JP2018048156A - 造血幹細胞の生着手順を強化するための材料および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年11月6日提出の米国仮特許出願第61/112,018号の利
益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の開発の一部は、助成金番号HL069669、HL079654およびDK0
7519の下にNIHから政府の援助を受けてなされたものである。米国政府は本発明に
一定の権利を有する。
本明細書に開示の態様および実施形態は、造血幹細胞および前駆細胞の生着を強化する
ための材料および方法に関する。
移植は特定の悪性および非悪性の血液疾患および代謝障害の治療のための確立された療法
である。移植用HSPCの供給源は、骨髄、動員された末梢血および臍帯血(UCB)を
含む(GoldmanおよびHorowitz、2002年;FruehaufおよびS
eggawiss、2003年:Broxmeyerら、2006年)。医師は、骨髄、
動員された末梢血幹細胞および臍帯血の移植を日常的に実施している。これらの手順は、
健康で正常なドナーから、または所与の病態を発症する前もしくは緩解にある間の患者か
ら採取された十分な数の造血幹および前駆細胞を必要とする。採取した材料は、後に、造
血系およびおそらくその疾患または奇形の組織および細胞が根絶された患者に投与される
。移植後、移植された幹細胞は、適切な骨髄微小環境ニッチへ移行または「ホーミング」
し、このようなニッチ内へ定着し、新しい幹細胞を増殖および産生し、このプロセスは自
己再生と呼ばれる(Porechaら、2006年;Broxmeyer、2006年;
Hallら、2006年)。これらの細胞は、系統が制限された前駆細胞および成熟細胞
に分化もし、そうして、レシピエントの健康にとって必要な造血系を形成する血液を復元
する。前駆細胞は、普通、移植された材料の中に存在し、成熟細胞を産生するためにこれ
らの生着を必要とすると思われる。しかし、前駆細胞は幹細胞ではなく、自己再生できな
いので、それらは限られた期間だけしか移植療法に参加できない。
るまたは損傷する細胞を計上した十分な細胞が移植されることを必要とする。このことは
、臍帯血の移植体は非常に限られた数の幹細胞しか含まないので、臍帯血移植体の移植に
大きな問題を提示する。この理由から、普通は臍帯血移植体を使用して成人移植を成功さ
せることはできない。同様に、患者および正常なドナーの10〜25%は、移植手順にお
ける使用のための十分な細胞を動員することができない。患者集団の一部において、特に
いくつかの化学療法薬を用いて処置された患者集団において、動員の失敗は患者の50%
以上において見られる。一般に、移植できる細胞が多いほど、移植が成功する可能性は大
きくなり、例えば、最新の最も優れた実務では、末梢血幹細胞移植手順が、レシピエント
患者の体重1キログラムあたり最少でもおよそ200万のCD34+細胞の投与を通常必
要とし、獲得でき、その後移植できるCD34+細胞が多いほど、患者の転帰はよくなる
と推奨している(Pulsipher、2009年)。
幹細胞および前駆細胞の生着効率および自己再生が弱いことにより、再構築(repopulati
on)の多段階プロセスにより測定した移植結果に悪影響を与える可能性がある。単離され
た移植体内のヒト造血幹細胞および前駆細胞の数をex vivo設定で試み増加させよ
うとする多くの取組みがなされてきたが、成功は限定的である。HSPCの移植効率を改
善する戦略が、医療専門家が直面する挑戦を克服するために必要である。本明細書に開示
する、本発明のいくつかの態様および実施形態は、この必要性に対処する。
化を対象とし、これらの態様のいくつかは、限定するものではないが、造血幹細胞および
前駆細胞療法の成功率を増加させるための、ex vivoの生存、自己再生および適切
な骨髄ニッチへのホーミングを含む。
および前駆細胞の数の増加を対象とする方法を含む。これらの方法のいくつかは、プロス
タグランジン、例えばプロスタグランジンEの生合成を阻害する化合物またはプロスタグ
ランジン応答に関与する少なくとも1種のプロスタグランジン受容体と拮抗する化合物を
特定するステップ、ならびにドナーの末梢血または骨髄から造血幹細胞および前駆細胞を
採取する前に、医薬有効量のこの化合物(複数可)をドナーに提供するステップを含む。
一実施形態において、プロスタグランジンE生合成阻害剤および/またはプロスタグラン
ジンEの受容体アンタゴニストの適用は、1種または複数種の、臨床的に承認された造血
幹細胞および前駆細胞の動員剤、例えば、顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)と組
み合わせ、造血移植体移植のためのアフェレーシスにより回収され得る造血幹細胞および
前駆細胞の数を増加させる。一実施形態において、この化合物は、例えば、インドメタシ
ン(2−{1−[(4−クロロフェニル)カルボニル]−5−メトキシ−2−メチル−1
H−インドール−3−イル}酢酸)または医薬として許容可能なその塩を含むシクロオキ
シゲナーゼ阻害剤から選択される。さらに他の実施形態において、シクロオキシゲナーゼ
阻害剤は、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム
、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ナプロキセン、ジクロフェナク、リコフェロン、エ
トドラク、ケトロラクまたは医薬として許容可能なそれらの塩からなる群から選択される
。いくつかの実施形態において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤はCOX−1およびCOX
−2の両方に対して作用し、多くの場合COX−2を好む。いくつかの実施形態において
、使用可能なさらに別の化合物はメロキシカムである。
細胞の移植体の長期再構築能力を強化する方法を含む。これは、レシピエントが造血系に
障害を有する状況において特に有用であり得る。この方法は、a)プロスタグランジンE
2の生合成を阻害する化合物および/またはプロスタグランジンE2受容体のアンタゴニ
ストの有効量を用いてドナーを処置し、ドナーから移植体を採取するステップ、b)移植
体と、有効量のプロスタグランジンE2または1種もしくは複数種のその誘導体とを、e
x vivoにおいて接触させるステップ、およびc)処置された移植体をレシピエント
に適用するステップを含む。一実施形態において、この方法は、有効量のプロスタグラン
ジンE2もしくはその誘導体の1種またはPGE2活性を有する任意の分子を、移植体材
料のそれらの適切な治療的ニッチへのホーミングを強化するために、移植レシピエントに
対して供給するステップをさらに含む。
する方法を含む。これらの方法のいくつかは、形質導入(transduction)のための少なく
とも1種の対象遺伝子を含有するウィルスベクターを提供するステップ、有効量のプロス
タグランジンE2またはその誘導体によってex vivoにおいて処置された少なくと
も1種の幹細胞を提供するステップ、およびウィルスベクターを、PGE2またはその誘
導体によって処置された幹細胞にトランスフェクションするステップを含み得る。
プ、PGE2の生合成および/または活性を減少させる化合物を提供するステップ、なら
びに造血幹細胞および/または前駆細胞の供給源と、該細胞のPGE2の生合成および/
または活性を減少させる有効量の前記化合物とを接触させるステップを含む、造血幹細胞
および/または前駆細胞の動員を強化する方法を含む。いくつかの実施形態において、P
GE2活性を減少させる化合物は、非ステロイド系抗炎症性化合物であり、この非ステロ
イド系抗炎症性化合物はシクロオキシゲナーゼ−1およびシクロオキシゲナーゼ−2の両
方に対して作用する。いくつかの実施形態において、この非ステロイド系抗炎症性化合物
は、主にシクロオキシゲナーゼ−2に対して作用する。いくつかの実施形態において、非
ステロイド系抗炎症性化合物は、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、エトリコ
キシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、エトドラク
、ケトロラクおよびリコフェロンからなる群から選択される。さらに他の実施形態におい
て、非ステロイド系抗炎症性化合物はインドメタシンであり、さらに他の実施形態におい
て、非ステロイド系抗炎症性化合物はメロキシカムである。
駆細胞の動員を強化する少なくとも1種の追加の化合物との同時処置で、オーバーラップ
した期間患者に投与される。いくつかの実施形態において、造血幹細胞および前駆細胞の
動員を強化する化合物は、G−CSFおよびプレリキサフォルからなる群から選択される
。いくつかの実施形態において、非ステロイド系抗炎症性化合物は、少なくとも3日間患
者に投与される。
物を提供するステップ、ならびにドナーから造血幹細胞または前駆細胞を採取する前に、
有効量の前記化合物を造血幹細胞または前駆細胞ドナーに投与するステップを含む、ドナ
ー由来の造血幹細胞および/または前駆細胞の動員を強化する方法を含む。いくつかの実
施形態において、少なくとも1種のPGE2受容体のアンタゴニストは、N−[[4’−
[[3−ブチル−1,5−ジヒドロ−5−オキソ−1−[2−(トリフルオロメチル)フ
ェニル]−4H−1,2,4−トリアゾール−4−イル]メチル][1,1’−ビフェニ
ル]−2−イル]スルホニル]−3−メチル−2−チオフェンカルボキシアミド(L−1
61,982)および4−(4,9−ジエトキシ−1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H
−ベンズ[f]イソインドール−2−イル)−N−(フェニルスルホニル)−ベンゼンア
セトアミド(GW627368X)からなる群から選択される。
せる少なくとも1種の化合物を用いて処置された、当該供給源由来の造血幹細胞および前
駆細胞を含む細胞の群を採取するステップ、造血幹細胞のセットと、PGE2活性を有す
る化合物とをex vivoにおいて接触させるステップ、およびex vivoにおい
てPGE2活性を増加させる前記化合物と接触させた、前記造血幹細胞および前駆細胞を
