JPH11514879A

JPH11514879A - 原始ヒト幹細胞を有するＭｐ１リガンドの使用法

Info

Publication number: JPH11514879A
Application number: JP9517062A
Authority: JP
Inventors: マーレー，レスリー・ジェイ; ヤング，ジュディ・シー
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト; システミックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-10-29
Publication date: 1999-12-21
Also published as: US7416887B2; EP0858503A1; AU7495396A; CA2236263C; CA2236263A1; WO1997016535A2; US20060024275A1; US20030082805A1; US6916470B2; AU717783B2; US6060052A; WO1997016535A3; US6326205B1

Abstract

(57)【要約】トロンボポイエチンのような骨髄増殖性白血病受容体(ｍｐｌ)リガンドが、自己再生特性の特徴を有し、全造血細胞系統を発生させることができる、ヒト幹細胞の亜集団において作用する。トロンボポイエチンは巨核細胞分化およびＣＤ３４⁺およびＣＤ３４⁺亜集団(CD34⁺Lin^-、CD34⁺Thy-1⁺Lin^-およびCD34⁺Lin^-Rh123^lo)の原始前駆細胞拡張の両方を支持する。トロンボポイエチンはまた静止ヒト細胞を刺激し、サイクルさせる。従って、ｍｐｌリガンドは造血能力の回復のための原始幹細胞の拡張および遺伝子治療適用における修飾ヒト幹細胞の提供に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】原始ヒト幹細胞を有するＭｐｌリガンドの使用法発明の分野本発明は、骨髄増殖性レセプター(ｍｐｌ)、特に最小分化の原始ヒト幹細胞亜集団を拡張させるためのｍｐｌリガンドの使用に関する。発明の背景トロンボポイエチン(ＴＰＯ)は、ｍｐｌの近年単離されたリガンドであり、当初はマウス骨髄増殖性白血病(ＭＰＬ)ウイルスにより誘導されるプロトオンコジーンと同定された。ＴＰＯはインビボおよびインビトロで巨核球(ＭＫ)前駆細胞分裂およびＭＫ成熟を独立して刺激することが示されている。血小板減少症齧歯類へのＴＰＯのインビボ投与は、血小板の数を明白に刺激し、骨髄の成熟ＭＫの数および倍数関係を増加させることが判明した。マウスにおけるｃ−ｍｐｌ(ＴＰＯレセプター)遺伝子の欠失は、血小板減少症をもたらすと報告されている。更に近年、ＭＫがＴＰＯに暴露した後の培養において機能的血小板の製造の引き金を引くことができることが証明されている。造血性幹細胞は、骨髄性赤血球(赤血球細胞、顆粒球、単核球)、巨核球(血小板)およびリンパ球(Ｔ−細胞、Ｂ−細胞およびナチュラル・キラー細胞)系統のいずれかに分化する、胎児骨髄、臍の緒の血液、成人骨髄および末梢血で同定されている少ない細胞である。加えて、これらの細胞は寿命が長く、更なる幹細胞を製造でき、この過程を自己再生と呼ぶ。幹細胞は最初に半固体媒体でコロニーを形成する能力により測定できる、系統制限前駆細胞への拘束が約束されている。前駆細胞は、多系統分化できる能力により制限され、自己再生能力を失っている。前駆細胞は、やがては血液の機能的成分のいずれかに分化し、成熟する。この成熟工程は、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、トロンボポイエチン(ＴＰＯ)、スチール・ファクター(Stl)、Ｆｋｌ−２リガンドおよびインターロイキン(ＩＬ)１−１５を含む調節因子の複合ネットワークにより調整されると考えられている。近年、インビトロアッセイが、自己再生および多系統分化能力を有するヒト造血幹細胞の同定のために開発されている。一つのアッセイは、新たに単離された間質性細胞または確立された間質性細胞を基にした、敷石領域形成細胞(ＣＡＦＣ)アッセイである。マウス系において、新鮮骨髄由来間質細胞またはクローン化間質細胞系における遅延出現敷石領域が、インビボ造血再集団形成能力と相関することが示されている。マウス間質細胞系ＳｙＳ１を使用したＣＡＦＣと長期培養開始細胞(LTCIC)頻度の相関が証明されている。加えて、インビボ重症複合免疫不全症(ＳＣＩＤ)−ｈｕ骨検定が、幹細胞集団候補の長期間移植の測定に使用されている。インビトロＣＡＦＣアッセイおよびＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデルは、多能性造血幹細胞(ＰＨＳＣ)候補からのＢ−細胞および骨髄細胞発生の分析を可能にする。幹細胞の別の亜集団は、移植後の移植片(engraftment)の異なる相を担い得る。１９６４年という昔に、２次脾臓コロニー形成単位(ＣＦＵ−Ｓ)を産生するマウスＣＦＵ−Ｓの能力の差異が定義されていた。現在、証拠は、殆どのＣＦＵ− Ｓが致死量を照射された宿主における再集団形成に関与しないことを示しているが、移植の可能性のある異質性が、放射線防御細胞の亜集団内でさえ存在することを示す。これは、連続骨髄移植で証明されている。組織片の長期再集団形成能力は、一連の移植で失われるが、短期再構築に寄与する細胞集団は生存している。存在する両方の短期および長期再構成幹細胞集団が、造血細胞の同位酵素分析およびレトロウイルス遺伝子マーキングが幹細胞の運命を追跡するのに用いられている実験に由来しているという考えにより更に支持される。致死量照射マウスにおける同位酵素変異体での供給体再構成の相関および変異の数学的分析は、多くの多系統クローンが再構築直後活性であるが、急速に減少し、移植後１２週間で大半が不活性になることを示す。これらの観察は、供給マウス骨髄において多系統短期移植の可能性のある、細胞の集団が存在することを示す。同様の観察が大型動物移植モデルでも成され、同位酵素差異が短期移植のための多重クローンの構築、続く相対的に少ない幹細胞クローンによる持続性構築を示す。これらの発見は、レトロウイルスマーク幹細胞の移植後のクローン発育の雄弁な分析により確認されている。異なる増殖能力の細胞のサブセットはまた物理的特性も異なり得、従って単離し得、機能的に同定し得る。致死量照射に続く再構築を担う骨髄細胞は、細胞サイズおよび密度分画を利用した遠心法、または蛍光生色素の取り込みを基にした蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)、レクチン結合、または細胞表面抗原提示を使用して単離できる。ＦＡＣＳは、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞、骨髄単核細胞および赤血球の移植欠失系統マーカーを担うマウス細胞を単離し、系統陰性(Ｌｉｎ^-)と呼ばれる。マウス骨髄のＬｉｎ^-フラクションは、更にＴｈｙ−１の低いレベルおよびＳｃａ−１抗原の発現を基にして細分割できる。Thy-1.l^loLin^-Sca-1⁺であるマウス細胞は、放射能防御能力に１０００倍富んでおり、同系C57BL/thy-1. 1マウスの骨髄で見られる放射能防御細胞の全てを含む。Thy-1.1^loLin^-Sca-1⁺である１００個程少ない細胞で、長期供給体由来再構築での致死量照射受容体の殆ど９５％で放射能防御できた。この細胞量で、Thy-1.1^loLin^-Sca-1⁺細胞が供給体末梢血白血球細胞を移植後１０日までに、血小板を移植後１４日以内に発生させ、この集団が短期および長期移植の可能性の両方を有する細胞を含むことを示す。 Thy-1.1^loLin^-Sca-1⁺細胞は、更に細胞サイクルの状態の差異および蛍光色素であるローダミン１２３の取り込みの差異により分割できる。ローダミン１２３は、活性ミトコンドリアを同定する色素であり、その細胞からの流出は、多剤耐性遺伝子生産物であるＰ−糖タンパク質により操作される。ローダミン１２３を少量残すこれらの細胞は、ローダミン鈍感(または低下)と呼ばれ、骨髄再集団形成能力(ＭＲＡ)を有することが示されている。この細胞は、ＣＤ３４抗原を提示する細胞(ＣＤ３４⁺)のサブセットに帰する骨髄移植を受けたヒトにおいて造血系再構築を担う。細胞のこの画分は、更に系統特異的マーカーの欠失(Ｌｉｎ^-)およびＴｈｙ抗原の発現(Ｔｈｙ−１⁺)を含む多くの抗原特性を基にして分割できる。成熟骨髄およびCD34⁺Thy-1⁺Lin^-である移動性末梢血細胞を使用したインビボアッセイは、この集団が全造血系統を構築できる細胞を含むことを示す。 Mpl発現は、ＭＫ系統中のヒト造血細胞の、および原始CD34⁺CD38^lo/-細胞のポリメーラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により検出されている。しかしながら、ＭＫ系統に拘束する前の原始細胞におけるＴＰＯの作用については殆ど知られていない。一つの報告は、表現型Sca-1⁺AA4⁺の原始マウスＨＳＣがｍｐｌを発現し、インビトロでのこれらの細胞のＴＰＯへの暴露は、ＭＫ分化をもたらすことを示す。本発明の要約本発明により、ヒト幹細胞が、原始非巨核球芽細胞の拡張および、巨核細胞( ＭＫ)系統およびＭＫ成熟に拘束するＭＫ前駆細胞の拡張により、骨髄増殖性白血球レセプター(ｍｐｌ)に結合し、活性化するリガンドに反応することを、驚くべきことに発見した。従って、ｍｐｌリガンドはインビトロおよびインビボ幹細胞活性化および拡張に有用である。ｍｐｌを発現し、ｍｐｌリガンドであるトロンボポイエチン(ＴＰＯ)に反応すると記載されているおよび本明細書に記載の原始ヒト幹細胞のサブセットは、骨髄移植を受けたヒトにおける造血系再生の能力を有する。本発明で有用な幹細胞は、実質的自己再生をする能力ならびに造血系統の全ての細胞への増殖および分化により特徴づけられる。これらの細胞は、ＣＤ３４抗原(ＣＤ３４⁺)のような細胞表面マーカーにより同定し得る。より好ましくは、本発明で有用な幹細胞は、実質的自己再生をする能力ならびに造血系統の全ての細胞への増殖および分化の能力に富んでいる。細胞のより豊富な亜集団は、系統特異的マーカーの欠失( Ｌｉｎ^-)および／またはＴｈｙ−１抗原の発現(Ｔｈｙ−１⁺)、例えば、CD34⁺Li n^-またはCD34⁺Thy-1⁺Lin^-により同定し得る。これらの細胞は長期および短期再集団形成の可能性に非常に富む。あるいは、所望の特性を有する細胞に富む亜集団を、CD34⁺Lin^-Rho^loまたはCD34⁺Thy-1⁺Lin^-Rho^loにより同定し得る。本発明で有用な幹細胞の亜集団は、その光分散特性、例えばＦＡＣＳ分析による低側面分散および低から中度前面分散特性および／または例えば、成熟リンパ細胞と成熟顆粒球の間のサイズを有する表現型によりまた同定し得る。本発明は、長期再集団形成ヒト幹細胞の、このような細胞をｍｐｌリガンド中で培養することによる生存を促進する方法を特徴とする。本発明のｍｐｌリガンドは、ｍｐｌ−介在生物学的活性が開始するように、ｍｐｌに結合する能力により特徴づけられる。好ましい態様において、ｍｐｌリガンドはＴＰＯ、より好ましくはヒトＴＰＯであり、更により好ましくは組み換えヒトＴＰＯである。