JP2003531816A - 遺伝子導入産物に機能的寛容を誘導する方法 - Google Patents

遺伝子導入産物に機能的寛容を誘導する方法

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アンダーソン，ゴラン，ケイ．
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Abstract

(57)【要約】 体細胞内の導入遺伝子の発現産物に機能的寛容を誘導する方法が開示され、本方法は受容者に１個またはそれ以上の腫瘍抗原を発現するように遺伝子導入で修飾される造血幹細胞などの幹細胞を導入することを含み、このような処置は選択肢として骨髄還元手順が先行することもある。開示された方法の目的はこれらの抗原が遺伝子治療処置の一部として導入される細胞またはベクターにより発現される時に、この同一抗原に寛容を誘導することにある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本出願は１９９９年１０月１日出願された合衆国暫定特許出願番号６０／１５
７２３３号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれ
ている。
【０００２】 本発明は遺伝子導入産物に対する免疫応答を抑制するための方法に関する。よ
り詳細には、本方法は遺伝子治療ベクターにより形質導入された造血幹細胞の移
植と、続く同一の遺伝子治療ベクターにより形質導入された体細胞の移植とによ
る混合分子造血キメラ現象の確立を含む。
【０００３】
【発明の背景】
遺伝子治療による個体の遺伝子の修飾、あるいは細胞内への遺伝物質の送達は
、がん、感染症、自己免疫疾患ならびに遺伝疾患などのような一般の疾病の処置
において有望な方法である。成功した遺伝子治療アプローチはしばしば細胞への
導入遺伝子の有効な送達と治療段階での導入遺伝子の長期的な発現の維持に依存
している。しかし患者内での遺伝子導入分子に対して影響を与える免疫応答の発
達は、遺伝子治療の有効性を妨げる可能性のある重大な合併症である（ウイルソ
ン，１９９５年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６巻２５４７−２５５４ペ
ージ；アンダーソン，１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ，３９２巻：２５―３０ページ
）。
【０００４】 機能的免疫応答を備えることを伴う免疫系のエフェクター行細胞は、ＣＤ４+
Ｔヘルパー細胞、ＣＤ８+Ｔキラー細胞、そしてＢリンパ球を含む。後者の細胞
型は導入遺伝子から発現される種瘍抗原、あるいは導入遺伝子によりコードされ
る分子が活性化した結果として産生される種瘍抗原を効率的に無力化にする抗体
と同様に、遺伝子治療ベクター自身に対する抗体も産生する。加えて、ＣＤ８+
細胞障害性Ｔ細胞は活性化して、ベクターを形質導入した細胞を効果的に破壊す
る。このＭＨＣクラスＩに制限された細胞障害性Ｔ細胞の仲介する、遺伝的に修
飾された細胞の殺傷は、明らかに、標的細胞の維持にとって主要な障害である（
リデル他，１９９６年，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２巻：２１６―２２３ページ）。こ
れらの免疫応答の複合的な結果が、抗体の仲介する急速な遺伝転写分子の無力化
と形質転換細胞の効率的な排除である。確かに、遺伝子治療により修飾された細
胞に対する免疫系の有効性は、癌、慢性感染性疾患、ＡＩＤＳを処置しようとす
る遺伝子治療試験で利用されてきた（ハナーニア他、１９９５年、Ａｍ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．，９９巻：５３７−５５２ページ；ディルバー他、１９９６年、Ｂｌｏｏ
ｄ．，８８巻：２１９２−２２００ページ；リデル他、１９９６年、Ｎａｔ．Ｍ
ｅｄ．，２巻：２１６−２２３）。
【０００５】 遺伝子治療に関連する宿主免疫応答の認識は、アデノウイルスベクターについ
て広く実証されており、（トライパシー他、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１巻：１１５５７−１１５６１ページ；ヤン他
、１９９５年，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９巻：２００４−２０１５ページ；モルナ
ー−キンバー他、１９９８年，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，９巻：２１２１
−２１３３ページ）、ここで宿主免疫応答は第一にウイルスベクターの構造タン
パク質に対して影響を与えるように見える。肝細胞遺伝子治療ラットモデルにお
けるアデノウイルスベクターに対する免疫寛容の誘導は、アデノウイルス抗原の
、胸腺内、経口あるいは新生児（静脈内）投与によって試みられた。これらの方
法は限られた成功しか得ていない（イヤン他、１９９７年，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．，９９巻：１０９８−１１０６ページ）。寛容化方法を発展させよう
とするこれらの試みに次いで、アデノウイルスベクターの肝臓への全身注入が行
われ、これらの場合では、アデノウイルス抗原に対する体液性応答、細胞性応答
の双方が多少減少した（高橋他、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，２７１巻：２６５３６−２６５４２ページ）。この問題を回避するために、ウ
イルスにコードされているタンパク質に対して影響を与える宿主免疫応答を最小
限にするためにアデノウイルスベクターが開発された（ウイルソン，１９９６年
、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２３４巻：１１８５−１１８７ページ）。この
結果も部分的な宿主免疫応答の排除にしか至らなかった。
【０００６】 レトロウイルスベクター発現産物に影響を与える免疫応答は、これまでも記載
されてきた（マコーマック他、１９９７年，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，８
巻：１２６３−１２７３ページ）。しかし導入遺伝子のコードする種瘍抗原、エ
リスロポエチンに影響を与える免疫応答は、ベクタータンパク質に影響を与える
免疫応答を支配する（トライパシー他，１９９６年，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２巻：
５４５−５５０ページ）。
【０００７】 定義された遺伝的混合骨髄キメラ現象は、同種異系移植片および異種移植片に
対するＴ細胞寛容を誘導する方法として記載されている。合衆国特許番号５，６
１４，１８７号、「移植に於ける特異的寛容」は、受容者哺乳類における、ＭＨ
Ｃの異なる移植片に対する寛容を誘導する方法を示している。この方法は分子混
合キメラ現象の状態と、特定のＭＨＣ抗原を発現する細胞、およびまたは、器官
の寛容の誘導を確立している（マドセン他、１９８９年．Ｎａｔｕｒｅ．，３３
２巻：１６１−１６４ページ；サイクス他、１９９３年． Ｔｒａｎｓｐｌａｎ
ｔａｔｉｏｎ．，５５巻：１９７−２０２ページ；フレーザー他，１９９５年．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４巻：１５８７−１５９５ページ；イエリーノ他、
１９９９年．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．，６７巻：１１１９−１１２８
ページ）。
【０００８】 ガラクトシル−α−１，３−ガラクトース（α−Ｇａｌ）エピトープに対して
反応する抗体の産生を阻害する同様のアプローチが最近記述されている（イアコ
ミーニ他、１９９８年．ＰＣＴ特許出願、国際公開番号ＷＯ９８／３３３８７号
）。細胞がブタα−１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−ＧＴ）遺伝子
を発現できるように遺伝的に修飾された自己由来骨髄細胞（ＢＭＣ）は、α−Ｇ
ａｌ正の細胞、組織、或いは器官の移植に先立って、異種移植受容者に対して移
植される。この方法はα−Ｇａｌエピトープに対する寛容状態を確立し、α−Ｇ
ａｌ正の細胞、組織、或いは器官の超過敏な拒絶反応を排除する。
【０００９】 提供者特異的な寛容の誘導と提供者造血細胞内で発現する導入遺伝子にコード
されているタンパク質に対する特異的な免疫応答の廃止は、遺伝子導入動物にお
いて報告されてきた（ザンビディス他、１９９７年．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
５８巻：２１７４−２１８２ページ）。
【００１０】 造血幹細胞が形質導入に使われるような細胞型である血液障害の処置の場合に
おいて、もし遺伝子転写アプローチによって原始再居住細胞が標的とされるなら
ば、寛容誘導は或る特定頻度で起こりうる。エバンスとモーガン（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，（１９９８年）９５巻：５７３４−５７
３９ページ）は、ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡ遺伝子を
発現するベクターを用いたＢＭＣの形質導入に伴い、ＦＶＩＩＩ欠損マウスの５
０％にｈＦＶＩＩＩタンパク質に対する寛容が確立された、というプロトコルを
記載している。
【００１１】
【発明の概要】
本発明は、ヒト患者などのような動物を処置する方法に関し、体細胞の移植、
ベクターの注入により前述の動物の疾病状態の処置を促進するための外来遺伝子
を含有し、また発現する体細胞、および遺伝子操作したベクターに対する免疫寛
容を獲得するためのものである。注意すべき事は、免疫寛容とは寛容が誘導され
る主要な機構であるが、その他の現在は未定義の寛容誘導の過程、または機構も
起こりうる。
【００１２】 一つの見地において、本発明は治療用ポリペプチドをコード化するベクター、
または前記ベクターの一つを含む組換え細胞、あるいは前記治療用ポリペプチド
をコード化するポリヌクレオチドの一つを受け入れる動物を前処置する方法に関
し、またこの方法は前記ベクターまたは前記ポリヌクレオチドより成るグループ
から選択される部材で形質導入される造血細胞で前記動物を処置することを含む
。
【００１３】 この発明の手順は、造血細胞を形質導入する使用される１個またはそれ以上の
同じ外来又は治療遺伝子を発現する体細胞のサンプルを前記動物、例えばそれを
必要とするヒト患者に導入し、また標的細胞あるいは細胞群での続く発現のため
に１個またはそれ以上の外来遺伝子を含むベクターのサンプルを前記患者に投与
することにつなぐことができる。本発明に従って、そのような体細胞は細胞懸濁
液の形態、あるいは移植の場合に固体組織塊の状態が普通である。加えて、本発
明の方法は、動物、とりわけヒト患者に免疫寛容を誘導するのに理想的に適して
おり、それは治療の受容者に対し免疫抑制剤の投与などのような骨髄整復手順を
施すことで遺伝子治療を受けさせ、次いで遺伝子治療手順の対象である種瘍抗原
、あるいは外来抗原を発現するように遺伝子導入で変更された造血幹細胞を投与
し、これにより外来遺伝子への受容者の露出に対する免疫応答を小さくする。そ
のような方法は、実際の移植、あるいは遺伝子治療に先だって、任意に、造血幹
細胞のような前述の幹細胞の投与に続く免疫抑制治療プログラムを利用する。
【００１４】 ここに開示された方法に用いるために考慮された遺伝子治療の型は、一般に、
遺伝的に処理された細胞、あるいはベクター、場合によっては受容者から抽出し
、受容者体内に再挿入した後に発現する１個またはそれ以上の新規遺伝子を含む
ように遺伝的に修飾した細胞のいくつかの型の投与から構成される。本発明の方
法によって生成される免疫寛容は、造血幹細胞のような幹細胞のゲノムの一部と
して前記の遺伝子を早期に発現させることにより、遺伝子治療で利用される遺伝
子に対する寛容を獲得するように意図されている。従って、ベクターが、遺伝子
治療プログラムの一部として用いられる体細胞内への導入遺伝子の挿入のために
、あるいは癌組織といった特異的な組織を標的とするように修飾された独立型ベ
クターのように、ベクターが遺伝子治療（すなわち、試験管内遺伝子輸送機構、
例えばレトロウイルス上澄み、ＤＮＡリボソーム複合体、ＤＮＡとＲＮＡ、セン
スとアンチセンス）の一部として用いられる場合には、そのようなベクターは同
一導入遺伝子をで、造血幹細胞のような幹細胞の形質導入のためにも、適切に利
用され、それにより前述の幹細胞が、導入遺伝子とベクター自体に特異的な遺伝
子の両方を発現することを可能にすることになり、また結果的には、ベクター自
体の構成要素である、ベクター遺伝子によってコードされる遺伝子産物と導入遺
伝子コード化産物の両方に対する免疫もしくは機能的寛容の発現に至るであろう
し、全ては既に発生している骨髄整復の環境下で起こる。
【００１５】 本発明の目的は、続く遺伝子操作された体細胞の投与と併せて移植された遺伝
子操作体細胞に対する免疫寛容を促進する骨髄整復プロセスの一部として免疫抑
制剤を使用する方法を提供することである。
【００１６】 本発明のもう一つ目的は、ここで開示記載される免疫寛容を獲得する方法を用
いて、疾病異常を処置する方法を提供することである。
【００１７】 本発明の更なる目的は、有害で望ましくない免疫応答によって特徴づけられる
疾病を処置する方法を提供することである。そのような疾病はアトピー性疾患お
よび自己免疫疾患を含む。
【００１８】
【詳細説明】
治療はしばしば、患者に対して、細胞の受容者内に存在する疾病異常の緩和に
有効な特異的遺伝子を持つ遺伝子操作細胞を提供する必要性を伴う。この様な治
療の主要な不都合な点は、細胞内に存在する遺伝子が、そのような治療にとって
必要不可欠なタンパク質を発現する時に、続いて、疾病異常を改善するだけでは
なく、望ましくなく、危険性のある免疫応答を引き起こすことである。細胞それ
自体が、もし異なる生体、場合によっては異なる種から得られた場合にも、しば
しば同様に望ましくない免疫応答を引き起こす。加えて、遺伝子操作ベクターが
、癌のような疾病を持つヒト患者のような動物体内に注入された場合にも、そこ
で前述のベクターはガン細胞に特異的に結合し、その中に入り込み、それによっ
てガン細胞を破壊する、あるいはガン細胞を続いて投与される抗ガン剤に対して
敏感にする遺伝子を導入する、そのようなベクターもまた望ましくなく有害な免
疫応答を与えてしまうかもしれない。そこで、細胞およびベクターが、それを必
要とするヒト患者のような動物体内に導入されねばならない時には、疾病と闘う
のに有用な産物を発現する細胞および、ベクターの持つ外来遺伝子の使用には、
免疫学的な問題を生み出すという付随的な効果がある。そこで、本発明は発現産
物が前記の免疫応答を緩和、もしくは改善するように働く治療用遺伝子の使用に
関する。
【００１９】 本発明の方法は、有益な方法で種瘍抗原に対する免疫応答を獲得する宿主の能
力を効果的に利用する遺伝子治療における免疫寛容を開発する方法を提供するこ
とによって、この問題を解決する。本開示の目的のために、「種瘍抗原」という
用語は、遺伝子治療を受けるヒト患者のような動物体内に見られる、前述の患者
の内因性ではない抗原、あるいは抗原決定因子、あるいはエピトープを意味する
。前記種瘍抗原は、遺伝子治療の結果として、この明細書の前後関係内でもっと
も一般的に発生し、これによりトランスジェニック体細胞のような遺伝的に修飾
された細胞が動物に導入され、特に前述の処置が遺伝子治療の治療プログラムの
一部として、ヒト患者に、そして前述の導入遺伝子の産物に対して実施され、前
記遺伝子導入産物の発現に際して、前記産物は続いてその様な発現産物に対する
免疫応答を結果的に獲得した受容患者の免疫機構にさらされる。
【００２０】 本発明の一見地は、（ａ）被験者に対して骨髄整復処置を施し、（ｂ）被験者
内で混合分子造血幹細胞キメラ現象が導入される少なくとも１個の遺伝子導入産
物を含む造血幹細胞のような幹細胞を導入し、また（ｃ）被験者体内に同一遺伝
子導入産物を含有する非造血幹細胞（すなわち、体細胞）を導入する、以上より
構成される分子治療用薬の必要性のある被験者を処置する方法を提供する。