レシピエント内に移植するステップを含む、レシピエントにおいて造血幹細胞および/ま
たは前駆細胞を生着させることを含む。いくつかの実施形態において、造血幹細胞は、骨
髄ドナーから取り出される。一方、さらに他の実施形態において、造血幹細胞は血液ドナ
ーから取り出された血液試料から採取される。そして、さらに他の実施形態において、細
胞は、臍帯または胎盤から取り出される。
GE2活性を有する化合物と、造血幹細胞および/または前駆細胞の集団をex viv
oで接触させるステップを含む、造血幹細胞および/または前駆細胞の生着率を増加させ
る方法を含む。いくつかの実施形態において、PGE2活性を有する化合物は、任意のE
シリーズのプロスタグランジンまたはEシリーズのプロスタグランジンの任意の誘導体、
例えばPGE1、PGE2、PGE3または例えばジメチル16,16−ジメチルPGE
2を含む、PGE1、PGE2、PGE3のジメチル誘導体などからなる群から選択され
る。いくつかの実施形態において、PGE2活性を有する化合物は、造血幹細胞および/
または前駆細胞集団と少なくとも1時間接触する。いくつかの実施形態は、PGE2活性
を有する化合物と接触させた造血幹細胞および/または前駆細胞を、実質的にPGE2活
性を有さない緩衝液を用いて、少なくとも1回洗浄するステップを含む。一方、さらに他
の実施形態は、PGE2活性を有する化合物と接触させた造血幹細胞および/または前駆
細胞を、患者内に導入するステップをさらに含む。
および特許請求の範囲を参照してさらによく理解され得る。
照するものでありそれらを説明するために特化された言語を使用する。それにもかかわら
ず、新規な技術の範囲は、その結果限定されないものとして意図され、新規な技術の原理
のこのような変更、改良およびさらなる応用は、新規な技術が関連する分野の技術者が通
常思いつくものとして企図されると理解されるものである。
、炎症および他の多数の生理学系の公知のメディエーターである。造血におけるPGE2
の役割は、様々な研究チームにより探求されているが、結果の調整は困難である。例えば
、in vitroおよびin vivoの研究により、PGE2は骨髄造血を負に制御
できること、すなわちPGE2は、BFU−EおよびCFU−GEMMのコロニー形成を
促進し、CFU−SおよびCFU−GMの増殖を強化することが実証されている。他方、
PGE2は、HSPCを刺激でき、造血に関して二相効果を有する。すなわち短期ex
vivoにおいて、骨髄細胞のPGE2処置は、休止細胞、おそらく幹細胞またはより未
発達な前駆細胞の集団から循環ヒトCFU−GMの産生を刺激することが示された。さら
に近年、16,16−ジメチルPGE2に対するex vivoの曝露が、マウス骨髄細
胞の再構築能力およびゼブラフィッシュの腎臓における髄の回復を増加させることが示さ
れた(Northら、2007年)。これらの研究は、造血の制御におけるPGE2に関
係するが、PGE2と造血幹細胞のホーミングとを関連付けることはできない。むしろ、
先の研究は、PGE2がHSPCの分化の調節に関与し、PGE2は細胞のホーミングに
関して直接効果を有さないことを示す傾向がある。
の安定化効果を有し、自己再生HSPCの生存、ホーミングおよび増殖を強化することに
よって、生着を容易にする。
度を増加するシクロオキシゲナーゼの活性の阻害である。限定されない一実施例において
、造血ドナーが一用量の動員剤を投与される1日前および毎日、造血ドナーに経口経路ま
たは全身経路によってシクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、50マイクログラムのイン
ドメタシンを毎日投与することは、末梢において幹細胞および前駆細胞の動員を強化する
。シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えばインドメタシンと、臨床的に承認された動員剤、
例えばG−CSFとの同時使用は、前駆細胞の動員に対して相乗効果を生み出す。
ンタゴニストを提供することによっても達成できる。
C頻度を強化し、PGE2処置HSPCに競合的有利性を提供することを示す。骨髄幹細
胞をex vivoにおいてPGE2で処置することは、マウスにおいて生着する幹細胞
の合計を強化し、幹細胞の生存を強化し、幹細胞のホーミング効率を増加させ、幹細胞の
自己再生を増加させる。dmPGE2によって誘導されたHSPCの頻度の強化は、同じ
動物内の直接一対一分析において対照およびdmPGE2処置細胞の生着を比較する、限
界希釈競合的移植モデルを使用することによって実証された。例えば、未処置造血移植体
または精製造血幹細胞集団(例えば、マウス中のSKL細胞またはヒト中のCD34+細
胞)と、真のPGE2またはより安定な類似体の16,16−ジメチルPGE2(または
任意のさらなる活性PGE類似体)とを、1mlの培養培地、例えば、IMDM中、10
0万から1000万細胞あたり0.001〜10マイクロモル濃度(Molar)のPGE2
の濃度で、1〜6時間、氷上でインキュベートした。インキュベート後、細胞を滅菌生理
食塩水で3回洗浄し、レシピエントに静脈内投与した。この方法により、Poisson
統計および競合的再構築単位(CRU)の分析によるHSPC頻度の計算に基づき、PG
E2をパルスしたHSPCの約4倍の競合的有利性を実証した。頻度分析により、対照細
胞に対して1/4の数のPGE2処置細胞を使用して同等の再構成が実証されている。加
えて、対照細胞またはPGE2処置細胞のどちらかを使用する、二次移植レシピエントに
おいて、全造血再構成が観察され、HSPC自己再生についてPGE2の悪影響はないこ
とが示された。実際、LTRC活性の増加傾向が見られ、段階移植の前に細胞または動物
にさらなる処置は実施していないので、一次移植において観察された、HSPCに関する
短期PGE2曝露の強化効果が長続きすることが示された。PGE2処置細胞の生着の強
化は、28週間にわたって安定であった。移植後90日の、二次移植動物における分析に
より、完全な多系統の再構成が実証され、より高いHSPC頻度が続き、長期再構築HS
PCに関する短期PGE2処置の安定した効果が示された。
たらされ得る。PGE2は、HSPCのホーミングに影響を与えないことが、North
らによって示唆されたが、彼らの研究は、HSPCを明確に評価していなかった。本明細
書において実証されたように、予想外に、PGE2により誘導されたHSPC頻度の強化
は、20週間を超えて安定であり、二次移植において維持された。競合的移植モデルにお
ける直接比較は、HSPCをPGE2に対して短期曝露することにより、約4倍の競合的
有利性がもたらされることを示した。合計移植細胞は、対照とPGE2処置細胞との間に
ホーミング効率の差はなかったが、PGE2処置され、分類されたSKL細胞のホーミン
グ効率の強化が観察され、PGE2が、HSPCのホーミングに直接効果を有することが
強く示唆された。
またはHSPCの長期再構築能に対するPGE2の効果を示唆する。
E2の効果がアルファケモカイン受容体のCXCR4ケモカイン受容体の上方制御を介し
て仲介されると思われ、HSPCのホーミングおよび自己再生ならびにHSPCの生存お
よび増殖を制御する、アポトーシス阻害剤タンパク質である、サバイビンに関与すること
である。
ageneg(SKL)マウス骨髄細胞および受容体サブタイプの発現において明白な差
のないCD34+ヒト臍帯血細胞(UCB)において、4種のPGE2受容体(EP1〜
EP4)すべての発現を示す。HSPC機能に関するいくつかの機能特性を分析した場合
、SKL(26.8%)およびCD34+UCB(17.3%)の両方におけるCXCR
4の発現の有意な増加が、PGE2曝露後に見られ、曝露後6時間においてCXCR4
mRNAの有意な上方制御が見られた。CXCR4の増加は、PGE2処置移植体のin
vivoの骨髄ホーミング効率の約2倍の増加と完全に一致し、操作していない骨髄(
p<0.001、3実験、n=6マウス/群/実験、個別にアッセイ)および同じ動物中
の1対1競合で精製SKL細胞(p<0.001、2実験、n=5マウス/群/実験、個
別にアッセイ)において観察され、HSPCに関するPGE2の直接効果を示唆した。ホ
ーミング効率の増加は、選択的CXCR4アンタゴニストのAMD3100を用いて処置
することによって有意に減少した。
えて、CXCR4アンタゴニストのAMD3100は、ホーミングに対するPGE2の効
果の強化を有意に減少させ、CXCR4発現の強化および骨髄SDF−1に対する化学誘
引は、ホーミングの強化に大いに関与するが、接着分子の発現または機能に対するさらな
る効果は排除され得ないことを示唆している。
植された幹細胞の生存がin vivoで強化されることである。PGE2または活性類
似体のレシピエントに対する、移植時の非経口投与および幹細胞の強化のための毎日の投
与を続けることは、移植されたHSPCの生存を増加させ得る。例えば、PGE2または
その活性類似体は、0.0001〜10マイクロモル濃度で、造血移植体の供与直前およ
びその後毎日患者に投与できる。
て、処置後24時間以内に増加をもたらす。加えて、BrdU処置レシピエントマウスに
おけるPGE2処置細胞の移植は、ビヒクルだけをパルスした移植細胞と比較して、細胞
周期のS+G2/M期において約2倍を超えるドナーSKL細胞を示した。
コンディショナルノックアウトマウスにおけるサバイビンの欠損は、HSPCの維持にサ
バイビンが必要であることを示す。本明細書に記載の研究は、PGE2処置SKL細胞に
おいてmRNAおよびサバイビンのタンパク質レベルの上昇、同時に起こる、アポトーシ
スを仲介するプロテアーゼである、活性カスパーゼ−3の減少を見出した。生存アッセイ
は、PGE2が、in vitroでSKL細胞のアポトーシスを用量依存的に減少させ
ること、同時に起こる、サバイビンのタンパク質発現の1.7倍の増加および活性カスパ
ーゼ−3の減少(23〜59%の減少;曝露後24〜72時間)を示した。
高い。PGE2に対するパルス曝露は、細胞周期においてHSPCの割合を約2倍増加し
、BrdU+SKL細胞のHSPC頻度、CRUおよびホーミングを増加し、一次および
二次移植においてHSPC頻度の強化を維持する。これらの結果の限定されない1つの説
明は、PGE2のパルス曝露が、HSPCの自己再生の単一ラウンドを開始できることで