ｍｐｌリガンド(例えば、ＴＰＯ)存在下で培養する幹細胞は、実質的自己再生をする能力および造血系統の全ての細胞への増殖および分化により特徴づけられ、即ち、多能性造血幹細胞である。本発明は、付随する分化の最小の拘束誘導で、幹細胞の集団を拡張するためのヒト幹細胞の原始亜集団におけるｍｐｌの使用を特徴とする。拡張細胞集団は、実質的自己再生ならびに造血系統の全ての細胞への増殖および分化ができる細胞を製造する能力により特徴づけられる。本発明は、ヒト患者の造血能力を回復させる治療的方法を特徴とする。幹細胞を患者から採取した細胞から精製し、ｍｐｌリガンドへのインビトロ暴露により拡張させ、患者に戻し、患者の造血能力の回復をもたらす。ｍｐｌリガンドトロンボポイエチン存在下での拡張に加えて、幹細胞のインビトロ拡張を、例えば、インターロイキン３(ＩＬ−３)、白血病阻害因子(ＬＩＦ)およびスチール・ファクター(Stl)(c-kitリガンド(ＫＬ)または幹細胞ファクター(ＳＣＦ)としてもまた既知)、インターロイキン６(ＩＬ−６)、胎児肝臓チロシンキナーゼ２／３(Fl k2/3)、マクロファージ阻害タンパク質−１α(MIP-1α)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、ＩＬ−１およびＩＬ−１１を含む更なるサイトカインの存在下で行うことができる。本発明は、静止幹細胞の活性化法を特徴とし、このような細胞をｍｐｌリガンドにさらすことにより、分化無しに分割させる。本発明のこの態様は、遺伝子治療に使用するレトロウイルスベクターによる造血細胞の改善された形質導入を可能にする。従って、この関連する態様において、静止幹細胞をｍｐｌリガンド存在下で活性化し、興味の対称の遺伝子を含むレトロウイルスベクターと共に培養する。能動的に分割した細胞は興味の対象の遺伝子を統合し、異種遺伝子生産物を発現する。このような形質転換幹細胞は、遺伝子治療適用に有効である。本発明の遺伝子治療態様において、造血細胞を患者から採取し、インビトロでｍｐｌリガンドおよび遺伝子運搬試薬、例えばレトロウイルスベクター存在下形質導入し、修飾細胞を患者に戻す。修飾幹細胞およびそれらの子孫は、所望の遺伝子生産物をインビボで発現し、従って持続性の有利な治療を提供する。最小分化および幹細胞活性化を伴う幹細胞拡張の利点に加えて、本発明の他の利点および特性は、この明細書を読んだ当業者には明らかである。図面の簡単な説明図１Ａは、培養CD34⁺Lin^-およびCD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞のCD41b⁺細胞集団拡張におけるＴＰＯの効果を示すグラフである。図１Ｂは、培養CD34⁺Lin^-およびCD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞の全細胞数におけるＴＰＯの効果を示すグラフである。詳細な説明本発明およびそれに使用する方法を記載する前に、本発明が特定の細胞系、ｍｐｌリガンドまたは記載の方法論に限定されないことは理解される。本発明で使用する用語は、具体的な態様を記載する目的のみであり、本発明の範囲が添付の請求の範囲のみにより制限されるため、限定する意図はないこともまた理解される。本明細書および請求の範囲で使用する限り、単数形は、その内容が明らかに異なっていない限り、複数形も含む。従って、例えば、“幹細胞”なる記載は１個のまたは多数の細胞(混合物を含む)を含み、“ｍｐｌリガンド”なる記載は、ｍｐｌ−介在生理活性を誘発するのに十分な特異性でｍｐｌに結合できる１個または多数の化合物を含む。特記しない限り、本明細書で記載する全技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは相当する方法および物質が、本発明の実施および試験で使用できるが、好ましい方法および物質をここで記載する。本明細書に記載する全ての刊行物は、引用したものが関連する特定の物質および方法を記載および記述する目的で、本明細書に包含させる。定義 “ｍｐｌリガンド”なる用語は、１個またはそれ以上のｍｐｌ−介在生理学的活性が開始されるように、ｍｐｌに結合できる化合物を意味する。本明細書に記載する限り、ｍｐｌ−介在生理活性は、(１)細胞が自己再生の能力および全造血細胞系統の発生の能力を維持するような、培養における幹細胞の生存の促進、( ２)拡張細胞集団が自己再生の能力および全造血細胞系統の発生の能力を維持するような、幹細胞集団の拡張、および(３)幹細胞が活性化し、分割して得られる細胞が自己再生の能力および全造血細胞系統を発生させる能力を維持するような、静止細胞の活性化を含む。本発明のｍｐｌリガンドは、少なくとも一つのｍｐｌ−媒介活性、好ましくは２個またはそれ以上のｍｐｌ−介在活性を開始する。好ましくは、ｍｐｌリガンドはトロンボポイエチン、より好ましくはヒトトロンボポイエチンおよび更に好ましくは組み換えヒトトロンボポイエチンである。“ ｍｐｌリガンド”なる用語はまた、１個またはそれ以上の上記のｍｐｌ−介在生理活性が開始されるように、ｍｐｌに結合できるｍｐｌレセプターへの抗体も含む。このような抗体は、本質的に異なるエピトープ特異性のモノクローナル抗体または別のモノクローナル抗体のプールからなり得る。“ｍｐｌリガンド”なる用語は更に模倣分子、例えば、１個またはそれ以上の上記のｍｐｌ−介在生理活性が開始されるようにｍｐｌに結合できる小分子を含む。当分野で既知の方法を合わせた本明細書に記載の方法およびアッセイは、模倣分子のライブラリーの構築およびＴＰＯ模倣物が必要な生理活性を有することを同定するスクリーニングに使用される。 “幹細胞”なる用語は、ヒト患者にインビボで投与された時、自己再生でき、系統制限先祖となり得、更に特異的系統に分化および拡張する造血細胞を意味する。本明細書で使用する限り、“幹細胞”なる用語は、造血細胞を意味し、他の細胞系の幹細胞ではない。更に、特記しない限り、“幹細胞”はヒト造血幹細胞を意味する。 “幹細胞”または“多能性”幹細胞なる用語は置き換え可能であり、(１)全ての定義された造血系統の子孫を発生させる能力を有する幹細胞および(２)重症免疫不全患者において、自己再生により、多能性造血幹細胞を含む全血細胞系およびその子孫を完全に再構築させることができる幹細胞を意味する。幹細胞または多能性幹細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３４⁺の発現により同定し得る。幹細胞は、造血細胞の全数の小さい割合を占めるだけである。造血細胞は、種々の細胞表面“マーカー”により同定可能である。このようなマーカーは、特定の系統または前駆細胞に特異的であるかまたは１種以上の細胞系に存在し得る。ＣＤ３４は、幹細胞および多くの分化前駆細胞のかなり数で見られるマーカーである。米国特許第４,７１４,６８０号は、ＣＤ３４マーカーを発現する細胞の集団を記載する。本明細書で使用する限り、“幹細胞”または“多能性幹細胞”は、全ての長期移植の可能性を有する造血細胞集団を意味する。ヒト造血幹細胞集団候補の長期移植の可能性のある動物モデルは、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデルおよび子宮内ヒツジモデルを含む。幹細胞のインビトロアッセイは、５−８週間後の間質共培養において製造された多くのクロノジェニック細胞の数の限定希釈分析を基にした長期培養−開始細胞(LTCIC)アッセイおよび敷石領域形成細胞(CAFC)アッセイを含み、LTCICアッセイと長期移植の可能性の相関を示す。本発明での使用において、非常に豊富な幹細胞集団が好ましい。非常に豊富な幹細胞集団の例は、ＣＤ３４マーカーの発現により選択される細胞の集団である。LTCICアッセイにおいて、ＣＤ３４⁺細胞に富む集団は、典型的に１／５０から１／５００の範囲、より点滴的には１／５０から１／２００のLTCIC頻度を有する。好ましくは、幹細胞集団は、ＣＤ３４⁺発現のみにより選択された集団により提供されるものよりも、より更に幹細胞に富む。より詳細に下記に示すような種々の方法の使用により。非常に豊富な幹細胞集団を得ることが可能である。非常に豊富な幹細胞集団は、典型的に１／５から１／１００の範囲、より典型的には１／１０から１／５０の範囲のLTCIC頻度を有する。好ましくは、少なくとも１／５０のLTCIC頻度を有する。非常に豊富な幹細胞集団の例は、このような細胞の記載および記述を引用して、本明細書に包含させる米国特許第５,０６１,６２０号に記載のような、CD34⁺Lin^-またはCD34⁺Thy-1⁺Lin^-表現型を有する集団である。この表現型の集団は、典型的に約１／２０のLTCIC頻度を有する。LTCIC頻度は、ＣＡＦＣ頻度と相関することが既知である。最も好ましくは、幹細胞集団を、ミトコンドリア色素ローダミン１２３(Rh123 )を流出させる能力に関して富ませる。Rh123流出能力は、殆どの多能性ヒト幹細胞に関連する特性である。従って、殆どの好ましい態様において、幹細胞集団は、CD34⁺Lin^-Rho123^loまたはCD34⁺Thy-1⁺Lin^-Rho123^lo表現型を有することにより特徴づけられる。当業者は、幹細胞集団で行う富化が、使用する選択基準およびその選択技術で達成される純度の両方に依存することを認める。更に、選られる LTCICまたはCAFC頻度は、使用する間質細胞およびサイトカインのようなアッセイ条件に依存するが、全骨髄に存在する以上の幹細胞活性の冨化は、同等である。幹細胞は、成人および胎児両方の骨髄、可動性末梢血(ＭＰＳ)および臍の緒の血液を含む、既知の幹細胞のヒト源から単離される。最初に、骨髄細胞を腸骨( 例えば、腸骨稜を経由した臀部骨から)、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔を含む骨髄の源から得ることができる。幹細胞の他の源は、胚卵黄嚢、胎児肝臓および胎児脾臓を含む。骨髄の単離のために、一般に約５−２５ｍＭの低濃度の許容される緩衝液として、簡便にはウシ胎児血清(ＦＣＳ)または他の天然起源因子を供給した食塩水溶液を含む適当な溶液で骨をさっと流す。慣用的緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液および乳酸緩衝液を含む。そうでなければ、骨髄は骨から、慣用法および当業者に既知の方法で吸引する。幹細胞を末梢血へ可動性とするための方法は当分野で既知であり、一般に化学療法剤、例えば、サイトキサン、シクロホスファミド、ＶＰ−１６およびＧＭ− ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−３のようなサイトカインまたはそれらの組み合わせでの処置を含む。典型的に、全白血球細胞の成分献血を、全白血球細胞の数が５００−２０００細胞／μlおよび血小板数が５０,０００／μlに到達した時に開始する。毎日の白血球搬出サンプルをＣＤ３４⁺および／またはＴｈｙ−１⁺ 細胞の存在に関して追跡し、幹細胞可動性のピーク、従って末梢血幹細胞回収の最適時を決定し得る。種々の技術が、最初にささげられた系統の細胞(“系統−拘束”細胞)の除去により、細胞を分離するために使用し得る。モノクローナル抗体は、特定の細胞系統および／または分化の段階に関するマーカーの同定に使用される。抗体を固体支持体に結合し、粗分離をし得る。用いる分離技術は、回収すべきフラクションの生存率を最大にしなければならない。