【００２１】 一つの見地においては、本発明は治療用ポリペプチドをコード化するベクター
、あるいは前記のベクターの一つを構成する組換え細胞、あるいは前記ベクター
あるいは前記治療用ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの一つを受け
入れる動物を前処置する方法に関し、この方法は前記ベクターまたは前記ポリヌ
クレオチドより成るグループから選択される部材で形質導入される造血細胞、と
りわけ造血幹細胞て前記動物を処置することを含む。
【００２２】 一つの実施例において、本発明の方法は免疫抑制治療プログラムを含む骨髄整
復処置を先行することができる。も一つの実施例においては、本発明に基づく前
処置プロセスは、全く異ならないとしても前処置に先行骨髄整復処置、あるいは
免疫抑制治療プログラムとは区別する免疫抑制治療プログラムを含む骨髄整復処
置が続く。
【００２３】 一つの実施例において、本発明は遺伝的に異なる体細胞あるいは前記外来遺伝
子からなる遺伝子治療用ベクターを受容中のもしくは受容する動物体内で、外来
もしくは治療用遺伝子産物に対する免疫あるいは機能的寛容を誘導する方法と関
し、本方法は、 （ａ）前記の動物に骨髄整復処置を施すことで、続いて外来遺伝子を発現する導
入、投与、注入される幹細胞が受容され、また移植され、および、 （ｂ）前記の動物体内に、前記の外来あるいは治療用遺伝子を発現するベクター
を形質導入された幹細胞のサンプルを導入し、それによって結果的に続いて外来
あるいは治療用遺伝子を構成する導入、細胞あるいはベクターに対する免疫寛容
あるいは免疫受容を誘導する、 ことから成る。
【００２４】 本発明に従って、ここで用いられる体細胞は受容者の細胞とは遺伝的に異なっ
ているか、あるいは、事実上、受容者のものとは異なる抗原構造を発現するよう
に遺伝的に変更もしくは遺伝子操作されている。従って、そのような体細胞は単
に細胞を置換あるいは補足するものとして利用されるか、さもなくば、受容者体
内に存在するが、異なる生物から取り出されたために遺伝子的に異なっているか
、あるいは様々な型の遺伝子置換治療を促進するように意図的に遺伝的変更また
は修飾された体細胞である。ここに示された方法はまた、受容者が受容者により
外来と見做された１個またはそれ以上の遺伝子を発現する遺伝子治療ベクターを
受ける場合に効果的である。本発明に従って、前記体細胞あるいはベクターは、
その様な細胞あるいはベクターの注射または注入といった殆どすべての実現可能
な投与形態で受容者に導入される。加えて、前記の外来抗原は同種異系抗原、ま
たは異種抗原、あるいは、通常の技術を有する人に公知でまた使用されている外
来遺伝子のその他の名称で称されるであろう。
【００２５】 本発明に従って、免疫寛容を誘導するためのこの様な方法は、一般に、動物体
内に、特にここでの動物がヒトの患者である場合に、１個またはそれ以上の外来
遺伝子を含有するベクターで生体外で形質導入された自己由来体細胞のサンプル
を導入するか、あるいは生体内条件下での遺伝子送達システム、例えばレトロウ
イルス上澄み、ＤＮＡリボソーム複合体、ＤＮＡあるいはＲＮＡ、センスとアン
チセンスの両方を導入することを伴ういくつかの型の疾病改善処置が続けられる
。
【００２６】 ここでの開示に従って、このような外来遺伝子は一般に治療用遺伝子であり、
それらは動物あるいはヒト患者に導入された同一体細胞あるいはベクター内に、
１個または１個以上存在するであろう。それらは一般に導入遺伝子である。これ
らの導入遺伝子は、ここでは、前記の遺伝子が受容者細胞に対して内因性ではな
い条件下で、遺伝子操作技術によって細胞内に導入された遺伝子と解釈される。
従ってこのような導入遺伝子には類似の細胞から取り出された遺伝子が含まれる
が、そのような遺伝子が、同一生体の異なる細胞、あるいは同一種の別生体、あ
るいは異種生体から取り出された同一遺伝子の異なった形態などのような、同一
遺伝子の異なった対立遺伝子である場合には、そのような対立遺伝子は受容者細
胞には見られない。例えば、ブタのインスリンをコードしている遺伝子がヒトの
細胞のゲノムに挿入された場合には、その遺伝子は導入遺伝子であろうし、その
細胞はトランスジェニック細胞となるであろう。同様に、ヒト遺伝子が、遺伝的
欠損によって通常は所有しているような遺伝子を欠損しているヒト細胞中に挿入
された場合、そのような遺伝子は、本開示の目的のための導入遺伝子であろうし
、そのような細胞はそのためのトランスジェニック細胞となるであろう。そのよ
うな導入遺伝子はまた、受容者細胞の種とは異なる種の細胞にのみ見られる遺伝
子、動物細胞に挿入される植物酵素をコードしている遺伝子のように、完全に異
なる遺伝子も含む。
【００２７】 ここで使用されているように、「治療用遺伝子」という用語は、患者あるいは
受容者に対して外来の遺伝子あるいは自己由来の遺伝子であるが、欠損あるいは
機能を持たない遺伝子治療の目的のために用いられる遺伝子を意味する。
【００２８】 本発明の目的は、器官の移植あるいは受容者に対して外来のものと認識される
タンパク質を産生する遺伝子治療の結果として生じる移植に対する不都合な免疫
応答を阻害することである。これに関連して、「阻害」という用語は、発病度予
防あるいは阻害あるいは減少を、あるいは移植拒絶に対する寛容の誘導あるいは
移植拒絶の逆転を意味するものとする。ここで用いられる「移植」という用語は
、必ずしもそれに限定されないが同種異系移植片と異種移植片の移植を含み、い
ずれかのまたすべての移植も意味する。そのような移植は、必ずしもこれに限定
されないが、例として細胞、骨髄、組織、固体器官、骨その他の移植も含むであ
ろう。
【００２９】 ここで用いられる「免疫応答」という用語は、例として、またこれに限定され
ないが、（ｉ）移植、（ｉｉ）対宿主性移植片病および、（ｉｉｉ）自己免疫疾
患の結果としての自己抗原などに対する応答において引き出される細胞性作用と
Ｔ細胞依存性抗体の両方を含むＴ細胞の活性化と増殖に依存する免疫応答を意味
するものとする。自己免疫疾患の例としては、これに限定されないが、慢性関節
リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化症、真性糖尿病、その他である。
【００３０】 ほとんど全ての骨髄整復方法が本発明の目的のために用いられる。これらには
、特許文献に記載されているもののような、種々の既知方法が含まれる。例えば
、サックスとサイクス、合衆国特許番号５，８７６，７０８並びにＷＯ９７／４
１８６３、ＷＯ９９／３９７２６、ＷＯ９９／３９７２７（後者二つの出願は、
免疫寛容を誘導するための副刺激遮断経路の使用について記載している）のよう
な種々の公開発明で開示されている方法を参照されたい。
【００３１】 ある実施例において、本発明の方法の一部である骨髄整復処置は、提供者幹細
胞の導入に先立って、提供者幹細胞に対する拒絶を予防するのに十分な量で被験
者に免疫抑制治療を処置することを含む。この提供者幹細胞は一般に造血幹細胞
であろう。
【００３２】 この免疫抑制治療は、被験者体内の宿主Ｔリンパ球およびまたはナチュラルキ
ラー細胞の不活化あるいは除去する被験者の処置を含みうる。例えば免疫抑制治
療は、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、ＯＫＴ３（オルソクローンＯＫＴ３モ
ノクローナル抗体、オルソ・ファーマシュティカル・コーポレイション、ラリタ
ン、ニュージャージー）ＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（合衆国特許５
，７３０，９７９と５，９５１，９８３−この全明細書は引用例としてここに組
み入れられている）などのようなＴ細胞除去抗ＣＤ４およびまたはＣＤ８抗体で
の処置を含みうる。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａは組換え技術により産生される抗体で
ある。この後者の抗体はＣＤ２+リンパ球濃度を減少させ、ナチュラルキラー細
胞活性を阻害するのに特に有用である。従って、ナチュラルキラー細胞活性は対
宿主性移植片病において影響を与える非ＭＨＣ制限細胞障害性機構を代表する。
もちろん、このような多くの抗体は、自然発生およびモノクローナル抗体の両方
、同じく組換え技術により産生された完全な合成抗体分子などの多くののこのよ
うな抗体をこの目的のために用いることが出来る。このような抗体あるいはその
抗原結合部分は、必ずそれに限定されないが、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ウ
シを含む多くの異なった種から誘導され、キメラ、ヒト化抗体（同じくこのよう
な抗体の活性フラグメント、誘導体）も含む。
【００３３】 本発明に従って、ここで用いられる「誘導体」という用語は、キメラ抗体また
はヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、あるいはここに開示された方法に
用いるのに効果的ないずれかの抗体（例えばＬＯ−ＣＤ２のような）によって認
識されるのと同一のエピトープ（あるいはその一部分）に結合するその他の抗体
を意味する。
【００３４】 ここで用いられる「フラグメント」という用語は抗体のある一部を意味してお
り、例としては、そのような抗体の部分は、必ずしもこれに限定されないが、Ｃ
ＤＲ、Ｆａｂあるいはその他の部分を含み、それらはここで開示された方法にお
いて有用な他の抗体（例えばＬＯ−ＣＤ２ａなど）によって認識されるそのいず
れかの部分と同一のエピトープあるいはその一部分に結合する。
【００３５】 ここで用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、同じく抗体フラグメント、誘導体、更に組換え技術により調製される抗
体、例えばキメラまたはヒト化抗体、一本鎖抗体あるいは（既に言及したＬＯ−
ＣＤ２ａなどの）本発明を実施するのに有用なポリクローナルおよびモノクロー
ナル抗体によって認識される同一エピトープまたはその部分と結合する二重特異
性抗体を含む。「分子」という用語は例として、またこれに限定されないが、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、あるいは、抗体を模倣するあるいは抗体フラグメ
ントあるいは誘導体として同一エピトープあるいはその一部分と結合する源から
取り出されたその他の化合物含む。
【００３６】 更に、本発明において有用な免疫抑制治療は、致死量以下の全身照射、または
胸腺照射、あるいはその両方の照射による処置を含む免疫応答を抑制するよう考
慮された物理的方法をさらに含むことができる。
【００３７】 他の実施例において、免疫抑制治療は、マクロライド系免疫抑制剤、アザチオ
プリン、ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン）、副刺
激遮断薬（例えば、抗ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質
（ＣＴＬ＝細胞障害性Ｔリンパ球））の一つあるいはそれ以上の化学物質を用い
た処置を含む。このような物質は、研究者あるいは医者の要望、受容者個々人（
処置を受けるヒト患者など）の必要性、感受性、健康状態全般に基づいて単一あ
るいは併用で利用されうる。加えて、その薬が併用で用いられる場合には、それ
らは、関連する特定の処置の要求と受容者の健康状態全般に依存して、お互いに
関連した投薬レベルで、あるいは全体として関連のない投薬レベルで用いられる
であろう。
【００３８】 ある実施例において、骨髄整復処置は提供者幹細胞の導入に先立って細胞整復
剤、例えばシクロホスファミドを被験者に処置することを含む。
【００３９】 望ましくは、調整治療プログラムはＴ細胞不活化抗体、例えばＭＥＤＩ−５０
７（バイオトランスプラント，インコーポレイテッド、チャールズタウン、マサ
チューセッツ）の投与と胸腺照射を含む。
【００４０】 本発明の方法はまた骨髄整復段階を含み、この段階では免疫抑制治療が用いら
れ、マクロイド系免疫抑制剤、アザチオプリン、ステロイド、副刺激遮断薬剤よ
り成るグループから選択される免疫抑制剤での処置を含み、これらは単独あるい
は併用して用いられ、併用時には等量投薬あるいは別個の異なる量の投薬が行わ
れる。
【００４１】 一般的に、ここに開示された骨髄整復法は化学的および物理的方法の両方を含
み、別々にあるいは併用して用いることができ。従って、ここに開示された方法
では、照射が化学物質と併用して用いることができる。例えば、骨髄整復処置は
胸腺照射とＴ細胞不活化抗体の両方による処置を含む。
【００４２】 ステロイドが免疫抑制剤として用いられる場合には、前記のステロイドは望ま
しくはプレドニゾロンとメチルプレドニゾロンより成るグループから選択される
。
【００４３】 本発明の方法での使用に利用できる補刺激遮断薬は、抗ＣＤ４０リガンド抗体
とＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質からなる集団から選択されることが好ましい
。
【００４４】 本発明の方法に用いられる骨髄整復処置はまたシクロヘキシミドのような細胞
整復薬による処置を含む。
【００４５】 本発明において用いられる骨髄整復段階の全体としての目的は、全免疫反応の
一時的抑制を提供し、また外来遺伝子あるいは遺伝子群を運び、かつ特定の産物
または産物群を発現する幹細胞の投与のために移植片受容者または遺伝子治療患
者に準備させることである。
【００４６】 特異的な例として、またこれに限定されない例として、骨髄整復処置がヒト化
ＬＯ−ＣＤ２ａなどの免疫抑制性抗体の投与を伴う場合には、この分子（単独で
あるいは、本開示に示され、（本発明の方法において）効果的な抗体またはフラ
グメントあるいはその誘導体もしくは前記の型の分子を含むその他の免疫抑制剤
と併用して投与される）は本発明に基づいて、Ｔ細胞の活性化と増殖を阻害し、
細胞表面上のＣＤ２発現密度を減少させそれによってＣＤ２+Ｔリンパ球数を削
減させるために、生体内条件下で投与される。
【００４７】 従って、例えば生体内条件下での方法において、その抗体（照射処置を含む、
プラスあるいはマイナスの他薬剤）は免疫応答を予防およびまたは阻害し、それ
によりＴ細胞の活性化と増殖を阻害するために投与される。
【００４８】 抗体またはフラグメントあるいはその誘導体もしくは前記の型の分子は、本発
明に従って細胞表面上のＣＤ２+発現密度を減少させ、それにより提供者細胞の
ＣＤ２+細胞数を削減するために、生体外条件下で投与される。例としてまたこ
れに限定されない例として、生体外条件下での方法において、そのような抗体ま
たはフラグメントあるいはその誘導体もしくは分子は、移植に基づく対宿主性移
植片病の発症を予防するために、移植に先立って提供者骨髄中に注入されるであ
ろう。
【００４９】 このような生体内あるいは生体外技術においては、抗体またはフラグメントあ
るいはその誘導体もしくは分子は薬理許容担体に投与されるであろう。そのよう
な担体の代表的な例としては、前記の標準食塩水溶液、緩衝剤、その他であろう
。このような薬理担体は通常の技術においてはよく知られており、適切な担体の
選択は、ここに記載された教訓から獲得される通常の技術に習熟した人の範囲内
にあるものと見做される。
【００５０】 本発明に用いる抗体あるいはその他の分子は生体内条件下で静脈内に、あるい
は筋肉内投与その他によって投与される。
【００５１】 前記のとおり、本発明の抗体あるいはその他の分子は移植片拒絶を阻害する有
効量で生体内に投与される。この開示の目的に対する「有効量」という用語は、
例えば移植片拒絶の阻害あるいはＴ細胞活性化の阻害といった求められる効果の
提供が可能となる免疫抑制剤の量を意味する。一般的にそのような薬剤が抗体で
ある場合には、後者は最低でも１ｍｇ量が投与される。より低量使用できるかも
しれないということは考慮されるべきである。加えて最初の処置後、続く処理が
もしあるならばそれに対しては前記量は減らすことができる。従って、本発明の
範囲はそのような量によって限定されるものではない。
【００５２】 Ｔ細胞活性を阻害するための本発明の技術は、単独で、あるいは、Ｔ細胞活性
化を阻害するあるいは移植片拒絶あるいは対宿主性移植片病を阻害する他の技術
、薬剤あるいは化合物と併用することができる。
【００５３】 本発明で提供される主な進歩は（骨髄整復に続く）以下のステップの利用であ
り、これにより造血幹細胞などの幹細胞は移植片受容者または遺伝子治療患者に
