ES2845641T3 - Materiales y métodos para mejorar procedimientos de injerto funcionante de células madre hematopoyéticas - Google Patents

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Abstract

Un método para mejorar la eficacia de la transducción viral en una población de células madre hematopoyéticas para terapia génica, que comprende: poner en contacto ex vivo una población de células madre hematopoyéticas con un vector viral que contiene al menos un gen de interés para la transducción, en el que la población de células madre hematopoyéticas que se van a poner en contacto con el vector viral se ha puesto en contacto ex vivo con una cantidad eficaz de una molécula que tiene actividad de PGE2.

Description

DESCRIPCIÓN
Materiales y métodos para mejorar procedimientos de injerto funcionante de células madre hematopoyéticas
Campo de invención
Los aspectos y la realización divulgados en el presente documento están relacionados con materiales y métodos para mejorar la eficacia de la transducción viral. También se divulgan en el presente documento métodos para mejorar el injerto funcionante de células madre y progenitoras hematopoyéticas.
Antecedentes
El trasplante de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) es una terapia probada para el tratamiento de determinadas enfermedades hematológicas malignas y no malignas y trastornos metabólicos. Las fuentes de HSPC para trasplante incluyen médula ósea, sangre periférica movilizada y sangre del cordón umbilical (UCB) (Goldman and Horowitz, 2002; Fruehauf and Seggawiss, 2003: Broxmeyer, et al., 2006). Los médicos realizan habitualmente trasplantes de médula ósea, células madre de sangre periférica movilizadas y sangre de cordón umbilical. Estos procedimientos requieren que se recolecte una cantidad suficiente de células madre y progenitoras hematopoyéticas de donantes normales sanos o de pacientes antes de que desarrollen una afección determinada o mientras están en remisión. Los materiales recolectados se administran posteriormente a pacientes cuyo sistema hematopoyético y presumiblemente sus tejidos y células enfermos o malformados han sido erradicados. Posterior al trasplante, las células madre trasplantadas viajan a o “retornan” a los nichos apropiados del microambiente de la médula ósea, se alojan dentro de esos nichos, proliferan y producen nuevas células madre, un proceso llamado autorrenovación (Porecha, et al., 2006; Broxmeyer, 2006; Hall et al., 2006). Las células también se diferencian en células progenitoras de linaje restringido y células maduras, restaurando de esta manera el sistema hematopoyético formador de sangre necesario para la salud del receptor. Las células progenitoras suelen estar presentes en los materiales trasplantados y pueden ser necesarias en estos injertos para producir células maduras. Sin embargo, dado que las células progenitoras no son células madre y no se pueden autorrenovar, participan en la terapia de trasplante solo por un período limitado de tiempo.
Debido a que el procedimiento de trasplante tensiona el material trasplantado, un trasplante exitoso requiere que se trasplanten suficientes células para tener en cuenta las células que mueren i se dañan durante el procedimiento. Esto presenta un gran problema para el trasplante de injertos de sangre de cordón umbilical, ya que estos injertos incluyen una cantidad muy limitada de células madre. Por esta razón, los injertos de sangre del cordón umbilical generalmente no se pueden utilizar para trasplantar con éxito a adultos. De manera similar, el 10-25% de los pacientes y donantes normales no logran movilizar suficientes células para uso en procedimientos de trasplante. En algunas poblaciones de pacientes, particularmente aquellos tratados con algunos agentes quimioterapéuticos, se observa una falta de movilización en más del 50% de los pacientes. En general, cuantas más células se puedan trasplantar, mayor será la probabilidad de que el trasplante sea exitoso; por ejemplo, las mejores prácticas actuales recomiendan que los procedimientos de trasplante de células madre de sangre periférica normalmente requieren una administración mínima de aproximadamente 2 millones de células CD34+ por kilogramo de peso corporal del paciente receptor, cuantas más células CD34+ se puedan adquirir y posteriormente trasplantar, mejor será el resultado del paciente (Pulsipher, 2009).
El número inadecuado de células madre, la incapacidad para migrar/retornar a los nichos de médula adecuados, o la eficiencia del injerto funcionante deficiente y la autorrenovación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas pueden afectar negativamente al resultado del trasplante, medido por el proceso de repoblación de múltiples etapas. Se han intentado numerosos enfoques para intentar expandir el número de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas dentro de injertos aislados en entornos ex vivo con éxito limitado. Se necesitan estrategias para mejorar la eficacia del trasplante de HSPC para superar el desafío al que se enfrenta la profesión médica. Algunos aspectos y realizaciones de la invención divulgadas en el presente documento abordan esta necesidad.
Resumen
En un aspecto, la invención proporciona un método para mejorar la eficacia de la transducción viral en una población de células madre hematopoyéticas para terapia génica, que comprende: poner en contacto ex vivo una población de células madre hematopoyéticas con un vector viral que contiene al menos un gen de interés para la transducción, en el que la población de células madre hematopoyéticas que se van a poner en contacto con el vector viral se ha puesto en contacto ex vivo con una cantidad eficaz de una molécula que tiene actividad de PGE2.
En una realización, la molécula que tiene actividad de PGE2 se selecciona del grupo que consiste en: una prostaglandina de la serie E y un derivado de dimetilo de una prostaglandina de la serie E.
En otra realización, la molécula que tiene actividad de PGE2 se selecciona del grupo que consiste en PGE2 y 16, 16-dimetil prostaglandina E2.
En aún otra realización, la población de células madre hematopoyéticas se obtiene de la médula ósea, sangre periférica movilizada, sangre del cordón umbilical (UCB) o la placenta.
Algunos aspectos de la divulgación están dirigidos a la mejora de la recolección y/o injerto funcionante de células madre y progenitoras hematopoyéticas, algunos de estos aspectos incluyen, pero no se limitan a, supervivencia ex vivo, autorrenovación y retorno linfocítico dirigido a nichos de médula adecuados para aumentar la tasa de éxito de la terapia con células madre y progenitoras hematopoyéticas.
Algunos aspectos de la divulgación incluyen métodos dirigidos a aumentar el número de células madre y progenitoras hematopoyéticas con capacidades de repoblación a largo plazo obtenidas de un donante. Algunos de estos métodos comprenden las etapas de: identificar un compuesto que inhibe la biosíntesis de una prostaglandina, tal como la prostaglandina E, o un compuesto que antagoniza al menos un receptor de prostaglandina implicado en la respuesta de prostaglandina; y proporcionar una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos al donante antes de recolectar células madre y progenitoras hematopoyéticas de la sangre periférica o la médula ósea del donante. En un caso, la aplicación de inhibidor de la biosíntesis de prostaglandina E y/o antagonista del receptor de prostaglandina E se combina con uno o más agentes de movilización de células madre y progenitoras hematopoyéticas clínicamente aprobados, por ejemplo, Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos (G-CSF), para aumentar el número de células madre y progenitoras hematopoyéticas que se pueden recolectar mediante aféresis para el trasplante del injerto hematopoyético. El compuesto se puede seleccionar entre inhibidores de ciclooxigenasa, que incluyen, por ejemplo, indometacina (ácido 2-{1-[(4-clorofenil)carbonil]-5-metoxi-2-metil-1H-indol-3-il}acético) o un sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Más específicamente, el inhibidor de ciclooxignasa se elige del grupo que consiste en aspirina, ibuprofeno, Celecoxib, Rofecoxib, Meloxicam, Etoricoxib, Valdecoxib, Naproxeno, Diclofenaco, Licofelona, Etodolaco, Cetorolaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunos casos, el inhibidor de ciclooxigenasa actúa sobre la COX-1 y la COX-2 muchas veces con preferencia por la COX-2. Aún otro compuesto que se puede utilizar es Meloxicam.
Otros aspectos de la divulgación incluyen métodos para mejorar la capacidad de repoblación a largo plazo del injerto de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas recolectadas en un receptor. Esto puede ser de particular utilidad en situaciones en las que el receptor tiene un sistema hematopoyético comprometido. El método comprende las etapas de: a) recolectar un injerto de un donante, en el que el donante se ha tratado con una cantidad eficaz de compuesto para inhibir la biosíntesis de prostaglandina E2 y/o antagonista del receptor de prostaglandina E2; b) poner en contacto el injerto con una cantidad eficaz de prostaglandina E2 o uno o más de sus derivados ex vivo; y c) aplicar el injerto tratado al receptor. En una realización, el método comprende adicionalmente la etapa de suministrar una cantidad eficaz de prostaglandina E2 o uno de sus derivados o cualquier molécula que tenga actividad de PGE2 a un receptor de trasplante para mejorar el retorno linfocítico dirigido de los materiales del injerto a sus nichos terapéuticos apropiados.
Otros aspectos de la divulgación incluyen métodos para mejorar la eficacia de la transducción viral en células madre. Algunos de estos métodos pueden incluir las etapas de: proporcionar un vector viral que contiene al menos un gen de interés para la transducción; proporcionar al menos una célula madre que ha sido tratada ex vivo con una cantidad eficaz de prostaglandina E2 o sus derivados, y transfectar el vector viral a la célula madre tratada con PGE2 o su derivado.
También se divulgan en el presente documento métodos para mejorar la movilización de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas, que comprenden las etapas de: identificar una fuente de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas; proporcionar un compuesto que reduce la biosíntesis y/o la actividad de PGE2; y poner en contacto la fuente de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas con una cantidad eficaz de dicho compuesto que reduce la biosíntesis y/o actividad de PGE2 de las células. El compuesto que reduce la actividad de PGE2 puede ser un compuesto antiinflamatorio no esteroide, en el que el compuesto antiinflamatorio no esteroide actúa tanto sobre la ciclooxigenasa-1 como sobre la ciclooxigenasa-2. En algunos casos, el compuesto antiinflamatorio no esteroide actúa principalmente sobre la ciclooxigenasa-2. Más específicamente, el compuesto antiinflamatorio no esteroide se puede seleccionar del grupo que consiste en: aspirina, celecoxib, rofecoxib, etoricoxib, valdecoxib, ibuprofeno, naproxeno, diclofenac, etodolac, ketrolac y licofelone. En aún otros casos, el compuesto antiinflamatorio no esteroide es indometacina y en otros casos el compuesto antiinflamatorio no esteroide es meloxicam.
En algunos casos, el compuesto antiinflamatorio no esteroide se administra a un paciente durante un período de tiempo que se solapa con el tratamiento conjunto con al menos un compuesto adicional que mejora la movilización de células madre y progenitoras hematopoyéticas. En algunos casos, el compuesto que mejora la movilización de células madre y progenitoras hematopoyéticas se selecciona del grupo que consiste en: G-CSF y plerixafor. En algunos casos, el compuesto antiinflamatorio no esteroide se administra a un paciente durante al menos 3 días.
También se divulgan en el presente documento métodos para mejorar la movilización de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas de un donante, que comprenden las etapas de: proporcionar un compuesto que es un antagonista de al menos un receptor de PGE2; y administrar una cantidad eficaz de dicho compuesto a un donante de células madre o progenitoras hematopoyéticas antes de recolectar las células madre o progenitoras hematopoyéticas del donante. En algunos casos, el antagonista de al menos un receptor de PGE2 se selecciona de los grupos que consisten en:
N-[[4'-[[3-butil-1,5-dihidro-5-oxo-1-[2-(trifluorometM)fenM]-4H-1,2,4-triazol-4-il]metil][1,1'-bifenM]-2-il]sulfonil]-3-metil-2-tiofenocarboxamida (L-161,982) y 4-(4,9-dietoxi-1,3-dihidro-1-oxo-2H-benz[f]isoindol-2-il)-N-(fenilsulfonil)-bencenoacetamida (GW627368X).