分離技術の使用は、物理的(密度勾配遠心およびカウンターフロー遠心エルトリエーション)、細胞表面(レクチンおよび抗体親和性)および生染色特性(ミトコンドリア結合色素ローダミン１２３およびＤＮＡ結合色素ヘキスト33342)の差異を基本にするものを含む。分離法は、抗体コート磁気ビーズを使用した磁気分離、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した細胞毒性剤または補体および細胞毒素を含むモノクローナル抗体との組み合わせおよび、固体マトリックスに結合した抗体の“パンニング”を含み得る。正確な分離を提供する技術は、精巧さが変化する、例えば、多くの色チャンネル、低角度および鋭光走査検出チャンネル、インピーダンス・チャンネル等のフロー・サイトメトリーを含む。分化細胞の大集団は、最初に相対的に粗い分離を使用し、そこでリンパ球および骨髄性単核球のような造血系の腫瘍細胞集団系統ならびに巨核細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球を除去する。通常、少なくとも約７０から９０パーセントの造血細胞を除去する。粗い分離と同時またはそれに続いて、例えば、ＣＤ３４マーカーを使用した陽性選択または陰性選択を行い得、そこで奉献細胞に存在する系統特異的マーカーの抗体を使用する。殆どの場合で、これらのマーカーはＣＤ２^-、ＣＤ３^-、ＣＤ７^-、ＣＤ８^-、ＣＤ１０^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１５^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^-、ＣＤ２０^-、ＣＤ３３^-、ＣＤ３８^-、ＣＤ７１^-、ＨＬＡ−ＤＲ^-およびグリコフォリンＡを含む；好ましくは、少なくともＣＤ２^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１５^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^-およびグリコフォリンＡを含む；および通常少なくとも、ＣＤ１４^-およびＣＤ１５^-を含む。本明細書で使用する限り、Ｌｉｎ^-は少なくとも一つの系統特異的マーカーを欠失する細胞集団、例えば、１個またはそれ以上の細胞系統が上記リストから選択される系統特異的マーカーを発現する細胞の除去により除去している集団である。実質的に奉献細胞が枯渇している造血細胞組成は、更にＴｈｙ−１⁺および／またはRho123^loの選択を使用して分離し得、更に非常に幹細胞に富む集団を達成する。精製幹細胞は、低側面散乱および低中前面散乱特性をＦＡＣＳ分析により有する。サイトスピン調製物は、成熟リンパ細胞から成熟顆粒球の間のサイズを有する幹細胞に富むことが示される。細胞は、光散乱特性およびその種々の細胞抗原の発現を基にして選択し得る。好ましくは、細胞を最初に粗分離、続いて、幹細胞に関するマーカーの陽性選択および系統拘束細胞に関するマーカーの陰性選択を含む細分離により分離する。非常に幹細胞に富む組成物は、この方法で達成し得る。所望の幹細胞は、CD34⁺ Thy-1⁺Lin^-表現型の集団により例示され、培養で長期間維持でき、二次および高次培養への継代が可能であり、種々のリンパ細胞および骨髄リンパ細胞系統、特にＢ−およびＴ−リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、赤血球等への分化が可能であることにより特徴づけられる。幹細胞は、条件培地、適当な間質細胞との共培養、または造血細胞の生育を維持するために必要な成長因子の組み合わせを含む培地を含む、適当な栄養培地の培養で生育し得る。条件培地または共培養に関して、種々の間質細胞系を使用し得る。ヒト間質細胞系が必要でないため、齧歯類、特にマウスを含む他の間質細胞系を使用し得る。適当なマウス間質細胞系は、ＡＣ３およびＡＣ６を含み、それらはWhitlock et al.（1987）Cell 48:1009-1021に記載されている。好ましくは、使用する間質細胞系は、ＡＣ６、AC6.21の継代である(SyS1とも呼ぶ)。幹細胞を含む組成物は、適当な間質細胞共培養において骨髄細胞およびリンパ細胞を製造する能力に関して試験できる。間質細胞は、幹細胞を維持する能力等の選択により、ヒト、ブタまたはマウスを含む種々の源由来であり得る。好ましくは、間質細胞はＡＣ３またはＡＣ６、最も好ましくはAC6.21であり、Ｂリンパ球および骨髄細胞を製造する能力は、ＬＩＦおよびＩＬ−６を添加した培養において決定される。幹細胞はまたＢ−細胞、Ｔ−細胞おおび骨髄単核細胞を下記のインビボアッセイでまた発生させる。Ｔ−細胞への分化を証明するために、胎児胸腺を単離し、４−７日、約２５℃ で培養し、リンパ球集団を実質的に枯渇させる。次いで、Ｔ−細胞活性を試験する細胞を、注入集団のＨＬＡが胸腺細胞のＨＬＡと不適合である胸腺組織にマイクロインジェクトする。次いで、胸腺組織を、引用として本明細書に包含させる米国特許第５,１４７,７８４号に記載のようにscid／scidマウスに移植、特に腎臓カプセル下で移植し得る。６週間後、胸腺組織を回収し、供給体由来ＣＤ４⁺ および／またはＣＤ８⁺Ｔ−細胞を、フロー・サイトメトリーにより分析する。更に本発明の幹細胞集団の長期再集団形成能力の証明が、SCID-hu骨モデルにおける連続骨髄およびＢ−リンパ球細胞集団の検出により示される。ヒト胎児骨を単離し、この骨の長手方向切片部分を哺乳類脂肪パッドに移植する。骨腔は、試験供給体集団の注入前のマウス宿主の体全部への照射により内因性細胞が減少している。注入されたＨＬＡの手段は、受容体骨細胞のＨＬＡと不適合である。ヒト造血源は、SCID-hu骨モデルにおけるＢリンパ球産生および骨髄造血を維持する。最後に、例えば、メチルセルロース培養におけるバースト形成単位赤血球系(B FU-E)単位の測定は、細胞が赤血球系統への発展ができることを証明する。幹細胞へのトロンボポイエチンの効果非常に精製された骨髄および可動性末梢血CD34⁺Thy-1⁺Lin^-幹細胞におけるヒトｍｐｌ転写は、RT-PCRにより証明された(実施例３)。しかしながら、レセプターが細胞表面に発現されるか、レセプターリガンドが細胞に何らかの効果があるか、不明であった。本研究は、ＴＰＯが原始ヒト造血細胞(“ＨＳＣ”)に効果があるかの測定で開始し、もしそうであれば、その活性の範囲を測定する。最初に、ヒトＴＰＯをクローン化し、実施例１に記載のように刊行配列を基にして配列決定した。成人骨髄(ＡＢＭ)由来の単一CD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞を、個々に、Terasakiウェル中で、マウス間質細胞一層、ＳｙＳ１上で、ＴＰＯ単独またはサイトカインＩＬ−３、ＫＬ、ＩＬ−６またはＬＩＦと組み合わせて個々に培養した(実施例４) 。各細胞の生育を、実施例４に記載のようにイメージ獲得により追跡した。個々のＡＢＭ組織由来の種々のサイトカイン条件下にプレートした各CD34⁺Thy-1⁺Lin^- 細胞による４週間にわたり達成される最大増殖を比較した。ＴＰＯ単独は７４％の平板効率および細胞あたり４５４の平均細胞製造を支持した。ＩＬ−３を添加した時、細胞製造が約４倍に促進された。この増殖のレベルは、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＬＩＦおよびＫＬの組み合わせの存在下で達成されるのと同等であった。結果は、ＴＰＯがヒトCD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞に作用し、原始非拘束ヒト造血前駆体(例えば、ＣＤ３４を発現するが、系統抗原は発現しない)の循環を誘導し、ＩＬ−３での共刺激は、全細胞製造を増加させる。ＴＰＯ存在下で生育した約５０％の単一CD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞が、サイズおよびCD41b抗原発現で測定して、ＭＫ分化を示した(実施例４)。CD41b抗原発現は、ＭＫ系統に拘束する細胞に特徴的である。これらの結果は、ＴＰＯがＭＫ系統への幹細胞分化を支持することを証明する。ＴＰＯが、単一幹細胞が、成熟前に多重ＭＫ先祖を製造するために刺激されることを定量的に測定するために、０日に、ABMCD34⁺Thy-1⁺Lin^-の集団に存在するＣＦＵ−ＭＫの数を、ＴＰＯ存在下の単一CD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞から生育した増殖胚芽細胞のウェルから得た数と比較した。他の代表的な実施例は、０日CD34⁺T hy-1⁺Lin^-細胞は、０.００２６ＣＦＵ−ＭＫ／細胞を製造し、それをＴＰＯおよびＩＬ−３存在下で平均８.３ＣＦＵ−ＭＫ／起源細胞(１−１８列)を製造する、単一CD34⁺Thy-1⁺Lin^-細胞から拡張させた胚芽細胞集団と比較した。これは、培養中のＭＫ前駆体製造の３,２００倍の増殖を示し、ＴＰＯが単一ヒト幹細胞上で作用し、培養におけるＭＫ系統への拘束、ＭＫ前駆細胞拡張およびＭＫ成熟を可能にすることを示す。ＭＫ増殖および分化の促進に加えて、本発明により、ＴＰＯが原始ＨＳＣに作用し、ＭＫ系統への分化なしに拡張を促進することが判明した。この発見は、ＭＫ系統のみがｍｐｌ−欠失トランスジェニックマウスにおいて欠失しているという報告の観点から、非常に驚くべきことである(Guerney et al.（1994）Science 265:1445)。ＴＰＯ存在下で生育するＡＢＭ由来の約５０％の単一CD34⁺Thy-1⁺L in^-細胞がＭＫ分化を示さなかった。小集団(生育した細胞の１０％)は、直接マクロファージ特性を有する大顆粒細胞に発育した。生育した残りの４０％の細胞は、非常にならべられた群(敷石領域)を形成し、それは４週間の期間にわたり、大屈折性ＭＫまたは大顆粒マクロファージ細胞に分化しなかった。ＩＬ−３のＴＰＯへの添加は、非巨核胚芽細胞拡張パターンを提示する細胞の頻度を、生育した単一細胞の４０％から８０％に増加させ、あるウェルが、Terasakiウェルの最大キャパシティー(約１０,０００細胞)に到達するほと、単一細胞の増殖を約４倍増加させた。他のサイトカインが単独またはＴＰＯと組み合わせて原始ＣＤ３４⁺細胞の増加を支持できるかを決定するために、初期造血細胞に既知の活性を有するサイトカインを試験した。ＣＤ３４⁺細胞がＩＬ−６＋ＬＩＦ＋ＩＬ−３＋ＫＦを使用して拡張した細胞集団内で検出されるが、最も高いＣＤ３４⁺細胞の割合は、ＴＰＯを含むウェルで常に見られた(表１)。その２％がＣＤ３４陽性である約１, ０００細胞の典型的ＴＰＯ−拡張胚芽集団は、ＣＤ３４⁺の約２０倍の拡張を示す(表１)。無間質条件下で群形成する、単一または少数のＨＳＣが間質層上で群形成されたものよりも急速な分化および低い全細胞製造を示すため、間質支持層(ＳｙＳ１)を本明細書に記載の長期培養アッセイに使用した。ＳｙＳ１クラスター上清単独は造血系前駆体を支持するための間質細胞と置き換えはできない。加えて、外来ヒトサイトカイン添加なしのＳｙＳ１に置かれた単一ＨＳＣは非常に低い生育頻度を示す。間質層で生育する単一ＨＳＣが、間質なしで生育するバルククラスターにおいてなされた上記の発見は、精製組み換えＴＰＯ単独が静止ＨＳＣを活性化できることを示すことにより、実証された。