投与され、またここでこのような細胞は外来遺伝子を含みまたそれを発現し、か
くして前記外部遺伝子は更に移植される生物学的物質として存在し、あるいは遺
伝子治療処方の一部として患者に投与されるようにベクターに存在し、またこの
ような遺伝子の産物は受容者の免疫系により外来のものであると見做される。
【００５４】 本発明の方法で使用される幹細胞が造血幹細胞である場合には、それは望まし
くはＣＤ３４+である（すなわちＣＤ３４抗原をその表面に呈示し、前記抗原は
造血前駆細胞のマーカーである）。このような細胞は従来公知の技術により回収
することができる。
【００５５】 望ましい実施例において、提供者幹細胞は同種異系、自己由来、同系または異
種幹細胞である。望ましい実施例において、提供者幹細胞は骨髄細胞、動員抹梢
血細胞、臍帯血細胞、または多能幹細胞として供給される。提供者幹細胞は、あ
る場合には移植のために生体外で拡張することができる。
【００５６】 もし提供者幹細胞が異系幹細胞、すなわち被験者以外の異なる種からのもので
ある場合には、提供者種は望ましくはブタ、すなわちミニチュアブタである。望
ましくはミニチュアブタＭＨＣで同系交配される（ブタ主要組織適合性複合体（
ＭＨＣ）はブタ白血球抗原（ＳＬＡ）と表示され多重遺伝子座より成る）。
【００５７】 望ましい実施例において、被験者はヒトであり、提供者幹細胞は同じヒトから
のものである。
【００５８】 免疫原に対する受容者の前もっての寛容化は、造血幹細胞または寛容誘導能力
を持つ他の細胞の遺伝子導入を使用して分子をコード化する遺伝子の事前送達に
より獲得されねばならない。
【００５９】 望ましくは、移植片受容者に導入されるべき遺伝子は高度に免疫原性である分
子を発現し、それによりより有効に寛容を誘導する。
【００６０】 同じように、この方法は、提供者幹細胞、望ましくは造血幹細胞により仲介さ
れる対宿主性移植片拒絶を予防するのに十分な量で提供者幹細胞の導入後に、免
疫抑制治療プログラムで被験者を処置する更なるステップを含むことができる。
【００６１】 かくして本発明は更に遺伝子的に異なる体細胞または遺伝子治療ベクターを受
け入れる動物に免疫原寛容を誘導する方法に関し、それは （ａ）前記動物に骨髄整復処置剤を投与し、 （ｂ）前記動物に１個またはそれ以上の外来遺伝子を発現する幹細胞のサンプ
ルを導入し、それにより外来遺伝子を含む前記ベクターの免疫寛容の導入または
寛容を来たし、また （ｃ）前記動物に前記幹細胞により仲介される対宿主性移植片拒絶を予防する
のに十分な量で免疫抑制治療プログラムで処置する ことを含むことを特徴とする。
【００６２】 本発明に従って、ここで利用される体細胞は受容者の細胞とは遺伝子的に異な
り、または事実上遺伝子的に変更されたか、もしくは受容者のそれとは異なる免
疫原構造を発現するために遺伝子的に操作されている。かくしてこのような体細
胞はさもなければ受容者に存在し、しかし異なる生体から誘導されるために遺伝
子的に異なる細胞を置換し、または補充するために単に利用され、あるいは各種
の型の遺伝子置換療法を促進するように慎重に遺伝子変更または修飾される。こ
こでの方法は、更に前記（ｃ）のステップを利用しない手順でこれまでに引用さ
れたように、受容者により外来であると見做される１個またはそれ以上の遺伝子
を発現する遺伝子治療ベクターを受容者が受け入れる場合には有効である。更に
前に引用されたように、本発明の方法は、一般に体細胞または遺伝子治療ベクタ
ーの導入を伴うある型の遺伝子置換療法が続けて行われるであろう。
【００６３】 本発明に従って、幹細胞およびまたは体細胞はいずれも同じ動物から取り出さ
れる。
【００６４】 望ましくは、本方法は体細胞の遺伝子欠損の修飾に指向される。
【００６５】 一つの実施例において、本発明は受容者、例えばヒトなどに第２の個体から獲
得される遺伝子変更細胞または組織に対する免疫寛容を導入することに指向され
る。望ましくは、第２個体または受容者のいずれかよりの造血幹細胞は遺伝子送
達を受けるであろう。より望ましくは、ＣＤ３４+造血幹細胞はこの遺伝子治療
法に利用されるであろう。
【００６６】 本発明のも一つの見地において、本方法はアトピー性疾患および自己免疫疾患
と関連する望ましくない免疫応答を軽減するのに使用される。
【００６７】 本発明の更にも一つの見地において、本発明に記載された方法は、疾病の病因
が与えられた分子の機能が不在または欠除により生じる場合および修復処置が抑
制的免疫応答に帰着する時に、遺伝的疾病の処置に対する遺伝子導入アプローチ
において特に有用である。望ましくは、本方法はいくつかの遺伝的疾病、例えば
嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、血友病Ａまたは血友病Ｂ、家族性高ステロー
ル血症、異常ヘモグロビン症、サラセミア、鎌状赤血球貧血、ゴシェ病、α1−
抗トリプシン欠損、遺伝性気腫、慢性閉芽腫症、ファンコーニ貧血：同じくある
種の免疫欠損、例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損重篤複合免疫不全
（ＳＣＩＤ）を含む他の先天性遺伝的疾患、などを処置する遺伝子導入処置で有
用である。
【００６８】 より特異的な実施例として、本発明の方法は嚢胞性線維症（ＣＦ）などの疾病
の処置にその使用を見出す。嚢胞性線維症は膵臓に影響を与える外分泌腺、呼吸
器系、およびアポクリン腺などの死を招く状態の高い先天性疾患である。ＣＦは
子供の重篤慢性肺疾患の主要な原因となる。ＣＦ患者での欠損遺伝子は嚢胞性線
維症膜貫通導管調節因子（ＣＦＴＲ）で示される無機能性ｃＡＭＰ活性化塩化物
チャンネルをコード化する。ＣＦＴＲ遺伝子の遺伝子送達により疾病を除こうと
努める進行中の臨床試験は限定された成功をもたらしただけであった（オールト
ン他、１９９８年、遺伝子治療、５巻：２９１−２９２ページ）。ＣＦの遺伝子
導入処置において、ＣＦＴＲ遺伝子での遺伝子導入により標的とされた主要な細
胞は気道上皮細胞である。鼻孔上皮での十分な数の気道細胞を標的化することの
難しさの他に、気道は十分に免疫適格性であり、ＣＦＴＲを発現する細胞に対し
て指向される免疫応答は重要であるように考えられる。
【００６９】 ロズメーヘル他（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１９９７年７月６巻（７号）
：１１５３−１１６２ページ）は内因性タンパク質に欠失のあるマウスの欠損を
修復するヒトＣＦＴＲの能力を研究するためにマウスモデルを使用した。このモ
デルでは、内因性ＣＦＴＲ遺伝子の発現は中断され遺伝子標的「ノックイン」事
象によりヒトＣＦＴＲ ｃＤＮＡで置換された。遺伝子置換のためのホモ接合性
動物はＣＦＴＲを完全に欠除するマウスと比べた時に改良された腸内病状または
生存のいずれを示すことにも失敗した。内因性ＣＦＴＲの欠損と関連する腸内病
状の修復での失敗はマウスでのヒトタンパク質の効果のない機能的発現と関連し
ていたことを著者はこれらのデータから結論づけた。
【００７０】 本発明の方法はこの問題をＣＦＴＲ遺伝子の発現の向上を促進することにより
解決する。かくして自己由来ＣＦＴＲノックアウトマウス造血幹細胞はＣＦＴＲ
遺伝子を発現するように設計された遺伝子導入ベクターにより形質転換され、Ｃ
ＦＴＲノックアウトマウスに再導入される。その後マウスＣＦＴＲ遺伝子の遺伝
子導入は、臨床試験で使用されてきた遺伝子導入剤、例えばアデノウイルスベク
ター、アデノ関連性ウイルス、陽イオン脂質などのいずれかのマウス気道上皮へ
の投与により達成される。
【００７１】 も一つの特異的実施例において、本発明は以下でより詳細に説明されるように
シストロフィンへの寛容の導入に関する。
【００７２】 も一つの見地において、本発明は自殺癌療法に適用されるように寛容誘導手順
に関する。このような手順は癌処置に照準を定める遺伝子導入プロトコルで望ま
しいベクターの有効な反復投与を行う能力を含む。このようなプロトコルでは、
ベクターにより運搬される治療遺伝子は、しばしば自殺遺伝子単純ヘルペスウイ
ルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。ＨＳＶ−ＴＫを発現する細胞で
のみ代謝されるヌクレシド類似体であるガンシクロビルでの形質導入細胞の処置
は形質導入細胞の特異的な死をもたらす。望ましくは、この方法はベクターとＨ
ＳＶ−ＴＫ導入遺伝子の両方に対して抗体の成長をもたらさず、これにより処置
の結果に悪影響を与える。
【００７３】 一つの特異的な実施例において、本発明は以下のものより成る動物の癌を処置
する方法に関し、すなわち （ａ）前記動物に骨髄整復処置剤を投与し、その結果外来遺伝子を発現する注
入幹細胞は受け入れられかつ移植され、また （ｂ）前記動物に、前記外来遺伝子を発現するベクターで形質導入される幹細
胞のサンプルを導入し、これにより免疫寛容の導入または外来遺伝子を含む前記
ベクターの受容をもたらし、 （ｃ）前記動物を前記幹細胞により仲介される対宿主性移植片拒絶を予防する
のに十分な量で免疫抑制治療プログラムで選択的に処置し、また （ｄ）前記動物に癌細胞を形質導入するベクターのサンプルを導入し、またこ
こで前記ベクターが前記癌細胞を１個またはそれ以上の細胞傷害剤に敏感にする
遺伝子を含む、 ことより成る動物の癌を処置する方法に関する。
【００７４】 本発明の遺伝子導入ベクターにより発現される免疫原分子はペプチド、ポリペ
プチド、炭水化物、核酸、および脂質であることができる。
【００７５】 本発明に基づく方法は細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換え
ＤＮＡ、および免疫学についての従来の技術を採用し、これらは通常の知識の範
囲内にある。このような技術はすべて文献で説明されている。例えば、免疫学に
おける現在のプロトコル、コリガン他編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ；
分子生物学における現在のプロトコル、オースベル他編、ジョン・ワイリー・ア
ンド・サンズを参照されたい。
【００７６】 前に記載のように、本発明は免疫寛容の状態を遺伝子導入産物に誘導し、それ
により発現およびまたは免疫受容を促進する遺伝子修飾幹細胞の使用に関する。
遺伝子導入産物はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの遺伝子導入ベクター、遺伝子
導入ベクターにより発現される産物、例えばベクター内に含まれる遺伝子により
コード化されるタンパク質またはペプチドあるいはポリペプチドを含む。更に含
まれるものはアンチセンスまたはセンスのいずれかであるＲＮＡ分子である。同
じくまた含まれるものは、遺伝子導入ベクターによりコード化される遺伝子産物
のいずれかの酵素活性の結果である産物である。
【００７７】 本発明の方法は、免疫分子を提示し効果的にＴ細胞寛容を誘導できる細胞の遺
伝子変更を考慮する。望ましくは、これらの細胞は造血系統から誘導される。し
かし本発明に記載されている方法はいずれか特定の細胞型に限定するものではな
い。現在の知識に基づいて、もっとも適切な細胞型は造血幹細胞であるであろう
。
【００７８】 本発明は更に受容者に導入される細胞により発現を意図されるポリヌクレオチ
ド、同じく受容者に試みられる遺伝子療法の特定の形態に必須のポリヌクレオチ
ドを含むベクターに関する。本発明に従って、治療の形態として移植を意図され
るものであるか、もしくは続く移植または治療を意図された体細胞の抗原を発現
するように遺伝子導入で変更された造血幹細胞などの幹細胞のいずれかである宿
主細胞は組換え技術で遺伝子操作される。
【００７９】 宿主細胞（移植または治療を意図された体細胞など、同様に免疫寛容を達成す
るように本発明の方法で使用を意図された造血幹細胞などの幹細胞など）は対象
となる導入遺伝子（その性質と構造は意図される移植または治療の特定の型に依
存する）を含む適切に遺伝子操作されたベクターで遺伝子操作（形質導入または
形質転換あるいは形質移入）され、またそのために一般的には発現ベクターであ
ろう。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ、またはいずれか
他の適切な構造のものであることができ、そのすべては関連する技術に習熟した
人にとっては公知のものである。
【００８０】 ある場合には、ベクターが種瘍内に、またより散漫な白血病の形態に癌などの
特定の最終目標としてベクターが標的化される場合のように、ベクターはそれ自
身遺伝子療法の対象とされ、また前記ベクターに挿入され標的細胞を形質導入す
ることを意図される遺伝子によりいずれかの応答に加えて生成される受容者から
の免疫応答を前記ベクターはそれ自身生成するであろう。このような場合本発明
の方法は、前記ベクターに対し、また同じくそれが運搬する遺伝子導入の発現産
物に対し、何らかの免疫応答を改善することに用途を見出す。
【００８１】 治療を意図する体細胞、およびここで開示される用途を意図される造血幹細胞
などの遺伝子操作宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換細胞を選択し
、または本発明の遺伝子を増幅するように適切に修飾された従来の栄養培地で培
養することができる。ここで開示される方法のために遺伝子導入幹細胞を調製す
るのに利用される温度、ｐＨおよびその他の培養条件は、一般に移植または治療
のために選択される宿主細胞と共にこれまでに使用されたものであり、関連する
通常の技術に習熟した人にとっては明らかであろう。
【００８２】 本発明に従って、使用される幹細胞による発現を意図されたポリヌクレオチド
は、ポリペプチドを発現する各種の発現ベクターのいずれか一つに含まれる。こ
のようなベクターは染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列、例えばＳ
Ｖ４０の誘導体、プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導さ
れるベクター；痘疹、アデノウイルス、鶏頭ウイルス、および仮性狂犬病などの
ウイルスＤＮＡ、同じく宿主で再製可能また生存可能である限りにおいていずれ
か他のベクターを含む。
【００８３】 本発明に基づく幹細胞を遺伝子導入修飾するための適切なＤＮＡ配列は各種の
手順でベクターに挿入される。一般にＤＮＡ配列は関連する通常の技術に習熟し
た人に公知の手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。
【００８４】 発現ベクター内のＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成に向けて適切な発現制限配列、ま
たはエンハンサー配列を含むプロモーター配列に操作可能に連続される。このよ
うなプロモーターの代表的な例としては下記のものがあげられる：レトロウイル
ス長末端反復（ＬＴＲ）またはＳＶ４０プロモーター（真核細胞；とりわけここ
で使用される幹細胞の遺伝子の発現を制御するものとして知られる）。発現ベク
ターは更に翻訳開始のリボソーム結合部位および転写終結因子を含む。
【００８５】 ここで、記載された適切なＤＮＡ配列並びにプロモーターまたは制御配列を含
むベクターは、幹細胞に遺伝子誘導タンパク質を発現させるために、本発明の方
法が適用されるヒト患者などの同じ動物から必ずしも必要ではないが多分誘導さ
れる造血幹細胞などの適切な幹細胞を形質転換することができる。
【００８６】 遺伝子治療への適用のためにどの遺伝子導入システムによって満足されねばな
らない最高の必要性は安全である。安全性は感染性ベクターの産生に利用される
ベクターゲノム構造とパーケージングシステムとの組合せから誘導される。遺伝
子導入を経由する遺伝子療法または薬剤送達は特殊化ベクターの創出を伴い、各
ベクターは特定の疾病にのみ適用可能である。かくして必要な安全特性を絶えず
維持し、しかもベクター設計に最大の柔軟性を可能にするように遺伝子の位置、
または調節配列、または調節配列と対象となる遺伝子との特異的組合せでの微妙
な変化は、ベクター力価、または導入遺伝子が標的細胞内で機能する方法で大き
な差異に導き得る。現在のベクター設計は全ベクターが再構築されるように遺伝
子とプロモーターの各組合わせのそれを必要とし、またそれでもなお異なるベク
ター間の比較はその構築の詳細において矛盾が存在するために困難である。ベク