Se divulga adicionalmente en el presente documento el injerto funcionante de células madre o progenitoras hematopoyéticas en el receptor, que comprende las etapas de: recolectar un grupo de células que incluye células madre y progenitoras hematopoyéticas de una fuente que ha sido tratada con al menos un compuesto que reduce la biosíntesis de PGE2 y/o actividad en la fuente; poner en contacto las células madre hematopoyéticas establecidas con un compuesto con actividad de PGE2 ex vivo; y trasplantar dichas células madre y progenitoras hematopoyéticas en contacto con dicho compuesto que aumenta la actividad de PGE2 ex vivo, en un receptor. En algunos casos, las células madre hematopoyéticas se extraen de un donante de médula ósea. Mientras que, en otros casos, las células madre hematopoyéticas se recolectan de una muestra de sangre extraída de un donante de sangre. Y en aún otros casos, las células se extraen de un cordón umbilical o de una placenta.
Algunas realizaciones incluyen métodos para aumentar las tasas de injerto funcionante de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas, que comprenden las etapas de proporcionar un compuesto con actividad de PGE2 ; y poner en contacto el compuesto con actividad de PEG2 con una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas ex vivo. En algunas realizaciones, el compuesto con actividad de PGE2, se selecciona del grupo que consiste en cualquier prostaglandina de la serie E o cualquier derivado de una prostaglandina de la serie E, tal como PGE1, PGE2, PGE3 o los derivados de dimetilo de PGE1, PGE2 , PGE3, que incluyen, para ejemplo, dimetil 16,16-dimetil PGE2. En algunas realizaciones, el compuesto que tiene actividad de PGE2 se pone en contacto con la población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas durante al menos 1 hora. Algunas realizaciones incluyen las etapas de lavar las células madre y/o progenitoras hematopoyéticas que estaban en contacto con el compuesto que tiene actividad de PGE2, al menos una vez con un tampón que está sustancialmente libre de actividad de PGE2. Aunque todavía otras realizaciones incluyen adicionalmente la etapa de: introducir en un paciente las células madre y/o progenitoras hematopióticas que estaban en contacto con el compuesto que tiene actividad de PGE2.
Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los siguientes dibujos, descripciones y reivindicaciones no limitantes.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1A. Esquema de un experimento para probar que el efecto de PGE2 mejora el injerto funcionante de células madre hematopoyéticas (panel superior); un diagrama de flujo representativo que ilustra las poblaciones de células CD45.1 y CD45.2 (panel inferior).
FIG. 1B. Gráfico del porcentaje de células negativas frente al número de células trasplantadas (panel superior); gráfico de dispersión del porcentaje de quimerismo frente a la relación de competidor (panel inferior izquierdo): y un gráfico de barras o CKU por 100 K células medidas bajo diferentes condiciones (panel inferior derecho).
FIG. 1C. Tabla que resume la Frecuencia de Repoblación Celular representada durante 20 semanas para las células tratadas con y sin dmPGE2.
FIG. 1D. Gráficos de FACS representativos de la reconstitución de múltiples linajes (mieloide, linfoide B y T, panel superior izquierdo). Gráfico de recuentos por CD3 (panel derecho de la fila superior). Fila del medio, gráficos de barras del porcentaje de WBC total medido a las 32 semanas en los receptores primarios (panel izquierdo) y a las 12 semanas en los receptores secundarios (panel derecho). Gráfico del porcentaje de quimerismo medido a las 20 semanas en los receptores primarios y a las 12 semanas en los receptores secundarios (panel inferior).
FIG. 2A. Selección de poblaciones de FACS representativa de médula ósea Linneg agotada de microperlas MACS que muestra la selección de poblaciones c-kit+ y Sca-1 de células agrupadas Linneg (panel lateral izquierdo). Recuento representado para diferentes receptores e P (paneles del medio) y cambio en el ARNm frente al número de ciclos representados para diferentes receptores (paneles derechos).
FIG. 2B. SSC de FACS representativos frente a CD34 (panel izquierdo); Recuentos representados para diferentes receptores EP (panel del medio) y Cambio en el ARNm representado frente al Número de Ciclo para diferentes receptores (panel derecho).
FIG. 3A. Esquema del experimento (arriba); % de CFSE representado para diferentes tratamientos (panel inferior). FIG. 3B. Diagrama que ilustra el protocolo experimental; porcentaje de eficiencia del retorno linfocítico dirigido (panel inferior izquierdo) y Cambio de multiplicidad (panel inferior derecho) medidos después de exposición a 16,16-dimetil prostaglandina E2 (dmPGE2) y varios controles.
FIG. 3C. Esquemas de experimentos (paneles izquierdos); Gráficos FACS de CD45.2 frente a CD45.1 para diferentes tratamientos (paneles del medio); porcentaje de eficiencia del retorno linfocítico dirigido representado para diferentes tratamientos (panel derecho).
FIG. 4A. Gráfico de flujo representativo del control de isotipo de expresión del receptor CXCR4 mostrado en gris (fila superior); Gráfico de barras que ilustra los resultados de la exposición al pulso de HSPC de murino y humano a PGE2 sobre la expresión de CXCR4, el cambio en CXCR4 representado para diferentes condiciones (fila inferior).
FIG. 4B. Gráfico de barras del porcentaje de eficiencia del retorno linfocítico dirigido representado para diferentes tratamientos.
FIG. 5A. Porcentaje de Anexina V SKL representado en función de la concentración de dmPGE2.
FIG. 5B. Aumento de multiplicidad en Survivina representado para diferentes condiciones.
FIG. 5C. Cambio porcentual normalizado para controlar la actividad representada para diferentes tiempos de exposición a dmPGE2.
FIG. 6A. Gráficos de flujo representativos que muestran el contenido de ADN (tinción 7AAD) de las células SKL agrupadas, el porcentaje de SKL en la fase S+G2M y el aumento de multiplicidad en el ciclo de SKL tratadas con dmPGE2 (panel izquierdo); el gráfico muestra datos combinados de 3 experimentos (panel derecho).
FIG. 6B. Esquema del experimento y representación gráfica de barras del aumento de multiplicidad en células SKL retornadas en S+G2/M medido con diferentes tratamientos. Gráfica que muestra el protocolo experimental (panel izquierdo); gráfico de barras de aumento de multiplicidad en S+G2/M medido con y sin dmPGE2.
FIG. 7A. Gráfico de barras que representa CFU-Gm por ml de sangre medida después de diferentes tratamientos. FIG. 7B. Gráfico de barras que representa CFU-GM por ml de sangre medida después de diferentes tratamientos. FIG. 8. Tabla que resume los datos que ilustran que PGE2 afecta el ciclo de SKL SLAM.
FIG. 9. Gráfico de migración de células de control y tratadas con dmPGE2 frente a la concentración de SDF-1. FIG. 10. Gráfico del porcentaje de migración de células CD34+ frente a la concentración de SDF-1 y/o AMD3100 (dihidrato de 1,1'-[1,4-fenilenbis(metileno)]bis[1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano]octohidrobromuro) comercializado bajo el nombre comercial Mozobil®.
FIG. 11. Gráfico de barras del porcentaje de eficiencia del retorno linfocítico dirigido de las células SKL frente al tratamiento con dmPGE2 y/o AMD3100 y varios controles.
FIG. 12. Gráfico FACS (panel izquierdo); y gráfico de barras (panel derecho) que ilustra el Cambio de multiplicidad en el ciclo de SKL medido con y sin dmPGE2.
FIG. 13. Esquema de un protocolo experimental (panel izquierdo); un gráfico de barras que muestra un aumento en S+G2/M medido con y sin dmPGE2 agregado.
FIG. 14. Gráfico del porcentaje de quimerismo medido en trasplantes en serie a lo largo del tiempo después de exposición inicial a dmPGE2 (cuadrados) o control (vehículo, diamantes).
FIG. 15. Gráfico de barras de CFU-GM por ml de sangre medida con vehículo (gris claro) indometacina (gris oscuro) o baicaleína (gris) panel izquierdo; gráfico de datos recopilados con G-CSF (gris claro); G-CSF más indometacina (sombreado gris) o G-CSF más baicaleína (gris).
FIG. 16. Gráfico de barras del Aumento de multiplicidad en UFC por ml de Sangre sobre G-CSF medido con G-CSF y GCSF más indometacina.
FIG. 17. Gráfico de barras del análisis fenotípico de células movilizadas, ya sea células SKL (lado izquierdo) o células SKL SLAM (lado derecho) medidas después del tratamiento con ya sea G-CSF o G-CSF más indometacina.
FIG. 18. Gráfico de barras de CFU-GM por ml de Sangre representado con vehículo o indometacina (panel izquierdo); o AMD3100 o AMD3100 más indometacina (panel derecho).
FIG. 19. Gráfico de barras de CFU-GM por ml de Sangre Periférica representado medido después del tratamiento con vehículo, indometacina, AMD3100; G-CSF; AMD3100plus GROBeta; AMD3100 más indometacina o G-CSF más indometacina.
FIG. 20. Gráfico de barras de CFU-GM por ml de Sangre después del tratamiento con vehículo (transparente), G-CSF (negro), GCSF más meloxicam ((8E)-8-[hidroxi-[(5-metil-1,3-tiazol-2-il)amino]metilideno]-9-metil-10,10-dioxo-10A6-tia-9-azabiciclo[4.4.0]deca-1,3,5-trien-7-ona) (gris claro) o G-CSF más indometacina (gris).
FIG. 21. Gráfico de barras de unidades de Repoblación Competitiva medidas con G-CSF (gris claro) o G-CSF más indometacina (gris) (panel izquierdo); y MFI CXCR4 en células SKL medidas con vehículo, G-CSF; sin escalonamiento, escalonamiento de 1 día o escalonamiento de 2 días (panel derecho).
FIG. 22. Gráfico del porcentaje de Quimerismo frente a PBMC: relación de BM medida con G-CSF (diamantes) o G-CSF más indometacina (cuadrados) (panel izquierdo); CRU escalado a 2 millones de PBMC medidas con G-CSF (gris claro) o G-CSF más indometacina (gris).
FIG. 23. Gráfico de PMN versus días posteriores al trasplante de PBMC movilizadas por G-CSF (diamantes) o G-CSF más Metacam (meloxicam) (cuadrados).
FIG. 24. Gráfico de PLT versus días posteriores al trasplante de PBMC movilizadas por G-CSF (diamantes) o G-CSF más Metacam (meloxicam) (cuadrados).
FIG. 25. Gráfico que resume el experimento diseñado para probar el efecto o el tratamiento de babuinos con ya sea solo GCSF o G-CSF más meloxicam.
FIG. 26. Gráficos de Células CD34+ (lado izquierdo) o CFU-GM (lado derecho) por ml de sangre extraída de 4 babuinos diferentes tratados con ya sea G-CSF o G-CSF más meloxicam.
FIG. 27. Gráfico de barras de CFU-GM por ml de sangre analizada utilizando diferentes compuestos que varían en su selectividad para COX-1 o COX-2.