ある。例えば、EP2およびEP4の受容体の活性化は、グリコーゲン合成キナーゼ−3
(GSK−3)のリン酸化に関与し、β−カテニンのシグナル伝達を増加させ(Hull
ら、2004年;Regan、2003年)、これはWnt経路の下流であり、HSPC
の生存および自己再生に関係している(Flemingら、2008年;Khanおよび
Bendall、2006年)。PGE2によるシグナル伝達は、おそらくEP4を介す
るが、EP4が直接β−カテニンを増加させ得ることを排他的に限定するものではない。
COX−2およびWnt経路との間の相乗的クロストークが示唆されている(Wangら
、2004年)。
し(Fukudaら、2004年)、HSPC機能に関与し(Chengら、2000年
)、カスパーゼ−3活性をブロックする(Liら、1998年;Tammら、1998年
)ことが公知である。近年、p21は、HSPCの自己再生に関係する(Janzenら
、2008年)。本明細書に報告した研究から引き出された1つの発見は、PGE2がサ
バイビンを上方制御し、カスパーゼ−3を減少させることであり、サバイビン経路が、自
己再生の増加に関するPGE2の効果に関係し得ることを示唆している。サバイビン(P
engら、2006年)およびCXCR4(Stallerら、2003年;Zagza
gら、2005年)の転写が、転写因子の低酸素誘導因子−1アルファ(HIF−1アル
ファ)により上方制御され、低酸素誘導因子−1アルファは、PGE2によって安定化さ
れ得(Liuら、2002年;Piccoliら、2007年)、おそらくいくつかのP
GE2応答経路と、HSPCの細胞生存、ホーミングおよび増殖/自己再生がリンクして
いることに留意するとさらに興味深い。
またはそれを超えるHSPCのレシピエント骨髄へのホーミングおよびHSPCの自己再
生の約2倍の増大によって生じることを示唆している。これらの結果は、それによってP
GE2がHSPCの機能を強化する作用の新規な機序を規定する役に立つことができ、こ
れらの結果は、造血移植、特に限定された細胞数が生着の乏しい見込みにつながる造血移
植体を容易にするための予期せぬ治療的取組みを示唆する。
法である。幹細胞のex vivoのPGE2処置は、自己再生分裂およびこのような細
胞の生存を増加し、これは、ウィルスベクターにより仲介される遺伝子組み込みの成功に
とって重要な因子である。PGE2により促進された幹細胞の自己再生分裂/生存は、最
新の幹細胞形質導入プロトコルに組み込むことができ、したがって、幹細胞遺伝子療法に
おける遺伝子形質導入効率全体を増加する。
ナー細胞の動員、HSPCの維持およびレシピエントの体内におけるHSPCのホーミン
グを含む多段階方法を報告する。いくつかの条件下で、これらの方法は、HSPC頻度に
おいて4倍の増加をもたらし、生着は、おそらく、例えば、HSPCのホーミングにおけ
る約2倍の増加およびPGE2の直接影響下のHSPCの細胞周期活性における2倍の増
加の累積効果に起因する。正確なシグナル伝達経路がさらに決定されるべきであるが、こ
の効果の限定されない1つの説明は、生着の強化は、CXCR4およびサバイビンなどの
因子の上方制御によることである。
特にHSPCの数が限定されている状況、例えば、UCBおよびいくつかの動員されたP
B産物において、または幹細胞遺伝子療法におけるウィルス遺伝子形質導入を設定するの
に臨床的に有意であり得る。本発明者らの限界希釈移植研究は、同等の生着結果を、PG
E2処置されていない対照と比較して、PGE2処置細胞が1/4の数で達成し得ること
を例示する。これらの結果は、HSPCの数が限定されている条件下でPGE2を使用す
ることの有用性を実証する。4種のEP受容体サブタイプすべてが、HSPCにおいて発
現されると思われるが、これらの受容体のどれ(または4種すべて)が生着機能に関係し
ているかは明らかでない。生着/回復の強化が、in vivoにおいてPGE2を投与
することによって、またはin vivoで使用されるPGE2が、ex vivoでP
GE2に曝露されたHSPCの生着をさらに容易にできる場合に得られることは、これら
の結果と一致する。
材料
マウス C57B1/6マウスは、Jackson Laboratories(Ba
r Harbor、ME、USA)から購入した。B6.SJL−PtrcAPep3B
/BoyJ(BOYJ)およびF1 C57B1/6/BOYJハイブリッドを、研究所
内で繁殖させた。すべての動物を、食物および酸性化水を連続提供されるマイクロアイソ
レーターケージにおいて飼育した。移植研究に使用するマウスは、放射時、および移植後
30日の間、ドキシサイクリンの供給を受けた。The Animal Care an
d Use Committee of Indiana University Sc
hool of Medicineは、すべての動物プロトコルを承認した。
encesから購入した。マウスKLおよびSKL細胞の検出および選別のために、PE
−Cy7と結合したストレプトアビジン(ビオチン化MACS系統抗体の染色用(Mil
tenyi Biotech、Auburn、CA))、c−kit−APC、Sca−
1−PEまたはAPC−Cy7、CD45.1−PEおよびCD45.2−FITCを使
用した。UCB CD34+細胞は、抗ヒト−CD34−APCを使用して検出した。多
系列分析のために、APC−Cy7−Mac−1、PE−Cy7−B−220およびAP
C−CD3を使用した。EP受容体は、抗EP1、EP2、EP3およびEP4ウサギI
gG(Cayman Chemicals)を用いて検出し、FITC−ヤギ−抗−ウサ
ギIgG(Southern Biotech、Birmingham、AL)を用いて
二次染色した。CXCR4の発現は、ストレプトアビジン−PECy7、c−kit−A
PC、Sca−l−APC−Cy7およびCXCR4−PEを使用して分析した。アポト
ーシスは、FITC−アネキシン−Vを用いて測定した。サバイビンおよび活性カスパー
ゼ−3の検出のために、細胞を透過処理し、CytoFix/CytoPerm kit
(BD)を使用して固定し、抗活性カスパーゼ−3−FITC Flow Kit(BD
)またはサバイビン−PE(R&D Systems)を用いて染色した。
it(BD)を用いて染色した。すべての分析はLSRIIにおいて実施し、選別は、F
ACSAriaソーターまたはFACSVantageソーター(BD)のどちらかにお
いて実施した。Cell Quest ProおよびDiva software(BD
)を、データの収集および分析に使用した。
限界希釈競合的および非競合的移植
WBM細胞(CD45.2)を、1マイクロモル濃度のdmPGE2(Cayman
Chemical、Ann Arbor、MI)/1×106細胞または滅菌、非発熱性
PBS中0.01%のETOHのどちらかを用いて、氷上において2時間処置した。イン
キュベーション後、細胞を2回洗浄し、2×105のコンジェニックCD45.1競合骨
髄細胞と、0.075:1、0.25:1、1:1および2.5:1の割合で混合し、致
死的に放射線(1100−cGy分割線量)を浴びたCD45.1マウスに、尾静脈注射
により移植した(5マウス/希釈)。PB中のCD45.1およびCD45.2細胞を、
フローサイトメトリによって、月1回決定した。1対1競合移植のために、CD45.1
マウスおよびCD45.2マウス由来のWBMを、ビヒクルまたはdmPGE2を用いて
処置しCD45.1/CD45.2マウス由来の2×105の競合骨髄細胞と、0.07
5:1、0.25:1、1:1および2.5:1の割合で混合し、致死的に放射線を浴び
たCD45.1/CD45.2マウスに移植した。PB中のCD45.1、CD45.2
およびCD45.1/CD45.2細胞の一部(proportion)を、月1回決定した。HS
PCの頻度を、L−CALCソフトウェア(Stem Cell Technologi
es、Vancouver BC、Canada)を使用して、Poisson統計によ
って定量化し、キメラ現象に対する寄与は<5%であり、陰性レシピエントと考えられる
。競合的再構築単位(CRU)を、記載のように(Harrison、1980)計算し
た。二次移植のために、移植後20週に、すでに移植を受けた1:1比のF1ハイブリッ
ドマウス由来の2×106のWBMを、致死的に放射線を浴びたF1ハイブリッドマウス
に非競合的様式で注射し、PBのキメラ現象および三血球系の再構成を月1回評価した。
SE(Molecular Probes、Eugene、OR)を用いて標識し、洗浄
し、1マイクロモル濃度のdmPGE2またはビヒクルのどちらかを用いて氷上で処置し
た。処置後、細胞を洗浄し、2×107の細胞を、致死的に放射線を浴びたCD45.2
マウスに移植した。16時間後、大腿骨および脛骨を洗い流し、マウス骨髄Lin+細胞
の一部を、MACSマイクロビーズ(Miltenyi Biotech)を使用して枯
渇させ、ビオチン(系統)、c−kit(K)およびSca−1(S)に特異的な蛍光色
素標識抗体を用いて染色し、CFSE+WBM(非系統枯渇)、KLおよびSKL細胞の
合計数を決定した。コンジェニックホーミング研究のために、Linneg CD45.
1細胞を、1マイクロモル濃度のdmPGE2、ビヒクルまたはPBSを用いて、氷上で
処置した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、2×106の細胞をCD45.2マウ
スに移植した。16時間後、レシピエントの骨髄を採取し、系統を枯渇し、染色し、ドナ
ーのCD45.1SKL細胞を決定した。選別されたSKL細胞を使用する競合的1対1
ホーミングの研究では、CD45.2およびCD45.1マウス由来のLinneg細胞
をFACS選別し、細胞を、dmPGE2またはビヒクルのどちらかを用いて2時間処置
し、洗浄し、3×104のCD45.1(ビヒクルまたはdmPGE2処置)+3×10
4のCD45.2(dmPGE2またはビヒクル処置)SKL細胞を、致死的に放射線を
浴びたF1ハイブリッドマウスに移植した。ホーミング研究においてCXCR4の役割を
評価するために、Linneg CD45.2細胞を、ビヒクルまたは1マイクロモル濃
度のdmPGE2+10マイクロモル濃度のAMD3100(AnorMed Inc.