ＰＫＨ２６は、細胞膜を標識し、各細胞分裂における強度を減少させる蛍光色素である。ＣＤ３４発現に関するＰＫＨ２６蛍光へのＴＰＯの効果は、無間質バルククラスターで分析した。これらの実験において、富化された静止(CD34⁺Lin^- Rh123^lo)幹細胞集団を試験した。細胞膜をマークするＰＫＨ２６色素を使用し、ＣＤ３４抗原の発現と組み合わせた細胞分裂を定量的に得、幹細胞増殖および分化における種々のサイトカイン組み合わせの効果を測定した。ＴＰＯ単独は、これらの静止ＨＳＣの刺激が可能であり、３日以内にサイクル循環を開始させ、培養６日後にまた高レベルのＣＤ３４発現を保持した。ＴＰＯ単独は、３日および６日に、ＫＬ単独よりも大きい活性化をもたらした。ＴＰＯとＫＬを組み合わせた時、それらは６日目までに細胞サイクルの増加に相乗的に作用した。ＩＬ−３＋ＴＰＯは、ＴＰＯ単独よりもかなり多くの細胞増殖を製造したが、ＴＰＯ単独またはＴＰＯ＋ＫＬよりも多くの分化をもたらした(例えば、ＣＤ３４発現の損失)。トロンボポイエチンの治療的使用本発明はｍｐｌリガンドであるトロンボポイエチンがヒト幹細胞に独特な予期しない効果を有するという発見に基づく。本明細書に提供されている証拠により確立されているように、ヒト長期再集団形成幹細胞のＴＰＯへの暴露は、最小分化を伴う細胞拡張をもたらす。ＴＰＯはまた、ヒト幹細胞拡張および続くＭＫ系統および非ＭＫ細胞への分化ももたらす。更に、ＴＰＯは他の既知のサイトカインよりも早く静止ヒト幹細胞をサイクルに活性化することを示す。加えて、ＴＰＯは、本明細書で、インビトロ培養においてヒト幹細胞の生存を促進することを示す。本明細書でＴＰＯに反応することが示されている原始ヒト造血細胞のサブセットは、自己再生および全造血系統細胞への増殖および分化の能力を有することを特徴とする長期再集団形成または多能性幹細胞である。長期再集団形成細胞集団の拡張のためのＴＰＯの使用。ＴＰＯが原始ヒト幹細胞亜集団を、多能性能力の損失なしに広範囲に増殖させる能力は、造血能力が不全であるか脅かされている患者の造血能力の回復に重要な臨床的示唆を有する。従って、本発明は、ヒト長期再集団形成集団のインビトロ拡張のためのＴＰＯの使用を特徴とする。これは、本来の造血能力が部分的に、実質的にまたは完全に妥協している患者における造血能力の再構築に特に有用である。任意の組織からの幹細胞をヒト患者から除去し、ＴＰＯにさらすことによりインビトロで拡張させ、拡張細胞を患者に戻す。必要であれば、この方法を幹細胞の実質的再集団形成を確実とするまで繰り返す。患者に戻された拡張幹細胞集団は、多能性特性、例えば、自己再生および造血系統の全細胞の製造能力を保持する。種々のサイトカインの組み合わせにより、拡張細胞集団は、幹細胞に加えて前駆細胞および種々の造血系統のより成熟した細胞(例えば、巨核細胞および好中球)を含み、短期および長期再集団形成の可能性の両方を提供する細胞集団を提供する。幹細胞は、好ましくは骨髄または可動性末梢血から、より好ましくは骨髄から単離する。拡張方法は、間質細胞存在下または非存在下で行い得る。間質細胞は、骨髄またはクローン化間質細胞系から新たに単離する。このような系統は、ヒト、マウスまたはブタであり得る；好ましくは細胞系は、下記実施例に記載のようにAC6.21である。臨床的使用のために、幹細胞を間質細胞非存在下であ培養するのが好ましい。拡張の間、ＴＰＯは幹細胞の生育および拡張の最初の過程にのみ、通常少なくとも２４時間、通常少なくとも約４８時間から４日間存在し得るか、より好ましくは拡張の過程の間維持し得る。細胞拡張の間、ＴＰＯは１０− ２００ng／mlの濃度範囲で存在する；より好ましくは、ＴＰＯは約１０−１００ ng／mlの濃度範囲で存在する。加えて、ＴＰＯは他の成長因子およびＩＬ−３のようなサイトカインと共に組み合わせて使用し得る。幹細胞拡張の間、ＴＰＯは約１ng／mlから約２００ng／mlの濃度範囲、好ましくは約５０ng／mlから１００ ng／mlの濃度範囲、最も好ましくは約５０ng／mlで存在する。細胞拡張をＴＰＯおよびＩＬ−３の存在下で行う時、ＩＬ−３は約１ng／mlから約１００ng／mlの濃度範囲、好ましくは約５ng／mlから２５ng／mlの濃度範囲、最も好ましくは約１０ng／mlで存在する。付加的調節因子、例えばStl(５０−１００ng／ml)、ＬＩＦ(５０ng／ml)、ＩＬ−６(２−１００ng／ml)、ＭＩＰ−１α(２−１００ng ／ml)、Flk2/Flt3(２−１００ng／ml)、Ｇ−ＣＳＦ(２−２０ng／ml)、ＧＭ−ＣＳＦ(２−２０ng／ml)、ＩＬ−１(２−１００ng／ml)およびＩＬ−１１(２−１００ng／ml)が存在し得る。当分野で既知の種々のインビトロおよびインビボ試験を使用し、幹細胞の多能性能力が維持されていることを確認し得る。遺伝子治療におけるトロンボポイエチンの使用。ＴＰＯは、本明細書で静止ヒト長期再集団形成幹細胞集団を刺激し、分化無しに能動的に分裂させること、例えば、ＴＰＯ存在下での長期再集団形成幹細胞の培養は、自己再生能力および造血系統の全細胞の発生の能力を保持している細胞の製造をもたらすことを示している。この発見は、レトロウイルスベクターがレトロウイルスＤＮＡの安定な統合のためにサイクル循環する標的細胞を必要とするため、外来性遺伝子でのヒト幹細胞の形質導入に特に重要である。ヒト多能性細胞集団を修飾する能力は、所望の遺伝子生産物を発現する修飾細胞およびその子孫と共に個々の長期再集団形成を提供する。比較して、Ｔ細胞のようなより成熟した造血細胞への遺伝子移入は、最良でも一過性の治療効果しか提供しない。従って、幹細胞の形質導入のためのＴＰＯの使用は、幹細胞の遺伝的修飾の有効な方法の発見のための現在の世界的な努力に適合する。レトロウイルスベクターが、ヒト長期再集団形成幹細胞の集団の遺伝的修飾に使用し得るが、リポソーム介在遺伝子移入またはアデノ関連ウイルスベクターのような他の方法も使用し得る。レトロウイルスベクターは、細胞系での実験で得られる遺伝子移入の遺伝子的に高い割合および、修飾細胞の子孫が移入遺伝子物質を含むことを確実とする遺伝子物質の安定な統合を得る能力のために、一次媒体である。造血幹細胞はヒト患者から回収し、長期再集団形成幹細胞を所得する。これらの細胞は、所望の遺伝子を担持するベクターでの形質導入による修飾の前または後に所望により拡張し得る。次いで、修飾細胞を、異種遺伝子の発現のためにヒト患者に戻す。患者は、修飾幹細胞を戻す前に、天然造血能力を部分的に、実質的にまたは完全に剥奪するために処置し得る。好ましくは、宿主の処置が完了した後に、次いで修飾幹細胞を宿主に戻し、異種遺伝子の発現を提供させる。幹細胞を戻す方法、宿主剥奪および幹細胞再集団形成の方法は当分野で既知である。必要であれば、この方法を繰り返し、修飾幹細胞の実質的再集団形成を確実にする。任意の拡張の間、ＴＰＯ単独または他の成長因子のとの組み合わせが、幹細胞の生育および拡張の最初の過程にのみ、通常少なくとも２４時間、通常少なくとも約４８時間から４日間存在し得るか、より好ましくは拡張の過程の間維持し得る。下記実施例８は、ＴＰＯ存在下での幹細胞形質導入のプロトコールを示す。臨床的環境での使用のために、幹細胞を前もってのまたは続く拡張なしで形質導入することが好ましい。形質導入は、例えば、Bregni et al.（1992）Blood 80:1418-1422に記載の方法により、製造細胞と幹細胞の直接共培養により達成し得る。臨床的使用のために、しかしながら、幹細胞とウイルス上清単独または精製ウイルス調製物とを、間質細胞非存在下で培養することによる形質導入が好ましい。形質導入は、幹細胞をウイルスと約４時間から６日間培養することにより行い得る。好ましくは、形質導入は、３日間、培地を新鮮なレトロウイルスを含む培地に毎日変えることにより行う。あるいは、幹細胞をウイルス存在下で数時間、例えば４時間、３日から４日間、ウイルス含有培地を毎日新鮮な培地に置換することにより培養し得る。硫酸プロタミン、ポリブレン等のようなポリカチオンが、一般に結合を促進するために包含される。硫酸プロタミンおよびポリブレンは、典型的に４μg／m lの範囲で使用される。他のサイトカインもまた添加でき、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＬＩＦ、スチール・ファクター(Stl)、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１αおよびFlk 2/Flt3を添加し得、好ましくはStlを含む。使用する因子は、天然に存在するかまたは例えば、組み換え的に製造し得、好ましくはヒトである。因子の量は、一般に約１ng／mlから２００ng／mlの範囲である。一般に、ＴＰＯに関して、濃度は約１ng／mlから２００ng／ml、より普通には５ng／mlから１００ng／mlおよび最適には約１０ng／mlから５０ng／mlの範囲である：Stlに関して、濃度は１０n g／mlから２００ng／ml、より普通には５０ng／mlから１００ng／mlの範囲である；ＬＩＦに関して、濃度は１ng／mlから１００ng／ml、より普通には１０ng／ mlから８０ng／mlの範囲およびより最適には約５０ng／mlである；ＩＬ−３に関して、濃度は約５ng／mlから１００ng／ml、より普通には５ng／mlから５０ng／ mlの範囲である；ＩＬ−６に関して、濃度は約５ng／mlから５０ng／ml、より普通には５ng／mlから２０ng／mlの範囲およびＧＭ−ＣＳＦに関しては、濃度は一般に５ng／mlから５０ng／ml、より普通には５ng／mlから２０ng／mlの範囲である。幹細胞が十分修飾されているかを確認するために、ＰＣＲを使用し、形質導入幹細胞またはその子孫のベクター特異的配列を増幅し得る。加えて、細胞を種々の条件下で生育させ、ＤＮＡを導入する能力を適当に維持しながら、造血系統の全てを成熟できることを確認し得る。上記の種々のインビトロおよびインビボ試験を使用し、幹細胞の多能性能力が維持されていることを確認し得る。遺伝子治療適用。幹細胞への遺伝子移入は、種々の腫瘍性、感染性または遺伝性疾患の処置に有用である。例えば、化学療法剤への耐性を付与する遺伝子を挿入し、それにより子孫造血細胞を保護し、化学療法剤の高投与量を可能にし、それにより処置の治療効果を改善し得る。例えば、mdr1遺伝子生産物により放出されるタキソールを含む種々の広範囲の医薬への耐性を増加するために、mdr1遺伝子を、例えば、乳癌処置のためのタキソールのような化学療法剤の投与と組み合わせて幹細胞に挿入し得る。同様に、メルファランのようなアルキル化剤への耐性の増加を提供する遺伝子を、高投与量化学療法剤と組み合わせて幹細胞に挿入し得る。造血細胞に主に作用するウイルス感染のために、幹細胞を修飾し、感染体に耐性の子孫を付与する。ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)の場合、例えば、特異的アンチセンスまたはリボザイム配列を挿入し得、標的細胞におけるウイルス感染または増殖を妨害する。あるいは、導入遺伝子生産物は必須ウイルスタンパク質に結合することにより“おとり”として作用し、それにより正常ウイルス生サイクルを妨害し、複製を阻害し得る。あるいは、幹細胞を修飾し、遺伝子欠損、または宿主が続く疾病により遺伝子欠失を獲得する場所を正すための生産物を製造する。