FIG. 28. Gráfico de barras del Cambio de multiplicidades en CFU-GM sobre G-CSF por ml de sangre probada después de tratar células con G-CSF o G-CSF más diferentes cantidades de ya sea aspirina o ibuprofeno.
FIG. 29. Gráfico de barras de CFU-GM por ml de sangre medida en la sangre periférica después del tratamiento con G-CSF o con diferentes niveles de meloxicam.
FIG. 30. Gráfico de barras de CFU-GM por Fémur medido en la médula ósea después del tratamiento con G-CSF o con diferentes niveles de meloxicam.
Descripción detallada
Con el fin de promover la comprensión de los principios de la nueva tecnología, ahora se hará referencia a las realizaciones preferidas de la misma y se utilizará un lenguaje específico para describir la misma. No obstante, se entenderá que, por lo tanto, no se pretende limitar el alcance de la nueva tecnología, contemplando dichas alteraciones, modificaciones y aplicaciones adicionales de los principios de la nueva tecnología como se le ocurriría normalmente a un experto en la técnica que se relaciona con la nueva tecnología.
La prostaglandina E2 (PGE2) es un eicosanoide fisiológico abundante y un mediador conocido del cáncer, la inflamación y muchos otros sistemas fisiológicos. Las funciones de PGE2 en la hematopoyesis han sido exploradas por varios equipos de investigación, pero los resultados son difíciles de conciliar. Por ejemplo, los estudios in vitro e in vivo demuestran que PGE2 puede regular negativamente la mielopoyesis: PGE2 promueve la formación de colonias BFU-E y CFU-GEMM y mejora la proliferación de CFU-S y CFUg M. Por otro lado, la PGE2 puede estimular la HSPC y tener efectos bifásicos sobre la hematopoyesis: se demostró que el tratamiento ex vivo con PGE2 a corto plazo de las células de médula ósea estimula la producción de CFU-GM humanas cíclicas a partir de una población de células inactivas, posiblemente células madre o más células progenitoras primitivas. Adicionalmente, recientemente, se mostró que la exposición ex vivo a 16, 16-dimetil PGE2 aumentó la capacidad de repoblación de las células de médula ósea de murino y la recuperación de médula renal en el pez cebra (North et al., 2007). Estos estudios implican a la PGE2 en la regulación de la hematopoyesis, pero no logran vincular la PGE2 con el retorno linfocítico dirigido de células madre hematopoyéticas. Por el contrario, los estudios previos tienden a indicar que PGE2 está involucrado en la modulación de la diferenciación de HSPC, y PGE2 no tiene un efecto directo sobre el retorno linfocítico dirigido de células.
Como se demuestra en el presente documento, la PGE2 tiene efectos directos y estabilizadores sobre las HSPC de repoblación a largo plazo y facilita el injerto funcionante al mejorar la supervivencia, retorno linfocítico dirigido y proliferación de las HSPC autorrenovables.
Un aspecto divulgado en este documento es la inhibición de la actividad de ciclooxigenasa que aumenta la frecuencia de la circulación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas en el sistema sanguíneo periférico. En un ejemplo no limitante, la administración de inhibidores de ciclooxigenasa, por ejemplo, 50 microgramos de indometacina al día, por ruta oral o sistémica, a donantes hematopoyéticos un día antes y con cada día que reciben una dosis de agente movilizador, mejoró la movilización de las células madre y células progenitoras en la periferia. El uso simultáneo de un inhibidor de ciclooxigenasa, por ejemplo, indometacina, con un agente movilizador clínicamente aprobado, por ejemplo, G-CSF, produce un efecto sinérgico para movilizar las células progenitoras.
La movilización de células madre hematopoyéticas y células progenitoras también se puede lograr al proporcionar al donante una cantidad eficaz de un antagonista del receptor de prostaglandina E.
Algunos aspectos divulgados muestran que la exposición ex vivo a PGE2 mejora la frecuencia de HSPC posterior al trasplante y proporciona una ventaja competitiva para las HSPC tratadas con PGE2. El tratamiento de las células madre de médula ósea con PGE2 ex vivo mejora el injerto funcionante total de células madre en ratones, lo que resulta en una mayor supervivencia de las células madre, una mayor eficiencia del retorno linfocítico dirigido de células madre y una mayor autorrenovación de las células madre. La mejora de la frecuencia de HSPC inducida por dmPGE2 se demostró al utilizar un modelo de trasplante competitivo de dilución limitante que comparó el injerto funcionante de células de control y tratadas con dmPGE2 en un análisis simultáneo directo dentro del mismo animal. Por ejemplo, los injertos hematopoyéticos no tratados o las poblaciones de células madre hematopoyéticas purificadas (por ejemplo, células SKL en ratones o células CD34+ en humanos) se incubaron con PGE2 auténtica o el análogo más estable 16,16-dimetil PGE2 (o cualquier análogo activo adicional de PGE) sobre hielo a concentraciones de PGE20.001-10 microMolar por 1-10 millones de células en 1 ml de medio de cultivo, por ejemplo, IMDM, durante 1-6 horas. Después de incubación, las células se lavaron 3 veces en solución salina estéril y se administraron a los receptores por vía intravenosa. Este proceso demostró una ventaja competitiva ~4 veces mayor de HSPC pulsada con PGE2 en base al cálculo de la frecuencia de HSPC mediante estadísticas de Poisson y análisis de unidades de repoblación competitivas (CRU). El análisis de frecuencia demuestra una reconstitución equivalente utilizando un cuarto del número de células tratadas con PGE2 frente a las células de control. Además, se observó una reconstitución hematopoyética completa en los receptores de trasplantes secundarios que utilizaban ya sea células de control o tratadas con PGE2 , lo que indica que no hay un impacto adverso de la PGE2 sobre la autorrenovación de HSPC. De hecho, se observó una tendencia hacia una mayor actividad de LTRC, lo que indica que el efecto potenciador de la exposición a PGE2 a corto plazo sobre HSPC observado en trasplantes primarios fue de larga duración, ya que no se realizó ningún tratamiento adicional sobre células o animales antes del trasplante en serie. El injerto funcionante mejorado de células tratadas con PGE2 fue estable durante 28 semanas. El análisis en animales con trasplante secundario 90 días posteriores al trasplante demostró una reconstitución de múltiple linaje completa y una frecuencia de HSPC más alta y continua, lo que indica un efecto estable del tratamiento con PGE2 a corto plazo sobre las HSPC de repoblación a largo plazo.
El injerto funcionante mejorado puede resultar de los cambios en la frecuencia de HSPC, retorno linfocítico dirigido, supervivencia y/o proliferación. Fue sugerido por North, et.al. que la PGE2 no afectó el retorno linfocítico dirigido de HSPC; sin embargo, sus estudios no evaluaron específicamente la HSPC. Inesperadamente, como se demuestra en el presente documento, la frecuencia de HSPC mejorada inducida por PGE2 fue estable durante un período > 20 semanas y se mantuvo en trasplantes secundarios. La comparación directa en modelos de trasplante competitivos mostró que la exposición a corto plazo de HSPC a PGE2 produjo una ventaja competitiva de ~4 veces. Aunque el total de células trasplantadas no tuvo diferencia en la eficiencia del retorno linfocítico dirigido entre las células de control y las tratadas con PGE2 , se observó una mayor eficiencia del retorno linfocítico dirigido de las células SKL clasificadas, tratadas con PGE2 , lo que sugiere fuertemente que la PGE2 tiene un efecto directo sobre el retorno linfocítico dirigido de HSPC.
Estos resultados sugieren un mayor efecto de PGE2 para la HSPC o la capacidad de repoblación a largo plazo de HSPC, en lugar de solo un efecto a corto plazo propuesto por estudios anteriores.
Una posibilidad, que se ofrece a modo de explicación y no de limitación, es que los efectos de PGE2 sobre la función de HSPC podrían estar mediados por la regulación en aumento del receptor de quimiocina CXCR4 del receptor de alfa-quimiocinas, implicado en la autorrenovación y autorrenovación de HSPC, y el inhibidor de la proteína de apoptosis Survivina, que regula la supervivencia y proliferación de HSPC.
La citometría de flujo y QRT-PCR muestran la expresión de los 4 receptores de PGE2 (EP1-EP4) sobre células de médula de murino Sca-1+, c-kit+, Lineageneg (SKL) y sobre células de sangre de cordón humano (UCB) CD34+ sin diferencias evidentes en la expresión del subtipo de receptor. Al analizar varias propiedades funcionales relevantes para la función HSPC, se observó un aumento significativo en la expresión de CXCR4 tanto en SKL (26.8%) como en UCB CD34+ (17.3%) después de exposición a PGE2, con una regulación en aumento significativa del ARNm de CXCR4 a las -6 horas posteriores a la exposición. El aumento de CXCR4 coincidió con un aumento de ~2 veces en la eficiencia del retorno linfocítico dirigido de la médula in vivo de los injertos tratados con PGE2 y se observó con médula ósea no manipulada (p <0.001, 3 experimentos, n = 6 ratones/grupo/experimento, probados individualmente) y con células SKL purificadas en competencia simultánea en el mismo animal (p <0.001, 2 experimentos, n = 5 ratones/grupo/experimento, probados individualmente), lo que indica un efecto directo de PGE2 sobre HSPC. El aumento en la eficiencia del retorno linfocítico dirigido se redujo significativamente mediante el tratamiento con el antagonista selectivo de CXCR4 AMD3100.
El tratamiento con PGE2 aumentó el ARNm de CXCR4 de células SKL y la expresión de superficie. Además, el antagonista de CXCR4 AMD3100 redujo significativamente el efecto potenciador de PGE2 en el retorno linfocítico dirigido, lo que sugiere que la expresión mejorada de CXCR4 y la quimioatracción al SDF-1 de médula es en gran parte responsable del retorno linfocítico dirigido mejorado, aunque no se pueden excluir efectos adicionales sobre la expresión o función de la molécula de adhesión.
Un aspecto divulgado en el presente documento es que el tratamiento con PGE2 de un receptor mejora la supervivencia de las células madre trasplantadas a los receptores in vivo. La administración parenteral de PGE2 o análogos activos a los receptores en el momento del trasplante y continuar con la administración diaria para mejorar las células madre podría aumentar la supervivencia de las HSPC trasplantadas. Por ejemplo, PGE2 o su análogo activo podría administrarse como 0.0001-10 micro molar a pacientes inmediatamente antes y diariamente después de recibir un injerto hematopoyético.
El tratamiento con FGE2 in vitro da como resultado un aumento en la proporción de células SKL activas en el ciclo celular dentro de las 24 horas posteriores al tratamiento. Además, el trasplante de células tratadas con PGE2 en ratones receptores tratados con BrdU mostró ~2 veces más células SKL del donante en la fase S+G2/M del ciclo celular en comparación con las células trasplantadas pulsadas solo con vehículo.
Se considera que la Survivina es necesaria para que la HSPC entre y progrese a través del ciclo celular y la deleción de Survivina en ratones transgénicos condicionales lo que indica que es necesaria para el mantenimiento de HSPC. Los estudios descritos en este documento encontraron niveles elevados de ARNm y proteína de Survivina, con caspasa-3 activa reducida concomitante, una proteasa que media la apoptosis, en células SKL tratadas con PGE2. Los ensayos de supervivencia indicaron que PGE2 disminuyó de manera dependiente de la dosis la apoptosis de las células SKL in vitro, coincidiendo con un aumento de 1.7 veces en la expresión de la proteína Survivina y una disminución en la caspasa-3 activa (disminución del 23-59%; 24-72 horas posteriores a la exposición).