ター構造におけるこれらの矛盾にケースバイケースでの回答を必要とするベクタ
ーの安全性への疑問に導き得る。重要なことは、ここで開示される遺伝子治療ベ
クターおよび遺伝子治療産物への寛容を誘導する方法は、遺伝子治療の安全性の
増加を来たす。ＯＴＣ欠損の遺伝子治療を受けた患者の死亡がこのような治療用
ベクターまたは遺伝子治療産物に対する激しい免疫応答の結果であったことは十
分に立証されており、本発明の方法により回避される。
【００８７】 造血幹細胞を形質転換または形質導入するのに有用な遺伝子導入構築物はプラ
スミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含み、その中に前進または復帰
配向で発現配列が挿入されている。本実施例の望ましい見地において、この構築
物は更に例えば配列に操作可能に連続されるプロモーターを含む調節配列より成
る。多数の適切なベクターおよびプロモーターは通常の知識を有する人には公知
であり、商業的にも利用可能である。このようなベクターはアデノウイルス、ヘ
ルペスウイルスベクター、および望ましくはレトロウイルスベクターを含むこと
ができる。アデノウイルスゲノムは約３６キロ塩基対の長さの線状二本鎖ＤＮＡ
分子である。アデノウイルスの十分特徴付けられた分子遺伝学は遺伝子導入のた
めの有利なベクターをそれに与えられる。アデノウイルスについての遺伝組織に
ついての知識はウイルスＤＮＡの大型断片の外部配列との置換を可能にする。加
えて、組換えアデノウイルスは構造的に安定しており、広範な増幅後には再調整
されたウイルスが観察されたことはなく、そのためこれらのウイルスは望ましい
遺伝子を真核細胞に導入する運搬ベクターとしてきわめて有用である。最近異な
った細胞型に特異的なアデノウイルスベクターの使用を可能にする方法が開発さ
れた（合衆国特許番号５，７５６，０８６号を参照のこと）。加えてレトロウイ
ルスベクターは更に培養造血幹細胞などの活発に分裂する細胞を形質移入するの
にきわめて有用である。
【００８８】 レトロウイルスベクターはまた真核細胞へのレトロウイルス仲介遺伝子導入を
仲介する作用薬として有用である。このようなベクターは一般にウイルスの構造
分子をコードする多数の配列が欠失し対象となる遺伝子で置換されるように構築
される。本発明の方法で有用なレトロウイルスベクターは、例えば合衆国特許番
号５，６７２，５１０号に含まれる。レトロウイルスベクターはｐＰＢＭ１９の
誘導体であることもある（バナージー他、（１９９７年）異種移植、４巻：１７
４−１８５ページ、卵巣癌ＢＲＣＡ１遺伝子を発現する）。他の例はイェリ，他
、（１９９３年）、移植、６７巻：１１１９−１１２８ページに記載されている
。
【００８９】 しかし他のプラスミドまたはベクターでもそれらが宿主として使用される幹細
胞で複製可能、生存可能であり、また遺伝子治療に適している限りにおいて使用
することができる。
【００９０】 プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクターまたは
他のベクターを選択マーカーと共に使用していずれか望ましい遺伝子から選択す
ることができる。真核プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期
、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬ
ＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクターとプロモータ
ーの選択は関連する通常の知識の水準の範囲内に十分にある。
【００９１】 遺伝子導入構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ
デキストラン仲介形質移入、または電気穿孔法により実行することができる。真
核細胞を使用し、また細胞を形質移入する手段として使用する適切なクローニン
グおよび発現ベクターは、サムブルック他、分子クローニング：実験室マニュア
ル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年）に
記載されており、その開示はここで引用例として組み込まれている。
【００９２】 遺伝子導入ポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写（それは次に本発明の方
法が減少させることを意図する望ましくない免疫反応を生成する種瘍抗原を表す
もの）はエンハンサー配列をベクターに挿入することで増加する。エンハンサー
はＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０乃至３００塩基対でプロモー
ターの転写を増加するようにそれに作用する。その例は複製起点塩基対１０００
乃至２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶ初期プロモーターエンハン
サー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーを含む。
【００９３】 一般に組換え発現ベクターは、例えばネオマイシン耐性遺伝子およびジヒドロ
葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）などの形質転換を可能にする複製起点および選択マー
カー、および下流構造配列の転写に指向する高度に発現された遺伝子から誘導さ
れるプロモーターを含む。望ましくはプロモーター配列は、治療効果が望まれる
適切な細胞系統または組織に導入遺伝子の転写と発現を標的設定するのに十分な
シス作用エレメントを提供しなければならない。異種構造配列は、翻訳開始およ
び終結配列、ならびに望ましくは翻訳されたタンパク質の分泌を細胞質間隙また
は細胞外媒質に向けることのできるリーダー配列を使って適切な相に組み立てら
れる。選択肢として、異種配列は望ましい特性、例えば発現組換え産物の安定化
または単純精製などを付与するＮ末端同定、ペプチドを含む融合タンパク質をコ
ード化することができる。
【００９４】 幹細胞を使用するのに適切な哺乳類発現ベクターは複製起点、適切なプロモー
ターとエンハンサー、およびまたいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライシング提供者および受容者部位、転写終結配列、および
５′フランキング非転写配列より成るであろう。ＳＶ４０スプライシング、およ
びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列は、必要とされる非転写遺伝子
を提供するために使用される。
【００９５】 本発明の方法の利用は決していずれか特定の遺伝子送達システムの使用を限定
するものではない。望ましいシステムは、導入遺伝子を非循環細胞に効果的に送
達し、続いてそのような導入遺伝子の発現、例えばレンチウイルス発現システム
などの発現から生じる長期持続遺伝子発現および生物活性性をもたらすよう導入
するものである。マウスモデルでの寛容研究においては、寛容原性タンパク質の
非常に低い水準の発現がマウスでの効果的な機能的寛容を誘導するのに必要であ
るように見える（フレーザー 他，１９９５年 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８
７−１５９７ページ；シューマッハー他、１９９６年、Ｔｒａｎｓｐｏａｎｔａ
ｔｉｏｎ．，６２巻．８３１−８３６ページ；ザンビディス他、１９９７年、Ｍ
ｏｌ．Ｍｅｄ．，３巻；２１２−２２４ページ）。更に本発明で提示される方法
は、遺伝子導入の結果として発現されるいずれか特定の分子への寛容の導入に限
定されるものではない。
【００９６】 いくつかの遺伝子疾患はこのアプローチに容易に従うものである。本アプロー
チの普遍性は、遺伝子疾患の処置に対する遺伝子導入アプローチで治療分子とし
て考えられる大抵の分子の免疫原性が現在殆ど研究されておらず理解されていな
いという事実に耐えていることである。もっとも特徴的なモデルシステム、例え
ば血友病で、抗体の産生の副作用が周知である（前掲）。かくして、例えば血友
病およびある種の免疫欠損などの血液疾患を処置する遺伝子導入アプローチは、
本発明の方法の利用を通じてより効果をあげるであろう。
【００９７】 本発明に記載された方法は臨床遺伝子導入適用の設計のために重要な意味合い
を持つ。遺伝子導入コード化タンパク質に対して向けられる免疫応答と関連する
重大な問題は本方法により当然効果的に除去されるものである。
【００９８】 遺伝子導入分子は遺伝子導入で導入される遺伝子によりコードされ、およびそ
のような遺伝子の活性から生じる分子を含む。
【００９９】 本発明の方法はこれから以下の限定されない実施例で更に詳細に記載されるで
あろう。しかしこのような実施例はこのような発明および他の特異的な実施例を
単に示すに過ぎず、ここで開示された発明の異なる実施例はそれ自身を関連する
通常の知識を有する人に示唆するであろうということが理解されねばならない。
【０１００】
【実施例】
マーカーＥＧＦＰへの寛容誘導 骨髄分子キメラ現象により免疫寛容の導入は、本発明の開示に記載された遺伝
子治療ベクターまたは治療用導入遺伝子産物に対する免疫応答を有効に排除する
ために利用できる方法である。臨床遺伝子治療プロトコルに適用される場合には
、この方法は遺伝子治療の有効性と安全性を改善するものとなる。従来の遺伝子
治療プロトコルは遺伝子治療産物に免疫寛容または中和性を導入する事前寛容化
を伴わない。ここに記載されるように、遺伝子治療修飾細胞の受容者により外来
であると認識された遺伝子導入産物に向けられる宿主免疫応答は、このような生
態内遺伝子修飾細胞の長期にわたる持続に対し大きな障害となる（マッカーシー
、１９９６年るＬａｎｃｅｔ ３４７巻：２３９−２４２ページ）。もし遺伝子
導入産物の免疫原性が顕著であるならば、治療効果は急速に減少する（ベニフー
ド他、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０巻：４４
０−４４７ページ）。実験データは、レトロウイルスベクターで形質導入された
骨髄細胞の自己移植により、免疫寛容が遺伝子治療産物に対して確立できたこと
を支持するものとして存在する（サイクス他、１９９３年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎ
ｔａｔｉｏｎ．５５巻：１９２−２０２ページ；ホワイト−シャーフ他、１９９
８年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１巻：３３３−３４４ページ；
ジャンヌーカキス他、１９９９年，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６巻：１４９９−１
５１１ページ；ハイム他．２０００年，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１巻：５３３−５
４４ページ）。実施例１の目標は、免疫原性であると知られている遺伝子導入コ
ード化マーカータンパク質、すなわち増強グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）
への寛容の誘導を示す動物モデルの展開を含み、これはＥＧＦＰ形質導入ＥＬ−
４リンパ種細胞の腫瘍拒絶モデルを使用して行われる。重要なことは、実施例１
はタンパク質の免疫原性がその免疫寛容を誘導する能力と直接相関するために、
ＥＧＦＰの免疫原性を利用することである（バッハマン他、１９９７年、Ｊ．Ｉ
ｍｏｕｎｏｌ．１５８巻：５１０６−５１１１ページ）。かくして、後天性免疫
応答が重篤である場合には、遺伝子導入産物に対する寛容誘導の潜在能力は更に
最大にされ寛容誘導の必要性も最大となる。加えて動物モデルとしてマウスを使
用する原理の証明の発展は、実施例２と３で示される遺伝子病と自己免疫疾患の
処置に対する追加マウスモデルの発展を促進する。混合分子キメラ現象および造
血幹細胞の移植を確立することにより、免疫系を再教育し、免疫寛容の現象を利
用する技術を確立する。
【０１０１】 ＥＧＦＰは形質導入の効率を測定するために遺伝子導入プロトコルで一般に使
用されるマーカータンパク質である（プラッシャー他、１９９２年 Ｇｅｎｅ，
１１１巻：２２９−２３３ページ；チャルフィー他、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２６３巻８０２−８０５ページ；ザン他、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｎ．Ｂ
ｉｏｈｐｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ２２７巻：７０７−７１１；ラミロ他、
１９９８年、Ａｎｎｕ．ＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ．，６７巻５０９−５４４ページ
）。ＥＧＦＰに対する強い免疫応答が報告された（ストリペック他、１９９９年
、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６巻：１３０５−１３１２ページ）。従って本発
明に従って、免疫寛容は造血幹細胞を形質導入することによりＥＧＦＰに容易に
導入される。ＥＧＦＰを発現するモノシストロン性レトロウイルスベクターでの
レトロウイルス形質導入はまたモデルシステムとしてマウスを使用することで達
せられる。１９４５年に生成された広く使用されているＥＬ−４Ｔ細胞リンパ腫
細胞系（ゴアラー、１９５０年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，４巻：３７２−３
７９ページ；クラインおよびクライン、１９６４年、Ｊ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．３２：５４７ページ）はＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６，Ｈ２b）マウス
から取り出され、もしＣ５７ＢＬ／６マウス内に注入されると容易に腫瘍に成長
する（ストリペック他、１９９９年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６巻：１３０
５−１３１２ページ）。Ｃ５７ ＢＬ／６動物の対照グループにおいて、ＥＧＦ
Ｐで形質導入されるマウスＥＬ−４Ｔ細胞リンパ腫細胞は後部の脇腹の皮下に投
与される。ＥＧＦＰ免疫原性は腫瘍拒絶で評価される。ＥＧＦＰの免疫原性の故
で、より激しい免疫応答がＥＧＦＰ形質導入ＥＬ−４細胞に対して高められ、そ
の結果腫瘍細胞はより効果的に拒絶される。ＥＧＦＰ発現は予想される種瘍の成
長の欠除する抹梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物での蛍光標示式細胞分取（ＦＡ
ＣＳ）によりモニターされ、文献記載のとおり触診法により容易にモニターされ
る（以下のものおよびストリペック他、１９９９年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
，６巻：１３０５−１３１２ページ参照）。これに付随して、これらのサンプル
は中性抗ＥＧＦＰ抗体の存在を分析される。ＥＧＦＰ+ＥＬ−４細胞の腫瘍拒絶
は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで皮下に移植された時に種瘍内に向けて成長する野生
型、ＥＬ−４細胞と際立った差を示す（前記参照）。実験動物の別のグループで
ＥＧＦＰへの寛容誘導がモニターされる。ＶＳＶ−Ｇ−ＥＧＦＰと両性ＥＧＦＰ
上澄みを使用するＣ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．１）共通遺伝子造血幹細胞の生体外
レトロウイルス形質導入に続き、このような細胞は最適移植のために骨髄切除処
置で馴化されたＣ５７ＢＬ／６５受容マウスに移植される。骨髄切除調整治療プ
ログラムはＥＧＦＰへの寛容導入の原理の証拠を得るためにこの実験で選択され
た。攻撃型骨髄切除処置が遺伝子治療のために患者を準備させる際にこのアプロ
ーチの使用を禁止することは強調されねばならない。しかし原理の証明が達成さ
れる時、非骨髄切除または骨髄還元馴化治療プログラムが本特許出願で実施例３