遺伝子欠損を正し得る遺伝子は、ＡＤＡ重症複合免疫不全症の処置のためのアデノシンデアミナーゼ；ゴーシェ病の処置のためのグルココレブロシダーゼ；鎌状赤血球性貧血の処置のためのβ−グロブリン；および血友病の処置のための第VIII因子または第IX因子；癌の免疫治療のための癌抗原特異的Ｔ−細胞レセプターならびに癌およびサイトカイン関連疾患の処置のためのサイトカインを含む。移入遺伝子の発現は、遺伝子移入の目的および所望の効果に依存した種々の方法により制御し得る。従って、導入遺伝子は、特異的生理学的条件下でのみ、または特定の細胞タイプで遺伝子の構造的発現をもたらすプロモーターの制御下に置く。導入配列の特異的細胞タイプでの発現をもたらすために使用し得るプロモーターの例は、Ｔ−細胞およびＮＫ細胞内での発現のためのGranzyme Ａおよび Granzyme Ｂ、幹細胞および前駆細胞内での発現のためのＣＤ３４プロモーター、細胞毒性Ｔ−細胞中での発現のためのＣＤ８プロモーターおよび骨髄細胞内での発現のためのCD11bプロモーターを含む。誘導可能プロモーターは、ある生理学的条件下での遺伝子発現に使用し得る。治療効果は、遺伝子生産物を、適当な局在化配列を結合させることにより、特定の細胞位置、例えば、核を標的とするようにすることにより、更に増加させ得る。加えて、誘導可能プロモーターの適当な使用により、種々のタンパク質生産物の発現が、化学物質、化学誘因物質、特定のリガンド等のような特定の刺激に反応して達成し得る。実施例１．トロンボポイエチンのクローニングおよび発現ＴＰＯｃＤＮＡをヒト胎児肝臓ｃＤＮＡ(Clontech，Palo Alto，CA)から、d e Sauvage et al．Nature（1994）369:533により公開された配列を基本にしたオリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によりクローン化し、ＣＯＳ細胞内で発現させた。ＴＰＯ−含有ＣＯＳ上清は、mpl−発現ＢａＦ３細胞の増殖の刺激において活性を示し(活性は３×１０５Ｕ／ml、ここで５０Ｕ／ml＝５０%最大活性)、それは先に記載されたように(de Sauvage et al．(1994)前掲) 、ヒトmpl発現構築物のＢａＦ３細胞への安定な形質導入により構築された。模擬形質導入ＣＯＳ上清(ＣＯＳコントロール)を空の発現ベクターで形質転換したＣＯＳ細胞から回収し、これはＢａＦ３細胞の増殖に効果がなかった。実施例２．細胞選択ヒト成人骨髄と可動化末梢血からの前駆細胞の豊富化。ヒト成人骨髄（ＡＢＭ）ＣＤ３４＋細胞を下記のとおり豊富化した。要約すると、ボランティアの正常なドナーの新鮮な骨髄吸引物２０mlは、Stanford University Medical Center(P alo Alto,CA)またはScripps Research Institute(La Jolla,CA)から得た。単核細胞（密度＜１.０７７）を、細胞分離培地[ＲＰＭＩ１６４０(JRH Bioscience s,Lenexa,KS)、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Gemini Bioproducts,Calabasas,CA )、５０Ｕ／mlペニシリンおよび５０μg／mlストレプトマイシン(JRH Bioscienc es)]にてFicoll（Pharmacia,Miwaukee,WI）密度勾配から単離した。ＣＤ３４陽性選択は、Sutherland et.al(1992)Exp.Hematol.20:590の方法により実施した。この方法のビーズ放出工程（bead release step）に使用したパスツレラ・ヘモリチカ由来のグリコプロテアーゼは、その後の前駆細胞のエクスビボ拡張（expa nsion）に作用しないことが示された(Marsh et al.(1992)Leukemia 6:929)。幹細胞を多発性骨髄腫患者の末梢血（ＭＰＢ）に可動化し、Murray et al．Bl ood(1995)85:368-378に記載のとおり白血球搬出法により収集した。ＭＰＢＣＤ３４⁺細胞を白血球搬出産物から、傾瀉法、顆粒球のフェニルメチルエステル溶解、および赤血球の塩化アンモニウム溶解を含む操作およびSutherland et al .(1992)前掲に記載のＣＤ３４陽性選択を用いて豊富化した。抗体。スルファローダミン（ＳＲ）に直接コンジュゲートさせたＴuＫ３（抗ＣＤ３４）およびフィコエリトリン（ＰＥ）に直接コンジュゲートさせたＧＭ２０１（抗ヒトＴhy−１）を用いて、フローサイトメトリーにより原前駆細胞（pr imitive progenitors）を精製した。ＦＬＯＰＣ２１マウスＩgＧ３（Sigma,St. Louis,MO）および精製マウスＩgＧ１（Becton Dickinson,Mountain View,CA）をそれぞれＳＲおよびＰＥにコンジュゲートさせ、ＣＤ３４およびＴhy−１染色の対照として使用した。フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)−コンジュゲート化系列抗体を用いて、選択物［Ｌeu−５b(抗ＣＤ２)、Ｌeu−Ｍ３(抗ＣＤ１４)、Ｌeu−Ｍ１(抗ＣＤ１５)、Ｌeu−１１a(抗ＣＤ１６)、Ｌeu−１２(抗ＣＤ１９)］から系列陽性細胞を除いた。ＦＩＴＣ−コンジュゲート化マウスＩgＧ１およびＩgＧ２a、ＰＥおよびＦＩＴＣ−コンジュゲート化ＨＰＣＡ２（抗ＣＤ３４）およびマウスＩgＧ１はBecton Dickinson社から購入した。ＦＩＴＣ−コンジュゲート化抗体Ｄ２.１０（抗グリコフォリン）は、ＡＭＡＣ（Westbrook,M E）から購入した。ＦＩＴＣ−コンジュゲート化マウスＩgＭは、Ｓigma社（St.L ouis MO）から購入した。ヒトガンマグロブリン（Gamimune）は、Miles Inc.社( Elkhart,IN)から購入した。蛍光標識およびフローサイトメトリー。ＣＤ３４⁺豊富化造血細胞を染色培地［フェノールレッド不含有ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＢＳおよび１０mＭＨＥＰＥＳ(Sigma,St.Louis,MO)］中濃度２×１０⁶／mlに調整し、氷上で実施される次の操作を用いて標識した。熱不活性化ヒトガンマグロブリン（Gamimune）を濃度１mg／mlで細胞懸濁液に添加し、ＦＣレセプター結合部位を封鎖した。細胞を抗ＣＤ３４−ＳＲ（１０μ g／ml）、抗Ｔhy−１−ＰＥ（１０μg／ml）、および系列マーカーのパネルに対抗するＦＩＴＣ−コンジュゲート化抗体の混合物と共にインキュベートした。この混合物は、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９および抗グリコフォリンＡを含んだ。無関係なマウスＩgＧ３−ＳＲ（１０μg／ml）およびＩgＧ１−ＰＥ（１０μg／ml）抗体をＣＤ３４およびＴｈｙ−１染色の対照として使用した。ＦＩＴＣ−コンジュゲート化マウスＩgＧ１、ＩgＧ２ａおよびＩgＭを系列パネルの対照として使用した。染色のためのインキュベーション時間は２０分であり、その後、３mlを染色培地で洗浄した。抗体染色に続き、細胞を１μg／mlヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Molecular P robes Inc.,Eugene OR）含有染色培地中、濃度１０⁶細胞／mlで再懸濁した。蛍光的に染色した細胞を分析し、ＦＡＣＳtar・プラス・セル・ソーター（Becton Dickinson）に貯蔵した。死滅細胞（ＰＩ陽性）および系列陽性細胞（アイソタイプ適合対照抗体染色を越える強度で染まった）をソートゲートから除いた。ＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺や、ある場合では、ＣＤ３４⁺Ｔhy−１^-のフラクションを生存系列陰性細胞（ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌin^-またはＣＤ３４⁺Ｔhy−１^-Ｌin^-）から選別した。本明細書に参照して具体的に組み込んだ、Spangrude et al.(1988)Science 24 1:58-62の方法に従い、ＣＤ３４⁺選択ＡＢＭ細胞にローダミン１２３色素(Ｒh１２３)(Molecular Probes,Eugene,OR)を加え、３７℃で２０分間発散（efflux）させた。次いで、この細胞を４℃まで冷却し、ＰＥとコンジュゲートさせる以外は上記のようにして抗ＣＤ３４−ＳＲおよび同じ系列マーカー抗体と反応させた。ＣＤ３４⁺Ｌin^-Ｒh１２３^lo表現型をもつ細胞をフローサイトメトリーにより精製した。実施例３．骨髄および可動化末梢血サンプル中のＭＰＬのＰＣＲ検出細胞溶解物は、全ヒト骨髄細胞と、実施例２に記載のようにして単離した表現型ＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-（Ｔhy⁺）およびＣＤ３４⁺Ｔhy−１^-Ｌin^-（Ｔhy^-）の骨髄または可動化末梢血細胞とから調製した。ＲＮＡは、製造元使用説明書に従いＲＮＡＳＴＡＴ６０（Tel-Test,Inc.）を用いて調製した。ｃＤＮＡは、各ＲＮＡサンプルからＢＲＬＳuperscript ＲＴを用いて製造元使用説明書に従い作成した。次いで、cＤＮＡの５分の１を最初の縮重（degenerate）ＰＣＲ反応に使用した。Ｉ型ヘモポエチン受容体ファミリーのＥpo受容体およびｍｐｌ受容体に関連する配列を増幅するように設計した縮重ＰＣＲプライマーは、次のとおりである：センスプライマーＨＥpＭ１−５(配列番号１)： 5'-GCTATTGCGGCCGCGAATTCGGARGAYYTIINITGYTTYTGG-3' アンチセンスプライマーＨＥpＭ２−３(配列番号２)： 5'-GCTATTCTCGAGATCGATSWCCAITCRCTCCAIIINCC-3' アンチセンスプライマーＨＥｐＭ３−３(配列番号３)： 5'-GCTATTCTCGAGATCGATSWCCAINIRCTCCAIIINCC-3' （Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ、Ｉ＝イノシン；Ｓ＝Ｇ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ）制限部位を各プライマーの５'末端に加えた。１組の反応はＨＥpＭ１−５およびＨＥpＭ２−３で実施し、他の反応はＨＥｐＭ１−５およびＨＥpＭ３−３で実施した。各場合で、塗沫を得た。２つのＰＣＲ産物（それぞれ２μl）を第２ＰＣＲ反応のために混合した。第２ＰＣＲは、ｍｐｌに特異的なプライマーを用いて実施した。次の２組のプライマーを使用した：Ａ組：センスプライマーｍｐｌ−５'(３１７−３３６)(配列番号４)： 5'-CGCTGCACCTCTGGGTGAAG-3' アンチセンスプライマーｍｐｌ−３'(５６８−５８８)(配列番号５)： 5'-AGCAGGGCAGCAGGTTTCTGT-3' Ｂ組：センスプライマーｍｐｌ−５'(３１７−３３６)(配列番号４)およびアンチセンスプライマーｍｐｌ−３−ＨＩ(７５４−７７４)(配列番号６): 5'-GCTGCGCAGCTGCAGCCAGTA-3' 結果。