Es probable que la supervivencia de HSPC mejorada, mediada a través de Survivina, contribuya a un injerto funcionante mejorado. La exposición al pulso a PGE2 aumenta la proporción de HSPC en el ciclo celular en ~2 veces, con mayor frecuencia de HSPC, CRU y retorno linfocítico dirigido de células BrdU+ SKL y mantenimiento de la frecuencia de HSPC mejorada en trasplantes primarios y secundarios. Una explicación no limitante de estos resultados es que la exposición al pulso de PGE2 puede iniciar una sola ronda de autorrenovación de HSPC. Por ejemplo, la activación de los receptores EP2 y EP4 se asocia con la fosforilación de la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) y el aumento de la señalización de p-catenina (Hull et al., 2004; Regan, 2003), que se encuentra en dirección descendente de la ruta Wnt, que se ha implicado en la supervivencia y autorrenovación de HSPC (Fleming et al., 2008; Khan and Bendall, 2006). La señalización por PGE2 posiblemente a través de EP4 pero sin limitarse exclusivamente a EP4 podría incrementar directamente la p-catenina. Se ha sugerido una intercomunicación sinérgica entre las rutas COX-2 y Wnt (Wang et al., 2004).
La Survivina también facilita el ciclo de células HSPC a través de p21WAF1/CDKN1 (Fukuda et al., 2004), que se sabe que está involucrado en la función de HSPC (Cheng et al., 2000), y bloquea la actividad de caspasa-3 (Li et al., 1998; Tamm et al., 1998). Recientemente, p21 estuvo implicado en la autorrenovación de HSPC (Janzen et al., 2008). Un hallazgo extraído de los estudios presentados en este documento es que la PGE2 regula en aumento la Survivina y disminuye la caspasa-3, lo que sugiere que la ruta de Survivina puede estar involucrada en los efectos de la PGE2 sobre el aumento de la autorrenovación. También es interesante notar que la transcripción de Survivina (Peng et al., 2006) y CXCR4 (Staller et al., 2003; Zagzag et al., 2005) está regulada en aumento por el factor de transcripción, factor inducible por hipoxia-1 alfa (HIF -1 alfa), que se puede estabilizar mediante PGE2 (Liu et al., 2002; Piccoli et al., 2007) , posiblemente vinculando algunas rutas de respuesta a PGE2 con la supervivencia celular, retorno linfocítico dirigido y proliferación/autorrenovación de HSPC.
Estos estudios sugieren que el aumento de ~4 veces en la frecuencia sw HSPC observado después del tratamiento con PGE2 da como resultado desde ~2 veces o más del retorno linfocítico dirigido de HSPC a la médula del receptor con ~2 veces más HSPC que experimenta autorrenovación. Estos resultados pueden ayudar a definir nuevos mecanismos de acción mediante los cuales PGE2 mejora la función de HSPC y sugieren un enfoque terapéutico inesperado para facilitar el trasplante hematopoyético, particularmente para injertos hematopoyéticos en los que un número limitado de células da como resultado un escaso potencial de injerto funcionante.
Un aspecto divulgado en este documento es un método para mejorar la eficacia de la transducción viral en la terapia génica de células madre. El tratamiento con PGE2 ex vivo de las células madre aumentó la división de autorrenovación y la supervivencia de dichas células, que es un factor importante para la integración genética exitosa mediada por vectores virales. La división/supervivencia de autorrenovación de células madre promovida por PGE2 se puede incorporar en los protocolos de transducción de células madre actuales, aumentando de esta manera la eficacia general de la transducción de genes en la terapia génica de células madre.
En el presente documento se reportan algunos métodos de uso de PGE2 para mejorar el injerto funcionante de HSPC, un proceso de varias etapas que incluye la movilización de células del donante, el mantenimiento de HSPC y el retorno linfocítico dirigido de HSPC en el cuerpo receptor. Bajo algunas condiciones, estos métodos dan como resultado un aumento de 4 veces en la frecuencia de HSPC y el injerto funcionante resulta posiblemente, por ejemplo, del efecto acumulativo de un aumento de 2 veces en el retorno linfocítico dirigido de HSPC y un aumento de 2 veces en la actividad del ciclo celular de HSPC bajo la influencia directa de PGE2. Aunque todavía no se han determinado las rutas de señalización precisas, una explicación no limitante de este efecto es que el injerto funcionante mejorado se debe a la regulación por incremento de factores tal como CXCR4 y Survivina.
La capacidad de PGE2 para mejorar el retorno linfocítico dirigido y la supervivencia y/o proliferación de HSPC puede ser clínicamente significativa, especialmente en entornos en los que los números de HSPC son limitantes, por ejemplo, UCB y algunos productos de PB movilizados, o para la transducción de genes virales en la terapia génica de células madre. Nuestros estudios de trasplante de dilución limitante ilustran que se pueden lograr resultados de injerto funcionante equivalentes con una cuarta parte del número de células tratadas con PGE2 en comparación con los controles que no se tratan de esta manera. Estos resultados demuestran la utilidad de utilizar PGE2 bajo condiciones en las que los números de HSPC son limitantes. Si bien los cuatro subtipos de receptores EP parecen expresarse sobre HSPC, no está claro cuáles de estos receptores (o si todos) están involucrados en la función de injerto funcionante. Es consistente con estos resultados que se puede lograr un injerto funcionante/recuperación mejorados al administrar PGE2 in vivo o si la PGE2 utilizada in vivo puede facilitar aún más el injerto funcionante de HSPC expuestas a PGE2 ex vivo.
Materiales y métodos
Materiales
Ratones. Se adquirieron ratones C57B1/6 de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE.UU.). Los híbridos B6.SJLPtrcAPep3B/BoyJ (BOYJ) y F1 C57B1/6/BOYJ se criaron internamente. Todos los animales se alojaron en jaulas microaisladoras con acceso continuo a alimentos y agua acidificada. Los ratones utilizados en los estudios de trasplante recibieron alimento con Doxiciclina en el momento de la radiación y durante 30 días posteriores al trasplante. El Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana aprobó todos los protocolos para animales.
Citometría de flujo. Todos los anticuerpos se adquirieron de BD Biosciences a menos que se indique lo contrario. Para la detección y clasificación de células KL y SKL de murino, estreptavidina conjugada con PE-Cy7 (para teñir anticuerpos de linaje MACS biotinilados (Miltenyi Biotech, Auburn, Ca )), c-kit-APC, Sca-1-PE o APC-Cy7, CD45. Se utilizaron 1-PE y CD45.2-FITC. Se detectaron células UCB CD34+ utilizando CD34-APC anti-humano. Para el análisis de múltiples linajes, se utilizaron APCCy7-Mac-1, PE-Cy7-B-220 y APC-CD3. Los receptores EP se detectaron con IgG de conejo anti EP1, EP2, EP3 y EP4 (Cayman Chemicals) y tinción secundaria con IgG FITC-cabra-anti-conejo (Southern Biotech, Birmingham, AL). La expresión de CXCR4 se analizó utilizando estreptavidina-PECy7, c-kit-APC, Sca-1-APCCy7 y CXCR4-PE. La apoptosis se midió con FITC-Anexina-V. Para la detección de Survivina y caspasa 3 activa, las células se permeabilizaron y fijaron utilizando el kit CytoFix/CytoPerm (BD) y se tiñeron con el kit de Flujo anti-caspasa-3-activa-FITC (BD) o Survivina-PE (R&D Systems).
Para el análisis del ciclo celular, las células se tiñeron con 7AAD o el Kit de Flujo FITC-BrdU (BD). Todos los análisis se realizaron en un LSRII y la clasificación se realizó en un clasificador FACSAria o FACSVantage (BD). Se utilizaron el software Cell Quest Pro y Diva (BD) para adquisición y análisis de datos.
Métodos
Trasplante competitivo y no competitivo de dilución limitante. Se trataron células WBM (CD45.2) sobre hielo durante 2 horas con dmPGE2 1 microMolar (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) por 1x106 células o ETOH al 0.01% en PBS estéril, no pirogénico. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces y se mezclaron con 2x105 células de médula ósea competidoras CD45.1 congénicas en relaciones de 0.075:1, 0.25:1, 1:1 y 2.5:1 y se trasplantaron en ratones CD45.1 irradiados letalmente (dosis dividida 1100-cGy) mediante inyección en la vena de la cola (5 ratones por dilución). Se determinaron mensualmente células CD45.1 y CD45.2 en PB mediante citometría de flujo. Para trasplantes competitivos simultáneos, se trataron WBM de ratones CD45.1 y ratones CD45.2 con vehículo o dmPGE2 y se mezclaron con 2x105 células de médula ósea competidoras de ratones CD45.1/CD45.2 en relaciones de 0.075:1, 0.25 :1, 1:1 y 2.5:1 y se trasplantaron en ratones CD45.1/CD45.2 irradiados letalmente. La proporción de células CD45.1, CD45.2 y CD45.1/CD45.2 en PB se determinó mensualmente. La frecuencia de HSPC se cuantificó mediante estadísticas de Poisson utilizando el software L-CALC (Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canadá) con una contribución al quimerismo de < 5% considerado un receptor negativo. Las unidades de repoblación competitivas (CRU) se calcularon como se describe (Harrison, 1980). Para los trasplantes secundarios, se inyectaron 2x106 WBM de ratones Híbridos F1 trasplantados previamente en la relación 1:1 a las 20 semanas posteriores al trasplante en ratones híbridos F1 irradiados letalmente de manera no competitiva y se evaluó mensualmente el quimerismo de PB y la reconstitución de trilinaje.
Análisis de retorno linfocítico dirigido de HSPC a médula ósea in vivo. Se marcó CD45.2 WBM con CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR) se lavó y trató sobre hielo con ya sea dmPGE21 microMolar o vehículo. Después del tratamiento, las células se lavaron y se trasplantaron 2x107 células en ratones CD45.2 irradiados letalmente. Después de 16 horas, se enjuagaron los fémures y las tibias, y se agotó una proporción de células Lin+ de médula de ratón utilizando microperlas MACS (Miltenyi Biotech), se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos para biotina (linaje), c-kit (K) y Sca -1 (S) y se determinó el número total de células CFSE+WBM (sin linaje agotado), KL y SKL. Para los estudios de retorno linfocítico dirigido congénito, las células CD45.1 Linneg se trataron sobre hielo con dmPGE2 1 microMolar, vehículo o PBS. Después de incubación, las células se lavaron y se trasplantaron 2x106 células en ratones CD45.2. Después de 16 horas, se recolecto la médula ósea del receptor, se agotó el linaje, se tiñeron y se determinaron las células CD45.1 SKL del donante. Para estudios de retorno linfocítico dirigido simultáneos competitivos utilizando células SKL clasificadas, las células Linneg de ratones CD45.2 y CD45.1 se clasificaron mediante FACS, las células se trataron con ya sea dmPGE2 o vehículo durante 2 horas, se lavaron y se trasplantaron 3x104 células CD45.1 (vehículo o dmPGE2) más 3x104 células SKL CD45.2 (tratadas con dmPGE2 o vehículo) en ratones Híbridos F1 irradiados letalmente. Para evaluar la función de CXCR4 en estudios de retorno linfocítico dirigido, se trataron células CD45.2 Linneg sobre hielo con vehículo o dmPGE2 1 microMolar más AMD3100 10 microMolar (AnorMed Inc., Vancouver, BC, Canadá) y se inyectaron 2x106 células tratadas en ratones CD45.1 irradiados letalmente. Las células SKL retornadas se analizaron 16 horas posteriores al trasplante.