、Vancouver、BC、Canada)を用いて氷上で処置し、2×106の処置
細胞を、致死的に放射線を浴びたCD45.1マウスに注射した。移植後16時間で、ホ
ーミングしたSKL細胞を分析した。
nneg細胞試料を、SKLについて染色し、KLおよびSKL細胞における個々のEP
受容体および表面受容体の発現を、FACSによって決定した。ヒトEP受容体のために
、UCBを、Institutional Review Boardの承認によりWi
shard Hospital、Indianapolis、INから入手した。単核細
胞を、Ficoll−Paque(商標)Plus(Amersham Bioscie
nces)において単離し、CD34+細胞を、MACSマイクロビーズ(Milten
yi Biotech)を用いて正に選択した(FukudaおよびPelus、200
1年)。複製細胞を、CD34に対して染色し、個々のEP受容体および表面発現を、F
ACSによって決定した。CXCR4、サバイビンおよび活性カスパーゼ−3を評価する
ために、Linneg細胞またはCD34+UCBを、1マイクロモル濃度のdmPGE
2またはビヒクル対照を用いて、氷上で2時間処置し、洗浄し、次いでRPMI−164
0+10%FBS中で、37℃において24時間培養した。細胞を、上記のように、SK
L(マウス細胞)およびCXCR4、サバイビンおよび/または活性カスパーゼ−3に対
して染色し、FACSによって分析した。
イクロモル濃度のdmPGE2またはビヒクルのどちらかを用いて2時間処置し、洗浄し
、Stem Cell Pro Media(Stem Cell Technolog
ies)中で、rmSCF(50ng/ml)(R&D Systems、Minnea
polis、MN)、rhFlt−3およびrhTPO(それぞれ100ng/ml)(
Immunex、Seattle、WA)と一緒に培養した。20時間後、細胞を、SK
Lを用いて染色し、固定し、透過処理し、7AAD(BD Biosciences、S
an Jose、CA)を用いて染色した。S+G2/M期のSKL細胞の一部をFAC
SによりDNA含有量を測定することによって決定した。in vivoの細胞周期分析
のために、CD45.2マウスに致死的に放射線を浴びせ、1マイクロモル濃度のdmP
GE2またはビヒクルのどちらかを用いて2時間処置したCD45.1マウス由来の、5
×106のLinneg細胞を移植した。移植時に、レシピエントマウスに、飲料水中1
ミリグラム/mLのBrdU(Sigma Aldrich、St. Louis、MO
)および1mg/マウスのBrdU I.Pを与えた。16時間後、レシピエントの骨髄
を単離し、系統を枯渇させ、CD45.1、SKLおよびBrdUに対して染色した。B
rdU+である、ホーミングした(CD45.1+)SKL細胞の一部を、個々のマウス
においてFACSによって決定した。
濃度のdmPGE2またはビヒクル対照を用いて、氷上で処置し、洗浄し、成長因子を含
まずに、37℃においてRPMI−1640+2%FBS中でインキュベートし、アポト
ーシスを誘導した。24時間後、細胞を、SKLおよびアネキシンVに対して染色し、ア
ネキシンV+SKL細胞の一部をFACSにより決定した。
agene、La Jolla、CA)を使用して得た。一定量のRNAを、(Fuku
daおよびPelus、2001年)に記載のように、1ミリモル濃度のdNTPおよび
RNase阻害剤を含む50マイクロリットルの体積中でランダムプライマー(Prom
ega、Madison、WI)およびMMLV逆転写酵素(Promega)を用いて
逆転写した。DNaseおよびRNase非含有水(Ambion、Austin、TX
)を加え、10ナノグラムのRNA/マクロリットルと同等の最終濃度を得、5マイクロ
リットルをQRT−PCRのために使用した。SYBR Green QRTPCRのた
めのプライマーを設計し、75〜150bpのサイズの増幅産物を作製した。QRT−P
CRを、Platinum SYBR Green qPCR supermix UD
G with Rox(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して、
合計容量30マイクロリットルで、ABI−7000(Applied Biosyst
ems、Carlsbad、CA)において、活性化ステップが50℃で2分間、変性が
95℃で2分間および増幅が95℃で15秒、50℃で30秒、72℃で30秒を45サ
イクルで実施し、その後解離によって唯一の産物が選られたことを確認した。
るものではないが、商品名Celebrex(登録商標)の名前で販売されているセレコ
キシブ(4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール−
1−イル]ベンゼンスルホンアミド);商品名Vioxx(登録商標)の名前で販売され
ているロフェコキシブ(4−(4−メチルスルホニルフェニル)−3−フェニル−5H−
フラン−2−オン);アスピリン(2−アセトキシ安息香酸);エトリコキシブ(5−ク
ロロ−6’−メチル−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2,3’−ビピリジ
ン);商品名Bextra(登録商標)の名前で販売されているバルデコキシブ(4−(
5−メチル−3−フェニルイソオキサゾール−4−イル)ベンゼンスルホンアミド);イ
ブプロフェン((RS)−2−(4−イソブチルフェニル)プロパン酸);ナプロキセン
((+)−(S)−2−(6−メトキシナフタレン−2−イル)プロパン酸);商品名V
oltaren(登録商標)の名前で市販されているジクロフェナク(2−(2−(2,
6−ジクロロフェニルアミノ)フェニル)酢酸);リコフェロン([6−(4−クロロフ
ェニル)−2,2−ジメチル−7−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−ピロリジン−5
−イル]酢酸);インドメタシン(2−{1−[(4−クロロフェニル)カルボニル]−
5−メトキシ−2−メチル−1H−インドール−3−イル}酢酸);商品名Metaca
mの名前で販売されているメロキシカム((8E)−8−[ヒドロキシ−[(5−メチル
−1,3−チアゾール−2−イル)アミノ]メチリデン]−9−メチル−10,10−ジ
オキソ−10λ6−チア−9−アザビシクロ[4.4.0]デカ−1,3,5−トリエン
−7−オン);エトドラク(2−(1,8−ジエチル−4,9−ジヒドロ−3H−ピラノ
[3,4−b]インドール−1−イル)酢酸);商品名Toradolの名前で市販され
ているケトロラク((±)−5−ベンゾイル−2,3−ジヒドロ−1H−ピロリジン−1
−カルボン酸,2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)−1,3−プロパンジオール)な
どの化合物を含む。
定するものではないが、Cayman Chemical Company (Ann
Arbor、MI、U.S.A.)または化学品供給会社によって維持/販売される他の
リストから利用可能な化合物を含む。
じて、Microsoft Excel(Microsoft Corp、Seattl
e、WA)の対応のある、または対応のない両側t検定関数を使用して決定した。本明細
書において使用する場合、特にいくつかの図において、「dmPGE2」と「dmPGE
」という用語は交換可能に使用される。
CD45.1/CD45.2ハイブリッドマウスに移植されたCD45.2およびCD
45.1のコンジェニック移植体を利用する限界希釈競合移植モデルの使用により、HS
PCをPGE2に短期曝露することが、HSPCおよび競合的再構築単位(CRU)の頻
度の長期強化を生み出すことが実証された。ここで図1Aを参照すると、CD45.1ま
たはCD45.2マウス由来の骨髄は、それぞれ、ビヒクルまたはdmPGE2を用いて
処置された。CD45.1/CD45.2ハイブリッド骨髄細胞を競合相手として使用し
た。限界希釈を、致死的に放射線(1100cGys、分割線量)を浴びたCD45.1
/CD45.2ハイブリッドマウスに移植し、PB中のキメラ現象を20週間にわたって
分析した。個々の細胞集団を検出する代表的フロープロットを示す(下段パネル)。
クル(赤色)またはdmPGE2(青色)をパルスした細胞に関する頻度分析(上段)は
、;P0=85,560(ビヒクル)およびP0=23,911(dmPGE2処置)。
PBおよびCRUの分析におけるキメラ現象を、12週において示す(平均±SEM)。
データは2つのプールされた実験を表す、n=5マウス/群/実験であり、それぞれ個別
にアッセイした。
レシピエントにおけるHSPCの頻度分析である。倍数変化は、ビヒクルと比較したdm
PGE2−パルスした細胞の生着頻度において増加を示す。
CSプロットである。ここで図1Dを参照すると、中央のパネルは、一次移植のための多
系統分析(32週、左パネル)および一次移植されたマウスから20週目に移植を受けた
4マウスを、12週間後に分析したコホート(右パネル)である。ビヒクルに対するdm
PGE2処置細胞のキメラ現象の増加は、一次移植に関して20週目(二次移植の時)お
よび二次移植の12週目に示される(下パネル)。20週目の一次移植に関するデータは
、2つのプールされた実験からであり、n=5マウス/群/実験、それぞれ個別にアッセ
イした。12週目の二次移植に関するデータは、n=4マウス/群、それぞれ個別にアッ
セイした。
よびHSPCの拡大を評価している。ex vivoでdmPGE2およびビヒクルへの
曝露された長期再構築細胞(LTRC)の拡大を調査するために、骨髄を、一次移植され
た動物から移植後20週目に採取し、二次レシピエントに移植した。二次移植後12週目
のPBの分析により、移植を受けたすべてのマウスに由来する細胞により多系統の再構成
が示され、一次移植されたLTRCの自己再生を示した。一次移植ドナーにおいて見られ
る、dmPGE2への曝露からもたらされるキメラ現象の増加は、任意の追加の処置をし
なくても二次移植においても見られた。さらに、dmPGE2を用いてすでに処置された
HSPCの競合力が増加する傾向が二次移植において観察され、骨髄細胞系列の再構成に
対してわずかにバイアスがあった。
HSPCの競合力(図1A),ならびに宿主細胞の内因性再構成の定量的比較を可能にす
る。移植12週後に、末梢血(PB)の分析により、ビヒクル処置細胞と比較して、dm
PGE2処置細胞にキメラ現象の増加が示され、HSPC頻度および競合的再構成単位(
CRU)が約4倍増加し、長期再構成能力の測定が認識された(図1B)。移植後に続く