全骨髄サンプルにおいて、ｍｐｌはｍｐｌ−５'/ｍｐｌ−３'プライマー単独で検出された。選別骨髄サンプルでは、ｍｐｌは、Ｔhy⁺およびＴhy^-サンプルの両方で両組のプライマーを用いて検出された。ｍｐｌは末梢血サンプル（Ｔhy⁺およびＴhy^-）においても両組のプライマーを用いて検出された。実施例４．幹細胞の単一細胞培養に対するＴＰＯの作用単一細胞沈着に使用されるテラサキ平板に、既に記載（Baum et al.(1992)Pro c.Natl.Acad.Sci.USA 89:2804;DiGiusto et al.(1994)Blood 84:421;Murray et al.(1995)前掲）のネズミストロマ細胞をストロマ細胞培養培地［ＲＰＭＩ１６４０、５％ＦＢＳ、１０^-5Ｍ２−メルカプトエタノール(２−ＭＥ)(Sigma)、４mＭグルタミン(JRH Biosciences)、５０Ｕ／mlペニシリンおよび５０μg／ml ストレプトマイシン］２０μl中１ウェル当たりおよそ５０細胞でプレスした。ストロマ細胞を４〜７日間培養してコンフルエントな単層を形成させた。コンフルエントな単層に放射線照射（セシウム源から１０００rads）し、過剰増殖を防いだ。造血細胞を播種する直前に、培地１０μlを取り出し、幹細胞培養培地（ＳＣＣＭ）[ＩＭＤＭ(JRH Biosciences)、５％プール化ヒト血漿（ＨＰ）、７. ５×１０^-3Ｍ α−ＴＧ(Aldrich Chemical Co.，Milwaukii,WI)、１０^-5Ｍ２− ＭＥ、１００mＭピルビン酸Ｎa(JRH Biosciences)、４mＭグルタミン、５０Ｕ／mlペニシリン、５０μg／mlストレプトマイシン]１０μlに換えた。この培養培地は、ヒト血漿（ＨＰ）およびα−ＴＧを含むＭＫ統合性の維持のために選択した。ＳＣＣＭに所定のサイトカイン類の組合わせを補足した。サイトカインには、組換えヒト(rh)ＩＬ−３（１０ng／ml）(Genzyme,Cambridge,MA)、rhＩＬ− ６（１０ng／ml）(Sandoz,Basel,Switzerland)、rhＫＬ（２５ng／ml）およびrh ＬＩＦ（１０ng／ml）（Tago/Biosource,Camarillo,CA)、およびＴＰＯ発現ベクターまたは５０ng／ml rhＴＰＯ（R&D Systems,Minneapolis,MN）で形質転換させたＣＯＳ細胞から収集した１０％上清がある。空の発現ベクターで形質転換させたＣＯＳ細胞から収集した上清はＴＰＯ−含有ＣＯＳ上清の対照として使用した。単一なＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-成人骨髄（ＡＢＭ）細胞を１０％対照ＣＯＳ上清(対照)、ＴＰＯで形質転換させたＣＯＳ細胞由来の１０％ＣＯＳ上清、１０％ＴＰＯＣＯＳ上清＋１０ng／ml ＩＬ−３、１０％ＴＰＯＣＯＳ上清＋２５n g／ml ＫＬの存在下、または１０ng／ml ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＬＩＦ、および２５ng／ml ＫＬの存在下で培養した。画像化（imaging）および細胞数定量。テラサキウェル単一細胞培養の画像（i mage）をデジタル化し、毎週２回貯蔵した。各画像でウェル全体が見えるように倍率を調整した。画像を得るために、ニコン Diaphot倒立顕微鏡とハママツC240 0 Newvicon CCDカメラを使用した。イメージ−１イメージ解析ソフトウェアとコンパック 66-MHz 486 コンピューター（デジタル化ハードウェア）を用いた(Uni versal Imaging,Philadelphia,PA)。画像の貯蔵にはパナソニックLF−7010上書き可能光ディスクドライブを用いた。細胞数は、直接計数する（＜１００細胞）か、またはウェルが満たされている割合を見積もる（＞１００細胞）ことにより、映像列から測定した。コンフルエントなウェルの平均細胞数は、血球計数器により測定した。サブコンフルエントおよびコンフルエントな細胞ウェルの表現型分析。フローサイトメトリーによる培養細胞に対するＣＤ３４発現の分析は下記のように行った。要約すると、テラサキウェル全体を芽球細胞で満たすまで増殖させた単一細胞を原前駆細胞（ＣＤ３４⁺細胞）の割合について個別に分析した。サブコンフルエントなテラサキウェルの内容物（芽球細胞で３０〜９０％満たされている）を分析のためにプールした。造血細胞を穏やかにピペット操作してウェルから取り出し、染色培地１００μlに再懸濁し、抗ＣＤ３４(ＨＰＣＡ２)−ＰＥで染色した。各ウェルから少量ずつ取って作成したプールをＩgＧ１−ＰＥでの対照染色に使用した。細胞の１％以上がアイソタイプ対照以上の蛍光レベルを示せば、ウェルがＣＤ３４⁺集団を含有するとみなした。ＭＫ前駆細胞フィブリンクロットアッセイ。コロニー形成単位巨核球（ＣＦＵ −ＭＫ）についての血清除去化フィブリンクロットアッセイは、既に報告されている(Bruno et al.(1989)Blood 73:671;Briddell et al.(1989)Blood 74：145) 。このアッセイでは、０日のＡＢＭＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞の集団中に存在するＣＦＵ−ＭＫ数を、ＴＰＯの存在下で単一ＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞から成長した増殖芽球細胞のウェルから得られた数と比較した。新しく選別した細胞を１０⁴細胞／mlで平板培養するか、または培養３週後にテラサキウェルから回収した芽球集団をＩＬ−３１０ng／μL(Sandoz,Basel,Switzerland)、ＧＭ−ＣＳＦ２ng／mlおよびＫＬ１００ng／ml（R&D Systems,Minneapolis,MN）の存在下でフィブリンクロットアッセイにおいて平板培養した。フィブリンクロットを固定し、１２日目にＣＤ４１ｂ⁺コロニーについて分析した。結果。その他のサイトカインの存在下または不在下で成長させた単一細胞培養に対するＴＰＯの作用、並びに平板培養効率（１回以上分裂した単一細胞の数／平板培養した細胞の数）および平板培養した全ての単一細胞による平均細胞増殖を比較した。対照ＣＯＣ上清単独は、ＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞の増殖を刺激しなかった。ＴＰＯ含有ＣＯＳ上清は、７４％の平板培養効率および１細胞当たり４５４細胞の平均細胞産生を支持した。２５ng／ml ＫＬをＴＰＯＣＯＳ上清と併用した場合、ＴＰＯ単独を越える成長増大は見られなかった。ＴＰＯに１０ng／mlのＩＬ−３を加えると、細胞産生はＴＰＯ単独のおよそ４倍（１,６８１細胞／投入細胞）に増大した。この増殖レベルは、４種のサイトカイン（ＩＬ −３、ＩＬ−６、ＬＩＦおよびＫＬ）を併用して得られるレベルと類似した。結果は、精製rhＴＰＯを使用した場合と同様であった。芽球細胞のＴＰＯ拡張。ＴＰＯ単独でまたはその他のサイトカインと併用して原ＣＤ３４⁺細胞の増殖を支持できるかどうかを測定するために、単一ＣＤ３４⁺ Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞を、５％ＴＰＯＣＯＳ上清、ＴＰＯ＋ＩＬ−３、ＴＰＯ＋ＫＬ、ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＫＬ＋ＬＩＦ、およびＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＫＬ＋ＬＩＦ＋ＴＰＯの存在下で培養した。４〜６週で細胞を培養ウェルから回収し、個別に分析するか、または同様の条件下で成長させた他のウェルとプールした。細胞集団を抗ＣＤ３４抗体で蛍光的に染色し、上記フローサイトメトリーにより分析した。これらの集団は、０.５〜４.４％のＣＤ３４⁺細胞を含有し、ＴＰＯ単独の場合の平均２.８％であり、ＴＰＯ＋ＩＬ−３の場合１％、ＴＰＯ＋ＫＬの場合１.２％、ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＬＩＦ＋ＫＬの場合０.５％、ＴＰＯ＋ＬＩＦ＋ＫＬ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６の場合２.１％であった。よって、これらの培養物では、ＴＰＯは、試験した他のサイトカインと比較して、ＭＫ系列に分化することなくＣＤ３４⁺細胞の拡張を増大させた。芽球細胞副産物は、免疫細胞化学染色によるとＣＤ４１ｂを発現しなかった。ＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞の成長形態に対するＴＰＯ作用。ＭＫ分化に対するＴＰＯの作用は、上記の方法によるサイズ、表現型およびＣＤ４１ｂ抗原発現によって測定した。ＴＰＯの存在下で成長させたＡＢＭ由来のおよそ５０％の単一ＣＤ３４⁺Ｔhy −１⁺Ｌin^-細胞は、ストロマ細胞層上の１０〜２００の屈折性（refractile）芽球細胞の初期拡張および分散（dispersal）の成長パターンにより測定したところ、ＭＫ分化を示し、続いて、大きい２５〜５０nmの屈折性細胞へ分化した。このプロセスは、初期平板培養から２〜３週にわたって起こった。この成長形態の細胞を含有するウェルを回収し、ＣＤ４１ｂ発現について免疫細胞化学染色により分析した。本質的に、これらの集団の全ての造血細胞がＣＤ４１ｂについて陽性染色された。これには、大細胞並びに依然としてかなりサイズの小さいものが含まれる。ＴＰＯが単一幹細胞を刺激して成熟前に多発性（multiple）ＭＫ前駆体細胞を産生していることを定性的に示すために、０日のＡＢＭＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌi n^-細胞の集団に存在するＣＦＵ−ＭＫ数を、ＴＰＯの存在下で単一ＣＤ３４⁺Ｔh y−１⁺Ｌin^-細胞から成長した増殖芽球細胞のウェルから得られた数と比較した。新しく選別した細胞、または培養３週後にテラサキウェルから回収した芽球集団をフィブリンクロットアッセイにおいて平板培養した。ＭＫ含有コロニーは、抗ＣＤ４１ｂ抗体によるフィブリンクロット培養物の免疫蛍光染色後に数えた。代表的実験の１つでは、０日のＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞５,０００個が１３個のＭＫコロニーまたは１細胞当たり０.００２６個のコロニーを産生した。それぞれ１つの細胞から生じた、個別の７つの芽球細胞集団は、ＴＰＯおよびＩＬ −３の存在下、１細胞当たり平均８.３個のＣＦＲ−ＭＫ（範囲１〜１８）を産生した。このことは、ＭＫ前駆細胞の産生が培養中に３,２００倍に増幅したことを表す。これらの事実は、ＴＰＯが単一ヒト幹細胞に作用でき、ＭＫ系列、ＭＫ前駆細胞拡張、および培養中のＭＫ成熟を拘束(commitment)させることを示す。実施例５．敷石領域（Cobblestone Area）形成細胞（ＣＡＦＣ）に対するＴＰＯの作用既に記載のように（Murray et al.(1995)前掲）、予め形成させたＳyＳ１ストロマ単層上、制限希釈（１００〜０.