Expresión de receptores EP, CXCR4 y Survivina. Muestras de células Linneg replicadas de ratones CD45.2 se tiñeron para SKL y cada uno de los receptores EP y se determinó la expresión del receptor de superficie sobre las células KL y SKL mediante FACS. Para los receptores EP humanos, se obtuvo UCB del Wishard Hospital, Indianapolis, IN con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional. Se aislaron células mononucleares sobre Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences) y se seleccionaron positivamente células CD34+ con microperlas MACS (Miltenyi Biotech) (Fukuda and Pelus, 2001). Las células replicadas se tiñeron para CD34 y cada uno de los receptores de EP y la expresión de superficie se determinaron mediante FACS. Para evaluar CXCR4, Survivina y caspasa-3 activa, se trataron células Linneg o UCB CD34+ sobre hielo con ya sea dmPGE21 micrMolar o control de vehículo durante 2 horas, se lavaron y luego se cultivaron en RPMI-1640 FBS al 10% a 37 °C durante 24 horas. Las células se tiñeron para SKL (células de murino) y CXCR4, Survivina y/o caspasa-3 activa, como se describió anteriormente, y se analizaron mediante FACS.
Análisis del ciclo celular. Para el análisis del ciclo celular in vitro, se trataron células Linneg con dmPGE21 microMolar 0 vehículo durante 2 horas, se lavaron y se cultivaron en Medio Stem Cell Pro (Stem Cell Technologies) con rm-SCF (50 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN), rhFlt-3 y rhTPO (100 ng/ml cada uno) (Immunex, Seattle, Wa ). Después de 20 horas, las células se tiñeron para SKL, se fijaron y se permeabilizaron y se tiñeron con 7AAD (BD Biosciences, San José, CA). Se determinó la proporción de células SKL en la fase S+G2/M al medir el contenido de ADN mediante FACS. Para el análisis del ciclo celular in vivo, se irradiaron letalmente ratones CD45.2 y se trasplantaron con 5x106 células Linneg de ratones CD45.1 tratados con dmPGE2 1 microMolar o vehículo durante 2 horas. En el momento del trasplante, los ratones receptores recibieron 1 miligramo/ml de BrdU (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) en agua potable y 1 mg por I.P. de BrdU de ratón Después de 16 horas, se aisló la médula del receptor, se agotó el linaje y se tiñó para CD45 .1, SKL y BrdU. Se determinó la proporción de células SKL (CD45.1+) retornadas que eran BrdU+ mediante FACS en ratones individuales.
Ensayo de apoptosis. Se trataron células Linneg sobre hielo con dmPGE20.1 nanoMolar a 1 microMolar o control de vehículo, se lavaron e incubaron en RPMI-1640 FBS al 2%, sin factores de crecimiento a 37 °C para inducir apoptosis. Después de 24 horas, las células se tiñeron para SKL y Anexina-V y se determinó la proporción de células de Anexina-V+ SKL mediante FACS.
Transcripción inversa y QRT-PCR. Se obtuvo ARN total utilizando el kit de purificación de ARN absoluto (Stratagene, La Jolla, CA). Se realizó una transcripción inversa de una cantidad constante de ARN con cebadores aleatorios (Promega, Madison, WI) y transcriptasa inversa MMLV (Promega) en un volumen de 50 microlitros con dNTP 1 miliMolar e inhibidor de ARNasa como se describe (Fukuda and Pelus, 2001). Se agregó agua libre de ADNasa y ARNasa (Ambion, Austin, TX) para obtener una concentración final equivalente a 10 nanogramos de ARN/microlitro y se utilizaron 5 microlitros para QRT-PCR. Se diseñaron cebadores para SYBR Green QRTPCR para producir un tamaño de amplicón de 75-150 pb. Se realizó QRTPCR en un volumen total de 30 microlitros utilizando la supermezcla Platinum SYbR Green qPCR uDg con Rox (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un ABI-7000 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), con una etapa de activación de 50 °C durante 2 min, desnaturalización a 95 °C durante 2 min y amplificación durante 45 ciclos a 95 °C-15 s, 50 °C-30 s, 72 °C-30 s, seguido de disociación para confirmar que solo se obtuvo un producto.
Los compuestos antiinflamatorios no esteroides que se pueden utilizar para practicar algunos aspectos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, compuestos tales como:
Celecoxib (4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil) pirazol-1-il]bencenosulfonamida) vendido bajo el nombre comercial Celebrex®; Rofecoxib (4-(4-metilsulfonilfenil)-3-fenil-5H-furan-2-ona) vendido bajo el nombre comercial Vioxx®; Aspirina (ácido 2-acetoxibenzoico); Etoricoxib (5-cloro-6'-metil-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-2,3'- bipiridina); Valdecoxib (4-(5-metil-3-fenilisoxazol-4-il) bencenosulfonamida) vendido bajo el nombre comercial Bextra®; Ibuprofeno (ácido (RS)-2-(4-isobutilfenil) propanoico); Naproxeno (ácido (+)-(S)-2-(6-metoxinaftalen-2-il) propanoico); Diclofenaco (ácido 2-(2-(2,6-diclorofenilamino) fenil)acético) comercializado bajo el nombre comercial Voltaren®; Licofelone (ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-2,3-dihidro-1H-pirrolizin-5-il]acético); Indometacina (ácido 2-{1-[(4-clorofenil)carbonil]-5-metoxi-2-metil-1H-indol-3-il}acético); meloxicam ((8E)-8-[hidroxi-[(5-metil-1,3-tiazol-2-il)amino] metilideno]-9-metil-10,10-dioxo-10A6-tia-9-azabiciclo[4.4.0]deca-1,3,5-trien-7-ona) vendido bajo el nombre comercial Metacam; Etodolac (ácido 2-(1,8-Dietil-4,9-dihidro- 3H-pirano[3,4-b]indol-1-il)acético); ketorolac (ácido (6)-5-benzoil-2,3-dihidro-1H-pirrolizina-1-carboxílico, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol) comercializado bajo el nombre comercial Toradol.
Los compuestos que actúan como antagonistas de al menos un receptor de PGE2 incluyen, pero no se limitan a, compuestos disponibles de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE.UU.) u otras listas mantenidas/vendidas por compañías de suministro de productos químicos.
Análisis estadístico. Todos los valores agrupados se expresan como la Media ± EEM. Las diferencias estadísticas se determinaron utilizando la función de prueba t de dos colas emparejada o no emparejada en Microsoft Excel (Microsoft Corp, Seattle, WA) según fuera apropiado. Como se utiliza en este documento, especialmente en algunas de las figuras, los términos “dmPGE2” y “dmPGE” se utilizan de manera intercambiable.
Ejemplos de referencia
1. PGE2 aumenta la frecuencia y el injerto funcionante de HSPC de repoblación a largo plazo
El uso de un modelo de trasplante competitivo de dilución limitante que utiliza injertos congénicos CD45.2 y CD45.1 trasplantados en ratones híbridos CD45.1/CD45.2, demostró que la exposición a corto plazo de HSPC a PGE2 produce una mejora a largo plazo de HSPC y frecuencia de la unidad de repoblación competitiva (CRU). Con referencia ahora a la FIG. 1A, se trató médula ósea de ratones CD45.1 o CD45.2 con vehículo o dmPGE2 respectivamente. Se utilizaron como competidores células de médula híbrida CD45.1/CD45.2. Se trasplantaron diluciones limitantes en ratones híbridos CD45.1/CD45.2 irradiados letalmente (1100cGys, dosis dividida) y se analizó el quimerismo en PB durante 20 semanas. Se muestra un diagrama de flujo representativo que detecta cada población celular (panel inferior).
Con referencia ahora a la FIG. 1B, análisis de frecuencia (arriba) para células pulsadas con vehículo (rojo) o dmPGE2 (azul), determinado por estadísticas de Poisson, a las 12 semanas; Po = 85.560 (vehículo) y P0 = 23.911 (tratadas con dmPGE2). El quimerismo en el análisis de PB y CRU se muestra a las 12 semanas (Media ± EEM). Los datos representan 2 experimentos agrupados, n = 5 ratones/grupo/experimento, cada uno ensayado individualmente.
Con referencia ahora a la FIG. 1C, análisis de frecuencia de HSPC en receptores de médula ósea tratada con vehículo o PGE2 durante 20 semanas. El cambio de multiplicidad indica un aumento en la frecuencia de injerto funcionante de células pulsadas con dmPGE2 en comparación con el vehículo.
Con referencia ahora a la FIG. 1D, gráficos representativos de FACS de reconstitución de múltiple linaje (mieloide, linfoide B y T). Con referencia ahora a la FIG. 1D, análisis multilinaje de paneles del medio para trasplante primario (panel izquierdo de 32 semanas) y una cohorte de 4 ratones que recibieron trasplantes de ratones trasplantados primarios a las 20 semanas, con análisis 12 semanas después (panel derecho). Se muestra un mayor quimerismo de las células tratadas con dmPGE2 frente a vehículo para el trasplante primario a las 20 semanas (momento del trasplante secundario) y el trasplante secundario 12 semanas después (panel inferior). Los datos para el trasplante primario de 20 semanas fueron de 2 experimentos agrupados, n = 5 ratones/grupo/experimento, cada uno ensayado individualmente. Datos para trasplante secundario de 12 semanas, n = 4 ratones/grupo, cada uno ensayado individualmente.
Todavía con referencia a la FIG. 1D, el trasplante en serie evalúa la autorrenovación y expansión de HSPC en injertos hematopoyéticos trasplantados. Para investigar la expansión de las células de repoblación a largo plazo (LTRC) expuestas a dmPGE2 y al vehículo ex vivo, se recolectó médula de animales trasplantados primarios a las 20 semanas posteriores al trasplante y se trasplantó a receptores secundarios. El análisis de PB 12 semanas posteriores al trasplante secundario mostró reconstitución de múltiples linajes mediante células de todos los ratones trasplantados, indicativo de autorrenovación de LTRC trasplantado primario. El aumento del quimerismo resultante de la exposición a dmPGE2 observado en donantes primarios también se observó en trasplantes secundarios sin tratamientos adicionales. Además, se observó una tendencia hacia una mayor competitividad de las HSPC previamente tratadas con dmPGE2 en trasplantes secundarios, con un ligero sesgo hacia la reconstitución del linaje mieloide.