20週間を通して、HSPCの頻度は約4倍の増加を維持し、dmPGE2のパルス曝露
の効果は安定であった(図1C)。移植後32週目に、PB中のBリンパ系列およびTリ
ンパ系列ならびに骨髄系列に関して再構成が見られ、未処置の競合細胞、dmPGE2処
置細胞またはビヒクル処置細胞の間に認識可能な差はなかった(図1D)。
容体を発現する。]
伝えられるところでは、PGE2は、4種の特異的な、高度に保存されたGタンパク質
共役受容体;EP1〜EP4と相互作用する(SugimotoおよびNarumiya
、2007年;Tsuboiら、2002年)。EP受容体のレパートリーは、多重の、
時としてPGE2に起因する逆の応答の原因となる(Breyerら、2001年)。H
SPCにおけるPGE2受容体サブタイプの発現は今まで知られていない。ここで図2A
を参照すると、造血前駆細胞(HPC)に富んだc−kit+Linneg(KL)細胞
およびHSPCに富んだSca−1+c−kit+Linneg(SKL)細胞における
EP受容体の分析は、4種すべてのEP受容体(EP3+、EP2、EP1およびEP4
)が発現されたことを示した。さらにここで図2A(右パネル)を参照すると、QRT−
PCRによりFACSにより選別されたKLおよびSKL細胞中に、4種すべてのEP受
容体に関するmRNAが検出されていた。ここで図2A(中央パネル)を参照すると、E
P3に関する解離曲線はいくつかのピークを示し、EP3の公知の多重スプライス変異体
と一致する(Nambaら、1993年)。KLまたはSKL細胞に関して、任意のEP
受容体サブタイプの表面発現またはmRNAレベルの間に、有意な定量的差異は見られな
かった。ここで図2Bを参照すると、ヒトCD34+UCB細胞の表面において、マウス
細胞の類似体(右パネル)は4種すべての受容体サブタイプを発現し、QRT−PCR分
析により、4種すべてのEP受容体のmRNAが検出されていた(図2B)。
PGE2に対するパルス曝露において観察されるHSPCの生着の強化は、HSPCの
数および/または細胞の促進をもたらす、または宿主の骨髄におけるHSPCのホーミン
グもしくは増殖をもたらす細胞周期状態に起因すると思われる。その原因と無関係に、骨
髄ニッチはHSPCにとって自己再生および増殖に必要であり、これらのニッチへのHS
PCのホーミングだけが長期再構築を提供し得る可能性が非常に高い。さらにここで図3
Aを参照すると、HSPCのホーミングを評価するために、CFSE標識された全骨髄(
WBM)CD45.2細胞は、dmPGE2またはビヒクルを氷上で2時間パルスされ、
洗浄され、致死的に放射線を浴びたCD45.2宿主にIV注射された。16時間後、骨
髄にホーミングするCFSE+細胞の合計およびKLおよびSKL細胞集団内のホーミン
グ事象の数を定量した。総WBM細胞を評価した場合、骨髄へのCFSE+細胞のホーミ
ングのパーセントにおいて、dmPGE2処置細胞およびビヒクル処置細胞の間に差異は
観察されなかったが、対照よりも有意に多くのSKL細胞が骨髄にホーミングした。ここ
で図3Bを参照すると、ビヒクル処置細胞または未操作細胞と比較して、コンジェニック
モデルにおいて、dmPGE2処置細胞に関してSKL細胞の有意により大きなパーセン
トが観察された。未処置細胞およびビヒクル−処置細胞の間にホーミング効率の差は見ら
れなかった。
が直接であったか間接であったかを決定するために、1対1移植モデルにおける豊富なH
SPCのホーミングが他の細胞と比較された。CD45.2およびCD45.1マウスの
両方から高度に精製されたSKL細胞を、FACS選別によって単離し、dmPGE2ま
たはビヒクルを用いて処置し、3×104のビヒクル処置CD45.1細胞+3×104
のdmPGEa処置CD45.2細胞を、CD45.1/CD45.2マウスに移植した
。さらなるコホートに、コンジェニック系を同時に移植し、処置群を交換し、系統のホー
ミングにおける任意のバイアスを試験した。WBMを使用した研究と同様に、精製SKL
細胞のdmPGE2パルス曝露は、それらのホーミング効率を2倍増加させ、HSPCに
対するPGE2の直接効果を強く示唆する。SKL細胞は、均質なHSPC集団ではない
が、SKL細胞は、LTRCに高度に富んでいる(Okadaら、1992年;Span
grudeおよびScollay、1990年)。
MD3100は、ホーミングの強化をブロックする。]
ここで図4Aを参照すると、ストロマ細胞由来因子−1アルファ(SDF−1a)/C
XCR4軸は、HSPCの輸送およびホーミングと関係している。本研究は、dmPGE
2処置HSPCのホーミングの改善は、SDF−1a/CXCR4のシグナル伝達の増加
の結果であったかどうかを評価した。Linneg細胞のdmPGE2に対するパルス曝
露は、KLおよびSKL細胞におけるCXCR4の発現を増加させ(図4A);同様に、
dmPGE2のパルス曝露は、予想通りCD34+UCB細胞におけるCXCR4の発現
を増加させた。QRT−PCRは、ビヒクルと比較してdmPGE2処置細胞においてC
XCR4 mRNAレベルが上昇し、最大の上昇は6時間目に観察されたことを実証した
(データ非掲載)。
ーミングの強化において役割を果たすかどうか決定するために、SDF−1へのin v
itroの遊走およびin vivoのHSPCのホーミングを阻害する選択的CXCR
4アンタゴニストAMD3100が使用された。PGE2のパルス曝露は、SKL細胞の
ホーミングを約2倍増加させ、ビヒクルまたはdmPGE2をパルスされた細胞をAMD
3100と一緒にインキュベートすることによりSKL細胞のホーミングは減少し、dm
PGE2パルス細胞のホーミング効率の改善は抑制された。
せる。]
PGE2処置は、HSPCの頻度およびCRUを4倍増加させる(図1)が、ホーミン
グはわずか2倍強化され(図3)、他の事象が生着の強化に関与していることを示唆する
。アポトーシスは、正常な造血または悪性の造血において重要な制御過程であり、PGE
2は抗アポトーシスシグナル伝達に関係している。さらに、EP受容体の下流シグナル伝
達分子であるcAMPの活性化は、CD34+細胞においてアポトーシスを阻害する。こ
れらの結果に一致する1つの仮説は、dmPGE2処置が、HSPCの生存および/また
は増殖に影響を与え、生着の強化に寄与するというものである。HSPCの生存に対する
dmPGE2の効果を評価するために、Linneg細胞に、0.1ナノモル濃度〜1マ
イクロモル濃度のdmPGE2またはビヒクルをパルスし、成長因子を含まない低血清培
養培地において培養した。dmPGE2に対するパルス曝露は、用量依存性様式でSKL
細胞においてアポトーシスを低下させ(図5A)1マイクロモル濃度で約65%の阻害に
達した。
胞の両方において、アポトーシスおよび増殖の重要な制御因子である。ここで図5Bを参
照すると、これらの結果が、PGE2がHSPCにおいてサバイビンに影響を与えたこと
を実証している。dmPGE2のパルス24時間後、細胞内サバイビンレベルは、対照と
比較して、マウスのSKL細胞およびCD34+UCB細胞の両方において有意に高く(
それぞれ1.7および2.4倍)、QRT−PCR分析により、対照と比較してサバイビ
ンmRNAの上昇が示された。
ーゼ−3の減少が、SKL細胞をdmPGE2に曝露後24、48および72時間におい
て見られた。
サバイビンは、HSPCが細胞周期に進入し、進行することを制御する。さらに、HS
PCの増殖および自己再生に関係するβ−カテニンは、EP受容体経路の下流に位置する
。これらの細胞周期制御因子を調節するPGE2の能力は、HSPCの自己再生および増
殖における増加が、dmPGE2をパルスされた細胞の生着の強化に寄与しうることを示
唆している。この仮説を試験するために、in vitroでdmPGE2またはビヒク
ルをパルスされたSKL細胞の細胞周期状態を分析した。ここで図6Aを参照すると、d
mPGE2に対するパルス曝露が、細胞循環の増加の指標である、SKL細胞中のDNA
含有量を増加させた(左パネル、右上の象限)。3つの実験において、対照と比較してd
mPGE2処置後に60%を超えるSKL細胞が細胞周期のS+G2/M期にあった(図
6A、右パネル)。KLまたはLinneg細胞の細胞周期速度に関して有意な効果は見
られず(非掲載)、dmPGE2が初期HSPCのサイクル状態を選択的に増加させるこ
とを示唆している。
を確認するために、骨髄細胞にdmPGE2をパルスし、移植後BrdUを用いて処置し
たコンジェニックマウスに注射し、16時間後、ドナーのBrdU+SKL細胞の一部を
決定した。ここで図6Bを参照すると、S+G2/M期にあるホーミングしたSKL細胞
の一部において約2倍の増加が、移植前dmPGE2をパルスした細胞に関して観察され
、HSPCのdmPGE2に対する短期曝露が、in vivoでHSPCが細胞周期に
進入し、進行することを刺激することが確認された。
による、PGE2の内因性生合成の阻害]
PGE2は、CXCR4受容体の発現を増加させるので、骨髄において、SDF−1/
CXCR4のシグナル伝達はHSPCの輸送および保有にとって重要である。これらの結
果と一致する1つの仮説は、COX1/COX2二重阻害剤のインドメタシンによるPG
E2の内因性生合成の阻害もまたHSPCを動員することである。ここで図7Aおよび7
Bを参照すると、図7Aおよび7Bは、150μg/kgのインドメタシンまたは150
ug/kgのバイカレインを単独で(図7A)またはG−CSFと一緒に(図7B)4日
間、毎日SC投与することによる、CFU−GMの動員に関する効果を示す。ここで図7
Aを参照すると、150μg/kgのインドメタシンをSCで1日1回4日間の投与する
ことにより、動員される前駆細胞の数が4倍増加した。ここで図7Bを参照すると、イン
ドメタシンとG−CSFとを同時投与することにより、末梢血幹細胞の動員において高度
に相乗的な増加が起こった。リポキシゲナーゼの阻害剤であるバイカレインは、ベースラ
インまたはG−CSF誘導性CFU−GM動員に関して効果を有さず、観察された効果が
、シクロオキシゲナーゼ経路の阻害に特異的であったことを示唆する。データは、それぞ
れ個別にアッセイしたN=3マウスに関する、動員されたCFU−GM/血液mlの平均
±SEMを表す。
CR4の発現が増加する。]
CXCR4を評価するために、Lineagenegマウスの骨髄細胞またはCD34
+UCBを、1マイクロモル濃度のdmPGE2またはビヒクル対照のどちらかを用いて
2時間氷上で処置し、洗浄し、次いでRPMI−1640/10%HI−FBS中で37
℃において24時間培養し、SKL(マウス細胞)またはCD34(ヒト)およびCXC
