(continuous intravenous infusion, C.I.V.)에 의해 사이클로스포린-A를 투여하였다. 14일차에, GVHD의 증상들이 개선되었고, CCL8 발현 수준이 저하되었다.
환자 5 (도 13)
중증의 재생불량 빈혈을 가진 19세의 여성이 일치하는 HLA-1 항원을 갖지 않는 부모로부터의 골수 줄기 세포 이식을 받았다. 상기 환자는 150 mg/m2 플루다라빈(fludarabine, Flu), 120 mg/kg 사이클로포스파미드(CY), 및 24 mg/kg 항-흉선세포 글로불린(anti-thymocyte globulin, ATG)으로 구성된 이식-전 조건화(pre-transplantation conditioning)를 받고, 타크롤리무스(tacrolimus)에 의해 GVHD에 대한 예방을 수행했다. 10일차에, 상기 환자는 고열을 보였고, 16일차에 사지 및 몸통에 비정형 피부 발진(atypical skin rash)이 나타났으나, 설사는 없었다. 20일차에, CCL8 수준이 명확한 증가를 보였다. 23일차에, 피부 발진 생검을 수행하고, 메틸프레드니솔론(mPSL) 치료법을 개시하였다. 31일차에, GVHD의 증상이 개선되었고, CCL8 발현 수준이 저하되었다.
실시예 6
GVHD 환자 및 정상 개체 중 CCL8 혈장 농도
정상 개체의 혈장, HSCT-후 환자 중, GVHD를 발병한 환자들 및 GVHD를 발병하지 않은 환자들의 혈장에서 CCL8의 양을 정량하였다. 도 11은 그 결과를 보여준다. 수치 단위는 pg/mL이다. HSCT를 받은 환자 중, GVHD를 발병하지 않았던 환자들에서 CCL8 혈장 농도는 6.92 내지 48.0 pg/mL이었고, 평균은 23.3 pg/mL이었다. GVHD를 발병한 환자에서 CCL8 혈장 농도는 52.0 내지 333.6 pg/mL이었고, 평균은 133.3 pg/mL이었으며, 이는 명확하게 더 높은 농도였다. 또한, 두명의 치료-내성 GVHD 케이스에서, CCL8 농도는 333.6 pg/mL 및 290.4 pg/mL이었고, 이는 매우 높은 농도였다. 이 두명의 환자들은 GVHD 치료법에 대해 내성을 보였고 사망했다. 정상 개체에서, CCL8 혈장 농도는 0 내지 32.6 pg/mL이었고 평균은 18.9 pg/mL이었으며, 이는 매우 낮은 값이었다. 이와 같은 발견으로부터, GVHD를 발병한 환자의 혈장에서 CCL8의 양은 정상 개체에서보다 훨씬 더 높고, 치료-내성 GVHD 환자에서, 상기 양은 훨씬 더 높다는 것을 것을 확인했다.
전술된 결과는 CCL8 발현량과 인간 환자에서 GVHD의 발병 및 경과 간에 강한 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7
감염과 감별 진단( Differential Diagnosis )
TLR 리간드가 투여된 마우스에서 CCL8 발현 수준을 측정하였다.
수컷 BALB/c (H-2d) 마우스를 Sankyo Labo Service Corporation (Tokyo, Japan)으로부터 구입하였다. 상기 마우스는 테스트의 개시 시에 8주 내지 10주령이었다. 달리 표시되지 않으면, 모든 시약은 SIGMA/ALDRICH (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다.
야생형 BALB/c 마우스에 500 ㎕의 PBS 중 5 ㎍의 리포폴리사카라이드(LPS)(대장균), 5 ㎍의 폴리(I:C) (GE Healthcare Bio-sciences, Tokyo, Japan), 및 20 mg의 D-GalN, 100 mg의 펩티드글리칸(PGN (스태필로콕코스 오레우스(Staphylococcus aureus)) (Invitrogen, CA, USA), 20 mg의 Zymosan-A (Invitrogen, CA, USA), 및 20 nmol의 Cpg-ODN (Invitrogen, CA, USA)을 복막내 주사하였다. 대조군 마우스에는 500 ㎕의 PBS를 복막내 주사하였다. 주사 4시간 후에, 혈장 시료를 수집하였다. 예비 실험에 의해 LPS, 폴리(I:C), PGN, Zymosan-A, 및 CpG-ODN의 투여량을 결정하였다.