Este modelo permite la comparación cuantitativa del injerto funcionante y la competitividad de HSPC de los grupos de tratamiento de control y dmPGE2 dentro del mismo animal (FIG. 1A), así como la repoblación endógena de células anfitrionas. A las 12 semanas posteriores al trasplante, el análisis de sangre periférica (PB) mostró un mayor quimerismo de las células tratadas con dmPGE2 en comparación con las células tratadas con vehículo, con un aumento de ~4 veces en la frecuencia de HSPC y en unidades de repoblación competitiva (CRU), medidas reconocidas de la capacidad de repoblación a largo plazo (FIG. 1B). A lo largo de las 20 semanas de seguimiento posterior al trasplante, se mantuvo un aumento de ~4 veces en la frecuencia de HSPC, lo que indica que el efecto de la exposición al pulso de dmPGE2 era estable (FIG. 1C). A las 32 semanas posteriores al trasplante, se observó reconstitución para los linajes linfoides y mieloides B y T en PB, sin diferencias discernibles entre las células competidoras no tratadas, dmPGE2 o células tratadas con vehículo (FIG. 1D).
2. Las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) de murino y humano expresan receptores de PGE2.
Según se informa, la PGE2 interactúa con 4 receptores acoplados a proteína G altamente conservados específicos; EP1-EP4 (Sugimoto and Narumiya, 2007; Tsuboi et al., 2002). El repertorio de receptores EP da cuenta de respuestas múltiples, a veces opuestas, atribuidas a PGE2 (Breyer et al., 2001). La expresión del subtipo de receptor de PGE2 sobre HSPC no se conoce previamente. Con referencia ahora a la FIG. 2A, el análisis de receptores EP sobre células Linneg c-kit+ (KL), enriquecidas para células progenitoras hematopoyéticas (HPC), y células Linneg Sca-1 c-kit+ (SKL), enriquecidas para HSPC, mostró que se expresaron todos los cuatro receptores EP (EP3+, EP2, EP1 y EP4). Con referencia ahora a la FIG. 2A, (panel derecho) además, QRT-PCR detectó ARNm para los cuatro receptores EP en células KL y SKL clasificadas por FACS. Con referencia ahora a la FIG.2A, las curvas de disociación (panel del medio) para EP3 mostraron varios picos, consistentes con las variantes de empalme múltiples conocidas de EP3 (Namba et al., 1993). No se observaron diferencias cuantitativas significativas en la expresión de superficie o en los niveles de ARNm entre cualquiera de los subtipos de receptores EP para las células KL o SKL. Con referencia ahora a la FIG.
2B, (panel derecho) análogos a las células de murino, los cuatro subtipos de receptores se expresaron sobre la superficie de células UCB CD34+ humanas y el análisis QRT-PCR detectó ARNm para los cuatro receptores EP (Figura 2B).
3. La exposición a PGE2 a corto plazo aumenta la eficiencia del retorno linfocítico dirigido de HSPC
El injerto funcionante de HSPC mejorado observado tras la exposición al pulso a PGE2 puede resultar de un aumento del número de HSPC y/o efectos del estado del ciclo celular sobre la facilitación de células o efectos sobre la retorno linfocítico dirigido o proliferación de HSPC en la médula del anfitrión. Independientemente de su causa, se requiere un nicho de médula para que las HSPC se renueven y se diferencien, y es muy probable que solo el retorno linfocítico dirigido de las HSPC en estos nichos pueda proporcionar una repoblación a largo plazo. Con referencia ahora a la FIG. 3A, con el fin de evaluar el retorno linfocítico dirigido de HSPC, se pulsaron células CD45.2 de médula ósea completa (WBM) marcadas con CFSE con dmPGE2 o vehículo durante 2 horas sobre hielo, se lavaron e inyectaron IV en anfitriones CD45.2 irradiados letalmente. Después de 16 horas, se cuantificaron el retorno linfocítico dirigido de células CFSE+ totales para médula ósea, así como el número de eventos retornados dentro de las poblaciones de células KL y SKL. No se observó ninguna diferencia en el porcentaje de células CFSE+ que retornan a la médula entre las células tratadas con dmPGE2 y con vehículo cuando se evaluaron las células WBM totales; sin embargo, significativamente más células SKL retornaron a la médula que al control. Con referencia ahora a la FIG. 3B, en un modelo congénico, también se observó un porcentaje significativamente mayor de células SKL para las células tratadas con dmPGE2 en comparación con las células tratadas con vehículo o no manipuladas. No se observó ninguna diferencia en la eficiencia del retorno linfocítico dirigido entre las células no tratadas y las tratadas con vehículo.
Con referencia ahora a la FIG. 3C, con el fin de determinar si el efecto mejorador de dmPGE2 sobre el retorno linfocítico dirigido de células SKL era directo o indirecto, el retorno linfocítico dirigido de HSPC enriquecido en un modelo de trasplante simultáneo se comparó con otras células. Se aislaron células SKL altamente purificadas de ratones CD45.2 y CD45.1 mediante clasificación FACS, se trataron con dmPGE2 o vehículo, y 3x104 células CD45.1 tratadas con vehículo más 3x104 células CD45.2 tratadas con dmPGE2 trasplantadas en ratones CD45.1/CD45.2. Al mismo tiempo, se trasplantó una cohorte adicional con cepa congénica y los grupos de tratamiento se cambiaron para probar cualquier sesgo en el retorno linfocítico dirigido de cepas. De manera similar a los estudios que utilizan WBM, la exposición al pulso de dmPGE2 de las células SKL purificadas aumentó su eficiencia del retorno linfocítico dirigido en 2 veces, lo que sugiere fuertemente un efecto directo de PGE2 sobre HSPC. Aunque las células SKL no son una población de HSPC homogénea, están altamente enriquecidas para LTRC (Okada et al., 1992; Spangrude and Scollay, 1990).
4. PGE2 aumenta CXCR4 de HSPC, y el antagonista de CXCR4 AMD3100 bloquea el retorno linfocítico dirigido mejorada
Con referencia ahora a la FIG. 4A, el eje del factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF-1a)/CXCR4 se ha implicado en el tráfico y el retorno linfocítico dirigido de HSPC. El estudio evaluó si el mejor retorno linfocítico dirigido de HSPC tratada con dmPGE2 era el resultado de una mayor señalización de SDF-1a/CXCR4. La exposición al pulso de células Linneg a dmPGE2 aumentó la expresión de CXCR4 sobre células KL y SKL (Figura 4A); de manera similar, la exposición al pulso de dmPGE2 aumentó la expresión de CXCR4 sobre células UCB CD34+ como se esperaba. La QRT-PCR demostró niveles elevados de ARNm de CXCR4 en células tratadas con dmPGE2 en comparación con el vehículo, con una elevación máxima observada a las 6 horas (datos no mostrados).
Con referencia ahora a la FIG. 4B, con el fin de determinar si el CXCR4 regulado en aumento desempeñaba una función en el retorno linfocítico dirigido mejorado observado después del tratamiento con PGE2, se utilizó el antagonista selectivo de CXCR4 AMD3100, que inhibe la migración in vitro a SDF-1 y el retorno linfocítico dirigido de HSPC in vivo. La exposición al pulso de PGE2 aumentó el retorno linfocítico dirigido de las células SKL en ~2 veces, y la incubación del vehículo o las células pulsadas con dmPGE2 con AMD3100 redujo el retorno linfocítico dirigido de las células SKL y anuló la eficiencia del retorno linfocítico dirigido mejorado de las células pulsadas con dmPGE2.
5. PGE2 reduce la apoptosis de HSPC coincidiendo con un aumento de Survivina.
El tratamiento con PGE2 produjo un aumento de 4 veces en la frecuencia de HSPC y CRU (FIG. 1), pero solo una mejora de 2 veces en el retorno linfocítico dirigido (FIG. 3), lo que sugiere que otros eventos están implicados en el injerto funcionante mejorado. La apoptosis es un proceso regulador importante en la hematopoyesis normal y maligna y la PGE2 se ha implicado en la señalización antiapoptótica. Más aún, la activación de cAMP, una molécula de señalización en dirección descendente de los receptores EP, inhibe la apoptosis en las células CD34+. Una hipótesis consistente con estos resultados es que el tratamiento con dmPGE2 afecta la supervivencia y/o proliferación de HSPC, lo que contribuye a un mejor injerto funcionante. Para evaluar un efecto de dmPGE2 sobre la supervivencia de HSPC, se pulsaron células Linneg con dmPGE20.1 nanoMolar - 1 microMolar o vehículo y se cultivaron en medio de cultivo reducido en suero sin factores de crecimiento. La exposición al pulso a dmPGE2 redujo la apoptosis en las células SKL de una manera dependiente de la dosis (Figura 5A), alcanzando una inhibición de ~65% a 1 microMolar.
El inhibidor de la proteína survivina de la apoptosis es un importante regulador de la apoptosis y la proliferación en células hematopoyéticas tanto normales como malignas. Con referencia ahora a la FIG. 5B, estos resultados demuestran que PGE2 afectó a la Survivina en HSPC. A las 24 horas después del pulso de dmPGE2, los niveles intracelulares de Survivina fueron significativamente más altos tanto en las células SKL de murino como en las células UCB CD34+ (1.7 y 2.4 veces, respectivamente) en comparación con el control y el análisis de QRT-PCR indicó un ARNm de Survivina elevado en comparación con el control.
Con referencia ahora a la FIG. 5C se observó una disminución de la caspasa-3 activa coincidente con un aumento de Survivina a las 24, 48 y 72 horas posteriores a la exposición de las células SKL a dmPGE2 en comparación con el control.
6. El tratamiento con PGE2 aumenta la proliferación de HSPC
La Survivina regula la entrada de HSPC y la progresión a través del ciclo celular. Adicionalmente, la p-catenina, implicada en la proliferación y autorrenovación de HSPC, se encuentra en dirección descendente de las rutas del receptor EP. La capacidad de PGE2 para modular estos reguladores del ciclo celular sugiere que un aumento en la autorrenovación y la proliferación de HSPC podrían contribuir al injerto funcionante mejorado de células pulsadas con dmPGE2. Para probar esta hipótesis, se analizó el estado del ciclo celular de las células SKL pulsadas con dmPGE2 o vehículo in vitro. Con referencia ahora a la FIG. 6A, la exposición al pulso a dmPGE2 aumentó el contenido de ADN en las células SKL, una indicación de aumento del ciclo celular (panel izquierdo, cuadrante superior derecho). En 3 experimentos, un 60% más de células SKL estaban en la fase S+G2/M del ciclo celular después del tratamiento con dmPGE2 en comparación con los controles (FIG. 6A, panel derecho). No se observó ningún efecto significativo sobre la tasa del ciclo celular de las células KL o Linneg (no mostradas); sugiriendo que dmPGE2 aumenta selectivamente el estado cíclico de HSPC temprano.
Para confirmar el efecto de dmPGE2 sobre la mejora del ciclo celular de HSPC observado in vitro, se pulsaron células de médula con dmPGE2 y se inyectaron en ratones congénicos tratados con BrdU posterior al trasplante, y se determinó la proporción de células BrdU SKL del donante 16 horas después. Con referencia ahora a la FIG. 6B, se observó un aumento de ~2 veces en la proporción de células SKL retornadas en la fase S+G2/M para las células pulsadas con dmPGE2 antes del trasplante, lo que confirma que la exposición a corto plazo de HSPC a dmPGE2 estimula a las HSPC a entrar y progresar a través del ciclo celular in vivo.