R4に関して染色し、FACSにより分析した。ここで図4Aを参照すると、dmPGE
2を用いて処置後24時間のKLおよびSKL細胞ならびにヒトCD34+UCB細胞に
おけるCXCR4の発現である。データは、dmPGE2またはビヒクルを用いた処置に
よる、CXCR4の平均蛍光強度(MFI)の変化の平均±SEMで表す(n=3)。Q
RT−PCRによる分析で、CXCR4mRNAの2.65倍の増加が実証される。
走を増加させる。]
新たに単離されたLineagenegマウス骨髄細胞に、dmPGE2またはビヒク
ルを2時間パルスし、洗浄し、10%HI−FCSを含む培地に再懸濁し、37℃におい
て16時間培養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、RPMI/0.5%BSA
に再懸濁し、トランスウェルにおいてrmSDF−1αに4時間遊走させた。細胞遊走の
合計を、フローサイトメトリにより測定した。ここで図9を参照すると、SKL細胞遊走
の合計は、dmPGE2をパルスした細胞がより高かった。データは、3つの実験に関す
る遊走パーセントの平均±SEMである。ビヒクルを用いて処置した細胞と比較したdm
PGE2処置細胞に関して、†P<0.05。
の遊走を増加させる。]
新たに単離されたUCB CD34+細胞に、dmPGE2またはビヒクルを2時間パ
ルスし、洗浄し、10%HI−FCSを含む培地に再懸濁し、37℃において16時間培
養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、RPMI/0.5%BSAに再懸濁し、
rhSDF−1への遊走をフローサイトメトリにより測定した。遊走アッセイの前に、C
XCR4受容体をブロックするために、複製細胞を、5マイクログラム/mlのAMD3
100と共に30分間インキュベートした。ここで図10を参照すると、データは、3つ
の実験に関する遊走パーセントの平均±SEMである。
PGE2による強化がブロックされる。]
ホーミングにおけるCXCR4の役割を評価するために、LineagenegCD4
5.2細胞を、ビヒクルまたは1マイクロモル濃度のdmPGE2+10マイクロモル濃
度のAMD3100を用いて処置し、2×106の処置細胞を、致死的に放射線を浴びた
CD45.1マウスに注射し、移植後16時間でホーミングしたSKL細胞を回収しFA
CSにより分析した。ここで図11を参照すると、10マイクロモル濃度のAMD310
0不在下または存在下の、ビヒクルおよびdmPGE2処置細胞の骨髄へのホーミング効
率である。ホーミングアッセイの前に、細胞を、AMD3100と共に30分間インキュ
ベートした。
させる。]
Lineageneg細胞を、ビヒクルまたは1マイクロモル濃度のdmPGE2どち
らかを用いて2時間処置し、洗浄し、rmSCF、rhFlt3およびrhTpoを含む
培地において培養した。20時間後、細胞を、SKLおよびHoechst−33342
およびPyronin−Yに対して染色した。細胞周期におけるSKL細胞の割合を、F
ACSにより測定した。ここで図12を参照すると、ゲーティングされたSKL細胞の細
胞周期分布を示す代表的フロープロットであり、それぞれ個別にアッセイした平均±SE
M、n=9マウスの3つの実験による、ビヒクル対照と比較した、dmPGE2処置細胞
に関する細胞周期における倍数増加を組み合わせたデータである。細胞周期におけるSK
L細胞の割合を、FACSにより測定した。ゲーティングされたSKL細胞の細胞周期分
布を示す代表的フロープロットであり、それぞれ個別にアッセイした平均±SEM、n=
9マウスの3つの実験による、ビヒクル対照と比較した、dmPGE2処置細胞に関する
細胞周期における倍数増加を組み合わせたデータである。
SLAM)SKL細胞の細胞周期速度を増加させる。]
ここで図8を参照すると、ビヒクルまたは1マイクロモル濃度のdmPGE2どちらか
を用いて2時間処置し、成長因子(50ng/mlのrmSCF、それぞれ100ng/
mlのrhFlt−3およびrhTPO)の存在下で20時間培養し、SLAM SKL
、Hoechst−33342およびPyronin−Yに対して染色し、細胞周期のG
0、G1、SおよびG2/M期にあるSLAM SKL細胞の割合を、FACSによるD
NAおよびRNA含有量の定量化によって決定したLinneg骨髄細胞を使用して収集
したデータを要約した表である。データは、それぞれ個別にアッセイしたn=9マウスに
関する平均±SEMである。(b)G1+S+G2Mにある細胞のパーセント;n=9マ
ウスに関する組み合わせデータ。(*)ビヒクル対照と比較してP<0.05。
の増殖および細胞周期速度を増加させる。]
CD45.1Lineageneg骨髄細胞を、dmPGE2またはビヒクルを用いて
処置し、致死的に放射線を浴びたCD45.2マウスに移植した。移植直後、BrdUを
飲料水中に提供し、IP注射によって投与した。16時間後骨髄を分析し、BrdU+で
あったCD45.1+、SKL細胞の割合を、FACS分析により分析した。ここで図1
3を参照すると、CD45.1Linneg骨髄細胞をdmPGE2またはビヒクルを用
いて処置し、致死的に放射線を浴びたCD45.2マウスに移植した。移植直後、Brd
Uを飲料水中に提供し、IP注射によって投与した。16時間後骨髄を分析し、BrdU
+であったCD45.1+、SKL細胞の割合を、FACS分析により分析した。PGE
2を用いて処置したSKL細胞がより高い割合で骨髄にホーミングした。データは、平均
±SEM、n=5/マウス/群であり、それぞれ個別にアッセイした。
1対1競合分析のために、CD45.1およびCD45.2マウス由来のWBMを、ビ
ヒクルまたはdmPGE2を用いて処置し、様々な割合で2×105のCD45.1/C
D45.2マウス由来の競合骨髄細胞と混合し、致死的に放射線を浴びたCD45.1/
CD45.2マウスに移植した。PB中のCD45.1、CD45.2およびCD45.
1/CD45.2細胞の割合を、月1回決定した。二次、三次および四次移植のために、
1:1比ですでに移植されたCD45.1/CD45.2マウス由来の2×106のWB
Mを、致死的に放射線を浴びたCD45.1/CD45.2マウスに非競合的様式で注射
した。PB中のCD45.1、CD45.2およびCD45.1/CD45.2細胞の割
合を、月1回決定した。ここで図14を参照すると、一次移植の20週目(二次移植の時
)およびサブコホートにおける32週目(二次移植の12週目分析の時)、二次移植の1
2週および24週目、三次および四次移植も同様にそれぞれ12週目に関する、dmPG
E2処置細胞対ビヒクルのキメラ現象の増加である。20週の一次移植に関するデータは
、それぞれ個別にアッセイした、n=5マウス/群/実験の2つのプールした実験からで
ある。二次、三次および四次移植に関するデータは、それぞれ個別にアッセイした、n=
5マウス/群からである。
員レジメン。]
マウスに、ゼラチン中の150マイクログラム/kgのインドメタシンまたは150マ
イクログラム/kgのバイカレイン(リポキシゲナーゼ阻害剤)を、G−CSFと共に、
または無しで48時間ごとに4日間のSC処置を与えた。CFU−GMの動員を、すでに
記載のように決定した(Pelusら、Experimental Hematolog
y33巻(2005年)295〜307頁)。ここで図7Aおよび7Bを参照すると、シ
クロオキシゲナーゼ二重阻害剤のインドメタシンおよびG−CSFの併用は、マウスHS
PCを相乗的に動員している。150μg/kgインドメタシンまたは150ug/kg
のバイカレイン(リポキシゲナーゼ阻害剤)を単独で(図7A)、またはG−CSFと一
緒に(図7B)4日間、毎日SC投与することによるCFU−GMの動員に関する効果で
ある。データは、それぞれアッセイした、N=3マウスの動員されたCFU−GM/血液
mlの平均±SEMとして表す。
はG−CSF+インドメタシン(50マイクログラム/マウス)を4日間、1日2回の(
bid)SC注射で毎日与えられた。CFU−GMの動員を記載(Pelusら、Expe
rimental Hematology 33巻(2005年)295〜307頁)の
ように決定した。併用して処置されたマウスは、G−CSFだけで処置された動物よりも
CFU−GM/単位においてより大きな倍数増加を実証した。
CS分析によりHSPCに関して分析した。SKLおよびSLAM−SKLの検出のため
に、細胞を、Sca−1−PE−Cy7、c−kit−APC、CD150−PECy5
、CD48−FITC、Lineage Cocktail−Biotinを用いて染色
し、ストレプトアビジン−APC−Cy7を用いて二次染色した。ここで図17を参照す
ると、分析は、BD−LSRIIにおいて実施された。G−CSFまたはG−CSFおよ
びインドメタシンの併用により処置されたマウスの末梢血において、表現型的に規定され
たHSPCのフローサイトメトリ分析である。それぞれ個別にアッセイされたN=5マウ
ス/群。
マウスに、ビヒクルまたはインドメタシン(50マイクログラム/マウス)を、4日間
毎日、1日2回(bid)SC注射した。5日目に、マウスに、ビヒクルまたはAMD31
00(5mg/kg)のどちらかを与えた。1時間後、マウスを犠牲にし、CFU−GM
の動員を、先に記載(Pelusら、Experimental Hematology
33巻(2005年)295〜307頁)のように決定した。ここで図18を参照する
と、ビヒクルまたはインドメタシン処置単独によるCFU−GMの動員である(左パネル
)。AMD3100またはインドメタシン処置+AMD3100の単回投与によるCFU
−GMの動員のグラフである(右パネル)。データは、それぞれ個別にアッセイされたN
=5マウス/群の平均±SEMとして表す。
マウスを、ビヒクル、インドメタシン(50マイクログラム/マウス、1日2回SC、
4日間)、AMD3100(5mg/kg、5日目)、G−CSF(1マイクログラム/
マウス、1日2回SC、4日間)、AMD3100+GROβ(それぞれ、5ミリグラム
/kgおよび20ミリグラム/kg、5日目)、AMD3100+インドメタシン(イン
ドメタシン50マイクログラム/マウス、1日2回4日間;AMD3100 5ミリグラ
ム/kg 5日目)またはG−CSF+インドメタシン(それぞれ、1マイクログラムお
よび50マイクログラム、1日2回SC、4日間)により処置した。CFU−GMの動員
を、先に記載(Pelusら、Experimental Hematology 33
巻(2005年)295〜307頁)のように決定した。ここで図19を参照すると、上