주사 4시간 후에, 헤파린-코팅된 주사기를 이용하여 마우스 혈액을 채취하고, 상기 혈액에 대해 채취 후 30분 이내에 5000 rpm에서 7분 동안 원심분리에 의한 분리를 수행하여 혈장을 수득하였다. 분리된 혈장 시료를 분석시까지 -80℃에 보관하였다. 자원자 및 환자로부터 혈액 시료를 채취하고, 혈장 시료를 준비하고, 분리된 시료들을 분석시까지 -80℃에 보관하였다.
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 인간 CCL8을 측정하였다. 인간 CCL8용 ELISA는 RayBiotech (Norcross, GA)으로부터 구입하고, 제조사의 프로토콜을 따랐다. 450 nm에서 플레이트 판독기(plate reader)(Multiskan JX, Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)로 플레이트를 판독하였다.
결과를 평균 ± S.E로 표시하였다. 유의성에 대한 통계적 분석은 양측(two-tailed) 또는 단측(one-tailed) t-검정을 이용하여 수행하였다. 유의성의 수준은 p < 0.05로 설정하였다. 복수 회의 비교에 대한 Bonferroni 보정을 이용하였다. 표시된 결과는 일련의 테스트에 대한 대표적인 데이터이다.
도 14에 도시된 바와 같이, CCL8의 수준은 TLR 리간의 투여에 의해 증가되지 않는다는 것이 명확하게 입증되었다. 이 발견은 CCL8 발현의 수준이 세균 감염 또는 바이러스 감염에 의해 증가되지 않는다는 것을 보여주며, GVHD와 감염증 간의 감별 진단이 CCL8 발현을 지표로 이용하는 것에 의해 수행될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8
GVHD 의 발현 전 진단
실시예 1에서와 같이, 마우스에서 동계 BMT를 수행하고, 이식 후 1일차, 3일차, 5일차 및 7일차에 혈액을 채취하고, 헤파린-혈장 시료를 수득하였다. 혈장 중 CCL8의 농도를 마우스 CCL8에 대한 ELISA를 이용하여 정량하였다.
이식 후 0일차 내지 7일차에 동계 BMT로부터 체중 변화, 7일차에 체중 감소, 굽은(hunched) 자세, 외피(coat), 피부 및 설사를 0점, 1점 및 2점의 3-단계 스케일로 평가하였다. 0점은 <10%의 체중 감소에 부여하였으며; 1점은 10% 내지 <25%의 체중 감소에 부여하고; 2점은 ≥25%의 체중 감소에 부여하였다. 굽은 자세의 경우, 정상적인 자세에 0점을 부여하고, 약간 굽은 자세에 1점을 부여하였으며, 매우 굽은 자세에 2점을 부여하였다. 외피의 경우, 정상에 0점을 부여하고, 약간 주름진 털에 1점을 부여하고, 손질(grooming) 없이 전신의 주름진 털에 2점을 부여하였다. 피부의 경우, 정상 피부에 0점을 부여하고, 꼬리 및 다리의 가시적인 경화증에 1점을 부여하고, 반점형 탈모증(patchy alopecia)을 갖는 마우스에 2점을 부여하였다. 설사의 경우, 정상에 0점을 부여하고, 약간의 설사에 1점을 부여하였으며, 완전한 설사에 2점을 부여하였다. 임상적 GVHD 점수는 각 기준에 대한 총 점수를 나타내며, 최대 점수는 10이다.
도 15는 CCL8 혈장 농도의 시간의 경과에 따른 변화를 보여준다. CCL8 혈장 농도는 골수 이식 직후에 증가되었고 5일차 이후에 훨씬 더 높았다. 대조적으로, 6일차까지 GVHD의 임상적 소견이 관찰되지 않았다. GVHD의 임상적 평가는 7일차에 약 2.5점이었고, 이는 초기 단계 GVHD를 나타낸다. 그 이후, GVHD 징후는 7일차부터 모든 마우스에서 진행되었고, 28일차에 점수는 6.3점이었다.
이 발견에 근거하여, 혈액 중 CCL8 단백질의 정량은 마우스에서 GVHD의 전임상(pre-clinical) 진단 또는 초기 단계 진단을 위해 유용한 것으로 사료된다.
실시예 9
항- CCL8 항체에 의한 GVHD 의 치료
토끼에 합성 CCL8 펩티드를 투여하여 항-마우스 CCL8 토끼 항체를 제조하고, 결과물인 항혈청으로부터 친화도 컬럼을 이용하여 항-CCL8 IgG 분획을 정제하였다. 정상 토끼의 혈청으로부터 유래된 IgG 분획을 정상 토끼 항체 대조군으로 이용하였다.