で示されるように続くマウスのグループで達成される。高用量全身照射（ＷＢＩ
）が低用量ＷＢＩまたは化学薬剤薬剤での処置に置換され、抗Ｔ細胞抗体および
胸腺照射での処置と結合された最小または非骨髄切除調整治療プログラムが展開
された。これらの手順は比較的低い水準での同種異系提供者幹細胞移植を可能に
し、それでもマウス、ブタ、および非ヒト霊長類モデルでの器官または組織移植
片に対する提供者特異的寛容の確立に十分であった（シャラビおよびサックス、
１９８９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９巻：４９３−５０２ページ；ファン他
、２０００年．Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５巻：１７３−１８１ペー
ジ；上川他（１９９７年）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６４巻：７０９
−７１６ページ）。低水準での遺伝子導入発現が数少ない移植遺伝子導入細胞か
ら免疫寛容を誘導するのに十分であることが現在利用できる通常の知識でのデー
タから期待される。かくして遺伝子治療遺伝子導入産物に向かう遺伝子操作寛容
を生成する方法は、従って、ここで適用可能であり、ここで示される遺伝子治療
を基礎とする寛容誘導へのプロトコルが展開される。
【０１０２】 骨髄移植約４週間のＥＧＦＰ形質導入造血幹細胞の移植に続き、マウスは出血
されＥＧＦＰ発現は異なった造血系統で決定された（下記参照）。更に追加の４
週間後（骨髄移植の８週間後）にマウスは再度出血され系統分析が繰返された。
マウスが出血手順から取り戻された時、ＥＧＦＰ形質導入ＥＬ−４細胞の皮下移
植が最初の対照グループに記載されたように行われる。抹梢血単核細胞で容易に
見出可能なＥＧＦＰを発現するマウスにおいて、予期される腫瘍成長、ＥＧＦＰ
発現、および抗ＥＧＦＰ抗体は前記のとおり分析される。いずれか一定の個体マ
ウスにおいて、ＥＧＦＰへの寛容誘導のための正確な時間枠および幹細胞誘導Ｅ
ＧＦＰ発現での最小水準は実験上決定される。ＥＬ−４−ＥＧＦＰ細胞で注入さ
れた動物の対照グループでの期待された結果は、抗ＥＧＦＤ抗体の出現とＥＬ−
４−細胞の破壊および腫瘍成長なしが同時に起こるＥＧＦＰの一過性発現である
。それに反してＥＧＦＰ+ＥＬ−４細胞の皮下（Ｓ．Ｃ．）移植に先立って、Ｅ
ＧＦＰ+造血幹細胞で移植された動物での結論は、持続ＥＧＦＰ発現、抗ＥＧＦ
Ｐ抗体と腫瘍成長のないことである。ＥＧＦＰへの寛容誘導はこれにより動物の
後者のグループで達成される。
【０１０３】 詳細な実験手順 Ｃ５７ＢＬ／６骨髄細胞のレトロウイルス形質導入のための手順 １．レトロウイルスベクターの生成 両方のレトロウイルス（ｐＧＢｉｐ−６とｐＰＢＭ２５−１）がＡＴＣＣ（ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，バージニア ２０１１０−２２
０９，マナサス，ユニバーシティ ブールバード １０８０１）に寄託され、そ
れぞれアクセッション番号ＰＴＡ−２４９８およびＰＴＡ２４９９を受けた。
【０１０４】 構築物ｐＧＢｉＰ（５６８８ヌクレオチド） このレトロウイルス構築物は以下に記載のようにＥＧＦＰ ｃＤＮＡおよび内
部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）より成る挿入片を持ち、モロニーマウ
ス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）長末端反復（ＬＴＲ）の制御下でＥＧＦＰを発
現する。
【０１０５】 構築物ｐＧＢｉＰの位置付け ヌクレオチド１−１０＝Ｘｍｎ Ｉ部位 ヌクレオチド５−１６１７＝プラスミドｐＬＮのヌクレオチド２−１６１４（
アクセッション番号＃Ｍ２８２４５，ミラーおよびロスマン，１９８９年，Ｂｉ
ｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７巻，９８０−９９０ページ）。
【０１０６】 ヌクレオチド１６１７−１６４２−発現されるｃＤＮＡｓを挿入するユニーク
ＢｓｔＸ ＩおよびＭｌｕ Ｉ部位を創り出すｐＬＮのＥｃｏ ＲＩ部位を除去
するアニーリングされたオリゴヌクレオチド。
【０１０７】 ＥＧＦＰの読み取り枠（ＯＲＦ）を含むＭｌｕ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ断片が次に示
すオリゴヌクレオチドでプラスミドｐＥＧＦＰ−１（クロンテック，アクセッシ
ョン ＃ Ｕ５５７６１）のＰＣＲにより作られた： センス−５′ ＴＴＴＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡ
ＡＧＧＧＣ ３′（配列識別番号：１） −Ｍｌｕ ｌ（アンダーライン部）に続くｐＥＧＦＰ−１のヌクレオチド８８
−１１１でアニーリングする塩基 アンチセンス−５′ ＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ
３′（配列識別番号：２） はｐＥＧＦＰ−１でのＮｏｔ Ｉ部位（アンダーライン部）を通じてヌクレオチ
ド８０５にアニーリングする。
【０１０８】 ＢｉＰを含むＮｏｔ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ断片（更にＧＲＰ７８（アクセッション
＃ Ｍ１９６４５ヌクレオチド３７６−５８６）として引用された免疫グロブリ
ン重鎖結合タンパク質の５′未翻訳（５′−ＵＴ）配列がも一つのレトロウイル
スベクターを消化することにより利用可能となり、前記２個の断片はＮｏｔ Ｉ
部位で連結され、Ｓａｌ Ｉ部位は平滑末端Ｃｌａ Ｉ部位でレトロウイルスベ
クターに参加するため平滑末端にされた（Ｓａｌ Ｉ／Ｃｌａ Ｉ結合はヌクレ
オチド２５９６にある）。
【０１０９】 ヌクレオチド２５９６−３１４８−プラスミドｐＭＰＺＥＮのＣｌａ Ｉ−Ｓ
ａｃ Ｉ断片であり、これは特許ＷＯ ９４−２４８７０に記載されている。
【０１１０】 ヌクレオチド３１４８−５６８８−これはｐＬＮの塩基対２９２４−５４６４
に一致する。
【０１１１】 構築物ｐＰＭＢ２５（６０７７ヌクレオチド） このレトロウイルス構築物は以下に示すように内部リボソームエントリー部位
（ＩＲＥＳ）−ＥＧＦＰ挿入片を持ち、またモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ
ｏＭＬＶ）長末端反復（ＬＴＲ）の制御の下でＥＧＦＰを発現する。
【０１１２】 脳心筋炎ウイルス（以下ＥＭＣと略称）の５′−ＵＴ領域からのＩＲＥＳはＸ
ｈｏ Ｉ−Ｎｃｏ Ｉ制限断片としてｐＰＢＭ１９から得られた（バナージー他
、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４巻：１６１−１７３ページ、１
９９７年）。ＮｃｏＩ−Ｎｏｔ Ｉ ＥＧＦＰ断片はプラスミドｐＥＧＦＰ−１
（クロンテック，カリフォルニア，パロアルト）からの制限消化で得られた。Ｅ
ＭＣとＥＧＦＰはＸｈｏ ＩとＮｏｔ Ｉ消化シャトルプラスミドであるｐｃＤ
ＮＡ３（インバイトロゲン，カリフォルニア、サンディエゴ）内で連結され、こ
れからＥＭＣ−ＥＧＦＰ断片がＸｈｏ Ｉと下流Ｅｃｏ ＲＩでの消化により続
いて放出された。
【０１１３】 構築物ｐＰＢＭ２５の特徴の位置付け ヌクレオチド１−１０＝Ｘｍｎ Ｉ部位 ヌクレオチド５−１６１７＝プラスミドｐＬＮのヌクレオチド２−１６１４（
アクセッション＃ Ｍ２８２４５、ミラーおよびロスマン，１９８９年、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．７巻：９８０−９９０ページ） ヌクレオチド１６１７−１６４２−発現されるｃＤＮＡｓを挿入するユニーク
ＢｓｔＸ ＩおよびＭｌｕ Ｉ部位を創り出すｐＬＮのＥｃｏ ＲＩ部位を除去
するアニーリングされたオリゴヌクレオチド。
【０１１４】 ヌクレオチド１６３６−平滑末端および再生Ｍｌｕ Ｉに連続されたＭｌｕＩ
／Ｘｈｏ Ｉの結合部 ヌクレオチド１６４７−２２１８−ＥＭＣ断片 ヌクレオチド２２２１−２９４０−ｐＣＤＮＡ３プラスミドポリリンカー（Ｎ
ｏｔ Ｉ−ＥｃｏＲＩ）からの塩基９７０−９３９ ヌクレオチド２９７１−２９８５−Ｅｃｏ ＲＩ−Ｃｌａ Ｉ−５′−ａａｔ
ｔｃｃａａｇｃｔｔａｔ−３′に結合するリンカー配列 ヌクレオチド２５９６−３５３６−特許ＷＯ９４／２４８７０記載のプラスミ
ドｐＭＰＺＥＮのＣｌａ Ｉ−ＳａｃＩ断片 ヌクレオチド３５３７−６０７７−ｐＬＮの塩基対２９２４−５４６４に対応 ２．レトロウイルス上澄みの調製 ＥＰＡ ２５．１６ 構築物ｐＰＢＭ２５を含む両栄養性レトロウイルス（ＰＡ３１７パッケージン
グ細胞系から誘導されたものでフレッド・ハッチンソン癌センター（ワシントン
，シアトル）からのライセンスによる）が、３２℃で胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）５
％で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で密集ローラーボト
ル（コーニング）から回収された。ウイルス力価は文献記載とおりに決定された
（ライモン他、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ，９０巻：３３１６−３３２１ページ）
。上澄みはＳ+Ｌ-フォーカス形成検定で測定され（ヴァイロメド，インコーポレ
イテッド，ニュージャージー，キャムデン）また文献記載（バナージー他、１９
９７年、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４巻：１６１−１７３ペー
ジ）のとおり複製コンピテントレトロウイルスに対して負であった。
【０１１５】 ＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰ 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープ糖タンパク質Ｇで偽類別
された構築物ｐＧＢｉＰを含むベクターが製造業者の指示に基づき汎親和性レト
ロウイルス発現システム（クロンテック、カリフォルニア、パロアルト）を用い
て調製された。要約すると、パッケージング細胞はＦＢＳ １０％で補充された
ＤＭＥＭで成長した。クロンテックの２９３ＧＰ細胞は構築物ｐＧＢｉＰを含む
上澄みで形質導入された。それはＦＡＣＳでＥＧＦＰ+ １３％から７５％に富
化され拡張された。これらの細胞はｇａｇ、ｐｏｌおよび（Ψ配列を持つ）レト
ロウイルス構築物を含み、続くＶＳＶ−Ｇ−ｅｎｖ構築物での形質移入はＶＳＶ
−Ｇ偽類別ＧＢｉＰ上澄みを産出した。上澄みは全部で５個の実験から調製され
た。純上澄みの力価は平均６×１０6／ｍｌであった。
【０１１６】 ３．提供者マウス−５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）処置と骨髄細胞抽出提
供者マウス：１０匹雌類似遺伝子Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃaＰｅｐ３b／Ｂｃｙ
Ｊ（Ｌｙ５．１）株＃００２０１４−（ジャクソン・ラボラトリー，メーン、バ
ーハーバー）。
【０１１７】 提供者Ｂ６−Ｌｙ５．１マウスは１５０ｍｇ／ｋｇの用量で無菌食塩水（０．
１ｍｌ／１０ｇ重量）に溶解された５−ＦＵを１−７日に腹腔内（ｉ．ｐ．）注
射された。マウスは０日に安楽死され骨髄細胞（ＢＭＣｓ）は無菌１Ｘハンクス
食塩緩衝液（１Ｘ ＨＢＳＳ）内で大腿骨、頸骨および上腕骨を無菌乳鉢と乳棒
で粉砕して収穫された。ＢＭＣｓは無菌金属濾過器で濾過して骨と組織断片から
分離された。細胞集塊は細胞を２２ゲージ針を通過させて分散された。細胞は計
数され下記のとおり培養された。
【０１１８】 ４．形質導入手段 マウス骨髄（ＭＢＭ）培地とサイトカインカクテル マウス骨髄培地は以下のものである：イスコーブ修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤ
Ｍ，カタログ＃５１４７１−７８Ｐ；ＪＲＨバイオサイエンシズ，カンサス，レ
ネクサ）がＦＢＳ，１５％（ハイクローン，ユタ，ローガン，カタログ＃ＳＨ３
００７１．０３）ベータ−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、ゲンタマイシ
ン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）および１００ｎｇ／ｍｌの組換えマウス幹細胞因子（
ｒｍＳＣＦ）、またそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトトロンボポエチン（ｒ
ｈＴＰＯ）、インターロイキン６（ｒｈｌＬ−６）、ｒｍＦｌｔ３リガンドで補
充される。すべての組換えサイトカインはＲ＆Ｄシステムズ（ミネソタ、ミネア
ポリス）から得られた。
【０１１９】 提供者マウス骨髄形質導入 提供者Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃaＰｅｐ３b／ＢｏｙＪ）（
Ｂ６−Ｌｙ５．１）雌マウスから前記のとおり調製された骨髄細胞（ＢＭＣ）は
ＥＧＦＰ ｃＤＮＡを運ぶＥＰＡ２５．１６またはＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰいずれ
かのモノシストロン性レトロウイルスベクターを用いてレトロネクチン（Ｒ）被
覆平板で形質導入された（下記参照）。
【０１２０】 レトロネクチン（Ｒ）被覆、レトロウイルス前被覆およびサイトカイシン前刺 激 レトロネクチン（Ｒ）（タカラ酒造株式会社）株溶液が０．２２μｍＭＩＬＬ
ＥＸ−ＧＶフィルター（ミリポア）を経由して無菌濾過されたｄＨ2Ｏで１ｍｇ
／ｍｌで調製された。皿の被覆のために、１Ｘ ＰＢＳで株の１：２０希釈液が
作られた。ファルコンポリスチレン６−ウエル（＃１１４６）または−１２ウエ
ル（＃１１４３）マルチウエル皿のウエルが希釈レトロネクチン（Ｒ）溶液でそ
れぞれ２ｍｌ／ウエルまたは１．５ｍｌ／ウエルで２時間室温で被覆された。被
覆が完了した後、レトロネクチン（Ｒ）溶液は吸引され、ＰＢＳの２％ＢＳＡフ
ラクションＶ（カタログ＃Ａ−９４１８、試験細胞培養、シグマ・ケミカル・カ
ンパニー、ミズーリ、セントルイス）の遮断液で置換された。３０分保温の後、
遮断液は吸引され細胞は２．５％（容積／容積）１Ｍヘペス／ハンクス平衡塩類
溶液（ジブコＢＲＬ、ニューヨーク、グランドアイランド）で洗浄された。ＥＰ
Ａ２５．１６での形質導入のために、ウエルは次いで４ｍｌ／ウエルでウイルス
上澄み（収穫３および−１、力価＝２×１０6／ｍｌ）で１時間３７℃で前装荷
された。ＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰでの形質導入のために、１２ウエル平板でのウエ
ルが２ｍｌウイルス上澄み（力価６×１０6／ｍｌ）を１時間３７℃で前装荷さ
れた。擬態形質導入のために、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭが使用された。
ＢＭＣｓはサイトカイン補充ＭＢＭ培地でファルコンポリスチレン６ウエルマル
チウエル平板（＃１１４６）のウエル当たり４．１×１０6細胞／ｍｌの濃度で
４８時間前刺激された。
【０１２１】 マウス骨髄（ＭＢＭ）細胞の形質導入 前刺激の後、細胞は６ウエル平板から収穫され、遠心分離され前記の上澄み同
量に再懸濁され、ＭＢＭ培地からサイトカインを含むよう調節された。擬態およ
びＥＰＡ２５．１６で形質導入中の細胞の最終濃度は３×１０6細胞／ｍｌであ
った。またＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰでの形質導入の場合、濃度は４×１０6細胞／
ｍｌであった。培地プラスいずれかの浮遊細胞は遠心分離され細胞ペレットは上
澄みとサイトカインの新鮮アリコートで４８時間の追加ヒットで再懸濁された。
【０１２２】 形質導入後に、細胞は被覆ウエルから軽くかき落して収穫され、１度 １Ｘ
ＨＢＳＳで洗浄され次いで５×１０6細胞／ｍｌの濃度で１Ｘ ＨＢＳＳに再懸
濁された。これらの形質導入細胞は致死照射受容マウスに注入された。
【０１２３】 ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析 少量の細胞がＥＧＦＰ発現の割合を決定するためにフローサイトメトリー分析