に要約した様々な処置レジメンに関してプロットしたCFU−GM/末梢血mLである。
間)、G−CSF+インドメタシン(50マイクログラム/マウス、1日2回 SC、4
日間)またはG−CSF+メロキシカム(0.3mg/kg、1日2回 SC、4日間)
により処置した。CFU−GMの動員を、先に記載(Pelusら、 Experime
ntal Hematology 33巻(2005年)295〜307頁)のように決
定した。ここで図20を参照すると、インドメタシン+G−CSFおよび同様に作用する
NSAIDのメロキシカム+G−CSFにより誘導される動員の比較を例示する棒グラフ
である。データは、それぞれ個別にアッセイされた、n=5マウス/群の平均±SEMと
して表す。
におけるCXCR4の発現の回復が可能になる。]
CD45.1マウスを、G−CSF(1マイクログラム/マウス、1日2回、SC、4
日間)またはG−CSF+インドメタシン(50マイクログラム/マウス、1日2回、S
C、4日間)を用いて動員し、末梢血単核細胞(PBMC)を5日目に採取した。PBM
Cを、様々な比率でCD45.2骨髄と混合し、致死的に放射線を浴びた(1100cG
y、分割線量)CD45.2マウスに移植した。ここで図21を参照すると、移植後12
週目の競合的再構築単位を示す(左パネル)。データは、それぞれ個別にアッセイされた
N=5マウス/群/実験の2つの実験から、平均±SEMとして表す。G−CSF単独と
比較して、インドメタシンとG−CSFとの同時投与により動員されたPBMCの生着に
改善がなかったので、ホーミングの欠損は、CXCR4受容体の発現の減少の結果として
起こると思われ、これは、インドメタシン処置とG−CSF処置とに時間差を与えること
によって緩和できるという仮説を立てた。CD45.2マウスを、G−CSF(1マイク
ログラム/マウス、1日2回、SC、4日間)、時間差無しのG−CSF+インドメタシ
ン(50マイクログラム/マウス、1日2回、SC、4日間)、1日の時間差のG−CS
F+インドメタシン(インドメタシンを1日目に開始し4日間与え、G−CSFをインド
メタシン処置の2日目から開始して4日間与え、PBMSの採取前に、G−CSFを与え
るが、インドメタシンは与えない日を1日作る)または2日の時間差のG−CSF+イン
ドメタシン(インドメタシンを1日目に開始し4日間与え、G−CSFをインドメタシン
処置の3日目から開始して4日間与え、PBMSの採取前に、G−CSFを与えるが、イ
ンドメタシンは与えない日を2日作る)により動員した。ここで図21を参照すると(右
パネル)、SKL細胞におけるCXCR4の発現を示す。データは、それぞれ個別にアッ
セイされた、N=5マウス/群の平均±SEMとして表す。
独により動員されたPBSCと比較して、有意に強化された長期幹細胞機能を示す。]
CD45.1マウスを、G−CSFまたはG−CSF+インドメタシン(1日ずらして
)を用いて動員し、PBMCを、CD45.2競合骨髄細胞と共に致死的に放射線を浴び
たCD45.2マウスに移植した。ここで図22を参照すると、移植後12週目における
、複数ドナーのキメラ現象:競合相手の比(左パネル)および競合的再構築単位(右パネ
ル)を示す。データは、それぞれ個別にアッセイされた、n=5マウス/群の平均±SE
Mとして表す。
的に放射線を浴びたマウスに移植した場合、G−CSF単独により動員されたPBSCと
比較して、末梢血好中球のカウントがより早く復元される。]
マウスを、G−CSFまたはG−CSF+メロキシカム(1日ずらして)を用いて動員
し、2×106のPBMCを、致死的に放射線を浴びたレシピエントに移植した。血中好
中球を、Hemavet950FS(Drew Scientific)により、(対照
のサブセットと比較して)完全に回復するまで1日おきに数えた。血中血小板を、Hem
avet950FS(Drew Scientific)により、(対照のサブセットと
比較して)完全に回復するまで1日おきに数えた。ここで図23を参照すると、末梢血(
PB)中の好中球は、(対照のサブセットと比較して)完全に回復するまで1日おきに数
えられた。これらのデータは、それぞれ個別にアッセイされた、n=10マウス/群の平
均±SEMとして表す。ここで図24を参照すると、末梢血(PB)中の血小板は(対照
のサブセットと比較して)完全に回復するまで1日おきに数えられた。これらのデータは
、それぞれ個別にアッセイされた、n=10マウス/群の平均±SEMとして表す。
決定]
ここで図25を参照すると、ヒヒの第1群を、以下の10ug/体重kgのG−CSF
の投与レジメン処置を用いて動員し、次いで2週間の洗い流し期間後に、動物を、10u
g/kgのG−CSF+0.1mg/kgのメロキシカムを用いて処置した。ヒヒの第2
群を、以下の10ug/kgのG−CSF+0.1mg/kgのメロキシカムのレジメン
を用いて動員し、2週間の洗い流し期間後、10ug/kgのG−CSFを用いる期間で
あった。ここで図26を参照すると、PB中のCD34+細胞がFACS分析により決定
され、先に記載のようにCFU−GM/血液mlを決定した。G−CSFとメロキシカム
との同時投与は、CD34+細胞の動員を増加させ(左パネル)、取り出した血液単位当
たりのCFU−GMを測定した。
酵素両方の阻害を必要とする。]
マウスを、G−CSF用いて動員し、PB中のCFU−GMを、G−CSFおよび様々
なNSAIDS(アスピリン[COX−1およびCOX−2];リコフェロン[COX−
2および5−LOX];SC−560[COX1];サリチル酸バレリル[COX−1]
;バルデコキシブ[COX−2];NS−398[COX−2])との併用による動員レ
ジメンと比較した。ここで図27を参照すると、これら試験の結果が要約されており、こ
れらのデータは、それぞれ個別にアッセイされた、n=4マウス/群の平均±SEMとし
て表される。COX1および2の両方を阻害することが公知である化合物は、2種のアイ
ソザイムの1種だけに対して高度に選択性であると思われる化合物より、コロニー形成細
胞の動員においてより優れていた。2種の一般的に使用されるCOX阻害剤の効率を試験
するために、マウスを、G−CSFまたはG−CSFと、アスピリンまたはイブプロフェ
ンとの併用により動員した(PO、1日2回、4日間)。CFU−GMを先に記載のよう
に決定した。ここで図28を参照すると、G−CSF+アスピリンおよびG−CSF+イ
ブプロフェンによる、CFU−GMの末梢血への動員の用量反応分析は、G−CSFだけ
で処置したマウスの対照群;G−CSF+10、20または40ミリグラム/kgのアス
ピリンを用いて処置したマウス;およびG−CSF+10、20または40ミリグラム/
kgのイブプロフェンを用いて処置したマウスに関して棒グラフの形態で提示される。デ
ータは、それぞれ個別にアッセイされた、n=4マウス/群の平均±SEMとして表す。
マウスを、G−CSFおよび以下のメロキシカム用量、メロキシカムに対して0.0(
対照)、0.02、0.2、0.5、1.5および3ミリグラム/体重kgを用いて動員
し(1日2回、SC、4日間)、CFU−GMを先に記載のように決定した。ここで図2
9を参照するとHSPCに対するメロキシカムの用量反応は、動物の末梢血、または動物
の骨髄において測定された(図30)。これらのデータは、それぞれ個別にアッセイされ
た、n=3マウス/群の平均±SEMとして表す。
示として考えるべきであり、特徴を限定するものではなく、好ましい実施形態が示され説
明されただけで、新規の技術の精神の範囲内で思いつくすべての変更および改良は、保護
されることが望ましいと理解されるべきである。同様に、新規の技術を、特定の実施例、
理論的議論、根拠および図解を使用して例示したが、これらの例示および添付の考察は、
決して技術を限定するように解釈されない。本出願において参照したすべての特許、特許
出願およびテキスト、科学論文、刊行物に対する参考文献などは、参照によりそれらの全
体が本明細書に組み込まれる。
示として考えるべきであり、特徴を限定するものではなく、好ましい実施形態が示され説
明されただけで、新規の技術の精神の範囲内で思いつくすべての変更および改良は、保護
されることが望ましいと理解されるべきである。同様に、新規の技術を、特定の実施例、
理論的議論、根拠および図解を使用して例示したが、これらの例示および添付の考察は、
決して技術を限定するように解釈されない。本出願において参照したすべての特許、特許
出願およびテキスト、科学論文、刊行物に対する参考文献などは、参照によりそれらの全
体が本明細書に組み込まれる。
本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
造血幹細胞および/または前駆細胞の供給源を特定するステップ、
PGE 2 の活性を減少させる化合物を提供するステップ、ならびに
造血幹細胞および/または前駆細胞の供給源と、前記細胞および周辺のPGE 2 活性を
減少させる有効量の前記化合物とを接触させるステップ、
を含む、造血幹細胞および前駆細胞の動員を強化する方法。
[2]
PGE 2 活性を減少させる化合物が非ステロイド系抗炎症性化合物である、請求項1に
記載の方法。
[3]
非ステロイド系抗炎症性化合物が、シクロオキシゲナーゼ−1およびシクロオキシゲナ
ーゼ−2の両方に作用する、請求項2に記載の方法。
[4]
非ステロイド系抗炎症性化合物が、主にシクロオキシゲナーゼ−2に作用する、請求項
3に記載の方法。
[5]
非ステロイド系抗炎症性化合物が、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、エト
リコキシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、エトド
ラク、ケトロラクおよびリコフェロンからなる群から選択される、請求項2に記載の方法
。
[6]
非ステロイド系抗炎症性化合物がインドメタシンである、請求項2に記載の方法。
[7]
非ステロイド系抗炎症性化合物がメロキシカムある、請求項2に記載の方法。
[8]
非ステロイド系抗炎症性化合物が、造血幹細胞および前駆細胞の動員を強化する少なく
とも1種の追加の化合物との同時処置で、オーバーラップした期間患者に投与される、請
求項2に記載の方法。
[9]
造血幹細胞および/または前駆細胞の動員を強化する追加の化合物が、G−CSFおよ
びプレリキサフォルからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
[10]
非ステロイド系抗炎症性化合物が少なくとも3日間患者に投与される、請求項2に記載
の方法。
[11]
少なくとも1種のPGE 2 受容体のアンタゴニストである化合物を提供するステップ、