7. La inhibición de biosíntesis de PGE2 endógena por el inhibidor dual de COX1/COX2 indometacina moviliza HSPC.
Dado que PGE2 aumenta la expresión del receptor CXCR4 y la señalización de SDF-1/CXCR4 es importante para el tráfico y la retención de HSPC en la médula. Una hipótesis consistente con estos resultados es que la inhibición de la biosíntesis de PGE2 endógena por el inhibidor dual de COX1/COX2, indometacina, también movilizaría la HSPC. Con referencia a la FIG. 7A y 7B, se muestran los efectos de la administración SC diaria de 150 pg/kg de indometacina o 150 ug/kg de baicaleína sola (FIG 7A) o con G-CSF (FIG 7B) durante 4 días sobre la movilización de CFU-GM. Con referencia ahora a la FIG. 7A, la administración de 150 pg/kg de indometacina, SC, una vez al día durante 4 días, produjo un aumento de 4 veces en el número de células progenitoras movilizadas. Con referencia ahora a la FIG. 7B, La coadministración de indometacina con G-CSF produjo un aumento altamente sinérgico en la movilización de células madre de sangre periférica. El inhibidor de la lipoxigenasa baicaleína no tuvo ningún efecto sobre el criterio de valoración o la movilización de CFU-GM inducida por G-CSF, lo que sugiere que los efectos observados fueron específicos de la inhibición de la ruta de ciclooxigenasa. Los datos se expresan como media de ± EEM de CFU-GM movilizados por ml de sangre para N = 3 ratones cada uno de ellos ensayado individualmente.
8. La exposición al pulso de HSPC de murino y de humano a PGE2 aumenta la expresión de CXCR4.
Para evaluar CXCR4, se trataron células de médula ósea de ratón Lineageneg o UCB CD34+ sobre hielo con dmPGE2 1 microMolar o control de vehículo durante 2 horas, se lavaron y luego se cultivaron en RPMI-1640/HIFBS al 10% a 37 °C durante 24 horas, se tiñeron para SKL (células de murino) o CD34 (humano) y CXCR4 y se analizaron mediante FACS. Con referencia ahora a la FIG. 4A, la expresión de CXCR4 sobre células Kl y SKL de murino y células UCB CD34+ de humano 24 horas después del tratamiento con dmPGE2. Los datos se expresan como media de ± EEM del % de cambio en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CXCR4 debido al tratamiento con dmPGE2 o vehículo (n = 3). El análisis por QRT-PCR demuestra un aumento de 2.65 veces en el ARNm de CXCR4.
9. La exposición al pulso de células SKL de murino a PGE2 aumenta la migración a SDF-1a.
Se pulsaron células de médula ósea de ratón Lineageneg recién aisladas con dmPGE2 o vehículo durante 2 horas, se lavaron y se resuspendieron en medio con HI-FCS al 10% y se cultivaron a 37 °C durante 16 horas. Después de incubación, las células se lavaron, se resuspendieron en RPMI/BSA al 0.5% y se dejaron migrar en transpozos a rmSDF-1a durante 4 horas. La migración celular total se midió mediante citometría de flujo. Con referencia ahora a la FIG. 9, la migración total de células SKL fue mayor para las células pulsadas con dmPGE2. Los datos son la media ± EEM del 6% de migración para 3 experimentos. f P <0.05 para células tratadas con dmPGE2 en comparación con células tratadas con vehículo.
10. La exposición al pulso de células CD34+ de humano a PGE2 aumenta la migración a SDF-1a.
Se pulsaron células UCB CD34+ recién aisladas con dmPGE2 o vehículo durante 2 horas, se lavaron y se resuspendieron en medio con HI-FCS al 10% y se cultivaron a 37°C durante 16 horas. Después de la incubación, las células se lavaron, se resuspendieron en RPMi/BSA al 0,5% y se midió la migración a rhSDF-1 mediante citometría de flujo. Para bloquear el receptor CXCR4, las células replicadas se incubaron con 5 microgramos/ml de AMD3100 durante 30 minutos antes del ensayo de migración. Con referencia ahora a la FIG. 10, los datos son la Media ± EEM del porcentaje de migración para 3 experimentos.
11. El bloqueo del receptor CXCR4 bloquea la mejora de PGE2 del retorno linfocítico dirigido de células SKL.
Para evaluar la función del CXCR4 en el retorno linfocítico dirigido, se trataron células CD45.2 Lineageneg con vehículo o dmPGE21 microMolar más AMD310010 microMolar, 2x106 células tratadas inyectadas en ratones CD45.1 irradiados letalmente y células SKL retornadas recuperadas 16 horas posteriores al trasplante y se analizaron mediante FACS. Con referencia ahora a la FIG. 11, la eficiencia del retorno linfocítico dirigido de células tratadas con dmPGE2 y vehículo a la médula ósea en ausencia y presencia de AMD3100 10 microMolar. Las células se incubaron con AMD3100 durante 30 minutos antes del ensayo del retorno linfocítico dirigido.
12. PGE2 aumenta la tasa del ciclo celular de las células SKL de murino in vitro.
Las células de Lineageneg se trataron con vehículo o con dmPGE2 1 microMolar durante 2 horas, se lavaron y se cultivaron en medio con rmSCF, rhFlt3 y rhTpo. Después de 20 horas, las células se tiñeron para SKL y Hoechst-33342 y Pyronin-Y. La proporción de células SKL en el ciclo celular se midió mediante FACS. Con referencia ahora a la FIG. 12, diagrama de flujo representativo que muestra la distribución del ciclo celular de las células SKL cerradas y datos combinados para el aumento de multiplicidad en el ciclo celular para las células tratadas con dmPGE2 en comparación con el control del vehículo de 3 experimentos, Media ± EEM, n = 9 ratones, cada uno ensayado individualmente. La proporción de células SKL en el ciclo celular se midió mediante FACS. Diagrama de flujo representativo que muestra la distribución del ciclo celular de células SKL agrupadas y los datos combinados para el aumento de multiplicidad en el ciclo celular para las células tratadas con dmPGE2 en comparación con el control del vehículo de 3 experimentos, Media ± EEM, n = 9 ratones, cada uno ensayado individualmente.
13. PGE2 aumenta la tasa del ciclo celular de células SKL CD150+48' (SLAM) altamente purificadas in vitro.
Con referencia ahora a la FIG. 8, la tabla resume los datos recopilados utilizando células de médula ósea de Linneg tratadas con dmPGE2 1 microMolar o vehículo durante 2 horas y cultivadas en presencia de factores de crecimiento (50 ng/ml de rm-SCF, 100 ng/ml de cada uno de rhFlt-3 y rhTPO) durante 20 horas, se tiñeron para SKL SLAM, Hoechst-33342 y Pyronin-Y y la proporción de células SKL SLAM en las fases G0, G1, S y G2/M del ciclo celular se determinó por cuantificación del A d N y el contenido de ARN mediante FACS. Los datos son la Media ± EEM para n = 9 ratones, cada uno ensayado individualmente. (b) Porcentaje de células en G1+S+G2M; Datos combinados para n = 9 ratones. (*) P <0.05 en comparación con el control del vehículo.
14. La exposición al pulso a PGE2 aumenta la tasa de proliferación y ciclo celular de células SKL recuperadas in vivo.
Se trataron células de médula ósea Lineageneg CD45.1 con dmPGE2 o vehículo y se trasplantaron en ratones CD45.2 irradiados letalmente. Inmediatamente posterior al trasplante, se proporcionó BrdU en agua potable y se administró mediante inyección IP. Se analizó la médula ósea 16 horas después y se analizó la proporción de células SKL CD45.1 que eran BrdU+ mediante análisis FACS. Con referencia ahora a la FIG. 13, se trataron células de médula ósea de Linneg CD45.1 con dmPGE2 o vehículo y se trasplantaron en ratones CD45.2 irradiados letalmente. Inmediatamente después del trasplante, se proporcionó BrdU en agua potable y se administró mediante inyección IP. Se analizó la médula ósea 16 horas después y se analizó la proporción de células SKL CD45.1+ que eran BrdU+ mediante análisis FACS. Una mayor proporción de células SKL tratadas con PGE2 retornaron a la médula. Los datos son Media ± EEM, n = 5 por ratones/grupo, cada uno ensayado individualmente.
15. La actividad de repoblación a largo plazo de las células madre se mantiene después de la exposición al pulso de PGE2.
Para el análisis competitivo simultáneo, se trataron WBM de ratones CD45.1 y CD45.2 con vehículo o dmPGE2 y se mezclaron con 2x105 de células de médula ósea competidoras de ratones CD45.1/CD45.2 en diversas relaciones y se trasplantaron en ratones CD45.1/CD45.2 irradiados letalmente. La proporción de células CD45.1, CD45.2 y CD45.1/CD45.2 en PB se determinó mensualmente. Para trasplantes secundarios, terciarios y cuaternarios, se inyectaron 2x106 WBM de ratones CD45.1/CD45.2 previamente trasplantados en una relación 1:1 en ratones CD45.1/CD45.2 irradiados letalmente de forma no competitiva. La proporción de células CD45.1, CD45.2 y CD45.1/CD45.2 en PB se determinó mensualmente. Con referencia ahora a la FIG. 14, se muestra un mayor quimerismo de las células tratadas con dmPGE2 frente al vehículo para el trasplante primario a las 20 semanas (momento del trasplante secundario) y en una subcohorte a las 32 semanas (momento del análisis de 12 semanas del trasplante secundario), para el trasplante secundario en 12 semanas y 24 semanas, e igualmente para trasplantes terciarios y cuaternarios, cada 12 semanas. Los datos para el trasplante primario de 20 semanas fueron de 2 experimentos agrupados, n = 5 ratones/grupo/experimento, cada uno ensayado individualmente. Los datos para los trasplantes secundarios, terciarios y cuaternarios fueron de n = 5 ratones/grupo, cada uno ensayado individualmente
16. Regímenes de movilización de Células Madre de Sangre Periférica (PBSC) para indometacina y G-CSF.
Se administró a los ratones tratamientos subcutáneos de 150 microgramos/kg de indometacina o 150 microgramos/kg de baicaleína (inhibidor de la lipoxigenasa) en gelatina cada 48 horas con o sin G-CSF durante 4 días. La movilización de CFU-GM se determinó como se describió previamente (Pelus et. Al., Experimenta1Hematology 33 (2005) 295-307). Con referencia ahora a la FIG. 7A 77B, la combinación del inhibidor dual de ciclooxigenasa Indometacina y G-CSF moviliza sinérgicamente HSPC de ratón. Efectos de la administración SC diaria de 150 pg/kg de indometacina o 150 ug/kg de baicaleína (inhibidor de la lipoxigenasa) sola (Figura 7A) o con G-CSF (Figura 7B) durante 4 días sobre la movilización de CFU-GM. Los datos se expresan como media de ± EEM de CFU-GM movilizado por ml de sangre para N = 3 ratones cada uno ensayado.
Con referencia ahora a la FIG. 16, los ratones recibieron inyecciones SC dos veces al día con G-CSF (1 microgramo por ratón) o G-CSF indometacina (50 microgramos por ratón) durante 4 días. La movilización de CFU-GM se determinó como se describe (Pelus et. Al., Experimental Hematology 33 (2005) 295-307). Los ratones tratados con la combinación demostraron un aumento mayor de CFU-GM por unidad de sangre que los animales tratados solo con G-CSF.