用に保存された。獲得と分析はセル・クエストソフトウエアを用いたベクトン・
ディキンソン・ファクスキャンでおこなわれた。ヨウ素化プロピジウム（０．５
−１μｇ／管）が分析で非生存細胞を除去するために加えられた。
【０１２４】 ５．マウス骨髄移植のための手順 形質導入に続き、細胞は尾部静脈を経由して拘束されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌受
容マウスに注入（移植）された。受容者動物は尾部静脈注射で０．２ｍｌの注入
を受けた。提供者と受容者の両マウスは少ない組織適合性抗原に対する性関連免
疫応答を避けるために雌にされた。
【０１２５】 受容者Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．２）雌マウス（ジャクソン・ラボラトリー，
メーン、バーハーバー）は移植の４時間前に抑制剤または麻酔の必要なしで１３
７−セシウムガンマ照射器で骨髄切除全身照射（１．１３Ｇｙ／分での１０Ｇｙ
）で４時間、前処置された。月間隔で１００−２００μＬの血液サンプルが、フ
ローサイトメトリーを用いて異なった造血誘導細胞系統でのＥＧＦＰ発現の分析
のために、イソフルレン吸入麻酔の下に後眼窩洞から取られる（下記参照）。
【０１２６】 ６．移植後フローサイトメトリーのモニター フローサイトメトリー（ＦＣＭ）抗体……すべての抗体は特に記載のない限り
ＢＤファーミンゲン（カリフォルニア，サンディエゴ）から得たものである。抗
体染色は９６ウエル平板で行われ、サンプルは２０−３０μｌ全マウス血である
。ＦＣブロック（抗ＣＤ１６／３２，クローン２４Ｇ２）がハウスに準備された
。サンプル室温で５−１０分２μｇ／ウエルでブロックされた。サンプルは下記
の抗体で染色された。
【０１２７】 ａ）提供者／宿主分析−ＰＥ抗マウスＣＤ４５．１ イソタイプＰＥマウス
ＩｇＧ２ａ．ストレプアビジン−ペルＣＰ（ＰＣＰ）イソタイプ対照ビオチンマ
ウスＩｇＧ２ａで明示されたビオチン抗マウスＣＤ４５．２。
【０１２８】 ｂ）リンパ球Ｔ細胞：ＰＣＰ抗マウスＣＤ３ｅ，イソタイプＰＣＰハムスター
ＩｇＧ． パンＢ細胞：ＰＥ抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０． イソタイプＰ
Ｅ−ラットＩｇＧ２ａ。
【０１２９】 ｃ）骨髄−ＰＥ抗マウスＣＤ１１ｂ，イソタイプＰＥラットＩｇＧ２ｂ。
【０１３０】 染色と洗浄の後、全血はＰｈａｒｍＬｙｓｅTMで１０分４℃で溶解された。獲
得と分析はセル・クエストソフトウエアを用いてベクトン・ディキンソン・ファ
クスキャンで行われた。
【０１３１】 実験は１０匹（またはグループ４の場合は１２匹）の受容者マウスの４グルー
プで構成された。各グループの動物は（１）照射または骨髄細胞（ＢＭＣｓ）な
し（２）１０ＧｙのＴＢＩ次いで擬態形質導入ＢＭＣｓ，（３）１０ＧｙのＴＢ
Ｉ次いで両栄養性ＥＰＡ２５．１６ベクター、および（４）１０Ｇｙ ＴＢＩ次
いで偽類別ＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰベクターを用いて形質導入されたＢＭＣｓ、で
与えられたもののいずれかであった。異なったグループは５匹ずつの２組のサブ
グループに分けられ、これによりその１組はＥＬ−４細胞で移植され（下記８．
ＥＬ−４白血病移植のための手順参照）、他は形質導入造血幹細胞からの長期Ｅ
ＧＦＰ発現（９ヶ月まで）をモニターされた。この実験アプローチで使用される
動物グループは下記（表１）で記載される。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】 結果 大規模マウス骨髄形質導入 形質導入細胞は従来の文献記載のとおり、０日にフローサイトメトリーで分析
され、また０日にＣＦＵ分析のために平板培養された。高力価ＶＳＶ−Ｇ−ＧＢ
ｉｐ上澄みは形質導入効率を著しく改善した。そこでは対応して高い割合のＥＧ
ＦＰ+コロニー形成細胞が存在した。予期されたように、ＧＢｉＰ形質導入細胞
の蛍光強度はＥＰＡ２５．１６形質導入細胞でのものよりも高かった。上澄みは
擬態（培地のみ）に比べて細胞拡張とＣＦＵ形成能力に対して小さい負の作用し
かなかった。結果は表２で示される。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】 ＥＧＦＰ発現の水準と細胞系統評価 骨髄移植４週後、１００μｌ末梢血が採取され、Ｔ細胞（ＣＤ３）と骨髄細胞
（ＣＤ１１ｂ）およびｐａｎＢ細胞マーカーＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０などのマーカ
ーの抗体を使用してＥＧＦＰ発現と細胞系統を分析した。グループ１からの１匹
の未処置マウスが対照として使用された。提供者（Ｌｙ５．１）細胞での注入後
に、すべての動物は生存し健康であった。提供者対受容者（それぞれＣＤ４５．
１とＣＤ４５．２）に対する２色染色で、提供者細胞割合と受容者＋／ＥＧＦＰ+ 割合とが決定された（表３）。ＥＧＦＰ発現はＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰ形質導入
ＢＭ細胞で移植されたグループ４マウスで容易に検出できた。グループ３マウス
での平均水準は１４倍低く、しかしすべてのマウスは擬態形質導入グループと比
べて正の染色を有していた。グループ３マウス（マウス２３を除く）での染色の
低水準は、ＥＧＦＰ+細胞の系統をＦＣＭで正確に評価する能力を制限した。移
植マウスでの系統プロファイルは対照動物に類似していた（表４）。ＥＧＦＰ発
現は分析されるすべての主要系統で検出された グループ４マウスでは、ＥＧＦＰ発現の類似の割合がＢ（４２％）と骨髄系統（
５０％）で観察された。ＥＰＡグループから分析される単一マウス（＃２３）で
は、ＥＧＦＰ発現は骨髄細胞（５９％）に向けて非対称であった。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
【０１３８】 かくしてＥＧＦＰ形質導入細胞の成功裏の移植が得られた。容易に検出できる
ＥＧＦＰ発現が、骨髄移植４週後の関連するすべての系統で観察された。追加の
系統評価の後、これらのマウスは以下に示されるようにＥＬ−４リンパ腫細胞お
よびＥＧＦＰ形質導入ＥＬ−４細胞で攻撃された。
【０１３９】 ７．ＥＧＦＰ形質導入ＥＬ−４細胞の生成 腫瘍モデルとしてここで使用されたＥＬ−４細胞系（ＡＴＣＣ＃ＴＥ−Ｂ３９
）はもとは９，１０−ジメチル−１，２−ベンズアントラセンによりＣ５７ＢＬ
マウスに導入されたリンパ腫から確立された（ゴアラー、１９５０年、Ｂｒ．Ｊ
．Ｃａｎｃｅｒ．４巻：３７２−３７９ページ；クラインおよびクライン，１９
６４年，Ｊ．Ｎａｔｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，３２巻：５４７ページ）。
同系遺伝子型ＥＬ−４腫瘍細胞のＣ５７ＢＬ／６への皮下移植に続き、マウス腫
瘍が成長する。しかしその投与の前に免疫原ＥＧＦＰ遺伝子導入産物を発現する
レトロウイルスベクターで細胞が形質導入されると、有効な免疫応答が起こりＥ
Ｌ−４−ＥＧＦＰ細胞は動物から拒絶され腫瘍は成長しない。本研究においては
、ＥＬ−４細胞はＶＳＶ−Ｇ−ＧＢｉＰで、また選択肢としてＥＧＦＰを発現す
るＥＰＡ２５．１６で表示される両栄養性ウイルスで形質導入された（（ポリブ
レン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で４時間３７℃で１０6細胞の導入）。単一細胞
クローンがＭｏＦｌｏソーティングで４日目に生成された。全体で７５クローン
が自己蛍光の背景で１０−５００倍の範囲のＥＧＦＰ発現でクローン選択の後で
拡張された。すべてのクローンの成長率は区別できなかった。すべてのクローン
はＥＧＦＰの安定した水準の発現を示した。（ＦＡＣＳで決定されたように）Ｅ
ＧＦＰを高いまた低い水準で発現するＥＬ−４クローンは更に選択され、Ｃ５７
ＢＬ／６マウスへの皮下移植のために使用された。
【０１４０】 ８．ＥＬ−４白血病移植のための手順 骨髄細胞移植３ヶ月後に、動物はイソフルラン吸入を用いて麻酔され、５０μ
ｌ量で５×１０4野生型ＥＬ−４腫瘍細胞または５×１０4ＥＧＦＰ形質導入ＥＬ-4 腫瘍細胞のいずれかを脇腹後部の皮下に注射された。腫瘍成長は触診で、続い
てカリパスを用いて測定された。動物は腫瘍が平均径１５ｍｍを越えた時に安楽
死される。種瘍の評価と測定は種瘍生物学と腫瘍免疫学で確立された方法に基づ
いて行われた。
【０１４１】 ＥＧＦＰ寛容誘導を評価するためのＣ５７ＢＬ／６ＥＧＦＰ−遺伝子導入皮膚
移植片の移植。
【０１４２】 ＥＧＦＰに対する免疫寛容は更にＣ５７ＢＬ／６−ＥＧＦＰ遺伝子導入皮膚移
植片により評価される。グループ１乃至４のそれぞれからのマウスはこの皮膚移
植手順を受ける。グループ１と２からのマウスではＢ６−ＥＧＦＰ皮膚移植片は
拒絶され、一方グループ３と４のマウスでは、ＥＧＦＰに対する寛容が導入され
るためＢ６−ＥＧＦＰ皮膚移植片は受容される。更にグループ１と２のマウスで
のＢ６−ＥＧＦＰ皮膚移植片の拒絶はこれらのマウスが達成した骨髄切除調整処
置が一般的な免疫不全を起こさなかったという対照として役立つ。Ｃ５７ＢＬ／
６−ＥＧＦＰ（Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１０ｓｂ）（岡部
他、１９９７年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、４０７巻：３１３−３１９ページ）
はジャクソン・ラボラトリー（メーン，バーハーバー）から購入される。これら
マウスでのＥＧＦＰ発現はニワトリ・ベータアクチンプロモーターおよびサイト
メガロウイルスエンハンサーの制御下にある。
【０１４３】 ９．造血前駆細胞形質導入によるマウスモデルでのジストロフィンへの寛容誘
導および筋ジストロフィーの修正 アメリカ合衆国においては、デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の高い
発生数がある。その病状は典型的に致死性で劣性形質として遺伝し、ジストロフ
ィン遺伝子の欠損により生じる。ジストロフィンは骨格筋および心筋で発現され
る細胞骨格タンパク質である。ＤＭＤを処置する最近の試みはアデノウイルスベ
クターおよびアデノ関連性ウイルスベクターを使用したものである（ハーティガ
ン−オコンナーおびチェンバレン、２０００年、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅ
ｃｈ．４８巻：２２３−２３８ページ）。ＤＭＤ修正の可能性は更に長年にわた
りジストロフィン欠損ｍｄｘマウスモデルでの異なったアプローチを用いて調査
されてきた。これらのマウスはジストロフィン発現を欠くＣ５７ＢＬ／１０（Ｂ
１０）マウスからのものであることのみが異なる（ホフマン他、１９８７年、Ｃ
ｅｌｌ．５１巻：９１９−９２８ページ）。動物モデルでのジストロフィン欠損
を修正する試みは遺伝子導入修正（コックス他、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ，３
６４巻：７２５−７２９ページ）、骨格筋のアデノウイルス遺伝子治療（ラゴッ
ト他、１９９４年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｓｕｐｐｌ．１巻：Ｓ５３−５４ペー
ジ）、野生型Ｃ５７ＢＬ／１０（Ｂ１０）筋芽細胞の移植（大塚他、１９９８年
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０巻：４６３５−４６４０ページ）、およびヌード
／ｍｄｘマウスにジストロフィンを発現するレトロウイルス生産者細胞の移植（
ファサティ他、１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００巻：６２０−
６２８ページ）を含んでいた。臨床での遺伝子治療処置の適用はジストロフィン
に対する強いＣＴＬ応答の発展とその結果ジストロフィン正筋原線維の破壊の故
で成功しなかった（大塚他、１９８８年、Ｊ．Ｆｍｍｕｎｏｌ．１６０巻：４６
３５−４６４０ページ）。かくしてジストロフィンの強い免疫原性はこれまでの
方法を使用する欠損を効果的に修正する能力の欠除を来たす。本発明の開示で提
案された遺伝子治療方法は当然この問題を効果的に軽減する。造血前駆幹細胞の
レトロウイルス形質導入によりジストロフィンに誘導される免疫寛容は、ジスト
ロフィン欠損を処置する治療効果を著しく高める。提案された方法の実現可能性
は病気に冒された筋にジストロフィン発現を部分的に修復することで立証され、
これは続く幹細胞移植で達成された（グッソーニ他、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ
．４０１巻：３９０−３９４ページ）。この部分的修復は造血細胞の筋原性能力
、および正常マウスからの野生型骨髄の移植がジストロフィンへの寛容の導入を
可能にしたことに起因する。ジストロフィン発現は長く継続し抗ジストロフィン
免疫応答の証拠は存在しなかった（グッソーニ他、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ．
４０１巻：３９０−３９４ページ）。
【０１４４】 本発明の開示に記載された方法では、最適移植のための最小または非骨髄切除
処置で調整されたｍｄｘ受容者マウスへのジストロフィン形質導入細胞の造血前
駆幹細胞移植が行われる。マウスジストロフィンのヌクレオチド配列は公知のド
メインで利用可能であり、またｃＤＮＡを分離し遺伝子導入ベクターを生成する
方法、およびジストロフィン発現を検出する方法は通常の知識を有する人に利用
可能である。ＶＳＶ−Ｇ偽類別レトロウイルスベクターを用いる形質導入により
マウス造血細胞でのＥＧＦＰ発現（前記実施例１）の効果的な標的設定に基づき
、ジストロフィンｃＤＮＡはＶＳＶ−Ｇを基礎するレトロウイルスベクターに挿
入される。多重造血系統での長期ジストロフィンｍＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＲま
たはノーザンブロッティングにより確認される。続いてジストロフィンを発現す
る野生型筋芽細胞またはｍｄｘ筋芽細胞がｍｄｘマウスに筋肉内注射される。ジ
ストロフィンに対し前寛容化されたこれらの動物では、治療用筋芽細胞は当然拒
絶されず臨床的効果も認識される。これらのマウスでの筋ジストロフィンの発病
度の記録と臨床組織病理学的進行状況は文献記載のとおり行われる（大塚他、１
９９８年．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０巻：４６３５−４６４０ページ）。
【０１４５】 １０．造血前駆細胞形質導入による多発性硬化に対するマウスモデルでのミエ
リン塩基性タンパク質への寛容誘導 本発明の開示の更なる適用は主な自己抗原が同定されている自己免疫疾患の処
置である。例えば多発性硬化（ＭＳ）においては、ミエリン塩基性タンパク質（
ＭＢＰ）が主要な自己抗原の一つであると考えられ、疾病で生じるＭＢＰを発現
するグリア細胞に対して自己免疫応答を仲介する。マウス実験自己免疫脳脊髄炎
（ＥＡＥ）が原発性中枢神経系の脱髄を起こす炎症性自己免疫疾患のモデルとし
て使用され、またしばしばヒトＭＳの動物モデルとして使用されてきた（ザンビ
ルおよびスタインマン、１９９０年，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８巻
：５７９−６２１ページ）。ＥＡＩはＭＢＰでの免疫化によりＳＪＬ／Ｊマウス
モデル菌株に誘導することができる（ヴェカール、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２６５巻：１２３７−１２４０ページ）。しかしＭＳ患者を処置するためにミ
エリンの経口投与を使用する臨床試験は、経口投与による不均整で非能率な寛容
化の故でプラシーボと比べて疾病の再発に著しい差異は示さなかった（ヴァイナ
ー他、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻：１３２１−１３２４ページ）。
かくしてＭＢＰへの寛容の誘導はこの実施例で提案されるように、ＭＢＰ形質導
入造血ＳＪＬ／Ｊ細胞のＥＡＥマウスへの骨髄移植により、より効果的に達成す