ならびに
ドナーから造血幹細胞および前駆細胞を採取する前に、有効量の前記化合物を造血幹細
胞および/または前駆細胞ドナーに投与するステップ、
を含む、ドナー由来の造血幹細胞および/または前駆細胞の動員を強化する方法。
[12]
少なくとも1種のPGE 2 受容体のアンタゴニストが、N−[[4’−[[3−ブチル
−1,5−ジヒドロ−5−オキソ−1−[2−(トリフルオロメチル)フェニル]−4H
−1,2,4−トリアゾール−4−イル]メチル][1,1’−ビフェニル]−2−イル
]スルホニル]−3−メチル−2−チオフェンカルボキシアミドおよび4−(4,9−ジ
エトキシ−1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H−ベンズ[f]イソインドール−2−イ
ル)−N−(フェニルスルホニル)−ベンゼンアセトアミドからなる群から選択される、
請求項11に記載の方法。
[13]
供給源においてPGE 2 活性を減少させる少なくとも1種の化合物を用いて処置された
、当該供給源由来の造血幹細胞および/または前駆細胞を含む細胞の群を採取するステッ
プ、
造血幹細胞および前駆細胞のセットと、PGE 2 活性とをex vivoにおいて接触
させるステップ、および
in vivoにおいてPGE 2 活性を有する前記化合物と接触させた、前記造血幹細
胞および前駆細胞をレシピエント内に移植するステップ、
を含む、レシピエントにおいて造血幹細胞および/または前駆細胞の生着を強化する方法
。
[14]
造血幹細胞および前駆細胞の供給源が、骨髄ドナーから取り出される骨髄の試料である
、請求項13に記載の方法。
[15]
造血幹細胞および前駆細胞の供給源が、血液ドナーから取り出される血液の試料である
、請求項13に記載の方法。
[16]
細胞の供給源が、臍帯または胎盤である、請求項13に記載の方法。
[17]
PGE 2 活性を有する化合物を提供するステップ、ならびに
PGE 2 活性を有する化合物と、造血幹細胞および前駆細胞の集団をex vivoで
接触させるステップ、
を含む、造血幹細胞および前駆細胞の生着率を増加させる方法。
[18]
PGE 2 活性を有する化合物が、PGE 2 またはdmPGE 2 からなる群から選択され
る、請求項17に記載の方法。
[19]
PGE 2 活性を有する化合物が、細胞集団と少なくとも1時間接触する、請求項17に
記載の方法。
[20]
PGE 2 活性を有する化合物と接触させた細胞集団の少なくとも一部を、実質的にPG
E 2 活性を有さない緩衝液を用いて、少なくとも1回洗浄するステップをさらに含む、請
求項17に記載の方法。
[21]
PGE 2 活性を有する化合物と接触させた細胞集団の少なくとも一部を、患者内に導入
するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
[22]
形質導入のための少なくとも1種の対象遺伝子を含有するウィルスベクターを提供する
ステップ、
有効量の、PGE 2 活性を有する分子によってex vivoにおいて処置された少な
くとも1種の幹細胞を供給するステップ、および
ウィルスベクターで、PGE 2 活性を有する分子によって処置された幹細胞をトランス
フェクションするステップ、
を含む、幹細胞におけるウィルス導入効率を強化する方法。
[23]
PGE 2 活性を有する分子が、EシリーズのプロスタグランジンおよびEシリーズのプ
ロスタグランジンのジメチル誘導体からなる群から選択される、請求項22に記載の方法
。
[24]
PGE 2 活性を有する分子が、PGE 2 およびdmPGE 2 からなる群から選択される
、請求項22に記載の方法。
[25]
PGE 2 活性を有する分子を提供するステップ、
造血幹細胞または前駆細胞の移植レシピエントを特定するステップ、および
治療有効量の、PGE 2 を有する分子を、移植レシピエントに投与するステップ、
を含む、移植レシピエントにおいて造血幹細胞および/または前駆細胞の生存を強化する
方法。
[26]
PGE 2 活性を有する分子が、EシリーズのプロスタグランジンおよびEシリーズのプ
ロスタグランジンのジメチル誘導体からなる群から選択される、請求項25に記載の方法
。
[27]
PGE 2 活性を有する分子が、PGE 2 およびdmPGE 2 からなる群から選択される
、請求項25に記載の方法。
Claims (27)
- 造血幹細胞および/または前駆細胞の供給源を特定するステップ、
PGE2の活性を減少させる化合物を提供するステップ、ならびに
造血幹細胞および/または前駆細胞の供給源と、前記細胞および周辺のPGE2活性を
減少させる有効量の前記化合物とを接触させるステップ、
を含む、造血幹細胞および前駆細胞の動員を強化する方法。 - PGE2活性を減少させる化合物が非ステロイド系抗炎症性化合物である、請求項1に
記載の方法。 - 非ステロイド系抗炎症性化合物が、シクロオキシゲナーゼ−1およびシクロオキシゲナ
ーゼ−2の両方に作用する、請求項2に記載の方法。 - 非ステロイド系抗炎症性化合物が、主にシクロオキシゲナーゼ−2に作用する、請求項
3に記載の方法。 - 非ステロイド系抗炎症性化合物が、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、エト
リコキシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、エトド
ラク、ケトロラクおよびリコフェロンからなる群から選択される、請求項2に記載の方法
。 - 非ステロイド系抗炎症性化合物がインドメタシンである、請求項2に記載の方法。
- 非ステロイド系抗炎症性化合物がメロキシカムある、請求項2に記載の方法。
- 非ステロイド系抗炎症性化合物が、造血幹細胞および前駆細胞の動員を強化する少なく
とも1種の追加の化合物との同時処置で、オーバーラップした期間患者に投与される、請
求項2に記載の方法。 - 造血幹細胞および/または前駆細胞の動員を強化する追加の化合物が、G−CSFおよ
びプレリキサフォルからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。 - 非ステロイド系抗炎症性化合物が少なくとも3日間患者に投与される、請求項2に記載
の方法。 - 少なくとも1種のPGE2受容体のアンタゴニストである化合物を提供するステップ、
ならびに
ドナーから造血幹細胞および前駆細胞を採取する前に、有効量の前記化合物を造血幹細
胞および/または前駆細胞ドナーに投与するステップ、
を含む、ドナー由来の造血幹細胞および/または前駆細胞の動員を強化する方法。 - 少なくとも1種のPGE2受容体のアンタゴニストが、N−[[4’−[[3−ブチル
−1,5−ジヒドロ−5−オキソ−1−[2−(トリフルオロメチル)フェニル]−4H
−1,2,4−トリアゾール−4−イル]メチル][1,1’−ビフェニル]−2−イル
]スルホニル]−3−メチル−2−チオフェンカルボキシアミドおよび4−(4,9−ジ
エトキシ−1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H−ベンズ[f]イソインドール−2−イ
ル)−N−(フェニルスルホニル)−ベンゼンアセトアミドからなる群から選択される、
請求項11に記載の方法。 - 供給源においてPGE2活性を減少させる少なくとも1種の化合物を用いて処置された
、当該供給源由来の造血幹細胞および/または前駆細胞を含む細胞の群を採取するステッ
プ、
造血幹細胞および前駆細胞のセットと、PGE2活性とをex vivoにおいて接触
させるステップ、および
in vivoにおいてPGE2活性を有する前記化合物と接触させた、前記造血幹細
胞および前駆細胞をレシピエント内に移植するステップ、
を含む、レシピエントにおいて造血幹細胞および/または前駆細胞の生着を強化する方法
。 - 造血幹細胞および前駆細胞の供給源が、骨髄ドナーから取り出される骨髄の試料である
、請求項13に記載の方法。 - 造血幹細胞および前駆細胞の供給源が、血液ドナーから取り出される血液の試料である
、請求項13に記載の方法。 - 細胞の供給源が、臍帯または胎盤である、請求項13に記載の方法。
- PGE2活性を有する化合物を提供するステップ、ならびに
PGE2活性を有する化合物と、造血幹細胞および前駆細胞の集団をex vivoで
接触させるステップ、
を含む、造血幹細胞および前駆細胞の生着率を増加させる方法。 - PGE2活性を有する化合物が、PGE2またはdmPGE2からなる群から選択され
る、請求項17に記載の方法。 - PGE2活性を有する化合物が、細胞集団と少なくとも1時間接触する、請求項17に
記載の方法。 - PGE2活性を有する化合物と接触させた細胞集団の少なくとも一部を、実質的にPG
E2活性を有さない緩衝液を用いて、少なくとも1回洗浄するステップをさらに含む、請
求項17に記載の方法。 - PGE2活性を有する化合物と接触させた細胞集団の少なくとも一部を、患者内に導入
するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。 - 形質導入のための少なくとも1種の対象遺伝子を含有するウィルスベクターを提供する
ステップ、
有効量の、PGE2活性を有する分子によってex vivoにおいて処置された少な
くとも1種の幹細胞を供給するステップ、および
ウィルスベクターで、PGE2活性を有する分子によって処置された幹細胞をトランス
フェクションするステップ、
を含む、幹細胞におけるウィルス導入効率を強化する方法。 - PGE2活性を有する分子が、EシリーズのプロスタグランジンおよびEシリーズのプ
ロスタグランジンのジメチル誘導体からなる群から選択される、請求項22に記載の方法
。 - PGE2活性を有する分子が、PGE2およびdmPGE2からなる群から選択される
、請求項22に記載の方法。 - PGE2活性を有する分子を提供するステップ、
造血幹細胞または前駆細胞の移植レシピエントを特定するステップ、および
治療有効量の、PGE2を有する分子を、移植レシピエントに投与するステップ、
を含む、移植レシピエントにおいて造血幹細胞および/または前駆細胞の生存を強化する
方法。 - PGE2活性を有する分子が、EシリーズのプロスタグランジンおよびEシリーズのプ
ロスタグランジンのジメチル誘導体からなる群から選択される、請求項25に記載の方法
。 - PGE2活性を有する分子が、PGE2およびdmPGE2からなる群から選択される
、請求項25に記載の方法。
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