Se analizaron las células mononucleares de baja densidad de la sangre periférica de los ratones movilizados mediante el régimen anterior para detectar HSPC mediante análisis FACS. Para la detección de SKL y SLAM-SKL, las células se tiñeron con Sca-1-PECy7, c-kit-APC, CD150-PECy5, CD48-FITC, Lineage Cocktail-Biotin y tinción secundaria con Estreptavidina-APC-Cy7. Con referencia ahora a la FIG. 17, se realizaron los análisis sobre un BD-LSR II. Análisis de citometría de flujo de HSPC fenotípicamente definido en sangre periférica de ratones tratados con G-CSF o la combinación de G-CSF e indometacina. N = 5 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
17. La movilización combinada por indometacina más AMD3100 moviliza HSPC.
A los ratones se les administraron inyecciones SC dos veces al día con vehículo o Indometacina (50 microgramos por ratón) durante cuatro días. El día 5, los ratones recibieron ya sea vehículo o AMD3100 (5 mg/kg). Una hora más tarde, se sacrificaron los ratones y se determinó la movilización de CFU-GM como se describió previamente (Pelus et. Al., Experimental Hematology 33 (2005) 295-307). Con referencia ahora a la FIG. 18, Movilización de CFU-GM por vehículo o tratamiento con indometacina sola (panel izquierdo). Movilización de CFU-GM mediante administración única de AMD3100 o tratamiento con indometacina AMD3100 (panel derecho). Los datos se expresan como la media ± EEM, n = 5 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
18. Comparación de la eficiencia de movilización empleando indometacina en combinación con varios regímenes de movilización.
Los ratones se trataron con vehículo, indometacina (50 microgramos por ratón, SC dos veces al día, 4 días), AMD3100 (5 mg/kg día 5), G-CSF (1 microgramo por ratón, SC dos veces al día, 4 días), AMD3100 GROp (5 miligramos/kg y 20 miligramos/kg respectivamente, día 5), AMD3100 indometacina (indometacina 50 microgramos por ratón, SC dos veces al día, 4 días; AMD3100 5 miligramos/kg día 5), o G-CSF indometacina (1 microgramo y 50 microgramos respectivamente, dos veces al día C, 4 días). La movilización de CFU-GM se determinó como se describió previamente (Pelus et. Al., Experimental Hematology 33 (2005) 295-307). Con referencia ahora a la FIG. 19, CFUGM por ml de sangre periférica representada para varios regímenes de tratamiento como se describe en lo anterior.
Los ratones se trataron con vehículo, G-CSF (1 microgramo por ratón, SC dos veces al día, 4 días), G-CSF indometacina (50 microgramos por ratón, SC dos veces al día, 4 días) o GCSF meloxicam (0.3 mg/kg, SC dos veces al día, 4 días). La movilización de CFU-GM se determinó como se describió previamente (Pelus et. Al., Experimental Hematology 33 (2005) 295-307). Con referencia ahora a la FIG. 20, un gráfico de barras que ilustra una comparación de la movilización inducida por indometacina G-CSF y el NSAID de acción similar a Meloxicam G-CSF. Los datos se expresan como la media ± EEM, n = 5 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
19. La dosificación escalonada con NSAID permite la recuperación de la expresión de CXCR4 sobre HSPC.
Se movilizaron ratones CD45.1 con G-CSF (1 microgramo por ratón, dos veces al día, SC, 4 días) o G-CSF indometacina (50 microgramos por ratón, dos veces al día, SC, 4 días) y células mononucleares de sangre periférica. (PBMC) se recogieron el día 5. Se mezclaron PBMC en diversas relaciones con médula ósea CD45.2 y se trasplantaron en ratones CD45.2 irradiados letalmente (1100 cGy, dosis dividida). Con referencia ahora a la FIG. 21, las unidades de repoblación competitivas se muestran a las 12 semanas posteriores al trasplante (panel izquierdo). Los datos se expresan como la media ± EEM de 2 experimentos, N = 5 ratones por grupo, por experimento, cada uno ensayado individualmente. Dado que no hubo mejora en el injerto funcionante con PBMC movilizado por indometacina coadministrado con GCSF en comparación con G-CSF solo, se planteó la hipótesis de que los déficits en el retorno linfocítico dirigido pueden ocurrir como resultado de una disminución en la expresión del receptor CXCR4, y que esto se podría aliviar al escalonar los tratamientos con indometacina y G-CSF. Los ratones CD45.2 se movilizaron con G-CSF (1 microgramo por ratón, dos veces al día, SC, 4 días), G-CSF indometacina sin escalonamiento (50 microgramos por ratón, dos veces al día, SC, 4 días), G-CSF Indometacina con un escalonamiento de 1 día (la indometacina comenzó primero y se proporcionó durante 4 días, y GCSF se proporcionó durante 4 días comenzando con el segundo tratamiento con indometacina, creando 1 día con G-CSF sin indometacina antes de la recolección de PBMC), o G-CSF indometacina con un escalonamiento de 2 días (la indometacina comenzó primero y se proporcionó durante 4 días, y el G-CSF se proporcionó durante 4 días comenzando en el tercer tratamiento con indometacina, creando 2 días con GCSF sin indometacina antes de la recolección de PBMC). Con referencia ahora a la FIG. 21 (panel derecho) se muestra la expresión de CXCR4 sobre células SKL. Los datos se expresan como la media ± EEM, N = 5 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
20. La PBSC movilizada de ratones tratados con G-CSF más NSAID muestra una función de células madre a largo plazo significativamente mejorada en comparación con la PBSC movilizada por G-CSF sola.
Se movilizaron ratones CD45.1 con G-CSF o GCSF indometacina (escalonamiento de 1 día) y se trasplantaron PBMC con médula ósea competidora CD45.2 en ratones CD45.2 irradiados letalmente. Con referencia ahora a la FIG.
22, se muestran las relaciones de quimerismo en múltiples donantes: competidor (panel izquierdo) y unidades de repoblación competitivas (panel derecho) a las 12 semanas posteriores al trasplante. Los datos se expresan como la media ± EEM, n = 5 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
21. La PBSC de ratones movilizados con G-CSF más NSAID restaura los recuentos de neutrófilos en sangre periférica más rápidamente cuando se trasplantan a ratones irradiados letalmente en comparación con PBSC movilizada por solo G-CSF.
Se movilizaron ratones con G-CSF o G-CSF meloxicam (escalonamiento de 1 día) y se trasplantaron 2x106 PBMC en receptores irradiados letalmente. Los neutrófilos en sangre se enumeraron día por medio con un Hemavet 950 FS (Drew Scientific) hasta la recuperación completa (en comparación con el subconjunto de control). Las plaquetas en sangre se enumeraron cada dos días mediante un Hemavet 950 FS (Drew Scientific) hasta la recuperación completa (en comparación con el subconjunto de control). Con referencia ahora a la FIG.23, Los neutrófilos en sangre periférica (PB) se enumeraron cada dos días hasta la recuperación completa (en comparación con el subconjunto de control). Estos datos se expresan como la media ± EEM, n = 10 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente. Con referencia ahora a la FIG. 24, las plaquetas en sangre periférica (PB) se enumeraron cada dos días hasta la recuperación completa (en comparación con el subconjunto de control). Los datos se expresan como la media ± EEM, n = 10 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
22. Determinación del efecto de G-CSF y Meloxicam sobre la movilización celular en babuinos.
Con referencia ahora a la FIG. 25, se movilizó un primer grupo de babuinos con el siguiente tratamiento de régimen de dosificación, con 10 ug/kg de peso corporal de G-CSF y luego, después de un período de lavado de dos semanas, los animales se trataron con 10 ug/kg de G-CSF más 0.1 mg/kg de meloxicam. Se movilizó un segundo grupo de babuinos con el siguiente régimen de 10 ug/kg de G-CSF más 0.1 mg/kg de meloxicam y después de un período de lavado de dos semanas con 10 ug/kg de GCSF. Con referencia ahora a la FIG. 26, se determinaron las células CD34+ en PB mediante análisis FACS y se determinó CFU-GM por ml de sangre como se describió previamente. La coadministración de G-CSF y Meloxicam aumentó la movilización de células CD34+ (panel izquierdo) y CFU-GM medidas por unidad de sangre extraída.
23. La mejora óptima de la movilización de PBSC en ratones requiere la inhibición de enzimas tanto COX1 como COX 2.
Los ratones se movilizaron con G-CSF y CFU-GM en PB se comparó con regímenes de movilización con GCSF y la combinación de varios NSAID (Aspirina [COX-1 y COX-2]; Licofelone [COX-2 y 5-LOX]; SC-560 [COX-1]; Salicilato de valerilo [COX-1]; Valdecoxib [CoX-2]; NS-398 [CoX-2]). Con referencia ahora a la FIG. 27, los resultados de estas pruebas se resumen y estos datos se expresan como la media ± EEM, n = 4 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente. Los compuestos que se sabe que inhiben tanto COX1 como 2 fueron mejores para movilizar células formadoras de colonias que los compuestos que se consideran altamente selectivos para solo una de las dos isoenzimas. Para probar la eficacia de dos inhibidores de COX de uso común, se movilizaron ratones con G-CSF o la combinación de G-CSF y aspirina o ibuprofeno (PO, dos veces al día, 4 días). CFUGM se determinó como se describió previamente. Con referencia ahora a la FIG. 28, el análisis de dosis-respuesta de la movilización de G-CSF Aspirina y G-CSF Ibuprofeno de CFU-GM a sangre periférica está presente en forma de gráfico de barras para un grupo de control de ratones tratados solo con G-CSF; para ratones tratados con G-CSF más 10, 20 o 40 miligramos/kg de aspirina; y para ratones tratados con G-CSF más 10, 20 o 40 miligramos/kg de ibuprofeno. Los datos se expresan como la media ± EEM, n = 4 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
24. Medición del efecto dependiente de dosis de meloxicam sobre UFC en ratones
Los ratones se movilizaron con G-CSF y después de dosis de meloxicam 0.0 (control) 0.02, 0.2, 0.5., 1.5 y 3 miligramos/kg de peso corporal para meloxicam (SC dos veces al día, 4 días) y se determinó CFU-GM como se describió anteriormente. Con referencia ahora a la FIG. 29 se midió la respuesta a la dosis de meloxicam en HSPC en muestras de sangre periférica de animales; o en la médula ósea de los animales (FIG 30). Estos datos se expresan como la media ± EEM, n = 3 ratones por grupo, cada uno ensayado individualmente.
Referencias
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un método para mejorar la eficacia de la transducción viral en una población de células madre hematopoyéticas para terapia génica, que comprende:
poner en contacto ex vivo una población de células madre hematopoyéticas con un vector viral que contiene al menos un gen de interés para la transducción,
en el que la población de células madre hematopoyéticas que se van a poner en contacto con el vector viral se ha puesto en contacto ex vivo con una cantidad eficaz de una molécula que tiene actividad de PGE2.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula que tiene actividad de PGE2 se selecciona del grupo que consiste en: una prostaglandina de la serie E y un derivado de dimetilo de una prostaglandina de la serie E.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula que tiene actividad de PGE2 se selecciona del grupo que consiste en PGE2 y 16, 16-dimetil prostaglandina E2.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la población de células madre hematopoyéticas se obtiene de la médula ósea, sangre periférica movilizada, sangre de cordón umbilical (UCB) o placenta.
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