실시예 1에서와 같이, 마우스에 골수 이식을 수행하였다. 항-마우스 CCL8 토끼 항체 또는 정상 토끼 항체를 동종이형 BMT 전날부터 시작하여 3일 연속으로 미정맥을 통해 공여체 마우스에 100 ㎍의 투여량으로 투여하였다. 각각 3마리의 마우스를 항 마우스 CCL8 항체(치료군) 및 정상 토끼 항체(대조군)로 처리하였다. BMT-후 14일차에, 마우스를 경추 탈구에 의해 희생시켰다. 피부, 간 및 소장을 제거하고 10% 완충 포르말린에서 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀에 포매하고, 절편을 준비하고 헤마톡실린/에오신으로 염색하고, GVHD를 나타내는 것으로 간주되는 병리적 징후를 찾기 위해 광학 현미경 하에 관찰하였다. 평가 방법은 하기와 같았다: 피부(단핵세포의 진표피 접합부로의 침윤, 및 모낭 또는 피지선에 대한 손상); 간(문맥주위 단핵세포 침윤 및 간세포 괴사); 및 소장(장샘 세포의 아폽토시스 및 융모의 확장 또는 편평화). 발견을 3-단계 스케일 상에서 양성(+), 중간(+/-), 또는 음성(-)으로 해석하였다.
피부 조직의 전형적 이미지가 도 16에 도시되며, (a)는 항-마우스 CCL8 항체의 투여 결과를 나타내고, (b)는 정상 토끼 항체(대조군)의 투여 결과를 나타낸다. 피부에서 GVDH에 대한 징후인 피지선에 대한 손상(화살표 머리) 및 진표피 접합부로의 림프구의 침윤(화살표)이 정상 토끼 항체를 투여받은 군에서 관찰될 수 있으나, 이들은 항-마우스 CCL8 항체를 투여받은 군에서는 관찰되지 않는다.
도 17은 전술된 평점 시스템을 이용한 결과를 보여준다. 진표피 접합부로의 염증 세포 침윤의 감소 및 피부의 모낭 및 피지선에 대한 손상의 개선은 항-CCL8 항체로 처리된 마우스에서만 관찰되었다. 이 결과는 항-CCL8 항체에 의한 치료가 GVHD의 치료에서 효과적이라는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Sapporo Medical University; Immuno-Biological Laboratories, Co. Ltd. <120> Diagnosis and Treatment of GVHD <130> PS12-0001 <150> JP 2007-165547 <151> 2007-06-22 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Lys Ile Tyr Ala Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Val Pro 1 5 10 15 Val Ser Pro Glu Lys Leu Thr Gly Pro Asp Lys Ala Pro Val Thr Cys 20 25 30 Cys Phe His Val Leu Lys Leu Lys Ile Pro Leu Arg Val Leu Lys Ser 35 40 45 Tyr Glu Arg Ile Asn Asn Ile Gln Cys Pro Met Glu Ala Val Val Phe 50 55 60 Gln Thr Lys Gln Gly Met Ser Leu Cys Val Asp Pro Thr Gln Lys Trp 65 70 75 80 Val Ser Glu Tyr Met Glu Ile Leu Asp Gln Lys Ser Gln Ile Leu Gln 85 90 95 Pro <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Gln Gly Met Ser Leu Cys Val Asp Pro Thr Gln Lys 1 5 10

Claims (8)

  1. 인간 개체 또는 동물 개체로부터 수득된 시료에서 이식편대숙주 질환의 진단 또는 경과(course)의 지표로서 CCL8 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 이식편대숙주 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CCL8 단백질의 수준을 측정하는 단계는 이식편대숙주 질환의 임상적 징후의 발현 전에 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CCL8 단백질의 수준은 항-CCL8 항체를 이용하여 측정되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CCL8 단백질의 수준은 질량 분광측정법(mass spectrometry), HPLC(high-performance liquid chromatography), 및 이차원 전기영동으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 측정되는 것인 방법.
  5. 항-CCL8 항체를 포함하는, 이식편대숙주 질환용 진단 시약.
  6. 이식편대숙주 질환의 치료제를 위한 후보 물질을 선택하는 방법으로서:
    이식편대숙주 질환 모델 동물에 테스트 물질을 투여하는 단계;
    상기 모델 동물로부터 수득된 시료에서 CCL8 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 CCL8 단백질 발현 수준이 상기 테스트 물질의 투여가 없는 경우의 수준보다 더 낮은 경우, 상기 테스트 물질을 이식편대숙주 질환의 치료제를 위한 후보 물질로 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 항-CCL8 항체를 활성성분으로 포함하는, 이식편대숙주 질환 치료용 약제학적 조성물.
  8. 삭제
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