ることができる。このプロトコルは追加の体細胞型の標的設定を伴わず、造血系
統での長期の発現の結果として達成される。
【０１４６】 本発明の開示に記載された方法では、最適移植のために最小または非骨髄切除
処置で馴化されたＳＪＬ受容体マウスへのＭＢＰ形質導入細胞の造血前駆幹細胞
移植が行われる。マウスＭＢＰのヌクレオチド配列は公知のドメインで利用可能
であり、またｃＤＮＡを分離し遺伝子導入ベクターを生成する方法およびＭＢＰ
発現を検出する方法は通常の技術を有する人にとって利用できる。ＶＳＶ−Ｇ偽
類別レトロウイルスベクター（前記）を用いる形質導入によりマウス造血細胞で
のＥＧＦＰ発現の効果的な標的設定に基づいて、ＭＢＰ ｃＤＮＡはＶＳＶ−Ｇ
を基礎にするトレトロウイルスベクターに挿入される。多重造血系統での長期Ｍ
ＢＰ ｍＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングで確認される
。ＭＢＰに寛容化されたこれらの動物では、治療効果は前記のとおりＳＪＬマウ
スでのＥＡＥの軽減である（ザンビルおよびスタイマン、１９９０年、Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８巻：５７９−６２１ページ）。これらマウスでのＥ
ＡＥの発病度および臨床組織病理学的進行の記録は文献記載のとおり実行される
（ザンビルおよびスタインマン、１９９０年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．８巻：５７９−６２１ページ）。
【０１４７】 １１．霊長類造血前駆細胞形質導入とＥＧＦＰへの寛容誘導 Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＥＧＦＰへの寛容誘導のための詳細に記載された方法
は霊長類モデル（ヒヒ、アカゲザル、およびシノモルグスサル）に適用される。
ＥＧＦＰの免疫原性はアカゲザルモデルで文献とされている（アレキサンダー他
、１９９８年，ＡＩＤＳ．Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，１５巻：１
１−２１ページ；ジョンソン，Ｒ．Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ（１巻（５号）：Ｓ
７，２０１８ページ（２０００年））。
【０１４８】 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）に対する特異的寛容はアカ
ゲサル造血細胞にｎｅｏの導入により提示された（ハイム他、２０００年、Ｍｏ
ｌ．Ｔｈｅｒ．１巻：５３３−５４４ページ）。霊長類造血細胞は１０μｇ／ｋ
ｇの濃度で５日間毎日皮下（ｓ．ｃ．）に投与された組換えヒト顆粒球コロニー
刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）の投与により動員され、次いで文献記載のとおり６
日での血液量の２．５倍の白血球２回連続交換（ドナヒュー他、１９９６年、Ｂ
ｌｏｏｄ、１６４４−１６５３ページ）か、または選択肢として実施例３に記載
のとおり骨髄吸引を行うかのいずれかが行われる。ＣＤ３４+細胞の富化は通常
の知識による手順を用いて実施例３に記載のとおり行われる。提供者幹細胞は同
種異系、同系、異種または自己由来のものであってもよい。遺伝子治療産物への
寛容誘導のための望ましい実施例では、提供者前駆幹細胞は自己由来のものであ
る。
【０１４９】 前駆細胞富化の度合は通常の知識に基づく文献に記載されたコロニー形成単位
前駆細胞検定により決定される。富化ＣＤ３４+細胞はＶＳＶ−Ｇで形質導入さ
れるか（前記参照）、あるいはＥＧＦＰを発現する手長ザル白血病ウイルス（Ｇ
ａＬＶ）エンベロープを持つレトロウイルスである。ＧａＬＶレトロウイルスは
文献に記載のとおりＦＢｄｅｌＰＧＳＡＦから発現されるＧａｌＶエンベロープ
を運ぶＴＥ ＦＬＹパッケージング細胞が産生された。（コセット他、１９９５
年．Ｊ．Ｖｉｏｌ．６９巻：７４３０−７４３６ページ）。レトロウイルス形質
導入および造血幹細胞の注入は実施例３で詳細に説明されている。選択肢として
、ヘルペスウイルス、アデノ関連性ウイルスまたは裸のＤＮＡ送達を含む遺伝子
送達方法は更に前駆体幹細胞集団に標的決定するために使用される。
【０１５０】 ＥＧＦＰ形質導入霊長類ＣＤ３４+前駆体細胞は、前記のとおり骨髄切除、骨
髄整復または非骨髄調整治療プログラムのいずれかを受けた受容者に注入される
。ＥＧＰＦの成功裡の遺伝子標識は１週または１ヶ月ベースで採られた血液サン
プルのフローサイトメトリー（ＦＣＭ）で決定される。ＥＧＦＰの長期の発現と
ＥＧＦＰ形質導入細胞の生体内持続が多重造血系統のＦＣＭとＰＣＲで確認され
た時点で、動物はＥＧＦＰを発現するように遺伝子修飾された自己由来体細胞の
注射で攻撃される。望ましい体細胞型は容易に受容者の免疫系により攻撃され、
かつ免疫優先体細胞ではないものである。実験動物および対照動物は別途記載の
ない限りマウス実験である（前記参照）。ＥＧＦＰ形質導入ＣＤ３４+前駆体幹
細胞のＢＭＴを誘導する寛容を受ける動物は何らかの免疫副作用または他の副作
用なしでＥＧＦＰを発現するいずれかの細胞型を受ける。これとは逆に、造血細
胞以外の体細胞で一次的また独占的に攻撃される動物はこのような細胞を大幅に
拒絶するようである。このような体細胞の移植後には、抗ＥＧＦＰ ＣＴＬ応答
および抗ＥＧＦＰ抗体応答は従来の技術で確立された免疫学的方法により検出さ
れるであろう。
【０１５１】 実施例２ 自殺遺伝子治療の効率を改善するためのＨＳＶ−ＴＫへの寛容誘導 ベクターの効果的な反復投与を行う能力は悪性疾患を処置することを目的とす
る遺伝子導入プロトコルで望ましいものである。とりわけ異なった腫瘍および対
宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）のための自殺遺伝子導入は動物モデルおよび臨床試
験の両方で有望な抗癌作用を示した（シンガルおよびカイザー、１９９８年、Ｓ
ｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎａｍ．，７巻：５０５−５３６ページ；タイ
バーギーン（１９９８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇ．，
５巻：４７８−４８２ページ）。この実施例では、ベクターで運ばれる治療用遺
伝子は自殺遺伝子単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）で
ある。ＨＳＶ−ＴＫを発現する細胞により代謝されるだけであるヌクレオチド類
似体であるガンシクロビルでの形質導入細胞の処置は形質導入腫瘍細胞の特異的
死をもたらす。ベクターおよびＨＳＶ−ＴＫ遺伝子導入産物両方への抗体の成長
が報告され、処置の結果に副作用をもたらす。更に前もって存在する抗ＨＳＶ−
１抗体は処置の結果に影響を与える（ハーリンガー他、１９９８年，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ．，５巻：８０９−８１９ページ）。
【０１５２】 マウスの対照グループにおいては、移植可能腫瘍細胞，ＨＳＶ−ＴＫを発現す
るレトロウイルスベクターで形質導入されたのぞましくはプレＢ白血病またはＴ
細胞リンパ腫、およびマーカーとしての大腸菌ｌａｃｚ遺伝子は腹腔内（ｉ．ｐ
．）に注射された。続いてガンシクロビルが投与され、形質導入腫瘍細胞の撲滅
が従来のベータガラクトシダーゼ検定で測定された。抗ＨＳＶ−１抗体の成長、
または前もっての存在は形質導入細胞を除去するガンシクロビルの効率を阻害す
るように見える。従って、動物の第２グループで、腹腔内注射に先立ってＢＭ細
胞の形質導入がＨＳＶ−ＴＫへの寛容を確立するために行われ、これによりガン
シクロビル投与による細胞を発現するＨＳＶ−ＴＫのより効果的な除去を産生す
る。
【０１５３】 実施例３ 抗癌遺伝子治療でのＢＲＣＡ１への寛容誘導 腫瘍抑制遺伝子の遺伝子治療仲介過発現が抗癌治療で限定された成功をあげて
使用された（ロスおよびクリスチアーノ（１９９７年，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ．Ｉｎｓｔ．巻：２１−３９ページ）。抗癌遺伝子治療アプローチは中和抗
体の成長により非常に複雑なものとなっている。本発明で記載されたプロトコル
を適用することにより達成される寛容誘導により、免疫応答により生じた合併症
は除かれた。ヒトＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子を発現するレトロウイルスベクター
の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を使用する上皮卵巣癌を持つフェーズＩＩ臨床試験は
終結したが、それは抗ＢＲＣＡ１中和抗体の成長があり、治療に対する臨床応答
が存在しなかったためであった（テート他（１９９０年），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ
ｅｒ．Ｒｅｓ．５巻：１７０８−１７１４ページ）。このフェーズＩＩ臨床試験
を受けた患者は拡張性の少ない疾病をもとに選ばれた。このような患者はこの遺
伝子アプローチに対する最適標的集団を形成する。腫瘍減少が一部成功した重篤
拡張転移性癌を持つ患者を使用する前のフェーズＩ試験では、最小の抗ＢＲＣＡ
１抗体応答のみが観察された（テート他（１９９７年）．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅ
ｒ．Ｒｅｓ．３巻：１９５９−１９６８ページ）。フェーズＩとフェーズＩＩ試
験の間の成功率の差は多分フェーズＩＩ患者でのより高い免疫能によるものであ
る。これは抗ＢＲＣＡ１抗体の成長、高い血清アルブミン水準および高いＷＢＣ
計数を含むいくつかの規準により示された（テート他（１９９７年）．Ｃｌｉｎ
．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５巻：１７０８−１７１４ページ）。高い免疫能はこ
の実施例で以下に記載されているように、腫瘍抑制ＢＲＣＡ１に対し寛容誘導に
より適した重症でない癌を持つ患者にさせる。
【０１５４】 プロトコルは以下のものである。造血幹細胞はＢＲＣＡ１を発現するレトロウ
イルスベクターで形質導入される。レトロウイルスベクターは卵巣癌ＢＲＣＡ１
遺伝子を発現するｐＰＢＭ１９の誘導体であり得る（バナージー他、（１９９７
年）Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４巻：１７４−１８５ページ）
。造血幹細胞の形質導入および注入の手順はイエリーノ他（１９９９年）Ｔｒａ
ｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６７巻：１１１９−１１２８ページに記載されてい
る。続いて実験的に決定された数週間後しかし１６週間以内に、ベクターの腹腔
内注射が文献記載のとおりに実行される（テート他（１９９９年）．Ｃｌｉｎ．
Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５巻：１７０８−１７１４ページ）。
【０１５５】 ドナヒュー他（１９９８年），ＡＳＨミーティング、要約番号２８４１；キー
ム他（１９９８年）Ｂｌｏｏｄ，９２巻：１８７８−１８８６ページに記載され
た修飾は本プロトコルにとり込むことができる。
【０１５６】 注入のための形質導入造血幹細胞の全数を増加するために、４回までの連続Ｂ
Ｍ吸引液が収穫され調整治療プログラムの前に個別に形質導入される。選択肢と
して、例えば動員された末梢幹細胞、臍帯血細胞などの他の源からの造血幹細胞
を使用することもできる。（腸骨稜から収穫された）もとのＢＭ吸引液は調整処
置に先行する数週間に形質導入され、注入まで冷凍保存される。（切開で上腕骨
または腸骨稜からの）最終ＢＭ収穫物は収集され、照射の前に調整治療プログラ
ムの週に形質導入される。
【０１５７】 幹細胞への形質導入効率を改善するために、ＣＤ３４+細胞は分離され形質導
入される。骨髄切除調整治療プログラムで調整された患者は形質導入ＣＤ３４+
ＢＭ細胞のみで移植される。骨髄切除治療プログラムで調整された患者は更に移
植を確かなものにし、ＢＭ発育不全の潜在リスクを減少するためにＣＤ３４+と
ＣＤ３４-形質導入ＢＭ細胞を受ける。各ＢＭ吸引液に対して、ＣＤ３４+および
ＣＤ３４-細胞は免疫吸着カラムを使用して正および負の選択でＢＭの低密度フ
ィコール勾配分画から富化される。ＣＤ３４分離は磁気ビード（ミルテニル、カ
リフォルニア，オーバーン）上で商業的に利用可能な抗ＣＤ３４抗体を用いて行
われる。ＣＤ３４分離物の純度と回収率はＦＡＣＳ分析ならびにＣＦＵ計数から
評価される。ＣＤ３４+またはＣＤ３４-細胞の形質導入前および導入中の培養条
件は、３００ｎｇ／ｍｌ組換えヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）（Ｒ＆Ｄシステムズ
、ミネソタ、ミネアポリス）、３００ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ−３リガンド（ｈＦ
ｌｔ−３Ｌ，Ｒ＆Ｄシステムズ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトトロンボポエチン（ｈ
ＴＰＯ，Ｒ＆Ｄシステムズ）および１００ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン−６
（ｈＩＬ−６，Ｒ＆Ｄシステムズ）で補充したステムスパン培地（ステム・セル
・テクノロジーズ，ワシントン，シアトル）での最初の前刺激により行われる。
３日目に細胞はレトロネクチン（Ｒ）被覆皿（パンヴェラ・コーポレーション，
ウイスコンシン，マジソン）に移される。培養ＢＭ細胞はポリブレン（Ｒ）（６
μｇ／ｍｌ、シグマ、ミズーリ、セントルイス）および前記の成長因子の存在下
で両栄養性組換えウイルスを含む上澄みを用いて４日間にわたり３回（各８時間
の）ウイルス露出を受ける。各ウイルス露出の開始時に、レトロウイルスを含む
上澄みはＢＭ細胞と共に８００ｘｇで１時間室温で遠心分離される。コロニー形
成単位（ＣＦＵ）検定がＥＧＦＰ正のグリーンコロニーの頻度を決定することで
試験管内形質導入の効率を評価するために形質導入ＢＭ細胞すべてに対して行わ
れる。正のコロニーは更にＲＴ−ＰＣＲにより評価される。
【０１５８】 自己由来骨髄移植と患者調整治療プログラム（０日＝最初のＢＭ注入日） 患者は好中球減少期間中の予防抗生物質処置として毎日静脈内（ｉ．ｖ．）５
０ｍｇのオフロキサシン（Ｒ．Ｗ．ジョンソン・ファーマシューティカル・リサ
ーチ・インスティチュート，ニュージャージー，ラリタン）を受け、また照射誘
導好中球減少期間を短くするために５μｇ／ｋｇ／日の用量で０日乃至１４日の
間組換えヒト顆粒球マイクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ノバ
ルティス）を受ける。ＢＭＴの受容者を準備するために使用された２種の調整治
療プログラムは以下のとおりである。（ａ）非骨髄切除治療プログラムとしては
、患者はコバルト６０源から３日に３Ｇｙの全身照射と１日に７Ｇｙの胸腺照射
を受ける。抗胸腺細胞グロブリン（ファルマシア・アプジョン，ミシガン、カラ
マズー）が静脈内５０ｍｇ／ｋｇで−３、−２、および−１日に投与される。シ
クロスポリンＡ（ＣｓＡ，ノバルティス、スイス、バーゼル）は平均血漿溝水準
＞２００ｎｇ／ｍｌを維持するために静脈（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．
）注射で１５−２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で０日から開始され２８日まで続けら
れた。形質導入自己由来ＢＭ細胞（冷凍保存およびまたは新鮮形質導入ＣＤ３４+ のみのもの）が単一用量として０日に注入される（注入細胞の全数は１−５０
×１０6の範囲にある）。（ｂ）骨髄切除治療プログラムとしては、患者は−２
および−１日に４．５Ｇｙの全身照射を受ける。ＣｓＡは非骨髄治療プログラム
と同じように投与される。組換えヒト巨核球成長および分化因子（アムゲン、カ
リフォルニア、サウザンドオークス）が血小板輸血要求を減少させるために０日