８細胞／ウェル）でWhitlock/Witte培地（５０％ＩＭＤＭ(JRH Biosciences)、５０％ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、４×１０^-5Ｍ２−メルカプトエタノール、１０mＭＨＥＰＥＳ、１０Ｕ／mlペニシリン、１００mg／mlストレプトマイシンおよび４mＭグルタミン）中、ＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-細胞を平板培養することにより、制限希釈（ＬＤ）培養物を確立した。４種のサイトカイン条件を比較した：（１）５％対照mock−トランスフェクションＣＯＳ上清；（２）５％ＴＰＯ−含有ＣＯＳ上清；（３）５０ng ／ml ＬＩＦ＋１０ng／mlＩＬ−６；および（４）５０ng／mlＬＩＦ＋１０ng／m lＩＬ−６＋５％ＴＰＯ上清。一実験では、精製ＴＰＯ（R&D Systems）を１０ng ／mlで使用した。培養物を週間隔で供給し、敷石領域形成について週に４回スコアした。敷石領域を含むウェルをＣＤ３４発現について分析した。敷石領域のサイズおよび頻度に対するＴＰＯ作用。培地単独でまたは５％対照ＣＯＳ上清で成長させたＬＤ培養物は殆ど成長を示さなかったのに対し、５％ＴＰＯ含有ＣＯＳ上清で成長させた培養物は敷石領域の成長も含み、細胞成長の増大を示した。ＬＩＦおよびＩＬ−６の存在下で成長させたＬＤ培養物は、既に観察されている（Murray et al.(1995)前掲）とおり、敷石領域形成を示した。しかしながら、ＴＰＯをＬＩＦとＩＬ−６に加えた場合、敷石領域は、より初期により高頻度で現れ（表２）、４週で非常に大きいサイズまで成長した。これらのウェルをＣＤ３４発現について分析すると、６９％がＣＤ３４⁺細胞を含有するのに比較して、ＬＩＦおよびＩＬ−６単独で成長させたウェルでは３８％であった。同様の結果が精製rhＴＰＯで得られた。単一細胞培養で得られた事実と一致するように、ＴＰＯは、制限希釈で培養した原前駆細胞由来のＣＤ３４⁺細胞の拡張を増大した（表３）。実施例６．ＴＰＯの拡張作用ＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺Ｌin^-またはＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺Ｌin^-ＡＢＭ細胞を所定のサイトカインを含むＳＣＣＭ中ＳyＳ１ストロマ細胞について培養し、７日目および１１日目に分析した。ＡＢＭＣＤ３４⁺選択細胞に対するＴＰＯの拡張作用。グリコプロテアーゼ選択ＣＤ３４⁺細胞の純度は、６０〜９３％の範囲であった。ＴＰＯ単独は、１１日までにＣＤ３４⁺の拡張を１.３倍に導き、その時点で、平均５２.８％のＭＫが観察された（表４）。ライト−ギムザ（Wright-Giemsa）染色では小さいＭＫと大きいＭＫの両方が示され、後者は倍数体化の指標である多房性核をもった。免疫細胞化学により、小細胞および大細胞の両方がＣＤ４１ｂ発現に対して陽性であり、ＭＫ系列に対する拘束を示すことを確認した。ＩＬ−３は、ＭＫ刺激因子であることが知られているが、ＣＤ３４⁺細胞をＩＬ−３単独で培養した場合１１日目で検出可能なのはほんの３％であった。ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＫＬとの併用により、１１日目のＭＫの割合が４.７倍低くなったが、総細胞数は５. ５倍に増加し、１１日目で同程度かまたは僅かに多い数のＭＫを産生した。結果は表５に示す。ＡＢＭＣＤ３４⁺Ｌin^-選択細胞に対するＴＰＯの拡張作用。ＦＡＣＳ選別処理により精製した（ＣＤ２⁺、ＣＤ１５⁺およびＣＤ１９⁺細胞を除去した）ＣＤ３４⁺Ｌin^-細胞は、８７％から９６％の純度であった。ＴＰＯ単独が存在する場合、総細胞拡張は、ＣＤ３４⁺細胞で観察されたものよりも多かった(表６)。１１日までに、ＴＰＯ＋ＩＬ−３で培養した細胞の細胞拡張はＴＰＯ単独の場合と比較して１０倍以上であったが、ＭＫの割合は、およそ３.５倍低かった(表５) 。ＴＰＯ＋ＩＬ−３では１１日で総ＭＫ数が２倍高かったが、ＭＫは、少数集団であり、主要細胞は骨髄状であるように見えた（表５）。ＧＭ−ＣＳＦをＴＰＯに加えると、１１日で細胞拡張が２.８倍に増えたが、ＭＫの割合は、ＴＰＯ＋ＩＬ−３の場合よりも僅かに高いままであった(３３.７％対２０.６％)(表５)。ＭＫ集団の純度を犠牲にすれば、ＴＰＯにＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかを加えることにより、より高い絶対数のＭＫを産生させることができる。ＡＢＭＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^-に対するＴＰＯの作用元のソート・ゲートを用いると、Ｔｈｙ−１⁺細胞亜集団の純度は７７−９０％（平均８４％）の間に、Ｔｈｙ−１^-細胞亜集団は６５−９３％（平均８６％）の間にあった。Ｔｈｙ−１⁺集団から有意の細胞拡張があり、高率のＭＫが１１日目までに常にみられた（６１．９−７７．６％）。このことは、ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^- 幹細胞がＴＰＯ刺激のみでＭＫに成熟し得ることを表している。ＭＫポテンシャルについてのＴｈｙ−１⁺とＴｈｙ−１^-細胞亜集団との相違は有意でなかった（図１Ａおよび＋Ｂ）。表６は、これらの条件における７日目および１１日目での平均全細胞拡張および各細胞亜集団のＭＫ産生を要約する。実施例７．ＴＰＯは休止幹細胞のサイクルへの活性化を刺激するＴＰＯが休止幹細胞をサイクルへ活性化するかどうかを決定するために、Ｒｈ１２３，（ＣＤ３４⁺Ｌｉｎ^-Ｒｈ１２３^lo）を流出し得る原始造血細胞に対するＴＰＯの作用を調べた。この細胞集団を膜染料ＰＫＨ２６でラベルし、ＰＫＨ蛍光の消失でもって細胞分裂が観測できるようにした。ラベルの方法は製造業者（Ｚynaxis Ｃell Ｓciences Ｉnc.，Ｍalvern，ＰＡ）の説明書に従った。ＰＫＨ２６染料でラベルしたＣＤ３４⁺Ｌｉｎ^-Ｒｈ１２３^lo細胞を下記のように６日目まで培養した。約１０⁴細胞を丸底９６ウエル・プレート中に１００μ ｌ／ウエルで間質のないＳＣＣＭに、サイトカインを加えないか（ネガティブ対照）あるいはＴＰＯ、ＫＬまたはＩＬ−３の単独、ＴＰＯとＫＬ、ならびにＴＰＯとＩＬ−３の存在下にまき、次いで３日目および６日目に検査した。培養物を採取し、抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体で染色し、培養の３日および６日目にＰＫＨ２６染色保持に対するＣＤ３４発現についてフローサイトメトリーで分析した。０日目の測定値を得るために、染色後に細胞アリコットを取り、３７℃で一夜インキュベートして、Ｒｈ１２３染料の完全流出をせしめた。次いで細胞を抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣで染色して、フローサイトメトリーで分析した。細胞のサイクリングはＰＫＨ蛍光の消失で表され、分化はＣＤ３４発現の消失で表れた。次いで細胞をＦＡＣＳ解析にかけた。血清含有培地において、加えるサイトカインを欠くときは、細胞は四分画の上右域に止まり（ＰＨＫ２６蛍光またはＣＤ３４発現の消失がない）、細胞が休止し続けていることを示した。ＴＰＯでの培養で３日目までに約８％のＲｈｏ１２３^lo細胞が分裂した。６日目までに３２％細胞がサイクルし、その２／３がＣＤ３４を発現した。３日目ではＴＰＯとＫＬの作用が同じであったが、６日目にはＴＰＯの存在で高率のＣＤ３４＋細胞が保有された。ｒｈＴＰＯとＫＬを併用すると、３日目までのサイクルへの細胞の活性化は、付加的以上であり、ＣＤ３４発現の消失なしに生じた。ＫＬとＴＰＯとには明らかに相乗作用があり、６日目までに６９％の細胞がサイクルに入ったが、６２％のサイクル細胞はＣＤ３４細胞に分化した。ＩＬ−３単独で６日目までに最高程度のサイクル化を刺激するが、これらの細胞の大部分はＣＤ３４発現を欠き、ＩＬ−３が自己再生の負担において分化を推進することを示した。ＴＰＯをＩＬ−３に加えることで、ＩＬ−３単独に見られるよりも多くの分裂細胞がＣＤ３４発現を３日目および６日目に保有した。しかし、ＴＰＯとＫＬ両者の培養に比べると、ＣＤ３４⁺である分裂細胞は少なかった。同様の結果が１０％ＴＰＯ含有ＣＯＳ上澄液を用いた以前に実験で得られた。実施例８．幹細胞の形質導入に対するＴＰＯの作用ＣＤ３４⁺Ｔｈｙ−１⁺Ｌｉｎ^-幹細胞を上記したように可動末梢血すなわちＡＢＭから選択した。形質導入試験は、本開示とともに当技術に既知の方法によって行った。ＴＰＯ（１０−１００ｎｇ／ｍｌ精製組換えＴＰＯ）に加えて、導入培地はＫＬ、ＩＬ−３、ＩＬ−６などのサイトカインを含有することがある。ＬＮレトロウイルス・ベクターは、選択可能なマーカーとして細菌性ｎｅｏ遺伝子をＨerpes Ｓimplex Ｖirusチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターの調節下に、Ｍoloneyネズミ白血病ウイルス長端末リピート（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）の調節下に挿入した所望の治療遺伝子と共に、含んでいる（Ｍiller ＆Ｒo sman（1989）Ｂiotechniques 7:980）。レトロウイルス・ベクターＤＮＡは両向性のパッケージ細胞（Ｍiller ＆Ｂuttimore（1986）Ｍol．Ｃell．Ｂiol．6:2 895）にエレクトロポレートし（Ｃhu et al.（1987）Ｎucleic Ａcids Ｒes．15 :1311）、次いで細胞を６００ｍｇ／ｍｌＧ４１８中で選択する（Ｇibco−ＢＲＬ）。抵抗性ＰＡ３１７細胞からのウイルスをＧＰ−Ｅ８６細胞の接種に用い（Ｍarkowitz et al.（1988）Ｊ．Ｖirol．62:1120）、Ｇ１８−抵抗性細胞集団を再びつくる。ＧＰ−Ｅ８６細胞からのウイルスを高い感染多重度（＞１０）でＰＡ３１７の接種に用い、個別のＧ４１８抵抗性ＰＡ３１７細胞クローンを単離した。高力価ウイルス上澄液を産生する単一クローン（ＮＩＨ３ｔ３細胞で測定される＞１×１０⁶Ｇ４１８抵抗性ＣＦＵ／ｍｌ）を選択する。産生細胞は、ＰＧ −４細胞のＳ＋Ｌアッセイで複製コンペテント・レトロウイルスについてネガティブである（Ｈaapala et al.（1985）Ｊ．Ｖirol．53:827）。ベクター産生細胞は高グルコースおよび１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ中で生育する。上澄液を合流単層の培地変換の２４時間後に採取し、−７０℃で貯蔵する。ウイルス上澄液を２×形質導入培地（サイトカインおよひ４μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを加えたＷhitlock／Ｗitt培地）において１：１に希釈し、３７℃にあらかじめ温め、選別した細胞を約５×１０⁵細胞／ｍｌで希釈ウイルス上澄液に懸濁する。同じことをＴＰＯなしで（対照）行う。４時間後、細胞から培地を除き、細胞をＴＰＯおよび／または追加サイトカインを有する（また有しない）新鮮な培地（ウイルスなし）に再び懸濁し、次いで、最初のウエルに細胞を再び採取する。培養物をさらに２０時間インキュベートする。この工程を連続した３日間、毎日４時間ウイルスの存在下にインキュベートした細胞でもって、繰り返す。