乃至９日に２．５μｍ／ｋｇ／日の用量で皮下に与えられる。形質導入自己由来
ＢＭ細胞は０日、１日、２日に注入される（注入細胞の全数は１−６００×１０6 の範囲にある）。０日と１日に注入された形質導入細胞は冷凍保存されており
、２日に注入された細胞は新鮮に調製されたＢＭ細胞である。
【０１５９】 ＢＲＣＡ１遺伝子を発現する体細胞注入の準備治療プログラム 幹細胞移植後１６週までの時点で、ベクターの注入液投与（前記のとおり）な
らびに分析のための腹腔液の毎日のサンプルを回収するために、患者は手術移植
用腹腔カテーテルを受ける。卵巣癌患者は４週を隔てて１日４回３サイクルでベ
クターの腹腔内注射を受ける。患者の腹腔水と血漿はＰＣＲ、ウエスタンブロッ
トおよび化学ならびに造血試験により広い範囲で分析される。レトロウイルス上
澄みの用量は１日４回１００ｍｌである（１０9−１０10ウイルス粒子）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 解析された全マウスの異なる系統におけるＥＧＦＰ発現の割合を
示した棒グラフ
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ ４Ｃ０８７ Ｎ Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 3/00 3/06 3/06 7/00 7/00 7/04 7/04 11/00 11/00 21/04 21/04 35/00 35/00 37/02 37/02 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 HA17 4B065 AA91X AA92X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 MA02 MA05 NA14 ZA512 ZA532 ZA592 ZA942 ZB072 ZC212 ZC332 ZC751 4C085 AA13 AA14 CC01 CC03 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 CB07 DA10 MA02 MA04 NA14 ZB07 4C087 AA01 AA02 BB44 BB59 BB65 CA12 MA01 MA05 NA13 ZA51 ZA53 ZA59 ZA94 ZB26 ZC21 ZC33

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療用ポリペプチドをコード化するベクター、または前記ベ
    クターの一つを含む組換え細胞、あるいは前記治療用ポリペプチドをコード化す
    るポリヌクレオチドの一つを受け入れる動物を前処置する一つの方法であって、
    前記ベクターまたは前記ポリヌクレオチドより成るグループから選択される部材
    で形質導入される造血幹細胞で前記動物を処置することを含むことを特徴とする
    方法。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の方法であって、ここで前記前処置が骨髄整復
    処置に先行することを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 請求項２記載の方法であって、ここで骨髄整復処置が前記形
    質導入造血幹細胞の拒絶を予防するのに十分な量で免疫抑制治療プログラムで患
    者を処置することを含むことを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】 請求項３記載の方法であって、ここで前記免疫抑制治療プロ
    グラムが患者の宿主Ｔリンパ球およびまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を不
    活性化およびまたは減少させる処置を含むことを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の方法であって、ここで免疫抑制治療プログラ
    ムがＴ細胞減少抗ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、またはその両方での処置を含むこと
    を特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 請求項５記載の方法であって、ここで前記抗体が抗胸腺細胞
    グロブリン（ＡＴＧ）、ＯＫＴ３モノクローナル抗体、ＭＥＤＩ−５０７モノク
    ローナル抗体、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体より成るグループから選択されること
    を特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 請求項３記載の方法であって、ここで免疫抑制治療プログラ
    ムが胸腺照射、致死量以下全身照射、および胸腺照射と致死量以下照射の両方よ
    り成るグループから選択されることを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】 請求項３記載の方法であって、ここで免疫抑制治療プログラ
    ムがマクロライド免疫抑制剤、アザチオプリン、ステロイド、副刺激遮断薬、お
    よび等量または異なった相対用量での前記のものの組合せより成るグループから
    選択される免疫抑制剤での処置を含むことを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の方法であって、ここで前記ステロイドがプレ
    ドニゾロンおよびメチルプレドニゾロンより成るグループから選択されることを
    特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】 請求項８記載の方法であって、ここで前記副刺激遮断薬が
    抗ＣＤ４０リガンド抗体とＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質より成るグループか
    ら選択されることを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 請求項３記載の方法であって、ここで骨髄整復処置が細胞
    整復薬での処置であることを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１記載の方法であって、ここで細胞整復薬がシク
    ロホスファミドであることを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】 請求項３記載の方法であって、ここで骨髄整復処置が胸腺
    照射とＴ細胞不活性化抗体両方での処置を含むことを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１３記載の方法であって、ここでＴ細胞不活性化抗
    体がヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体であることを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載の方法であって、ここで造血幹細胞がＣＤ３
    ４+であることを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１記載の方法であって、ここで造血幹細胞が同種異
    系幹細胞、自己由来幹細胞、同系幹細胞および異種幹細胞より成るグループから
    選択されることを特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６記載の方法であって、ここで異種幹細胞がブタ
    幹細胞であることを特徴とする方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７記載の方法であって、ここでブタ幹細胞がブタ
    主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）で同系交配されたミニチャーブタからの
    幹細胞であることを特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１記載の方法であって、ここで造血幹細胞が骨髄細
    胞、動員抹梢血細胞、臍帯血細胞、および多能幹細胞より成るグループから選択
    されることを特徴とする方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１記載の方法であって、ここで動物がヒトであるこ
    とを特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１９記載の方法であって、ここで造血幹細胞が同じ
    ヒトから取り出されることを特徴とする方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１記載の方法であって、ここで前記前処置が更に前
    記幹細胞で仲介される対宿主性移植片拒絶を予防するのに十分な量での免疫抑制
    治療プログラムで前記動物を処置することを含むことを特徴とする方法。
  23. 【請求項２３】 請求項３記載の方法であって、更に前記幹細胞で仲介され
    る対宿主性移植片拒絶を予防するのに十分な量で請求項２記載のものとは別の免
    疫抑制治療プログラムで前記動物を処置することを含むことを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１または２３記載の方法であって、ここで前記造血
    幹細胞および体細胞が同じ動物から取り出されることを特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１または２３記載の方法であって、ここで前記治療
    遺伝子産物が遺伝子欠損病を軽減するように作用することを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５記載の方法であって、ここで遺伝子欠損が嚢胞
    性線維症、筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血
    症、異常ヘモグロビン症、サラセミア、鎖状赤血球貧血、ゴシェ病、α1−抗ト
    リプシン欠損、遺伝性気腫、慢性肉芽腫症、ファンコーニ貧血、および免疫欠損
    症より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１または２３記載の方法であって、ここで前記治療
    遺伝子産物が有害な免疫応答を減少するように作用することを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２７記載の方法であって、ここで前記有害な免疫応
    答が自己免疫疾患またはアトピー性疾患であることを特徴とする方法。
  29. 【請求項２９】 請求項１または２３記載の方法であって、ここで前記治療
    遺伝子が癌に悩むまたは癌の危険にある患者の癌を軽減しまたは予防することを
    特徴とする方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２３記載の方法であって、更に癌細胞を形質導入す
    るベクターのサンプルを前記動物に導入することを含み、ここで前記ベクターが
    、その遺伝子産物が１個またはそれ以上の細胞傷害剤に対して前記癌細胞を敏感
    にする遺伝子を含むことを特徴とする方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０記載の方法であって、ここで癌敏感性遺伝子が
    単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子であることを特
    徴とする方法。
  32. 【請求項３２】 請求項３１記載の方法であって、ここで細胞傷害剤がガン
    シクロビルであることを特徴とする方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３２記載の方法であって、ここでベクターがアデノ
    ウイルスおよびレトロウイルスより成るグループから選択されることを特徴とす
    る方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016530895A (ja) * 2013-09-23 2016-10-06 ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイションＷｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 動物細胞を遺伝子改変する改良された方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003245752A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-19 Bio Transplant, Inc. Process for promoting graft acceptance by depletion of hematopoietic stem cells
AU2002952834A0 (en) * 2002-09-16 2002-12-05 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of treating an autoimmune disease
SG10201504917PA (en) 2005-07-11 2015-07-30 Macrogenics Inc Methods For The Treatment Of Autoimmune Disorders Using Immunosuppressive Monoclonal Antibodies With Reduced Toxicity
BRPI0713426A2 (pt) 2006-06-14 2012-10-09 Macrogenics Inc métodos de tratar, diminuir a progressão, ou melhorar um ou mais sintomas de um distúrbio, e de prevenir ou retardar o inìcio de um distúrbio
CA2704312A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Deltacell B.V. Means and methods for eliciting an immune response

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876708A (en) * 1992-02-19 1999-03-02 The General Hospital Corporation Allogeneic and xenogeneic transplantation
US5679340A (en) * 1994-03-31 1997-10-21 Diacrin, Inc. Cells with multiple altered epitopes on a surface antigen for use in transplantation
US5928638A (en) * 1996-06-17 1999-07-27 Systemix, Inc. Methods for gene transfer

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016530895A (ja) * 2013-09-23 2016-10-06 ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイションＷｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 動物細胞を遺伝子改変する改良された方法

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