７２時間後、生きている細胞数を数える。細胞を上記のように形質導入するが、４時間のインキュベーションの間２１℃、２８００×ｇでサンプルを遠心分離すると、導入度数は改善される。導入度数を測定するために、各導入からの２．５−５×１０³細胞を下記のサイトカイン含有のメチルセルロース（Ｓtem Ｃell Ｔechnologies）５ｍｌに加える。ＫＬ，１０ｎｇ／ｍｌ；ＧＭ−ＣＳＦ，２５ｎｇ／ｍｌ；Ｇ−ＣＳＦ，２５ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−３，１０ｎｇ／ｍｌ；およびｒｈＥＰＯ，２units ／ｍｌ。細胞／サイトカイン・メチルセルロース混合物１．１ｍｌを、５ｍｌシリンジおよび１６．５ゲージ針を用いて４種の３ｃｍ格子プレートに入れ、プレートを２週間３７℃インキュベーターにかける。１４日後、単一のメチルセルロース・コロニーを取り上げ、Ｌysing Ｂuffer（７５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴris−ＨＣｌ，ｐＨ９．２５，１．５ｍＭＭｇＣｌ２，０．５％Ｔween− ２０, ０．５％ＮＰ４０，１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）５０μｌに懸濁し、形質導入細胞中のベクター特異的配列を増幅するためにＰＣＲを用いる。ＰＣＲ産生物をエチジウム・ブロマイド・アガロースゲル上で視覚化する。ロング・ターム・間質・培養物をより原始的前駆細胞の遺伝子マーキングを検査するために用いた。簡単に言うと、各導入からの１０，０００細胞を４週間、２０ｎｇ／ｍｌＬＩＦおよび２０ｎｇ／ｍｌＩＬ−６を補充した培地中におけるマウス間質細胞の予めつくった単層上で培養する。プレートを毎週、半除去により栄養補給し、生長ポジティブ・ウエルをトランスジーンの存在についてＰＣＲで解析する。結果ＴＰＣの存在下に形質導入された細胞は、ＴＰＯの不存在に導入された細胞に比して、改善された細胞生存能力を示し、より多くの形質導入幹細胞をもたらす。導入度数はＴＰＯに加えてＩＬ−３およびＫＬの存在で改善され、これは、細胞の生存能力、細胞のサイクリングおよびヒト造血幹細胞に対する両向性レトロウイルスの結合を促進する。 *ＴＰＯ−ＣＯＳ上澄液含有 **１０ng/ml rhＴＰＯ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヤング，ジュディ・シーアメリカ合衆国94040カリフォルニア州マウンテン・ビュー、マウント・バーノン・コート209、1943番

Claims

【特許請求の範囲】１．骨髄増殖性受容体(ｍｐｌ)リガンドの存在下幹細胞を培養し、該リガンドをｍｐｌに結合させてｍｐｌ−介在生物活性を起こすことを含む、培養中の幹細胞の生存を促進する方法。２．該ｍｐｌリガンドがトロンボポエチンである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第２項に記載の方法。４．該トロンボポエチンが組換えヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第３項に記載の方法。５．該ｍｐｌリガンドの存在下で培養される該細胞が、自己再生能および全ての造血細胞系列を生ぜしめる能力を特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。６．該細胞がヒト幹細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。７．該細胞がＣＤ３４⁺である、請求の範囲第６項に記載の方法。８．該細胞がＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺である、請求の範囲第６項に記載の方法。９．該細胞がＣＤ３４⁺Ｌin^-である、請求の範囲第６項に記載の方法。 10．該細胞がＣＤ３４⁺Ｔhy⁺Ｌin^-である、請求の範囲第６項に記載の方法。 11．該細胞がＣＤ３４⁺＋Ｌin^-Ｒho^loまたはＣＤ３４⁺Ｔhy⁺Ｌin^-Ｒho^loである、請求の範囲第６項に記載の方法。 12．該組換えヒトトロンボポエチンが約１ng／mlから約１００ng／mlの濃度で存在する、請求の範囲第４項に記載の方法。 13．幹細胞をｍｐｌリガンドにさらし、幹細胞を増殖させて幹細胞の拡張集団を形成すること含む、幹細胞の集団を拡張する方法。 14．該ｍｐｌリガンドがトロンボポエチンである、請求の範囲第１３項に記載の方法。 15．該トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第１４項に記載の方法。 16．該トロンボポエチンが組換えヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第１５項に記載の方法。 17．該拡張細胞は、実質的な自己再生を受ける能力および全ての造血細胞系列を生ぜしめる能力を特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。 18．該細胞がヒト幹細胞である、請求の範囲第１３項に記載の方法。 19．該細胞がＣＤ３４⁺である、請求の範囲第１８項に記載の方法。 20．該細胞がＣＤ３４⁺Ｌin^-である、請求の範囲第１９項に記載の方法。 21．該細胞がＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺である、請求の範囲第１９項に記載の方法。 22．該細胞がＣＤ３４⁺Ｔhy⁺Ｌin^-である、請求の範囲第１９項に記載の方法。 23．該細胞がＣＤ３４⁺Ｌin^-Ｒho^loまたはＣＤ３４⁺Ｔhy⁺Ｌin^-Ｒho^loである、請求の範囲第１９項に記載の方法。 24．該組換えヒトトロンボポエチンが約１ng／mlから約１００ng／mlの濃度で存在する、請求の範囲第１６項に記載の方法。 25．ヒト対象に造血能力を回復させるための治療法であって： (ａ)ヒト対象から幹細胞を摘出し、 (ｂ)該細胞をｍｐｌリガンドの存在下で拡張させて、ヒト対象から拡張幹細胞集団を形成し；そして、 (ｃ)該拡張細胞を該対象に戻して、造血能力を該対象に回復させる、工程を含む、方法。 26．該拡張幹細胞集団は、自己再生能および全ての造血細胞系列を生ぜしめる能力を特徴とする、請求の範囲第２５項に記載の方法。 27．該ｍｐｌリガンドがトロンボポエチンである、請求の範囲第２５項に記載の方法。 28．該トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第２５項に記載の方法。 29．該トロンボポエチンが組換えヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第２８項に記載の方法。 30．該組換えヒトトロンボポエチンが約１ng／mlから約１００ng／mlの濃度で存在する、請求の範囲第２９項に記載の方法。 31．該細胞を更に１種以上のサイトカイン類の存在下で拡張させる、請求の範囲第２５項に記載の方法。 32．該サイトカインが、インターロイキン３(ＩＬ−３)、インターロイキン６ (ＩＬ−６)、白血病阻害因子(ＬＩＦ)、c−kitリカンド(ＫＬ)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)およびスチール因子(Ｓtl)からなる群から選択される、請求の範囲第３１項に記載の方法。 33．該サイトカインまたは該サイトカイン類の１種がＩＬ−３である、請求の範囲第３２項に記載の方法。 34．静止幹細胞をｍｐｌリガンドにさらして、該細胞を活性化して分裂させることを含む、静止幹細胞を分裂させるために活性化する方法。 35．該ｍｐｌリガンドがトロンボポエチンである、請求の範囲第３４項に記載の方法。 36．該トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第３５項に記載の方法。 37．該トロンボポエチンが組換えヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第３６項に記載の方法。 38．該細胞がヒト幹細胞である、請求の範囲第３４項に記載の方法。 39．該細胞がＣＤ３４⁺である、請求の範囲第３８項に記載の方法。 40．該細胞がＣＤ３４⁺Ｌin^-である、請求の範囲第３８項に記載の方法。 41．該細胞がＣＤ３４⁺Ｔhy−１⁺である、請求の範囲第３８項に記載の方法。 42．該細胞がＣＤ３４⁺Ｔhy⁺Ｌin^-である、請求の範囲第３８項に記載の方法。 43．該細胞がＣＤ３４⁺Ｌin^-Ｒho^loまたはＣＤ３４⁺Ｔhy⁺Ｌin^-Ｒho^loである、請求の範囲第３８項に記載の方法。 44．該活性細胞から形成された細胞は、自己再生能および全ての造血細胞系列を生ぜしめる能力を特徴とする、請求の範囲第３４項に記載の方法。 45．該組換えヒトトロンボポエチンが約１ng／mlから約１００ng／mlの濃度で存在する、請求の範囲第３７項に記載の方法。 46．幹細胞を修飾する方法であって； (ａ)外来遺伝子をウイルスベクターへ挿入し； (ｂ)静止幹細胞をｍｐｌリガンドの存在下で培養して、該細胞を活性化して分裂させ；そして、 (ｃ)該活性化細胞を該ウイルスベクターにさらして、該外来遺伝子を該幹細胞のＤＮＡへ挿入する、工程を含む、方法。 47．該ｍｐｌリガンドがトロンボポエチンである、請求の範囲第４６項に記載の方法。 48．該トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第４７項に記載の方法。 49．該トロンボポエチンが組換えヒトトロンボポエチンである、請求の範囲第４８項に記載の方法。 50．対象に遺伝子治療を提供する方法であって、 (ａ)外来遺伝子をウイルスベクターに挿入し； (ｂ)静止幹細胞をｍｐｌリガンドの存在下で培養して、該細胞を活性化して分裂させ； (ｃ)該活性化細胞を該ウイルスベクターにさらして、該外来遺伝子を該幹細胞のＤＮＡに組込み；そして、 (ｄ)そのようにして修飾した該幹細胞を、これを必要とする対象に提供する、ことを含む、。 51．該外来遺伝子がｍｄｒ１遺伝子産物、アデノシンデアミナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、β−グロブリン、ＶIII因子、ＩＸ因子、ｍｄｒ関連タンパク質、Ｔ−細胞受容体、サイトカイン、およびＨＩＶの複製を妨げるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求の範囲第４６項に記載の方法。 52．該外来遺伝子がアンチセンスまたはリボザイム配列である、請求の範囲第４６項に記載の方法。 53．幹細胞の培養法におけるｍｐｌリガンドの使用。 54．ｍｐｌリガンドがトロンボポエチンである、請求の範囲第５３項に記載の使用。 55．幹細胞がＣＤ３４⁺細胞である、請求の範囲第５３項または第５４項に記載の使用。 56．遺伝子治療または造血再構成に使用する細胞組成物の製造におけるｍｐｌリガンドの使用。 57．ｍｐｌリガンドおよび１種以上のサイトカインを含む細胞培養培地。 58．トロンボポエチン１０〜２００mg／mlおよびＩＬ−３１〜１００ng／ml を含む、請求の範囲第５７項に記載の細胞培養培地。